TWI548748B - 造血幹／先驅細胞之體外放大培養方法及其立即可使用之組成物 - Google Patents

造血幹／先驅細胞之體外放大培養方法及其立即可使用之組成物 Download PDF

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Description

造血幹/先驅細胞之體外放大培養方法及其立即可使用之組成物
本發明係關於一種高度純化並可立即使用之體外放大培養造血幹/前驅細胞的製備方法及其組成物。更特別地，本發明係關於一種將利用梯度離心純化所得之單核球細胞先經過隔夜培養後，再進行造血幹/前驅細胞純化及體外放大培養的方法。經由本發明方法製得之高純化造血幹/前驅細胞，不僅含有高比例臨床上之有效造血幹/前驅細胞(CD34+CD38-細胞)，且於其純化及製造過程中並未使用含動物來源成分之試劑，因此所得之造血幹/前驅細胞培養物可直接施用於臨床應用。
造血幹細胞(Hematopoietic stem cells；HSCs)係所有成熟血球之前身，具有自我更新與分化成不同造血細胞系的能力(Blood,Vol.89,No.12,1997：pp4337-4347)。迄今，造血幹細胞移植(Hematopoietic stem cells transplantation；HSCT)已為廣泛應用於血液疾病與先天性遺傳疾病等治療。一般而言，於臨床上較合適之造血幹細胞來源包含：骨髓(Bone marrow)、週邊血(Peripheral blood)以及臍帶血(Umbilical cord blood)。早期的骨髓幹細胞抽取方式常伴隨極度疼痛不適之步驟，逐漸以週邊血作為造血幹細胞移植之來源，但因配對不易，故近年來常以臍帶血作為造血幹細 胞移植之來源選擇。
CD34係一種表現於人類造血幹細胞的表面抗原，通常被作為造血幹細胞的指標，臨床上已有研究證明移植CD34+細胞數量之多寡與移植後存活率和成功率成正比(Moore KA,et al.Blood.1997；89：4337-4347)，隨著研究進一步發現，於細胞表面表現CD34而未帶有CD38抗原的細胞(CD34+CD38-細胞)係真正主要具有效用之造血幹細胞。
雖說臍帶血造血幹細胞移植在臨床應用上已有良好成效，但在臨床上移植造血幹細胞之數量，有核細胞(Total nuclear cells；TNC)至少需達到2x107cells/kg或CD34+細胞達到2x105cells/kg，而所遇到之課題為：臍帶血所能取得之造血幹細胞數量極有限，因此，已有許多致力於造血幹細胞體外擴增放大之技術研究。
舉例而言，美國專利申請號US11/255,191係揭露一種提供造血幹細胞體外擴增及其分析方法，係利用加入各種有效含量的細胞激素培養造血幹細胞，並提供一用於鑑定分離造血幹細胞之試劑盒；日本專利申請號JP2010188594為造血幹細胞之製造方法，則係利用添加一擴增試劑至培養基中以放大造血幹細胞數；以及，中國專利申請號CN2012100087227係提供一種以血管內皮細胞靶向的Notch配體的可溶性融合蛋白人D111-RGD(hD111-RGD)體外擴增造血幹細胞之方法。另，除了於培養階段促進造血幹細胞增生以增其數量外，中華民國專利申請號第 098115726號，揭示用於分離、體外擴增及收獲造血幹細胞的方法與系統，係可快速分離出造血幹細胞並進行體外擴增以提高造血幹細胞獲取效率。
目前已知的體外擴增造血幹細胞之方法，主要係於培養基中添加各種不同物質，如細胞激素、化合物及重組蛋白等來促使造血幹細胞增生。然而，大部分造血幹細胞之培養時間需長達7天甚至於2週以上，並無法在短期間內獲取臨床上有效之造血幹細胞(CD34+CD38-細胞)族群。由於造血幹細胞之來源極其珍貴且脆弱，因此如何於有效提升造血幹細胞之回收率與產率，以及如何將獲取不易之造血幹細胞作有效保存，成為體外擴增造血幹細胞的核心關鍵。
於是，本發明之一方面在於提供一種高度純化並可立即使用之體外培養造血幹/前驅細胞之製備方法，其特徵在於：以傳統密度梯度離心純化單核球細胞後，透過隔夜培養使單核球細胞活性恢復，進而於隔日純化造血幹/前驅細胞，藉以大幅提高造血幹/前驅細胞的回收率。
於本發明之某些具體實施例，所述之製備方法包含：將含有造血幹/前驅細胞之來源血液解凍，以梯度離心進行單核球純化，獲取高純度單核球細胞並進行隔夜培養；將經過隔夜培養之單核球細胞進行分離純化得到高純度造血幹/前驅細胞，並將其培養於含有細胞激素及TAT-HOXB4之IMDM/5% HABS培養 液中培養4-7天，收取造血幹/前驅細胞培養物。於本發明之另一項具體實施例，所述之”隔夜培養”係將單核球細胞以細胞密度5x105-6x106cells/mL培養於IMDM/5% HABS培養液中16-18小時。又，於本發明之另一項具體實施例，其中該造血幹/前驅細胞之來血液為源血液為週邊血(Peripheral blood)或臍帶血(Umbilical cord blood)。
於本發明之一項具體實施例，係將高純度造血幹/前驅細胞以細胞密度1x104-5x105cells/mL培養於含有細胞激素及TAT-HOXB4之IMDM/5% HABS培養液中培養4-7天，之後收取造血幹/前驅細胞培養物。於本發明之另一項具體實施例，所述之細胞激素包含間白素-3(IL-3)、間白素-6(IL-6)、SCF、FLT-3L及血小板生成素(TPO)。
另一方面，本發明之製備方法進一步包含：將所得之體外培養造血幹/前驅細胞以含有24-80% Albuminar®-25及20% CryoSure-DEX40(內含6-20%人類白蛋白)之保存劑進行冷凍保存。
又另一方面，本發明提供一種根據本發明之製備法所製得之組成物，其特徵在於包含臨床上有效造血幹/前驅細胞(CD34+CD38-細胞)之百分比例為15-40%；於本發明之一具體較佳實施例，其百分比例為25-30%。且所述臨床上有效造血幹/前驅細胞(CD34+CD38-細胞)之比例與未經體外培養之造血幹/前驅細胞族群比較可提高3-5倍。於本發明之另一較佳具體實施例，所製得之 組成物中臨床上有效造血幹/前驅係胞(CD34+CD38-細胞)之百分比可高達27%，且相較於未經體外培養之造血幹/前驅細胞族群，可提高3.8倍。
第1圖係利用流式細胞儀分析以不同純化步驟之造血幹/前驅細胞的回收率。
第2圖係以3種不同成分之細胞培養液培養高純度造血幹/前驅細胞4天後之增生倍率比較：第2(A)圖係有核細胞總數(Total nuclear cell,TNC)擴增倍率；第2(B)圖則係CD34+細胞數量擴增倍率。
第3圖係利用流式細胞儀分析以不同成分之細胞培養液及不同細胞密度條件培養下所增生的造血幹/前驅細胞族群比例之比較。
第4圖係比較不同培養密度對於造血幹/前驅細胞擴增影響分析：第4(A)圖係有核細胞總數(Total nuclear cell,TNC)擴增倍率；第4(B)圖係CD34+細胞數量擴增倍率。
第5圖係比較不同保存劑對於造血幹/前驅細胞族群之穩定度分析：第5(A)圖為細胞存活率分析；第5(B)圖為利用流式細胞儀分析造血幹/前驅細胞族群比例。
本發明之其他特色及優點將於下列實施例中為進一步舉例說明，但該實施例僅為輔助，並非用於限制本發明之範圍。
實施例一、造血幹/前驅細胞之純化及回收
本發明之一方面特徵點在於，透過純化及隔夜培養單核球細胞，藉以提高造血幹/前驅細胞之回收率。因此於本實施例所進行之實驗分為兩個處理組，一組為將含有造血幹/前驅細胞之來源血液解凍，其來源血液可為臍帶血或週邊血；先離心移除DMSO後加入Ficoll-Paque以梯度密度離心純化出單核球細胞，並於當日純化分離造血幹/先驅細胞。純化分離造血幹/先驅細胞方式如下：將前述之純化單核球細胞收集離心後回溶於300μl 1X PBS或含0.5%人類白蛋白之生理食鹽水中，而後加入100μl FcR blocking buffer及100μl CD34磁珠混合均勻後置於4℃以翻轉狀態作用30分鐘；作用完畢後再加入5mL 4℃ 1X PBS或含0.5%人類白蛋白之生理食鹽水稀釋，以4-12℃離心轉速300g離心10分鐘沉澱。再以3mL的1XPBS或含0.5%人類白蛋白之生理食鹽水回溶細胞並加入架於磁座的管柱中，再以5mL的1XPBS或含0.5%人類白蛋白之生理食鹽水清洗管柱三次；最後將其移開磁座，加入5mL的1XPBS或含0.5%人類白蛋白之生理食鹽水並使用活塞將管柱中被CD34磁珠免疫沉澱之細胞壓出，即純化分離出造血幹/先驅細胞。
另一組則係將如前述之以梯度密度離心方法純化出單核球細胞，加入或未加入紅血球裂解液進行紅血球裂解，而獲取單核球細胞；並且，以細胞密度5x105-6x106cells/mL回溶於IMDM/5%HABS培養液當中，並置於培養皿，於37℃ 5%CO2培養 箱中培養16至18小時，之後再於培養隔日再進行純化分離造血幹/先驅細胞。
將上述之處理組分別利用流式細胞儀進行分析，可得單核球細胞群落及經過純化分離之造血幹/前驅細胞細胞群落的分析結果。以上結果如第1圖所示，可觀察到上述處理組間之單核球細胞純化率並無差別，而在將來源血液解凍的當日即直接純化分離造血幹/先驅細胞之處理組，其造血幹/先驅細胞純度為13.5%；相較於自經過隔夜培養之單核球細胞處理組，其造血幹/先驅細胞之比例則皆高達76.2%以上，且依本發明之較佳具體實施例，造血幹/先驅細胞之比例已可達92%。以上實驗可證明，透過本發明隔夜培養單核球細胞之方法，可使單核球細胞因細胞解凍變化之損傷獲得恢復活性，而提升了造血幹/先驅細胞之回收純度。
實施例二、造血幹/先驅細胞之體外擴增培養
除了改良純化方法以提高細胞純化回收率外，特殊之細胞培養液成分亦或是細胞培養之密度皆為影響造血幹/先驅細胞之體外擴增培養重要因素，故本發明亦針對以上影響因素進行實驗。將如前述之實施例所純化的高純度造血幹/前驅細胞分別培養於含有不同細胞激素成分之IMDM/5% HABS培養液中培養4天，並進行細胞增生倍率分析比較。實驗中係將處理組依其所包含之細胞培養液成分區分為以下3組，(1)處理組別1：含有5ng/mL IL-3、10ng/mL IL-6、50ng/mL SCF、20ng/mL FLT-3L、15nM TAT-HOXB4； (2)處理組別2：含有5ng/mL IL-3、10ng/mL IL-6、100ng/mL SCF、20ng/mL FLT-3L、15nM TAT-HOXB4；(3)處理組別3：含有5ng/mL IL-3、10ng/mL IL-6、100ng/mL SCF、20ng/mL FLT-3L、25ng/mL TPO、15nM TAT-HOXB4。
細胞培養分析結果如第2圖所示。由第2(A)圖的有核細胞總數(Total nuclear cell,TNC)擴增倍率結果及第2(B)圖的CD34+細胞數量擴增倍率結果顯示，不論是細胞樣本1或樣本2，在各處理組培養下皆可具有倍數的成長，其中，又以處理組3之IMDM/5% HABS培養液所培養之擴增率增加最為明顯。由上述結果可知，細胞激素之組成及比例含量對於造血幹/前驅細胞之擴增影響極大。
除研究培養液成分對於造血幹/前驅細胞擴增之影響以外，細胞培養密度亦是對於細胞放大的影響之一。為此，以含有5ng/mL IL-3、10ng/mL IL-6、100ng/mL SCF、20ng/mL FLT-3L、25ng/mL TPO、0.1% BSA之培養液或以上述之處理組3之IMDM/5% HABS細胞培養液，將先前實施例所述之高純度造血幹/前驅細胞分別以細胞密度5x104、1x105及5x105cells/mL培養4天，之後以流式細胞儀進行細胞群落分析，結果如下表1及第3圖所示。
由表1及第3圖之結果顯示，在不同成分及不同細胞密度之培養條件下，雖然皆會使細胞增生，但其細胞族群之增生比例卻不盡相同。首先，以不同細胞培養液的部份進行比較，可得到與前一實施例實驗相符之結果，不論是何種細胞密度進行培養，以前述之組別3細胞培養液成分之IMDM/5% HABS培養液培養4天所得之有效造血幹/前驅細胞(包含CD34+細胞及CD34+CD38-細胞)比例明顯比BSA培養液組別高。
再者，以不同細胞密度進行比較，可觀察到以細胞密度5x104cells/mL培養4天後有效造血幹/前驅細胞族群之比例可高達72.5-77.2%。綜合以上比較，原先有效造血幹/前驅細胞族群(CD34+CD38-細胞)僅7%，經由組別3之IMDM/5% HABS細胞培養 液以及特定細胞密度5x104cells/mL培養後，可擴增至高達27.2%，以及，有核細胞總數(Total nuclear cell,TNC)擴增倍率亦高達13.52倍。
再進一步地，以細胞密度5x104cells/mL為基準並下調測試造血幹/前驅細胞之最佳培養條件，分為以下4組細胞密度進行培養，並進行細胞數量分析，細胞密度分別為：(1)細胞密度組別1：以密度1x104cells/mL培養至第7天；(2)細胞密度組別2：以密度5x104cells/mL培養3天，並於第3天時改以密度1.5x104cells/mL培養至第7天；(3)細胞密度組別3：以密度5x104cells/mL培養3天，並於第3天時改以密度3x104cells/mL培養至第7天；(4)細胞密度組別4：以密度5x104cells/mL培養至第7天。
其分析結果如第4圖所示，可明顯觀察到，相較於其他組別，在以細胞密度組別1之細胞密度連續培養至第7天的培養條件下，不論是第4(A)圖所示之有核細胞總數(Total nuclear cell,TNC)擴增倍率或是第4(B)圖所示之CD34+細胞擴增倍率皆明顯擴增，分別高達141.5倍及18.5倍。由本實施例可知細胞密度對於造血幹/前驅細胞之體外擴增培養係一重要因子。
實施例三、體外擴增培養之造血幹/前驅細胞之冷凍保存
根據以上實施例已可有效擴增體外培養造血幹/前驅細胞，然而除此以外，如何對於該細胞進行有效冷凍儲存以及確 保其在解凍仍可維持其有效造血幹/前驅細胞族群之存活比例為一大重點，因此，本實施例以3種保存劑配方作為試驗，其配方分別為：(1)配方1：80% Albuminar®-25,20%CryoSure-DEX40(內含20%人類白蛋白)；(2)配方2：48% Albuminar®-25,20%CryoSure-DEX40，生理食鹽水(內含12%人類白蛋白)；(3)配方3：24% Albuminar®-25,20%CryoSure-DEX40，生理食鹽水(內含6%人類白蛋白)。
將前述培養4天所得之造血幹/前驅細胞分別使用以上3種冷凍保存劑做冷凍保存，並儲存於BioArchive系統當中進行為期1個月之冷凍儲存，再經解凍測試以比較不同保存劑對細胞族群之影響，其結果如第5圖所示：由第5(A)圖之存活率分析(7-AAD染色)可得知，3種不同配方之保存劑所保存的造血幹/前驅細胞，在經由解凍後其存活率並沒有明顯不同；而進一步分析以流式細胞儀進行有效造血幹/前驅細胞族群(CD34+細胞及CD34+CD38-細胞)之結果，如第5(B)圖所示，則觀察到以配方3之保存劑所冷凍解凍之有效造血幹/前驅細胞族群比例相較於其他配方為良好。由此證明，以體外擴增培養之有效造血幹/前驅細胞亦可被以適當之保存劑進行冷凍保存，並於解凍後保持高比例之細胞族群純度及良好細胞存活率。
綜合以上實施方式之結果，證實本發明之製備方法 可有效獲取高純度之造血幹/前驅細胞，並以特殊成分之細胞培養液以特定密度進行培養，即可於短期內(4-7天)即獲得高比例臨床上之有效造血幹/前驅細胞之數量，最後，以特殊配方之保存劑進行細胞冷凍保存以維持有效造血幹/前驅細胞族群之比例及細胞存活率。
另外本發明之製備法在各個過程中，不論是細胞純化、體外擴增或者是冷凍保存，皆未使用含有其他動物來源成分之試劑，即代表，由本發明之製備方法所製得之組成物，不需再經過其他加工處理即可直接作為臨床之應用。

Claims (7)

  1. 一種高度純化並可立即使用之體外培養造血幹/前驅細胞之製備方法，其包含：將含有造血幹/前驅細胞之來源血液解凍，以梯度離心進行單核球純化，獲取高純度單核球細胞；將前述高純度單核球細胞以細胞密度5x105-6x106cells/mL培養於IMDM/5% HABS培養液中16-18小時，之後分離造血幹/前驅細胞；將自前述經隔夜培養之單核球細胞分離所得的高純度造血幹/前驅細胞培養於含有細胞激素及TAT-HOXB4之IMDM/5% HABS培養液中培養4-7天，其中該細胞激素係包含間白素-3(IL-3)、間白素-6(IL-6)、幹細胞因子(SCF)、FLT-3配基(FLT-3L)及血小板生成素(TPO)；及收取造血幹/前驅細胞培養物。
  2. 如請求項1所述之製備方法，進一步包含將製備得之體外培養造血幹/前驅細胞以包含含有6-20%人類白蛋白之組合物的保存劑進行冷凍保存。
  3. 如請求項1所述之製備方法，其中該細胞激素係包含5~10ng/mL之IL-3、10~20ng/mL之IL-6、50~100ng/mL之SCF、20~40ng/mL之FLT-3L、25~50ng/mL之TPO。
  4. 如請求項1所述之製備方法，其中該高純度造血幹/前驅細胞培 養係以細胞密度1x104-5x105cells/mL培養於含有細胞激素及TAT-HOXB4之IMDM/5% HABS培養液中培養。
  5. 如請求項2項所述之製備方法，其中保存劑係由包含20%人類白蛋白之組合物所組成。
  6. 如請求項1所述之製備方法，其中該造血幹/前驅細胞之血液來源為臍帶血(Umbilical cord blood)。
  7. 如請求項1所述之製備方法，其中該造血幹/前驅細胞之血液來源為週邊血(Peripheral blood)。
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