TW213950B

TW213950B -

Info

Publication number: TW213950B
Application number: TW081109460A
Authority: TW
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1991-12-20
Filing date: 1992-11-25
Publication date: 1993-10-01
Also published as: CA2126247A1; JP2002503941A; EP0618930A4; EP0618930A1; WO1993013134A1; US5256561A; AU3276893A

Description

A6 B6 213950 五、發明説明（1 ) (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 發明背景本發明大體上是有關單株抗體，且待別是可與Η I V 一 2專一性結合但不與Η I V — 1顯著結合之鼠類單株抗體，彼之用法，及含彼之套組。由目前流行病學數據推測，後天免疫缺失症候群（ A I D S係由至少二型式之人類免疫缺失病毒所引起的，通稱為HIV。人類免疫缺失病毒1型（HIV—1)已自AIDS及AIDS —相關複合症（ARC)患者，及 A I DS高危險群健康個體中分離。如見F. Barre-Sin- ous s i e t al·, Isolation of T-Lymphotropic Retrovi-rus From a Patient At Risk For Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS)» Science 220:868— 8 7 1 (1983) ； M · Popovic e t al·，Detection，

Isolation and Continuous Production Of Cyt opa t h i c Retroviruses (HTLV- 1 ) From Patients With AIDS an-d Pre-AIDS， Science 224:497—500 ( 1 9 8 4) ； and R.C· Gallo e t al·，Frequent Detec 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 tion and Isolation Of Cytopath i c Retroviruses ( HTLV-I ) From Patients With AIDS and At Risk For AIDS，Science 224 :500 - 503 ( 1 9 8 4) 〇據報告，HIV— 1之傳染係由性接觸，曝於血液或某些血液製品下，或由受感染母親傳給其胎兒或幼兒。ρ· Piot et al·， AIDS： An International Perspective， Science 239 :573 — 579 (1988)。同時，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公:ίί ) -3 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 ^- 五、發明説明（2 ) 在AIDS及ARC病人及高危險群個人中，HIV—1 抗體之發生率很高。M.G· Sarngadharan et al·，Antib-odies Reactive With Human T-Lymphotrophic Retrovi-ruses (HTLV- 1 ) In The Serum of Patients With AIDS ，Science 224:506 — 508 (1984)。此病毒幾乎可自血清陽性値體90%中分離。D. Gallo et a-1·， Comparative Studies On Use Of Fresh and Frzen Peripheral Blood Lymphocyte Specimens For Isolation Of Human Immunodeficiency Virus and Effects Of Cell Lysis On Isolation Efficiency， J· Clin· Microbiology 25: 1291 - 1294 (1987)。

第二種Η I V病毒，命名為人類免疫缺失病毒2型（ HIV — 2),於1986年分離自西非之AIDS患者〇 F· Clavel e t al·， Isolation Of a New Human Retrovirus From West African Patients With AIDS， Science 233:343 — 346 (1996) 〇 HIV-2 感染目前已在最初流行區域以外之人體被鑑知，且被報告的有曾住過西非之歐洲人或與此區域個體有過性關僳者，性伴侶來自流行區之同性戀者，及其他。如見，A.G. Sa-imot et al.> HIV-2/LAV-2 In Portuguese Man With A-IDS Who Had Served In Angola In 1968—74, Lancet i ： 6 8 8 (1987) ;Μ·Α· Rey et al·， HIV -1 and HIV-2 Double Infection In French Homosexua-1 Male With AIDS-Related Complex， Lancet i ϊ 3 8 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） . (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i裝. 訂. 2 A6 B6 五、發明説明（3 ) - 3 8 9 (1 9 8 7) ； A. Werner et al" HIV-2, La- neet i : 8 6 8 — 869 (1987) ;G· Brucker et al·, HIV-2 infection In Two Homosexual Men In France .Lancet i ： 2 2 3 (1987) ;K· Marquart e t al·, HIV-2 in West Germany， AIDS 2 ： 1 4 1 ( 1988) ； CDC, AIDS due to HIV-2 infection, MMWR 37：33-35 (1987) ; Anon · , ΗIV-2 D - etected In UK， Nature 332—295(1988)。於1 960年晚期，因HIV — 2感染所致之 A IDS追億診斷病例，包於法國及英國中所有報告，且與Η I V — 2感染有關的第一個輸血實例近來已考證。N. Burin des Roziers， Infection Par Le Virus HIV-2 A— vec Longue Period D’incubation， Presse Med 1 6 · 1981 ( 1 987) ； A· Bryceson et al., HIV-2-

Associated AIDS In The 1970 fs* Lancet ii : 22 1 (1 988) ; and A. M· Courouce et al·，A·

Prospective Study of HIV-2 Prevalence In France » AIDS 2:261 - 265 (1988) 〇 HIV — 2與HIV— 1區別之基礎為下列因素：（ 1)在中度或高迫切度條件下，以完整基因體構築之 HIV — 1 DNA無法與HIV—2 RNA雜交；（ 2 ) « a g ^ d ο 1基因産物之胺基酸相同性（同質性）低於6 0%,且二病毒間盘—n v编碼蛋白質僅有3 7% ; 及（3)含HIV— 1抗體之血清在HIV — 2分離物上本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事项再場寫本頁) —裝. •11. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -5 - 經濟部中央標準局W工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（4 ) 無中和作用，和Η I V — 2抗血清在Η I V — 1株之交叉中和活性相反。F. Clavel，HIV-2» The West African AIDS Virus, AIDS 1:135—140(1987); R . A . Weiss e t a 1 . . HIV-2 Antisera Cross-Neutraliz-e HIV-1, AIDS 2:95— l〇〇 (1988)。血清學研究顯示，雖然HIV - 1及Η IV — 2在其核心抗原上其有許多的抗原決定基，但此二病毒之被膜糖蛋白交叉反應性極低。F. Clavel ,上文。咸信被膜抗原此有限之交叉反應性可用來解釋，為何目前用於HIV—1之血清學分析，無法與某些來自具Η I V- 2抗體個體之血清反應〇 F . Denis et a 1 · . Comparison Of 1 〇 Enzyme Immun-oas says For Detection Of Antibody To Human Immunodeficiency Virus Type 2 i n West African sera， J· Clin. Micro 26:1000—1004 (1988) 〇近來公告的美國專利案No. 5， 055， 391，定出 Η I V — 2基因體之輿圖，且提出偵測病毒之分析法。因此被發展以偵測HIV— 1，HIV — 2，或二者之試驗，必須含有可決定受試樣品中任一或二種病毒專一存在之試劑。因此需有一種試劑，如單株抗體，可僅與 HIV — 2 (來自人類）反應，而不與HIV—1抗體決定基反應者。發明要點本發明提出一種單株抗體，其可與人類受試樣品中之本紙張尺·度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货）一 6 一丨裝------訂-----f (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) ‘ ·-_B6_ 五、發明説明（5 ) Η I V - 2 gp36抗原專一地結合，而不與人類受試樣品中之Η I V— 1抗體顯著的結合。此單株抗體稱之為 7 — 1 054— 1 80,由融合瘤細胞株 7 — 1 054—1 80所分泌。融合瘤細胞株 7-1054-180,已於 1991 年 1 1 月 1 曰，於 ATCC Ν ο . Η Β 10 9 08下貯置於美國標準菌種收集所，1 2 3 0 Parklawn Drive，Rockville. Maryland 20852。本發明提出一種於偵測Η I V — 1及/或Η I V — 2 之免疫分析之改進方法，像加入已知量之單株抗體，其可專一地與Η I V_2 g ρ36抗原蛣合且不與Η IV-1抗原顯箸地反應。於此狀況下，單株抗體可充作陽性對照組以專一地偵測HIV - 2 gp36抗原，此分析像可偵測Η I V— 1及Η I V— 2任一者或二者。也提出測試套組，其中於分別的小瓶或容器中含有由細胞株7—1054-180所分泌之單株抗體 7-1054-180。附圇說明經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲#^面之注意事項再填寫本頁) 圖1示出質體P JC 1 00/XL — 1之構築。圖2示出由質體P J C 1 ◦ 0所编碼之重組蛋白質。圖3示出（Α)考馬斯亮藍R — 25及（Β)銀染色之SDS—PAGE凝膠電泳結果，及單株抗體 7-1054—180。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -7 - 2i 沾 U A6 __B6 五、發明説明（6 ) 圖4示出單株抗體7—1◦54—18◦代表性批次與重組體Η I V — 2及Η I V- 1抗原反應之結果。圖5Α及5Β示出單株抗體7—1054—180的 1、2及3批次與HIV—1病毒蛋白質（圖5Α)及 Η IV — 2病毒蛋白質（圔5Β)(其固化在習知之免疫吸漬條上）之反應性。詳細説明經濟部中央標準局員工消費合作社印5衣 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之單株抗體可應用於各種分析条統中，以決定受試樣品中是否有任何Η I V — 2之存在。也可使用所提出單株抗體之片段。如，於一個第一分析型式中，已塗覆至固相上之多種或單株抗一 Η IV — 2抗體或其片段，可與可能含有HIV_2抗原之受試樣品接觸，以形成混合物。此混合物在足以形成抗原/抗體複合物之時間及條件下培育。之後，含單株或多種抗體或其片段之指示試劑，其可專一地與HIV — 2抗原結合，且其上己粘附有産訊化合物，與抗原/抗體複合物接觸以形成第二混合物。此第二混合物再於足以形成抗體/抗原/抗體複合物之時間及條件下培育。受試樣品中Η I V — 2抗原之存在及若有時捕獲在固相上，則由偵測由産訊化合物所産生之可偵測訊號決定。存在於受試樣品中之Η I V — 2抗原含量與産生之訊號或比例。另外，已結合於固相之單株或多種抗一 Η IV — 2抗體或其片段，受試樣品及含有單株或多種抗體或其Η段之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公;^ ) 經濟部中央標準屬3工消費合作社印製 Α6 Β6 五、發明説明（7 ) 指示試劑，其傜可專一地與Η IV — 2抗原結合且粘附有産訊化合物，再接觸以形成混合物。此混合物在足以形成抗體/抗原/抗體複合物之時間及條件下培育。受試樣品中若有任何HIV—2抗原之存在，且捕獲在固相上，則由偵測産訊化合物産生之可偵測訊號而決定。存在於受試樣品中Η I V — 2抗原之含量和産生之訊號成比例。於此或上述之分析型式中，本發明之單株抗體可呈捕獲相或指示試劑之部份應用。於另一分析型式中，本發明之單株抗體可充作競爭性探針，以偵測Η IV — 2抗原之抗體。如，塗覆在固相上之Η IV — 2抗原（較好是Η IV — 2被膜抗原）與疑似含有Η IV — 2抗體之受試樣品接觸，並與含有産訊化合物及本發明單株抗體之指示試劑，在足以形成受試樣並及指示劑至固相或指示試劑至固相之抗原/抗體複合物之時間及條件下共培育。本發明單株抗體與固相結合之減弱，可由産生訊號之減弱證知，此可定量偵測。與已證實為陰性Η I V — 2受試樣品所産生之訊號比較下，訊號可測及之減弱可顯示受試樣品中存在有抗_ Η I V — 2抗體。又另一偵测方法中，本發明單株抗體可於經固定之組織切片，以及經固定的細胞中用來偵測Η IV — 2抗原，像利用免疫組織化學分析等精藝者熟知之標準方法進行。此外，這些單株抗體可結合至類似CNBr -活化之 Sepharose基質上，且用於自細胞培養，或生物組織（如血液或肝）中親和力純化特異的Η IV — 2抗原。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉甲4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝_ 訂_ -9 - Α6 Β6 五、發明説明（8 ) 本發明之單株抗體也可用於産生供治療用，或其他類似應用之嵌合型抗體。可個別地提出單株抗體或其Η段以偵測Η I V — 2抗原。此處所提出之本發明單株抗體（及其Η段）之混合，也可與其他對Η I V — 2有不同專一性之單株抗體混合，充作Η I V — 2抗體混合物或*摻雜物"之組份，其中各自有不同的結合專一性。因此，此摻雑物可含有本發明直接相對於Η I V — 2基因體p 3 6專一抗原決定基之單株抗體，加上相對於其他Η I V - 2抗原決定基之不同單株抗體。可使用此單株抗體之摻雜物，以取代如此中分析型式所述之單一單株抗體。可用於分析型式中之多株抗體或其片段，應可專一地與Η I V - 2抗原結合。所使用之多株抗體較好是源自哺乳動物；可使用人類、山羊、兔子或羊抗一 Η IV— 2多株抗體。較好，多株抗體是兔子多株之一 Η IV — 2抗髏。用於分析中之多株抗體可單獨使用或呈多株抗體之摻雜物型式。由於分析型式中所使用之摻雜物含有具不同 Η I V — 2專一性之單株或多株抗體，其應可用於Η I V 一 2感染之診斷、評估及預後，以及用於研究Η IV - 2 蛋白質之分化及專一性。當偵測Η I V— 1及Η I V — 2任一者或二者之混合存在時，單株抗體也可用於單株抗體摻雜物中。於此分析型式中，將不同的Η I V— 1及Η I V — 2抗體固化在固相載體上。受試樣品與固化在固相載體上之抗體接觸，於本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨裝· 訂. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 10 213 213 經濟部中央標準局IK工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（9 ) 足以形成抗原/抗體複合物之時間及條件下培育，其再與抗原具專一性且其上粘附有産訊化合物（標誌）之多株或單株抗體摻雜物任一者接觸，並於足以形成抗體/抗體/ 抗原複合物之時間及條件下培育。抗體任一者或二者之存在，可偵測由標誌産生之可偵測訊號來決定。可以此處所述之本發明方法測試之受試樣品包括：人類及動物體液，如全血、血清、血漿、腦脊髄液、尿液、生物流體如細胞培養物上清液，固定之組織檢品及固定的細胞檢品。 •"固相〃並不嚴苛，且可由精藝者選擇。因此，乳膠粒子、微粒子、磁性或非磁性珠粒、膜、塑質管、徹滴定孔洞壁、玻璃或聚矽氧碎片及鞣酸化之羊紅血球均為適合之實例。肽固化在固相上之適合方法包括離子性、疏水性、共價交互作用等。此中所使用之a固相〃傜指任何材質，其以接下來的反應可溶解，或可使溶解。固相之選擇可依據其吸引及固化捕獲試劑之内在能力而定。另外，固相可保有額外的受體，其具有吸引及固化捕獲試劑之能力。此額外的受體包括荷電之物質，其係捕獲試劑本身相反之電荷，或共軛至捕獲試劑之荷電物質之相反電荷。又另一變化，受體分子可為任何的專一性結合成員，其固化（粘附）至固相上，且具有經由專一性結合反應固化至捕獲試劑之能力。受體分子可使捕獲試劑於分析進行前或之中結合至固相材質上。因此固相可為塑質、衍化塑質、磁性或非磁性金屬、試管之玻璃或聚矽氧表面、徹滴定孔洞、薄本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） ----------------7------裝------.玎 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -11 - A6 五、發明説明（10 ) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) H、珠粒、微粒子、碎片及一般精藝者已知之其他構型。也希望且在本發明範圍内的，那固相也可含有任何適當的多孔材質，其具有充份的孔隙度以令偵測抗體可接近及適當的表面親和力以結合抗原。通常以微孔結構為較佳，但也可使用呈水合狀態之凝膠結構材質。此種有用之固相載體包括：經濟部中央標準局貝工消費合作社印製天然的聚合型碩水化物及其以合成修飾之交聯或取代之衍生物，如瓊脂、瓊脂糖、交聯的藻酸、經取代及交聯的瓜爾膠、纖維素酯，尤其與硝酸及羧酸形成者，混合型纖維素酯，及纖維素醚；含氮之天然聚合物，如蛋白質及衍生物，包括交聯或經修飾之明膠；天然的碩氫聚合物，如乳膠及橡膠；合成的聚合物，其可以適當的多孔結構製備，如乙烯聚合物，包括聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚乙酸乙烯酯，及其部份水解之衍生物，聚丙烯醯胺，聚異丁烯酸酯，上述縮聚物之共聚物及三聚物，如多酯類，多醯胺類，及其他聚合物，如多胺酯類或聚環氧化物；多孔無機物質如鹼土金屬及鎂之硫酸鹽或碩酸鹽，包括硫酸鋇，硫酸鈣，碩酸鈣，鹼金屬及鹸土金屬之矽酸鹽，鋁及鎂；及鋁或矽之氧化物或水合物，如粘土、礬土、滑石、高嶺土、沸石、矽膠或玻璃（這些物質可充作滤膜配合上述聚合材質）；及上述種類之混合物或共聚物，如啓動預存在之天然聚合物上合成聚合物之聚合作用而得之接枝共聚物。所有這些材質可以適當形狀使用，如薄膜、片或板，或其也可塗覆或結合或層壓至適當的性載體上本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -12 - Α6 __Β6_ 五、發明説明（11 ) ，如紙、玻璃、塑質膜、或織物。硝化纖維素之多孔結構，對各種試劑包括單株抗體，有極佳的吸收及吸附品質。耐龍也具類似特性，且也適用 0 希望上述之此種多孔固相載體，較好呈厚度由約 0. 0 1至0. 5毫米，較好約0. 1毫米之片型。孔徑大小可有大的變化，但較好由約〇. 025至15微米，尤其是由約0.15至15徹米。此種載體之表面可以化學處理而活化，其可造成抗原或抗體共價連接至載體。然而經由不甚明瞭之疏水性力量吸射在多孔材質上，大體可得抗原或抗體之不可逆之結合。經濟部中央標準局s工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再寫本頁) 指示劑含有産訊化合物（標誌），其經由共軛（粘附 )至Η IV — 2專一結合成員之外在方法，可偵測所産生之可測及之訊號。''專一性結合成員〃在此中表示專一性結合對的一個成員。那，二個不同的分子，其中分子之一經由化學或物理方法專一地結合至第二分子。指示試劑除了為Η IV — 2專一結合對之抗體成員外，也可為任何專一結合對之成員，包括半抗原一抗半抗原条統，如生物素或抗生物素，抗生物素蛋白或生物素，碩水化合物或外源凝集素，互補的核苷酸序列，效應物或受體分子，酵素輔因子及酵素，酵素抑制劑或酵素，及其他。免疫反應性之專一結合成員可為抗體、抗原、或抗體/抗原複合物，其可結合至Η IV — 2,如於三明治式分析中，結合至捕獲試劑如於競爭性分析中，或結合至輔助之專一結合成員，適用中國國娜C㈣甲4規格(一公⑻ — 經濟部中央標準局工消费合作社印製 A6 2139«* J_B6__ 五、發明説明（12 ) 如於間接分析中。各種訊化合物（標誌）可包括色原、催化劑（如酵素 )、螢光化合物（如螢光素及若丹明）、化學發光化合物、放射活性元素、及可直接目視之標誌。酵素之實例包括鹸性磷酸酶、輝葉過氧化酶、/3 _半乳糖苷酶、及其他。特殊標誌之選擇並不嚴苛，但其像可本身産生訊號或與一種以上之額外物質聯合下産訊。也包括利用各種其他固相之其他具體實例，且也在本發明範圍之内。如，離子捕獲步驟以將可固化之反應複合物與陰電荷聚合物固化，述於共有的美國專利案No. 150, 278,相當於EP申請案0326100,及美國專利案No. 375, 029 (EP專利案No· 0406473),二者享有共同所有權且列入本案參考，可依本發明應用以達成快速的溶液相免疫化學反應。藉著員電荷多陰離子/免疫複合物及先前經處理；正電荷多孔基質間之離子交互作用，可固化之免疫復合物可自反應混合物其餘分分出，並利用先前所述之各種産訊糸統偵測，包括述於化學發光訊號偵測中者，如共有的美國專利案 No. 921, 979中所述，其相當於ΕΡ0案No. 0 2 7 3, 1 15,其享有共同所有權，且列為本案參考。同時，本發明方法也可使適用於其中利用微粒子技術之糸統中，包括於自動及半自動条統中，其中固相包括微粒子。此種条統包括於未決之美國專利案425, 651 本紙張尺度適用中國困家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） ----------------7 ------裝------tr f請先閱讀背面之注意事项再填寫本頁> -14 - 2l39r.j a6 _；_____B6_ 五、發明説明（13 ) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁)

及425， 643中所述者，其分列相當於已發展的 EP ◦案 No. EP 0 4 2 5 633 及 EP 0 424634,其列為本案參考。於免疫分析中使用掃描探針顯徹術（SPM),也是一種技術，此中本發明之單株抗體是可容易適用的。於掃描探針顯微術中，特別是原子力顯徹術，捕獲相如至少一種本發明之單株抗體，粘附至固相，且利用掃描探針顯微鏡來偵測可能存在於固相表面之抗原/抗體複合物。使用掃描坑道顯徹術可省去標誌之需求，其在許多免疫分析条統中為了偵測抗原/抗體複合物通常是必要的。此種糸統述於未決之美國專利案No. 662, 147號中，其具有共同所有權且列為本案參考。可以許多方式使用SPM來追踪專一性結合反應。於一個具體實例中，將專一結合配對的一成員（分析物專一之物質，其條本發明之單株抗體）粘附至適合掃描之表面。可經由吸附至受試Η (其包括塑質或金屬表面之固相）經濟部中央標準局貝工消費合作社印製粘附分析物專一性物質，傜依循精藝者已知之方法。或者也可利用共價粘附該專一性結合配對（分析物專一性物質 )至受試Η上，受試片包括衍生化之塑質、金屬、聚矽氣、或玻璃之固相。共價粘附方法是精藝者已知的，且包括將專一性結合配對不可逆地鍵結至受試片之各種方法。若受試片為聚矽氣或玻璃，則於吸引專一性結合配對之前，表面必須先活化。可使用經活化之矽烷化合物，如三乙氧基胺基丙基矽烷（購自 Sigma Chemical Co·，St· Loui- 本紙張尺度逯用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐〉 -15 - Α6 Β6 經濟部t央標準曷兵工消費合作社印製五、發明説明（14 ) s, M0),三乙氧基乙烯基矽烷（Aldrich Chemical Co., Milwaukee，WI),及（3 —魏基丙基）一三甲氧基砂院（ Sigma Chemical Co.，St. Louis，M0),以分別引入反應性基團，如胺基、乙烯基、及硫醇。此種活化之表面可直接用來鏈接結合配對（於胺基或硫醇例中），或經活化之表面可進一步以連接子反應，如戊二醛、辛二酸二琥珀醯亞胺基酯SPPD9 (3 —〔2 —吡啶基二硫基〕丙酸琥泊醯亞胺基酯）、SMCC (環己烷一 1一羧酸琥珀醯亞胺基一4 一〔N —馬來醯亞胺基甲基〕酯）、SIAB ( 〔4 -碘乙醯基〕胺基苯甲酸琥珀醯亞胺基酯）、及 SMPB 4 —〔1 一馬來醯亞胺基苯基〕丁酸琥珀醯亞胺基酯，以自表面分出結合配對。乙烯基可氧化，以提供共價粘附之方法。其也可充作支靠以聚合各種聚合物、充多丙烯酸、其可對專一結合配對提供多個粘附點。胺基表面可以各種分子量之經氧化之葡聚醏反應，以提供不同大小及能力之親水連接子。經氧化之葡聚醏實例包括： Dextran T-40 (分子量 4 〇，〇◦ 0 道耳呑），Dextran T-110(分子量 1 1 0，0 0 0 道耳呑），Dextran T-500 (分子量 500，〇〇〇道耳呑），Dextran T-2M (分子量2，0 0 0 , 〇〇〇道耳呑）（均可構自卩1^1：111&〇卜 a , P i scataway，N J )，或 F i co 1 1 (分子量 7 0 , 0 ◦〇道耳呑）（可購自 S i gma Chem i ca 1 Co .，St . Lou i s，M0 )。同時，多電解質交互作用也可用來將專一性結合配對固化至受試Η表面，利用未決之美國專利案No. (請先閲讀背面之;±意事项再填寫本頁)

• J 裝· 訂, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）一 16 — 一 ,- A6 9‘m.。_____ B6 _ 五、發明説明（15 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 150, 278 (1988年1月29日公告），及糸列號No. 375, 029 (公告於1989年7月7日） ,各自享有共同所有權，且均列為本案參考。粘附漸佳方法是共價方法。於粘附至專一結合成員後，表面可以進一步處理，如以血清、蛋白質、或其他阻斷劑以將非專一性結合減至最低。表面不論在製造位置或使用點上均可予以掃描，以證實其針對此目的之適用性。此掃描過程並不預期可改變受試片之專一結合特性。雖然本發明掲示對固體使用之偏好，然而也希望本發明的肽類可被利用於非固相分析条統中。這些分析条統像精藝者已知的，且被視為在本發明範圍之内。經濟部中央標準局貝工消費合作社印製本發明之單株抗體可充作分析中之陽性對照組，其經過設計可偵測至少Η IV - 2抗體之存在，或應用於自 Η I V — 2感染中區別Η I V— 1之分析中。於偵測受試樣品中Η IV — 2抗體存在的分析中，Η IV — 2抗原應充作捕獲相使用。這些Η I V — 2抗原可以各種純化方法製備以得病毒溶胞産物，Η IV — 2基因體各種免疫原區之合成肽，及/或利用合成或天然抗原或抗原之抗原決定基産生重組蛋白質。也希望這些Η I V — 2抗原型式可被應用於各種分析型式中，包括此中所述之充作捕獲相或偵測相。本發明單株抗體之使用，可確使被用來偵測Η I V —2抗體之試劑，由於取代分析進行時之受試血清可適度地操作，此依精藝者已知之步驟進行。本發明之單株抗體也可充作偵測Η I V— 1及/或Η I V — 2試驗中之陽性本紙張尺及適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -17 - A6 B6 2130^：_ 五、發明説明（16 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 對照組，或其可自HIV—2中區別HIV—1。於這些分析型式中，當結果之産生是受試樣品與HIV-1及/ 或Η IV — 2之各種抗原決定基反應，則十分重要的是應要確使試驗中所使用之抗原像如所預期地進行。此品質之保證可由以本發明之單株抗體取代受試樣品來進行，分析中將受試樣品與其中已粘附有Η I V— 1及Η I V — 2蛋白質之固相接觸，並在足以形成抗原/抗體複合物之時間及條件下培育，之後如此形成之複合物與HIV—1及 Η IV - 2專一性抗體接觸，並依預先決定之變數來決定分析結果。利用本發明單株抗體如所述進行的分析結果，若在預定變數之外，則分析結果將是可置疑或無效的。希望分析中所應用之試劑可呈套組型式提供，有一個以上之容器如小瓶或瓶，且各容器含分別的試劑，如單株抗體、單株抗體之摻雜物等。這些套組中也可含有進行分析所需的其他試劑之小瓶或容器，如洗滌、處理及指示試劑〇經濟部中央標準局WX工消費合作社印製以下實例，經由描述此單株抗體之發展方法、特性、抗原決定基與圖及臨界利用價值，可加以說明本發明 7—1054—18◦單株抗體之優點及利用性。單株抗體發展所用的方法，依循技藝中已知之步驟，且詳述於 Kohler and Milstein. Nature 256:494( 1 9 7 5)，且總鹽於 J.G.R. Hurrel，ed·，Monoc 1 on-al Hybridoma Antibodies» Techniques and Applications» CRC Press. Inc·» Boco Raton. FL ( 1 982) 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -18 - A6 B6 五、發明説明（17) 。單株抗體發展之另一方法依據Kohler•及Milstein之方法》乃像 L.T. Mimms et al.，Virology 1 7 6 : 604-619 (1990)，其已列為本案參考。這些實例用以説明，而非限制，本發明之精藝及範圍。奮例奮例1.骨髄瘤細_株乏餺備及維持構築一個重組體DNA純糸，以含有Η IV — 2 g Ρ 4 1 Rod分離物胺基末端108値胺基酸（Guy-ader e t a 1 . > Nature 326:662 — 669 〔 1 987〕）並與CKS作為融合蛋白質。此抗原用來（命名為γρ41 Η I V - 2 Rod)免疫老鼠，由此取免疫之脾細胞與SP2/0 — Ag 14骨髄瘤細胞融合 ,以産生融合瘤細胞株（7— 1054— 180),其可分泌可與HIV—2 gp41反應之免疫球蛋白（Ig )G類（IgG)之單株抗體。所得之IGg産自老鼠腹水，且以蛋白質A親和力層析純化。 A·重組體免疫原之構築及表現圖1示出質髏PJC1001 XL—1之構築。此質體為專利案U· S. No· 275, 309 (EP案 0370458)之土題，其享有共同所有權且列為本案參考。表現rp41 Η I V - 2 Rod抗原之重組體大腸桿菌純条，其構築以三階段進行。首先，合成5個個本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝- 訂. 經濟部中央標準局員工消費合作社印¾ _ 19 - 經濟部中央標準局ΜΓ工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（18) 別的寡核苷酸，並分別選殖。第二，將5序列組合且連接至選殖載體。第三，rp41 HIV — 2 Rod序列繼代選殖至C K S表現載體中。因此，利用可於大腸桿菌中有最佳表現之密碼子，化學合成可指導合成Η IV — 2被膜基因1〇8個胺基酸（ 502至609)之DNA片段。合成5個個別的寡核苷酸，分別選m利用寡核苷酸指令之雙股打斷修補方法進行。由熟知之Sanger二去氧方法證實序列（F. Sanger e-t al .，J. Molec. Biol 162:729 (1 9 8 2) 〇基因組合並連接至選殖載體pUC 1 9,及H i nd皿一 Sa 1 I片段。生成之質體命名為PJC22。表現載體PJB210,可使重組基因融合至CKS 蛋白質。質體PTB210掲示於美國專利案 276, 263號中，其為美國糸列案167, 067之部份續篇，其享有共同所權，且列為本案參考。此質體由質體PBR322組成，有經修飾之1 a π隨動子融合至 k d s B基因片段上。此片段编碼CKS基因完整248 胺基酸中的前239個，且一個合成連接子融合至 k d s B片段末端。合成的連接子包括多重限制位置可供基因嵌入，轉譯停止密碼及轉錄終結子。質體PJC22以Hi ndl及AsP718水解，再分離出编碼rp41 HIV—2 Rod之360 bp片段，並嵌入表現載體pTB2 1 〇之H i nd HI及 As p7 1 8位置中。生成之質體命名為pjC 1 〇〇, 本紙張尺度適用中國a家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公;St ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂. -20 - A6 B6 2139^0 五、發明説明（19 ) (請先閲讀背面之注意事項再埸寫本頁) 表現被膜區而與C K S蛋白質融合。融合蛋白質在1 ac 啓動子控制下表現。啓動子區，轉錄起始及核糖結合位置占據1 一 1 2 5 鹼基。编碼區含有衍自CKS蛋白質239胺基酸之序列 (126—842鹼基）及合成多連接子的18値胺基酸 (483 — 896鹼基）。此後接以Η IV— 2被膜胺基末端108個殘基（897 - 1 220鹼基）及其餘多連接子的10個胺基酸（1221 — 1250鹸基）。轉譯作用在1251_1253鹼基處之終結密碼子處終結。由質體P J C 1 0 0所编碼之重組蛋白質圖解說明於圖2 中。胺基末端含有CKS 239個胺基酸，繼以18個非一HIV胺基酸，108 個 HIV — 2 p 4 1 Rod a b d非_H I V之胺基酸。經濟部中央標準局員工消費合作社印製總而言之，質體PJCIO ◦编碼重組體蛋白質 r p 4 1 Η I V - 2 Rod,其含有CKS蛋白質 239個胺基酸，繼以PTB2 1 —多重限制位置鍵結子的18個胺基酸（非一 Η IV胺基酸），示自Η IV — 2 a η ν蛋白質108個胺基酸（p41 Rod)及來自 PTB2 1 0多重限制位置鍵結子的額外的1 0個胺基酸 ,(非一HIV胺基酸）。質髏PJC100轉形至大腸桿菌K一12 XL-1 株（recA1 , endA1, gyrA96· Th i-1, hsdR17· supE44 ,re 1 A1, Lac-/F * , prοAB, lacIqZdeltaMIS, TN10)細胞，後者以已知之氯化鈣使可勝任。於此構體中，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公;^ ) -21 - ...... A6 21·孤」_ B6_

I 五、發明説明（20 ) r p 4 1 Η I V - 2 R 〇 d融合蛋白質之表現僳在 1 a c啓動子控制之下。抗原加入異丙基硫代半乳糖（ I PTG)而誘導。質體以獨立單元複製，像不可移動的且每細胞維持在10至30個套數。一値經分離之P JC 1 00/XL — 1集落，在含有胰化蛋白腺、酵母浸膏、葡萄糖、磷酸鹽及氨苄青徽素之培養基中，以3 7t：培養一夜。此培養物使達15%甘油 ,分裝成1毫升並冷凍於一 701C下。此細胞庫充作免疫原來源，用於接下來之老鼠免疫接種中。細胞庫每小份用來接種至1. 6升之上述生長基中，並在震盪下於37Ϊ：培養至0. 5光密度（600毫微米 ),且抗原之表現以添加IPTG誘導之。誘導3小時後，自培養中分出生物團塊，冷凍至一20Ό下直到老鼠免疫接種。 B .老鼠^狰疮培種此免疫接種流程（10集老鼠）包括第一次免疫接種及第14及2 9天之附加免疫接種。於每次免疫接種中，如上述製備之10徹克0. 1%硫酸十二酯鈉（SDS) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁> 經溶解之PJ100/XL— 1、與RIBI佐劑乳化。此經乳化之免疫原腹膜内接種及皮下接種。個別老鼠以第三次免疫接種後約4週之免疫原，利用標準之習知方法行微滴定盤酵素免疫分析（E IA)之免疫反應性篩選。老鼠於第三次免疫接種後15週，靜脈内接種以10微克的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -22 - A6 B6 _ 五、發明説明（21 ) (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) 免疫原。 C .骨辅瘤細朐株之發屐靜脈内追加後三天，脾細胞以聚乙二醇（PEG)方法與Sp 2/0 — Ag 14骨髄瘤細胞融合，後者得自 Milstein Laboratories，England。融合體培養於含 1 〇 %胚牛血清（FCS),加上1%次黃嘌昤、胺甲碟昤及胸替（HAT)之Iscovo's經修飾之Dulbecco’s培養基中（IMDM)。以微滴定盤EIA篩選大型培養物，此用（B)部份所述之免疫原溶解於6M胍一 HC1中。反應性培養再繼代選殖，並以來自PJC100/XL— 1經純化之γρ41 HIV—2 (免疫原）及rp41 Η I V - 2 ( "Diagen",掲示於 ΕΡ0 等 0370458 ，已列為本案參考），及重組體HIV— 2 p41抗原

pJC 1 04/XL-l ( Diagen株）筛選。二種 Η I V 經濟部中央揉準局8工消費合作社印製一 2抗原均純化自溶菌酶處理過且音波震盪過之生物團塊。溶菌産物以離心使澄明化，並回收不溶流份。接下來圃塊以 5% 三通 X — 100® (購自 SUma Chem i ca 1 Co .， St. Louis，MO)、1% 去氧瞻酸鈉、及 Tr i s — EDTA缓衝溶液洗滌。洗過之團塊，溶解且澄明於6M 胍一 HC 1中，用來塗覆於微滴定盤上。簡言之，1 〇〇徹克/毫升的毎孔洞每毫升1微克於室溫下培育一夜。純化自表現載體之CKS (PTB210/XL—1諝和於 Abbott HIV AB ® HIV-l/HIV-2 EIA 之檢品稀釋液中）（本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -23 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（22) 可購自 Abbott Laboratories，Abbott Park，IL· )用於飾選微滴定盤型式中，以鑑知及消除可與融合蛋白質中 CKS組份反應之可分泌單株抗體之純糸。因此，經選出以最好擴大用之純条，與二種重組體ΓΡ41蛋白質之 gp41組分反應。其中一純糸，命名為 7 — 1054 — 180,選出以進一步研究。純条 7—1054 — 180培養物擴大，分裝及冷凍於含1〇 %FC S及1 0%二甲亞碩之I MDM中。啻例2:7—1054—180蜇株抗體之産製及純化以下步驟用於産製及純化單株抗體 7-1054-180。 A .産製含7 - 1 054 - 1 80翬株抗體之腹水液得自細胞庫之冷凍7— 1 0 54— 1 8 0融合瘤細胞安瓿劑解凍，再置入擴大培養中。存活之融合瘤細胞腹膜内接種至經Pristane處理之老鼠。取出老鼠之腹水、匯集、經0. 2徹米濾膜過濾，並接免疫球蛋白G (IgG )類分析，以決定純化所需之蛋白質A管柱之體積。 B.自腹水中純化蜇株抗體7—1054—180 簡言之，經過濾及解凍之腹水與等體積之蛋白質A Sepharose結合缓衝溶液（1. 5M甘胺酸，3. 〇M NaCl, pH8. 9)混合，再經◦. 2微米濾膜過滴本紙張尺度適用中國0家標準（CNS〉甲4规格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i裝- 訂· -24 - A6 __B6_ 五、發明説明（23 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 。由定量腹水中IgG之含量，可決定蛋白質A管柱之體積。之後腹水再填料至蛋白質A層析管柱（可購自Phar-macia，Piscataway，NJ),且管柱以上述之結合緩衝溶液洗滌。繼續洗滌，直到得到穩定的吸光度（2 8 0毫微米 )基線為止。抗體以0. 1M檸檬酸，pH4. 5自Ρι：-〇te in A管柱中溶離。之後溶離液在2 — 8〇t：下以 PBS透析一夜。經透析之7—1054—180 I g G無菌過濾並分裝且貯於一8 〇t!下。宵例3 . Η I V—2反臁件單株抗體之鑑宙如下，在單株抗體7— 1054— 180下進行生化及免疫學鑑定。 A . 抗原鑑亩檢査以下準則以鑑定單株抗體：物質外觀，終pH值，徹生物負荷，抗體效價，SDS- PAGE電泳，層析 ,免疫反應性及比活性。以下關於單株抗體 7 — 1 054 — 1 80之數據，僳由三個不同批次分析而決定的。經濟部中央標準局8工消費合作社印製以目視檢査單株抗體之物質外觀，在環境溫度下似呈無色及澄清液體。單株抗體之終pH值，以標準實驗室技術偵測為：二批次呈7.1,—批次呈7. 2。在單株抗體各批次上進行徹生物負荷分析。單株抗體經0. 45徹米濾膜過濾後，濾膜在胰化酪蛋白大豆瓊脂上以3 Ot：培本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -25 A6 B6 2ΐό^^ 五、發明説明（24) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 育3天。檢査濾膜上於培育末了細菌生長之情形。 0. 4 5徹米濾膜在胰化酪蛋白大豆瓊脂上以3 2t：培育 3天偵測不到徹生物生長。抗體效價依據定量胺基酸分析所決定之蛋白質含量為主。抗體樣品真空乾燥，並接受1501C下，6N HC 1及1%酚之蒸汽水解共2小時。利用經修飾之 Millipore-Waters苯基硫胺甲醯基（PTC)策略進行衍生化作用。樣品以α—胺基丁酸為内在標準品，在Wate-rs Η P L C裝置有Maxima 8 2 0數據条統上分析三次。自定量胺基酸組成中所估計之蛋白質濃度為1批次為 1. 14毫克/毫升，2批次為4. 48毫克/毫升及3 批次為2.17毫克/毫升。得自定量胺基酸分析之數據用來夬定三個受試單株抗體批次之胺基酸殘基莫耳濃度比率。在這些分析中並不包括半胱胺酸及免胺酸，因為發現到其在水解中部份或完全地水解。單株抗體 7— 1054 —180之確實胺基酸組成示於表1。對每個1 6胺基酸所實驗決定之莫耳濃度比例，在三批次中像可再生的，且有4. 4%變化僳數（％CV)之總百分率 Ο 經濟部中央揉準局WT工消費合作社印*'衣抗體批次之同質性分析，利用還原條件下，SDS存在時之聚丙烯醛胺凝膠電泳（SDS — PAGE)進行。凝膠以考馬斯亮藍R — 250染色，依循可利用之方法。證實在IgG重及輕鍵正確分子大小下之蛋白質含量。在考馬斯藍染色之凝膠上進行掃描式光密度分析以評估純度衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐) " ' -26 - D A6 D A6 經濟部中央標準局w工消费合作社印¾ B6 五、發明説明（25 ) 。經掃描凝膠上蛋白質之含量偽在考馬斯藍結合之線性範圍内。於染料前頭移出凝膠前停止各SDS — PAGE凝膠之電泳。以考馬斯亮藍R- 25染色之結果示於圖3 ( A)。可觀察到相當於I gG重鏈（58, 000道耳呑，Da)及 IgG輕鏈（28, OOODa)的二帶。以精藝者已知之方法準備銀染色之SDS—PAGE凝膠，其含有和考馬斯藍染色凝膠所頃相同量之蛋白質，明示出各式雜質之定性存在是固定的，但可测及定量的變化。銀染色之SDS—PAGE凝膠結果示於圖3 (B)中。1 批次於第1列，較另2批次之純度略差，此僳指當各單株抗體批次以等量頃料至凝膠上而言。使用考馬斯染色凝膠之掃描光密度分析，以定量於單株抗體批次中所含之主要組份百分率。結果顯示對 58, OOODa帶加上，28， OOODa帶所估計之平均純度，在三個單株抗體批次中占考馬斯藍可染色物質總量之95%以上。由考馬斯染色及銀染色之凝膠中，1 批次顯出較另2批次略差之純度，但所估計出之純度仍在 9 5 %以上。單株抗體之1、 2及3批次，利用Bio Rad S i ο - S i 1 SEC — 400凝膠滲透管柱，於磷酸鹽缓衝食鹽水（PBS) ，pH7. 2中層析。決定分子量，且方法用來取得相對純度及結構完整性。1〇微克的單株抗體樣品以B i o_Rad SEC — 400管柱分析（B i 〇 _ R a d R i c h m ο n d，C A)於 P B S 中，流速為 1 笔升本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -----------------------裝-------玎------J. (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -27 - Α6 Β6 2139ϊ^ 五、發明説明（26 ) (請先閲f面之注意事項再填寫本頁) /分。概圔符合受試的三批次。分子大小和在相同條件下層析之I g G標準品比得上；高峰滯留時間為1批次 8. 90分，2批次8. 95分，3批次8. 95分，及 I gG標準品8. 9 0分。降下面積為各層析中所測及之 280毫微米吸光度總量之95%以上。於任一單株抗體批次中均測不到集結或明顯的降解作用。以免疫吸漬決定單株抗體7-1054—180各批次對免疫原、重組體Η I V — 2及重組體Η I V — 1抗原、純化自CKS及大腸桿菌溶胞産物之免疫反應性。以 Η I V— 2單株抗體7 - 1 054— 1 8 ◦之各批次充作第一抗體探針，以撿査其與各蛋白質之反應性。圖5之Μ 列含 19kDa、28kDa、33kDa、49kDa 、80kDa及106kDa之分子量標準。決定各單株抗體批次與重組體Η I V — 2及Η I V— 1抗原之反應性。代表性批次之結果示於圖4。於三批本中，均以免疫原 r p 4 1 Η I V - 2 Rod(l 列）及 rp HIV -2 Diagen (2列）偵測免疫吸漬活性。無一批次之單株抗體與HIV—l r p C K S - 4 1 (來自pTB 319/XL-1細胞之重組體HIV—1抗原，3列）經濟部中央標準局興工消費合作社印製 ,重組體CKS (4列）或大腸桿菌溶胞産物（5列）反應。與重組體Η IV — 2抗原之吸漬反應性，於三批次單株抗體中均定性的一致。各單株抗體批次與固化在習知免疫吸漬長條上之 Η I V — 1及Η I V — 2病毒蛋白質之反應性，示於圖本紙張尺度通用中國因家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公梦） A6 _B6_ 五、發明説明（27) 5A及5 B。含有Η I V — 1病毒蛋白質之硝化纖維免疫吸潰長條（HB分離物，圖5Α)與HIV—1陽性人類血清反應，利用標準的山羊抗人類共軛物（可購自Bio-Rad， Richmond， CA ) 進彳了，其顯不完全的反應性光譜（ 1列）。於2列上之長條與對HIV— 1 gp41具專一性之鼠抗體反應，再與山羊抗-老鼠共軛物反應。所觀察到的反應性顯示，習知之免疫吸漬長條可有效地用於此分析中。於3、4及5列上之Η IV— 1長條與 7—1054—180單株抗體各批次反應，之後與山羊抗一老鼠共扼物反應（可購自Bi〇_Rad，Richmond，CA) 。由圖5可識別的，單株抗體7—1054—18◦不與任何Η I V— 1蛋白質反應。含Η I V — 2病毒蛋白質（腦分離物）之硝化免疫吸漬長條也類似地測試。結果示於圖5Β。 1列示出可與 Η IV - 2蛋白質反應之陽性人類血清。2列含與Η IV 一 1 ( g ρ 4 1具專一性之與鼠抗體，且缺乏如圖5 Β 2 經濟部中央標準局具工消費合作社印3衣 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 列中所見之反應性，咸信是由於缺乏所使用之Η I V— 1 單株抗體及Η IV — 2蛋白質間之交叉反應性。3、4及 5列分別含7—1054—180單株抗體的1、 2及3 批次反應，之後與山羊抗一老鼠共軛物反應（可購自Bio-Rad, Richmond, CA ) 。由這些 7— 1054-180 單株抗體批次所顯示之7—1054—18◦單株抗體與 Η I V - 2 g Ρ36單體及g ρ36寡物之反應生進一步說明其與Η I V-2之專一反應生（Pau et al., Lan- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐)' ~ ' 一 29 一經濟部+央標準局貝工消費合作社印製 A6 _____B6_ 五、發明説明（28 ) cet 337:616-617 (1991) 〇當將圖5A及圖5B中之數據集合，重組體及天然免疫吸漬分析之結果顯示，三批次之7— 1 0 54 — 1 8 0 可與存在於Η IV — 2 gp4 1上之抗原決定基反應，但在（s, 1 H ) SP41上者則否。現在進行可為 7 — 1 054 — 1 80單株抗體專一地結合之抗原決定基與圖分析。雖然7—1054—180單株抗體之抗原決定基專一性尚未確實地定出輿圖，然已定出HIV—2穿膜糖蛋白上之型式一專一的反應生。見Gnan et al.，S-cience 237： 1346-1349 (1987) 〇比活性之決定僳先稀釋各批次的 7-1054— 180單株抗體，並於EIA試驗中測試各稀釋液，以決定分析型式中於0. 15毫升下可産生 0. 7光密度（〇D)所需之抗體蛋白質。自單株抗體各批次之稀釋曲線中，可決定出此量在0. 72微克至 0. 81微克範圍内。故此試驗之％CV為5. 9%。利用Amersham鼠抗體EIA分型套組（可購自Am-er sham > Inc. Arlington Heights , IL)決定 7— 1054— 180單株抗體之同型及I gG亞型。每一抗體批次，在稀釋下的主要亞型為IgG亞型1(K鍵 )。此可由自7—1054—180融合瘤細胞培養液中分離的IgG上行亞分型分析而予以進一步證實。窗例9 7 — 1 0 5 4 — 1 8 0 Μ抶杭鵲之穩定性測試本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) —裝. 訂_ -30 ~ A6 B6 五、發明説明（29 ) (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 進行7—1054—180單株抗體批次穩定性之測試，僳將整份單株抗體與HIV — 2陽性樣品之稀釋液貯置於2 — 8 t：下以連缠貯留，且在整値研究過程中分析 0D讀數。於此研究中，分析於0天、7天、1月、3月、4月、5月、6月、8月、11月及11月7天時進行。單株抗體之0D顯示在整個研究中訊號幾無下降。也決定出，7— 1 054— 1 80單株抗體對經稀釋之Η IV 一 2陽性血清樣品在穩定性而言僳比得上的。窨例4.使用7 — 1054- 1 8Q單株抗體充作陽性對照組於分析中單株抗體7—1054—180可充作陽性對照組使用，以決定受試樣品中Η I V— 1或Η I V_2 任一者或二者之存在。於此步驟中，重組體P 24 ( 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 Η I V - 1 gag) , g p 4 1 (HIV— 1 e n v )及 gp41 (HIV— 2 env，D i agen純糸）固化聚苯乙烯珠粒上。珠粒再塗覆以7— 1 054 — 1 80單株抗體並培育。Η I V抗體之偵測像加入標記有璋菜過氧化酶（HRP0)之 HIV-1 g a g：及 e η v 及 Η I V - 2 e n v重組體抗原。在二個不同的試驗期中，於5個不同的試驗處進行這些分析（cominunity B1〇〇d

Center of Greater Kansas City» Kansas City» Μ0» N— orth American Biologicals， Inc·* Miami » FL > Louis-ana Blood Center. Shreveport LA， Blood Systems Ce- 本紙張尺度適用中國困家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -31 - A6 B6 五、發明説明（30 ) ntral Lab， Scottsdale， AZ， and Abbott Laboratorie. s，Abbott Park，IL)。數據不於表 1 及 2。表 2

分析間 SD CV 各處之間 SD CV_

72 5.289 0.4341 8.2 0.4367 8.3 0.5059 9.6 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

分析間 SD CV 各處之間 SD CV

72 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7.861 0.6853 8.7 0.7496 9.5 0.8304 10.6 由7_ 1 054 — 1 80細胞株所産生之單株抗髏 7 — 1 〇 54— 1 8 0於布達佩斯條約下貯置於美國標準菌株收集所，1 2 3 0 1 Porklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852,於 1991 年 11 月 1 日， ATCC编號HB10908。本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐〉 "32 -

五、發明説明（31) 本發明之單株抗體可用於各種方式，包括充作捕獲劑或充作各種分析型式中之指示劑的一部份，或充作陽性對照組以行診斷或研究試驗，充作純化之一具。本發明此中所掲示的其他用法及變化，對精藝者應是易見的。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本纸張尺度適用中國國家標準（CNS>甲4规格（210 X 297公釐） -33 - Α6 Β6 五、發明説明（32 ) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 表 1 MAb抗一Η I V— 2三批次按重量比率計之胺基酸組成實驗重量百分率胺基酸殘基 1批次 2批次 3批次 A S X 9 . 1 8 . 4 8 . 6 G L X 1 1 . 3 1 1 . 3 1 1 . 9 S E R 8 . 2 8 . 1 8 . 7 G L Y 3 . 6 6 . 7 4 . 7 HIS 2 . 5 2 . 5 2 . 6 A R G 4 . 9 4 . 2 4 . 7 T H R 9 . 1 8 . 7 9 . 5 ALA 3 . 7 3 . 6 3 . 9 PRO 6 . 8 6 . 5 7 . 1 T Y R 6 . 〇 5 . 7 6 . 1 V A L 7 · 8 7 . 6 8 . 2 MET 2 . 〇 1 . 8 1 . 8 I L E 4 . 3 4 . 2 4 . 6 LEU 7 . 4 7 . 2 7 . 7 P Η E 5 . 2 5 . 2 5 . 7 L Y S 8 . 2 8 . 2 8 . 5 經濟部中央標準局WJ：工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -34 -

Claims

六、申請專利範園

公告本 ^ D7 附件一 A :第Al 1 0 9 4 6 0號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國82年6月修正 1 種可與HIV— 2 gp 3 6抗原專一性結合但不與Η I V — .1抗原結合之單株抗體。 2 ·如申請專利範圍第1項之單株抗體，其係由 A T C C Ν ο . Η B 1 Ο 9 Ο 8細胞株所分泌的。 3 .—種偵測Η I V — 2抗原或抗體之免疫分析法，其改進處包括如下步驟：添加已知量之單株抗體，該單株抗體係可與Η I V-2 gp 3 6抗原專一性結合但明顯不與HIV- 1抗原結合者。 4 .如申請專利範圍第3項之免疫分析法，其中該單株抗體係由細胞株ATCC No.HB 10908所分泌的。 5 種決定受試樣品中至少有Η IV — 2存在之試驗套組，其包括：一種容器，其含有由ATCC No.HB 1 0 9 0 8所分泌的單株抗體。丨装------訂------線 (請先閱讀背面之;±意事項存瑣寫本頁> 娌濟部中喪《準居R工消费合作钍印製本紙張尺度適《中《«家標準（CNS) f 4规格（210 X 2耵X* ) - 1 -