TWI395754B - 人類化之c-kit抗體 - Google Patents
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Description
本發明係關於用於治療c-Kit相關之發炎性、纖維化、自體免疫及癌症疾病之組合物,且係關於含有人類化c-Kit抗體之組合物。
肥大細胞已牽涉於發炎性病症(諸如哮喘、類風濕性關節炎及發炎性腸病)的調節中且廣泛認識到在過敏性炎症中之作用。肥大細胞在來自重度哮喘患者之肺外植體中數量增加且為諸如白三烯、組織胺及Th2細胞激素之臨床相關發炎性介體的主要來源。肥大細胞為疾病組織中預形成之TNF的主要來源。
幹細胞因子(SCF)為經細胞及膜相關之酪胺酸激酶受體(下文稱作c-Kit)發信號之醣蛋白;且此信號轉導路徑在血細胞生成中起關鍵作用,其通常協同其他細胞激素充當陽性調節劑與陰性調節劑。可溶性排出c-Kit受體可在調節SCF中起作用。C-Kit在多能造血幹細胞上表現,該等幹細胞為屬於淋巴及紅血球系之成熟細胞之前驅體。不同於其他造血細胞,肥大細胞前驅體及成熟肥大細胞保持c-Kit之高表現量。因此,經由c-Kit之SCF信號轉導對肥大細胞生長、功能、運輸及存活而言至關重要。其亦在配子形成及黑素生成中起作用。在W基因座中具有失活c-Kit突變之小鼠實際上無肥大細胞。在人類中活化c-Kit突變與肥大細胞增多症相關。
c-Kit陽性多能造血幹細胞為包括間葉細胞、纖維母細胞及肥大細胞之多個細胞類型之前驅體。纖維化疾病部分由產生細胞外基質沈積之過多纖維母細胞活性及增殖表徵。已報導C-Kit陽性骨髓多能造血幹細胞為纖維化組織中纖維母細胞及肥大細胞之來源。
肥大細胞可提供發炎性、血管生成、促有絲分裂及纖維生成介體之持久來源。肥大細胞功能上及解剖學上與纖維母細胞有關且在活化纖維母細胞中具有直接作用。肥大細胞增加纖維母細胞介導之膠原蛋白收縮、細胞外基質沈積之動力學及量值且可使纖維母細胞轉化成肌纖維母細胞。纖維母細胞繼而分泌SCF以進一步活化及擴增肥大細胞,且兩種細胞類型均為纖維生成網路之組份。
肥大細胞數量及肥大細胞介體在包括特發性肺纖維化(IPF)及硬皮病之多數人類纖維化疾病中顯著升高。分化肥大細胞表型在一些硬皮病患者中及在硬皮病之Tsk小鼠模型中偵測到。侵襲性全身性形式之肥大細胞增多症可由指示肥大細胞可為纖維化中之效應細胞之骨髓纖維化表徵。
GleevecTM
及類別中之其他者(如SutentTM
)為可靶向c-Kit信號轉導活性但抑制許多其他激酶之多靶向酪胺酸激酶受體抑制劑。此等激酶抑制劑指示腫瘤學設定。對於Gleevec而言,已報導骨髓抑制、貧血及包括心臟中毒及周邊水腫之許多副作用。由此,此等分子對於慢性治療與c-Kit信號轉導相關之疾病的風險概況可能並不具有最佳效益。因此,對新穎療法及試劑、尤其更有效且更具選擇性且對於治療c-Kit相關之發炎性及纖維化疾病具有更佳安全概況的彼等新穎療法及試劑存在需要。該化合物亦可在諸如來源於骨髓之白血病、與c-Kit突變相關之疾病(諸如GIST及肥大細胞增多症)、與如在黑素瘤及各種SCLC中c-Kit過度表現及/或過多SCF自分泌活性相關之疾病的腫瘤性疾病中顯示顯著更佳之功效及安全概況。目前正缺乏靶向人類c-Kit且能夠影響治療效益而無顯著不利效應之療法及試劑。
本發明提供為在細胞相關及膜c-Kit受體處SCF之拮抗劑及中性拮抗劑的試劑,諸如單株抗體。在一更特定實施例中,提供結合c-Kit之人類化(非鼠類)單株抗體。在甚至更特定之實施例中,本發明之人類化抗體包含選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:6中所列出之彼等胺基酸序列的胺基酸序列。本發明亦提供編碼前述抗體或特異性結合劑中之任一者之核酸。在本發明之一相關實施例中,提供包含前述核酸序列中之任一者之載體。在另一實施例中,提供包含前述核酸或載體中之任一者的宿主細胞。
在一實施例中,c-Kit結合劑及中性拮抗劑可包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6之胺基酸序列。在另一實施例中,前述試劑中之任一者包含與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所列出之胺基酸序列中之一或多者至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上一致的胺基酸序列。在該等實施例中,關於SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6之序列變異可分別表示(例如)在彼位置處使用替代性人類胺基酸保守取代IgG之相應構架區。
在例示性實施例中,結合c-Kit之抗體或特異性結合劑包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所列出之胺基酸序列。然而,預期本發明之抗體可為IgG抗體同型之混合物(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型之混合物)。
前述抗體中之任一者可為(例如)原生或突變IgG抗體(例如IgG1或IgG3亞型或任何其他IgG亞型之抗體)。如由表面電漿共振(BIAcore分析)所測定,前述抗體可顯示由低於1×10-2
或低於1×10-3
或1×10-4
、1×10-5
、1×10-6
、1×10-7
、1×10-8
或1×10-9
之kd
表徵的親和力。
如由細胞檢定所測定,前述抗體可顯示低於1×10-2
或低於1×10-3
或1×10-4
、1×10-5
、1×10-6
、1×10-7
、1×10-8
或1×10-9
之中性拮抗劑IC50。在一特定實施例中,人類化抗體之親和力及功能性效能與親本鼠類抗體之親和力及效能至少相當。在一較佳實施例中,人類化抗體並非c-Kit受體之促效劑且並不活化可引起類過敏反應之肥大細胞,且應顯示與親本鼠類抗體至少相當之PD/PK及免疫原性概況。
眾多方法涵蓋於本發明中。舉例而言,提供產生前述抗體或特異性結合劑之方法,其包含培養前述宿主細胞使得核酸得以表現以產生抗體或試劑。該等方法亦可包含自宿主細胞培養物回收抗體或試劑之步驟。在一相關實施例中,提供由前述方法產生之經分離抗體或試劑。
本發明進一步提供使用前述抗體或特異性結合劑中之任一者(例如)以藉由投與有效量之前述抗體或特異性結合劑來治療或預防c-Kit相關之病症的方法。該待治療病症之一實例為纖維化疾病。
鼠類抗人類c-Kit抗體SR-1描述於美國專利第5,919,911號及美國專利第5,489,516號中,其各者均以引用的方式併入本文中。SR-1顯示與c-Kit之合適之結合特性且阻斷SCF介導之受體信號轉導,然而此分子並不具有超出明顯免疫原性問題之人類治療中所要之所有特徵。Broudy報導SR-1具有一些可引起受體內化及磷酸化之類促效劑活性(J Cell Physiol.1994年3月;158(3):545-54)。此等功能活性致使分子有效性更小及安全性更低。儘管單株抗體之人類化為經確立之方法且一般預期生物活性經適當轉譯,但取決於人類構架之人類化SR-1抗體之構形可產生對c-Kit之不同固有活性及由此不同生物功能。在此特定實例中,將尋求所要藥理學特性而非不當之"促效"特性,但達成其之方法尚未公開。將SR-1抗體之互補判定區插入結構上不同之IgG1及IgG2及IgG4之人類重鏈及輕鏈的獨特組合中,同時令人驚訝地維持對c-Kit之類似親和力。然而,此等構架區中之每一者證實具有劣勢。
IgG2背景中之人類化SR-1證實對c-Kit具有高親和力,而在多個細胞類型中不能完全阻斷SCF介導之受體內化且在經培養之肥大細胞檢定中引起c-Kit磷酸化(存活信號)且介導細胞異常叢生。此等特性可能不合乎需要,因此治療策略之目的在於藉由阻斷存活SCF信號細胞凋亡性地使肥大細胞及前驅體衰竭且避免可引起活體內類過敏反應之肥大細胞活化。當將小鼠SR-1 CDR區插入人類IgG1構架中時,亦維持親和力及功能性效能,但此背景不太理想,此係由於對於抗體之此同型通常見到補體活化及細胞介導之細胞毒性。當將小鼠SR-1 CDR區插入人類IgG4構架中時,亦維持親和力及功能性效能,但意想不到地,此分子在純化及按比例放大後即顯示顯著凝集。
因此,本發明者試圖藉由產生不具有補體活化且不活化c-Kit及肥大細胞而保持對於膜c-Kit受體及並非可溶性c-Kit受體所要之親和力、中性拮抗劑效能之抗體來克服此等分子中之每一者的不足。此抗體亦應顯示適當之PD/PK且對使肥大細胞衰竭有效且無活體內對肥大細胞起促效作用之跡象。
Seq Id No:1表示編碼SR-1人類化輕鏈之核酸。
ATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATATTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGTGGGACCAAGGTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA(SEQ ID NO:1)
Seq Id No:2如下,其中粗體字表示CDR(例如,CDR1為SEQ ID NO:2之胺基酸43至58,CDR2為SEQ ID NO:2之胺基酸74至80,且CDR3為SEQ ID NO:2之胺基酸113至121):
成熟人類化輕鏈為SEQ ID NO:2之胺基酸20至248。
Seq Id No:3 ATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTCTGCTTGCTGGCAGTGGCCCCAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGTTACAATATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTTATTTATTCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAGGGTCACCATTACCGCTGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGAGGGATACTCGTTTTGGTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO:3).
CDR以粗體字表示(例如,CDR1為SEQ ID NO:4之胺基酸50至54,CDR2為SEQ ID NO:4之胺基酸69至85,且CDR3為SEQ ID NO:4之胺基酸118至125):
ATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTCTGCTTGCTGGCAGTGGCCCCAGGTGCCCACTCCCAGGrGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCrTCACCAGTTACAATATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTTATTTATTCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAGGGTCACCATTACCGCTGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGAGGGATACTCGTTTTGGTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(Seq Id No:5)
以下為SR-1 IgG2重鏈之全長胺基酸序列,且CDR以粗體字表示:
SR-1 MULC
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTAACATTGTGTTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCTGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATATTTATGGCAATAGTrTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGrGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCrGTGGAGGCTGATGATGCrGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACrGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATrGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTGA(SEQ ID NO:7)
CDR以粗體字表示:
ATGGGATGGAGTTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGACAGGGCCTGGAATGGATTGGAGTTATTTATTCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAAATCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGAGAGGGArACTCGTTTTGGTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCrCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaatgA(Seq Id No:9)
SR-1之輕鏈CDR1為RASESVDIYGNSFMH(SEQ ID NO:8之胺基酸44至58),CDR2為LASNLES(SEQ ID NO:8之胺基酸74至80),且CDR3為QQNNEDPYT(SEQ ID NO:8之胺基酸111至121)。重鏈CDR1為SYNMH(SEQ ID NO:10之胺基酸50至54),CDR2為VIYSGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID NO:10之胺基酸69至85),CDR3為RDTRFGN(SEQ ID NO:10之胺基酸118至125)。
應瞭解,本申請案中所描述之重鏈及輕鏈中之每一者在細胞中經處理成成熟形式。因此,信號肽分解且在抗體之重鏈的狀況下,C末端離胺酸分解。因此,成熟形式經蛋白質水解性處理且亦包括其他轉譯後修飾,諸如當在哺乳動物細胞中表現時的糖基化作用。每一重鏈及輕鏈之信號肽為SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:10之胺基酸1至20及SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:10之胺基酸1至19。
鼠類SR-1之輕鏈之核苷酸及胺基酸序列在SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8中列出。鼠類SR-1之重鏈之核苷酸及胺基酸序列在SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10中列出。具有進一步取代(例如鼠類胺基酸之保守取代)之變異體亦可保持高結合親和力。在CDR及構架內之位置中的取代、缺失或插入可在不影響親和力的情況下進行。
在一實施例中,人類化抗體包含保持鼠類SR-1之原始鼠類CDR之輕鏈,例如SEQ ID NO:8之約44-58、約74-80及約113-121之位置。在其他實施例中,人類化抗體包含保持鼠類SR-1之鼠類CDR之重鏈,例如SEQ ID NO:10之約50-54、約68-85及約118-125之位置,且具有來源於人類之構架區。如本文中所使用,應瞭解,只要維持對c-Kit之親和力,術語"約"涵蓋兩個至五個胺基酸位置變化。
在一實施例中,該等試劑可包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所列出之胺基酸序列。在另一實施例中,前述試劑中之任一者包含與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所列出之胺基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上一致的胺基酸序列。在該等實施例中,相對於SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6之序列變異可分別表示(例如)在彼位置處使用替代性人類胺基酸保守取代IgG之相應構架區。
在一實施例中,如由表面電漿共振(BIAcore分析)所測定,前述抗體顯示由低於10-2
或低於10-3
或10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
之kd
所表徵的親和力。在另一實施例中,如由細胞檢定所測定,前述抗體顯示低於1×10-2
或低於1×10-3
或1×10-4
、1×10-5
、1×10-6
、1×10-7
、1×10-8
、1×10-9
之中性拮抗劑效能IC50。
本發明提供多種特異性結合劑及中性拮抗劑,包括(但不限於)人類或人類化c-Kit特異性抗體,其來源於鼠類SR-1且保持所需特徵及/或減輕c-Kit相關之病症之症狀的能力,該等特徵為諸如在1×10-2
或更低之範圍內或範圍降至1×10-9
或更低(例如10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
或更低)之對於c-Kit的Kd(解離速率常數)及/或在1×10-2
或更低之範圍內或範圍降至1×10-9
或更低(例如10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
或更低)之對於c-Kit之中性拮抗劑IC50。本發明亦提供編碼該等特異性結合劑多肽之核酸、包含該等核酸之載體及重組宿主細胞,產生該等特異性結合劑之方法,包括該等特異性結合劑之醫藥調配物,製備該等醫藥調配物之方法,及用該等醫藥調配物及化合物治療患者之方法。
建構編碼此等經修飾之輕鏈可變區之核酸且與編碼CDR移植物或人類化重鏈之核酸共同表現且反之亦然,且視情況可與恆定區連接。只要維持合適之結合親和力,任何人類化或嵌合重鏈及輕鏈均可組合。將所要基因引入哺乳動物細胞中且表現、純化及表徵所得重組免疫球蛋白產物。
術語"抗體"以最廣泛意義使用且包括經完全裝配之抗體、單株抗體(包括人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及可結合抗原之抗體片段(例如Fab'、F'(ab)2、Fv、單鏈抗體、微型雙功能抗體),只要其顯示所要生物活性,則術語包含前述抗體或抗體片段之互補判定區(CDR)。術語"抗體"自該術語範疇明確排除鼠類抗體(亦即由鼠類融合瘤產生或具有與由鼠類融合瘤產生之抗體相同之序列的抗體)。
術語"特異性結合劑"包括如上文所定義之抗體及具有所要抗原結合特性之含有來源於CDR之序列之重組肽或其他化合物。特定包括於該術語中者為含有與鼠類SR-1之一或多個CDR(較佳包括重鏈CDR3)至少80%、90%或100%一致之胺基酸序列的肽。
如本文中所使用,應瞭解,術語"中性拮抗劑"意謂能夠抑制促效劑活性之特異性結合劑。此等試劑包括如上文所定義之抗體及具有所要抗原結合特性之含有來源於CDR之序列之重組肽或其他化合物。特定包括於該術語中者為含有與鼠類SR-1之一或多個CDR(較佳包括重鏈CDR3)至少80%、90%或100%一致之胺基酸序列的肽。
亦包括於術語中者為"肽體(peptibody)",其為作為與至少一個抗原結合肽連接之"媒劑"之包含抗體Fc域的分子。來自SR-1抗體之抗體CDR可適於併入肽體中,尤其包括重鏈之CDR3。肽體的產生一般描述於PCT公開案WO 00/24782(於2000年5月4日公開)中。肽可在有或無連接子的情況下串連(亦即依序)連接。含半胱胺醯基殘基之肽可與另一含Cys之肽交聯,其任一者或二者可與媒劑連接。同樣,具有一個以上Cys殘基之任何肽可形成肽內二硫鍵。可使此等肽中之任一者衍生,例如可用胺基使羧基末端封端,可使半胱胺酸封端,或可經除胺基酸殘基以外之部分取代胺基酸殘基(參見(例如)Bhatnagar等人,J.Med.Chem.39:3814-9(1996),及Cuthbertson等人,J.Med.Chem.40:2876-82(1997),其均以引用的方式全部併入本文中)。肽序列可類似於對於抗體之親和力成熟來最優化或另外由丙胺酸掃描或隨機或定點突變來改變,接著篩選以鑑別最佳結合劑。Lowman,Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:401-24(1997)。
可將各種分子插入特異性結合劑結構中(例如在特異性結合劑之肽部分本身內或在特異性結合劑之肽與媒劑部分之間),同時保持特異性結合劑之所要活性。可易於插入(例如)分子(諸如Fc域或其片段)、聚乙二醇或其他相關分子(諸如葡聚糖)、脂肪酸、脂質、膽固醇組、小碳水化合物、肽、細胞毒性劑、化學治療劑、如本文中所述之可偵測部分(包括螢光劑、諸如放射性同位素之放射性標記)、寡醣、寡核苷酸、聚核苷酸、干擾(或其他)RNA、酶、激素或類似物。適於以此方式插入之其他分子將為熟習此項技術者所瞭解,且涵蓋於本發明之範疇內。其包括將(例如)所要分子插入(視情況)由合適之連接子連接之兩個連續胺基酸之間。
"經分離"之抗體為已自表現其之細胞之組份鑑別及分離之一者。細胞之污染組份為會干擾抗體之診斷或治療用途之物質,且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中,由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染料將抗體純化至(1)大於95重量%之抗體且最佳大於99重量%,(2)足以獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度,或(3)均質。由於抗體之天然環境之至少一種組份將不存在,因此經分離之天然產生之抗體包括在重組細胞內原位之抗體。一般而言,然而,經分離抗體將由至少一個純化步驟來製備。
如本文中所使用,術語"單株抗體"係指自大體上均質抗體之群體所獲得之抗體,亦即,除可以微量存在之可能的天然產生之突變體以外包含該群體之個別抗體相同。與通常包括針對不同抗原決定基之不同抗體的多株抗體製劑相反,單株抗體針對個別抗原位點或抗原決定基具高度特異性。
視人類免疫球蛋白重鏈之恆定域之胺基酸序列而定,可將人類免疫球蛋白分成不同類別。有五個主要類別:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且可將此等類別中之數者進一步分成亞類或同型,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於免疫球蛋白之不同類別之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。免疫球蛋白之不同類別之次單位結構及三維構型已為熟知。具有不同效應功能之不同同型(例如IgG1及IgG3同型)具有ADCC活性。
術語"高變"區係指擔負抗原結合之抗體之胺基酸殘基。高變區包含來自互補判定區或CDR之胺基酸殘基[亦即,如由Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)所描述,輕鏈可變域中之殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)及重鏈可變域中之31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)]。儘管與含有所有CDR之整個抗原結合位點相比親和力更小,但即使單一CDR亦可識別且結合抗原。應瞭解,只要抗體保持其結合靶分子之能力,則抗體之CDR可包括指定界限以外之額外或較少序列。
來自高變"環"之殘基之替代性定義由Chothia等人,J.Mol.Biol.
196:901-917(1987)描述為輕鏈可變域中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈可變域中之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)。
"構架"或FR殘基為除高變區殘基以外之彼等可變區殘基。
"抗體片段"包含完整全長抗體之一部分,較佳為完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段;微型雙功能抗體;線抗體(Zapata等人,Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995));單鏈抗體分子;及自抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同抗原結合片段(稱作"Fab"片段),各具有單一抗原結合位點及含有恆定區之殘餘"Fc"片段。Fab片段含有所有可變域,以及輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH
1)。Fc片段呈現碳水化合物且擔負許多抗體效能功能(諸如結合補體及細胞受體),其使一類抗體區別於另一類。
胃蛋白酶處理得到具有包含抗體之VH
及VL
域之兩個"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段的F(ab')2片段,其中此等域存在於單一多肽鏈中。Fab片段由於在包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸之重鏈CH
1域之羧基末端處包括少數其他殘基而不同於Fab'片段。較佳地,Fv多肽進一步包含能使Fv形成用於抗原結合之所要結構的介於VH
域與VL
域之間的多肽連接子。對於sFv之論述,參見Pluckthun於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg中及Moore編,Springer-Verlag,New York,第269-315頁(1994)。
"Fv"為含有完全抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此區域由處於緊密、非共價締合之一重鏈可變域與一輕鏈可變域之二聚體組成。在此構型中,每個可變域之三個CDR相互作用以在VH
VL
二聚體之表面上界定抗原結合位點。總體而言,六個CDR賦予抗體以抗原結合特異性。然而,儘管與整個結合位點相比親和力更小,但單一可變域(或僅包含三個對抗原具特異性之CDR的一半Fv)具有識別及結合抗原之能力。
術語"微型雙功能抗體"係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段,該等片段包含在同一多肽鏈(VH
VL
)中與輕鏈可變域(VL
)連接之重鏈可變域(VH
)。藉由使用太短以至於不能使同一鏈上兩個域之間配對的連接子,致使域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。微型雙功能抗體更充分地描述於(例如)EP 404,097;WO 93/11161;及30 Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
已發展各種技術用於產生抗體片段。傳統上,此等片段經由完整抗體之蛋白水解性消化而得,但亦可由重組宿主細胞直接產生。參見(例如)Better等人,Science 240:1041-1043(1988);Skerra等人,Science 240:1038-1041(1988);Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)。
如本文中所提供,治療發炎性、自體免疫、腫瘤性及纖維化病症之組合物及方法可利用單獨或以與其他治療劑組合使用之一或多種抗c-Kit治療劑以達成所要作用。適於根據本發明使用之例示性抗纖維化劑包括細胞激素,其中該細胞激素係選自轉化生長因子β(TGF-β)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-9(IL-9)、介白素-13(IL-13)、顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、介白素-1β(IL-1β)、結締組織生長因子(CTGF)、介白素-6(IL-6)、抑瘤素M(OSM)、來源於血小板之生長因子(PDGF)、單核細胞趨化蛋白1(CCL2/MCP-1)及肺及活化調節趨化因子(CCL18/PARC)。
根據本發明來源於SR-1之抗體較佳由重組DNA方法使用此項技術中所熟知之抗體表現系統中之一者來產生(參見(例如)Harlow及Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。該等抗體亦較佳為具有來源於免疫球蛋白之可變序列及人類恆定區之嵌合融合蛋白質,或更佳為包含人類抗體殘基但較佳至少保持鼠類SR-1之CDR的更類人化單株抗體(諸如人類或人類化抗體)。除完整、全長分子以外,術語"抗體"亦指其片段或完整分子之多聚體或聚集體及/或結合c-Kit之片段。
短語"人類化抗體"係指來源於非人類抗體、通常小鼠單株抗體之抗體。或者,人類化抗體可來源於保持或大體上保持親本、非人類抗體之抗原結合特性但當投予人類時與親本抗體相比顯示免疫原性減少之嵌合抗體。如本文中所使用,短語"嵌合抗體"係指含有來源於兩種通常起源於不同物種之不同抗體(參見(例如)美國專利第4,816,567號)之序列的抗體。更為通常地,嵌合抗體包含人類及鼠類抗體片段,一般為人類恆定區及小鼠可變區。
所關注之免疫球蛋白之胺基酸序列可藉由直接蛋白質定序來確定,且合適之編碼核苷酸序列可根據通用密碼子表來設計。
或者,使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)自融合瘤細胞分離及定序編碼單株抗體之DNA。序列確定一般將需要分離所關注之基因或cDNA之至少一部分。通常,其需要選殖編碼單株抗體之DNA或較佳mRNA(亦即cDNA)。使用標準技術進行選殖(參見(例如)Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Guide,第1-3卷,Cold Spring Harbor Press,其以引用的方式併入本文中)。舉例而言,可藉由逆轉錄polyA+mRNA、較佳膜相關之mRNA建構cDNA庫,且使用對人類免疫球蛋白多肽基因序列具特異性之探針篩選庫。在一較佳實施例中,然而,聚合酶鏈反應(PCR)用於擴增編碼所關注之免疫球蛋白基因片段(例如輕鏈可變片段)之cDNA(或全長cDNA之部分)。經擴增之序列可易於選殖至例如表現載體、微型基因載體或噬菌體呈現載體之任何合適之載體中。應瞭解,所使用之特定選殖方法並不關鍵,只要其能夠確定所關注之免疫球蛋白多肽之一些部分的序列即可。
如本文中所使用,"經分離"之核酸分子或"經分離"之核酸序列為(1)自天然來源之核酸中通常關連之至少一種污染核酸分子鑑別及分離或(2)經選殖、擴增、標記或另外區別於背景核酸以使所關注之核酸序列可確定的核酸分子。經分離之核酸分子不同於在自然中見到之形式或設定。然而,經分離之核酸分子包括通常表現抗體之細胞中所含之核酸分子,例如,其中該核酸分子在染色體中位置不同於天然細胞。
用於選殖及定序之RNA之一個來源為一個藉由轉殖基因小鼠獲得B細胞且使該B細胞與永生細胞融合所產生之融合瘤。使用融合瘤之優點在於可輕易篩選融合瘤,且選擇可產生所關注之人類單株抗體之融合瘤。或者,可自經免疫之動物之B細胞(或全脾)分離RNA。當使用融合瘤以外之來源時,可能需要篩選編碼具有特異性結合特徵之免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽之序列。該篩選之一個方法為使用噬菌體呈現技術。噬菌體呈現描述於例如Dower等人,WO 91/17271;McCafferty等人,WO 92/01047;及Caton及Koprowski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6450-6454(1990)中,各併入本文供參考。在一個使用噬菌體呈現技術之實施例中,分離經免疫之轉殖基因小鼠之cDNA(例如全脾cDNA),使用聚合酶鏈反應以擴增一個編碼免疫球蛋白多肽之一部分(例如CDR區)的cDNA序列,且將經擴增之序列插入噬菌體載體中。以諸如淘選(panning)之標準技術鑑別編碼所關注之肽(例如具有所要結合特徵之可變區肽)的cDNAs。
接著確定經擴增或經選殖之核酸之序列。通常,確定編碼免疫球蛋白多肽之整個可變區之序列,然而,有時將足以僅定序可變區之一部分,例如編碼CDR之部分。通常,所定序之部分長度將為至少30個鹼基,更為通常地,將定序編碼至少約三分之一或至少約二分之一長度之可變區的鹼基。
可對自cDNA庫分離之純系進行定序,或當使用PCR時,在次選殖經擴增之序列後或藉由直接PCR定序經擴增之片段來進行定序。使用標準技術進行定序(參見(例如)Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Guide,第1-3卷,Cold Spring Harbor Press;及Sanger,F.等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467,其均以引用的方式併入本文中)。藉由將經選殖之核酸之序列與人類免疫球蛋白基因及cDNA之公開序列比較,熟習此項技術者將能夠視所定序之區域容易地確定(i)融合瘤免疫球蛋白多肽(包括重鏈之同型)之生殖系片段用法及(ii)重鏈可變區及輕鏈可變域之序列,包括由添加N區及體細胞突變過程所產生之序列。免疫球蛋白基因序列資訊之一來源為Bethesda,Md的國家生物科技資訊中心(National Center for Biotechnology Information)、美國國立醫學圖書館(National Library of Medicine)、美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)。
一旦分離,即可將DNA可操作地連接表現對照序列或置放於表現載體中,接著使其轉染至不另外產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌(E.coli)細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中以引導在重組宿主細胞中合成單株抗體。重組產生抗體在此項技術中熟知。
表現對照序列係指對在特定宿主有機體中表現經可操作地連接之編碼序列所必需之DNA序列。適合於原核生物之對照序列(例如)包括啟動子、視情況操縱基因序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺嘌呤信號及強化子。
當核酸與另一核酸序列處於功能關係中時,該核酸經可操作地連接。舉例而言,若前序列或分泌前導之DNA表現成參與分泌多肽之前體蛋白,則其可操作地連接多肽之DNA;若啟動子或強化子影響序列轉錄,則其可操作地連接編碼序列;或若核糖體結合位點經安置以有利於轉譯,則其可操作地連接編碼序列。一般而言,可操作地連接意謂所連接之DNA序列為鄰近的,且在分泌前導的狀況下為鄰近的且在閱讀相中。然而,強化子並不必須鄰近。藉由在適宜限制性位點處接合來完成連接。若該等位點不存在,則根據習知慣例使用合成寡核苷酸接附子或連接子。
細胞、細胞株及細胞培養物通常可互換使用且所有該等名稱在本文中均包括子代。轉化體及轉化細胞包括來源於其之初級主題細胞及培養物而不考慮轉移體數。亦應瞭解,所有子代之DNA含量可並不精確地相同,此係歸因於有意或無意的突變。當在原始轉化細胞中篩選時具有相同功能或生物活性之突變子代包括在內。
本發明亦提供編碼本發明之特異性結合劑或抗體之經分離核酸,該等經分離核酸視情況可操作地連接由宿主細胞、載體及包含該等核酸之宿主細胞所識別之對照序列;及用於產生特異性結合劑或抗體之重組技術,其可包含培養宿主細胞以表現核酸且視情況自宿主細胞培養物或培養基回收特異性結合劑或抗體。
許多載體在此項技術中已知。載體組份可包括以下各物中之一或多者:信號序列(其可(例如)直接分泌特異性結合劑或抗體)、複製起始點、一或多個選擇性標記基因(其可(例如)賦予抗生素或其他藥物抗性,補足營養缺陷或供給培養基中不可得之關鍵養分)、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列,其中所有者在此項技術中皆熟知。
合適之宿主細胞包括原核生物、酵母或上述較高等真核生物細胞。為達成此目的,合適之原核生物包括真細菌,諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體,例如腸內菌科(Enterobacteriaceae
):諸如埃希氏菌屬(Escherichia
),例如大腸桿菌;腸內菌屬(Enterobacter
);伊文氏菌屬(Erwinia
);克雷伯氏菌屬(Klebsiella
);變形桿菌屬(Proteus
);沙門氏菌屬(Salmonella
),例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium
);沙雷氏菌屬(Serratia
),例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans
);及志賀氏菌屬(Shigella
);以及桿菌屬(Bacilli
),諸如枯草桿菌(B.subtilis
)及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis
);假單胞菌屬(Pseudomonas
);及鏈黴菌屬(Streptomyces
)。除原核生物以外,諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為編碼特異性結合劑之載體之合適的選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae
)或普通麵包酵母(baker's yeast
)在較低等真核宿主微生物中最常使用。然而,許多其他屬、種及菌株為市售的且適用於本文中,諸如畢赤酵母(Pichia
),例如甲醇酵母(P.pastoris
)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe
);刻魯維拉菌(Kluyveromyces
)、耶羅威亞酵母(Yarrowia
);假絲酵母(Candida
);裏氏木黴(Trichoderma reesia
);粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa
);許旺酵母屬(Schwanniomyces
),諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis
);及絲狀真菌,諸如脈孢菌(Neurospora
)、青黴菌(Penicillium
)、彎頸黴(Tolypocladium
)及麯黴(Aspergillus
)宿主(諸如構巢麯黴(A.nidulans
)及黑麯黴(A.niger
))。
用於表現經糖基化之特異性結合劑或抗體之合適之宿主細胞來源於多細胞有機體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別來自以下宿主之眾多桿狀病毒株及變異體及相應容許性昆蟲宿主細胞:諸如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及中國種家蠶(Bombyx mori)。用於轉染該等細胞之多種病毒株公開可得,例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV之L-1變異體及中國種家蠶NPV之Bm-5病毒株。
然而,最大關注於脊椎動物細胞,且在培養物(組織培養物)中繁殖脊椎動物細胞已成為常規程序。適用之哺乳動物宿主細胞株之實例為:中國倉鼠卵巢細胞,包括CHOK1細胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44及中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));由SV40轉化之猴腎CV1細胞株(COS-7,ATCC CRL 1651);經次選殖用於在懸浮液培養物中生長之人類胚胎腎細胞株(293或293細胞)[Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)];幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10);小鼠塞特利氏細胞(Sertoli cell)(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細胞(CV1,ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人類宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2);犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34);水牛鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75);人類肝癌細胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC 5細胞或FS4細胞。
宿主細胞以用於產生特異性結合劑或抗體之上述核酸或載體來轉化或轉染且在適當時經修飾用於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所要序列之基因的習知營養培養基中培養。另外,具有由選擇性標記分離之轉錄單位之多個複本的新穎載體及經轉染之細胞株對於表現特異性結合劑或抗體而言尤其適用且較佳。
用於產生本發明之特異性結合劑或抗體之宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如Ham's F10(Sigma)、最低必需培養基((EMM),(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及杜爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM),Sigma)之市售培養基適於培養宿主細胞。另外,Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979);Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980);美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號或第5,122,469號;WO 90103430;WO 87/00195;或美國專利參照案第30,985號中所述之培養基中之任一者可用作宿主細胞之培養基。此等培養基中之任一者必要時可用以下各物來補充:激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、磷酸鈣、磷酸鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GentamycinTM
藥物)、痕量元素(稱作通常以微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能源。熟習此項技術者所知之任何其他必需補充劑亦可以適當濃度包括在內。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為經選擇用於表現之宿主細胞先前所使用之彼等條件,且將對一般熟習此項技術者顯而易見。將含有適當個別輕鏈及重鏈對之如美國專利申請案第20030082735中所述之表現載體(pDC323及pDC324)轉染至CS9宿主細胞株中。
培養宿主細胞後,特異性結合劑或抗體可在細胞周質間隙中細胞內產生,或直接分泌至培養基中。若細胞內產生特異性結合劑或抗體,則作為第一步驟,(例如)藉由離心或超濾移除微粒碎片(宿主細胞或溶解片段)。
可使用(例如)羥磷灰石層析法、陽離子或陰離子交換層析法或較佳親和層析法、使用所關注之抗原或蛋白質A或蛋白質G作為親和配位體來純化特異性結合劑或抗體組合物。蛋白質A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之特異性結合劑或抗體(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62
:1-13(1983))。推薦蛋白質G用於所有小鼠同型且用於人類γ3(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。親和配位體所連接之基質最常為瓊脂糖,但其他基質亦可用。諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯之機械穩定之基質與可以瓊脂糖達成者相比使流動速率更快且使處理時間更短。當特異性結合劑或抗體包含CH
3域時,Bakerbond ABXTM
樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)適用於純化。視待回收之特異性結合劑或抗體而定,諸如乙醇沉澱、逆相HPLC、色譜焦聚、SDS-PAGE及硫酸銨沉澱之用於蛋白質純化之其他技術亦為可能的。
齧齒動物單株抗體之可變Ig域與人類恆定Ig域融合之嵌合單株抗體可使用此項技術中已知之標準程序來產生(參見Morrison,S.L.,等人(1984)Chimeric Human Antibody Molecules;Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6841-6855;及Boulianne,G.L.,等人,Nature 312,643-646.(1984))。儘管已證實一些嵌合單株抗體在人類中具較小免疫原性,但齧齒動物可變Ig域仍可產生顯著人類抗齧齒動物回應。
人類化抗體可由多種方法獲得,該等方法包括(例如):(1)將非人類互補判定區(CDR)移植於人類構架及恆定區上(在此項技術中稱作經"CDR移植"人類化之方法),或替代地(2)移植整個非人類可變域,但藉由置換表面殘基用類人類表面將其"覆蓋"(在此項技術中稱作"面飾法"之方法)。此等方法揭示於(例如)Jones等人,Nature 321:522 525(1986);Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,81:6851 6855(1984);Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44:6592(1988);Verhoeyer等人,Science 239:1534 1536(1988);Padlan,Molec.Immun.28:489 498(1991);Padlan,Molec.Immunol.31(3):169 217(1994);及Kettleborough,C.A.等人,Protein Eng.4(7):773 83(1991)中,其各者皆以引用的方式併入本文中。
詳言之,單獨或以結合物形式在人類中重複活體內投與之齧齒動物抗體將在抗齧齒動物抗體之接受者中產生免疫反應,所謂HAMA反應(人類抗小鼠抗體)。若需要重複給藥,則HAMA反應可限制藥物之效用。藉由用親水性聚合物(諸如聚乙二醇)化學修飾抗體或藉由使用遺傳工程化之方法以產生更類人類之抗體結合結構可降低抗體之免疫原性。
CDR移植包括將來自小鼠重鏈及輕鏈可變Ig域之六個CDR中之一或多者引入人類可變Ig域之適當構架區中。此技術(Riechmann,L.等人,Nature 332,323(1988))利用保守構架區(FR1-FR4)作為支架以支撐CDR環,該等CDR環為與抗原之主觸點。然而,CDR移植之顯著缺點在於其可產生與原始小鼠抗體相比具有大體上更低結合親和力之人類化抗體,此係由於構架區之胺基酸可有助於抗原結合且由於CDR環之胺基酸可影響兩個可變Ig域之締合。嵌合SR-1抗體在基於細胞之檢定中並不顯示適當功能性效能。
為維持人類化單株抗體之親和力,可藉由選擇最緊密類似於原始小鼠抗體之構架區的人類構架區及藉由抗原結合位點之電腦模擬輔助在構架或CDR內單一胺基酸的定點突變來改良CDR移植技術(例如,Co,M.S.等人(1994),J.Immunol.152,2968-2976)。
一種使抗體人類化之方法包含使非人類重鏈及輕鏈序列與人類重鏈及輕鏈序列對準,基於該對準用人類構架選擇及置換非人類構架,分子模擬以預測人類化序列之構形且與親本抗體之構形比較。在此過程後,使CDR區中之殘基重複回復突變(其打亂CDR之結構)直至所預測之人類化序列模型之構形緊密近似於親本非人類抗體之非人類CDR之構形。可使該等人類化抗體進一步衍生以有利於(例如)經由Ashwell受體捕捉及清除(參見(例如)美國專利第5,530,101號及第5,585,089號)。
已報導由合理設計之小鼠單株抗體之多種人類化(參見(例如)公開於2002年7月11日之20020091240;WO 92/11018;及美國專利第5,693,762號;美國專利第5,766,866號)。抗體之人類工程化亦已描述於(例如)Studnicka等人之美國專利第5,766,886號;Studnicka等人之Protein Engineering 7:805-814(1994)中。
可藉由將適當核苷酸變化引入編碼DNA中或藉由肽合成來製備所要特異性結合劑或抗體之胺基酸序列變異體。該等變異體包括(例如)在特異性結合劑或抗體之胺基酸序列內殘基的缺失及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代之任何組合以達成最終構築體,其限制條件為該最終構築體具有所要特徵。胺基酸變化亦可改變特異性結合劑或人類化或變異抗體之轉譯後過程,諸如改變糖基化位點之數量或位置。
編碼特異性結合劑或抗體之胺基酸序列變異體之核酸分子由此項技術中已知之多種方法來製備。該等方法包括特異性結合劑或抗體之早先所製備之變異體或非變異體變型的寡核苷酸介導(或定點)突變、PCR突變及盒式突變。
用於鑑別對於突變為較佳位置之特異性結合劑或抗體之某些殘基或區域的適用方法稱作如由Cunningham及Wells Science,244:1081-1085(1989)所描述之"丙胺酸掃描突變"。在此,殘基或靶殘基之群(例如帶電殘基,諸如arg、asp、his、lys及glu)得以鑑別且經中性或帶負電胺基酸(最佳為丙胺酸或多聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原的相互作用。藉由在取代位點處或對於取代位點引入另外或其他變異體來改進證明當時對取代具功能敏感性之彼等胺基酸位置。因此,儘管預定對於引入胺基酸序列變異之位點,但突變性質本身無須預定。舉例而言,為分析突變在特定位點處之效能,在靶密碼子或區域處進行ala掃描或隨機突變且對於所要活性篩選經表現之變異體。
一般而言,特異性結合劑或抗體之胺基酸序列變異體將具有與重鏈或輕鏈之原始特異性結合劑或抗體(鼠類或人類化)胺基酸序列具有至少60%胺基酸序列一致性、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%一致性,更佳至少85%一致性、甚至更佳至少90%一致性且最佳至少95%一致性(包括(例如)80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及100%)的胺基酸序列。在使序列對準且引入空隙(必要時)以達成最大序列一致性百分數且並不將任何保守取代(如下表I所定義)視作序列一致性之部分後,關於此序列之一致性或同源性在本文中定義為在與原始序列一致之候選序列中胺基酸殘基之百分數。N末端、C末端或特異性結合劑或抗體序列中之內部擴展、缺失或插入中無一者將被視為影響序列一致性或同源性。因此,可由通常用於比較兩個多肽之胺基酸位置之相似性的標準方法來確定序列一致性。使用諸如BLAST或FASTA之電腦程式,使兩個多肽對準以最佳匹配其個別胺基酸(沿一個或兩個序列之全長或沿一個或兩個序列之預定部分)。程式提供默認開放罰分及默認空位罰分,及記分矩陣(諸如PAM 250)[標準記分矩陣;參見Dayhoff等人,於Atlas of Protein Sequence and Structure
,第5卷,第3增刊(1978)中]可與電腦程式聯合使用。舉例而言,可接著將一致性百分數計算成:一致性匹配之總數乘以100且接著除以在經匹配之跨度內較長序列之長度與引入較長序列中以使兩個序列對準的空位數之和。
胺基酸序列插入包括在自一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽之長度範圍內之胺基及/或羧基末端融合,以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之特異性結合劑或抗體或與抗原決定基標記或補救受體抗原決定基融合之特異性結合劑或抗體(包括抗體片段)。特異性結合劑或抗體分子之其他插入變異體包括(例如)在N末端或C末端處使特異性結合劑或抗體之血清半衰期增加之與多肽的融合。
抗原決定基標記之實例包括flu HA標記多肽及其抗體12CA5[Field等人,Mol.Cell.Biol.8
:2159-2165(1988)];c-myc標記及其8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗體[Evan等人,Mol.Cell.Biol.5(12)
:3610-3616(1985)];及單純疱疹病毒糖蛋白D(gD)標記及其抗體[Paborsky等人,Protein Engineering 3(6)
:547-553(1990)]。其他例示性標記為使使用鎳螯合作標記之化合物分離的一般約六個組胺酸殘基之聚組胺酸序列。其他標籤及標記(諸如FLAG標記)(Eastman Kodak,Rochester,NY)在此項技術中熟知且通常使用。
術語"補救受體(salvage receptor)結合抗原決定基"係指擔負使IgG分子之活體內血清半衰期增加之IgG分子(例如IgG1
、IgG2
、IgG3
或IgG4
)之Fc區的抗原決定基。
另一類型之變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體具有在特異性結合劑或抗體分子中之至少一個胺基酸殘基經移除且不同殘基插入其位置中。涵蓋在高變區或CDR區或構架區中之任一者內之取代型突變。保守取代展示於表1中。最保守取代見於"較佳取代"之標頭下。若該等取代使生物活性無變化,則可引入在表1中命名為"例示性取代"或如根據胺基酸類別在下文中進一步描述之更實質性變化且篩選產物。
特異性結合劑或抗體之生物特性的實質性修飾可藉由選擇取代來完成,該等取代對於維持(a)在取代區域中之多肽骨架之結構(例如呈片式或螺旋構形)、(b)在目標位點處之分子的電荷或疏水性或(c)側鏈之大小的作用方面顯著不同。基於常見側鏈特性將天然產生之殘基分組:(1)疏水性:正白胺酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性親水性:cys、ser、thr;(3)酸性:asp、glu;(4)鹼性:asn、gln、hiS、lys、arg;(5)影響鏈定位之殘基:gly、pro;及(6)芳族:trp、tyr、phe。
保守取代包括將胺基酸用其類別之另一成員置換。非保守取代包括將此等類別中之一者之成員用另一類別之成員置換。
並不涉及維持特異性結合劑或人類化或變異抗體之適當構形的任何半胱胺酸殘基亦可(一般)經絲胺酸取代以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反地,可將半胱胺酸鍵添加至特異性結合劑或抗體中以改良其穩定性(尤其當抗體為諸如Fv片段之抗體片段時)。
親和力成熟包括製備及篩選在親本特異性結合劑或抗體之CDR內具有突變(缺失、插入或取代)之特異性結合劑或抗體變異體且選擇相對於親本結合劑或抗體具有改良之生物特性(諸如結合親和力)之變異體。用於產生該等取代型變異體之便利方式為使用噬菌體呈現的親和力成熟。簡而言之,使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以在每一位點處產生所有可能之胺基取代。由此產生之特異性結合劑或抗體變異體當與封裝於每一粒子內之M13之基因III型產物融合時可以單價方式自絲狀噬菌體粒子呈現。接著對於經噬菌體呈現之變異體之生物活性(例如結合親和力)篩選經噬菌體呈現之變異體。
可進行丙胺酸掃描突變以鑑別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。或者或另外,可有利的為分析抗原抗體複合物之晶體結構以鑑別特異性結合劑或抗體與抗原之間的接觸點。該等接觸殘基及鄰近殘基為用於根據本文中詳述之技術取代的候選物。一旦產生該等變異體,則使變異體之組經受如本文中所述之篩選且可選擇在一或多個相關檢定中具有優越特性之特異性結合劑或抗體用於進一步發展。
利用基因改組及定向進化之技術亦可用於製備及篩選所要活性之特異性結合劑或抗體變異體。舉例而言,Jermutus等人,Proc Natl Acad Sci USA.2001 Jan 2;98(1):75-80報導將基於核糖體呈現之特製活體外選擇策略與藉由DNA改組之活體外多樣化組合以發展單鏈Fv抗體片段(scFv)之解離速率或熱力學穩定性;Fermer等人,Tumour Biol.2004年1月-4月;25(1-2):7-13報導使用與DNA改組組合之噬菌體呈現使親和力升高差不多三個量級。
亦可產生特異性結合劑或抗體變異體,其相對於親本特異性結合劑或抗體具有經修飾之糖基化模式,例如使在特異性結合劑或抗體中所發現之一或多個碳水化合物部分缺失,及/或添加不存在於特異性結合劑或抗體中之一或多個糖基化位點。
包括抗體之多肽的糖基化通常經N連接或經O連接。經N連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺酸殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為用於碳水化合物部分與天冬醯胺酸側鏈之酶促連接之識別序列。此等三肽序列中之任一者在多肽中的存在產生潛在糖基化位點。因此,可藉由改變胺基酸序列以使其含有此等三肽序列中之一或多者將經N連接之糖基化位點添加至特異性結合劑或抗體中。經O連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸連接,儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸,但該羥基胺基酸最通常為絲胺酸或蘇胺酸。可藉由對原始特異性結合劑或抗體之序列插入或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基將經O連接之糖基化位點添加至特異性結合劑或抗體中。
可移除半胱胺酸殘基或將其引入Fc區中,進而在此區域中消除或增加鏈間二硫鍵形成。由此產生之同源二聚特異性結合劑或抗體可具有改良之內化能力及/或增加之補體介導細胞殺傷性及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人,J.Exp Med.176:1191-1195(1992)及Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。如Wolff等人,Cancer Research 53:2560-2565(1993)所述,亦可使用異型雙功能交聯劑製備同源二聚特異性結合劑或抗體。或者,可工程化特異性結合劑或抗體,其具有雙Fc區且進而可具有增強之補體溶解性及ADCC能力。參見Stevenson等人,Anti-CancerDrug Design 3:219-230(1989)。
已顯示CDR內之序列可使抗體與II類MHC結合且觸發不當之輔助性T細胞反應。保守取代可使特異性結合劑或抗體保持結合活性而降低其觸發不當之T細胞反應的能力。
亦預期移除重鏈或輕鏈之N末端20個胺基酸中之一或多者。
亦可需要進行修飾以增加血清半衰期,例如藉由併入或添加補救受體結合抗原決定基(例如藉由使適當區域突變或藉由將抗原決定基併入肽標記中,接著使該肽標記與特異性結合劑或抗體在任一端或在中間(例如藉由DNA或肽合成)而融合)(參見(例如)WO96/32478)或添加諸如PEG之分子或包括多醣聚合物之其他水可溶性聚合物。
補救受體結合抗原決定基較佳組成其中來自Fc域之一個或兩個環之任意一或多個胺基酸殘基轉移至特異性結合劑或抗體或片段之類似位置的區域。甚至更佳地,轉移來自Fc域之一個或兩個環之三個或三個以上殘基。更佳地,抗原決定基自Fc區(例如IgG之Fc區)之CH
2域獲取且轉移至特異性結合劑或抗體之CH
1、CH
3或VH
區或一個以上該區域。或者,抗原決定基自Fc區之CH
2域獲取且轉移至特異性結合劑或抗體片段之CL
區或VL
區或二者。亦參見國際申請案WO 97/34631及WO 96/32478,其描述Fc變異體及其與補救受體的相互作用。
調節IgG活體內穩定視其與FcRn的結合性而定。已報導修飾IgG之Fc域與FcRn之間的相互作用改良單株抗體之血清半衰期。使與新生Fc受體FcRn結合之親和力更高且減緩降解且改良PK概況之Fc中之突變應為較佳。IgG上之FcRn結合位點定位於CH
2-CH
3域界面處。在此區域中之殘基突變(M428L及T250Q/M428L、T250Q/M428L、P257I/Q31II、M252Y/S254T/T256E、H433K/N434F/Y436H或M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F/Y436H)使在pH 6.0及pH 7.3下IgG1對人類FcRn之親和力增加。另外,當靜脈內給予猴時,一些此等突變使藥物動力學特性增強(清除更慢、半衰期更長)。
已鑑別為形成補體依賴性細胞毒性(CDC)之原因的恆定區之其他位點,諸如C1q結合位點及/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)[參見(例如)Molec.Immunol.29(5):633-9(1992);Shields等人,J.Biol.Chem.,276(9):6591-6604(2001),其以引用的方式全部併入本文中]。在Fc受體結合位點內殘基的突變可使效應功能改變(亦即增加或降低),諸如ADCC或CDC活性改變或半衰期改變。如上所述,潛在突變包括一或多個殘基的插入、缺失或取代,其包括用丙胺酸取代、保守取代、非保守取代或在來自不同亞類之同一位置處用相應胺基酸殘基置換(例如在彼位置處用相應IgG2殘基置換IgG1殘基)。
特異性結合劑或抗體之共價修飾亦包括於本發明之範疇內。其可(若適用)藉由特異性結合劑或抗體之化學合成或藉由特異性結合劑或抗體之酶促或化學裂解來進行。可藉由使靶向之胺基酸殘基與能與所選擇之側鏈或N末端或C末端殘基反應的有機衍生劑反應將其他類型之共價修飾引入特異性結合劑或抗體中。
使最常見的半胱胺醯基殘基與α-鹵乙酸酯(及相應胺)(諸如氯乙酸或氯乙醯胺)反應以得到羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦可藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙醯酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑反應而衍生。
組胺醯基殘基藉由與焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反應而衍生,此係由於該焦碳酸二乙酯試劑對組胺醯基側鏈相對具特異性。對溴苯乙醯基溴亦適用;反應較佳在0.1 M二甲胂酸鈉中在pH 6.0下進行。
離胺醯基及胺基末端殘基與丁二酸酐或其他羧酸酐反應。用此等試劑衍生具有使離胺醯基殘基之電荷變相反的作用。用於使含α-胺基之殘基衍生之其他合適之試劑包括亞胺基酯(諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮及與乙醛酸酯之轉胺酶催化反應。
精胺醯基殘基藉由與一或多種習知試劑(尤其苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚三酮)反應而得以修飾。精胺酸殘基的衍生需要使反應在鹼性條件下進行,此係由於胍官能基之高pKa
。此外,此等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。
可進行酪胺醯基殘基的特異性修飾,尤其關注藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標籤引入酪胺醯基殘基中。最常見地,N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷用於分別形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。使用125
I或131
I使酪胺醯基殘基碘化以製備經標記之蛋白質以在放射性免疫檢定中使用。
側羧基(天冬胺醯基或麩胺醯基)藉由與諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二醯亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二醯亞胺之碳化二醯亞胺(R-N.dbd.C.dbd.N-R')(其中R及R'為不同烷基)反應而選擇性修飾。此外,天冬胺醯基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應而轉化成天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。
分別使麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基頻繁脫醯胺成相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。使此等殘基在中性或鹼性條件下脫醯胺。此等殘基之脫醯胺之形式屬於本發明之範疇內。
其他修飾包括脯胺酸及離胺酸的羥基化,絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基的磷酸化,離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,第79-86頁(1983)),N末端胺的乙醯化,及任何C末端羧基的醯胺化。
另一類型之共價修飾包括使糖苷與特異性結合劑或抗體化學或酶促偶聯。此等程序之優勢在於其不需要在具有經N連接或經O連接之糖基化的糖基化能力之宿主細胞中產生特異性結合劑或抗體。視所使用之偶聯模式而定,糖可與以下各物連接:(a)精胺酸及組胺酸,(b)游離羧基,(c)游離硫氫基(諸如半胱胺酸之彼等游離硫氫基),(d)游離羥基(諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之彼等游離羥基),(e)芳族殘基(諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等芳族殘基),或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於1987年9月11日公開之WO87/05330中及Aplin及Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,第259-306頁(1981)中。
存在於特異性結合劑或抗體上之任何碳水化合物部分的移除可以化學方式或以酶促方式來完成。化學去糖基化需要將特異性結合劑或抗體暴露於化合物三氟甲烷磺酸或等效化合物。此處理使除連接糖(N-乙醯基葡糖胺或N-乙醯基半乳胺糖)以外之多數或所有糖裂解,同時留下完整特異性結合劑或抗體。化學去糖基化由Hakimuddin等人Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)及由Edge等人Anal.Biochem.,118:131(1981)描述。如由Thotakura等人Meth.Enzymol.138:350(1987)所述,在特異性結合劑或抗體上之碳水化合物部分的酶促裂解可藉由使用多種內糖苷酶及外糖苷酶來達成。
特異性結合劑或抗體之另一類型之共價修飾包含使特異性結合劑或抗體與例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油、聚環氧烷或多醣聚合物(諸如葡聚糖)之多種非蛋白質聚合物中之一者連接。該等方法在此項技術中已知,參見(例如)美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號、第4,179,337號、第4,766,106號、第4,179,337號、第4,495,285號、第4,609,546號或EP 315 456。
"治療"為以預防病症發展或改變病症之病理學為目的所進行的介入。因此,"治療"係指治療性療法與預防性量測。需要治療者包括已患有病症者以及有待預防病症者。
對於治療目的而言,"哺乳動物"係指歸類為哺乳動物之任何動物,包括人類、家畜及農畜及動物園動物、運動型動物或寵物型動物,諸如狗、馬、貓、母牛等。較佳地,哺乳動物為人類。
如本文中所使用,短語"治療有效量"意指提供肥大細胞或祖(progenitor)細胞數量及/或活性下降、纖維樣(fibroid)元素或其前驅體減少或提供c-Kit相關疾病有關症狀的嚴重性或進展下降(亦即提供"治療功效")之治療用或預防用人類化c-Kit抗體的量。肥大細胞及祖造血多能幹細胞為表現c-Kit之初級細胞類型,因此預期HSC衍生之細胞(諸如肥大細胞及疾病所涉及之細胞)可用本發明之組合物及方法來處理。
短語"減少纖維化之活性"意指完全或部分抑制及逆轉免疫系統活化所產生之炎症及纖維化的能力。
如本文中所使用,術語"纖維化疾病或病症"係指涉及一或多個組織中纖維化的病狀。如本文中所使用,術語"纖維化"係指過量纖維結締組織在器官或組織中以反應性過程異常形成或發展,與纖維組織以正常組份形成或器官或組織之癒合相反。纖維化係由在任何特定組織中纖維母細胞積聚及超過正常沈積的膠原蛋白沈積來表徵。如本文中所使用,術語"纖維化"與"異常癒合,包括間葉細胞-纖維母細胞轉變,過多纖維母細胞增殖、活性及膠原蛋白及其他細胞外基質蛋白沈積"同義使用。
纖維母細胞為結締組織細胞,其分散於全身之結締組織中。纖維母細胞分泌一種含有I型及/或III型膠原蛋白之非硬性細胞外基質。回應組織之損傷,附近循環中之纖維母細胞或間葉細胞前驅細胞遷移至創口,可在其他細胞(諸如肥大細胞)及其介體影響下變得替代性活化,增生,且產生大量膠原性細胞外基質。膠原蛋白為富含甘胺酸及脯胺酸之纖維蛋白,其為細胞外基質及結締組織、軟骨及骨之主要組份。膠原蛋白分子為稱作α-鏈之三股螺旋結構,其以繩狀螺旋形式彼此纏繞。膠原蛋白以若干形式或類型存在;其中,最常見的I型見於皮膚、肌腱及骨中;III型見於皮膚、血管及內臟器官中。
肥大細胞相關之纖維化疾病包括:病理性纖維化或瘢痕化(包括心臟內硬化)、特發性間質纖維化、肺間質纖維化、肌肉周邊纖維化、西姆斯氏纖維化(Symmers' fibrosis)、周心纖維化、肝炎、皮膚纖維瘤、膽汁性肝硬化、酒精性肝硬化、急性肺纖維化、特發性肺纖維化、急性呼吸窘迫症候群、腎纖維化/絲球體腎炎、腎纖維化/糖尿病腎病變、全身性硬皮病、局部硬皮病、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕、嚴重關節黏連/關節炎、骨髓纖維化、角膜瘢痕、囊腫性纖維化、肌肉萎縮症(杜興氏(duchenne's))、心臟纖維化、肌肉纖維化/視網膜分離、食管狹窄及payronles疾病。此外,纖維化病症可由手術誘導或引發,包括瘢痕修復/整形手術、青光眼、白內障纖維化、角膜瘢痕、關節黏連、移植物抗宿主疾病、肌腱手術、神經壓迫、杜普宜特朗氏巒縮(dupuytren's contracture)、OB/GYN黏連/纖維化、骨盆腔黏連、硬膜外纖維化、再狹窄。亦預期纖維結合蛋白沈積為病因因素之纖維化病狀可根據本發明來治療。特發性肺纖維化、博萊黴素(bleomycin)肺、囊腫性纖維化及腎小球性腎病變(包括特徵為Fn沈積於腎中最終導致腎衰竭之疾病)為亦可根據本發明治療之病狀的實例。涉及免疫系統活化且其中肥大細胞分泌發炎性細胞激素(諸如TNF)且可活化淋巴細胞及直接與淋巴細胞相互作用之炎症亦可根據本發明來治療。
咸信硬皮病為引起纖維化病症之結締組織之自體免疫疾病,該纖維化疾病之特徵為由皮膚或其他器官中之纖維母細胞過度產生新膠原蛋白所引起之皮膚增厚及硬化。硬皮病可以涉及許多器官之局部或全身性疾病的形式發生。硬皮病亦稱作全身性硬化症。硬皮病病理學的發展與在患病組織/器官中肥大細胞數量增加相關。
全身性硬化症之特徵為形成玻璃樣化及增厚之膠原性纖維組織,伴有皮膚增厚且與皮下組織(尤其手部及面部之皮下組織)黏連。該疾病之特徵亦可為由因喪失蠕動性及食道之黏膜下層纖維化引起之吞咽困難,因肺纖維化、心肌纖維化引起之呼吸困難,及腎血管病變(Stedman's Medical Dictionary,第26版,Williams & Wilkins,1995)。肺纖維化影響30%至70%之硬皮病患者,其常引起限制性肺病(Atamas等人Cytokine and Growth Factor Rev 14
:537-550(2003))。一些患者患有重疊之硬皮病與諸如類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症及多肌炎之其他結締組織疾病。當硬皮病特徵與多肌炎及全身性紅斑性狼瘡症之特徵同時存在時,病狀稱為混合型結締組織疾病(MCTD)。
已知以一些形式之皮炎存在之症狀係由皮膚肥大細胞去粒使得(尤其)組胺酸釋放而引起。因此,適於根據本發明治療之另一肥大細胞相關之病症為色素性蕁麻疹。此病症呈現特徵性皮膚損傷,其為摩擦時產生痛癢之單一或多個有色斑點或節結且含有大量肥大細胞。有不同形式之相關皮炎(皮膚炎症)(諸如紅斑、水腫、丘疹及瘙癢)可存在於人類與動物皮炎中,上述所有皆可根據本發明來治療。
肥大細胞增多症在許多狀況下為贅生性疾病且涉及新穎或異常肥大細胞生長且可為SCF自分泌信號轉導增加或活化c-Kit突變之結果。肥大細胞增多症可為局部或全身性的,其涉及多個器官,諸如骨髓。肥大細胞回應某些事件將某些介體或化學物質(其中一者為組織胺)釋放於身體中。患有全身性肥大細胞增多症之人群使肥大細胞之數量增加得以發展,或其使功能可能不當之異常形狀之肥大細胞得以發展。另外,當假定肥大細胞未能相繼死亡時,其進一步增加總肥大細胞負荷。當肥大細胞去粒且釋放其內含物時,其可引起許多急性及潛在嚴重病狀或疾病。肥大細胞病症亦包括使諸如孤立性皮膚肥大細胞瘤之局部疾病至肥大細胞白血病之更嚴重疾病的增殖性病症。實例包括皮膚肥大細胞瘤、侵襲性肥大細胞增多症、無痛性肥大細胞增多症、具有相關血液病之肥大細胞增多症、色素性蕁麻疹、恆定發疹性毛細血管擴張(tmep)、全身性肥大細胞疾病、肥大細胞白血病、骨髓白血病、全身性肥大細胞增多症(有或無皮膚表現,諸如色素性蕁麻疹)、肥大細胞活化症候群/病症及更常見的兒科肥大細胞病症(諸如孤立性肥大細胞瘤及彌漫皮膚肥大細胞增多症)。
肥大細胞活化症候群或病症由正常或接近正常數目之肥大細胞表徵。然而,易於觸發肥大細胞釋放其內含物,其引起許多相同症狀。過敏及休克之危險與此病症一起存在,但不同於肥大細胞之增殖性病症,此症候群可不具有發展成更具侵襲性或更惡性之階段的潛力。與肥大細胞去粒相關之該等病症之實例可包括:腹痛、蕁麻疹及皮疹、過敏症、食道炎症、血壓變化及休克、腸絞痛及膨脹、骨痛(輕度至嚴重/虛弱)、瘙癢(有或無皮疹)、胸痛(涉及肝、脾及其他器官)、認知困難/腦霧、吸收障礙、退變性椎間盤病、偏頭痛、腹瀉、肌肉疼痛、頭昏/眩暈/頭暈目眩、噁心、昏厥、骨質疏鬆症/骨質減少、疲勞、外周神經病變及感覺異常、面部潮紅、快速心率、胃食道逆流及嘔吐。
肥大細胞在過敏性疾病中之作用已由藥物臨床驗證,該等藥物阻斷肥大細胞特異性介體(諸如組織胺及皮質類固醇),該等介體之活性使肥大細胞凋亡。其他肥大細胞相關之疾病包括組織胺介導之過敏性反應,其可藉由抑制趨化激素誘導之肥大細胞及嗜鹼細胞去粒及組織胺釋放來治療。可用本發明方法及組合物有效治療之肥大細胞相關之病症或疾病的實例亦包括(但不限於):接觸性皮炎、異位性皮炎、過敏性皮炎、濕疹性皮炎及由昆蟲咬傷或螫刺引起之皮炎。
適於由本發明之方法及組合物治療之其他肥大細胞相關之適應症包括間質性肺病中之肺部發炎性病狀,例如類肉瘤病、新生兒呼吸窘迫症候群(RDS)、支氣管肺發育異常(BPD);及由血清PLA2活性升高表徵之病狀,諸如成人RDS(ARDS)。
亦已公開肥大細胞在關節炎中顯示作用。肥大細胞在RA及OA患者之發炎性滑膜組織中增加,且已顯示Gleevec使滑膜外植體中肥大細胞凋亡且人類病例研究顯示在RA患者中之功效。肥大細胞在敗血性休克、胰腺炎、膠原血管疾病、急性腎衰竭、腹膜炎及自體免疫葡萄膜炎中有作用。
研究亦表明肥大細胞參與多發性硬化症之病理生理學。應瞭解,腦中之肥大細胞釋放可引起脫髓鞘之血管活性胺。自肥大細胞釋放之組織胺可改變血管完整性且使又牽涉於多發性硬化症之病源學中之血腦障壁部分破裂。因此,預期本發明之方法及組合物適於治療或改善與多發性硬化症相關之病態。
C-kit亦在某些未免疫細胞(諸如黑素細胞及腸道細胞)以及精母細胞上表現。本發明可在治療黑素瘤及GIST中具有效用且可在作為男性避孕藥方面具有效用。
可將在實施本發明之方法中使用之抗c-Kit特異性結合劑或抗體調配成包含適於所要傳遞方法之載劑的醫藥組合物。合適之載劑包括當與抗c-Kit特異性結合劑及中性拮抗劑或抗體組合時保持對c-Kit之高親和力結合及效能且與個體之免疫系統不反應的任何物質。實例包括(但不限於)許多標準醫藥載劑中之任一者,諸如無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、抑菌水及其類似物。可使用多種水性載劑,例如水、經緩衝之水、0.4%生理食鹽水、0.3%甘胺酸及其類似物;且可包括經受輕度化學修飾及其類似修飾之用於增強穩定性之其他蛋白質,諸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。
在調配物中例示性抗體濃度可在約0.1 mg/ml至約180 mg/ml,或約0.1 mg/mL至約50 mg/mL,或約0.5 mg/mL至約25 mg/mL,或替代地約2 mg/mL至約10 mg/mL之範圍內。抗體之水性調配物可在pH緩衝溶液中製備,例如在約4.5至約6.5,或約4.8至約5.5,或替代地約5.0之pH值下製備。適合於此範圍內之pH值的緩衝液之實例包括乙酸鹽(例如乙酸鈉)、丁二酸鹽(諸如丁二酸鈉)、葡糖酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽及其他有機酸緩衝液。緩衝液濃度可為約1 mM至約200 mM或約10 mM至約60 mM,其取決於(例如)緩衝液及調配物之所要等張性。
亦可穩定抗體之張力劑可包括於調配物中。例示性張力劑包括多元醇,諸如甘露醇;蔗糖或海藻糖。儘管高張性或低張性溶液可適合,但較佳地,水性調配物為等張性的。調配物中多元醇之例示性濃度可在約1%至約15%(重量/體積)之範圍內。
亦可將界面活性劑添加至抗體調配物中以減少經調配之抗體凝集及/或使調配物中微粒形成最少及/或減少吸附。例示性界面活性劑包括非離子型界面活性劑,諸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。界面活性劑之例示性濃度可在約0.001%至約0.5%,或約0.005%至約0.2%,或替代地約0.004%至約0.01%(重量/體積)之範圍內。
在一實施例中,調配物含有上述鑑別之試劑(亦即抗體、緩衝液、多元醇及界面活性劑)且基本上不含一或多種防腐劑,諸如苄醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇及苄索氯銨(benzethonium Cl)。在另一實施例中,防腐劑可(例如)以約0.1%至約2%或替代地約0.5%至約1%範圍內之濃度包括於調配物中。一或多種其他醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(諸如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編(1980)中所述之彼等者)可包括於調配物中,其限制條件為其不負面影響調配物之所要特徵。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所使用之劑量及濃度下對接受者無毒且包括:其他緩衝劑;共溶劑;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;螯合劑,諸如EDTA;金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物);生物可降解聚合物,諸如聚酯;及/或成鹽平衡離子,諸如鈉。
藉由將具有所要純度之抗體與可選生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編(1980))混合來製備呈經凍乾之調配物或水溶液形式的抗體之治療用調配物。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所使用之劑量及濃度下對接受者無毒,且包括:緩衝液,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨;氯化六羥季銨;氯化苯甲烴銨、苄索氯銨;苯酚、丁醇或苄醇;對羥基苯甲酸烷酯,諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;及間甲酚);低分子量(小於約10個殘基)多肽;蛋白質,諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、雙醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖、麥芽糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖,諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽平衡離子,諸如鈉;金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物);及/或非離子型界面活性劑,諸如TWEENTM
、PLURONICSTM
或聚乙二醇(PEG)。
在一實施例中,本發明之合適之調配物含有與使等張且穩定之張力劑(諸如多元醇、山梨糖醇、蔗糖或氯化鈉)組合之等張緩衝液,諸如磷酸鹽、乙酸鹽或TRIS緩衝液。該張力劑之一實例為5%山梨糖醇或蔗糖。另外,調配物可視情況包括0.01%至0.02%(重量/體積)之界面活性劑以防止凝集且用於穩定。調配物之pH值可在4.5-6.5或4.5至5.5之範圍內。對於抗體之醫藥調配物之其他例示性描述可見於US 2003/0113316及美國專利第6,171,586號中,各專利均以引用的方式全部併入本文中。
本文中之調配物亦可含有對於待治療之特定適應症所必需之一種以上活性化合物,較佳為具有彼此不負面影響之互補活性的彼等活性化合物。舉例而言,可需要進一步提供免疫抑制劑。該等分子以對所預期之目的有效的量適宜地以組合形式存在。
活性成份亦可例如由凝聚技術或由界面聚合圈閉於所製備之微囊(例如分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編(1980)中。
亦涵蓋抗體之懸浮液及晶體形式。製備懸浮液及晶體形式之方法為熟習此項技術者所知。
待用於活體內投與之調配物必須無菌。本發明之組合物可由習知、熟知之殺菌技術來殺菌。舉例而言,殺菌易於藉由經無菌過濾膜過濾來完成。可將所得溶液封裝待用或在無菌條件下過濾且凍乾,投藥前將經凍乾之製劑與無菌溶液組合。
尤其當多肽在液體組合物中相對不穩定時,冷凍乾燥法常用於穩定多肽以長期儲存。凍乾週期通常包含三個步驟:冷凍、一次乾燥及二次乾燥;Williams及Polli,Journal of Parenteral Science and Technology,第38卷,第2號,第48-59頁(1984)。在冷凍步驟中,使溶液冷卻直至其充分冷凍。溶液中之大量水在此階段形成冰。在一次乾燥階段中使冰昇華,其藉由使用真空使腔室壓力降至冰之蒸氣壓以下來進行。最終,在二次乾燥階段中在降低之腔室壓力及升高之存放溫度下移除吸著水或結合水。該方法產生稱作凍乾餅之物質。其後,在使用前使該餅復水。
儘管在製備用於非經腸投藥之藥物中有時使用抗菌劑之稀溶液,但用於經凍乾之物質之標準復水實踐為反向添加某體積之純水(通常與凍乾期間所移除之體積相當);Chen,Drug Development and Industrial Pharmacy,第18卷,第11號及第12號,第1311-1354頁(1992)。
已注意到賦形劑在某些狀況下充當經冷凍乾燥之產物的穩定劑;Carpenter等人,Developments in Biological Standardization,第74卷,第225-239頁(1991)。舉例而言,已知賦形劑包括多元醇(包括甘露糖醇、山梨糖醇及甘油);糖(包括葡萄糖及蔗糖);及胺基酸(包括丙胺酸、甘胺酸及麩胺酸)。
另外,多元醇及糖亦常用於保護多肽免受冷凍及乾燥誘發之損害且增強在乾燥狀況下在儲存期間的穩定性。一般而言,糖(尤其雙醣)在冷凍乾燥過程中與儲存期間均有效。亦已報導包括單醣及雙醣及諸如PVP之聚合物之其他類別之分子作為經凍乾之產物的穩定劑。
對於注射而言,醫藥調配物及/或藥物可為適合於用如上所述之適當溶液復水的散劑。此等散劑之實例包括(但不限於):經冷凍乾燥、經旋轉乾燥或經噴霧乾燥之散劑,非晶形散劑,顆粒,沉澱物或微粒。對於注射而言,調配物可視情況含有穩定劑、pH調節劑、界面活性劑、生物可用性調節劑及此等試劑之組合。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質,該等基質呈成形物品(例如薄膜或微囊)的形式。持續釋放基質之實例包括:聚酯;水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇));聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號);L-麩胺酸及γ-乙基-L-麩胺酸酯之共聚物;不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯;可降解乳酸-乙醇酸共聚物,諸如Lupron DepotTM
(包含乳酸-乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)之可注射微球體);及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能釋放分子歷時超過100天,但某些水凝膠釋放蛋白質歷時較短的時間。當經囊封之抗體保留於身體中歷時長時間時,其因暴露於37℃下之濕度而可能變性或聚集,使得生物活性損失且使免疫原性可能變化。可設計合理的策略使其穩定化,其視所涉及之機制而定。舉例而言,若發現凝集機制為經硫基-二硫化物互換形成分子間S--S鍵,則可藉由修飾硫氫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來達成穩定。
可將本發明之調配物設計成短效、快速釋放、長效或如本文中所述之持續釋放型。因此,醫藥調配物亦可經調配用於受控釋放或用於緩慢釋放。
特定劑量可視個體之疾病病狀、年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食,給藥時間間隔,投藥途徑,排泄率及藥物組合來調整。含有有效量之上述劑型中之任一者良好地處於常規實驗之範圍內,且由此良好地處於本發明之範疇內。
特異性結合劑或抗體由任何合適之方式來投與,該等方式包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內,且必要時用於局部治療、病灶內投藥。非經腸輸注包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮內或皮下投藥。另外,特異性結合劑或抗體適宜地藉由脈衝輸注來投藥,較佳以該特異性結合劑或抗體之遞減劑量投藥。較佳地,藉由注射給藥,更佳地藉由靜脈內或皮下注射給藥,其部分取決於投藥為短暫性或慢性。涵蓋其他投藥方法,包括(例如)經由接近所要位點置放之導管局部、尤其經皮、經黏膜、經直腸、經口或局部投藥。最佳地,本發明之特異性結合劑或抗體在生理溶液中以介於0.01 mg/kg至100 mg/kg之間的範圍內之劑量以每天至每週至每月之頻率(例如每天、每隔一天、每隔兩天,或每週2次、3次、4次、5次或6次)經靜脈內投藥,較佳為在0.1至45 mg/kg、0.1至15 mg/kg或0.1至10 mg/kg之範圍內之劑量以每週2次或3次之頻率或高達45 mg/kg每月一次投藥。
本發明之抗體亦可與其他抗發炎治療劑一起並行投藥。並行投藥包括在不同時間及以不同途徑投與兩種不同治療劑,只要在試劑發揮其治療作用之時間內有一些重疊即可。此項技術中已知之例示性抗c-Kit試劑包括甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)(GleevecTM
)。請注意,甲磺酸伊馬替尼亦對來自Abl酪胺酸激酶之信號轉導起拮抗作用且因此其並非特異性c-Kit抑制劑。
SR-1藉由直接CDR移植而人類化,儘管其保持所要功能活性有待於證實,但令人驚訝地其對維持親和力所需而言無回復突變。將維持最典型殘基且不引入其他脯胺酸殘基之人類構架選作受體序列。基於此等準則,重鏈受體序列為構架I及II之VH1 1-46及構架III之VH1 1-e,其中JH4作為最接近之J區(亦稱作構架IV)。輕鏈受體序列為VK4 B3生殖系序列,其中JK2作為最接近之J區。
完成同型轉換以產生人類化抗體之人類IgG2、IgG1、IgG4P及無糖基化(aglycosylated)之IgG1形式。藉由使在位置297(Kabat編號)處之單一殘基自天冬醯胺酸突變成麩胺酸而自人類IgG1恆定區序列移除經N連接之糖基化一致位點。
呈無糖基化之IgG1(hSR-1 aIgG1)形式之人類化SR-1以所要方式以比對可溶性c-Kit之親和力更高之親和力結合膜c-Kit,且為SCF之高效中性拮抗劑且在使用c-Kit信號轉導之近側及遠側讀出來測試之所有基於細胞的檢定中介導對c-Kit無直接促效作用。選擇無糖基化之IgG1同型以避免效應功能及經由旁觀者效應(bystander effect)使細胞殺死。此抗體在猴中顯示意想不到且所要之半衰期、非線性PK及可飽和之靶介導抗體消除。如預期,其亦使活體內肥大細胞衰竭。
結合後由幹細胞因子(SCF)活化c-Kit使得最可能經內涵蛋白依賴性路徑二聚/低聚、自體磷酸化及受體內化。如由Biacore測定,與可溶性c-Kit細胞外域單體相比,SR-1單株抗體以高1000倍之親和力結合c-Kit二聚體。動力學模擬表明即使在ng/ml之可溶性排出受體單體存在下SR-1亦會優先結合原生膜相關受體。
存在於糖蛋白上之碳水化合物可影響生物及功能特性。使SR-1人類化成無糖基化之IgG1形式顯示結合參數得以保留。以1.0 pM之KinExA平衡結合Kd且使用Biacore檢定,人類化SR-1 aIgG1結合重組c-Kit受體Fc,hSR-1 aIgG1阻斷具有Ki=70之幹細胞因子(SCF)結合性。與單體相比,hSR-1 aIgG1以高親和力結合受體二聚體。其為並未預期確信以人類化轉譯之重要特徵且係由於可溶性c-Kit單體不太可能充當活體內抗體之彙集點。
人類巨核母細胞細胞株UT-7依賴於SCF存活且移除SCF或抑制SCF使得生存力快速損失且增殖減少。此檢定適合於SCF拮抗劑之IC50效能測定。hSR-1 aIgG1顯示35 pM之平均IC50。
hSR-1 aIgG1有效抑制在MO7e細胞中SCF介導之c-Kit磷酸化及內化,其指示抗體可阻斷SCF介導之c-Kit信號轉導事件。與SR-1能本質上介導c-Kit內化及磷酸化的發現相反,令人驚訝地,在對於hSR-1 aIgG1之MO7e c-Kit受體近側磷酸化讀出中偵測到無促效跡象。顯著地,對於hSR-1 IgG2而言,IgG2抗體有效性稍小且並不完全抑制SCF介導之c-Kit受體內化。
使用初級經分離人類CD34+、CD1l7+(c-Kit)骨髓細胞在來源於GM-CSF之菌落形成上在1.0 μg/mL之SCF協同效應下hSR-1 aIgG1顯示中性。與hSR-1 aIgG1並不介導c-Kit內化或磷酸化之吾人之新穎發現一致,且在此檢定中對於高達10 μg/mL濃度之抗體觀測到hSR-1 aIgG1無本質的拮抗存活活性。實際上,抗體能在基線以下抑制存活。
來源於骨髓CD34+細胞之經培養之人類肥大細胞用於評估化合物之表觀效能及等級次序。hSR-1 aIgG1抑制SCF依賴性肥大細胞存活,不賦予肥大細胞存活信號,不介導c-Kit受體磷酸化(圖3)且顯示無介導同型肥大細胞凝集之能力。相反,hSR-1 IgG2能阻斷SCF肥大細胞存活,但本身顯示賦予存活信號、介導c-Kit受體磷酸化且產生對肥大細胞叢集起重現性作用之部分促效劑活性。當此抗體以活體內高達30 mg/kg每週一次歷時4週或高達150 mg/kg經皮下每週一次歷時2週在非人類靈長類動物中給藥時,對於hSR-1 aIGg1未觀測到意想不到的異常。
hSR-1 aIgG1顯示與表現Fcγ受體I=CD64、Fcγ受體II=CD32及Fcγ受體III=CD16之U-937細胞無可偵測之非特異性FcR結合性。相反,經偵測可推測SR-1 IgG1及IgG4P同型與高親和力FcγRI結合。因此,對於hSR-1 aIgG1預期無ADCC活性,且迄今實驗數據顯示無補體依賴性細胞毒性細胞死亡。已報導無糖基化之嵌合小鼠/人類IgG1抗體保持一些效應功能(Hybridoma.1991年4月;10(2):211-7)且因此hSR-1 aIgG1之此等所要活性並未預期。數據顯示應用標準方法及由此選擇典型IgG2或IgG1或IgG4同型尚未得到具有適當特徵之分子,其為對c-Kit具高親和力之黏合劑、功能性中性拮抗劑且不會活化肥大細胞。
以3 mg/kg單一靜脈內或皮下投藥後,進行初步PK研究以在雄性獼猴中比較hSR-1 IgG2及hSR-1 aIgG1 PK。時間分佈指示二者之非線性PK。在較低濃度下濃度下降較快。
在獼猴中單一靜脈內或皮下投藥後,如由C0
/Cmax
及AUC0-tlast
量測,兩種抗體顯示類似暴露。基於AUC0-tlast
,血清清除率對於兩種人類化抗體為均大致0.3 m L/hr/kg。在皮下給藥後,對於hSR-1 aIgG1及hSR-1 IgG2人類化SR-1變型而言,生物可用性分別為約82%及69%。
在每週一次重複給藥後,基於非洲綠猴中SR-1及人類化抗體之初步暴露數據,人類化抗體與SR-1相比達成更高暴露。顯著地,hSR1-aIgG1在組PK中顯示相同最佳性且先前已證明分子的糖基化程度可改變其藥物動力學特性,且在抗體的狀況下改變其新陳代謝性及其他生物特性。Cancer Immunol Immunother.1992;35(3):165-74。
在肥大細胞擴增之創口PD模型中最小有效劑量為小於在猴中每週一次歷時2週所投與之0.3 mg/Kg。依據基於體表面積之劑量變換,預測以等效給藥方案在人類中最小有效劑量為小於0.1 mg/Kg。然而,其為作為PK之初步估計且由hSR-1 aIgG1在人類中抑制c-Kit之程度與持續時間之間的藥效關係及臨床終點在此時為未知的。當更多藥物動力學及藥效數據可用時,將進行更精確的預測。
在人類中,表現類胰蛋白酶且缺乏凝乳酶之肥大細胞MCt主要位於黏膜組織(諸如肺及結腸)中,且已在皮膚中及對在此病狀下顯示肥大細胞可能替代性活化之較高程度的一些硬皮病患者偵測到此亞型。表現類胰蛋白酶與凝乳酶之肥大細胞MCtc亦在一些此等組織中局部化且類似地已與硬皮病及其他纖維化病狀相關。因此,兩種亞型均表示在涉及黏膜及結締組織之疾病(例如IPF、SSc、哮喘、RA及IBD)中對於c-Kit抑制劑之主要靶。由於肥大細胞一般壽命長且具組織抗性,因此療法亦須高效、有效且具有良好的體積分佈及PK。此外,肥大細胞主要為靜態的直至經活化以去粒且重新合成介體,該等介體接著在發炎反應中起關鍵作用。
在持續且大量抑制c-Kit後,活體內研究之目的在於證明(諸如)存在於肺及結腸中之基底黏膜肥大細胞及結締組織肥大細胞衰竭且確定對血細胞生成之作用及對前驅細胞之作用以及對紅血球生成、黑素生成及精子生成(由此在男性避孕中之效用)的影響。SR-1單株抗體係基於在CD34+骨髓細胞CFU檢定(以1.0 μg/mL抑制)中其對人類及猴c-Kit之等效功能性效能及其猴PK來選擇。
以在3 mg/Kg至30 mg/Kg範圍內之劑量每週一次歷時4週投與SR-1。在時程研究中,顯示在2次給藥後至第14天基底結腸肥大細胞最大衰竭(C低谷
>800倍之細胞IC50),且由此選擇第14天作為時間點以確定c-Kit拮抗劑對基底結腸肥大細胞之藥理學活性。出於實際原因,在第28天在驗屍及研究終止時評估基底肺肥大細胞。
以每週一次所投與之SR-1之3.0 mg/Kg之劑量,在大於200倍之UT-7細胞IC50之C低谷
PK值下觀測到基底肺肥大細胞衰竭。未評估較低劑量之SR-1對基底結腸肥大細胞及肺肥大細胞、黑素生成及精子生成的作用。
然而,以hSR-1 aIgG1之較低劑量研究在0.3、1.0及3.0 mg/Kg下進行。第14天,C低谷
值為大於200倍、大於2000倍及大於8000倍之細胞IC50且此等C低谷
值對應於對基底結腸肥大細胞無功效、基底結腸肥大細胞接近半衰竭(69%)及其接近全部衰竭(96%)(概述於表1中)。對於hSR-1 aIgG1之暴露、細胞效能及作用關係與所報導之SR-1結果相一致。
皮膚損傷後,繼之以穩固的發炎反應,其中首先嗜中性白血球及接著巨噬細胞及肥大細胞自鄰近組織及自循環遷出;組織粒化及再形成上皮;且引起皮下創口結締組織之纖維母細胞相關的收縮(Diegelmann RF等人,Front.Biosci.2004年1月1日;9:283-9)。皮膚創口損傷為研究可能與纖維化相關之機制的模型,此係由於所涉及之許多細胞類型與此疾病相關。此外,已報導在人類中其與來源於纖維母細胞之SCF升高及活化及肥大細胞之密度增加相聯繫(Trautmann A等人,J.Pathol.2000年1月;190(1):100-6)。在猴中皮膚創口損傷後,肥大細胞數量以時間依賴性方式增加,在受創傷後14天達到穩定狀態,其與人類範例相當。
每週一次所投與之SR-1之0.3、1或3 mg/Kg之劑量使得在第14天接近最大抑制經創口活化之肥大細胞擴增(圖1)。最大抑制定義為受創傷後至第14天100%阻斷肥大細胞在基線以上之數量增加。第14天,0.3 mpk劑量之C低谷
值為大於7倍之UT-7 IC50(表2)。經3週,血清含量為約2倍之UT-7 IC50,且在此暴露下觀測到僅部分抑制(圖1)。第3週,對於1 mg/Kg與3 mg/Kg組仍觀測到最大功效,其中血清C低谷
值保持大於200倍之IC50下。此等研究表明大於7倍之IC50濃度的持續C低谷
暴露對於最大抑制經創口擴增之肥大細胞而言很可能為需要的。
基於在此模型中對於SR-1所示之最大功效評估hSR-1 aIgG1之0.3、1.0及3.0 mg/Kg之劑量。在所測試之最低劑量(0.3 mg/Kg)下,在2週內觀測到最大抑制經創口誘發之肥大細胞擴增。此時血清C低谷
值為大於200倍之UT-7 IC50(表2)。
表2概述在創口PD模型中SR-1及hSR-1 aIgG1之PD/PK作用。
產生切口,接著至第21天在人類(左)或非人類靈長類動物(右)中進行鑽孔活組織檢查(圖2)。由產色體染色或IHC分別顯露肥大細胞及/或表現SCF之纖維母細胞。在人類中,SCF表現增加且返回基線,且在正常創口癒合期間短暫地繼之以肥大細胞數量瞬間增加。在猴中觀測到對受創傷之類似肥大細胞反應。在纖維化及異常創口癒合期間,SCF表現及肥大細胞數量仍增加(圖2)。
小鼠遺傳學顯示c-Kit在胚胎發育期間在血細胞生成中起作用,但在人類中雜合失活c-Kit突變及/或在Piebald個體中失能c-Kit突變尚未與血液異常相聯繫。SCF及c-Kit在人類血細胞生成中具重要性,此係由於SCF與G-CSF組合用於使造血幹細胞活動化。此外,主要靶向BCR-ABL、PDGFR及c-Kit之多激酶抑制劑Gleevec具有作為其主要藥理學作用的骨髓抑制作用,且已報導嚴重3-4級貧血及血小板減少出現在GIST患者中(Hensley ML等人,Semin.Hematol.2003年4月;40(2增刊2):21-5)。
小鼠遺傳學指示c-Kit在胚胎發生期間對黑母細胞自神經脊遷出起作用,且此作用在人類白斑病中受到支持。已報導Gleevec在少量GIST患者中引起毛髮"帶狀"脫色,但其並非一致性結果,且亦已報導色素過多。不能排除其他激酶(諸如PDGF)的貢獻。用多激酶抑制劑及c-Kit抗體在小鼠中之研究顯示抑制毛髮色素沉著為完全可逆的,其表明c-Kit抑制作用影響黑素細胞功能且在出生後設定中不存活(MoSs等人,2003)。
SR-1在每週一次歷時4週所投與之3至30 mg/Kg之劑量範圍研究中使用以確定抑制血細胞生成、精子生成及活性黑素生成所需之暴露。對在研究開始後在基線處、第4天、第7天、第14天、第21天及第28天所獲取之血液樣本進行包括細胞分化之全血組。在Queen Elizabeth Hospital Clinical Hematology實驗室(Barbados)進行新分離之血液樣本的分析。
與對照個體及基線值相比在所分析之任何血液參數上均偵測到對SR-1無顯著影響,但在開始給藥後4週在經藥物治療之動物中RBC無顯著降低。在所測試之最高劑量(30 mg/Kg,每週一次經4週)下,達成大於70,000倍之UT-7 IC50效能的暴露程度。由骨髓組織病理學分析證實對血液參數的顯著作用缺乏,該骨髓組織病理學分析顯示在經藥物治療之組與對照組之間無差異且CD117陽性造血幹細胞未衰竭,其表明在非洲綠猴NHP物種中對於血細胞生成而言有潛在的多餘路徑。由於可在黑素瘤中有效用,因此亦檢驗每週一次歷時4週所投與之3-30 mpk對黑素生成的影響。為評估對經活化之黑素細胞的作用(其可更好地反映疾病病況),脫去毛髮以活化黑素生成。皮毛之正常毛髮顏色在任何組中均未受可見顯著受影響。然而,在接受30 mg/Kg劑量之猴中在新近再生長之毛髮中觀測到毛髮色素沉著受抑制達可變程度。在10 mg/Kg組中觀測到無影響,其表明無影響之劑量在10-30 mg/Kg之間。在10 mg/Kg組中,SR-1暴露為大於8000倍之UT-7 IC50。肥大細胞衰竭之最大功效在大於7倍之UT-7 IC50下達成。此等數據表明c-Kit抑制影響黑素細胞功能,且可能需要較高劑量/暴露以阻斷由過多黑素細胞活性所表徵之疾病。
小鼠研究已顯示c-Kit對經分化之c-Kit受體陽性精原細胞的維持及增殖具重要性,但對精原細胞分化的初始步驟並不重要。對於非活性c-Kit受體等位基因而言為異型合子之雄性與雌性Piebald個體為可繁殖的,其表明此程度之c-Kit失活似乎並不影響原始生殖細胞生長、形成精子或形成卵子。
SR-1顯示自0.3-30 mg/Kg劑量依賴性抑制精子生成。0.3 mg/Kg每週一次之劑量小於在更高劑量下所觀測到的最大作用,且需要更低劑量範圍研究以定義ED50。所達成之暴露為7倍之UT-7 IC50,其為在肥大細胞擴增之創口模型中最大功效所需之暴露。PK外推法表明抗體很可能在最後給藥後1個月清除,但選擇9個月作為保守時間點以評估回收。在9個月在所有給藥動物中發現正常精子生成,其證明類hSR-1 aIgGl分子之用途適用作男性避孕藥。
人類化抗c-Kit無糖基化IgG1(hSR-1 aIgG1)抗體為高效及高特異性抗體,其在使用c-Kit信號轉導之近側及遠側讀出所測試之所有基於細胞的檢定中呈中性。如對於親本鼠類單株SR-1抗體所報導,本質上,該抗體並不介導c-Kit受體內化或磷酸化。基於標準方法尚未預測在人類化IgG1、IgG2及IgG4同型之上選擇無糖基化IgG1同型。經由新穎實驗以經驗選擇hSR-1 aIgG1以顯示其對膜c-Kit受體顯示適當的藥理學特徵,避免對c-Kit及對肥大細胞具促效劑活性,經由旁觀者效應使效應功能缺乏及細胞殺死。在猴中此抗體顯示良好的皮下生物可用性及半衰期、非線性PK及可飽和之靶介導抗體消除及肥大細胞衰竭。此等資料將預測合適之人類有效肥大細胞衰竭劑量。
在猴創口PD模型中親本小鼠SR-1單株抗體之最小有效劑量為小於0.3 mg/Kg(C低谷
>7倍之細胞IC50),且在使基底皮膚、結腸及肺肥大細胞衰竭中在稍高暴露(C低谷
>800倍之細胞IC50)下亦有效。類似地,在可觀測到對新近再生長之毛髮中毛髮色素沉著有定性影響之前,需要大於8000倍之細胞IC50的暴露程度。已報導在齧齒動物中使用多激酶抑制劑及c-Kit抗體抑制新近生長之毛髮中毛髮色素沉著,且hSR-1 aIgG1可在與過多黑素細胞活性相關之疾病中具有效用。停止治療後,作用為可逆的。在大於7倍之細胞IC50的程度(在創口PD模型中賦予最大功效之暴露)下顯示對抑制精子生成的次最大作用。
本說明書中所引用及/或申請書資料表中所列出之所有上述美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利公開案皆以引用的方式全部併入本文中。
自前述,應瞭解,儘管出於說明之目的,在本文中已描述本發明之特定實施例,但在不脫離本發明之精神及範疇的情況下可作出各種修改。
圖1:在創口活化模型中SR-1抑制肥大細胞。
圖2:在創口癒合模型中對肥大細胞計數。
圖3:人類化SR-1同功異型物抑制幹細胞因子(SCF)誘導之c-Kit活化及隨後經由c-Kit之磷酸化。
<110> 美商安美基公司<120> 人類化之c-KIT抗體<130> A-1126-US <140> 096114083 <141> 2007-04-20 <150> 60794771 <151> 2006-04-24 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 717 <212> DNA <213> 智人<400> 1<210> 2 <211> 238 <212> PRT <213> 智人<400> 2 <210> 3 <211> 1401 <212> DNA <213> 智人<400> 3 <210> 4 <211> 466 <212> PRT <213> 智人<400> 4 <210> 5 <211> 1389 <212> DNA <213> 智人<400> 5<210> 6 <211> 462 <212> PRT <213> 智人<400> 6 <210> 7 <211> 717 <212> DNA <213> 智人<400> 7<210> 8 <211> 238 <212> PRT <213> 智人<400> 8 <210> 9 <211> 1401 <212> DNA <213> 智人<400> 9 <210> 10 <211> 466 <212> PRT <213> 智人<400> 10
Claims (25)
- 一種結合劑,其特異性結合c-Kit且包含:(i)與SEQ ID NO:2所示之可變區胺基酸序列98%或98%以上一致的胺基酸序列,及(ii)與SEQ ID NO:4所示之可變區胺基酸序列98%或98%以上一致的胺基酸序列。
- 如請求項1之結合劑,其包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列。
- 如請求項1之結合劑,其包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
- 如請求項1之結合劑,其中在互補決定區中具有至少一個保守胺基酸取代,其中該結合劑維持對c-Kit之親和力。
- 如請求項4之結合劑,其中有一個保守胺基酸取代。
- 如請求項1-5中任一項之結合劑,其顯示對於c-Kit之親和力Kd低於10-2 ,該親和力係藉由表面電漿共振分析所測定。
- 如請求項1-5中任一項之結合劑,其中該結合劑為無糖基化之IgG1抗體。
- 如請求項1-5中任一項之結合劑,其中該結合劑為單株抗體。
- 如請求項7之結合劑,其中在位置297(Kabat編號)處之N連接之糖基化一致位點係經移除。
- 如請求項9之結合劑,其中該N連接之糖基化一致位點係 藉由使在位置297處之單一殘基自天冬醯胺酸突變成不同的胺基酸而移除。
- 如請求項6之結合劑,其顯示對於c-Kit之親和力Kd低於10-6 ,該親和力係藉由表面電漿共振分析所測定。
- 如請求項11之結合劑,其顯示對於c-Kit之親和力Kd低於10-8 ,該親和力係藉由表面電漿共振分析所測定。
- 如請求項12之結合劑,其顯示對於c-Kit之親和力Kd低於10-9 ,該親和力係藉由表面電漿共振分析所測定。
- 一種核酸,其編碼如請求項1至13中任一項之結合劑。
- 一種載體,其包含如請求項14之核酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項15之載體。
- 一種產生特異性c-Kit結合劑之方法,其包含培養如請求項16之宿主細胞以使核酸表現而產生該特異性結合劑。
- 如請求項17之方法,其進一步包含自該宿主細胞培養物回收該特異性結合劑之步驟。
- 一種如請求項1至13中任一項之結合劑之用途,其係用於製備減輕或治療個體之纖維化、炎症、自體免疫或癌症相關之c-Kit疾病或病症的醫藥品。
- 如請求項19之用途,其中該病症或疾病為纖維化。
- 如請求項19之用途,其中該結合劑係選自由人類抗體、人類化抗體、單鏈抗體或抗體片段組成之群。
- 如請求項21之用途,其中該結合劑另包含Fc域。
- 如請求項20之用途,其中該纖維化病症係選自由硬皮病、間質性肺病、特發性肺纖維化、B型或C型慢性肝炎 所引起之纖維化、輻射誘發之纖維化、及創口癒合所引起之纖維化組成之群。
- 如請求項23之用途,其中該醫藥品係與拮抗前纖維化細胞激素(cytokine)之第二拮抗劑併用,其中該細胞激素係選自轉形生長因子β(TGF-β)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-9(IL-9)、介白素-13(IL-13)、顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、介白素-1β(IL-1β)、結締組織生長因子(CTGF)、介白素-6(IL-6)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生之生長因子(PDGF)、單核細胞趨化(chemotactic)蛋白1(CCL2/MCP-1)及肺及活化調節之趨化因子(chemokine)(CCL18/PARC)。
- 一種醫藥組合物,其用於減輕或預防罹患纖維化病症之個體纖維化,該醫藥組合物包含治療有效量之如請求項1至13中任一項之結合劑。
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