UA64090A

UA64090A - A method for quantitative and qualitative evaluation of apoptosis in cellular suspensions

Info

Publication number: UA64090A
Application number: UA2002119220A
Authority: UA
Inventors: Oleksandr Ivanovych Bilyi; Rostyslav Oleksandrovych Bilyi; Vasyl Bohdanovych Hetman; Rostyslav Stepanovych Stoika
Original assignee: Ivan Franko Lviv Nat Universit
Priority date: 2002-11-20
Filing date: 2002-11-20
Publication date: 2004-02-16

Abstract

A method for quantitative and qualitative evaluation of apoptosis in cellular suspensions involves supplying biological cells in the flow of liquid at a constant rate, passing the laser beam through the flow of liquid with cells to be tested and registration of scattered light pulses. Preliminarily the measuring device is calibrated, thereafter scattered light pulses are registered at an angle in the range between 2 and 358 degrees, results of measurement are normalized, and dimensional distribution of cells is determined; the parameter is apoptical index and functional dependence thereof.

Description

Опис винаходуDescription of the invention

Винахід відноситься до області біології та медицини, зокрема, до оптичних способів контролю явища 2 апоптозу, і може знайти застосування для діагностичних цілей в медицині.The invention relates to the field of biology and medicine, in particular, to optical methods of controlling the phenomenon of apoptosis 2, and may find application for diagnostic purposes in medicine.

Кількісна оцінка вмісту апоптичних клітин звичайно здійснюється за параметром, відомим як апоптичний індекс (АїЇ), який характеризує кількість клітин з морфологічними ознаками апоптозу і визначається як відсоток кількості апоптичних клітин від загальної кількості клітин, які спостерігаються в експерименті (А.А.Quantification of the content of apoptotic cells is usually carried out using a parameter known as the apoptotic index (AiY), which characterizes the number of cells with morphological signs of apoptosis and is defined as a percentage of the number of apoptotic cells from the total number of cells observed in the experiment (A.A.

Фильченков, Р.С. Стойка/ Апоптоз и рак. -К2: Морион. -1999. -184с.4. Відомий оптичний спосіб кількісної оцінки апоптичних клітин в клітинних суспензіях, названий як автоматизований мікрокультуральний кінетичний аналіз | Кгамівом М.О. А поме! тісгосиМиге Кіпейс аззау (МіСК аззау) ог таїїдпапі сеїЇ дгомлй апа спетозепіїмійу./ Еицг. ) Сапсег. 1994. М.З0А. Р.1564 -1570), в якому кількісна оцінка наявних апоптичних клітин в досліджуваному середовищі проводиться за часовими змінами оптичної густини культурального середовища, яке містить досліджувані клітини, на вибраному інтервалі довжин хвиль оптичного діапазону 12 спектру. При цьому, часову зміну оптичної густини цього середовища, яке пов'язують зі зміною інтенсивності розсіяного світла клітинами, яке виникає через морфологічні зміни, викликані апоптозом. За цим способом якісна оцінка апоптозу, викликана дією лікарських хеміотерапевтичних препаратів, включає виконання наступних дій: одержання зразка клітин з досліджуваного об'єкту; виділення із зразка суспензії однорідних клітин; поміщення клітин в культуральне середовище; дія на клітини в культуральному середовищі хеміотерапетичного препарату, який індукує апоптоз; інкубація культури клітин; почергове вимірювання оптичної густини культурального середовища з клітинами, підданих дії хеміотерапетичного препарату, і культурального середовища з тими ж клітинами, які не піддавались дії хеміотерапетичного препарату, на довжині хвилі, вибраної з інтервалу від 590 до 650 нанометрів; визначення тангенса кута нахилу прямої, побудованої за різницевими значеннями даних часових змін оптичної густини культурального середовища, яке піддавали дії 29 хеміотерапетичного препарату, і даних часових змін оптичної густини культурального середовища, яке не « піддавалось дії хеміотерапетичного препарату, на часовому періоді від початку наростання оптичної густини до досягнення максимуму оптичної густини; наявність позитивного значення тангенса кута нахилу вказує протікання апоптозу культивованих клітин |Раїепі 6258553 ИБА від 10.07.2001. МКП С1201/24. Авзау їТог теазигіпад ароріовів іп сеїЇ сийиге)|. о 30 Недоліком даного способу є складність проведення аналізу, довготривалість проведення аналізу, Ге»! необхідність використання спеціальних культуральних середовищ, які не поглинають в оптичному інтервалі спектру від 590 до 650 нанометрів. оFilchenkov, R.S. Stand/ Apoptosis and cancer. -K2: Morion. -1999. -184p.4. A known optical method for quantifying apoptotic cells in cell suspensions, called automated microculture kinetic analysis | Kgamiv M.O. And pome! tisgosyMyge Kipeis azzau (MiSK azzau) og taiidpapi seiYi dhomlj apa spetozepiimiyu./ Eitsg. ) Sapseg. 1994. M.Z0A. P.1564 -1570), in which the quantitative assessment of the existing apoptotic cells in the studied environment is carried out based on temporal changes in the optical density of the culture medium containing the studied cells, in the selected wavelength interval of the optical range of the 12 spectrum. At the same time, a temporal change in the optical density of this medium is associated with a change in the intensity of light scattered by cells, which occurs due to morphological changes caused by apoptosis. According to this method, a qualitative assessment of apoptosis caused by the action of medicinal chemotherapeutic drugs includes the following actions: obtaining a sample of cells from the object under study; selection of a suspension of homogeneous cells from the sample; placing cells in the culture medium; action on cells in the culture medium of a chemotherapeutic drug that induces apoptosis; incubation of cell culture; alternating measurement of the optical density of the culture medium with cells exposed to the chemotherapeutic drug and the culture medium with the same cells that were not exposed to the chemotherapeutic drug at a wavelength selected from the interval from 590 to 650 nanometers; determination of the tangent of the angle of inclination of the straight line constructed from the difference values of the data of temporal changes in the optical density of the culture medium, which was exposed to the action of 29 chemotherapeutic drugs, and the data of the temporal changes of the optical density of the culture medium, which was not "subjected to the action of the chemotherapeutic drug, in the time period from the beginning of the increase in the optical density until reaching the maximum optical density; the presence of a positive value of the tangent of the angle of inclination indicates the occurrence of apoptosis of cultured cells | Raiepi 6258553 IBA from 07.10.2001 MKP C1201/24. Avzau iTog theazigipad aroriov ip seiYi siyige)|. o 30 The disadvantage of this method is the complexity of the analysis, the long duration of the analysis, Ge"! the need to use special culture media that do not absorb in the optical range of the spectrum from 590 to 650 nanometers. at

Найбільш близьким за технічною суттю до запропонованого є спосіб проточної цитометрії, який для аналізу і «І сортування клітин використовує і розсіяння світла під малими кутами від 0" до 2" , або інакше пряме розсіяне 325 світло, і один з вказаних способів: розсіяння світла під кутом 90 градусів, або інакше бокове розсіяне світло ке,The method of flow cytometry closest in technical essence to the proposed one is the method of flow cytometry, which uses light scattering at small angles from 0" to 2" for the analysis and sorting of cells, or otherwise direct scattered 325 light, and one of the specified methods: light scattering under at an angle of 90 degrees, or otherwise side diffused light,

ІКгамівом М.О., Юапієї Т.О., Коцгу М.). Сотрагайме апаїувів ої айегепі теїподоіодіса! арргоаспез Юю пе іп мійго віцау ої агод-іпдисей ароріозіз. /Атег. у). Раїйоіоду. 1999. М.155, Мо4. Р.1327-1339), або електричний імпеданс ІНиаі Ма Її, Мип Хіапд Сі. ЕІесігоспетіса! теїйод їог апаїугіпуд іпігасеШаг гедох асіїмйу спапдез « ої Ше ейвзіде-іпаисей ароріозіз іп о НІі-бО сейв./ Апаі). Спіт. Асіа. 2000. М.416. Р.221-226), або З 50 флуоресценцію забарвлених барвником цитоплазми досліджуваних клітин |Раїепі 5834196 ЗА від 10.11. 1998, с МКП С1201/68. Мейо тїог аегесіпуд апа/ог оріопаПйу ачапійуїпд апа/ог зерагайпо ароріоїіс сеїЇв іп ог їотIkgamiv M.O., Yuapiei T.O., Kotsgu M.). Sotragayme apaiuviv oi ayegepi teipodoiodisa! arrgoaspez Yuyu pe ip myo vitsau oi agod-ipdysey arorioziz. / Ateg. in). Raiioiodu. 1999. M.155, Mo4. R. 1327-1339), or electrical impedance INiai Ma Yia, Myp Hiapd Si. Eiesigospetisa! teiiod yog apaiugipud ipigaseShag gedoh asiimyu spapdez « oi She eivzide-ipaisei arorioziz ip o NIi-bO seiv./ Apai). Sleep Asia 2000. M.416. P.221-226), or Z 50 fluorescence of the dye-stained cytoplasm of the studied cells | Raiepi 5834196 ZA from 10.11. 1998, p. MKP C1201/68. Mayo tiog aegesipud apa/og oriopaPyu achapiyuipd apa/og zeragaypo arorioiis seiYv ip og iot

Із» а ватріє; Раїепі 5945291 ИО5БА від 31.08. 1999, МКП (С01М033/53. Мейо ог аїізііпдиівпіпо міаріє, еапу ароріоїїіс, Іаїе ароріоїшс, апа песгоїїс сеїЇв|, У всіх вказаних випадках протікання апоптозу супроводжувалось падінням інтенсивності розсіяного світла під кутом 0 градусів | зростанням інтенсивності розсіяного світла 49 під кутом 90 градусів. При цьому кількісна оцінка компонент апоптичних клітин за параметром апоптичногр б індексу лише за даними змінами інтенсивності прямого розсіяного світла з великою точністю неможлива. Метод «їз» калібрування або стандартизації проточного цитометра передбачає використання сферичних синтетичних частинок, які характеризуються заданим об'ємом і значенням показника заломлення, а пристрій забезпечує два о вимірні сигнали: один сигнал прямого розсіяного світла калібрувальними частинками, а другий, принаймі один з (Те) 20 вказаних: бокове розсіяне світло, електричний імпеданс, поглинання світла, флуоресценція світла, радіочастотний сигнал |Раїепі 6074879 ОА від 13.06.2000., МКП 501М31/00. Зупіпеййс роїутег рагіісіев Тог изе с аз звіапаагівз апа саїїбгайоге іп Яом/ сутеїгу)!) Процедура калібрування проточного цитометра включає виконання наступних дій: а) проведення калібрування стандартними синтетичними частинками, які мають середні величини діаметрів і значень показників заломлення, аналогічні за значеннями відтворюваності частинками, які досліджуються, при в. цьому, в потоці рідини лише одна частинка в часі проходить Через пучок світла; б) детектування першого і другого вимірного сигналу від вказаних калібрувальних частинок, які перетинають пучок світла; в) визначення значень інтенсивностей першого і другого сигналів, таким чином, видаючи пару бо взаємовідповідних за інтенсивностями сигналів; г) перетворення пари взаємовідповідних за інтенсивностями сигналів в значення об'єму і показника заломлення, з метою виділення стандартизованих амплітуд сигналів проточного цитометра; д) калібрування проточного цитометра за зміною інтенсивності прямого розсіяного світла, для чого виміряють об'єм і показник заломлення частинок, а по отриманих значеннях перераховують аналізовані частинки бо у відповідності сигналу для відповідних значень об'єму і показника заломлення.Iz" a vatrie; Raiepi 5945291 ИО5BA from 31.08. 1999, MKP (С01М033/53. Mayo og aiiziipdiivpipo miarie, eapu arorioiiis, Iaie arorioiishs, apa pesgoiis seiYiv|, In all the specified cases, the process of apoptosis was accompanied by a drop in the intensity of scattered light at an angle of 0 degrees | an increase in the intensity of scattered light 49 at an angle of 90 degrees. At the same time, it is impossible to quantify the components of apoptotic cells according to the parameter of the apoptic gr b index only based on the changes in the intensity of direct scattered light with high accuracy. , and the device provides two measurable signals: one signal of direct scattered light by calibration particles, and the second, at least one of (Te) 20 specified: side scattered light, electrical impedance, light absorption, light fluorescence, radio frequency signal |Raiepi 6074879 ОА from 13.06 .2000., MKP 501M31/00. Zupipe yys roiuteg ragiisiev Tog ize s az zviapaagivz apa saiibgayoge ip Yaom/ suteigu)!) The flow cytometer calibration procedure includes performing the following actions: a) carrying out calibration with standard synthetic particles that have average values of diameters and refractive index values, similar in reproducibility values of particles, which are investigated, at thus, in a fluid flow, only one particle at a time passes through a beam of light; b) detection of the first and second measurement signal from the indicated calibration particles that cross the light beam; c) determining the values of the intensities of the first and second signals, thus producing a pair of signals corresponding to each other in intensity; d) conversion of a pair of signals corresponding in intensity to volume and refractive index values, in order to extract standardized amplitudes of flow cytometer signals; e) calibration of the flow cytometer according to the change in the intensity of direct scattered light, for which the volume and refractive index of the particles are measured, and the analyzed particles are counted based on the obtained values, because in accordance with the signal for the corresponding values of the volume and the refractive index.

Поєднання двох вимірних сигналів дозволяє більш точно оцінювати розмір клітин та їх зміни, здійснювати розподіл клітин за розмірами, сортувати клітини.The combination of two measurement signals allows more accurate assessment of the size of cells and their changes, the distribution of cells by size, and the sorting of cells.

Спосіб вимірювання розмірів і сортування клітин методом проточної цитометрії включає виконання наступних дій (Раїепі 4765737 ОА від 08.23. 1988., МКП 501М15/14. Сеї| віге теазигетепів ивіпд ІОН іп Яож/ суїотейу апа сеї! зопіпа): а) подачу біологічних клітин, які досліджуються, в потоці рідини з постійною швидкістю; б) проходження променя лазера Через потік рідини з досліджуваними клітинами таким чином, щоб поперечний переріз променя в місці перетину його клітинами був більший, ніж поперечний переріз 70 досліджуваних клітин, і його в часі могла перетинати лише одна клітина; в) вимірювання часу прольоту кожної біологічної клітини в потоці рідини через промінь, одержуючи при цьому електричний сигнал, який пропорційний ширині (або об'єму) біологічної клітини; г) формування першого електричного сигналу по величині інтенсивності прямого розсіяного світла або вторинного флуоресцентного випромінювання одною біологічною клітиною, яка з потоком рідини перетинає /5 лазерний промінь; д) формування другого електричного сигналу, амплітуда якого визначається інтегралом по часу від першого електричного сигналу; е) формування третього електричного сигналу, амплітуда якого дорівнює максимальному значенню амплітуди першого електричного сигналу; є) формування четвертого електричного сигналу, який визначається відношенням амплітуди другого сигналу до амплітуди третього сигналу і характеризує ширину кожної біологічної клітини плюс ширину перерізу лазерного променя; ї) формування п'ятого електричного сигналу, який є пропорційний ширині біологічної клітини, шляхом віднімання від четвертого сигналу постійного сигналу, пропорційного ширині лазерного променя.The method of measuring the size and sorting of cells by the flow cytometry method includes the following actions (Raiepi 4765737 OA dated 08.23. 1988., MKP 501М15/14. Seii| vige teazigetepiv ivipd ION ip Yaozh/ suioteyu apa sei! zopipa): a) supply of biological cells, which are investigated, in a fluid flow with a constant velocity; b) passage of the laser beam through the fluid flow with the cells under study in such a way that the cross-section of the beam at the point of intersection with its cells was greater than the cross-section of 70 cells under study, and only one cell could cross it in time; c) measuring the time of flight of each biological cell in the flow of liquid through the beam, while receiving an electrical signal that is proportional to the width (or volume) of the biological cell; d) formation of the first electrical signal based on the intensity of direct scattered light or secondary fluorescent radiation by one biological cell, which crosses the /5 laser beam with the flow of liquid; e) formation of the second electrical signal, the amplitude of which is determined by the time integral of the first electrical signal; e) formation of the third electrical signal, the amplitude of which is equal to the maximum value of the amplitude of the first electrical signal; g) formation of the fourth electrical signal, which is determined by the ratio of the amplitude of the second signal to the amplitude of the third signal and characterizes the width of each biological cell plus the width of the cross-section of the laser beam; i) formation of the fifth electrical signal, which is proportional to the width of the biological cell, by subtracting a constant signal proportional to the width of the laser beam from the fourth signal.

Недоліком даного способу є складність вимірювань, зумовлена необхідністю одночасного використання принаймні двох різних методів, один з яких: пряме розсіяння світла є обов'язковим. Точність методу є невисокою з наступних причин. Для калібрування проточного цитометра необхідно підібрати частинки, показник « заломлення яких рівний досліджуваному об'єкту, в даному випадку біологічним клітинам, а показник заломлення рідини, в яку поміщені частинки, по можливості був якнайбільше відмінний. Показник заломлення для складових компонент біологічної клітини має значення: для ядра п-1.39, цитоплазми п-1.37, мембрани клітини п-1.46, о зо оточуючого середовища п-1.35 |Оцпп А. Зтіпрефег С., УУеісп А. у., Кіспагаз-Копит МК. ГРіпце-айегепсеThe disadvantage of this method is the complexity of measurements due to the need to simultaneously use at least two different methods, one of which: direct scattering of light is mandatory. The accuracy of the method is low for the following reasons. To calibrate the flow cytometer, it is necessary to select particles whose refractive index is equal to the object under study, in this case biological cells, and the refractive index of the liquid in which the particles are placed was as different as possible. The refractive index for the constituent components of a biological cell has the following values: for the nucleus n-1.39, cytoplasm n-1.37, cell membrane n-1.46, o zo of the surrounding environment n-1.35 Hoof MK. Hriptse-ayegepse

Іте-дотаіп зітшиіанйоп ої Пд зсацегіпу їгот зіпдіе сеїв. / У Віотей. Оріїсв. 1997. М.2, Мо3. Р.262-266 |, б» залежить від осмолярного тиску води і концентрації глюкози у клітині в межах від 1.330 до 1.344 (для клітин о печінки) (іш Н., Веацймоїй В., Кітига М., Спапсе В. Юерепдепсе ої і(іззце оріїсаІ! ргорегіев оп зоіціе-іпдисей спапдез іп геїгасіїме іпдех апа озтоїагйу. У Віотей. Оріїсв. 1996. М.1, Мо2. Р.200-211). Як правило, клітини - з5 досліджують у водних розчинах, показник заломлення яких близький до показника заломлення води, який в со інтервалі довжин хвиль від 400 до 8ООнм змінюється від 1.339 до 1.329 |Наіїе С.М., Оцегту М.К. Оріїса! сопвіапів ої магїег іп (Пе 200-пт (о 200-Е т мамеїІепдій гедіоп. /Аррі. Оріїсв. 1973. М.12, Мо3. Р.555-5631).Ite-dotaip zitshiianyop oi Pd zsacegipu ygot zipdie seiv. / In Viotei. Oriisv. 1997. M.2, Mo3. P.262-266 |, b" depends on the osmolar pressure of water and the concentration of glucose in the cell in the range from 1.330 to 1.344 (for liver cells) (Ish N., Veatsymoii V., Kitiga M., Spapse V. Yuerepdepse oii and (izztse oriisaI! rgoregiev op zoitsie-ipdysey spapdez ip geigasiime ipdeh apa oztoiagyu. In Viotei. Oriisv. 1996. M.1, Mo2. P.200-211). As a rule, cells - z5 are studied in aqueous solutions, the refractive index of which is close to the refractive index of water, which varies from 1.339 to 1.329 in the wavelength range from 400 to 8OOnm mameii Hediop. / Arri. Oriisv. 1973. M. 12, Mo3. R. 555-5631).

В основу винаходу поставлено завдання удосконалити спосіб кількісної та якісної оцінки апоптозу в « клітинних суспензіях шляхом забезпечення використання лише одного кута для вимірювання інтенсивності розсіяного світла, визначення розмірного розподілу клітин та параметру апоптичний індекс, що дозволить т с спростити схему вимірювань і розширити арсенал відомих засобів дослідження. ч» Поставлене завдання вирішується тим, що у відомому способі кількісної та якісної оцінки апоптозу в " клітинних суспензіях, який включає подачу біологічних клітин в потоці рідини з постійною швидкістю, проходження променя лазера через потік рідини з досліджуваними клітинами і реєстрацію імпульсів розсіяного світла, згідно з винаходом, попередньо калібрують вимірювальний пристрій, після чого реєструють імпульси (2) розсіяного світла під кутом в інтервалі від 2 до 358 градусів, нормують результати вимірювання, визначають їз розмірний розподіл клітин, параметр апоптичний індекс та його функціональну залежність шляхом розв'язку рівняння о й ІВ(тьп) - УвАлит ті 0, се) і о де і - кількість вибраних для калібрування сферичних синтетичних частинок з відомими розмірами і однаковим показником заломлення, | - порядковий номер елементу та | 2 і, А(т,п,) - квадратична матриця, елемент якої а;(т,п,) виражає статистичні характеристики інтенсивності розсіяного світла для окремо вибраної сферичної синтетичної частинки із заданим розміром і показником заломлення, Фі - стала величина, в межах від О до 1.The invention is based on the task of improving the method of quantitative and qualitative assessment of apoptosis in cell suspensions by ensuring the use of only one angle for measuring the intensity of scattered light, determining the dimensional distribution of cells and the apoptotic index parameter, which will allow us to simplify the measurement scheme and expand the arsenal of known research tools . h» The task is solved by the fact that in the known method of quantitative and qualitative assessment of apoptosis in cell suspensions, which includes feeding biological cells in a liquid stream at a constant speed, passing a laser beam through the liquid stream with the cells under study and recording scattered light pulses, according to according to the invention, the measuring device is pre-calibrated, after which the pulses (2) of scattered light are recorded at an angle in the range from 2 to 358 degrees, the measurement results are normalized, the size distribution of cells is determined, the apoptotic index parameter and its functional dependence by solving the equation IV(tp) - Uvalit ti 0, se) and o where i - the number of spherical synthetic particles with known dimensions and the same refractive index selected for calibration, | - serial number of the element and | 2 i, A(t,n,) - quadratic matrix, the element of which a;(t,n,) expresses the statistical characteristics of the intensity of scattered light for a separately selected spherical of a synthetic particle with a given size and refractive index, Fi is a constant value ranging from 0 to 1.

Р» Дослідження протікання апоптозу клітинних суспензій методом проточної цитометрії супроводжується падінням інтенсивності прямого розсіяного світла і зростанням інтенсивності бокового розсіяного світла. Це зумовлено морфологічними змінами клітин, характерними для протікання апоптозу, зокрема агрегація бо хроматину, конденсація ядра та цитоплазми та їх фрагментація на апоптичні тільця, розмір яких менший за розмір нормальних клітин, які не зазнали морфологічних змін внаслідок апоптозу. При цьому в розмірному розподілі клітин спостерігаються два максимуми: перший, який знаходиться в інтервалі розмірів менших значень, відповідає апоптичним клітинам; другий, який знаходиться в інтервалі розмірів більших значень, відповідає нормальним клітинам. Параметр, відомий як апоптичний індекс, визначається з розмірного розподілу клітин як 65 Відношення кількості апоптичних клітин до сумарної кількості клітин з розмірного розподілу клітин, підданих апоптозу. Пропонований спосіб кількісної та якісної оцінки апоптозу в клітинних суспензіях в потоці рідини допускає лише використання бокового розсіяння світла, забезпечуючи можливість кількісної та якісної оцінки апоптозу в клітинних суспензіях за параметром, відомим як апоптичний індекс, який визначається з розмірного розподілу клітин, підданих апоптозу. При цьому відпадає необхідність використання другого розмірного каналу для калібрування пристрою, який здійснює аналіз апоптозу клітинних суспензій, так як процедура визначення розмірного розподілу клітин пропонованим способом передбачає попереднє калібрування пристрою по зміні інтенсивності розсіяного світла сферичними синтетичними частинками під тим же кутом, який вибраний визначення розмірного розподілу досліджуваних клітин.P» Study of the course of apoptosis of cell suspensions by the method of flow cytometry is accompanied by a decrease in the intensity of direct scattered light and an increase in the intensity of side scattered light. This is due to the morphological changes of cells characteristic of the course of apoptosis, in particular the aggregation of chromatin, condensation of the nucleus and cytoplasm and their fragmentation into apoptotic bodies, the size of which is smaller than the size of normal cells that have not undergone morphological changes due to apoptosis. At the same time, two maxima are observed in the size distribution of cells: the first, which is in the size range of smaller values, corresponds to apoptotic cells; the second, which is in the size range of larger values, corresponds to normal cells. A parameter known as the apoptotic index is determined from the size distribution of cells as 65 The ratio of the number of apoptotic cells to the total number of cells from the size distribution of cells undergoing apoptosis. The proposed method of quantitative and qualitative assessment of apoptosis in cell suspensions in a fluid flow allows only the use of side scattering of light, providing the possibility of quantitative and qualitative assessment of apoptosis in cell suspensions by a parameter known as the apoptotic index, which is determined from the size distribution of cells subjected to apoptosis. At the same time, there is no need to use a second size channel for calibrating the device that performs the analysis of apoptosis of cell suspensions, since the procedure for determining the size distribution of cells by the proposed method involves preliminary calibration of the device by changing the intensity of scattered light by spherical synthetic particles at the same angle as the selected size distribution studied cells.

На фіг.1 зображено апоптоз в лейкемійних клітинах лінії К562, індукований дією цисплатин. А - зображення /0 В Уультрафіолетовому «світлі імерсійного препарату клітин, фарбованих акридиновим оранжевим, збільшення - 900. Б - комп'ютерний аналіз зображення А. Стадії апоптозу: 1- нормальна клітина, 2,3,4,5 - послідовні етапи розвитку апоптозу, 6 - апоптоз клітини.Figure 1 shows apoptosis in leukemic cells of the K562 line, induced by the action of cisplatin. A - image /0 In ultraviolet "light of an immersion preparation of cells stained with acridine orange, magnification - 900. B - computer analysis of image A. Stages of apoptosis: 1 - normal cell, 2,3,4,5 - successive stages of the development of apoptosis , 6 - cell apoptosis.

На фіг.2 зображено апоптоз в лейкемійних клітинах лінії І1210(5), індукований дією цисплатин. Для підтвердження наявності апопточних клітин проводили мікроскопування клітин при А,В - зображення у звичайному освітленні та після фарбування акридиновим оранжевим. Стрілками позначені клітини, піддані апоптозу. С - зображення при ультрафіолетовому світлі, 0 - зображення при змішаному (звичайному та ультрафіолетовому) освітленні. На С, ЮО виділені: внизу - нормальна клітина, вгорі - апоптична клітина розпадається на З апоптичні тільця.Figure 2 shows apoptosis in leukemic cells of line I1210(5), induced by the action of cisplatin. To confirm the presence of apoptotic cells, microscopy of cells was carried out under A, B - images in normal lighting and after staining with acridine orange. Cells undergoing apoptosis are indicated by arrows. C - image under ultraviolet light, 0 - image under mixed (normal and ultraviolet) lighting. C, SE are highlighted: below - a normal cell, above - an apoptotic cell disintegrating into C apoptotic bodies.

На фіг.3 зображено електрофореграму ДНК лейкемійних клітин лінії К562, апоптоз яких індукований дією цисплатини через 48 годин концентраціями: 1 - контроль, 2-0.1мкг/мл, 3-0.5мкг/мл, 4 - маркер ДНК.Fig. 3 shows the DNA electrophoregram of leukemia cells of the K562 line, the apoptosis of which is induced by the action of cisplatin after 48 hours with concentrations: 1 - control, 2-0.1μg/ml, 3-0.5μg/ml, 4 - DNA marker.

На фіг.4 зображено електрофореграму ДНК лейкемійних клітин лінії Ї. 1210(8), апоптоз яких індукований дією цисплатини через 48 годин концентраціями: 1 - контроль 2-0.05мкг/мл, 3-0.25мкг/мл, 4 - маркер ДНК.Fig. 4 shows the DNA electrophorogram of leukemic cells of the Y. 1210(8) line, the apoptosis of which is induced by the action of cisplatin after 48 hours with concentrations: 1 - control 2-0.05μg/ml, 3-0.25μg/ml, 4 - DNA marker.

На фіг.5 зображено розподіл за розмірами клітин лінії КОб2 в потоці рідини, одержаний вимірюванням розсіяння світла під кутом 90 градусів, апоптоз яких індукований дією цисплатини концентраціями 0 (крива 1), ов 0 (крива 2), 0.25 (крива 3), 0.5мкг/мл (крива 4).Fig. 5 shows the size distribution of cells of the KOb2 line in the liquid flow, obtained by measuring light scattering at an angle of 90 degrees, the apoptosis of which is induced by the action of cisplatin at concentrations of 0 (curve 1), ov 0 (curve 2), 0.25 (curve 3), 0.5 μg/ml (curve 4).

На фіг.б зображено відсотковий склад апоптичних клітин лінії К5бб2, індукованих дією цисплатини « концентраціями 0 (стовпчик 1), 0.1 (стовпчик 2), 0.25 (стовпчик 3), 0.5мкг/мл (стовпчик 4).Figure b shows the percentage composition of apoptotic cells of the K5bb2 line induced by the action of cisplatin at concentrations of 0 (column 1), 0.1 (column 2), 0.25 (column 3), 0.5 μg/ml (column 4).

На фіг.7 зображено функціональні залежності зміни відсоткового вмісту апоптичних клітин лінії К5б62, апоптоз яких індукований дією цисплатину концентраціями 0, 0.1, 0.25 і О.Бмкг/мл., одержані з розмірного о зо розподілу клітин вимірюванням розсіяння світла під кутом 90 градусів згідно фіг.5.Fig. 7 shows the functional dependence of changes in the percentage of apoptotic cells of the K5b62 line, the apoptosis of which is induced by the action of cisplatin at concentrations of 0, 0.1, 0.25 and 0.Bmkg/ml, obtained from the dimensional distribution of cells by measuring light scattering at an angle of 90 degrees according to Fig. .5.

На фіг.8 зображено розподіл за розмірами клітин лінії І1219(5) в потоці рідини, одержаний вимірюванням Ме розсіяння світла під кутом 90 градусів, апоптоз яких індукований дією цисплатини концентраціями 0 (крива 1), о 0.05 (крива 2), 0.1 (крива 3), 0.25 (крива 4).Fig. 8 shows the size distribution of the cells of the I1219(5) line in the liquid flow, obtained by measuring the light scattering Me at an angle of 90 degrees, the apoptosis of which is induced by the action of cisplatin at concentrations of 0 (curve 1), 0.05 (curve 2), 0.1 (curve 3), 0.25 (curve 4).

На фіг.9 зображено відсотковий склад апоптичних клітин лінії І/1210(8), індукованих дією цисплатини « концентраціями 0 (стовпчик 1), 0.05 (стовпчик 2), 0.1 (стовпчик 3), 0.25 (стовпчик 4). «оFigure 9 shows the percentage composition of apoptotic cells of line I/1210(8), induced by the action of cisplatin at concentrations of 0 (column 1), 0.05 (column 2), 0.1 (column 3), 0.25 (column 4). "at

На фіг.10 зображено функціональні залежності зміни відсоткового вмісту апоптичних клітин лінії І1210(5), апоптоз яких індукований дією цисплатину концентраціями 0, 0.05, 0.1 і 0.25мкг/мл., одержані з розмірного розподілу клітин вимірюванням розсіяння світла під кутом 90 градусів згідно фіг.8.Fig. 10 shows the functional dependence of changes in the percentage of apoptotic cells of the I1210(5) line, the apoptosis of which is induced by the action of cisplatin at concentrations of 0, 0.05, 0.1 and 0.25 μg/ml, obtained from the size distribution of cells by measuring light scattering at an angle of 90 degrees according to Fig. .8.

Кількісна оцінка апоптозу в клітинних суспензіях передбачає забезпечення подачі біологічних клітин в « потоці рідини з постійною швидкістю, проходження променя лазера Через потік рідини з досліджуваними з с клітинами так, щоб поперечний переріз променя в місці перетину його клітинами був більший ніж поперечний переріз досліджуваних клітин і його в часі могла перетинати лише одна клітина з подальшим визначенням ;» розмірного розподілу клітин, підданих апоптозу. Для цього попередньо здійснюється процедура калібрування пристрою. Вона полягає в побудові двомірного розподілу нормованих значень амплітуд та тривалостей реєстрованих імпульсів для кожної окремо взятої для калібрування сферичної синтетичної частинки з відомим б розміром і однаковим показником заломлення, для чого з потоком рідин за вибраний проміжок часу всі частинки при перетині перерізу променя реєструються шляхом вимірювання амплітуди і тривалості імпульсів, після чого ве реєстровані імпульси сортуються за амплітудою і тривалістю, для чого інтервал амплітуд поділяється на т о піддіапазонів і обмежуються знизу напругою рівня шумів фотоелектричної системи реєстрації, а зверху напругою 5р насичення вхідного підсилювача, а інтервал тривалостей поділяється на п піддіапазонів і обмежується часом і, проходження поперечного перерізу лазерного променя. Процедура находження розмірного розподілу клітин в о потоці рідини полягає у забезпеченні проведення вимірювань за однакових умов, як у випадку процедури калібрування, побудові на основі результатів вимірювань функції, яка б визначала статистичні характеристики розсіяного клітинами світла, і математичним способом розкласти дану функцію на складові, одержані в ов результаті процедури калібрування. Для того щоб виключити залежність кінцевих результатів від часу вимірювання, проводиться операція нормування. У випадку, коли процедура вимірювання передбачає дляQuantitative assessment of apoptosis in cell suspensions involves supplying biological cells in a fluid flow at a constant speed, passing a laser beam through the fluid flow with the cells under study in such a way that the cross section of the beam at the point of intersection with its cells is greater than the cross section of the cells under study and its only one cell with further definition could cross in time;" size distribution of cells subjected to apoptosis. To do this, the device calibration procedure is performed beforehand. It consists in constructing a two-dimensional distribution of the normalized values of the amplitudes and durations of the registered pulses for each spherical synthetic particle taken separately for calibration with a known size and the same refractive index, for which, with the flow of liquids for a selected time interval, all particles at the intersection of the beam cross section are registered by measuring the amplitude and duration of the pulses, after which the registered pulses are sorted by amplitude and duration, for which the amplitude interval is divided into t o subbands and limited from below by the noise level voltage of the photovoltaic registration system, and from above by the 5p saturation voltage of the input amplifier, and the duration interval is divided into n subbands and is limited by time and the passage of the cross section of the laser beam. The procedure for finding the size distribution of cells in the fluid flow consists in ensuring that measurements are carried out under the same conditions as in the case of the calibration procedure, constructing a function based on the measurement results that would determine the statistical characteristics of the light scattered by the cells, and mathematically decomposing this function into the components obtained as a result of the calibration procedure. In order to exclude the dependence of the final results on the measurement time, a normalization operation is performed. In the event that the measurement procedure provides for

Р одержання результату вимірювання проведення лише однієї операції заміру, процедура нормування полягає в проведенні операції ділення чисельного значення величини в кожному з піддіапазонів на суму чисельних значень величин в усіх піддіапазонах, на які розбиті інтервали амплітуд і тривалостей зареєстрованих імпульсів. У бо Випадку, коли процедура вимірювання передбачає для одержання результату вимірювання проведення принаймні двох операцій заміру: основного і повірочного, процедура нормування полягає в операції ділення чисельних значень величин в кожному з піддіапазонів, на які розбиті інтервал амплітуд і тривалостей зареєстрованих імпульсів для операцій заміру основної і повірочної на час заміру даної операції, Її подальшим відніманням в кожному піддіапазоні чисельних значень величин, отриманих для повірочного заміру від 65 /Контрольного заміру і проведенні операції ділення чисельного значення величини в кожному з піддіапазонів на суму чисельних значень величин в усіх піддіапазонах, на які розбиті інтервали амплітуд і тривалостей зареєстрованих імпульсів. По нормованих значеннях чисельних величин амплітуд та тривалостей реєстрованих імпульсів будується матриця-стовбець виду А (т,п,), елемент якої а (т,п,) рівний нормованому значенню амплітуд та тривалостей реєстрованих імпульсів. Визначення розподілу клітин по розмірах в потоці рідини здійснюється шляхом побудови двомірного розподілу амплітуд і тривалостей зареєстрованих імпульсів розсіяного світла клітинами у піддіапазонах з межами, як у випадку зондування частинок, вибраних для калібрування, нормуванням чисельних значень величин амплітуди та тривалості імпульсів в кожному з піддіапазонів, побудовою по нормованих значеннях матриці виду В(т,п). Розподіл клітин за розмірами в потоці рідини визначається шляхом розв'язку рівнянняObtaining the measurement result of carrying out only one measurement operation, the normalization procedure consists in carrying out the operation of dividing the numerical value of the quantity in each of the sub-ranges by the sum of the numerical values of the quantities in all sub-ranges, into which the intervals of the amplitudes and durations of the registered pulses are divided. In the event that the measurement procedure involves at least two measurement operations to obtain the measurement result: the main and the verification one, the normalization procedure consists in the operation of dividing the numerical values of the quantities in each of the sub-ranges into which the interval of amplitudes and durations of the registered pulses for the main and verification operations are divided. verification at the time of measurement of this operation, its further subtraction in each sub-range of the numerical values of the quantities obtained for the verification measurement from 65/Control measurement and carrying out the operation of dividing the numerical value of the quantity in each of the sub-ranges by the sum of the numerical values of the quantities in all the sub-ranges into which the intervals are divided amplitudes and durations of registered pulses. Based on the normalized values of the numerical values of the amplitudes and durations of the registered pulses, a matrix-column of the form A (t,n,) is constructed, the element of which a (t,n,) is equal to the normalized value of the amplitudes and durations of the registered pulses. Determination of the size distribution of cells in the fluid flow is carried out by constructing a two-dimensional distribution of amplitudes and durations of registered pulses of scattered light by cells in sub-ranges with boundaries, as in the case of probing particles selected for calibration, by normalizing the numerical values of the amplitude and duration of pulses in each of the sub-ranges, by constructing by the normalized values of the matrix of the form B(t,n). The size distribution of cells in the fluid flow is determined by solving the equation

ІВ(тьп) - УА (тт 0, : де і - кількість вибраних для калібрування сферичних синтетичних частинок з відомими розмірами і однаковим показником заломлення, | - порядковий номер елементу та | 5 і, АдДт,п,) - квадратична матриця, елемент якої ад(т,п,) виражає статистичні характеристики інтенсивності розсіяного світла для окремо вибраної сферичної синтетичної частинки з заданим розміром і показником заломлення, й - стала величина, в межах від О до 1.IV(tp) - UA (tt 0, : where i is the number of spherical synthetic particles with known dimensions and the same refractive index selected for calibration, | is the serial number of the element and | 5 i, AdDt,n,) is a quadratic matrix, the element of which ad(t,p,) expresses the statistical characteristics of the intensity of scattered light for an individually selected spherical synthetic particle with a given size and refractive index, and is a constant value ranging from О to 1.

Кількісна оцінка апоптозу в клітинних суспензіях досягається визначенням параметра апоптичний індекс, який рівний значенню б, яке в розмірному розподілі досліджуваних клітин виражає кількісний вміст вибраних для калібрування сферичних синтетичних частинок, максимум яких з двох можливих максимумів в одержаному розмірному розподілі клітин рівний мінімальному значенню.Quantitative assessment of apoptosis in cell suspensions is achieved by determining the parameter apoptotic index, which is equal to the value b, which in the size distribution of the studied cells expresses the quantitative content of spherical synthetic particles selected for calibration, the maximum of which of the two possible maximums in the obtained size distribution of cells is equal to the minimum value.

Якісна оцінка апоптозу в клітинних суспензіях полягає в побудові функціональної залежності зміни параметра апоптичний індекс. У випадку, коли апоптоз індукується субстанцією, визначають функціональну залежність зміни параметра апоптичний індекс від концентрації субстанції. У випадку, коли функціональна залежність зміни параметра апоптичний індекс має монотонно зростаючий вид, стверджують про апоптозо-індуковану активність субстанції. «Qualitative assessment of apoptosis in cell suspensions consists in constructing a functional dependence of changes in the apoptotic index parameter. In the case when apoptosis is induced by a substance, the functional dependence of the change in the apoptotic index parameter on the concentration of the substance is determined. In the case when the functional dependence of the change in the apoptotic index parameter has a monotonically increasing form, the apoptosis-induced activity of the substance is claimed. "

Можливість реалізації способу покажемо на наступних прикладах.We will show the possibility of implementing the method in the following examples.

Приклад 1.Example 1.

Дослідження апоптозу лімфобластичних клітин лінії К562 лімфоцитарної лейкемії людини, АТСС номер: ав! ССІ-219, індукованого цисплатином. Нормальні клітини лінії К5б2 є округлими суспензійними частинками із середнім діаметром 4,бмкм. Клітини висівали у флакони Кароля в концентрації 200000од/мл, використовуючи о культуральне середовище КРМІ-1640 з додаванням 1095 ембріональної бичачої сироватки, при цьому ретельно «3 суспендовували 10-15 разів для уникнення утворення клітинних агрегатів. Через 24 години для індукції апоптозу до клітин додавали протипухлинний препарат цисплатин (цис-диамінодихлороплатина), у зростаючих З Концентраціях 0, 0,1 0,25 і О,бмкг/мл клітинної суспензії. Клітини знову суспендовували. В подальшому для Ге) підтвердження апоптозу клітини фарбували акридиновим оранжевим, який при збудженні ультрафіолетовим світлом викликає флюоресценцію РНК в червоній області спектра і флюоресценцію ДНК у жовто-зеленій області спектра. На фіг.1(А) зображено апоптоз лейкемійних клітин лінії К562, індукований дією препарату цисплатин, « одержаних зображенням в ультрафіолетовому світлі імерсійного препарату клітин, фарбованих акридиновим оранжевим, збільшення 7900. На фіг.1(Б) - комп'ютерний аналіз зображення на фіг.1(А). Цифрами позначено й) с морфологічні зміни клітин лінії КОб2 в процесі апоптозу: 1- нормальна клітина; 2, З, 4, 5 - послідовні етапи ц розвитку апоптозу, 6 - апоптоз клітини. Бачимо фрагментацію ядра та цитоплазми клітини, чотири апоптичні "» тільця на стадії розділення. Підтвердженням апоптозу є дані електрофорезу клітинної ДНК на агарному гелі. На фіг3 зображено електрофореграма ДНК лейкемійних клітин лінії К5б2, апоптоз яких індукований дією цисплатини через 48 годин концентраціями: 1 - контроль, 2-0.1мкг/мл, 3-0.5мкг/мл, 4 - маркер ДНК. Як бачимо, б під дією цисплатини спостерігається виражена і виключно апоптична картина загибелі, що відображає їх фрагментацію ДНК з утворенням так званої "драбини ДНК" - характерного біохімічного маркера апоптозу.Study of apoptosis of lymphoblastic cells of the K562 line of human lymphocytic leukemia, ATCC number: av! Cisplatin-induced SSI-219. Normal cells of the K5b2 line are rounded suspension particles with an average diameter of 4.μm. Cells were sown in Karol vials at a concentration of 200,000 units/ml, using the KRMI-1640 culture medium with the addition of 1095 fetal bovine serum, while thoroughly suspending the mixture 10-15 times to avoid the formation of cell aggregates. After 24 hours, to induce apoptosis, the antitumor drug cisplatin (cis-diaminodichloroplatinum) was added to the cells in increasing concentrations of 0, 0.1, 0.25 and 0.bmcg/ml of cell suspension. Cells were resuspended. Subsequently, for Ge) confirmation of apoptosis, cells were stained with acridine orange, which when excited by ultraviolet light causes fluorescence of RNA in the red region of the spectrum and fluorescence of DNA in the yellow-green region of the spectrum. Fig. 1(A) shows apoptosis of leukemic cells of the K562 line, induced by the action of the drug cisplatin, obtained by imaging in ultraviolet light the immersion drug of cells stained with acridine orange, magnification 7900. Fig. 1(B) - computer analysis of the image on Fig. 1(A). The numbers indicate morphological changes of cells of the KOb2 line during apoptosis: 1- normal cell; 2, C, 4, 5 - consecutive stages of the development of apoptosis, 6 - cell apoptosis. We see the fragmentation of the nucleus and cytoplasm of the cell, four apoptotic "" bodies at the separation stage. Apoptosis is confirmed by the data of electrophoresis of cellular DNA on an agar gel. Fig. 3 shows the DNA electrophorogram of leukemia cells of the K5b2 line, the apoptosis of which is induced by the action of cisplatin after 48 hours with the following concentrations: 1 - control , 2-0.1μg/ml, 3-0.5μg/ml, 4 - a DNA marker. As we can see, under the action of cisplatin, a pronounced and exclusively apoptotic pattern of death is observed, which reflects their DNA fragmentation with the formation of a so-called "DNA ladder" - a characteristic biochemical marker of apoptosis.

Кількісна оцінка апоптичних клітин лінії К5б2 за аналізом розсіяного світла клітинами під кутом 90 ав! градусів проводилась так. Суспендовані клітини лінії К562, після додавання для індукції апоптозу препарату цисплатини у зростаючих концентраціях 0, 0.1 0.25 і О0.5мкг/мл клітинної суспензії, розводили у стерильному ї-о фізіологічному розчині (0,995 розчин натрію хлориду) до концентрації 25000кл/мл. Для цього брали стерильний с 0,995 розчин натрію хлориду для ін'єкцій у вену в посудині ємністю 200мл, герметично закритий гумовим корком з алюмінієвим ободом, який серійно випускається фармацевтичною промисловістю (в нашому випадку використовувався фізіологічний розчин виробництва ДП "Львівдіалік", м. Львів). Набирали стерильним шприцом 2 Мміллілітри клітинної суспензії, вводили його у посудину з 0,995 розчином натрію хлориду і поміщали у пристрій, що забезпечує подачу потоку рідини з постійною швидкістю в інтервалі від О,0їмл/сек до 1,Омл/секQuantitative assessment of apoptotic cells of the K5b2 line based on the analysis of scattered light by cells at an angle of 90 av! degrees was conducted as follows. Suspended cells of the K562 line, after the addition of the drug cisplatin in increasing concentrations of 0, 0.1, 0.25 and 0.5 μg/ml of cell suspension to induce apoptosis, were diluted in a sterile saline solution (0.995 sodium chloride solution) to a concentration of 25,000 kl/ml. For this, a sterile 0.995 sodium chloride solution for intravenous injections was taken in a 200 ml container, hermetically closed with a rubber stopper with an aluminum rim, which is serially produced by the pharmaceutical industry (in our case, the physiological solution produced by Lvivdialik SE, Lviv) was used. . 2 milliliters of cell suspension were collected with a sterile syringe, introduced into a vessel with 0.995 sodium chloride solution and placed in a device that provides a constant flow of liquid in the range from 0.0 ml/sec to 1.0 ml/sec

Р» через поперечний переріз променя Не-Ме лазера на довжині випромінювання 632,8нм. При цьому поперечний переріз променя в місці перетину його потоком рідини фокусувався в пляму діаметром 55...б6Омкм, є більшим ніж поперечний переріз досліджуваних клітин і його в часі могла перетинати лише одна клітина. Результати бо вимірювань розмірного розподілу клітин лінії Коб2 в потоці рідини пристроєм, який попередньо калібрований синтетичними сферичними полістирольними частинками з показником заломлення п-1.56, апоптоз яких індукований дією цисплатини концентраціями 0 (крива 1), 0.1 (крива 2), 0.25 (крива 3) і О.5мкг/мл (крива 4), наведені на фіг.5. Оцінка апоптозу за параметром апоптичний індекс проводилась шляхом визначення відсоткового вмісту апоптичних клітин для кожної з наведених концентрацій цисплатини. Для цього для кожної 65 Кривої розмірного розподілу клітин розраховувалась площа під кожним з двох максимумів на кривих розподілу.P" through the cross-section of the Ne-Me laser beam at the radiation length of 632.8 nm. At the same time, the cross-section of the beam at the point of its intersection with the liquid flow was focused into a spot with a diameter of 55...b6Ωm, which is larger than the cross-section of the studied cells and could be crossed by only one cell in time. The results of measurements of the size distribution of cells of the Kob2 line in the liquid flow using a device pre-calibrated with synthetic spherical polystyrene particles with a refractive index of n-1.56, the apoptosis of which is induced by the action of cisplatin at concentrations of 0 (curve 1), 0.1 (curve 2), 0.25 (curve 3) and O.5μg/ml (curve 4), shown in Fig.5. Assessment of apoptosis according to the apoptotic index parameter was carried out by determining the percentage of apoptotic cells for each of the given concentrations of cisplatin. For this, the area under each of the two maxima on the distribution curves was calculated for each 65 Curve of the size distribution of cells.

Відсотковий вміст апоптичних клітин визначався шляхом відношення розрахованої площі під максимумом в області менших розмірів до загальної площі під обома максимумами. На фіг.б наведено відсотковий вміст апоптичних клітин лінії К562, індукованих до апоптозу дією цисплатини концентраціями 0 (стовпчик 1), 0.1 (стовпчик 2), 0.25 (стовпчик 3) і О.5мкг/мл (стовпчик 4).The percentage of apoptotic cells was determined by the ratio of the calculated area under the maximum in the area of smaller sizes to the total area under both maxima. Figure b shows the percentage of apoptotic cells of the K562 line induced to apoptosis by the action of cisplatin at concentrations of 0 (column 1), 0.1 (column 2), 0.25 (column 3) and 0.5 μg/ml (column 4).

Якісна оцінка апоптозу клітин лінії К5б2, індукованого дією цисплатини, проводилась по виду функціональної залежності зміни параметра апоптичний індекс від концентрації цисплатини. Для цього будувалась графічна залежність розрахованих значень параметра апоптичний індекс згідно процедури кількісна оцінка апоптозу, описаної вище, від концентрації індукуючої апоптоз субстанції. На фіг.7 наведена побудована по одержаних даних графічна залежність відсоткового вмісту апоптичних клітин лінії К562 від концентрації 7/0 Чисплатини. Бачимо поступово зростаючий характер функціональної залежності зміни кривої, що свідчить про апоптозо-індуковану активність цисплатини стосовно клітин лінії К562.Qualitative assessment of apoptosis of cells of the K5b2 line, induced by the action of cisplatin, was carried out according to the functional dependence of the change of the apoptotic index parameter on the concentration of cisplatin. For this, a graphical dependence of the calculated values of the apoptotic index parameter was constructed according to the procedure for quantitative assessment of apoptosis, described above, on the concentration of the apoptosis-inducing substance. Fig. 7 shows the graphical dependence of the percentage of apoptotic cells of the K562 line on the concentration of 7/0 Chisplatin, built on the basis of the obtained data. We see the gradually increasing nature of the functional dependence of the change in the curve, which indicates the apoptosis-induced activity of cisplatin in relation to cells of the K562 line.

Приклад 2.Example 2.

Дослідження апоптозу лімфобластичних клітин лінії І 1210(5З)лімфоцитарної лейкемії миші, АТСС номер:Study of apoptosis of lymphoblastic cells of line I 1210(5Z) lymphocytic leukemia of the mouse, ATCC number:

ССІ-219, індукованого цисплатином. Нормальні клітини лінії Ї/1210(5) являють собою округлі суспензійні /5 частинки із середнім діаметром 4,бмкм. Клітини висівали у флакони Кароля в концентрації 20000Окл/мл, використовуючи культуральне середовище КРМІ-1640 з додаванням 1095 ембріональної бичачої сироватки, при цьому ретельно суспендовували 10-15 разів для уникнення утворення клітинних агрегатів. Через 24 години для індукції апоптозу до клітин додавали протипухлинний препарат цисплатин (цис-диамінодихлороплатина), у зростаючих концентраціях 0, 0.05, 0.1 і 0.25мкг/мл клітинної суспензії. Клітини знову суспендовували. Через 48 годин проводили мікроскопічні дослідження клітин під люмінесцентним мікроскопом шляхом їх фарбування акридиновим оранжевим та етидій бромідом. На фіг.2 зображено апоптоз лейкемійних клітин лінії І 1210(8), індукований дією цисплатин. А, В - зображення у звичайному освітленні та після фарбування акридиновим оранжевим. Стрілками позначені клітини, піддані апоптозу. С - зображення при ультрафіолетовому світлі, О - зображення при змішаному (звичайному та ультрафіолетовому) освітленні. На С, О виділені: внизу - нормальна об Клітина, вгорі - апоптична клітина розпадається на З апоптичні тільця. Для підтвердження апоптозу використовували електрофорез в агарному гелі клітинної ДНК. На фіг.4 зображено електрофореграма ДНК « лейкемійних клітин лінії І 1210(8), апоптоз яких індукований дією цисплатини через 48 годин концентраціями: 1 - контроль, 2-0.05мкг/мл, 3-0.25мкг/мл, 4 - маркер ДНК. Як бачимо, під дією цисплатини спостерігається чітка апоптична картина загибелі клітин з утворенням так званої "драбини ДНК" -характерного біохімічного маркера о зо апоптозу.Cisplatin-induced SSI-219. Normal cells of the Y/1210(5) line are rounded suspension particles with an average diameter of 4.μm. Cells were seeded in Karol vials at a concentration of 20,000 Ocl/ml, using culture medium KRMI-1640 with the addition of 1095 fetal bovine serum, while carefully suspending 10-15 times to avoid the formation of cell aggregates. After 24 hours, to induce apoptosis, the antitumor drug cisplatin (cis-diaminodichloroplatinum) was added to the cells in increasing concentrations of 0, 0.05, 0.1, and 0.25 μg/ml of cell suspension. Cells were resuspended. After 48 hours, microscopic studies of cells were carried out under a fluorescent microscope by staining them with acridine orange and ethidium bromide. Figure 2 shows the apoptosis of leukemic cells of line I 1210(8), induced by the action of cisplatin. A, B - images in normal lighting and after staining with acridine orange. Cells undergoing apoptosis are indicated by arrows. C - image under ultraviolet light, O - image under mixed (normal and ultraviolet) lighting. On C, O are highlighted: below - a normal cell, above - an apoptotic cell disintegrates into C apoptotic bodies. Cell DNA agar gel electrophoresis was used to confirm apoptosis. Fig. 4 shows a DNA electrophorogram of leukemic cells of line I 1210(8), the apoptosis of which is induced by the action of cisplatin after 48 hours with concentrations: 1 - control, 2-0.05μg/ml, 3-0.25μg/ml, 4 - DNA marker. As we can see, under the action of cisplatin, a clear apoptotic pattern of cell death with the formation of the so-called "DNA ladder" - a characteristic biochemical marker of apoptosis - is observed.

Кількісна оцінка апоптичних клітин лінії Ї1210(5) за аналізом розсіяного світла клітинами під кутом 90 Ме градусів проводилась так. Суспендовані клітини лінії І1210(5), після додавання для індукції апоптозу о препарату цисплатини у зростаючих концентраціях 0, 0.05, 0.1 і 0.25мкг/мл клітинної суспензії, розводили у стерильному фізіологічному розчині (0,995 розчин натрію хлориду) до концентрації 25000кл/мл. Для цього брали - стерильний 0,995 розчин натрію хлориду для ін'єкцій у вену в посудині ємністю 200мл, герметично закритий «о гумовим корком з алюмінієвим ободом, який серійно випускається фармацевтичною промисловістю (в нашому випадку використовувався фізіологічний розчин виробництва ДП "Львівдіалік", м.Львів). Набирали стерильним шприцом 2 міллілітри клітинної суспензії, вводили його у посудину з 0,995 розчином натрію хлориду і поміщали у пристрій, що забезпечує подачу потоку рідини з постійною швидкістю в інтервалі від О,Тмл/сек до 1Омл/сек « через поперечний переріз променя Не-Ме лазера на довжині випромінювання 632,8нм. При цьому поперечний з с переріз променя в місці перетину його потоком рідини фокусувався в пятно діаметром 55...60мкм, був більший ніж поперечний переріз досліджуваних клітин і його в часі могла перетинати лише одна клітина. Результати ;» вимірювань розмірного розподілу клітин лінії І1210(5) в потоці рідини пристроєм, який попередньо калібрований синтетичними сферичними полістирольними частинками з показником заломлення п-1.56, апоптоз яких індукований дією цисплатини концентраціями 0 (крива 1), 0.1 (крива 2), 0.25 (крива 3) і О.5мкг/мл (крива 4),Quantitative assessment of apoptotic cells of the Y1210(5) line based on the analysis of scattered light by cells at an angle of 90 degrees was carried out as follows. Suspended cells of the I1210(5) line, after addition of cisplatin in increasing concentrations of 0, 0.05, 0.1 and 0.25 μg/ml of cell suspension to induce apoptosis, were diluted in sterile physiological solution (0.995 sodium chloride solution) to a concentration of 25,000 kl/ml. For this, they took - a sterile 0.995 solution of sodium chloride for intravenous injections in a 200 ml container, hermetically closed with a rubber stopper with an aluminum rim, which is serially produced by the pharmaceutical industry (in our case, the physiological solution produced by SE "Lvivdialik", m. Lviv). 2 milliliters of cell suspension were collected with a sterile syringe, injected into a vessel with 0.995 sodium chloride solution and placed in a device that provides a flow of liquid at a constant rate in the range from 0.Tml/sec to 1Oml/sec through the cross section of the Ne-Me beam laser at a radiation length of 632.8 nm. At the same time, the cross-section of the beam at the point of its intersection with the liquid flow was focused into a spot with a diameter of 55...60 μm, was larger than the cross-section of the studied cells, and only one cell could cross it in time. Results ;" measurements of the size distribution of cells of the I1210(5) line in the liquid flow using a device pre-calibrated with synthetic spherical polystyrene particles with a refractive index of n-1.56, the apoptosis of which is induced by the action of cisplatin at concentrations of 0 (curve 1), 0.1 (curve 2), 0.25 (curve 3 ) and O.5μg/ml (curve 4),

Ге» наведені на фіг.8. Оцінка апоптозу за параметром апоптичний індекс проводилась шляхом визначення відсоткового вмісту апоптичних клітин для кожної з наведених концентрацій цисплатини. Для цього для кожної ве кривої розмірного розподілу клітин розраховувалась площа під кожним з двох максимумів на кривих розподілу. о Відсотковий вміст апоптичних клітин визначався шляхом відношення розрахованої площі під максимумом в області менших розмірів до загальної площі під обома максимумами. На фіг.Унаведено відсотковий вміст ік апоптичних клітин лінії І 1219(5), індукованих до апоптозу дією цисплатини концентраціями 0 (стовпчик 1), 0.1 о (стовпчик 2), 0.25 (стовпчик 3) і О.5мкг/мл (стовпчик 4).Ge" are shown in Fig. 8. Assessment of apoptosis according to the apoptotic index parameter was carried out by determining the percentage of apoptotic cells for each of the given concentrations of cisplatin. For this, the area under each of the two maxima on the distribution curves was calculated for each cell size distribution curve. o The percentage of apoptotic cells was determined by the ratio of the calculated area under the maximum in the area of smaller sizes to the total area under both maxima. The figure shows the percentage of IC of apoptotic cells of line I 1219(5), induced to apoptosis by the action of cisplatin at concentrations of 0 (column 1), 0.1 o (column 2), 0.25 (column 3) and 0.5 μg/ml (column 4) .

Якісна оцінка апоптозу клітин лінії /1210(5), індукованого дією цисплатини, проводилась по виду функціональної залежності зміни параметра апоптичний індекс від концентрації цисплатини. Для цього будувалась графічна залежність розрахованих значень параметра апоптичний індекс згідно процедури кількісна оцінка апоптозу, описаної вище, від концентрації індукуючої апоптоз субстанції. На фіг. 6(В) наведенаQualitative assessment of apoptosis of cells of line /1210(5), induced by the action of cisplatin, was carried out according to the functional dependence of the change of the apoptotic index parameter on the concentration of cisplatin. For this, a graphical dependence of the calculated values of the apoptotic index parameter was constructed according to the procedure for quantitative assessment of apoptosis, described above, on the concentration of the apoptosis-inducing substance. In fig. 6(B) is given

Р побудована по одержаних даних графічна залежність відсоткового вмісту апоптичних клітин лінії І 1210(5) від концентрації цисплатини. Бачимо поступово зростачий характер функціональної залежності зміни кривої, що свідчить про апоптозо-індуковану активність цисплатини стосовно клітин лінії І 1210(5).P is a graphical dependence of the percentage of apoptotic cells of line I 1210(5) on the concentration of cisplatin based on the obtained data. We see the gradually increasing nature of the functional dependence of the change in the curve, which indicates the apoptosis-induced activity of cisplatin in relation to cells of the I 1210(5) line.

Claims

The formula of the invention

The method of quantitative and qualitative assessment of apoptosis in cell suspensions, which includes the introduction of biological

65 cells in a fluid flow at a constant speed, the passage of a laser beam through the fluid flow with the cells under study and the registration of pulses of scattered light, which is distinguished by the fact that the measuring device is pre-calibrated, after which the pulses of scattered light are recorded at an angle in the range from 2 to 358 degrees, normalize the measurement results, determine the size distribution of cells, the parameter is the apoptotic index and its functional dependence by solving the equation W n) - U fifit n - 0, Y where and - the number of spherical synthetic particles with known dimensions and the same refractive index selected for calibration , | - the serial number of the element and ii, Art) - a square matrix, the 70th element of which ati) expresses the statistical characteristics of the intensity of scattered light for a separately selected spherical synthetic particle with a given size and refractive index, Fi - a constant value, in the range from 0.00001 to 1 . " "c) (o) "c) " (Se)

- and? (o) sh" ("c) se) (42) 60 b5