TW202304944A - 用於產生ｍＲＮＡ之三核苷酸及四核苷酸帽的合成 - Google Patents

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Abstract

本文提供製備用作5’ mRNA帽之三核苷酸及四核苷酸的方法。該等方法利用一種新穎「自上而下」策略，且與傳統方法相比，以更高之產率及增加之效率合成寡核苷酸。本文揭示之方法的關鍵步驟亦可適合於利用「一鍋法」，使得最終寡核苷酸產物之產率增加。

Description

用於產生mRNA之三核苷酸及四核苷酸帽的合成
短寡核苷酸，包括三核苷酸及四核苷酸，可用作產生mRNA之帽。mRNA加帽增加其穩定性，且亦可防止其被核酸外切酶降解，促進其轉譯，且調節其自細胞核中之輸出(Ramanathan, A.等人 mRNA capping: biological functions and application. Nucleic Acids Res. 2016, 44(16), 7511-7526)。用於合成三核苷酸及四核苷酸之習知策略通常涉及「自下而上」方法，其中將新核苷酸添加至正在生長之寡核苷酸鏈的5’末端。雖然此等策略得益於其反映用於固相寡核苷酸合成之傳統方法的事實，以及單體構建塊通常包含與先例化學相容之標準官能化模式的事實，但習知「自下而上」方法亦有許多缺點。此等包括在酸性條件下必要保護基之相容性問題，導致產率降低，以及5’-磷酸酯部分之安裝延遲直至合成結束。因此，需要用於合成三核苷酸及四核苷酸之新穎且改良之方法。
本申請案描述利用「自上而下」方法合成寡核苷酸之新方法，其中在正在生長之寡核苷酸鏈之3’末端添加新核苷/核苷酸單元。如本文所詳述，此類方法允許在合成單體之階段預先安裝寡核苷酸之所有磷官能基，且利用單體核苷/核苷酸之5’羥基與3’羥基之間固有之化學反應性差異。此外，自上而下之方法允許開發一種新保護基策略，該策略增加與寡核苷酸合成中利用之酸性條件之相容性，且避免傳統上使用之酸不穩定保護基引起的複雜性及低效。最後，本文所述之自上而下之策略亦可適合於使用「一鍋」法執行關鍵步驟，該方法提高合成效率且顯著增加最終寡核苷酸產物之產率。
因此，本文提供合成三核苷酸之方法，該等方法包括使式(4)化合物或其鹽與式(5)化合物或其鹽反應：
Figure 02_image003
(4)及
Figure 02_image005
(5)， 以獲得式(6)化合物或其鹽：
Figure 02_image007
(6)；及 使式(6)化合物與式(10)化合物或其鹽反應：
Figure 02_image009
(10)， 以獲得式(11)化合物：
Figure 02_image001
(11)， 其中R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、R 6、R a、R b、R c及R d在本文中定義。
本揭示案之某些實施例之細節在如下所述之某些實施例之詳細描述中闡述。本發明之其他特徵、目標及優勢將自定義、實例及申請專利範圍顯而易知。
相關申請案
本申請案根據35 U.S.C. § 119(e)主張2021年3月31日提出申請之美國臨時申請案U.S.S.N. 63/168,799的優先權，該臨時申請案以引用之方式併入本文中。 定義
下文更詳細地描述特定官能基及化學術語之定義。化學元素係根據元素週期表, CAS版本, Handbook of Chemistry and Physics, 第75版, 內封面進行鑑定，且具體官能基一般如其中所述定義。此外，有機化學之一般原理以及特定官能部分及反應性在以下中有所描述：Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999；Michael B. Smith, March’s Advanced Organic Chemistry, 第7版, John Wiley & Sons公司, New York, 2013；Richard C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, John Wiley & Sons公司, New York, 2018；及Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 第3版, Cambridge University Press, Cambridge, 1987。
本文所述之化合物可包含一或多個不對稱中心，且因此可呈各種立體異構形式存在，例如鏡像異構物及/或非鏡像異構物。例如，本文所述之化合物可呈個別鏡像異構物、非鏡像異構物或幾何異構物之形式，或者可呈立體異構物混合物之形式，包括外消旋混合物及富含一或多種立體異構物之混合物。異構物可藉由熟習此項技術者已知之方法自混合物中分離，該等方法包括對掌性高壓液相層析法(HPLC)以及對掌性鹽之形成及結晶；或者較佳異構物可藉由不對稱合成來製備。例如參見Jacques等人, Enantiomers, Racemates and Resolutions(Wiley Interscience, New York, 1981)；Wilen等人, Tetrahedron 33:2725 (1977)；Eliel, E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill, NY, 1962)；及Wilen, S.H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions第268頁(E.L. Eliel編輯, Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)。本發明另外涵蓋呈實質上不含其他異構物之個別異構物形式之化合物，且可替代地，呈各種異構物之混合物形式之化合物。
除非另外提供，否則本文描繪之化學式及結構包括不包含同位素富集原子之化合物，且亦包括包含同位素富集原子之化合物。例如，除氫經氘或氚置換、 19F經 18F置換或碳經富含 13C或 14C之碳置換之外具有本發明結構之化合物均在本揭示案之範疇內。舉例而言，此類化合物可用作生物分析中之分析工具或探針。
當列出一系列值(「範圍」)時，其涵蓋該範圍內之每個值及子範圍。除非另有提供，否則範圍包括範圍兩端之值。例如，「C 1-6烷基」涵蓋C 1、C 2、C 3、C 4、C 5、C 6、C 1-6、C 1-5、C 1-4、C 1-3、C 1-2、C 2-6、C 2-5、C 2-4、C 2-3、C 3-6、C 3-5、C 3-4、C 4-6、C 4-5及C 5-6烷基。
術語「烷基」係指具有1個至20個碳原子之直鏈或具支鏈飽和烴基之基團(「C 1-20烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個至12個碳原子(「C 1-12烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個至10個碳原子(「C 1-10烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個至9個碳原子(「C 1-9烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個至8個碳原子(「C 1-8烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個至7個碳原子(「C 1-7烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個至6個碳原子(「C 1-6烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個至5個碳原子(「C 1-5烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個至4個碳原子(「C 1-4烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個至3個碳原子(「C 1-3烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個至2個碳原子(「C 1-2烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個碳原子(「C 1烷基」)。在一些實施例中，烷基具有2個至6個碳原子(「C 2-6烷基」)。C 1-6烷基之實例包括甲基(C 1)、乙基(C 2)、丙基(C 3) (例如，正丙基、異丙基)、丁基(C 4) (例如，正丁基、第三丁基、第二丁基、異丁基)、戊基(C 5) (例如，正戊基、3-戊基、戊基、新戊基、3-甲基-2-丁基、第三戊基)及己基(C 6) (例如，正己基)。烷基之其他實例包括正庚基(C 7)、正辛基(C 8)、正十二烷基(C 12)及其類似基團。除非另有說明，否則烷基之每種情況獨立地未經取代(「未取代之烷基」)或經一或多個取代基(例如鹵素，諸如F)取代(「經取代之烷基」)。在某些實施例中，烷基為未取代之C 1-12烷基(諸如未取代之C 1-6烷基，例如-CH 3(Me)、未取代之乙基(Et)、未取代之丙基(Pr，例如未取代之正丙基(n-Pr)、未取代之異丙基( i-Pr))、未取代之丁基(Bu，例如未取代之正丁基( n-Bu)、未取代之第三丁基( tert-Bu或 t-Bu)、未取代之第二丁基( sec-Bu或 s-Bu)、未取代之異丁基( i-Bu))。在某些實施例中，烷基為經取代之C 1-12烷基(諸如經取代之C 1-6烷基，例如-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CH 2F、-CH 2CHF 2、-CH 2CF 3或芐基(Bn))。
術語「鹵烷基」係經取代之烷基，其中一或多個氫原子獨立地經鹵素，例如氟、溴、氯或碘置換。「全鹵烷基」為鹵烷基之子集且係指所有氫原子獨立地經鹵素，例如氟、溴、氯或碘置換之烷基。
術語「雜烷基」係指如下烷基，其進一步包括至少一個在母鏈內(例如，插入在相鄰碳原子之間)及/或置放在母鏈之一或多個末端位置的選自氧、氮或硫之雜原子(例如，1個、2個、3個或4個雜原子)。
術語「碳環基」或「碳環」係指在非芳族環系統中具有3個至14個環碳原子(「C 3-14碳環基」)及零個雜原子之非芳族環烴基之基團。在一些實施例中，碳環基具有3個至14個環碳原子(「C 3-14碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有3個至13個環碳原子(「C 3-13碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有3個至12個環碳原子(「C 3-12碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有3個至11個環碳原子(「C 3-11碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有3個至10個環碳原子(「C 3-10碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有3個至6個環碳原子(「C 3-6碳環基」)。示例性C 3-6碳環基包括環丙基(C 3)、環丙烯基(C 3)、環丁基(C 4)、環丁烯基(C 4)、環戊基(C 5)、環戊烯基(C 5)、環己基(C 6)、環己烯基(C 6)、環己二烯基(C 6)及其類似基團。除非另有說明，否則碳環基之每種情況獨立地未經取代(「未取代之碳環基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之碳環基」)。在某些實施例中，碳環基為未取代之C 3-14碳環基。在某些實施例中，碳環基為經取代之C 3-14碳環基。
在一些實施例中，「環烷基」為具有3個至14個環碳原子之單環飽和碳環基(「C 3-14環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有3個至10個環碳原子(「C 3-10環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有3個至8個環碳原子(「C 3-8環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有3個至6個環碳原子(「C 3-6環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有4個至6個環碳原子(「C 4-6環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有5個至6個環碳原子(「C 5-6環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有5個至10個環碳原子(「C 5-10環烷基」)。
術語「雜環基」或「雜環」係指具有環碳原子及1個至4個環雜原子之3至14員非芳族環系統之基團，其中每個雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「3-14員雜環基」)。在含有一或多個氮原子之雜環基中，若價數允許，則附接點可為碳原子或氮原子。
示例性的含有1個雜原子之3員雜環基包括氮丙啶基、環氧乙烷基及噻喃基。示例性的含有1個雜原子之4員雜環基包括氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基及硫雜環丁烷基。示例性的含有1個雜原子之5員雜環基包括四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、二氫噻吩基、吡咯啶基、二氫吡咯基及吡咯基-2,5-二酮。示例性的含有2個雜原子之5員雜環基包括二氧戊環基、氧硫雜環戊烷基及二硫雜環戊烷基。示例性的含有3個雜原子之5員雜環基包括三唑啉基、㗁二唑啉基及噻二唑啉基。示例性的含有1個雜原子之6員雜環基包括哌啶基、四氫哌喃基、二氫吡啶基及硫雜環己烷基。示例性的含有2個雜原子之6員雜環基包括哌𠯤基、嗎啉基、二硫雜環己烷基及二㗁烷基。示例性的含有3個雜原子之6員雜環基包括三𠯤基。術語「芳基」係指具有在芳環系統中提供之6-14個環碳原子及零個雜原子的單環或多環(例如雙環或三環) 4n+2芳環系統(例如，在環狀陣列中共享6個、10個或14個π電子)之基團(「C 6-14芳基」)。在一些實施例中，芳基具有6個環碳原子(「C 6芳基」；例如，苯基)。在一些實施例中，芳基具有10個環碳原子(「C 10芳基」；例如萘基，諸如1-萘基及2-萘基)。在一些實施例中，芳基具有14個環碳原子(「C 14芳基」；例如蒽基)。「芳基」亦包括如下環系統，其中如上定義之芳環與一或多個碳環基或雜環基稠合，其中基團或附接點位於芳環上，且在此類情況下，碳原子數繼續指定芳環系統中之碳原子數。除非另有說明，否則芳基之每種情況獨立地未經取代(「未取代之芳基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之芳基」)。在某些實施例中，芳基為未取代之C 6-14芳基。在某些實施例中，芳基為經取代之C 6-14芳基。
術語「雜芳基」係指具有環碳原子及在芳環系統中提供之1個至4個環雜原子的5-14員單環或多環(例如雙環、三環) 4n+2芳環系統(例如，在環狀陣列中共享6個、10個或14個π電子)之基團，其中每個雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5-14員雜芳基」)。在含有一或多個氮原子之雜芳基中，若價數允許，則附接點可為碳原子或氮原子。
術語「不飽和鍵」係指雙鍵或三鍵。
術語「不飽和」或「部分不飽和」係指包括至少一個雙鍵或三鍵之部分。
術語「飽和」或「完全飽和」係指不含雙鍵或三鍵之部分，例如，部分僅含單鍵。
除非另有明確規定，否則基團視情況經取代。術語「視情況經取代」係指經取代或未取代。在某些實施例中，烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基視情況經取代。「視情況經取代」係指經取代或未取代之基團(例如，「經取代」或「未取代」之烷基、「經取代」或「未取代」之烯基、「經取代」或「未取代」之炔基、「經取代」或「未取代」之雜烷基、「經取代」或「未取代」之雜烯基、「經取代」或「未取代」之雜炔基、「經取代」或「未取代」之碳環基、「經取代」或「未取代」之雜環基、「經取代」或「未取代」之芳基或「經取代」或「未取代」之雜芳基)。一般而言，術語「經取代」意謂基團上存在之至少一個氫經允許之取代基，例如取代後產生穩定化合物之取代基置換，該化合物為例如不會例如藉由重排、環化、消去或其他反應自發發生轉變之化合物。除非另有指示，否則「經取代」之基團在該基團之一或多個可取代位置處具有取代基，且當任何給定結構中之多於一個位置經取代時，各位置處之取代基為相同或不同的。預期術語「經取代」包括用有機化合物之所有允許之取代基進行之取代，且包括本文所述之引起穩定化合物形成之任何取代基。本發明預期任何及所有此類組合以得到穩定化合物。出於本發明之目的，諸如氮之雜原子可具有氫取代基及/或如本文所述之滿足雜原子價數且引起穩定部分形成之任何合適取代基。本發明不受本文所述之示例性取代基之任何限制。
示例性碳原子取代基包括鹵素、-CN、-NO 2、-N 3、-SO 2H、-SO 3H、-OH、-OR aa、-ON(R bb) 2、-N(R bb) 2、-N(R bb) 3 +X -、-N(OR cc)R bb、-SH、-SR aa、-SSR cc、-C(=O)R aa、-CO 2H、-CHO、-C(OR cc) 2、-CO 2R aa、-OC(=O)R aa、-OCO 2R aa、-C(=O)N(R bb) 2、-OC(=O)N(R bb) 2、-NR bbC(=O)R aa、-NR bbCO 2R aa、-NR bbC(=O)N(R bb) 2、-C(=NR bb)R aa、-C(=NR bb)OR aa、-OC(=NR bb)R aa、-OC(=NR bb)OR aa、-C(=NR bb)N(R bb) 2、-OC(=NR bb)N(R bb) 2、-NR bbC(=NR bb)N(R bb) 2、-C(=O)NR bbSO 2R aa、-NR bbSO 2R aa、-SO 2N(R bb) 2、-SO 2R aa、-SO 2OR aa、-OSO 2R aa、-S(=O)R aa、-OS(=O)R aa、-Si(R aa) 3、-OSi(R aa) 3-C(=S)N(R bb) 2、-C(=O)SR aa、-C(=S)SR aa、-SC(=S)SR aa、-SC(=O)SR aa、-OC(=O)SR aa、-SC(=O)OR aa、-SC(=O)R aa、-P(=O)(R aa) 2、-P(=O)(OR cc) 2、-OP(=O)(R aa) 2、-OP(=O)(OR cc) 2、-P(=O)(N(R bb) 2) 2、-OP(=O)(N(R bb) 2) 2、-NR bbP(=O)(R aa) 2、-NR bbP(=O)(OR cc) 2、-NR bbP(=O)(N(R bb) 2) 2、-P(R cc) 2、-P(OR cc) 2、-P(R cc) 3 +X -、-P(OR cc) 3 +X -、-P(R cc) 4、-P(OR cc) 4、-OP(R cc) 2、-OP(R cc) 3 +X -、-OP(OR cc) 2、-OP(OR cc) 3 +X -、-OP(R cc) 4、-OP(OR cc) 4、-B(R aa) 2、-B(OR cc) 2、-BR aa(OR cc)、C 1-20烷基、C 1-20全鹵烷基、C 1-20烯基、C 1-20炔基、雜C 1-20烷基、雜C 1-20烯基、雜C 1-20炔基、C 3-10碳環基、3-14員雜環基、C 6-14芳基及5-14員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0個、1個、2個、3個、4個或5個R dd基團取代；其中X -為相對離子； 或者碳原子上之兩個孿位氫經基團=O、=S、=NN(R bb) 2、=NNR bbC(=O)R aa、=NNR bbC(=O)OR aa、=NNR bbS(=O) 2R aa、=NR bb或=NOR cc置換；其中： R aa之每種情況獨立地選自C 1-20烷基、C 1-20全鹵烷基、C 1-20烯基、C 1-20炔基、雜C 1-20烷基、雜C 1-20烯基、雜C 1-20炔基、C 3-10碳環基、3-14員雜環基、C 6-14芳基及5-14員雜芳基，或者兩個R aa基團接合形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基各自獨立地經0個、1個、2個、3個、4個或5個R dd基團取代； R bb之每種情況獨立地選自氫、-OH、-OR aa、-N(R cc) 2、-CN、-C(=O)R aa、-C(=O)N(R cc) 2、-CO 2R aa、-SO 2R aa、-C(=NR cc)OR aa、-C(=NR cc)N(R cc) 2、-SO 2N(R cc) 2、-SO 2R cc、-SO 2OR cc、-SOR aa、-C(=S)N(R cc) 2、-C(=O)SR cc、-C(=S)SR cc、-P(=O)(R aa) 2、-P(=O)(OR cc) 2、-P(=O)(N(R cc) 2) 2、C 1-20烷基、C 1-20全鹵烷基、C 1-20烯基、C 1-20炔基、雜C 1-20烷基、雜C 1-20烯基、雜C 1-20炔基、C 3-10碳環基、3-14員雜環基、C 6-14芳基及5-14員雜芳基，或者兩個R bb基團接合形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0個、1個、2個、3個、4個或5個R dd基團取代； R cc之每種情況獨立地選自氫、C 1-20烷基、C 1-20全鹵烷基、C 1-20烯基、C 1-20炔基、雜C 1-20烷基、雜C 1-20烯基、雜C 1-20炔基、C 3-10碳環基、3-14員雜環基、C 6-14芳基及5-14員雜芳基，或者兩個R cc基團接合形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0個、1個、2個、3個、4個或5個R dd基團取代； R dd之每種情況獨立地選自鹵素、-CN、-NO 2、-N 3、-SO 2H、-SO 3H、-OH、-OR ee、-ON(R ff) 2、-N(R ff) 2、-N(R ff) 3 +X -、-N(OR ee)R ff、-SH、-SR ee、-SSR ee、-C(=O)R ee、-CO 2H、-CO 2R ee、-OC(=O)R ee、-OCO 2R ee、-C(=O)N(R ff) 2、-OC(=O)N(R ff) 2、-NR ffC(=O)R ee、-NR ffCO 2R ee、-NR ffC(=O)N(R ff) 2、-C(=NR ff)OR ee、-OC(=NR ff)R ee、-OC(=NR ff)OR ee、-C(=NR ff)N(R ff) 2、-OC(=NR ff)N(R ff) 2、-NR ffC(=NR ff)N(R ff) 2、-NR ffSO 2R ee、-SO 2N(R ff) 2、-SO 2R ee、-SO 2OR ee、-OSO 2R ee、-S(=O)R ee、-Si(R ee) 3、-OSi(R ee) 3、-C(=S)N(R ff) 2、-C(=O)SR ee、-C(=S)SR ee、-SC(=S)SR ee、-P(=O)(OR ee) 2、-P(=O)(R ee) 2、-OP(=O)(R ee) 2、-OP(=O)(OR ee) 2、C 1-10烷基、C 1-10全鹵烷基、C 1-10烯基、C 1-10炔基、雜C 1-10烷基、雜C 1-10烯基、雜C 1-10炔基、C 3-10碳環基、3-10員雜環基、C 6-10芳基及5-10員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0個、1個、2個、3個、4個或5個R gg基團取代，或者兩個孿位R dd取代基接合形成=O或=S；其中X -為相對離子； R ee之每種情況獨立地選自C 1-10烷基、C 1-10全鹵烷基、C 1-10烯基、C 1-10炔基、雜C 1-10烷基、雜C 1-10烯基、雜C 1-10炔基、C 3-10碳環基、C 6-10芳基、3-10員雜環基及3-10員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0個、1個、2個、3個、4個或5個R gg基團取代； R ff之每種情況獨立地選自氫、C 1-10烷基、C 1-10全鹵烷基、C 1-10烯基、C 1-10炔基、雜C 1-10烷基、雜C 1-10烯基、雜C 1-10炔基、C 3-10碳環基、3-10員雜環基、C 6-10芳基及5-10員雜芳基，或者兩個R ff基團接合形成3-10員雜環基或5-10員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0個、1個、2個、3個、4個或5個R gg基團取代； R gg之每種情況獨立地為鹵素、-CN、-NO 2、-N 3、-SO 2H、-SO 3H、-OH、-OC 1-6烷基、-ON(C 1-6烷基) 2、-N(C 1-6烷基) 2、-N(C 1-6烷基) 3 +X -、-NH(C 1-6烷基) 2 +X -、-NH 2(C 1-6烷基) +X -、-NH 3 +X -、-N(OC 1-6烷基)(C 1-6烷基)、-N(OH)(C 1-6烷基)、-NH(OH)、-SH、-SC 1-6烷基、-SS(C 1-6烷基)、-C(=O)(C 1-6烷基)、-CO 2H、-CO 2(C 1-6烷基)、-OC(=O)(C 1-6烷基)、-OCO 2(C 1-6烷基)、-C(=O)NH 2、-C(=O)N(C 1-6烷基) 2、-OC(=O)NH(C 1-6烷基)、-NHC(=O)(C 1-6烷基)、-N(C 1-6烷基)C(=O)(C 1-6烷基)、-NHCO 2(C 1-6烷基)、-NHC(=O)N(C 1-6烷基) 2、-NHC(=O)NH(C 1-6烷基)、-NHC(=O)NH 2、-C(=NH)O(C 1-6烷基)、-OC(=NH)(C 1-6烷基)、-OC(=NH)OC 1-6烷基、-C(=NH)N(C 1-6烷基) 2、-C(=NH)NH(C 1-6烷基)、-C(=NH)NH 2、-OC(=NH)N(C 1-6烷基) 2、-OC(NH)NH(C 1-6烷基)、-OC(NH)NH 2、-NHC(NH)N(C 1-6烷基) 2、-NHC(=NH)NH 2、-NHSO 2(C 1-6烷基)、-SO 2N(C 1-6烷基) 2、-SO 2NH(C 1-6烷基)、-SO 2NH 2、-SO 2C 1-6烷基、-SO 2OC 1-6烷基、-OSO 2C 1-6烷基、-SOC 1-6烷基、-Si(C 1-6烷基) 3、-OSi(C 1-6烷基) 3-C(=S)N(C 1-6烷基) 2、C(=S)NH(C 1-6烷基)、C(=S)NH 2、-C(=O)S(C 1-6烷基)、-C(=S)SC 1-6烷基、-SC(=S)SC 1-6烷基、-P(=O)(OC 1-6烷基) 2、-P(=O)(C 1-6烷基) 2、-OP(=O)(C 1-6烷基) 2、-OP(=O)(OC 1-6烷基) 2、C 1-10烷基、C 1-10全鹵烷基、C 1-10烯基、C 1-10炔基、雜C 1-10烷基、雜C 1-10烯基、雜C 1-10炔基、C 3-10碳環基、C 6-10芳基、3-10員雜環基或5-10員雜芳基；或者兩個孿位R gg取代基可接合形成=O或=S；且各X -為相對離子。
在某些實施例中，各碳原子取代基獨立地為鹵素、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-6烷基、-OR aa、-SR aa、-N(R bb) 2、-CN、-SCN、-NO 2、-C(=O)R aa、-CO 2R aa、-C(=O)N(R bb) 2、-OC(=O)R aa、-OCO 2R aa、-OC(=O)N(R bb) 2、-NR bbC(=O)R aa、-NR bbCO 2R aa或-NR bbC(=O)N(R bb) 2。在某些實施例中，各碳原子取代基獨立地為鹵素、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、-OR aa、-SR aa、-N(R bb) 2、-CN、-SCN、-NO 2、-C(=O)R aa、-CO 2R aa、-C(=O)N(R bb) 2、-OC(=O)R aa、-OCO 2R aa、-OC(=O)N(R bb) 2、-NR bbC(=O)R aa、-NR bbCO 2R aa或-NR bbC(=O)N(R bb) 2，其中R aa為氫、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、氧保護基(例如，矽烷基、TBDPS、TBDMS、TIPS、TES、TMS、MOM、THP、t-Bu、Bn、烯丙基、乙醯基、特戊醯基或苯甲醯基) (當附接至氧原子時)或硫保護基(例如，乙醯胺基甲基、t-Bu、3-硝基-2-吡啶次磺醯基、2-吡啶-次磺醯基或三苯基甲基) (當附接至硫原子時)；且各R bb獨立地為氫、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、或氮保護基(例如，Bn、Boc、Cbz、Fmoc、三氟乙醯基、三苯基甲基、乙醯基或Ts)。在某些實施例中，各碳原子取代基獨立地為鹵素、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-6烷基、-OR aa、-SR aa、-N(R bb) 2、-CN、-SCN或-NO 2。在某些實施例中，各碳原子取代基獨立地為鹵素、經取代(例如，經一或多個鹵素部分取代)或未取代之C 1-10烷基、-OR aa、-SR aa、-N(R bb) 2、-CN、-SCN或-NO 2，其中R aa為氫、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、氧保護基(例如，矽烷基、TBDPS、TBDMS、TIPS、TES、TMS、MOM、THP、t-Bu、Bn、烯丙基、乙醯基、特戊醯基或苯甲醯基) (當附接至氧原子時)或硫保護基(例如，乙醯胺基甲基、t-Bu、3-硝基-2-吡啶次磺醯基、2-吡啶-次磺醯基或三苯基甲基) (當附接至硫原子時)；且各R bb獨立地為氫、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、或氮保護基(例如，Bn、Boc、Cbz、Fmoc、三氟乙醯基、三苯基甲基、乙醯基或Ts)。
在某些實施例中，碳原子取代基之分子量低於250 g/mol、低於200 g/mol、低於150 g/mol、低於100 g/mol或低於50 g/mol。在某些實施例中，碳原子取代基由碳、氫、氟、氯、溴、碘、氧、硫、氮及/或矽原子組成。在某些實施例中，碳原子取代基由碳、氫、氟、氯、溴、碘、氧、硫及/或氮原子組成。在某些實施例中，碳原子取代基由碳、氫、氟、氯、溴及/或碘原子組成。在某些實施例中，碳原子取代基由碳、氫、氟及/或氯原子組成。
術語「鹵基」或「鹵素」係指氟(氟基，-F)、氯(氯基，-Cl)、溴(溴基，-Br)或碘(碘基，-I)。
若價數允許，則氮原子可經取代或未經取代，且包括一級、二級、三級及四級氮原子。示例性氮原子取代基包括氫、-OH、-OR aa、-N(R cc) 2、-CN、-C(=O)R aa、-C(=O)N(R cc) 2、-CO 2R aa、-SO 2R aa、-C(=NR bb)R aa、-C(=NR cc)OR aa、-C(=NR cc)N(R cc) 2、-SO 2N(R cc) 2、-SO 2R cc、-SO 2OR cc、-SOR aa、-C(=S)N(R cc) 2、-C(=O)SR cc、-C(=S)SR cc、-P(=O)(OR cc) 2、-P(=O)(R aa) 2、-P(=O)(N(R cc) 2) 2、C 1-20烷基、C 1-20全鹵烷基、C 1-20烯基、C 1-20炔基、雜C 1-20烷基、雜C 1-20烯基、雜C 1-20炔基、C 3-10碳環基、3-14員雜環基、C 6-14芳基及5-14員雜芳基，或者兩個附接至N原子之R cc基團接合形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0個、1個、2個、3個、4個或5個R dd基團取代，且其中R aa、R bb、R cc及R dd如上所定義。
在某些實施例中，各氮原子取代基獨立地為經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-6烷基、-C(=O)R aa、-CO 2R aa、-C(=O)N(R bb) 2、或氮保護基。在某些實施例中，各氮原子取代基獨立地為經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、-C(=O)R aa、-CO 2R aa、-C(=O)N(R bb) 2、或氮保護基，其中R aa為氫、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、或氧保護基(當附接至氧原子時)；且各R bb獨立地為氫、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、或氮保護基。在某些實施例中，各氮原子取代基獨立地為經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-6烷基、或氮保護基。
在某些實施例中，氮原子上存在之取代基為氮保護基(在本文中亦稱為「胺基保護基」)。氮保護基包括-OH、-OR aa、-N(R cc) 2、-C(=O)R aa、-C(=O)N(R cc) 2、-CO 2R aa、-SO 2R aa、-C(=NR cc)R aa、-C(=NR cc)OR aa、-C(=NR cc)N(R cc) 2、-SO 2N(R cc) 2、-SO 2R cc、-SO 2OR cc、-SOR aa、-C(=S)N(R cc) 2、-C(=O)SR cc、-C(=S)SR cc、C 1-10烷基(例如，芳烷基、雜芳烷基)、C 1-20烯基、C 1-20炔基、雜C 1-20烷基、雜C 1-20烯基、雜C 1-20炔基、C 3-10碳環基、3-14員雜環基、C 6-14芳基及5-14員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳烷基、芳基及雜芳基獨立地經0個、1個、2個、3個、4個或5個R dd基團取代，且其中R aa、R bb、R cc及R dd如本文中所定義。氮保護基係本領域中熟知的且包括在 Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene及P. G. M. Wuts, 第3版, John Wiley & Sons, 1999 (以引用之方式併入本文中)中詳細描述之彼等氮保護基。
舉例而言，在某些實施例中，至少一個氮保護基為醯胺基(例如，包括氮保護基(例如，-C(＝O)R aa)直接附接之氮原子之部分)。在某些此類實施例中，各氮保護基連同氮保護基所附接之氮原子一起獨立地選自由以下組成之群：甲醯胺、乙醯胺、氯乙醯胺、三氯乙醯胺、三氟乙醯胺、苯乙醯胺、3-苯基丙醯胺、吡啶甲醯胺、3-吡啶基甲醯胺、 N-苯甲醯基苯丙胺醯基衍生物、苯甲醯胺、對苯基苯甲醯胺、鄰硝基苯乙醯胺、鄰硝基苯氧基乙醯胺、乙醯乙醯胺、( N’-二硫基苯甲氧基醯基胺基)乙醯胺、3-(對羥基苯基)丙醯胺、3-(鄰硝基苯基)丙醯胺、2-甲基-2-(鄰硝基苯氧基)丙醯胺、2-甲基-2-(鄰苯基偶氮苯氧基)丙醯胺、4-氯丁醯胺、3-甲基-3-硝基丁醯胺、鄰硝基肉桂醯胺、 N-乙醯基甲硫胺酸衍生物、鄰硝基苯甲醯胺及鄰-(苯甲醯氧基甲基)苯甲醯胺。
在某些實施例中，至少一個氮保護基為胺基甲酸酯基(例如，包括氮保護基(例如，-C(＝O)OR aa)直接附接之氮原子之部分)。在某些此類實施例中，各氮保護基連同氮保護基所附接之氮原子一起獨立地選自由以下組成之群：胺基甲酸甲酯、胺基甲酸乙酯、胺基甲酸9-茀基甲酯(Fmoc)、胺基甲酸9-(2-磺基)茀基甲酯、胺基甲酸9-(2,7-二溴)茀基甲酯、胺基甲酸2,7-二-第三丁基-[9-(10,10-二側氧基-10,10,10,10-四氫噻噸基)]甲酯(DBD-Tmoc)、胺基甲酸4-甲氧基苯甲醯甲基酯(Phenoc)、胺基甲酸2,2,2-三氯乙酯(Troc)、胺基甲酸2-三甲基矽烷基乙酯(Teoc)、胺基甲酸2-苯基乙酯(hZ)、胺基甲酸1-(1-金剛烷基)-1-甲基乙酯(Adpoc)、胺基甲酸1,1-二甲基-2-鹵乙酯、胺基甲酸1,1-二甲基-2,2-二溴乙酯(DB-t-BOC)、胺基甲酸1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙酯(TCBOC)、胺基甲酸1-甲基-1-(4-聯苯基)乙酯(Bpoc)、胺基甲酸1-(3,5-二-第三丁基苯基)-1-甲基乙酯(t-Bumeoc)、胺基甲酸2-(2ʹ-及4ʹ-吡啶基)乙酯(Pyoc)、胺基甲酸2-(N,N-二環己基甲醯胺基)乙酯、胺基甲酸第三丁酯(BOC或Boc)、胺基甲酸1-金剛烷基酯(Adoc)、胺基甲酸乙烯酯(Voc)、胺基甲酸烯丙酯(Alloc)、胺基甲酸1-異丙基烯丙酯(Ipaoc)、胺基甲酸肉桂基酯(Coc)、胺基甲酸4-硝基肉桂基酯(Noc)、胺基甲酸8-喹啉基酯、胺基甲酸N-羥基哌啶基酯、二硫基胺基甲酸烷酯、胺基甲酸苯甲酯(Cbz)、胺基甲酸對甲氧基苯甲酯(Moz)、胺基甲酸對硝基苯甲酯、胺基甲酸對溴苯甲酯、胺基甲酸對氯苯甲酯、胺基甲酸2,4-二氯苯甲酯、胺基甲酸4-甲基亚磺醯基苯甲酯(Msz)、胺基甲酸9-蒽基甲酯、胺基甲酸二苯基甲酯、胺基甲酸2-甲硫基乙酯、胺基甲酸2-甲基磺醯基乙酯、胺基甲酸2-(對甲苯磺醯基)乙酯、胺基甲酸[2-(1,3-二硫雜環己烷基)]甲酯(Dmoc)、胺基甲酸4-甲硫基苯酯(Mtpc)、胺基甲酸2,4-二甲硫基苯酯(Bmpc)、胺基甲酸2-膦醯基乙酯(Peoc)、胺基甲酸2-三苯基膦醯基異丙酯(Ppoc)、胺基甲酸1,1-二甲基-2-氰基乙酯、胺基甲酸間氯-對醯氧基苯甲酯、胺基甲酸對(二羥基氧硼基)苯甲酯、胺基甲酸5-苯并異㗁唑基甲酯、胺基甲酸2-(三氟甲基)-6-色酮基甲酯(Tcroc)、胺基甲酸間硝基苯酯、胺基甲酸3,5-二甲氧基苯甲酯、胺基甲酸鄰硝基苯甲酯、胺基甲酸3,4-二甲氧基-6-硝基苯甲酯、胺基甲酸苯基(鄰硝基苯基)甲酯、胺基甲酸第三戊酯、 S-硫代胺基甲酸苯甲酯、胺基甲酸對氰基苯甲酯、胺基甲酸環丁酯、胺基甲酸環己酯、胺基甲酸環戊酯、胺基甲酸環丙基甲酯、胺基甲酸對癸氧基苯甲酯、胺基甲酸2,2-二甲氧基醯基乙烯酯、胺基甲酸鄰( N, N-二甲基甲醯胺基)苯甲酯、胺基甲酸1,1-二甲基-3-( N, N-二甲基甲醯胺基)丙酯、胺基甲酸1,1-二甲基丙炔酯、胺基甲酸二(2-吡啶基)甲酯、胺基甲酸2-呋喃基甲酯、胺基甲酸2-碘乙酯、胺基甲酸異莰酯、胺基甲酸異丁酯、胺基甲酸異菸鹼基酯、胺基甲酸對(對 ’-甲氧基苯基偶氮基)苯甲酯、胺基甲酸1-甲基環丁酯、胺基甲酸1-甲基環己酯、胺基甲酸1-甲基-1-環丙基甲酯、胺基甲酸1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙酯、胺基甲酸1-甲基-1-(對苯基偶氮苯基)乙酯、胺基甲酸1-甲基-1-苯基乙酯、胺基甲酸1-甲基-1-(4-吡啶基)乙酯、胺基甲酸苯酯、胺基甲酸對(苯基偶氮基)苯甲酯、胺基甲酸2,4,6-三-第三丁基苯酯、胺基甲酸4-(三甲基銨)苯甲酯及胺基甲酸2,4,6-三甲基苯甲酯。
在某些實施例中，至少一個氮保護基為磺醯胺基(例如，包括氮保護基(例如，-S(=O) 2R aa)直接附接之氮原子之部分)。在某些此類實施例中，各氮保護基連同氮保護基所附接之氮原子一起獨立地選自由以下組成之群：對甲苯磺醯胺(Ts)、苯磺醯胺、2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺醯胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺醯胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺醯胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺醯胺(Mte)、4-甲氧基苯磺醯胺(Mbs)、2,4,6-三甲基苯磺醯胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺醯胺(iMds)、2,2,5,7,8-五甲基𠳭烷-6-磺醯胺(Pmc)、甲烷磺醯胺(Ms)、β-三甲基矽烷基乙烷磺醯胺(SES)、9-蒽磺醯胺、4-(4ʹ,8ʹ-二甲氧基萘基甲基)苯磺醯胺(DNMBS)、苯甲基磺醯胺、三氟甲基磺醯胺及苯甲醯甲基磺醯胺。
在某些實施例中，各氮保護基連同氮保護基所附接之氮原子一起獨立地選自由以下組成之群：啡噻𠯤基-(10)-醯基衍生物、 N’-對甲苯磺醯基胺基醯基衍生物、 N’-苯基胺基硫基醯基衍生物、 N-苯甲醯基苯丙胺醯基衍生物、 N-乙醯基甲硫胺酸衍生物、4,5-二苯基-3-㗁唑啉-2-酮、 N-酞醯亞胺、 N-二硫雜琥珀醯亞胺(Dts)、 N-2,3-二苯基順丁烯二醯亞胺、 N-2,5-二甲基吡咯、 N-1,1,4,4-四甲基二矽烷基氮雜環戊烷加合物(STABASE)、5-取代之1,3-二甲基-1,3,5-三氮雜環己-2-酮、5-取代之1,3-二苯甲基-1,3,5-三氮雜環己-2-酮、1-取代之3,5-二硝基-4-吡啶酮、 N-甲胺、 N-烯丙胺、 N-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、 N-3-乙醯氧基丙胺、 N-(1-異丙基-4-硝基-2-側氧基-3-吡咯啉-3-基)胺、四級銨鹽、 N-苯甲基胺、 N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、 N-5-二苯并環庚胺、 N-三苯基甲胺(Tr)、 N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、 N-9-苯基茀基胺(PhF)、 N-2,7-二氯-9-茀基亞甲基胺、 N-二茂鐵基甲基胺基(Fcm)、 N-2-吡啶甲基胺基 N’-氧化物、 N-1,1-二甲硫基亞甲基胺、 N-亞芐基胺、 N-對甲氧基亞芐基胺、 N-二苯基亞甲基胺、 N-[(2-吡啶基)均三甲苯基]亞甲基胺、 N-( N’, N’-二甲基胺基亞甲基)胺、 N-對硝基亞芐基胺、 N-亞水楊基胺、 N-5-氯亞水楊基胺、 N-(5-氯-2-羥基苯基)苯基亞甲基胺、 N-亞環己基胺、 N-(5,5-二甲基-3-側氧基-1-環己烯基)胺、 N-硼烷衍生物、 N-二苯基硼酸衍生物、 N-[苯基(五醯基鉻或鎢)醯基]胺、 N-銅螯合物、 N-鋅螯合物、 N-硝基胺、 N-亞硝基胺、胺 N-氧化物、二苯基膦醯胺(Dpp)、二甲硫基膦醯胺(Mpt)、二苯基硫代膦醯胺(Ppt)、胺基磷酸二烷酯、胺基磷酸二苯甲酯、胺基磷酸二苯酯、苯次磺醯胺、鄰硝基苯次磺醯胺(Nps)、2,4-二硝基苯次磺醯胺、五氯苯次磺醯胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺醯胺、三苯基甲基次磺醯胺及3-硝基吡啶次磺醯胺(Npys)。在一些實施例中，氮保護基的兩種情況連同氮保護基附接之氮原子為 N, N’-亞異丙基二胺。
在某些實施例中，至少一個氮保護基為Bn、Boc、Cbz、Fmoc、三氟乙醯基、三苯基甲基、乙醯基或Ts。
在某些實施例中，各氧原子取代基獨立地為經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、-C(=O)R aa、-CO 2R aa、-C(=O)N(R bb) 2、或氧保護基。在某些實施例中，各氧原子取代基獨立地為經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-6烷基、-C(=O)R aa、-CO 2R aa、-C(=O)N(R bb) 2、或氧保護基，其中R aa為氫、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、或氧保護基(當附接至氧原子時)；且各R bb獨立地為氫、經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-10烷基、或氮保護基。在某些實施例中，各氧原子取代基獨立地為經取代(例如，經一或多個鹵素取代)或未取代之C 1-6烷基、或氧保護基。
在某些實施例中，氧原子上存在之取代基為氧保護基(在本文中亦稱為「羥基保護基」)。氧保護基包括 -R aa、-N(R bb) 2、-C(=O)SR aa、-C(=O)R aa、-CO 2R aa、-C(=O)N(R bb) 2、-C(=NR bb)R aa、-C(=NR bb)OR aa、-C(=NR bb)N(R bb) 2、-S(=O)R aa、-SO 2R aa、-Si(R aa) 3、-P(R cc) 2、-P(R cc) 3 +X -、-P(OR cc) 2、-P(OR cc) 3 +X -、-P(=O)(R aa) 2、-P(=O)(OR cc) 2及-P(=O)(N(R bb) 2) 2，其中X -、R aa、R bb及R cc如本文中所定義。氧保護基係本領域中熟知的且包括在 Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene及P. G. M. Wuts, 第3版, John Wiley & Sons, 1999 (以引用之方式併入本文中)中詳細描述之彼等氧保護基。
在某些實施例中，各氧保護基連同氧保護基附接之氧原子一起係選自由以下組成之群：甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲硫基甲基(MTM)、第三丁基硫基甲基、(苯基二甲基矽烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苯甲氧基甲基(BOM)、對甲氧基苯甲氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(p-AOM)、癒創木酚甲基(GUM)、第三丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基(POM)、矽氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、雙(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基矽烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氫哌喃基(THP)、3-溴四氫哌喃基、四氫硫哌喃基、1-甲氧基環己基、4-甲氧基四氫哌喃基(MTHP)、4-甲氧基四氫硫哌喃基、4-甲氧基四氫硫哌喃基 S, S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二㗁烷-2-基、四氫呋喃基、四氫硫呋喃基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氫-7,8,8-三甲基-4,7-亞甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苯甲氧基乙基、1-甲基-1-苯甲氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基矽烷基乙基、2-(苯基硒基)乙基、第三丁基、烯丙基、對氯苯基、對甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苯甲基(Bn)、對甲氧基苯甲基(PMB)、3,4-二甲氧基苯甲基、鄰硝基苯甲基、對硝基苯甲基、對鹵苯甲基、2,6-二氯苯甲基、對氰基苯甲基、對苯基苯甲基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基 N-氧離子基、二苯基甲基、 p, p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并環庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、對甲氧基苯基二苯基甲基、二(對甲氧基苯基)苯基甲基、三(對甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯甲醯甲氧基苯基)二苯基甲基、4,4′,4″-參(4,5-二氯酞醯亞胺基苯基)甲基、4,4′,4″-參(乙醯丙醯氧基苯基)甲基、4,4′,4″-參(苯甲醯氧基苯基)甲基、4,4'-二甲氧基-3"'-[N-(咪唑基甲基)]三苯甲基醚(IDTr-OR)、4,4'-二甲氧基-3"'-[N-(咪唑基乙基)胺甲醯基]三苯甲基醚(IETr-OR)、1,1-雙(4-甲氧基苯基)-1′-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)二苯并哌喃基、9-(9-苯基-10-側氧基)蒽基、1,3-苯并二硫戊环-2-基、苯并異噻唑基 S, S-二氧離子基、三甲基矽烷基(TMS)、三乙基矽烷基(TES)、三異丙基矽烷基(TIPS)、二甲基異丙基矽烷基(IPDMS)、二乙基異丙基矽烷基(DEIPS)、二甲基第三己基矽烷基、第三丁基二甲基矽烷基(TBDMS)、第三丁基二苯基矽烷基(TBDPS)、三苯甲基矽烷基、三-對二甲苯基矽烷基、三苯基矽烷基、二苯基甲基矽烷基(DPMS)、第三丁基甲氧基苯基矽烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲醯基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、對氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-側氧基戊酸酯(乙醯丙酸酯)、4,4-(伸乙基二硫基)戊酸酯(乙醯丙醯基二硫縮醛)、特戊酸酯、金剛酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、對苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(均三甲基苯甲酸酯)、碳酸甲酯、碳酸9-茀基甲酯(Fmoc)、碳酸乙酯、碳酸2,2,2-三氯乙酯(Troc)、碳酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(TMSEC)、碳酸2-(苯基磺醯基)乙酯(Psec)、碳酸2-(三苯基膦醯基)乙酯(Peoc)、碳酸異丁酯、碳酸乙烯酯、碳酸烯丙酯、碳酸第三丁酯(BOC或Boc)、碳酸對硝基苯酯、碳酸苯甲酯、碳酸對甲氧基苯甲酯、碳酸3,4-二甲氧基苯甲酯、碳酸鄰硝基苯甲酯、碳酸對硝基苯甲酯、硫代碳酸 S-苯甲酯、碳酸4-乙氧基-1-萘基酯、二硫代碳酸甲酯、2-碘苯甲酸酯、4-疊氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、鄰-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲醯基苯磺酸酯、碳酸2-(甲硫基甲氧基)乙酯(MTMEC-OR)、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-雙(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、異丁酸酯、單琥珀酸酯、( E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、鄰(甲氧基醯基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、 N, N, N’, N’-四甲基二胺基磷酸烷酯、 N-苯基胺基甲酸烷酯、硼酸酯、二甲基硫代膦醯基、2,4-二硝基苯基次磺酸烷酯、硫酸酯、甲烷磺酸酯(甲磺酸酯)、苯甲基磺酸酯及甲苯磺酸酯(Ts)。
在某些實施例中，至少一個氧保護基為矽烷基、TBDPS、TBDMS、TIPS、TES、TMS、MOM、THP、 t-Bu、Bn、烯丙基、乙醯基、特戊醯基或苯甲醯基。
在某些實施例中，取代基之分子量低於250 g/mol、低於200 g/mol、低於150 g/mol、低於100 g/mol或低於50 g/mol。在某些實施例中，取代基由碳、氫、氟、氯、溴、碘、氧、硫、氮及/或矽原子組成。在某些實施例中，取代基由碳、氫、氟、氯、溴、碘、氧、硫及/或氮原子組成。在某些實施例中，取代基由碳、氫、氟、氯、溴及/或碘原子組成。在某些實施例中，取代基由碳、氫、氟及/或氯原子組成。在某些實施例中，取代基包含0個、1個、2個或3個氫鍵供體。在某些實施例中，取代基包含0個、1個、2個或3個氫鍵受體。
「相對離子」或「陰離子相對離子」係與帶正電基團締合之帶負電基團，以保持電子中性。陰離子相對離子可為單價的(例如，包括一個形式負電荷)。陰離子相對離子亦可為多價的(例如，包括多於一個形式負電荷)，諸如二價或三價。示例性相對離子包括鹵離子(例如，F -、Cl -、Br -、I -)、NO 3 -、ClO 4 -、OH -、H 2PO 4 -、HCO 3 -、HSO 4 -、磺酸根離子(例如，甲烷磺酸根、三氟甲烷磺酸根、對甲苯磺酸根、苯磺酸根、10-樟腦磺酸根、萘-2-磺酸根、萘-1-磺酸-5-磺酸根、乙烷-1-磺酸-2-磺酸根及其類似離子)、羧酸根離子(例如，乙酸根、丙酸根、苯甲酸根、甘油酸根、乳酸根、酒石酸根、乙醇酸根、葡萄糖酸根及其類似離子)、BF 4 -、PF 4 -、PF 6 -、AsF 6 -、SbF 6 -、B[3,5-(CF 3) 2C 6H 3] 4] -、B(C 6F 5) 4 -、BPh 4 -、Al(OC(CF 3) 3) 4 -及碳硼烷陰離子(例如，CB 11H 12 -或(HCB 11Me 5Br 6) -)。可為多價之示例性相對離子包括CO 3 2-、HPO 4 2-、PO 4 3-、B 4O 7 2-、SO 4 2-、S 2O 3 2-、羧酸根陰離子(例如，酒石酸根、檸檬酸根、反丁烯二酸根、順丁烯二酸根、蘋果酸根、丙二酸根、葡萄糖酸根、琥珀酸根、戊二酸根、己二酸根、庚二酸根、辛二酸根、壬二酸根、癸二酸根、水楊酸根、酞酸根、天冬胺酸根、麩胺酸根及其類似陰離子)及碳硼烷。
使用片語「至少一種情況」係指1種、2種、3種、4種或更多種情況，但亦涵蓋範圍，例如1至4種、1至3種、1至2種、2至4種、2至3種或3至4種情況，包括端點。
「非氫基團」係指針對非氫之特定變數所定義之任何基團。
此等及其他示例性取代基在詳細說明、實例及申請專利範圍中更詳細地描述。本發明不受上述取代基示例性列表之任何限制。
如本文所用，術語「鹽」係指任何及所有鹽且涵蓋醫藥學上可接受之鹽。鹽包括由酸及鹼之中和反應產生之離子化合物。鹽由一或多種陽離子(帶正電之離子)及一或多種陰離子(負離子)構成，以使得鹽為電中性的(無淨電荷)。本發明化合物之鹽包括衍生自無機酸及有機酸以及無機鹼及無機鹼之鹽。酸加成鹽之實例為胺基與無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及過氯酸，或與有機酸，諸如乙酸、草酸、順丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸形成的鹽，或藉由使用本領域中已知之其他方法，諸如離子交換形成的鹽。其他鹽包括己二酸鹽、褐藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡萄糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽、馬尿酸鹽及其類似鹽。衍生自適當鹼之鹽包括鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、銨鹽及N +(C 1-4烷基) 4鹽。代表性之鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂及其類似鹽。其他鹽包括銨、四級銨及胺陽離子，使用相對離子，諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳烷基磺酸根及芳基磺酸根形成。
如本文所用，術語「處理」係指與分離及/或純化化學反應之一或多種產物(例如，自任何剩餘之起始物質、其他試劑、溶劑或化學反應之副產物)相關之任何單個步驟或一系列多個步驟。處理反應可包括藉由例如蒸發或凍乾移除溶劑。處理反應亦可包括例如藉由將反應混合物分離成有機層及水層，進行液-液萃取。在一些實施例中，處理反應包括淬滅反應以使任何未反應之試劑失活。處理反應亦可包括冷卻反應混合物以誘導固體自混合物中沈澱，其可藉由例如過濾、傾析或離心來收集或移除。處理反應亦可包括藉由層析法純化一或多種反應產物。其他方法亦可用於純化一或多種反應產物，包括但不限於蒸餾及再結晶。處理反應之其他方法係本領域中已知的，且熟習此項技術者將能夠容易地確定可用於處理特定反應之其他適當方法。
如本文所用，在X為數字或百分比的情況下術語「約X」或「大約X」係指介於X之99.5%與100.5%之間、99%與101%之間、98%與102%之間、97%與103%之間、96%與104%之間、95%與105%之間、92%與108%之間或90%與110%之間(包括端點)的數字或百分比。
本文所述之態樣不限於具體實施例、系統、組合物、方法或組態，因此當然可變化。本文使用之術語僅出於描述特定態樣之目的，且除非本文具體定義，否則不意欲限制。 合成三核苷酸之方法
在一個態樣中，本文提供用於合成三核苷酸之方法，該等方法包括使式(4)化合物或其鹽與式(5)化合物或其鹽反應以獲得式(6)化合物或其鹽：
Figure 02_image003
(4)；
Figure 02_image005
(5)；及
Figure 02_image007
(6)。
在某些實施例中，接著式(6)化合物可與式(10)化合物或其鹽反應以獲得式(11)化合物或其鹽：
Figure 02_image009
(10)及
Figure 02_image001
(11)。
在本文所揭示之化合物中，R 1可為氮保護基(例如，本文所揭示之任何氮保護基)。在一些實施例中，R 1為醯基氮保護基(例如，可藉由鹼處理而移除之與酸性條件相容之醯基)。在某些實施例中，R 1為烷基，諸如異丁基。
本文揭示之化合物中的部分R a、R b及R c可各自獨立地為氧保護基。在某些實施例中，R a為2-氰基乙基。在某些實施例中，R b為2-氰基乙基。在某些實施例中，R c為2-氰基乙基。R a、R b及R c全部三個均可為2-氰基乙基。在一些實施例中，R 1為異丁基且R a、R b及R c均為2-氰基乙基。舉例而言，式(4)化合物可為具有以下結構之化合物：
Figure 02_image017
。
本文揭示之化合物中的部分R 2亦可獨立地為本文所揭示之任何氮保護基。在一些實施例中，R 2為醯基氮保護基(例如，可藉由鹼處理而移除之與酸性條件相容之醯基)。在一特定實施例中，R 2為苯甲醯基。在一些實施例中，R 2為烷基。
本文所揭示之化合物中的部分R 3可為本文所揭示之任何氧保護基。在一些實施例中，R 3為O-醯基保護基(例如，特戊酸酯)。舉例而言，式(5)化合物可為具有以下結構之化合物：
Figure 02_image019
。
本文揭示之化合物亦可包括部分Y。在一些實施例中，Y為O。在某些實施例中，Y不存在。舉例而言，式(6)化合物可為具有以下結構之化合物：
Figure 02_image007
， 其中Y為O或不存在。在某些實施例中，式(6)化合物為具有以下結構之化合物：
Figure 02_image022
。
本文揭示之化合物可包括部分R 4。R 4可為氮保護基(例如，本文所揭示之任何氮保護基)。在一些實施例中，R 4為醯基氮保護基(例如，可藉由鹼處理而移除之與酸性條件相容之醯基)。在某些實施例中，R 4為烷基。在一特定實施例中，R 4為異丁基。
本文揭示之化合物亦可包括部分R 5、R 6及R d。在一些實施例中，R 5、R 6及R d各獨立地為氧保護基。本文所揭示之化合物中的部分R 5及R 6可為本文所揭示之任何氧保護基。在一些實施例中，R 5及R 6各獨立地為O-醯基保護基。在某些實施例中，R 5及R 6可各自獨立地為烷基(例如，異丁基)。在某些實施例中，R d為2-氰基乙基。在一些實施例中，R 5及R 6各為異丁基且R d為2-氰基乙基。舉例而言，式(10)化合物可為具有以下結構之化合物：
Figure 02_image024
。
在一些實施例中，式(11)化合物可具有以下結構：
Figure 02_image026
。
式(4)化合物與式(5)化合物可在活化劑存在下反應以獲得式(6)化合物。舉例而言，酸活化劑可用於活化化合物中之二異丙基胺基，諸如式(4)化合物中之二異丙基。在酸活化後，二異丙基胺基充當離去基且經另一個分子之5’-羥基，諸如式(5)化合物之5’-羥基取代。在一些實施例中，酸活化劑為弱酸(例如，當其溶解在溶劑中時部分解離之酸)。可用於本文所述之方法之示例性酸活化劑包括但不限於吡啶三氟乙酸鹽、1H-四唑、二異丙基銨鹽四氮唑、5-(乙硫基)-1H-四唑及4,5-二氰基咪唑。在一些實施例中，在本文所述之方法中使用之酸活化劑為吡啶三氟乙酸鹽。酸活化劑亦可呈溶液形式提供。在某些實施例中，酸活化劑為吡啶三氟乙酸鹽且呈吡啶溶液提供。
本文所揭示之方法之各步驟可在各種溶劑存在下進行。舉例而言，式(4)化合物與式(5)化合物可在溶劑存在下反應以獲得式(6)化合物。進行此反應之合適溶劑包括但不限於吡啶、乙腈、二氯甲烷、四氫呋喃及二甲基甲醯胺。在一些實施例中，式(4)化合物與式(5)化合物之反應在吡啶中進行。
各種條件適合使式(4)化合物與式(5)化合物反應以獲得式(6)化合物，且熟習此項技術者容易理解，使用本文所揭示之方法，此類條件可經替換且仍然相容。例如，此類反應可進行不同時間量。反應可包含大約0.5小時、大約1小時、大約1.5小時、大約2小時、大約2.5小時、大約3小時、大約3.5小時、大約4小時、大約4.5小時或大約5小時之反應時間。在一些實施例中，式(4)化合物與式(5)化合物之反應進行大約2-3小時之反應時間。
試劑彼此之各種莫耳比亦可用於本文所揭示之方法之反應中。舉例而言，在獲得式(6)化合物之反應中，式(5)化合物與式(4)化合物之比率可為大約1:0.5、大約1:0.6、大約1:0.7、大約1:0.8、大約1:0.9、大約1:1、大約1:1.1、大約1:1.2、大約1:1.3、大約1:1.4、大約1:1.5、大約1:1.6、大約1:1.7、大約1:1.8、大約1:1.9或大約1:2。在一些實施例中，可使用大於1:2之比率。在某些實施例中，使用大約1:1.4之比率。式(5)化合物與酸活化劑之比率可為大約1:1、大約1:1.5、大約1:2、大約1:2.5、大約1:3、大約1:3.5、大約1:4、大約1:4.5或大約1:5。在某些實施例中，式(5)化合物與酸活化劑之比率為大約1:2。
在此類反應中亦可采用各種溫度。例如，在添加酸活化劑之前，式(4)化合物與式(5)化合物之反應可包含大約-30℃、大約-25℃、大約-20℃、大約-15℃、大約-10℃、大約-5℃、大約0℃、大約5℃或大約10℃之反應溫度。在某些實施例中，式(4)化合物與式(5)化合物之反應包含在添加酸活化劑之前大約-10℃之溫度。在一些實施例中，在添加酸活化劑之前及在添加酸活化劑之後的反應溫度相同。添加酸活化劑之前及添加酸活化劑之後的反應溫度亦可彼此不同。例如，添加酸活化劑之後的反應溫度可在大約-30℃至大約30℃、大約-25℃至大約25℃、大約-20℃至大約20℃、大約-15℃至大約15℃、大約-10℃至大約10℃或大約-5℃至大約5℃之範圍內。在一些實施例中，添加酸活化劑之後的溫度在大約-3℃至大約5℃之範圍內。 一鍋反應製程
根據本文所揭示之方法，式(4)化合物與式(5)化合物之反應可包括氧化劑。在一些實施例中，此類反應不包含氧化劑。舉例而言，此類反應可不包含氧化劑，從而引起式(6-a)化合物之產生：
Figure 02_image028
(6-a)， 其中R 1、R 2、R 3、R a、R b及R c如本文中所定義。
在與式(10)化合物反應之前，式(6)化合物可經分離或未經分離。在一些實施例中，未使用氧化劑時產生之式(6-a)化合物在與式(10)化合物反應之前不分離。此製程在本文中稱為「一鍋」反應(例如，多個步驟在同一反應容器內進行而不分離中間物)。與包含分離中間化合物之相應反應順序(例如，「逐步」反應)相比，一鍋反應可具有若干優點。例如，一鍋反應可減少進行本文所揭示之方法所需之時間量(例如，消除處理或純化一鍋法中未分離之中間化合物所需的時間)。一鍋反應亦可減輕在處理或純化條件下可能發生之中間物上之保護基的部分或完全損失。相對於相應逐步製程，此類反應亦可提高總產量或產率。例如，在本文所揭示之一些方法中使用之一鍋反應策略可使反應產率自約30-40%提高至約45%、約50%、約55%、約56%、約57%、約58%、約59%、約60%或大於約60%。在一些實施例中，在本文所揭示之方法中使用一鍋反應策略使總產率自約30-40%提高至大約60%。
使用本文所述之一鍋法，式(6-a)化合物可在不分離下直接與式(10)化合物反應，以獲得式(11-a)化合物：
Figure 02_image030
(11-a)， 其中R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、R 6、R a、R b、R c及R d如本文中所定義。 在一些實施例中，式(11-a)化合物具有以下結構：
Figure 02_image032
。
接著可將式(11-a)化合物氧化以獲得式(11)化合物。式(11-a)化合物之氧化可在氧化劑存在下完成。氧化劑(oxidant)，亦稱為氧化劑(oxidizer)或氧化劑(oxidizing agent)，係能夠接受來自另一種物質之電子的物質(例如，氧化另一種物質)。用於本文所揭示之方法(亦即，用於將P(III)氧化為P(V))之合適氧化劑係熟知的，且對於熟習此項技術者而言係顯而易見的(例如，在Connelly, N. G.及Geiger, W. E. Chem. Rev. 1996, 96, 877-910中揭示之彼等氧化劑)。本文所揭示之方法中使用之氧化劑可為無機氧化劑。合適無機氧化劑包括但不限於碘、過氧化氫、氧氣及臭氧。本文所揭示之方法中使用之氧化劑亦可為有機氧化劑，例如有機過氧化物。合適有機過氧化物包括但不限於氫過氧化物(例如，具有結構通式ROOH之過氧化物，其中R為有機基團，諸如氫過氧化烷基)、過氧酸(例如，具有結構通式RC(=O)OOH之過氧化物，其中R為有機基團，諸如烷基過氧酸)、過氧化二醯基(例如，具有結構通式RC(=O)OOC(=O)R之過氧化物，其中各R獨立地為有機基團，諸如過氧化烷基二醯基或過氧化芳基二醯基)及過氧化二烷基(例如，具有結構通式ROOR之過氧化物，其中各R獨立地為烷基)。在一些實施例中，在本文所揭示之方法中使用氫過氧化物。在一些實施例中，氫過氧化物為氫過氧化甲基、氫過氧化乙基、氫過氧化正丙基、氫過氧化異丙基、氫過氧化正丁基、氫過氧化異丁基或氫過氧化第三丁基。在某些實施例中，本文所揭示之方法中使用之氧化劑為氫過氧化第三丁基。
各種條件適合使式(6-a)化合物與式(10)化合物反應以獲得式(11)化合物，且熟習此項技術者容易理解，使用本文所揭示之方法，此類條件可經替換且仍然相容。舉例而言，此類反應可進行不同時間量。此類反應可包含在添加氧化劑之前大約0.5小時、大約1小時、大約1.5小時、大約2小時、大約2.5小時、大約3小時、大約3.5小時、大約4小時、大約4.5小時、大約5小時、大約5.5小時、大約6小時或超過大約6小時之反應時間。在一些實施例中，式(6-a)化合物與式(10)化合物之反應在添加氧化劑之前進行大約3-5小時之反應時間。反應可包含在添加氧化劑之後大約1-48小時、大約2-44小時、大約4-40小時、大約6-36小時、大約8-32小時、大約10-28小時或大約12-24小時之反應時間。在某些實施例中，反應包含在添加氧化劑之後大約12-24小時之反應時間。
試劑彼此之各種莫耳比亦可用於本文所揭示之方法之反應中。舉例而言，在獲得式(6)化合物之反應中，式(6-a)化合物與式(10)化合物之比率可為大約1:0.5、大約1:0.6、大約1:0.7、大約1:0.8、大約1:0.9、大約1:1、大約1:1.1、大約1:1.2、大約1:1.3、大約1:1.4、大約1:1.5、大約1:1.6、大約1:1.7、大約1:1.8、大約1:1.9或大約1:2。在一些實施例中，可使用大於1:2之比率。在某些實施例中，使用大約1:1.6之比率。式(6-a)化合物與酸活化劑之比率可為大約1:1、大約1:1.5、大約1:2、大約1:2.5、大約1:3、大約1:3.5、大約1:4、大約1:4.5或大約1:5。在某些實施例中，式(5)化合物與酸活化劑之比率為大約1:2。式(6-a)化合物與氧化劑之比率可為大約1:1、大約1:1.5、大約1:2、大約1:2.5、大約1:3、大約1:3.5、大約1:4、大約1:4.5或大約1:5。在一些實施例中，使用大於1:5之比率。在某些實施例中，本文所揭示之方法中使用的式(6-a)化合物與氧化劑之比率為大約1:3。
在此類反應中亦可使用各種溫度。舉例而言，式(6-a)化合物與式(10)化合物之反應可包含在大約-15℃至大約30℃、大約-10℃至大約25℃、大約-5℃至大約20℃或大約0℃至大約15℃範圍內之反應溫度。在某些實施例中，式(6-a)化合物與式(10)化合物之反應包含在大約0℃至大約14℃範圍內之溫度。 逐步反應 製程
獲得式(6)化合物之式(4)化合物與式(5)化合物之反應可包括使用氧化劑。當式(4)化合物與式(5)化合物之反應中使用氧化劑時，可產生式(6-b)化合物：
Figure 02_image034
(6-b)， 其中R 1、R 2、R 3、R a、R b及R c如本文中所定義。
式(6-b)化合物可與式(10)化合物反應以獲得式(11)之化合物。式(6-b)化合物可在與式(10)化合物反應之前分離。式(6-b)化合物亦可在與式(10)化合物反應之前純化。此類反應製程在本文中稱為「逐步」反應製程。此製程之優點包括但不限於在式(4)化合物與式(5)化合物之偶合中的高區域選擇性、藉由本文所揭示之方法產生之下游三核苷酸之流線型組裝及在合成製程之早期階段得到之三核苷酸的5’-官能化。此類逐步製程(自式(4)化合物與式(5)化合物之偶合至式(11)化合物之產生)之產率可在約20%至約50%、約22%至約48%、約24%至約46%、約26%至約44%、約26%至約44%、約28%至約42%、約30%至約40%、約32%至約38%或約34%至約36%之範圍內。在一些實施例中，本文所揭示之方法中之此類逐步製程的產率為約30%至約40%。 三核苷酸合成之完成
在使用本文所述之步驟獲得式(11)化合物之後，化合物可進一步反應以合成三核苷酸、四核苷酸或更大之核酸分子。在一些實施例中，將式(11)化合物脫除保護基以形成式(12)化合物或其鹽：
Figure 02_image036
(12)。
式(12)化合物可含有部分X，其中X代表磷酸酯部分之任何合適之相對離子。在一些實施例中，X為氫、第1族金屬、第2族金屬或經取代或未取代之銨。在一些實施例中，X不存在。在某些實施例中，X為氫。在某些實施例中，X為鹼金屬或鹼土金屬。在某些實施例中，X為Li。在某些實施例中，X為Na。在某些實施例中，X為K。在某些實施例中，X為銨離子。在某些實施例中，X為N,N-二甲基辛銨(DMOA)。
獲得式(12)化合物的將式(11)化合物脫除保護基可包括使用本領域已知之任何合適方法以任何順序對式(11)化合物中之各種部分脫除保護基。在一些實施例中，將式(11)化合物之磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-a)化合物或其鹽作為第一脫除保護基步驟進行：
Figure 02_image038
(12-a)， 其中R 1、R 2、R 3、R 4、R 5及R 6如本文中所定義。
在形成式(12-a)化合物之後，可進行式(12-a)化合物之整體脫除保護基以獲得式(12)化合物或其鹽。在一些實施例中，式(12)化合物中之磷酸酯部分之脫除保護基在N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)存在下進行。在一些實施例中，式(12-a)化合物整體脫除保護基在氫氧化銨及甲胺存在下進行。
在一些實施例中，將式(11)化合物脫除保護基包括將式(11)化合物之磷酸酯部分脫除部分保護基以獲得式(12-b)化合物：
Figure 02_image040
(12-b)， 或其鹽，其中R a、R 1、R 2、R 3、R 4、R 5及R 6如本文中所定義；將式(12-b)化合物之剩餘磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-a)化合物：
Figure 02_image038
(12-a)， 或其鹽，其中R 1、R 2、R 3、R 4、R 5及R 6如本文中所定義；及將式(12-a)化合物整體脫除保護基以獲得式(12)化合物或其鹽。在一些實施例中，在胺存在下將式(11)化合物之磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-b)化合物。在一些實施例中，胺為空間位阻胺。在一些實施例中，胺為正丁胺、第二丁胺、異丁胺、第三丁胺、異丙胺或二異丙基乙胺。在某些實施例中，胺為 t-BuNH 2。在一些實施例中，在N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)存在下將式(12-b)化合物之剩餘磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-a)化合物。在一些實施例中，在氫氧化銨及甲胺存在下將式(12-a)化合物整體脫除保護基以獲得式(12)化合物。在一些實施例中，式(12-a)化合物具有以下結構：
Figure 02_image043
， 或其鹽。
在一些實施例中，式(12-b)化合物具有以下結構：
Figure 02_image045
， 或其鹽。
在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包括使式(12)化合物與式(15)化合物反應：
Figure 02_image047
(15)。 在某些實施例中，式(15)化合物之一或多個鈉陽離子不存在或獨立地經另一種第1族金屬陽離子或經取代或未取代之銨基置換。在某些實施例中，式(15)化合物進一步包括陰離子以實現電子中性。例如，式(15)化合物中之一個鈉陽離子可能不存在，從而導致電子中性：
Figure 02_image049
。
式(12)化合物與式(15)化合物之反應可產生式(16)化合物或其鹽：
Figure 02_image051
(16)。
式(16)化合物含有部分Y，表示獨立定義之相對離子，提供化合物之各種鹽形式。可在Y之位置上獨立使用任何單價陽離子以產生式(16)之鹽，包括在定義部分及整個本申請案中描述之彼等陽離子。舉例而言，Y之合適選項可包括但不限於氫、三乙銨、銨、鈉及鉀。在一些實施例中，Y為銨(例如，式(16)化合物作為銨鹽產生)。在一些實施例中，Y之每種情況相同。在某些實施例中，Y之每種情況可不同。例如，Y之一或多種情況可為銨，且Y之每種其他情況可獨立地為氫或另一種合適之相對離子。在某些實施例中，一或多個Y不存在。
在一些實施例中，在使式(12)化合物與式(15)化合物反應之前，X為H之式(12)化合物轉變成X為Na、K或Li之式(12)化合物，且X為Na、K或Li之式(12)化合物轉變成X為DMOA之式(12)化合物。在某些實施例中，X為DMOA之式(12)化合物用於與式(15)化合物之反應中以獲得式(16)化合物。
在一些實施例中，使式(12)化合物與式(15)化合物反應以產生式(16)化合物包括金屬鹽介導之式(12)化合物與式(15)化合物之偶合(例如，如Woodman, E. K.等人 N,N’-Carbonyldiimidazole-Mediated Amide Coupling: Significant Rate Enhancement Achieved by Acid Catalysis with Imidazole-HCl. Org. Process Res. Dev. 2009, 13(1), 106-113中所述)。在一些實施例中，式(12)化合物與式(15)化合物之反應在酸及金屬或金屬鹽存在下進行。在某些實施例中，酸為HCl。任何合適之金屬鹽均可用於反應中，包括在PCT申請公開案第WO 2014/103704號(以引用之方式整體併入本文)中揭示之彼等金屬鹽。在一些實施例中，金屬鹽為FeCl 3、AlCl 3、MnCl 2、MgCl 2、FeCl 2、ZnCl 2、NiCl 2、CoCl 2或CaCl 2。在某些實施例中，金屬鹽為FeCl 3。
在一些實施例中，該方法進一步包括純化使用本文所揭示之方法產生之式(16)之四核苷酸。用於純化寡核苷酸之各種方法係本領域中已知的(例如，Zhang等人, Int. J. Mol. Sci. RecentMethods for Purification and Structure Determination of Oligonucleotides. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(12), 2134中揭示之彼等方法)且可用於純化式(16)之四核苷酸。在一些實施例中，切向流過濾(TFF，亦稱為錯流過濾)用於純化由本文所揭示之方法產生之四核苷酸。在TFF中，含有待純化之四核苷酸之最終反應混合物藉由使其切向流過多孔過濾膜之表面來過濾。此過程繼續進行，且隨著時間之推移，額外之試劑通過過濾膜，留下純化及濃縮之四核苷酸。在一些實施例中，該方法包括藉由陰離子交換層析法(AEX)進一步純化四核苷酸，其中使四核苷酸通過含有帶正電之化學基團之離子交換樹脂。混合物中之任何帶負電之物質，諸如式(16)之四核苷酸化合物，與離子交換樹脂結合，而其他分子則通過樹脂。AEX純化步驟可顯著提高四核苷酸化合物之純度。熟習此項技術者將容易理解其他方法亦可用於純化本文合成之四核苷酸。 三核苷酸構建塊之合成
本文所述之方法中利用之化合物可藉由各種合成程序產生。舉例而言，式(4)化合物可藉由式(3)化合物之亞磷醯化形成：
Figure 02_image053
(3)。
式(3)化合物可包含部分R 1、R a及R b。在一些實施例中，R 1為氮保護基(例如，醯基氮保護基)。在某些實施例中，R 1為異丁基。R a及R b可各自獨立地為氧保護基。在某些實施例中，R a為2-氰基乙基。在某些實施例中，R b為2-氰基乙基。因此，在式(3)化合物中，R 1可為異丁基，且R a及R b各可為2-氰基乙基。舉例而言，式(3)化合物可具有以下結構：
Figure 02_image055
。
可在例如N,N,N’,N’-四異丙基二胺基亞磷酸2-氰基乙酯及5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)存在下進行式(3)化合物之亞磷醯化，以產生式(4)化合物。在一些實施例中，式(4)化合物在與式(5)化合物反應之前未純化或處理。
在一些實施例中，該方法進一步包括藉由使式(1)化合物與式(2)化合物反應以獲得式(3)化合物：
Figure 02_image057
(1)及
Figure 02_image059
(2)。
在一些實施例中，式(1)化合物中之部分R 1為氮保護基。舉例而言，R 1可為醯基氮保護基。在某些實施例中，R 1為異丁基。式(2)化合物中之部分R a及R b可各自獨立地為氧保護基。舉例而言，R a及R b可各自獨立地為2-氰基乙基。在一些實施例中，式(1)化合物及式(2)化合物具有以下結構：
Figure 02_image061
(1)及
Figure 02_image063
(2)。
在一些實施例中，在酸活化劑，諸如吡啶三氟乙酸鹽存在下使式(1)化合物與式(2)化合物反應。在一些實施例中，反應進一步包括在氧化劑(例如，本文所述之任何合適之氧化劑)存在下將此類反應之產物氧化。
在各個實施例中，用於本文所述之方法之化合物含有部分R a、R b、R c及R d。此等部分中之每一者可獨立地具有下式：
Figure 02_image065
， 其中R x及R y各自獨立地為H、視情況經取代之環狀或非環狀烷基、視情況經取代之環狀或非環狀雜烷基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基。在一些實施例中，R x及R y組合形成3-6員環(例如，碳環或雜環)。在某些實施例中，R x及R y獨立地為H或C 1-C 6烷基。在某些實施例中，R x及R y獨立地為C 1-C 6烷基。R x及R y亦可組合形成3-6員碳環。
在某些實施例中，R x為甲基且R y為甲基。R a及R b因此可各自獨立地具有下式：
Figure 02_image067
。
在一些實施例中，R x及R y均為氫。R c及R d因此可各自獨立地具有下式：
Figure 02_image069
。
本文所揭示之方法可進一步包括藉由式(5-a)化合物之3’及5’羥基脫除保護基來形成式(5)化合物：
Figure 02_image071
(5-a)。 此類脫除保護基可在酸存在下進行。在一些實施例中，式(5-a)化合物之脫除保護基在氫氟酸存在下進行。
在一些實施例中，該方法進一步包括藉由保護式(5-b)化合物之2’羥基來形成式(5-a)化合物：
Figure 02_image073
(5-b)。 式(5-b)化合物之保護可在鹼及合適氧保護基前驅體，例如POMCl及KHDMS存在下進行。
本文所述之方法可進一步包括藉由保護式(5-c)化合物中之3’及5’羥基來形成式(5-b)化合物：
Figure 02_image075
(5-c)。 在一些實施例中，式(5-c)化合物中之3’及5’羥基之保護在 t-(Bu) 2Si(OTf) 2存在下進行。
本文所述之方法可進一步包括藉由式(9)化合物之亞磷醯化來形成式(10)化合物：
Figure 02_image077
(9)。 式(9)化合物之亞磷醯化可在N,N,N’,N’-四異丙基二胺基亞磷酸2-氰基乙酯及二異丙基銨鹽四氮唑存在下進行。
在一些實施例中，該方法進一步包括藉由將式(8)化合物之5’羥基脫除保護基來形成式(9)化合物：
Figure 02_image079
(8)。 將式(8)化合物脫除保護基可在TCA及C 12H 25SH存在下進行。
該方法可進一步包括藉由保護式(7)化合物之2’及3’羥基來形成式(8)化合物：
Figure 02_image081
(7)。 此類反應可在 i-Bu 2O、三乙胺及4-二甲基胺基吡啶存在下進行。
在一些實施例中，該方法進一步包括藉由式(14)化合物反應來形成式(15)化合物：
Figure 02_image083
(14)。 式(14)化合物反應可在咪唑、Ph 3P、TEA及(PyS) 2存在下進行。
在一些實施例中，該方法進一步包括藉由將式(13)化合物烷基化來形成式(14)化合物：
Figure 02_image085
(13)。 將式(13)化合物烷基化可在(MeO) 2SO 2存在下進行。在一些實施例中，烷基化反應進一步包括在大約3.5、大約3.6、大約3.7、大約3.8、大約3.9、大約4、大約4.1、大約4.2、大約4.3、大約4.4或大約4.5之pH下反應。在某些實施例中，將式(13)化合物烷基化在大約4之pH下進行。式(13)化合物可使用本領域已知之各種方法純化，包括如本文所述之陰離子交換層析法(AEX)。
在一些態樣中，本文提供之用於合成三核苷酸之方法包括使式(4)化合物與式(5)化合物在吡啶三氟乙酸鹽及吡啶存在下反應：
Figure 02_image017
及
Figure 02_image019
， 以獲得式(6)化合物：
Figure 02_image089
； 使式(6)化合物與式(10)化合物在吡啶三氟乙酸鹽及吡啶存在下反應：
Figure 02_image024
， 以獲得式(11-a)化合物：
Figure 02_image032
；及 使式(11-a)化合物與氫過氧化第三丁基反應以獲得式(11)化合物：
Figure 02_image093
。
在一些實施例中，該方法進一步包括在 t-BuNH 2存在下將式(11)化合物之磷酸酯部分脫除部分保護基以獲得式(12-b)化合物：
Figure 02_image045
； 在N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)存在下將式(12-b)化合物之剩餘磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-a)化合物：
Figure 02_image096
；及 在氫氧化銨及甲胺存在下將式(12-a)化合物整體脫除保護基以獲得式(12)化合物：
Figure 02_image098
， 其中X為DMOA。
在一些實施例中，該方法進一步包括在HCl及金屬鹽存在下使式(12)化合物與式(15)化合物反應：
Figure 02_image047
以獲得式(16)化合物：
Figure 02_image051
， 其中Y之每種情況獨立地為NH 4或不存在。
在一些實施例中，式(4)化合物藉由以下形成：在N,N,N’,N’-四異丙基二胺基亞磷酸2-氰基乙酯及5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)存在下進行式(3)化合物之亞磷醯化：
Figure 02_image055
以獲得式(4)化合物。
在一些實施例中，式(3)化合物藉由以下形成：使式(1)化合物與式(2)化合物在吡啶三氟乙酸鹽及吡啶存在下反應：
Figure 02_image061
及
Figure 02_image063
；及 在氫過氧化第三丁基存在下將相應產物氧化以獲得式(3)化合物。 物質組合物
在一個態樣中，本揭示案提供式(1)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image061
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(2)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image063
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(3)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image055
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(4)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image017
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(5)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image019
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(6)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image089
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(7)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image081
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(8)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image079
； 及其鹽。
在另一態樣中，本發明提供式(9)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image077
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(10)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image024
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(11)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image093
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(11-a)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image032
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(12-a)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image113
， 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(12-b)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image045
， 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(12)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image115
， 其中X不存在、為H、Na或DMOA；及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(15)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image047
； 及其鹽。
在另一態樣中，本揭示案提供式(16)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image051
， 其中Y之每種情況獨立地為NH 4或不存在；及其鹽。 實例 實例 1 ：逐步三核苷酸組裝
Figure 02_image119
Figure 02_image121
空間位阻之胺基亞磷酸酯 (phosphoramidite) 2s ：
Figure 02_image123
將PCl 3(20.5 g，13 ml，149 mmol，1當量，1 wt，1 vol)溶解在CH 2Cl 2(200 ml，9.8 vol)中且冷卻至＜ -20℃。添加三乙胺(TEA；15.3 g，21 ml，151 mmol，1當量)，接著在10分鐘內逐滴添加二異丙胺(DIPA；15.2 g，21 ml，150 mmol，1當量)，維持＜ -20℃。添加完成後，將混合物在-23℃至-20℃下攪拌1小時，接著升溫至環境溫度。6小時後，將混合物冷卻至-10℃且添加TEA (30.5 g，42 ml，301 mmol，2當量)。添加 3- 羥基 -3- 甲基丁腈(29.7 g，31 ml，300 mmol，2當量)且使混合物升溫至環境溫度。攪拌隔夜後，將混合物用己烷(200 ml，19.8 vol)稀釋，過濾，且用CH 2Cl 2/己烷1:1 (100 ml，5 vol)沖洗。將濾液濃縮，用己烷/EtOAc 1:1 (200 ml，9.8 vol)再稀釋且過濾。將濾液濃縮且通過具有含0.1% TEA之己烷/EtOAc 20% (1 L，50 vol；用於調節、樣品裝載及溶析)的矽膠塞(75 g)。將濾液濃縮，得到淡黃色固體，將其濕磨、過濾且用正庚烷(200 ml，9.8 vol)沖洗且乾燥隔夜，得到呈白色結晶固體狀之 2s(41.2 g，125 mmol，84%產率)。將回收之濾液/沖洗液濃縮，用正庚烷(20 ml，1 vol)稀釋且儲存在冷凍機中。藉由傾析移除黃色上清液，得到呈淡黃色固體狀之另外之 2s(2.3 g，7.0 mmol，4.7%產率)。 2’-OMe-G 5’- 磷酸酯 3s ：
Figure 02_image125
將 1s(15 g，40.83 mmol，1當量，1 wt，1 vol)與吡啶(75 ml×2，5 vol×2)共沸，再溶解在吡啶(30 ml，2 vol)中，且冷卻至-10℃。將吡啶三氟乙酸鹽(Py-TFA；15.78 g，81.7 mmol，2當量)與吡啶(75 ml×2，5 vol×2)共沸，且再溶解在吡啶(50 ml，3.3 vol)中，且合併至 1s中(25 ml吡啶，1.7 vol用於完全沖洗及轉移)。以固體形式添加 2s(13.37 g，40.83 mmol，1當量，0.89 wt) (-8℃)，且將混合物升溫至0℃。在0℃下攪拌40分鐘後，使混合物在1小時內升溫至環境溫度，再攪拌1小時，且冷卻至0℃。添加TBHP (5-6 M癸烷溶液；8.9 ml，0.59 vol，49 mmol，1.2當量)且使混合物升溫至環境溫度。攪拌隔夜後，用20 wt%之亞硫酸鈉水溶液(Na 2SO 3；12.9 g，0.86 g，20.4 mmol，0.5當量)淬滅反應，攪拌10分鐘且濃縮。將所得混合物在CH 2Cl 2(150 ml，10 vol)與9 wt% NaHCO 3水溶液(153 g，10 wt，164 mmol，4當量)之間分配。分離有機層且放在一邊。用CH 2Cl 2(150 ml，10 vol)萃取水層。合併所有有機層，用鹽水(45 ml，3 vol)洗滌，經硫酸鈉(Na 2SO 4；10 g，0.67 wt，70 mmol)乾燥且過濾。將濾液濃縮，與甲苯(75 ml，5 vol)共沸，且進行矽膠管柱層析法(EtOAc/IPA 10%-25%及EtOAc/丙酮30-100%)，得到呈白色乾泡沫狀之 3s(18.08 g，1.21 wt，29.7 mmol，72%產率)。
1H-NMR (CDCl 3, 300 MHz), δ (ppm) = 12.31 (s, 1H), 10.64 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 5.90 (d, J= 5.9 Hz, 1H), 4.64 (m, 1H), 4.54 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 4.42 (m, 2H), 4.34 (m, 1H), 3.84 (d, J= 4.1 Hz, 1H), 3.39 (s, 3H),  2.90 (d, J= 2.8 Hz, 2H), 2.85 (m, 1H), 2.78 (d, J= 4.2 Hz, 2H), 1.71 (s, 3H), 1.70 (s, 3H), 1.61 (s, 3H),  1.59 (s, 3H), 1.25 (m, 6H)。 2’-OMe-G 3’- 亞磷醯化：
Figure 02_image127
將 3s(400 g，656 mmol，1當量，1 wt，1 vol)與乙腈(1.2 L×2，3 vol×2)共沸，且藉由用CH 2Cl 2(1.2 L，3 vol)稀釋及沖洗轉移至帶有頂部機械攪拌器之5 L 3頸反應器中。將N,N,N’,N’-四異丙基二胺基亞磷酸2-氰基乙酯(218.3 g，724 mmol，1.10當量)與乙腈(1.2 L，3 vol)共沸且藉由用CH 2Cl 2(1.2 L，3 vol)稀釋及沖洗添加至反應器中。將所得混合物冷卻至-3℃且添加5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT，93.96 g，722 mmol，1.1當量)。使反應升溫至環境溫度，繼續隔夜，且接著用正庚烷(1.2 L，3 vol)稀釋。過濾混合物以移除沈澱，且用2:1 v/v CH 2Cl 2-庚烷(0.6 L，1.5 vol)沖洗反應器及濾餅。回收之濾液依次用以下來洗滌：(1) 20 wt% KHCO 3水溶液(500 g，1.0 mol，1.5當量)；(2) 15 wt% NaCl水溶液(800 g)；(3) 23 wt% NaCl水溶液(800 g)。濃縮有機層，與乙腈(1.2 L×2，3 vol×2)共沸，再溶解在乙腈(800 ml，2 vol)中，且用乙腈(200 ml，0.5 vol)沖洗/稀釋，得到 4s儲備溶液(1461 g，假定淨重656.2 mmol，0.449 mmol/g)，用於儲存在5℃下。
1H-NMR (CD 3CN, 300 MHz), δ (ppm) = 12.07 (br, 1H), 10.45 (br, 1H), 7.85 (ds, 1H), 5.87 (m, 1H), 4.67 (m, 1H), 4.60 (m, 1H), 4.4-4.5 (m, 3H), 3.91-4.11 (m, 2H), 3.65-3.81 (m, 3H), 3.52 (m, 1H), 3.37 & 3.33 (ds, 3H), 2.94 (m, 2H), 2.81 (m, 2H), 2.71-2.78 (m, 3H), 1.67 (s, 3H), 1.66 (s, 3H), 1.57 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.2-1.3 (m, 18H)。 2’-OMe-G + A 偶合：
Figure 02_image129
將 5s(170.65 g，351.5 mmol，1當量，1 wt，1 vol)與吡啶(850 ml，5 vol)共沸以移除550 ml吡啶。與吡啶(850 ml，5 vol)重複共沸以移除750 ml吡啶(剩餘大約400 ml吡啶)。在另一燒瓶中，將吡啶三氟乙酸鹽(「Py-TFA」，135.8 g，703 mmol，2.0當量)與吡啶(850 ml，5 vol)共沸以移除550 ml吡啶。與吡啶(850 ml，5 vol)重複共沸以移除830 ml吡啶(剩餘大約320 ml吡啶)。用吡啶(360 ml)稀釋所得混合物以將總吡啶體積調節至大約680 ml (4 vol)。濃縮 4s儲備溶液(1056 g，假定淨重492 mmol，0.466 mmol/g，1.4當量)，與850 ml吡啶共沸以移除680 ml吡啶(剩餘大約170 ml吡啶)。藉由用322 ml吡啶稀釋及沖洗將 4s轉移至12 L反應器中。藉由用300 ml吡啶稀釋及沖洗將 5s轉移至反應器中。將所得混合物冷卻至低於-10℃且添加Py-TFA溶液。使混合物在3小時內緩慢升溫至5℃且冷卻至2℃。添加TBHP (5-6 M之癸烷溶液，96 ml，0.5 mmol，1.5當量)且使混合物升溫至環境溫度(19℃)。2小時後，將混合物用甲苯(3.75 L，22 vol)稀釋，冷卻至10℃，且用10 wt%亞硫酸鈉水溶液(Na 2SO 3，332 g，263 mmol，0.75當量)淬滅。分離頂層且放在一邊。將底層用水(0.85 L，5 vol)稀釋且用CH 2Cl 2(1.7 L，10 vol)萃取。合併所有有機層且濃縮。將所得混合物用CH 2Cl 2(3.4 L，20 vol)稀釋且依次用以下來洗滌：(1) 10 wt% KHCO 3水溶液(704 g，703 mmol，2.0當量)；(2) 10 wt% NaCl水溶液(500 g)；(3) 23 wt% NaCl水溶液(500 g)，且濃縮。將由此獲得之粗混合物與甲苯(1.37 L，8 vol)共沸且進行矽膠塞純化(SiO 2，2 kg塞×2，用CH 2Cl 2-EtOH 2.5%至20%溶析；RediSep Gold 330 g×1，用CH 2Cl 2-EtOH 2%至14%溶析)。將主要溶析份濃縮，與丙酮合併，再次濃縮，且與正庚烷共沸，得到呈白色固體狀之 6s(295.5 g，244 mmol，69%產率)。 G- 亞磷醯化：
Figure 02_image131
將 9s(56.6 g，115 mmol，1當量，1 wt，1 vol)與乙腈(283 ml×2，5 vol×2)共沸且懸浮在CH 2Cl 2(142 ml，2.5 vol)中。將N,N,N’,N’-四異丙基二胺基亞磷酸2-氰基乙酯(38.09 g，126 mmol，1.1當量)與乙腈(283 ml，5 vol)共沸，且與CH 2Cl 2(142 ml，2.5 vol)合併至 9s中。將所得混合物冷卻至-10℃且添加二異丙基銨鹽四氮唑(1.97 g，11.5 mmol，0.1當量)。使反應升溫至環境溫度且攪拌隔夜，得到 10s 溶液(假設理論100%產率，11.5 mmol，1當量)，直接用於 2’-OMe-G/A + G 偶合。 2’-OMe-G/A + G 偶合：
Figure 02_image133
將 6s(92.6 g，76.5 mmol，1當量，1 V，1 wt)與吡啶(460 ml及287 ml，5 V及3 vol)共沸，且接著用吡啶(185 ml，2 vol)稀釋且冷卻至-10℃。將吡啶三氟乙酸鹽(Py-TFA，29.56 g，153 mmol，2當量)與吡啶(185 ml×2，2 vol×2)共沸且用吡啶(140 ml，1.5 vol)稀釋。將 10s溶液(在0.28 L CH 2Cl 2中之反應混合物，假定淨重115 mmol，1.5當量)添加至 6s溶液中且用CH 2Cl 2(17 ml)沖洗。5分鐘後，在-10℃下添加Py-TFA溶液，且使混合物升溫至環境溫度。攪拌隔夜後，將混合物冷卻至0℃且添加TBHP (5-6 M之癸烷溶液，20.9 ml，0.11 mol，1.5當量)。使混合物升溫至環境溫度且攪拌4-5小時。將反應混合物用甲苯(930 ml，10 vol)稀釋，冷卻至0℃，且用10 wt%亞硫酸鈉水溶液(Na 2SO 3，60 g，48 mmol，0.62當量)淬滅。分離上層且放在一邊。用以下物質萃取底層：(1) 甲苯(185 ml，2 vol)及(2) CH 2Cl 2(280 ml，3 vol)。合併所有有機層且濃縮得到橙色油狀物，將其用CH 2Cl 2(930 ml，10 vol)稀釋且用10 wt% KHCO 3水溶液(150 g，150 mmol，2當量)洗滌。分離有機層且放在一邊。用CH 2Cl 2(185 ml，2 vol)萃取水層。合併所有有機層，用12 wt% NaCl水溶液(125 ml×2)洗滌，經硫酸鈉(Na 2SO 4，93 g，1 wt)乾燥隔夜，過濾且部分濃縮至大約0.8 L，且進行矽膠塞過濾(SiO 21 kg，用CH 2Cl 2/EtOH 2%至40%溶析)，得到作為部分損失及未部分損失2-氰基乙基(CE)基團之產物之混合物的 11s(黃色泡沫，113 g)。 整體脫除保護基 ：
Figure 02_image135
將 11s(56 g，36 mmol，1當量，1 wt，1 vol)與THF (500 ml×2，9 vol×2)共沸且再溶解在THF (250 ml，4.5 vol)中。在環境溫度下添加N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA；120 ml，2.1 vol，491 mmol，15當量)。5分鐘後，將混合物冷卻至-10℃且添加1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU；73 ml，1.3 vol，0.49 mol，15當量)。使混合物升溫且攪拌2小時。將混合物用正庚烷(500 ml，9 vol)稀釋且冷卻至-10℃。添加水(56 ml，1 vol)，且在劇烈攪拌下使所得雙相混合物升溫至環境溫度。藉由傾析移除上層。用正庚烷(500 ml，9 vol)重複濕磨/傾析循環。向底層添加28 wt%氫氧化銨(NH 4OH；112 ml，2 vol，1.66 mol，51當量)及40 wt%甲胺水溶液(MeNH 2；112 ml，2 vol，1.3 mol，40當量)。將所得混合物在環境溫度下攪拌隔夜。將混合物用IPA (500 ml，9 vol)稀釋且濃縮。與IPA (500 ml×4，9 vol×4)重複共沸且將所得油/固體懸浮在IPA (1 L，18 vol)中且過濾。將濕濾餅轉移回反應器/燒瓶中且在真空下乾燥，得到呈黃色固體狀之 粗製 12s(胺混合物之粗製鹽；38 g)。
來自29.8 g規模(17 mmol)之 11s整體脫除保護基的 12s 粗製鹽進行聚合物C18逆相管柱層析法(A：10 mM二甲基辛基碳酸氫銨(DMOAB)緩衝液，B：乙腈；梯度：0-50% B)，得到呈白色固體狀之 12ssDMOA鹽(13.0 g，12.4 mmol，73%產率)。 整體脫除保護基 - 分離粗製 12s 之替代方法：
Figure 02_image137
將 11s(400 g，220 mmol，1當量，1 wt，1 vol)與THF (2000 ml，5 vol)共沸，轉移至具有無水THF (總THF體積調整為4 vol)之12L反應器中，且冷卻至12℃。在添加N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA；645 ml，1.61 vol，2.64 mmol，12當量)同時維持內部溫度(T-內部) ≤ 18℃。將混合物冷卻至0℃，且添加1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU；395 ml，0.988 vol，2.64 mol，12當量)，同時維持內部溫度≤ 3℃。添加完成後，將混合物在0-5℃下攪拌1小時且冷卻至-5℃。將混合物用正庚烷(3200 ml，8 vol)稀釋且再冷卻至-3℃。添加水(300 ml，0.75 vol)，同時控制放熱(T-內部≤18℃)，得到雙相混合物。移除上層，且用庚烷/THF (2:1；2400 ml×2，6 vol×2)洗滌底層。向水性底層中添加28 wt%氫氧化銨(NH 4OH；600 ml，1.5 vol，8.9 mol，40當量)。攪拌隔夜後，添加40 wt%之甲胺水溶液(MeNH 2；600 ml，1.5 vol，6.9 mol，32當量)，且再繼續攪拌≥ 6小時。將混合物冷卻至-5℃且藉由逐滴添加乙酸(1000 ml，2.5 vol，15.5 mol，80當量)中和，同時維持T-內部低於15℃。添加完成後，將混合物用2-丙醇(6400 ml，16 vol)稀釋，且將由此形成之黃色懸浮液在3000 rpm下離心10分鐘。藉由傾析移除黃色上清液。底部之灰白色糊狀固體藉由利用以下重複濕磨、離心及傾析之循環來沖洗：(1) 2-丙醇/水(4:1，2000 ml，5 vol)及(2) 2-丙醇(2000 ml，5 vol)。最終濕固體在真空烘箱中在35℃下乾燥，得到呈灰白色固體狀之 粗製 12s(230.4 g，219 mmol，0.576 wt)。
1H-NMR (DMSO- d 6 , 300 MHz) δ (ppm) = 10.67 (bs, 2H), 8.42 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.23 (bs, 2H), 6.63 (bs, 2H), 6.56 (bs, 2H), 5.86 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 5.79 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 5.64 (d, J= 6.5 Hz, 1H), 4.80 (m, 2H), 4.63 (m, 1H), 4.49 (m, 1H), 4.34 (m, 1H), 4.16-4.28 (m, 3H), 3.75-4.05 (m, 7H), 3.21 (s, 3H), 2.82 (m, 6H), 2.60 (s, 18H), 1.50 (m, 6H), 1.12 (s, 30H), 0.75 (m, 9H)。 咪唑化物 (imidazolide) 偶合：
Figure 02_image139
將 15s(50.0 g，90.5 mmol)溶解在0.2 L Milli-Q水中且經由過濾漏斗過濾。將黃色濾液轉移至量瓶中，且將總體積用Milli-Q水調整至250 ml。將由此獲得之 15s儲備溶液(水中20% (w/v)，0.36 mmol/ml)儲存在冷凍機(5℃)中直至使用。
將 12ss(23.85 g，15.65 mmol，1 wt，1 vol，1當量)溶解在Milli-Q水(72 ml，3.0 vol)中。添加 15s儲備溶液(138 ml，5.8 vol，50 mmol，3.2當量)，且將混合物冷卻至5℃ (約pH 8)。逐滴添加1M HCl以將pH調節至5 (39 ml，1.6 vol，39 mmol，2.5當量)，且接著逐滴添加1 M FeCl 3(2.35 ml，0.1 vol，2.35 mmol，0.15當量)。逐滴添加1M HCl以將pH值調節為3 (40 ml，1.7 vol，40 mmol，2.6當量)，且使混合物升溫至20℃。6小時後，添加 15s儲備溶液(17.3 ml，0.73 vol，6.2 mmol，0.4當量)，且將混合物冷卻至0℃ (pH 4)。添加1 M HCl (5 ml，0.2 vol，5 mmol，0.3當量)以將pH值調節至3。攪拌隔夜後(19小時，pH 4，13℃)，用1 M HCl (5 ml，0.2 vol，5 mmol，0.3當量)重新調節pH至3。2小時後，經由過濾漏斗過濾混合物且用Milli-Q水沖洗，得到570 g黃色溶液，將其藉由切向流過濾(TFF)與陰離子交換層析法(AEX)之組合進行純化，得到呈銨(NH 4 +)鹽形式之水溶液的 16s(淨重12.2 g，0.51 wt，8.17 mmol，52%產率)。
可替代地，在3 L燒瓶中，將 12ss(57.00 g，37.4 mmol，1 wt，1 vol，1當量)溶解在Milli-Q水(171 ml，3.0 vol)中。在500 ml燒瓶中，將 15s(82.65 g，1.45 wt，150 mmol，4.0當量)溶解在Milli-Q水(256 ml，4.5 vol)中。將所得懸浮液經由20微米聚乙烯過濾漏斗過濾且將濾液添加至主反應器中。使用另外之Milli-Q水(28.5 ml，0.5 vol)進行完全沖洗、過濾及轉移。將合併之混合物冷卻至≤ 5℃ (約pH 8)，且藉由在3-5℃下逐滴添加1M HCl (112 ml + 18.7 ml + 9.4 ml = 140.1 ml，2.46 vol，140 mmol，3.75當量)將pH值調低至5。逐滴添加1 M FeCl 3(5.62 ml，0.1 vol，5.62 mmol，0.15當量)且藉由在3-5℃下逐滴添加1M HCl (74.8 ml + 18.7 ml + 8 ml = 101.5 ml，1.78 vol，102 mmol，2.71當量)將pH值調低至2-3。添加完成後，使混合物升溫至20℃。7小時後，將混合物冷卻至≤ 5℃，藉由逐滴添加1 M HCl (6.0 ml，0.11 vol，6 mmol，0.16當量)調節至pH 2，且接著升溫至20℃。攪拌隔夜後，將混合物經由20微米聚乙烯過濾漏斗過濾且用Milli-Q水(114 ml，2 vol)沖洗，得到0.95 kg黃色溶液，將其與自類似製程獲得之小規模 16s粗濾液(1.39 mmol規模；AE-405)合併。合併之粗製 16s(理論上相當於38.8 mmol)藉由切向流過濾(TFF；Sartorius Hydrosart ®2kDa)與陰離子交換層析法(AEX；TOSOH SuperQ，Cytiva ÄKTA™ pilot，NH 4Cl緩衝液)之組合進行純化，得到呈銨(NH 4 +)鹽形式之水溶液的 16s(淨重35.9 g，24.06 mmol，62%產率)。
1H-NMR (含10% v/v D 2O之DMSO- d 6, 300 MHz) δ (ppm) = 9.60 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.43 (br, 1H), 5.92 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 5.82 (s, 1H), 5.79 (m, 1H), 5.68 (d, J= 5.6 Hz, 1H),. 4.88 (m, 2H), 4.67 (m, 1H), 4.53-4.57 (m, 2H), 4.46 (m, 1H), 4.40 (m, 1H), 4.29-4.33 (m, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.85-4.15 (m, 10H), 3.24 (s, 3H)。 實例 2 ： 一鍋 三核苷酸組裝 (a)
Figure 02_image141
(b)
Figure 02_image143
(c)
Figure 02_image145
(d)
Figure 02_image147
下文未描述之步驟如實例1中所述進行。
Figure 02_image149
G- 亞磷醯化：
將 9s(325.2 g，659 mmol，1.6當量)與乙腈(1 L×2，5 vol×2)共沸且懸浮在CH 2Cl 2(400 ml，2 vol)中。將N,N,N’,N’-四異丙基二胺基亞磷酸2-氰基乙酯(220 g，730 mmol，1.77當量)與乙腈(1L)共沸，且與DCM (1 L)合併至 9s中。將所得混合物冷卻至低於-10℃且添加二異丙基銨鹽四氮唑(11.29 g，65.9 mmol，0.16當量)。使反應升溫至環境溫度且攪拌隔夜，得到 10s 溶液(假設理論100%產率，659 mmol，1.6當量)，直接用於 2’-OMe-G/A + G 偶合。 2’OMe-G + A 偶合：
將 5s(200 g，412 mmol，1當量，1 wt，1 vol)與吡啶(1 L×2, 5 vol×2)共沸且用吡啶(300 ml，1.5 vol)稀釋。將吡啶三氟乙酸鹽(「Py-TFA」，159 g，825 mmol，2.00當量)與吡啶(1 L×2，5 vol×2)共沸且再溶解在吡啶(800 ml，4 vol)中，得到 Py-TFA 溶液 -1。濃縮 4s(乙腈中之儲備溶液，0.449 mmol/g，1285 g，577 mmol，1.40當量)，與吡啶(1 L，5 vol)共沸以移除900 ml (4.5 vol)吡啶，且用吡啶(300 ml，1.5 vol)稀釋。將 5s轉移至12 L反應器中且用吡啶(100 ml×2，0.5 vol×2)沖洗。將 4s合併至 5s中且用吡啶(100 ml×2，0.5 vol×2)沖洗。將所得混合物冷卻至＜ -10℃，且添加 Py-TFA 溶液 1。使混合物升溫，在-3℃至2℃下攪拌2-3小時，且冷卻至＜ -5℃，得到 6s，直接進行 2’OMe-G/A + G 偶合。 2’OMe-G/A + G 偶合：
將吡啶三氟乙酸鹽(159 g，825 mmol，2.00當量)與吡啶(1 L×2，5 vol×2)共沸且再溶解在吡啶(1 L，5 vol)中，得到 Py-TFA 溶液 -2。將分開製備之 10s 溶液(659 mmol，1.6當量)添加至 6s中(用100 ml CH 2Cl 2，0.5 vol沖洗)，接著添加 Py-TFA 溶液 -2。將所得混合物在0-14℃下攪拌3-4小時，接著用TBHP (5-6 M之癸烷溶液，225 ml，3當量，1.2 mol)處理隔夜。將混合物倒入甲苯(4 L，20 vol)與10 wt%亞硫酸鈉水溶液(Na 2SO 3；1.04 kg，2.0當量)之預先冷卻(5℃)之雙相混合物中(200 ml CH 2Cl 2及500 ml甲苯用於沖洗及完全轉移)。將混合物用水(1 L，5 vol)稀釋且攪拌萃取。分離頂層且放在一邊。用CH 2Cl 2(2 L×2，10 vol×2)萃取底層。將所有有機層合併，濃縮且分配在10 wt%碳酸氫鉀水溶液(KHCO 3；1.65 kg，4.0當量)與CH 2Cl 2(6 L，30 vol)之間。分離有機層且放在一邊。用CH 2Cl 2(1 L，5 vol)萃取水層。合併所有有機層，用10 wt%氯化鈉(NaCl；1.20 kg，6 wt)洗滌，且允許相分離隔夜。收集有機層，濃縮，且與甲苯(4 L，20 vol)共沸。將由此獲得之粗混合物進行矽膠塞過濾(2 kg SiO 2×2，CH 2Cl 2/EtOH 0-40%)，得到作為部分損失及未部分損失2-氰基乙基(CE)基團之產物之混合物的 11s(黃色乾泡沫，782 g)。 實例 3 ：一鍋三核苷酸組裝之進一步最佳化
Figure 02_image151
Figure 02_image153
下文未描述之步驟如實例1及2中進行。 完全保護之三核苷酸 11s 之合成
Figure 02_image155
原材料之共沸乾燥
將 5s(300 g，1 wt，1 vol，618 mmol，1當量)與吡啶(1.5 L，5 vol)共沸以蒸餾出1.2 L吡啶。重複與吡啶(1.5 L，5 vol)共沸以蒸餾出1.45 L吡啶(剩餘0.35 L吡啶)。使該材料免受空氣及水分之影響。
將 3s(452 g，1.51 wt，741 mmol，1.2當量)與乙腈(1.5 L，5 vol)共沸以蒸餾出1.36 L乙腈。重複與乙腈(1. 5 L，5 Vol)共沸以蒸餾出1.4 L乙腈。使該材料免受空氣及水分之影響。
將 9s(427 g，1.42 wt，856 mmol，1.4當量)懸浮在乙腈(1.5 L，5 vol)中且共沸以蒸餾出1.3 L乙腈。重複與乙腈(1. 5 L，5 Vol)共沸以蒸餾出1.5 L乙腈。使該材料免受空氣及水分之影響。
將 (iPr 2N) 2P-OCE (224 g，0.75 wt，742 mmol，1.2當量)與乙腈(900 mL，3 vol)共沸以蒸餾出830 mL乙腈。重複與乙腈(900 vol)共沸以蒸餾出860 mL乙腈(剩餘0.1 L)。 →  (iPr 2N) 2P-OCE-1
將 (iPr 2N) 2P-OCE (279 g，0.93 wt，927 mmol，1.5當量)與乙腈(900 mL，3 vol)共沸以蒸餾出820 mL乙腈。重複與乙腈(900 vol)共沸以蒸餾出885 mL乙腈(剩餘0.1 L)。 →  (iPr 2N) 2P-OCE-2
將 Py-TFA(239 g，0.80 wt，1.24 mol，2.0當量)與吡啶(1.2 L，4 vol)共沸以蒸餾出1.1 L吡啶。重複與吡啶(1.2 L，4 vol)共沸以蒸餾出1.2 L吡啶(剩下100 mL)。使該材料免受空氣及水分之影響。 → Py-TFA-1
將 Py-TFA(239 g，0.80 wt，1.24 mol，2.0當量)與吡啶(1.2 L，4 vol)共沸以蒸餾出1.1 L吡啶。重複與吡啶(1.2 L，4 vol)共沸以蒸餾出1.22 L吡啶(剩下80 mL)。使該材料免受空氣及水分之影響。 → Py-TFA-2 合成 10s
將先前共沸之 3s用DCM (1.5 L，5 vol)稀釋。藉由用DCM (900 mL，3 vol)稀釋添加先前共沸之 (iPr 2N) 2P-OCE-1 (1.2當量)。將所得混合物冷卻至-10℃且用ETT (96.5 g，0.32 wt，741 mmol，1.2當量)處理。移除冷卻浴，且使混合物升溫至環境溫度。攪拌隔夜後，將反應混合物用己烷(1.2 L，4 vol)稀釋，攪拌10分鐘，且過濾以移除不溶性固體(收集到110.2 g白色固體)。將反應器及濾餅用DCM-己烷2:1 (v/v) (900 mL，3 vol)沖洗且濃縮收集之濾液，得到粗製 4s(814.71 g；理論產率：600 g)。 二核苷酸偶合 - 6s 之合成
藉由用吡啶(1.2 L，4 vol)稀釋將 4s轉移至12 L反應器中。先前共沸之 5s(300 g，618 mmol，1當量)藉由用吡啶(900 mL，3 vol)稀釋合併至粗製 4s中，且將所得混合物冷卻至-10℃。將先前共沸之 Py-TFA-1用吡啶(1.2 L，4 vol)稀釋且添加至反應器中(添加後：-4.9℃)。一旦T-內部降至≤ -10℃ (10分鐘)，則移除冷卻浴，且使混合物升溫。在1小時(6.8℃)及2小時(16.2℃)時間點取IPC樣品且進行分析，以監測 5s之消耗及 6s之形成。 一鍋三核苷酸偶合 - 11s 之合成
將反應冷卻至-2.3℃且添加 10s溶液(添加後：7.5℃)。T-內部降至3℃後，將先前共沸之 Py-TFA-2用吡啶(1.2 L，4 vol)稀釋且添加至反應器中(添加後：5.4℃；25分鐘：0.6℃)。使混合物升溫。在5小時時間點(18℃)取IPC樣品以監測 6s之消耗及 11s-P(III) 2 之形成。將混合物冷卻至-1.4℃且在0.3小時內添加TBHP (314 mL，1.05 vol，1.7 mol，3當量) (添加後：1.3℃)。移除冷卻浴，且使混合物升溫至環境溫度以進行隔夜反應(添加TBHP後14小時)。 處理
在攪拌下將偶合反應混合物添加至甲苯(6.0 L，20 vol)與10 wt% Na 2SO 3水溶液(776 g，2.6 wt，615 mmol，1當量)之預先冷卻(0℃)之混合物中。添加水(3.0 L，10 vol)，且繼續攪拌10分鐘。使混合物進行相分離(3層)且收集底部之兩層(7.5 L) (Aq-1)。分離頂層且放在一邊(Org-1)。將水層(Aq-1)用DCM (4.0 L，13 vol)反萃取以分離有機層(Org-2)及水層(Aq-2；無產物)。將Org-1及Org-2合併，濃縮且在DCM (4.5 L，15 vol)中復原。用5 wt% NaCl水溶液(3.0 kg，10 wt，2.5 mol，4當量)洗滌混合物且濃縮，得到呈濃稠橙色糖漿狀之粗製 11s(1753 g)。 磷酸酯脫除部分保護基
Figure 02_image157
將 11s(1753 g；假定淨重1122 g，617 mmol，1當量)溶解在乙腈(2.24 L，2 vol)中，且在環境溫度下用第三丁胺(1.12 L，1 vol，10.7 mol，17當量)處理。反應似乎在15分鐘內完成。將MTBE (16.8 L，15 vol)裝入20 L反應器中且冷卻。在攪拌下將反應混合物添加至預冷卻之MTBE中(開始：7.8℃；結束：11℃)。將所得淡黃色懸浮液在3℃下攪拌1小時且經由過濾漏斗過濾。藉由蠕動泵移除上清液，且將過濾器上之濕固體離心。將填充之固體與MTBE (5.6 L，5 vol)一起濕磨，再次離心，且在真空烘箱(20℃)中乾燥3天，得到呈灰白色固體狀之 11s-1(1221.7 g)。 逐步整體脫除保護基
Figure 02_image159
將 11s-1(405 g，1 wt，1 vol，219 mmol，1當量)溶解在THF (1.62 L，4 vol)中，且冷卻至低於0℃。添加BSA (867 mL，2.14 vol，3.55 mol，16.2當量)，同時維持T-內部低於0℃ (在15分鐘內)。使混合物在1小時內升溫至15℃，且接著冷卻至低於0℃。逐滴添加DBU (531 mL，1.31 vol，3.55 mol，16.2當量)，同時維持T-內部低於0℃。完成添加後，使混合物升溫。IPC分析(1小時，T-內部 = 12℃)顯示經取代之氰基乙基完全裂解。再過0.5小時後，將混合物(T-內部 = 17℃)冷卻至低於0℃且用正庚烷(3.24 L，8 vol)稀釋。
在攪拌下，添加水(304 mL，0.75 vol)，同時維持T-內部低於10℃。繼續攪拌，且將混合物升溫(18℃)。停止攪拌，且使混合物相分離。移除上層溶液，且用正庚烷-THF 2:1 (v/v) (2.43 L×2，6 vol×2)將 11s-2之濃稠水性混合物洗滌兩次。
添加NH 4OH (677 mL，1.67 vol，10 mol，46當量)，且將所得混合物在環境溫度下攪拌隔夜(16小時)。添加40%甲胺(339 mL，0.84 vol，3.9 mol，18當量)，且繼續攪拌。每1-2小時取IPC樣品以監測反應進展。8小時後(所需產物：單-iBu = 93:7)，將混合物冷卻至低於0℃且藉由逐滴添加AcOH (1.065 L，2.63 vol，18.6 mol，85當量)進行中和，同時維持T-內部低於8℃。
在T-內部降至低於0℃後，添加IPA (6.48 L，16 vol)以形成淡黃色懸浮液。將混合物轉移至15 x離心瓶中且進行離心(3000 rpm，4℃，10分鐘)。移除上清液，且將濕固體在冷凍機(5℃)中儲存隔夜。使用(1) 70% EtOH-水及(2) EtOH重複濕磨-離心-傾析循環，藉此，將固體合併至更少之瓶子中。將4瓶中之濕固體在真空烘箱中在22℃下乾燥隔夜。將固體合併至1瓶(239 g固體)中，且在真空烘箱中在20℃下進一步乾燥2天，得到呈灰白色固體狀之 12s-1(184.2 g)。 Na + 鹽之形成、逆相純化及鹽交換
Figure 02_image161
將 12s-1(368.4 g，1 wt，1 vol，350 mmol，1當量；來自兩批)懸浮在水(1.11 L，3 vol)中，進行音波處理，且轉移至12-L RB燒瓶中。水(368 mL，1 vol)用於完全沖洗及轉移。在攪拌(160 rpm)下添加3M NaOAc水溶液(0.70 L，1.9 vol，2.1 mol，6當量)。混合物保持均勻。添加無水乙醇(6.63 L，18 vol)。IPC分析顯示黃色上清液中無產物。藉由布氏玻璃漏斗(Buchner glass funnel)過濾混合物以收集灰白色沈澱。將濕濾餅用(1) EtOH-H 2O 7:3 (v/v) (2.21 L，6 vol)及(2)無水EtOH (1.47 L，4 vol)沖洗且在真空烘箱中在22℃下乾燥3天，得到呈灰白色固體狀之 12s-2(341 g，0.92 wt，299 mmol，85%產率)。
使用2×800 g堆疊之PuriFlash管柱、Atoll X 40µ 800G聚合物管柱(CV=2243 mL；使用16 CV，總溶劑36 L)藉由逆相層析法純化75 g 12s-2。將粗製 12s-2Na +鹽溶解在1.0 L水及1.0 L 400 mM二甲基辛基碳酸氫銨(DMOAB)緩衝溶液中。將所得混合物陳化以允許完全溶解。將溶液過濾且裝載至2×800 g堆疊之PuriFlash管柱、Atoll X 40µ 800G聚合物管柱上。 移動相 A ： 10 mM DMOAB溶液(藉由在5.0 L水中混合125 mL之400 mM DMOAB儲備溶液製備)， 移動相 B ：乙腈。使用移動相A (DMOAB緩衝液)將溶液裝載至管柱上。將管柱用0-25% B溶析，流速為200 mL/min。收集主峰溶析份(各約500 mL)且藉由UPLC/LCMS進行分析。匯集適當溶析份且真空濃縮以移除乙腈。將混合物分成兩半(約300 mL)裝入2×500 mL瓶中，且凍乾24-48小時，得到呈白色固體狀之 12s-3 DMOA 鹽(39.3 g，質量回收率為52%，純度為95.6%)。 合成 16s
Figure 02_image163
將 12s-3 DMOA 鹽(33.8 wt% DMOA，96.8%純；102.01 g，60 mmol)及水(0.30 kg)裝入2L玻璃夾套反應器中。將混合物在24-26℃下攪拌以完全溶解，且接著冷卻至4℃。在另一容器中，將 Im(m 7GDP)Na* ( 15s；155.07 g)溶解在水(0.40 kg)中且添加至反應器中。額外水(0.10 kg×2)用於完全沖洗及轉移。將混合物冷卻至-1℃ (pH 7)。逐滴添加1N HCl (水溶液；300 ml，300 mmol)以調整至pH 5.0 (目標1 ± 2℃)。在0℃下逐滴添加1M FeCl 3(水溶液；13 mL，13 mmol)。逐滴添加1N HCl (水溶液；50 ml，50 mmol)以調整至pH 4.0 (目標1 ± 2℃)。將混合物升溫至20℃且攪拌16小時(藉由HPLC，轉化率為95%)。將混合物冷卻(目標1 ± 2℃)且用5 wt% NH 4OH (12 mL)調整至pH 5.3。自反應器中收集混合物，精製過濾，且藉由陰離子交換層析法(NH 4Cl緩衝液)與切向流過濾(TFF)之組合進行純化，得到呈20 mM銨(NH 4 +)鹽形式之水溶液的 16s(1.97 kg；淨55.5 g 16s游離磷酸鹽，62%調整產率)。*Im(m 7GDP)Na：P 2-咪唑化物7-甲基鳥苷5’-二磷酸酯單鈉鹽(CAS 531553-69-2)。 三核苷酸 Na + 鹽 12s-2 替代製備及分離
製備及分離 1 ：在溫和加熱(45℃浴)下將三核苷酸DMOA鹽 12s-3(凍乾固體；3.00 g)懸浮在6 mL水中。添加3M NaOAc水溶液(6 ml)，且將所得混合物加熱至45℃以完全溶解。在加熱/攪拌下添加無水EtOH (30 ml)。完全添加後，將混合物在45℃下攪拌3分鐘，接著冷卻至17℃。過濾收集灰白色沈澱，用(1) EtOH-水7:3 (v/v) 30 ml及(2) EtOH (24 mL)沖洗，且真空/空氣乾燥20分鐘，接著在真空烘箱(40℃)中乾燥1小時，得到呈白色固體狀之 12s-2(2.397 g)。
製備及分離 2 ：將三核苷酸DMOA鹽 12s-3(凍乾固體；27.4 g)溶解在123 ml水(4.5 vol)中。完全溶解後，添加36 ml 3M NaOAc (6當量)。混合物保持均勻。將所得混合物經由20 um PE過濾器過濾且在600 rpm攪拌下添加至384 ml無水EtOH (14 vol)中。41 ml水(1.5 vol)用於完全沖洗及過濾。在環境溫度下攪拌1小時後，將混合物經由20微米PE過濾漏斗過濾以收集白色沈澱，用以下物質沖洗：(1) 82 ml 70% EtOH (3 vol)；(2) 82 ml 70% EtOH (3 vol)；(3) 82 ml EtOH (3 vol)；及(4) 82 ml EtOH (3 vol)，在N 2/真空下乾燥30分鐘，且轉移至琥珀色玻璃罐中。在35℃之真空烘箱中乾燥隔夜，得到呈白色固體狀之 12s-2(21.52 g)。
製備及分離 3 ：將三核苷酸Na +鹽 12s-2(2372 g；假定估計淨重25 g，自 12s-1之AEX及TFF純化獲得)之水溶液濃縮至211 g，經由過濾漏斗(20微米PE玻璃料)過濾，且在環境溫度下添加至250 ml 2-丙醇中以形成白色漿液。39 ml水用於完全沖洗、過濾及轉移。將混合物用額外250 ml 2-丙醇稀釋，且過濾收集白色沈澱，用(1) 100 ml 2-丙醇及(2) 150 ml EtOH沖洗，且在真空烘箱中乾燥隔夜(30℃)。將由此獲得之19.974 g白色固體用刮刀粉碎成細粉，且在30℃之真空烘箱中進一步乾燥。獲得呈白色固體狀之 12s-2(19.045 g)。
製備及分離 4 ：將三核苷酸Na +鹽 12s-2(2340 g；假定淨重25 g，自 12s-1之AEX及TFF純化獲得)之水溶液濃縮至0.5 L，且經由過濾漏斗(20微米PE玻璃料)過濾。將收集之濾液進一步濃縮至150 g，且在700 ml離心瓶中用350 ml 2-丙醇稀釋。50 ml水用於完全沖洗及轉移。先後用150 ml 70% EtOH及150 mL EtOH對所得白色漿液進行離心-傾析-濕磨循環(3000 rpm，10分鐘，4℃)。將由此獲得之濕白色固體在真空烘箱中在35℃下乾燥3天，得到呈白色固體狀之 12s-2(16.88 g)。 三核苷酸 12s Li + 鹽之製備
將粗製三核苷酸 12s-1(1 g，1 vol)溶解在2 ml水(2 vol)中且在室溫下用8 M LiCl (1 ml)處理。3分鐘後，添加80% EtOH (v/v)，且過濾收集由此形成之灰白色沈澱，用(1) 80% EtOH (8 ml)及(2)無水EtOH (8 ml)沖洗，且接著乾燥，得到呈灰白色固體狀之三核苷酸 12s Li + 鹽(840 mg)。 三核苷酸 12s K + 鹽之製備
將三核苷酸DMOA鹽 12s-3(42.38 g，27.8 mmol，1當量)溶解在水(127 mL，3 Vol)中。在環境溫度下添加3M KOAc (46.4 mL，139 mmol，5當量)，加熱至45℃，接著冷卻。添加無水EtOH (0.51 L，12 vol)，且將由此形成之白色懸浮液轉移至2 L燒瓶中。水(85 mL，2 vol)及無水EtOH (0.51 L，12 Vol)用於完全轉移及稀釋。第二天，將白色懸浮液轉移至2×700 ml離心瓶中，且先後利用70% EtOH (0.5 L/瓶)及無水EtOH (0.5 L/瓶)進行離心-傾析-濕磨循環(3000 rpm，10分鐘，4℃)。將由此獲得之白色濕濾餅在真空烘箱(20℃)中乾燥3天，得到 12s K + 鹽(27.3 g)。 以引用之方式併入
本申請案涉及各種已發布之專利、公開之專利申請案、科學期刊文章及其他出版物，所有均以引用之方式併入本文中。本文闡述本發明之一或多個實施例之細節。本發明之其他特徵、目標及優勢將自詳細描述、圖式、實例及申請專利範圍顯而易知。 等效物及範疇
除非相反指示或另外自上下文顯而易見，否則諸如「一個(種)」及「該(等)」之冠詞可意謂一個(種)或超過一個(種)。除非相反指示或另外自上下文顯而易見，否則在一組之一或多個成員之間包括「或」之實施例或描述在該等組成員中之一者、超過一者或全部存在於、用於既定產物或過程中或以其他方式與既定產物或過程相關時被視為滿足條件的。本發明包括恰好一個組成員存在於、用於既定產物或過程中或以其他方式與既定產物或過程相關的實施例。本發明包括組成員中超過一個或全部存在於、用於給定產物或過程中或以其他方式與給定產物或過程相關的實施例。
此外，本揭示案涵蓋將來自一或多個所列請求項之一或多個限制、要素、條款及描述性術語引入另一請求項中的所有變體、組合及排列。例如，可修改附屬於另一請求項之任何請求項以包括在附屬於相同基本請求項之任何其他請求項中發現之一或多個限制。在要素呈清單呈現之情況下，例如，以馬庫什組(Markush group)格式，亦揭示要素之各子組，且可自該組中刪除任何要素。應當理解，一般而言，在本發明或本發明之態樣稱為包含特定要素及/或特徵之情況下，本揭示案之某些實施例或本揭示案之態樣由或基本上由此類要素及/或特徵組成。為簡單起見，彼等實施例未在本文中以同樣的話具體闡述。亦應注意，術語「包含」及「含有」意欲為開放性的且允許包括額外要素或步驟。在給出範圍之情況下，包括終點。此外，除非另外指示或自上下文及熟習此項技術者之理解中顯而易見，否則在本發明之不同實施例中，表示為範圍之值可採用所述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另外明確指出，否則直至該範圍之下限之十分位。
本申請案涉及各種已發布之專利、公開之專利申請案、科學期刊文章及其他出版物，所有均以引用之方式併入本文中。若任何併入之參考文獻與本說明書之間存在衝突，則以說明書為準。另外，屬先前技術之本發明之任何特定實施例均可明確地自實施例之任一或多項排除。由於此類實施例被認為係熟習此項技術者所知的，故可將其排除在外，即使本文中未明確陳述該排除。本發明之任何特定實施例可出於任何原因自任何實施例中排除，無論是否與先前技術之存在相關。
熟習此項技術者將認識到，或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所述之特定實施例之多種等效物。本文所述之實施例之範疇不欲限於以上描述，而是如隨附申請專利範圍中所述。熟習此項技術者將理解，在不背離本發明之如以下申請專利範圍所限定之精神或範疇之情況下，可對此描述進行各種改變及修改。 實施例
本揭示案之實施例包括： 實施例1.   一種用於合成三核苷酸之方法，其包括： a) 使式(4)化合物或其鹽與式(5)化合物或其鹽反應：
Figure 02_image003
(4)及
Figure 02_image005
(5)， 其中R 1及R 2各自獨立地為氮保護基；且 R 3、R a、R b及R c各獨立地為氧保護基； 以獲得式(6)化合物：
Figure 02_image007
(6)； 或其鹽； 其中Y為O或不存在； b) 使該式(6)化合物與式(10)化合物或其鹽反應：
Figure 02_image009
(10)， 其中R 4為氮保護基；且 R 5、R 6及R d各獨立地為氧保護基； 以獲得式(11)化合物：
Figure 02_image001
(11)； 或其鹽。 實施例2.   實施例1之方法，其中步驟a)及/或步驟b)進一步包括添加酸活化劑。 實施例3.   實施例2之方法，其中該酸活化劑為弱酸。 實施例4.   實施例2或3之方法，其中該酸活化劑係選自由以下組成之群：吡啶三氟乙酸鹽、1H-四唑、二異丙基銨鹽四氮唑、5-(乙硫基)-1H-四唑及4,5-二氰基咪唑。 實施例5.   實施例4之方法，其中該活化劑為吡啶三氟乙酸鹽。 實施例6.   實施例1至5中任一項之方法，其中步驟a)在選自由以下組成之群的溶劑存在下進行：吡啶、乙腈、二氯甲烷、四氫呋喃及二甲基甲醯胺。 實施例7.   實施例6之方法，其中該溶劑為吡啶。 實施例8.   實施例1至7中任一項之方法，其中步驟a)包含大約2-3小時之反應時間。 實施例9.   實施例1至8中任一項之方法，其中步驟a)包含大約1:1.4的該式(5)化合物與該式(4)化合物之比率。 實施例10. 實施例2至9中任一項之方法，其中步驟a)包含大約1:2的該式(5)化合物與該酸活化劑之比率。 實施例11. 實施例2至10中任一項之方法，其中在添加該酸活化劑之前步驟a)包含大約-10℃之溫度。 實施例12. 實施例2至11中任一項之方法，其中在添加該酸活化劑之後步驟a)包含大約-3℃至大約5℃之溫度。 實施例13. 實施例1至12中任一項之方法，其中步驟a)不包含氧化劑，且其中該式(6)化合物為式(6-a)化合物：
Figure 02_image028
(6-a)。 實施例14. 實施例13之方法，其中在步驟b)之前不分離該式(6-a)化合物。 實施例15. 實施例1至12中任一項之方法，其中步驟a)包含氧化劑，且其中該式(6)化合物為式(6-b)化合物：
Figure 02_image034
(6-b)。 實施例16. 實施例15之方法，其中在步驟b)之前分離該式(6-b)化合物。 實施例17. 實施例13或14之方法，其中步驟b)包括： b.1) 使該式(6-a)化合物及該式(10)化合物反應以獲得式(11-a)化合物：
Figure 02_image030
(11-a)；及 b.2) 將該式(11-a)化合物氧化以獲得該式(11)化合物。 實施例18. 實施例17之方法，其中步驟b.1)包含大約3小時至大約4小時之反應時間。 實施例19. 實施例17至18中任一項之方法，其中步驟b.1)包含大約1:1.6的該式(6-a)化合物與該式(10)化合物之比率。 實施例20. 實施例17至19中任一項之方法，其中步驟b.1)包含大約1:2的該式(6-a)化合物與該酸活化劑之比率。 實施例21. 實施例17至20中任一項之方法，其中步驟b.1)包含大約0℃至大約14℃之溫度。 實施例22. 實施例17之方法，其中步驟b.2)包含選自由以下組成之群的氧化劑：氫過氧化物、過氧酸、過氧化二醯基、過氧化二烷基、過氧化氫、氧氣、過硫酸氫鉀複合鹽(oxone)、碘及臭氧。 實施例23. 實施例22之方法，其中該氧化劑為氫過氧化第三丁基。 實施例24. 實施例17至23中任一項之方法，其中步驟b.2)包含大約12-24小時之反應時間。 實施例25. 實施例22至24中任一項之方法，其中步驟b.2)包含大約1:3的該式(6-a)化合物與該氧化劑之比率。 實施例26. 實施例15至16中任一項之方法，其中步驟b)包括使該式(6-b)化合物及該式(10)化合物反應以獲得式(11)化合物。 實施例27. 實施例1至26中任一項之方法，其進一步包括： c) 將該式(11)化合物脫除保護基以形成式(12)化合物：
Figure 02_image173
(12)， 其中X不存在、為H、Na或DMOA； 或其鹽。 實施例28. 實施例27之方法，其中步驟c)包括： c.1) 將該式(11)化合物之磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-a)化合物：
Figure 02_image038
(12-a)， 或其鹽；及 c.2) 將該式(12-a)化合物整體脫除保護基以獲得該式(12)化合物或其鹽。 實施例29. 實施例28之方法，其中步驟c.1)在N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)存在下進行。 實施例30. 實施例28或29之方法，其中步驟c.2)在氫氧化銨及甲胺存在下進行。 實施例31. 實施例27之方法，其中步驟c)包括： c.1) 將該式(11)化合物之磷酸酯部分脫除部分保護基以獲得式(12-b)化合物：
Figure 02_image040
(12-b)， 或其鹽； c.2) 將該式(12-b)化合物之剩餘磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-a)化合物：
Figure 02_image038
(12-a)， 或其鹽；及 c.3) 將該式(12-a)化合物整體脫除保護基以獲得該式(12)化合物或其鹽。 實施例32. 實施例31之方法，其中步驟c.1)在 t-BuNH 2存在下進行。 實施例33. 實施例31或32之方法，其中步驟c.2)在N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)存在下進行。 實施例34. 實施例31至33中任一項之方法，其中步驟c.3)在氫氧化銨及甲胺存在下進行。 實施例35. 實施例27至34中任一項之方法，其進一步包括： d) 使該式(12)化合物與式(15)化合物反應：
Figure 02_image047
(15) 以獲得式(16)化合物：
Figure 02_image051
(16)， 或其鹽； 其中Y之每種情況獨立地為NH 4或不存在。 實施例36. 實施例35之方法，其進一步包括在使該式(12)化合物與該式(15)化合物反應之前： i) 將X為H之式(12)化合物轉變成X為Na、K或Li之式(12)化合物；及 ii) 將X為Na、K或Li之該式(12)化合物轉變成X為DMOA之式(12)化合物。 實施例37. 實施例36之方法，其中X為DMOA之該式(12)化合物用於與該式(15)化合物反應以獲得式(16)化合物。 實施例38. 實施例35之方法，其中步驟d)包括金屬鹽介導的該式(12)化合物與該式(15)化合物之偶合。 實施例39. 實施例35或38之方法，其中步驟d)在HCl及金屬鹽存在下進行。 實施例40. 實施例35至39中任一項之方法，其中該式(16)化合物藉由切向流過濾(TFF)純化。 實施例41. 實施例40之方法，其中該式(16)化合物藉由陰離子交換層析法(AEX)進一步純化。 實施例42. 實施例1至41中任一項之方法，其中該式(4)化合物藉由以下形成： e) 式(3)化合物之亞磷醯化：
Figure 02_image053
(3)， 其中R 1為氮保護基；且 R a及R b各獨立地為氧保護基； 以獲得該式(4)化合物。 實施例43. 實施例42之方法，其中步驟e)在N,N,N’,N’-四異丙基二胺基亞磷酸2-氰基乙酯及5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)存在下進行。 實施例44. 實施例42之方法，其中該式(4)化合物在與該式(5)化合物反應之前未純化或處理。 實施例45. 實施例42或43之方法，其中該式(3)化合物藉由以下形成： f) 使式(1)化合物與式(2)化合物反應：
Figure 02_image057
(1)及
Figure 02_image059
(2) 其中R 1為氮保護基；且 R a及R b各獨立地為氧保護基； 以獲得該式(3)化合物。 實施例46. 實施例45之方法，其中步驟f)包括： f.1) 使該式(1)化合物與該式(2)化合物在酸活化劑存在下反應；及 f.2) 將步驟f.1)之產物氧化。 實施例47. 實施例1至46中任一項之方法，其中R a、R b、R c及R d各自獨立地具有下式：
Figure 02_image065
其中R x及R y各自獨立地為H、視情況經取代之環狀或非環狀烷基、視情況經取代之環狀或非環狀雜烷基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；或其中R x及R y組合形成3-6員環。 實施例48. 實施例47之方法，其中R x及R y各自獨立地為H或C 1-C 6烷基，或其中R x及R y組合形成3-6員碳環。 實施例49. 實施例1至48中任一項之方法，其中R a及R b具有下式：
Figure 02_image067
。 實施例50. 實施例1至49中任一項之方法，其中R c具有下式：
Figure 02_image069
。 實施例51. 實施例1至50中任一項之方法，其中R d具有下式：
Figure 02_image069
。 實施例52. 實施例45之方法，其中該式(1)化合物具有以下結構：
Figure 02_image061
； 或其鹽。 實施例53. 實施例45之方法，其中該式(2)化合物具有以下結構：
Figure 02_image063
； 或其鹽。 實施例54. 實施例42至53中任一項之方法，其中該式(3)化合物具有以下結構：
Figure 02_image055
； 或其鹽。 實施例55. 實施例1至54中任一項之方法，其中該式(4)化合物具有以下結構：
Figure 02_image017
； 或其鹽。 實施例56. 實施例1至55中任一項之方法，其中該式(5)化合物具有以下結構：
Figure 02_image019
； 或其鹽。 實施例57. 實施例1至56中任一項之方法，其中該式(6)化合物具有以下結構：
Figure 02_image022
； 或其鹽。 實施例58. 實施例1至57中任一項之方法，其中該式(6)化合物具有以下結構：
Figure 02_image089
； 或其鹽。 實施例59. 實施例1至58中任一項之方法，其中該式(10)化合物具有以下結構：
Figure 02_image024
； 或其鹽。 實施例60. 實施例1至59中任一項之方法，其中該式(11)化合物具有以下結構：
Figure 02_image093
； 或其鹽。 實施例61. 實施例17至25中任一項之方法，其中該式(11-a)化合物具有以下結構：
Figure 02_image032
； 或其鹽。 實施例62. 實施例31之方法，其中該式(12-a)化合物具有以下結構：
Figure 02_image196
， 或其鹽。 實施例63. 實施例31之方法，其中該式(12-b)化合物具有以下結構：
Figure 02_image045
， 或其鹽。 實施例64. 一種用於合成三核苷酸之方法，其包括： a) 使式(4)化合物與式(5)化合物在吡啶三氟乙酸鹽及吡啶存在下反應：
Figure 02_image017
及
Figure 02_image019
， 以獲得式(6)化合物：
Figure 02_image089
； b.1) 使該式(6)化合物與式(10)化合物在吡啶三氟乙酸鹽及吡啶存在下反應：
Figure 02_image024
， 以獲得式(11-a)化合物：
Figure 02_image032
；及 b.2) 使該式(11-a)化合物與氫過氧化第三丁基反應以獲得式(11)化合物：
Figure 02_image093
。 實施例65. 實施例64之方法，其進一步包括： c.1) 在 t-BuNH 2存在下將該式(11)化合物之磷酸酯部分脫除部分保護基以獲得式(12-b)化合物：
Figure 02_image045
； c.2) 在N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)存在下將該式(12-b)化合物之剩餘磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-a)化合物：
Figure 02_image206
；及 c.3) 在氫氧化銨及甲胺存在下將該式(12-a)化合物整體脫除保護基以獲得該式(12)化合物：
Figure 02_image208
， 其中X為DMOA。 實施例66. 實施例65之方法，其進一步包括： d) 使該式(12)化合物與式(15)化合物在HCl及金屬鹽存在下反應：
Figure 02_image047
以獲得式(16)化合物：
Figure 02_image051
， 其中Y之每種情況獨立地為NH 4或不存在。 實施例67. 實施例64至66中任一項之方法，其中該式(4)化合物藉由以下形成： e) 在N,N,N’,N’-四異丙基二胺基亞磷酸2-氰基乙酯及5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)存在下進行式(3)化合物之亞磷醯化：
Figure 02_image055
以獲得該式(4)化合物。 實施例68. 實施例67之方法，其中該式(3)化合物藉由以下形成： f.1) 在吡啶三氟乙酸鹽及吡啶存在下使式(1)化合物與式(2)化合物反應：
Figure 02_image061
及
Figure 02_image063
；及 f.2) 在氫過氧化第三丁基存在下將步驟(f.1)之產物氧化以獲得該式(3)化合物。 實施例69. 一種式(1)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image061
； 或其鹽。 實施例70. 一種式(2)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image063
； 或其鹽。 實施例71. 一種式(3)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image055
； 或其鹽。 實施例72. 一種式(4)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image017
； 或其鹽。 實施例73. 一種式(5)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image019
； 或其鹽。 實施例74. 一種式(6)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image089
； 或其鹽。 實施例75. 一種式(7)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image081
； 或其鹽。 實施例76. 一種式(8)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image079
； 或其鹽。 實施例77. 一種式(9)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image077
； 或其鹽。 實施例78. 一種式(10)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image024
； 或其鹽。 實施例79. 一種式(11)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image093
； 或其鹽。 實施例80. 一種式(11-a)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image032
； 或其鹽。 實施例81. 一種式(12-a)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image224
， 或其鹽。 實施例82. 一種式(12-b)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image045
， 或其鹽。 實施例83. 一種式(15)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image047
； 或其鹽。 實施例84. 一種式(16)化合物，其具有以下結構：
Figure 02_image051
， 其中Y之每種情況獨立地為NH 4或不存在； 或其鹽。
圖 1提供關於三核苷酸組裝逐步法之合成方案。
圖 2提供關於三核苷酸組裝一鍋法之合成方案。
圖 3提供關於三核苷酸組裝一鍋法之替代合成方案。
Figure 111112239-A0101-11-0002-1

Claims (85)

  1. 一種用於合成三核苷酸之方法，其包括： a) 使式(4)化合物或其鹽與式(5)化合物或其鹽反應：
    Figure 03_image003
    (4)及
    Figure 03_image005
    (5)， 其中R 1及R 2各自獨立地為氮保護基；且 R 3、R a、R b及R c各獨立地為氧保護基； 以獲得式(6)化合物：
    Figure 03_image007
    (6)； 或其鹽； 其中Y為O或不存在； b) 使該式(6)化合物與式(10)化合物或其鹽反應：
    Figure 03_image009
    (10)， 其中R 4為氮保護基；且 R 5、R 6及R d各獨立地為氧保護基； 以獲得式(11)化合物：
    Figure 03_image001
    (11)； 或其鹽。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟a)及/或步驟b)進一步包括添加酸活化劑。
  3. 如請求項2之方法，其中該酸活化劑為弱酸。
  4. 如請求項2之方法，其中該酸活化劑係選自由以下組成之群：吡啶三氟乙酸鹽、1H-四唑、二異丙基銨鹽四氮唑、5-(乙硫基)-1H-四唑及4,5-二氰基咪唑。
  5. 如請求項4之方法，其中該活化劑為吡啶三氟乙酸鹽。
  6. 如請求項1之方法，其中步驟a)在選自由以下組成之群的溶劑存在下進行：吡啶、乙腈、二氯甲烷、四氫呋喃及二甲基甲醯胺。
  7. 如請求項6之方法，其中該溶劑為吡啶。
  8. 如請求項1之方法，其中步驟a)包含大約2-3小時之反應時間。
  9. 如請求項1之方法，其中步驟a)包含大約1:1.4的該式(5)化合物與該式(4)化合物之比率。
  10. 如請求項2之方法，其中步驟a)包含大約1:2的該式(5)化合物與該酸活化劑之比率。
  11. 如請求項2之方法，其中在添加該酸活化劑之前步驟a)包含大約-10℃之溫度。
  12. 如請求項2之方法，其中在添加該酸活化劑之後步驟a)包含大約-3℃至大約5℃之溫度。
  13. 如請求項1之方法，其中步驟a)不包含氧化劑，且其中該式(6)化合物為式(6-a)化合物：
    Figure 03_image028
    (6-a)。
  14. 如請求項13之方法，其中在步驟b)之前不分離該式(6-a)化合物。
  15. 如請求項1之方法，其中步驟a)包含氧化劑，且其中該式(6)化合物為式(6-b)化合物：
    Figure 03_image034
    (6-b)。
  16. 如請求項15之方法，其中在步驟b)之前分離該式(6-b)化合物。
  17. 如請求項13之方法，其中步驟b)包括： b.1) 使該式(6-a)化合物及該式(10)化合物反應以獲得式(11-a)化合物：
    Figure 03_image030
    (11-a)；及 b.2) 將該式(11-a)化合物氧化以獲得該式(11)化合物。
  18. 如請求項17之方法，其中步驟b.1)包含大約3小時至大約4小時之反應時間。
  19. 如請求項17之方法，其中步驟b.1)包含大約1:1.6的該式(6-a)化合物與該式(10)化合物之比率。
  20. 如請求項17之方法，其中步驟b.1)包含大約1:2的該式(6-a)化合物與該酸活化劑之比率。
  21. 如請求項17之方法，其中步驟b.1)包含大約0℃至大約14℃之溫度。
  22. 如請求項17之方法，其中步驟b.2)包含選自由以下組成之群的氧化劑：氫過氧化物、過氧酸、過氧化二醯基、過氧化二烷基、過氧化氫、氧氣、過硫酸氫鉀複合鹽(oxone)、碘及臭氧。
  23. 如請求項22之方法，其中該氧化劑為氫過氧化第三丁基。
  24. 如請求項17之方法，其中步驟b.2)包含大約12-24小時之反應時間。
  25. 如請求項22之方法，其中步驟b.2)包含大約1:3的該式(6-a)化合物與該氧化劑之比率。
  26. 如請求項15之方法，其中步驟b)包括使該式(6-b)化合物及該式(10)化合物反應以獲得式(11)化合物。
  27. 如請求項1至26中任一項之方法，其進一步包括： c) 將該式(11)化合物脫除保護基以形成式(12)化合物：
    Figure 03_image235
    (12)， 其中X不存在、為H、Li、Na、K或DMOA； 或其鹽。
  28. 如請求項27之方法，其中步驟c)包括： c.1) 將該式(11)化合物之磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-a)化合物：
    Figure 03_image038
    (12-a)， 或其鹽；及 c.2) 將該式(12-a)化合物整體脫除保護基以獲得該式(12)化合物或其鹽。
  29. 如請求項28之方法，其中步驟c.1)在N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)存在下進行。
  30. 如請求項28之方法，其中步驟c.2)在氫氧化銨及甲胺存在下進行。
  31. 如請求項27之方法，其中步驟c)包括： c.1) 將該式(11)化合物之磷酸酯部分脫除部分保護基以獲得式(12-b)化合物：
    Figure 03_image040
    (12-b)， 或其鹽； c.2) 將該式(12-b)化合物之剩餘磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-a)化合物：
    Figure 03_image038
    (12-a)， 或其鹽；及 c.3) 將該式(12-a)化合物整體脫除保護基以獲得該式(12)化合物或其鹽。
  32. 如請求項31之方法，其中步驟c.1)在 t-BuNH 2存在下進行。
  33. 如請求項31之方法，其中步驟c.2)在N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)存在下進行。
  34. 如請求項31之方法，其中步驟c.3)在氫氧化銨及甲胺存在下進行。
  35. 如請求項27之方法，其進一步包括： d) 使該式(12)化合物與式(15)化合物反應：
    Figure 03_image047
    (15) 以獲得式(16)化合物：
    Figure 03_image051
    (16)， 或其鹽； 其中Y之每種情況獨立地為NH 4或不存在。
  36. 如請求項35之方法，其進一步包括在使該式(12)化合物與該式(15)化合物反應之前： i) 將X為H之式(12)化合物轉變成X為Na、K或Li之式(12)化合物；及 ii) 將X為Na、K或Li之該式(12)化合物轉變成X為DMOA之式(12)化合物。
  37. 如請求項36之方法，其中X為DMOA之該式(12)化合物用於與該式(15)化合物反應以獲得式(16)化合物。
  38. 如請求項35之方法，其中步驟d)包括金屬鹽介導的該式(12)化合物與該式(15)化合物之偶合。
  39. 如請求項35之方法，其中步驟d)在HCl及金屬鹽存在下進行。
  40. 如請求項35之方法，其中該式(16)化合物藉由切向流過濾(TFF)純化。
  41. 如請求項40之方法，其中該式(16)化合物藉由陰離子交換層析法(AEX)進一步純化。
  42. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該式(4)化合物藉由以下形成： e) 式(3)化合物之亞磷醯化：
    Figure 03_image053
    (3)， 其中R 1為氮保護基；且 R a及R b各獨立地為氧保護基； 以獲得該式(4)化合物。
  43. 如請求項42之方法，其中步驟e)在N,N,N’,N’-四異丙基二胺基亞磷酸2-氰基乙酯及5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)存在下進行。
  44. 如請求項42之方法，其中該式(4)化合物在與該式(5)化合物反應之前未純化或處理。
  45. 如請求項42之方法，其中該式(3)化合物藉由以下形成： f) 使式(1)化合物與式(2)化合物反應：
    Figure 03_image057
    (1)及
    Figure 03_image059
    (2) 其中R 1為氮保護基；且 R a及R b各獨立地為氧保護基； 以獲得該式(3)化合物。
  46. 如請求項45之方法，其中步驟f)包括： f.1) 使該式(1)化合物與該式(2)化合物在酸活化劑存在下反應；及 f.2) 將步驟f.1)之產物氧化。
  47. 如請求項1至26中任一項之方法，其中R a、R b、R c及R d各自獨立地具有下式：
    Figure 03_image065
    其中R x及R y各自獨立地為H、視情況經取代之環狀或非環狀烷基、視情況經取代之環狀或非環狀雜烷基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；或其中R x及R y組合形成3-6員環。
  48. 如請求項47之方法，其中R x及R y各自獨立地為H或C 1-C 6烷基，或其中R x及R y組合形成3-6員碳環。
  49. 如請求項1至26中任一項之方法，其中R a及R b具有下式：
    Figure 03_image067
    。
  50. 如請求項1至26中任一項之方法，其中R c具有下式：
    Figure 03_image069
    。
  51. 如請求項1至26中任一項之方法，其中R d具有下式：
    Figure 03_image069
    。
  52. 如請求項45之方法，其中該式(1)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image061
    ； 或其鹽。
  53. 如請求項45之方法，其中該式(2)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image063
    ； 或其鹽。
  54. 如請求項42之方法，其中該式(3)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image055
    ； 或其鹽。
  55. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該式(4)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image017
    ； 或其鹽。
  56. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該式(5)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image019
    ； 或其鹽。
  57. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該式(6)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image022
    ； 或其鹽。
  58. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該式(6)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image089
    ； 或其鹽。
  59. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該式(10)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image024
    ； 或其鹽。
  60. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該式(11)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image093
    ； 或其鹽。
  61. 如請求項17之方法，其中該式(11-a)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image032
    ； 或其鹽。
  62. 如請求項31之方法，其中該式(12-a)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image258
    ， 或其鹽。
  63. 如請求項31之方法，其中該式(12-b)化合物具有以下結構：
    Figure 03_image045
    ，或其鹽。
  64. 一種用於合成三核苷酸之方法，其包括： a) 使式(4)化合物與式(5)化合物在吡啶三氟乙酸鹽及吡啶存在下反應：
    Figure 03_image017
    及
    Figure 03_image019
    ， 以獲得式(6)化合物：
    Figure 03_image089
    ； b.1) 使該式(6)化合物與式(10)化合物在吡啶三氟乙酸鹽及吡啶存在下反應：
    Figure 03_image024
    ， 以獲得式(11-a)化合物：
    Figure 03_image032
    ；及 b.2) 使該式(11-a)化合物與氫過氧化第三丁基反應以獲得式(11)化合物：
    Figure 03_image093
    。
  65. 如請求項64之方法，其進一步包括： c.1) 在 t-BuNH 2存在下將該式(11)化合物之磷酸酯部分脫除部分保護基以獲得式(12-b)化合物：
    Figure 03_image045
    ； c.2) 在N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)存在下將該式(12-b)化合物之剩餘磷酸酯部分脫除保護基以獲得式(12-a)化合物：
    Figure 03_image266
    ；及 c.3) 在氫氧化銨及甲胺存在下將該式(12-a)化合物整體脫除保護基以獲得該式(12)化合物：
    Figure 03_image267
    ， 其中X為DMOA。
  66. 如請求項65之方法，其進一步包括： d) 使該式(12)化合物與式(15)化合物在HCl及金屬鹽存在下反應：
    Figure 03_image047
    以獲得式(16)化合物：
    Figure 03_image051
    ， 其中Y之每種情況獨立地為NH 4或不存在。
  67. 如請求項64至66中任一項之方法，其中該式(4)化合物藉由以下形成： e) 在N,N,N’,N’-四異丙基二胺基亞磷酸2-氰基乙酯及5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)存在下進行式(3)化合物之亞磷醯化：
    Figure 03_image055
    以獲得該式(4)化合物。
  68. 如請求項67之方法，其中該式(3)化合物藉由以下形成： f.1) 在吡啶三氟乙酸鹽及吡啶存在下使式(1)化合物與式(2)化合物反應：
    Figure 03_image061
    及
    Figure 03_image063
    ；及 f.2) 在氫過氧化第三丁基存在下將步驟(f.1)之產物氧化以獲得該式(3)化合物。
  69. 一種式(1)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image061
    ； 或其鹽。
  70. 一種式(2)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image063
    ； 或其鹽。
  71. 一種式(3)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image055
    ； 或其鹽。
  72. 一種式(4)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image017
    ； 或其鹽。
  73. 一種式(5)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image019
    ； 或其鹽。
  74. 一種式(6)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image089
    ； 或其鹽。
  75. 一種式(7)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image081
    ； 或其鹽。
  76. 一種式(8)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image079
    ； 或其鹽。
  77. 一種式(9)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image077
    ； 或其鹽。
  78. 一種式(10)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image024
    ； 或其鹽。
  79. 一種式(11)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image093
    ； 或其鹽。
  80. 一種式(11-a)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image032
    ； 或其鹽。
  81. 一種式(12-a)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image285
    ， 或其鹽。
  82. 一種式(12-b)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image045
    ，或其鹽。
  83. 一種式(12)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image288
    ， 其中X不存在、為H、Na或DMOA； 或其鹽。
  84. 一種式(15)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image047
    ； 或其鹽。
  85. 一種式(16)化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image051
    ， 其中Y之每種情況獨立地為NH 4或不存在； 或其鹽。
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