TWI537389B - 用於控制丁二醇生產之發酵方法 - Google Patents

用於控制丁二醇生產之發酵方法 Download PDF

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Description

用於控制丁二醇生產之發酵方法
本發明係關於由微生物發酵包含一氧化碳或一氧化碳及氫氣之基質生產2,3-丁二醇。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2011年3月31日申請之美國申請案第61/470,172號之優先權，該美國申請案以全文引用的方式併入。
用於運輸之生物燃料為汽油之有吸引力的替代物且以低濃度摻合物形式迅速滲入燃料市場。來源於天然植物來源的生物燃料比來源於化石資源(諸如汽油)之燃料更具有環境可持續性，其使用使得由於燃料燃燒釋放於大氣中之所謂的化石二氧化碳(CO2)氣體含量減少。另外，生物燃料可在許多地理位置於當地生產，且可用以減少對進口化石能源之依賴。適用作生物燃料之醇類包括乙醇、丁醇及2,3-丁二醇。
乙醇正迅速成為全世界主要的富氫液體運輸燃料。據估計，2002年乙醇之全世界消耗量為108億加侖(gallon)。亦預計燃料乙醇行業之全球市場今後將急劇增長，這是因為歐洲、日本、美國及若干開發中國家對乙醇的關注增加。
包括1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇及2,3-丁二醇之丁二醇可被認為具有多種優於乙醇之優勢。如同乙醇一樣，丁二醇可直接用作機動車燃料添加劑。其亦可相對容 易地轉化成許多其他可能的較高值及/或較高能積。舉例而言，2,3-丁二醇可輕易以兩步法轉化為八碳二聚體，其可用作航空燃料。
2,3-丁二醇自其二官能主鏈衍生其多功能性，亦即2個羥基位於鄰位C原子，使得該分子可十分容易地轉化為諸如丁二烯、丁二酮、乙醯甲基甲醇(acetoin)、甲基乙基酮等之物質。此等化合物用作基礎分子以製造廣泛的工業上生產之化學品。
另外，2,3-丁二醇可用作內燃機燃料。其在若干方面比乙醇更類似於汽油。隨著對環境可持續性燃料之生產及應用的關注之加強，對生產2,3-丁二醇(常稱為生物丁醇)之生物方法的關注亦增加。
2,3-丁二醇可藉由微生物發酵含有碳水化合物之原料來生產(Syu MJ,ApplMicrobiolBiotechnol 55：10-18(2001),Qin等人，Chinese J ChemEng 14(1)：132-136(2006))。2,3-丁二醇亦可藉由微生物發酵作物(諸如甜菜、玉米、小麥及甘蔗)之生物質來生產。然而，此等碳水化合物原料之成本受其作為人類糧食或動物飼料之價值的影響，且載培產澱粉或蔗糖之作物用於2,3-丁二醇生產並非在所有地理位置均具有經濟可持續性。因此，關注的是開發將較低成本及/或更豐富的碳資源轉化為2,3-丁二醇之技術。
一氧化碳(CO)為諸如煤或油及油衍生產物之有機材料不完全燃燒的主要副產物。雖然含碳前驅體完全燃燒產生CO2及水作為僅有的最終產物，但一些工業方法需要高 溫，促使一氧化碳累積超過CO2。一個實例為鋼鐵工業，其中需要高溫以得到所需鋼品質。舉例而言，據報導澳大利亞鋼鐵工業每年產生並向大氣中釋放超過500,000公噸之CO。
此外，CO亦為合成氣之主要組分，其中CO及H2之變化量由含碳燃料氣化得到。舉例而言，合成氣可藉由裂化廢木材及木料之有機生物質產生以得到用於生產燃料及更複雜化學品之前驅體。
CO釋放至大氣中可具有顯著環境影響。另外，可能需要支付排放稅，增加工廠成本。由於CO為反應性高能分子，所以其可用作生產多種化學品之前驅體化合物。然而，此有價值的原料並未用於生產2,3-丁二醇。
本發明之一目標為提供一種至少一定程度上克服上述缺陷之方法或至少向公眾提供一種適用的選擇。
在本發明之第一廣泛態樣中，提供一種藉由微生物發酵包含CO及H2之基質提高丁二醇生產效率之方法。在特定實施例中，本發明提供一種藉由微生物發酵控制丁二醇生產之方法，該方法包括：i)提供包含CO及H2之基質；及ii)在含有一或多種微生物培養物之生物反應器中，厭氧發酵該基質以產生丁二醇；及一或多種副產物；其中步驟(ii)中之丁二醇生產率受步驟(i)之基質組成的影響。
在一個實施例中，該一或多種副產物為醇及/或酸。
在一個實施例中，該一或多種副產物為乙醇。
在一個實施例中，該一或多種副產物為乙酸。
在一個實施例中，(i)之基質的H2組成影響丁二醇生產率。
在本發明之一個實施例中，提供一種降低2,3-丁二醇生產率之基質，其具有高H2濃度。
在本發明之一個實施例中，提供一種藉由微生物發酵提高丁二醇生產率之方法，該方法包括：(i)提供包含CO之低氫氣含量基質；(ii)在含有一或多種一氧化碳營養型產乙酸細菌之培養物的生物反應器中，厭氧發酵該基質以產生丁二醇。
在一個實施例中，基質包含小於20體積%之H2、小於15體積%之H2、小於10體積%之H2、小於5體積%之H2或小於2體積%之H2。在一個實施例中，H2之比吸收量小於每天1000 mmol/L、小於每天500 mmol/L、小於每天300 mmol/L、小於每天200 mmol/L或小於每天100 mmol/L。
在一個實施例中，2,3-丁二醇生產率為每天至少20 g/L、每天至少25 g/L、每天至少30 g/L、每天至少35 g/L、每天至少40 g/L或每天至少45 g/L。
在一個實施例中，發酵液中2,3-丁二醇之濃度為至少2 g/L、至少4 g/L、至少6 g/L、至少8 g/L或至少10 g/L。
在本發明之另一實施例中，提供一種藉由微生物發酵降低丁二醇生產率之方法，該方法包括：(i)提供富含H2之基質； (ii)在含有一或多種微生物之培養物的生物反應器中，厭氧發酵該基質。
在一個實施例中，基質包含至少20體積%之H2、至少25體積%之H2、至少30體積%之H2、至少35體積%之H2、至少40體積%之H2、至少45體積%之H2或約50體積%之H2。
在一個實施例中，H2之比吸收量為每天至少2500 mmol/L、每天至少3000 mmol/L、每天至少3500 mmol/L、每天至少4000 mmol/L、每天至少4500 mmol/L或每天至少5000 mmol/L。
在一個實施例中，2,3-丁二醇生產率小於每天15 g/L、小於每天10 g/L、小於每天5 g/L、小於每天3 g/L或小於每天1 g/L。
在一個實施例中，發酵液中2,3-丁二醇之濃度小於2 g/L、或小於1 g/L或為約0 g/L。
在本發明之第二廣泛態樣中，提供一種藉由微生物發酵生產一或多種產物之方法，該方法至少包含以下步驟：(a)提供含有一氧化碳或一氧化碳及氫氣之基質；及(b)在含有一或多種一氧化碳營養型產乙酸細菌之培養物的生物反應器中，厭氧發酵該基質以產生2,3-丁二醇及一或多種副產物；其中2,3-丁二醇生產率之提高與發酵槽中所提供之細胞的胞齡相關。
在一個實施例中，該一或多種副產物為醇及/或酸。
在一個實施例中，該一或多種副產物為乙醇。
在一個實施例中，該一或多種副產物為乙酸。
在本發明之一個實施例中，生物反應器中細胞之平均胞齡藉由使用細胞再循環元件而增加。熟習此項技術者應瞭解，細胞再循環元件可包括(但不限於)細胞再循環膜或圓盤堆疊式離心分離器。
在一個實施例中，當生物反應器中細胞之平均胞齡增加時，2,3-丁二醇之生產率提高。
在本發明之一個實施例中，當生物反應器中細胞之平均胞齡較低時，抑制2,3-丁二醇生產。
雖然本發明大致如上文所定義，但其不限於此且亦包括提供實例之以下說明書的實施例。
本發明現參照隨附圖式進行更詳細描述
以下為用一般術語給出之本發明之描述，包括其較佳實施例。本發明在下文標題「實例」下給出之揭示內容中進一步說明，該部分提供支持本發明之試驗資料、本發明態樣之特定實例及執行本發明之方式。
如本文中所用，「丁二醇」係指二醇之所有結構異構體，包括1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇及2,3-丁二醇及其立體異構體。術語「2,3-丁二醇」應解釋為包括該化合物之所有對映異構及非對映異構形式，包括(R,R)、(S,S)及內消旋形式、外消旋形式、部分立體異構純形式或實質上立體異構純形式。
術語「生物反應器」包括由一或多個容器及/或塔或管 道佈置組成之發酵裝置，其包括連續攪拌槽反應器(CSTR)、固定化細胞反應器(ICR)、滴流床反應器(TBR)、氣泡塔、氣升發酵槽、靜態混合器、或適於氣-液接觸之其他容器或其他裝置。在一些實施例中，生物反應器可包含第一生長反應器及第二發酵反應器。因此，當提及添加基質至生物反應器或發酵反應中時，應理解為包括在適當時添加至此等反應器之任一者或兩者中。
術語「基質」及同類術語應理解為包括任何基質，其中例如一氧化碳及/或氫氣可被一或多種細菌菌株用於生長及/或發酵。
「包含一氧化碳之氣態基質」或「至少包含CO之氣態基質」包括含有一定含量一氧化碳之任何氣體。氣態基質通常含有較大比例之CO，較佳至少約10體積%至約95體積%之CO。
「包含氫氣之氣態基質」包括含有一定含量氫氣之任何氣體。
術語「提高效率」、「提高之效率」及其類似術語當用在發酵相關製程時，包括(但不限於)以下一或多項：提高催化發酵之微生物的生長速率、在升高之丁二醇濃度下提高生長速率及/或產物生產速率、提高每消耗一體積基質時所產生之所需產物之體積、提高所需產物之生產速率或生產量、及提高所需產物相對於其他發酵副產物之生產比例。
「丁二醇生產率」或「丁二醇生產速率」為丁二醇之體 積生產率。在連續系統中，以穩態丁二醇濃度與液體滯留時間之比率計算體積生產率。在分批系統中，以分批系統中之丁二醇濃度及產生該濃度所需之時間計算體積生產率。體積生產率以每天g/L之形式記錄。
除非上下文另外要求，否則如本文中所用之詞語「發酵」、「發酵製程」或「發酵反應」及其類似詞語意欲涵蓋該過程之生長期及產物生物合成期兩者。
低氫氣含量基質
本發明者已驚訝地顯示藉由產乙醇梭菌(Clostridium autoentanogenum)之微生物發酵生產2,3-丁二醇。詳言之，本發明者已確定可藉由某些因素來控制2,3-丁二醇之生產。根據本發明之一個態樣，其已證實2,3-丁二醇的產量可藉由控制氣態基質之氫氣組成來增加或減少。根據本發明之第二態樣，其已證實生物反應器中微生物細胞之胞齡及微生物培養物之生長期會影響該細胞之2,3-丁二醇產量。
已顯示，可藉由提供低氫氣含量基質來提高2,3-丁二醇生產率。本發明者已證實，當限制基質中氫氣之量時，可提高2,3-丁二醇之生產率。本發明者確定，當氣態基質之氫氣組成小於20體積%之H2、小於15體積%之H2、小於10體積%之H2、小於5體積%之H2或小於2體積%之H2時，可提高2,3-丁二醇之生產率。
亦已確定2,3-丁二醇生產率與細菌培養物之氫氣吸收量之間的相關性。詳言之，已顯示，當H2吸收量小於每天 1000 mmol/L、小於每天500 mmol/L、小於每天300 mmol/L、小於每天200 mmol/L或小於每天100 mmol/L時，可提高2,3-丁二醇之生產率。
本發明者已證實，當限制氫氣吸收量時，2,3-丁二醇生產率為每天至少15 g/L、每天至少20 g/L、每天至少25 g/L、每天至少30 g/L、每天至少35 g/L、每天至少40 g/L或每天至少45 g/L。在一個實施例中，發酵液中之2,3-丁二醇濃度為至少2 g/L、至少4 g/L、至少6 g/L、至少8 g/L或至少10 g/L。
高氫氣含量基質
相應地，已展示增加氣態基質之H2組成對2,3-丁二醇生產率具有負面影響。在一個實施例中，2,3-丁二醇生產率小於每天10 g/L、小於每天5 g/L、小於每天3 g/L或小於每天1 g/L。在一個實施例中，發酵液中2,3-丁二醇之濃度小於2 g/L、或小於1 g/L或為約0 g/L。
使用氫氣組成增加之基質的發酵展示降低的2,3-丁二醇生產率。具有大於25體積%之H2、或大於30體積%之H2、或大於40體積%之H2、或大於45體積%之H2或大於50體積%之H2之氫氣組成的基質對培養物之體積生產率具有抑制作用。
H2之比吸收量增加對2,3-丁二醇生產率具有類似影響。在氫氣吸收量為每天至少2500 mmol/L、每天至少3000 mmol/L、每天至少3500 mmol/L、每天至少4000 mmol/L、每天至少4500 mmol/L或每天至少5000 mmol/L之培養物 中，2,3-丁二醇生產率比具有較低氫氣吸收量之培養物中低。
在本發明之第二態樣中，已證實當細菌培養物之生長實質上停止時，2,3-丁二醇之生產率提高。本發明者已令人驚訝地展示培養物中細胞之胞齡對細胞之體積生產率有影響。小於80小時之細胞的2,3-丁二醇體積生產率明顯低於較老細胞之體積生產率。2,3-丁二醇生產率在具有大於90小時、或大於100小時、或大於110小時之平均胞齡的細胞培養物中得以改良。在一個實施例中，2,3-丁二醇生產率大於每天6 g/L、大於每天8 g/L、大於每天10 g/L、大於每天12 g/L、大於每天14 g/L或大於每天16 g/L。
在本發明之一個實施例中，當生物反應器中細胞之平均胞齡較低時，2,3-丁二醇之生產率較低。在本發明之一個實施例中，當生物反應器中細胞之平均胞齡小於80小時、或小於60小時、或小於40小時、小於30小時、小於20小時或小於10小時時，2,3-丁二醇之生產率較低。在一個實施例中，2,3-丁二醇生產率小於每天4 g/L、小於每天3 g/L、小於每天2 g/L或小於每天1 g/L。
此外，2,3-丁二醇：乙醇比率在具有較老細胞群體之培養物中得以改良。在發酵中，已展示隨著培養物老化，該比率改良有利於2,3-丁二醇產生。具有小於90小時之平均胞齡的細胞培養物展示2,3-丁二醇與乙醇之比率為約1：10、或約1：15、或約1：20、或約1：25。具有大於100小時之平均胞齡的細胞培養物展示有利於2,3-丁二醇之明顯改良，比 率為約1：6、或約1：5、或約1：4、約1：3、約1：2或約1：1。
在本發明之一個實施例中，生物反應器中細胞之平均胞齡藉由使用細胞截留構件而增加。細胞截留構件為此項技術中所熟知，但例示性細胞截留構件包括橫向切流濾膜及/或中空纖維膜。
微生物
在一個實施例中，一或多種微生物係選自一氧化碳營養型產乙酸細菌之群。在某些實施例中，微生物係選自包含以下之群：產乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、揚氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、卡氏梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、塔氏梭菌(Clostridium drakei)、糞味梭菌(Clostridium scatologenes)、古氏梭菌(Clostridium coskatii)、黏丁酸桿菌(Butyribacteriumlimosum)、甲基營養丁酸桿菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏醋酸桿菌(Acetobacteriumwoodii)、巴氏烷酸菌(Alkalibaculum bacchii)、布絡特菌(Blautiaproducta)、黏液真桿菌(Eubacteriumlimosum)、熱乙酸菌(Moorellathermoacetica)、自養熱乙酸菌(Moorellathermautotrophica)、潘氏草酸桿菌(Oxobacterpfennigii)及奇維嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacterkiuvi)。
在本發明之實施例中，用於發酵之一或多種微生物為產乙醇梭菌。在一較佳實施例中，產乙醇梭菌為具有以標識寄存編號19630寄存於德國生物材料資源中心(German Resource Centre for Biological Material，DSMZ)之菌株之標識特徵的產乙醇梭菌。在另一實施例中，產乙醇梭菌為具有DSMZ寄存編號DSMZ 23693之標識特徵的產乙醇梭菌。
培養本發明之方法中所用之細菌可使用在此項技術中已知用於培養及使用厭氧細菌發酵基質之許多方法來進行。例示性技術在本文獻之「實例」部分提供。進一步舉例而言，可利用以下文章中大體所述之使用氣態基質用於發酵之彼等方法：K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausen及J.L.Gaddy(1991).Bioreactors for synthesis gas fermentations resources.Conservation and Recycling,5；145-165；K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausen及J.L.Gaddy(1991).Bioreactor design for synthesis gas fermentations.Fuel.70.605-614；K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausen及J.L.Gaddy(1992).Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels.Enzyme and Microbial Technology.14；602-608；J.L.Vega,G.M.Antorrena,E.C.Clausen及J.L.Gaddy(1989).Study of Gaseous Substrate Fermentation：Carbon Monoxide Conversion to Acetate.2.Continuous Culture.Biotech.Bioeng.34.6.785-793；J.L.Vega,E.C.Clausen及J.L.Gaddy(1989).Study of gaseous substrate fermentations：Carbon monoxide conversion to acetate.1.Batch culture. Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784；以及J.L.Vega,E.C.Clausen及J.L.Gaddy(1990).Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations.Resources,Conservation and Recyling.3.149-160。在包含碳水化合物之基質上培養細菌的方法亦為在此項技術中所熟知。
基質
在本發明之一個實施例中，2,3-丁二醇係藉由使用產乙醇梭菌微生物發酵包含碳水化合物之基質來產生。應瞭解，存在適於此項技術中已知之發酵的碳水化合物之許多實例及用以發酵碳水化合物基質之方法類型的許多實例。舉例而言，合適基質可包括(但不限於)單醣(諸如葡萄糖及果糖)、寡醣(諸如蔗糖或乳糖)、多醣(諸如纖維素或澱粉)。雖然預期所有此等碳水化合物基質(及其混合物)適用於本發明，但較佳碳水化合物基質為葡萄糖、果糖及蔗糖(及其混合物)。
熟習此項技術者應瞭解，如例如US20070031918中所述，可經由前處理及糖化製程，自纖維素及木質纖維素生物質獲得可發酵糖。生物質係指任何纖維素或木質纖維素材料且包括包含纖維素且視情況進一步包含半纖維素、木質素、澱粉、寡醣及/或單醣之材料。生物質包括(但不限於)生物能源作物、農業廢物、城市固體廢物、工業固體廢物、造紙廢泥漿、庭院廢物、木材及林業廢物。
然而，在本發明之一個較佳實施例中，以市售果糖用作 發酵之碳源及能源。
在一個較佳實施例中，本發明方法係採用包含一氧化碳或一氧化碳及氫氣之基質(較佳係包含一氧化碳或一氧化碳及氫氣之氣態基質)。氣態基質較佳為工業生產方法副產物所獲得之廢氣，或來自某些其他來源，諸如來自內燃機(例如汽車)排氣之廢氣。在某些實施例中，工業生產方法係選自由以下組成之群：含鐵金屬產物製造(諸如鋼鐵廠)、非含鐵產物製造、石油精煉方法、煤的氣化、電力生產、碳黑生產、氨生產、甲醇生產及焦煤製造。在此等實施例中，基質可在其排放至大氣之前使用任何便利方法自工業生產方法捕捉。視氣態基質之組成而定，亦可能需要在引入發酵中之前處理氣態基質，以移除任何不希望有的雜質(諸如塵粒)。舉例而言，可使用已知方法過濾或洗滌氣態基質。
在本發明之其他實施例中，氣態基質可來源於生物質之氣化。氣化製程包括在限制供應空氣或氧氣下部分燃燒生物質。所得氣體通常主要包含CO及H2，以及極少體積的CO2、甲烷、乙烯及乙烷。舉例而言，在食物(諸如來自甘蔗之糖、或來自玉米或穀物之澱粉)之提取及加工期間所獲得的生物質副產物或由林業得到的非食物生物質廢物可經過氣化，以產生適用於本發明之含CO氣體。
基質通常含有較大比例之CO，諸如至少約20體積%至約100體積%之CO、40體積%至95體積%之CO、40體積%至60體積%之CO及45體積%至55體積%之CO。在特定實施例 中，基質包含約25體積%、或約30體積%、或約35體積%、或約40體積%、或約45體積%、或約50體積%之CO、或約55體積%之CO、或約60體積%之CO。具有較低CO濃度(諸如6%)之基質亦可為合適的，尤其是在H2及CO2亦存在時。
在特定實施例中，以足夠進行2,3-丁二醇生產之含量供應CO。在特定實施例中，以使得維持至少0.4 mmol/g/min；或至少0.5 mmol/g/min；或至少0.6 mmol/g/min；或至少0.7 mmol/g/min；或至少0.8 mmol/g/min；或至少0.9 mmol/g/min；或至少1.0 mmol/g/min；或至少1.2 mmol/g/min；或至少1.5 mmol/g/min之比吸收率來供應CO。熟習此項技術者應瞭解供應CO(尤其氣態CO)之方法，以便達到所需吸收率。然而，舉例而言，諸如在發酵培養基中增加氣體容納量之因素將增加可用於藉由微生物培養轉化為產物的CO之量。此外，以較快速率或較高分壓供應CO亦將增加發酵液中CO之利用率。
為改良2,3-丁二醇發酵之效率，基質通常含有極小比例之H2，諸如小於20體積%之H2、小於15體積%之H2、小於10體積%之H2、小於5體積%之H2、或小於2體積%之H2或實質上無H2。
已證實，過量H2對2,3-丁二醇生產率具有抑制作用。已展示大於0.10 mmol/g/min；或大於0.11 mmol/g/min；或大於0.12 mmol/g/min；或大於0.15 mmol/g/min之H2吸收量抑 制2,3-丁二醇生產率。
在特定實施例中，H2以空乏含量供應以提高2,3-丁二醇生產率。在特定實施例中，以使得比吸收率小於0.09 mmol/g/min；或小於0.08 mmol/g/min；或小於0.07 mmol/g/min；或小於0.05 mmol/g/min；或小於0.01 mmol/g/min來供應H2。
氣態基質亦可含有例如一些CO2，諸如約1體積%至約80體積%、或1體積%至約30體積%。在一個實施例中，其含有約5體積%至約10體積%。在另一實施例中，氣態基質含有約20體積%之CO2。
一氧化碳通常將以氣態添加至發酵反應中。然而，本發明不應視為限於以此狀態添加基質。舉例而言，一氧化碳可以液體形式提供。舉例而言，可用含有一氧化碳之氣體使液體飽和且隨後添加液體至生物反應器中。此舉可使用標準方法達成。舉例而言，可使用微泡分佈發生器(Hensirisak等人.Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology第101卷，2002年10月3日)。
在本發明之一個實施例中，本發明者已確定，2,3-丁二醇可藉由發酵第一基質及第二基質來產生。在本發明之一個特定實施例中，2,3-丁二醇將在供應第一基質(較佳碳水化合物且更佳果糖)及第二基質(較佳包含CO之基質)時產生。
在另一實施例中，本發明者已確定2,3-丁二醇將由第一 基質產生，且一旦完全消耗，該第一基質可用第二基質替換且繼續產生2,3-丁二醇。在一個較佳實施例中，該第一基質為果糖且一旦果糖完全消耗，可供應包含CO之基質。本發明者已驚人地發現2,3-丁二醇繼續產生。本發明者進一步預期，若需要，則第一基質與第二基質可交替。舉例而言，若第一基質不能利用，則可使用替代性基質直至第一基質之利用率改良為止。
培養基
應瞭解，對於細菌生長及進行基質發酵為丁二醇而言，除基質之外，亦需要將合適的營養培養基饋入生物反應器中。營養培養基將含有足以允許所用微生物生長之諸如維生素及礦物質之組分。適於產乙醇梭菌生長之厭氧培養基為此項技術中已知，如例如由Abrini等人(Clostridium autoethanogenum,sp.Nov.,An Anaerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide；Arch.Microbiol.,161：345-351(1994))所述。下文「實例」部分提供合適培養基之其他實例。
發酵條件
發酵適宜在進行基質發酵為丁二醇之合適條件下進行。應考慮之反應條件包括溫度、培養基流動速率、pH值、培養基氧化還原電勢、攪拌速率(若使用連續攪拌槽式反應器)、接種物含量、最大基質濃度及確保基質含量不受限制之基質引入生物反應器之速率、及避免產物抑制之最大產物濃度。
本發明者已確定，在pH值不受控制的一個實施例中，似乎不存在對2,3-丁二醇生產之有害影響。
生物反應器
發酵反應可在如本文先前所述之任何合適生物反應器中進行。在本發明之一些較佳實施例中，生物反應器可包含培養微生物之第一生長反應器，及第二發酵反應器，將生長反應器之培養液饋入該第二發酵反應器且在其中生產大部分發酵產物(例如2,3-丁二醇)。
細胞截留構件
根據本發明之一個實施例，生物反應器經組態以使細胞能夠累積，藉此增加生物反應器中細胞之平均胞齡。細胞截留構件為此項技術中所熟知，但例示性細胞截留構件包括橫向切流濾膜及/或中空纖維膜。
產物回收
發酵將產生在營養培養基中包含所需產物(諸如丁二醇)及/或一或多種副產物(諸如乙醇、乙酸鹽及丁酸鹽)以及細菌細胞之發酵液。在一個較佳實施例中，發酵產物包括2,3-丁二醇。
2,3-丁二醇或含有2,3-丁二醇及一或多種其他醇類之混合醇流可藉由此項技術中已知之方法(諸如分餾或蒸發、全蒸發及萃取發酵)自發酵液中回收。諸如酸之副產物(包括乙酸鹽及丁酸鹽)亦可使用此項技術中已知的方法自發酵液中回收。舉例而言，可使用包含活性炭過濾器或電滲析之吸附系統。
在本發明之某些較佳實施例中，2,3-丁二醇及副產物藉由以下操作自發酵液中回收：連續移除一部分來自生物反應器之培養液，自培養液分離微生物細胞(例如宜藉由過濾)，及自培養液回收2,3-丁二醇及視情況選用之其他醇及酸。醇宜例如藉由蒸餾回收，且酸可例如藉由吸附於活性炭上來回收。所分離之微生物細胞較佳返回發酵生物反應器中。在醇及酸已移除之後，無細胞之滲透剩餘物亦較佳返回發酵生物反應器中。其他營養物(諸如B族維生素)可添加至無細胞之滲透液中以在其返回生物反應器中之前補充營養培養基。
又，若在2,3-丁二醇及/或副產物回收期間調節培養液之pH值，則pH值應在培養液返回生物反應器中之前再調節至與發酵生物反應器中培養液之pH值類似的pH值。
現將參照以下非限制性實例更詳細地描述本發明。
實例 實例1 材料及方法
生物反應器培養基製備：
將stem溶液3、stem溶液4、乙酸銨、刃天青、磷酸及逆滲透水添加至用N2氣體噴射之2 L發酵容器中。持續不斷地攪拌培養基，加熱至37℃且使用NH4OH(5 M)調節pH值至5.3。接著添加金屬溶液1、金屬溶液2、鎢酸鈉溶液及複合B-維生素溶液且用N2氣體噴射2小時以上。接著用含有H2(3%)、N2(30%)、CO(47%)及CO2(20%)之鋼鐵廠氣體噴射培養基且使用Cr2+溶液還原至約200 mV(Ag/AgCl電極)之氧化還原電位(ORP)。
細菌：
自德國生物材料資源中心(DSMZ)獲得產乙醇梭菌。給予該細菌之寄存編號為DSMZ 10061。
在生物反應器中發酵：
所製備之培養基用來自分裂旺盛培養物之細菌接種且經由添加Na2S(0.5 M)供以硫來源。使用NH4OH(5 M)維持5.0之pH值且在整個發酵過程中將培養液溫度設定為37℃。響應於培養物要求或就實驗目的，調節氣體輸入速率及組成以及培養基進料速率。該發酵亦利用細胞再循環膜連續抽取培養液滲透物，同時保留細菌細胞。
取樣及分析程序：
在不同時間間隔獲取液體培養物樣品，歷時41天時間。此等樣品用以確定在600 nm下之光密度(分光光度計)及基質與產物之含量(高效液相層析-HPLC)。HPLC常規用以定量乙酸鹽、乙醇及2,3-丁二醇之含量。使用氣相層析儀 (GC)分析輸入氣體及輸出氣體組成，可量測培養物之CO及H2消耗量及CO2生產量。
圖1至6說明藉由改變生物反應器中之H2吸收量控制2,3-丁二醇生產率的能力。圖1及3展示在每天約3000 mmol/L之速率的十分穩定之氫氣吸收量下，所得2,3-丁二醇濃度小於1 g/L，且2,3-丁二醇生產率小於每天7 g/L。圖2及4展示生物反應器之氫氣吸收量為每天約400 mmol/L至每天約0 mmol/L。所得2,3-丁二醇濃度為2 g/L至9 g/L，且2,3-丁二醇生產率增至每天10 g/L。圖4說明2,3-丁二醇生產率增至每天約45 g/L。
圖5展示生物反應器之氫氣吸收量的穩定增加率，及與增加的氫氣吸收量一致穩定地減小的2,3-丁二醇之含量。圖4展示歷時42天進行的生物反應器實驗，其清楚展示減小的氫氣吸收量與增加的2,3-丁二醇含量之間的相關性。
實例2
圖7-8及表2說明根據本發明之一個實施例，兩個反應器系統中之2,3-丁二醇含量及乙醇含量。
圖7使兩個反應器系統之第一發酵槽中之2,3-丁二醇與胞齡之間的關係相關聯。圖7展示第一反應器中2,3-丁二醇之生產速率隨著該發酵槽中胞齡增加而穩定增加。
圖8展示兩個反應器系統之第二發酵槽中2,3-丁二醇之生產率及濃度。圖8說明發酵液中之2,3-丁二醇濃度以及2,3-丁二醇生產率隨著發酵槽中胞齡之增加而增加。
表2說明胞齡與2,3-丁二醇之間的相關性以及兩個反應器 系統中高乙醇生產率之影響。表2展示兩個反應器系統之第一反應器中高乙醇生產率與整個系統之高2,3-丁二醇生產率有關，而在第一反應器之生產率較低且平均胞齡較低時，整個系統之2,3-丁二醇生產率較低。
本發明已參照某些較佳實施例於本文中描述，以使讀者能夠不經過度實驗實踐本發明。然而，一般技術者將輕易認識到，許多組分及參數可在不悖離本發明範疇的情況下在某種程度上變化或修改或由已知等效物替換。應瞭解，該等修改及等效物如單獨陳述般併入本文中。提供名稱(title)、標題(heading)或其類似物以增強讀者對此文獻的理解，且不應視為限制本發明之範疇。
上文及下文所引述之所有申請案、專利及公開案(若存在)之全部揭示內容係以引用的方式併入本文中。然而，在本說明書中提及任何申請案、專利及公開案並未且不應視為承認或以任何形式暗示其構成有效先前技術或成為世界上任何國家通用知識之一部分。
在本說明書通篇及其隨附的任何申請專利範圍中，除非上下文另外要求，否則詞語「包含」及其類似物應解釋為與排他意義相反的包括意義，亦即「包括(但不限於)」的意義。
圖1為展示生物反應器中2,3-丁二醇濃度隨著氫氣吸收量升高而減小的圖示；圖2為說明生物反應器中2,3-丁二醇濃度隨著氫氣吸收量降低而增加的圖示；圖3為展示生物反應器中2,3-丁二醇生產速率隨著氫氣吸收量升高而減小的圖示；圖4為說明生物反應器中2,3-丁二醇生產速率隨著氫氣吸收量降低而增加的圖示；圖5為說明氫氣吸收量增加及對應的2,3-丁二醇濃度降低之圖示；圖6為展示歷時42天氫氣吸收量與2,3-丁二醇濃度之間相關性的圖示；圖7為展示兩個反應器系統之第一反應器中2,3-丁二醇與胞齡之間之相關性的圖示；圖8為展示兩個反應器系統之第二反應器中2,3-丁二醇濃度及體積生產率隨胞齡變化之圖示。

Claims (5)

  1. 一種藉由至少包含CO及H2之基質之微生物發酵法來生產2,3-丁二醇之方法，該方法包括：a.將該基質通入包含至少一種梭菌屬(Clostridium)細菌之培養物之生物反應器中；及b.由該基質進行厭氧發酵，產生2,3-丁二醇及至少一種副產物，其中供應該基質使該培養物之氫氣比吸收率維持在0mmol/L/天至400mmol/L/天，並生產2g/L/天至45g/L/天之2,3-丁二醇。
  2. 如請求項1之方法，其中該梭菌屬細菌係選自包含以下之群：產乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、揚氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、卡氏梭菌(Clostridium carboxidivorans)、塔氏梭菌(Clostridium drakei)、糞味梭菌(Clostridium scatologenes)及古氏梭菌(Clostridium coskatii)。
  3. 如請求項1之方法，其進一步包含添加細胞截留膜至該生物反應器中，其中該細胞截留膜係選自由橫向切流濾膜及中空纖維膜組成之群，由此增加細菌細胞之平均胞齡。
  4. 如請求項1之方法，其中該副產物係選自由醇、酸及其混合物組成之群。
  5. 如請求項4之方法，其中該醇為乙醇。
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