TW200411052A - Method of transferring mutation into target nucleic acid - Google Patents

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200411052 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種對標的核酸導入變異之方法，其將變 異$入基因，以致可用於修復基因上之變異。 【先前技術】 目前進行之基因治療，係對於因細胞中之基因缺損及變 異造成機能異常之細胞，使用病毒類載體等將該基因導入 、、、田胞中之方法。藉此，細胞可以回復正常，履行本來之任 務。此可謂基因之補充療法。 但是藉由病毒類載體導入基因具有問題點。在染色體上 異基因以原樣殘存，若來自該變異基因之變異蛋白質與 來自正常基因之正常蛋白質具有類似之構造，變異蛋白質 可能會妨礙正常蛋白質之機能。 近年，與藉由病毒類載體導入DNa不同，而是使細胞中 目的基因之驗基變換之基因插革巴法（gene targeting)正受到 注目。舉例言之’在湯瑪士 •傑佛遜大學之&卜Β· Kmiec 開發之嵌合形成法[proc, Natl. Acad. Sci. USA，Vol. 93，p 2071〜2070 (1996)]中，使用將欲變化之鹼基部分做成dna ’且在其之兩端配置供決定位置之rna之嵌合寡核苷酸。 由於RNA與DNA之鐽結比Dna彼此間之鍵結強，若將嵌合 券核苷酸導入細胞，則兩端之RNA之鹼基序列將尋找來自 細胞内DNA之對應鹼基序列並與之形成雙股’繼而藉由錯 配修復將變異導入目的部位。但是，嵌合寡核苷酸脂之環 狀構造複雜’為維持該構造使用多餘的8個胸腺，唆，因此 86645 200411052 對於標的DNA之結合力有相當負面的影響。 ,〇.、Ig°UCheVa等人開發單股寡㈣酸（以下稱為“ng。) 形成法[Gene Therapy v〇1 R m PL Mi· 8, p 391 〜399 (2001)]。其中在中 央配置與標的核酸中待轡显 丁行义呉之鹼基對應之鹼基，在兩側使 用帶有數個曱基化尿嘧σ定之由I + 山疋之由數十個鹼基組成之募核苷酸 ，其中該曱基化尿嘧啶難以被核酸酶分解。 但是，上述二種變異導入方法之修復效率皆低。在二者 中修復效率較佳之單股寡核苦酸（ss olig〇)形成法亦有明確 之優點。S亥法在鍵結於標的核酸後之錯配修復過程中，雙 股DNA之意義及反義兩股之變異鹼基無法一次修復，而只 能修復任一方之變異鹼基，剩下之互補股中之變異鹼基需 要藉由細胞之錯配修復機構再一次修復。 上述Kmiec等人之嵌合募核苷酸（chimera 〇Hg〇)為了維持 環狀構造，導入與標的DNA沒有關係之序列。其之數目占 全部募核苷酸之十分之一以上。因此，嵌合寡核苷酸插入 標的DNA之活性低。 另一重點為chimera olig〇及ss OHgo之修復機制，從所使 用之寡核苷酸之構造觀之，不可能同時修復二個以上分離 之變異鹼基。進行二個以上之分離鹼基之修復或變異之導 入時，必須進行數次之募核苷酸導入及選殖。不用說費工 夫，目前將DNA導入細胞之技術對於細胞之傷害大，要得 到生存且保持期望機能之細胞有困難。 又，在修復細胞之染色體之變異鹼基之情況，只能將修 復用DNA導入細胞質。該修復用DNA視濃度梯度以自由擴 86645 200411052 散之方式向核移動。在該情況必須將高莫耳數修復用dna 導入細胞中，結果，進入核之量少，變異之修復效率不佳。 與基因治療之發展之同時，期望改變上述機制複雜且效 果不佳之修復方法，而可以同時修復複數個鹼基，主動地 將修復用核酸輸送至核且效果高的方法。 【發明内容】 本發明者為達成上述目的深入檢討之結果，發現藉由使 用具有逆方向反覆之DNA，可以有效率地將變異導入標的 核酸之驗基中，於是完成本發明。 馨 本發明之第1發明，係關於將變異導入標的核酸之鹼基序 列之方法，其特徵為包含： (1)調製具有逆方向反覆序列之DNA之步驟，其中該具有逆 方向反復序列之dna之驗基序列與標的核酸相同，且具 有含待導入標的核酸中之變異之鹼基序列；以及 ()將上述具有逆方向反覆序列之dna導入細胞内之步驟。 在第1發明中，該具有逆方向反覆序列之DNA可具有針對 有核疋位化號（nuclear 1〇calizati〇n signal)之蛋白質之結合_ 基元序列（binding motif sequence)，例如針對轉錄因子之結 合基元序列。又，上述DNA可含有適當修飾之鹼基。 在第1發明中，標的核酸可為存在於細胞質或核之核酸。 又，具有逆方向反覆序列之DNA可為雙股及單股之任一者 之 Dna。 依照第1發明之方法，可以同時將複數個變異導入標的核 酉欠。被導入標的核酸中之變異例如為鹼基之置換、缺失及/ 86645 丄 或插入。 本發明之第2發明发&、 為错由第1發明之方法將變異導入標的 核酸用之套組，复牲 ”付倣為含有具逆方向反覆序列之DNA， 該DNA與標的核酸相 不目冋且具有包含待導入標的核酸之變異 之驗基序列。 第2發明之套也所八 、、所3有之具逆方向反覆序列之DN A可含 . 有針對轉錄因子之杜人- · 、、口 口基凡序列（binding motif sequence) 或、二適田知飾之鹼基。再者，具逆方向反覆序列之DN a可 為雙股及單股DNA之任_者。 _ 【實施方式】 發明之詳細說明 對於本說明書中記載之「標的核酸」無特殊限定，其包 含期望導入變異之任一種核酸。舉例言之，本發明可被用 於將變異導入存在於細胞内之DNA，而以存在於細胞質内 之DNA(游離基因DNA、質體及粒線體DNA等）或存在於核 内之DNA(染色體1^八）做為標的核酸。 人 又，在本發明中，對於被導入標的核酸中之變異無特殊_ 限疋，可以導入鹼基取代、缺失及插入等變異，在該情、、兄 ，所使用之具有逆方向反覆序列之DNA包含具有上述變異 之驗基序列。 再者，在本發明中變異之導入，不僅將變異導入正常的 驗基序列’當然亦包含將天然或生成之鹼基序列之變異修 復成正常序列之態樣。 在本發明中所使用之具有逆方向反覆序列之DNA(以下 86645 200411052 稱為逆方向反覆DNA)，為與標的核酸相同且具有含待導入 標的核酸中之變異之鹼基序列之DNA。其中所謂「相同」 意指具有與標的核酸或其之互補股可形成雙股之驗基序列 者，並非意味具有完全一致之鹼基序列者。亦即，意指具 有藉由形成鹼基對可與標的核酸充分形成雙股之鹼基序列。 對於具有逆方向反覆序列之DNA之製作方法無特殊限定 ，可以使用化學合成、酵素合成（核酸增幅反應等）及生物 學合成（利用具有質體等之自行複製能力之核酸之方法）之 任一種。具有逆方向反覆序列之DNA中，標的核酸之意義 股及反義股之序列雖為縱列式並列，但在兩者之間，於可 將變異導入標的核酸之範圍内，可以插入任意之序列（間隔 基）。 在本發明中，雖然可以.使用具有逆方向反覆之雙股〇1^八 ，但亦可使用將此等雙股DNA變性得到之單股DNA。該單 股DNA，由於意義股部份及反義股部份具有互補的鹼基序 列，有時亦得到該二部分形成鹼基對鍵結之堆疊構造，此 等形態之單股DNA在本發明中亦可被使用。 上述形成堆疊構造之具有逆方向反覆序列之DNA，例如 可藉由與美國專利第5,643,762號、第5,714,323號及第 6,〇43,028號中被記載為slDNA之單股DNA相同之方法調製。 在本發明之方法中，可以將同時變異導入標的核酸上之 兩個以上處所。被使用於該目的之具有逆方向反覆序列之 DNA只要長度夠即可。在細胞之增殖週期中之d财合成期 (S phase)中，進行DNA相同重組修復。從父dna複製成母 86645 200411052 DNA之時，父DNA螺旋解開形成複製交叉（f〇rk)。在該時期 可以同時鍵結於交叉部分之DNA之意義股與反義股二者之 DNA，插靶（targeting)活性應該高。基於上述，本發明者掣 作在單股DNA中，同時具有標的DNA之意義股及反義股之 序列且可結合於標的DNA之意義及反義兩股之單股逆方向 反覆DNA。 關於該方法，首先構築質體，在該質體中置入二相同基 因或其片段以逆向方式排列之逆方向反覆DNA插子。例如 為實施例2所述之質體之構築方法。培養用該質體轉形之大 腸菌’可以得到大量之質體。在質體中逆方向反覆dna插 子之兩端，使用限制酵素將該插子從載體中切斷，可以得 到逆方向反覆DNA。又，亦㈣以上述f體做為模板之pcR 法來增幅逆方向反覆DNA之方法。 但是，在上述質體之構築中，對於插在逆方向反覆dna 中之基因或其之片段雖無特殊限定，但一般以卟至 1500 bp為較佳，在500 bp以下之情況，要將完全相同之二 個DNA片段彼此以逆方向插入載體質體有固難。在該情況 ’可用 其他方法（例如化學方法或 DNA。 酵素方法）合成目的之 在本發明中，可以使用在待導入變異之標的核酸上之， 位之上、下游，具有包含10個驗基以上或百個驗基以上」 驗基序列之逆方向反覆DNA，以易趴引i 4 易於引起相同重組。 依知、本發明，使用具有逆方6 逆万向反覆序列之DNA將變異_ 入標的核酸中之情況，例如要枱 要才又正存在於基因上之變異礙 86645 200411052 基之情況’若製作具有在對應於變異鹼基之部位上包含正 系鹼基之野生型基因之序列之逆方向反覆DNA，並使用公 知之DNA導入法（例如磷酸鈣法、電泳法或將脂質做為媒體 之轉染法等）將其導入細胞，將可以修復變異之鹼基。 相反地，將變異導入野生型基因之情況，調製包含欲導 入该基因之鹼基（鹼基序列）之逆方向反覆DNA，然後使用 上述之DNA導入法導入細胞，可以將變異導入標的基因。 為了防止具有本發明中之逆方向反覆序列之DNA被核酸 酶/刀解，可保護上述DNA25i末端及3，末端以防核酸酶作用_ 。對於末端之保護，雖無特殊限定，但例如可將DNA以物 理及化學方法實施環化。又，在上述DNA中可含有修飾之 自双基，例如修飾之去氧核糖核苷酸、修飾之核糖核苷酸及 LMA (WO 99/14226號國際公開公報）等；以導入甲基化之核 糖核苷酸及去氧核糖核苷酸等進行末端之保護為較佳。上 述各種鹼基對具有逆方向反覆序列之DNA之末端部分之導 入’可藉由化學的手段或如下述實施例所示之酵素手段實 施。 、· 在本發明所使用之具有逆方向反覆序列之DNA中，可以 含有針對具有核定位信號之蛋白質之結合基元 motif)序列（亦即能結合於該蛋白質之dna序列）。 對於在本發明中可以使用之具有核定位信號之蛋白質， 無特殊限定，可以使用天然或人工之蛋白質，例如轉錄因 子SV40大型T抗原、組蛋白、核質（nucie〇piasmin)、以及 為雙股RNA結合蛋白質之NF90等。又，多種具有核定位信 86645 -12- 200411052 號之蛋白質被記載在Biochim Biophys Acta，ν〇ι ι〇7ΐ, p 8 3 1 〇 1 (1 9 9 i)中，此等在本發明中可被使用。 在上述有核定位信號之蛋白質具有能結合於特定DNA序 列之能力之情況，本發明之具有逆方向反覆序列之臟可 以含有針對上述蛋白質之結合基元序列（m〇tif “叭⑶“）。 對於在本發明中使用之結合基元序列無特殊限定，例如 在本發明中可以使用能與待導入變異之細胞中所表現之具 有才Λ疋位L 5虎之蛋白質結合之序列。對於沒有DNA之結合 部位或者不知結合部位是否存在之具有減位信號之蛋白籲 質’亦可以藉由製作具有此等核定位信號及適當的dna結 曰序列之嵌合蛋白質而用於本發明。 於上述具有核定位信號之蛋白質在待導入變異之細胞中 表現之情況’藉由將具有針對上述蛋白質之基元序列之具 C方向反後序列之DN A導入細胞中，被導入之D難將與上 :蛋白質結合以及被輸送至核中，而可以將目的變異導入 染色體DNA。具有核定位信號之蛋白質在待導入變異之細 月:中不被表現之情〉兄’或•人工製作之情況，則在々寺導入· 又.、之、、、田胞中導入上述蛋白質或編碼其之基因，可以實施 本發日:之方法。將上述蛋白質或編碼其之基因導入細胞之 雜&又有彳寸殊限疋’可以利用公知之方法，例如使用核糖 妝等之方法及使用質體類媒體或病毒類媒體等之方法。再 者上述蛋白質或編碼該蛋白質之基因與具有針對該蛋白 質之基it序列之具逆方向反覆序列之dna同時導入細胞中。 在本^明中適合使用之可與具有核定位信號之蛋白質結 86645 -13- 200411052 合之序列’例如為可與轉錄因子結合之dna序列。在本發 明中圯載之所謂轉錄因子意指會影響藉由RNA聚合酶從 DNA轉錄為RNA之效率之因子。在本發明中可以使用之針 對轉錄因子之結合基元（binding m〇tif)序列，雖非用來特別 限定本發明，但是可列舉NF_KB、Spl、Ap卜NF-IL6 (C/EBPp) 、AP2、Oct-1、SRF及Ets-1等可與轉錄因子結合之序列為 例上述轉錄因子之結合基元序列，例如為以下文獻記載 者· Eur· J· Biochem，Vol. 268, p 1 828〜1 836 (2001) ; J. Biol· Chem·，Vol· 263, p 3372〜3379 (1998) ; Cell，Vol· 49, p 741 〜籲 752 (1987)； EMBO J. V〇l. 9? p 1 897-1906 (1990)； Proc. Natl.

Acad· Sci· USA，Vol. 88, p 7948〜7952 (1991) ; Genes Dev·， V〇l. 25 p 1 582^1 599 (1 988) ； Nucleic Acids Res.5 V〇l. 2〇5 p 3297〜3303 (1992) ; Genes Dev·，Vol. 4, p 1451 〜1453 (1990)。 本發明之具有逆方向反覆序列之DNA所含有之結合基元 序列之套數沒有限定，可為1套，亦可為複數套。又，對於 其之位置亦無特殊限定，可為上述DNA之5,或3,端部分。舉 例言之，可在5,末端部分及3,末端部分二者含有2套以上之_ 結合基元序列。較佳在逆方向反覆序列部分之中央，亦即 反覆序列之間導入結合基元序列。 上述含有針對具有核定位信號之蛋白質之結合基元序列 之具逆方向反覆序列之DNA，由於可以主動地輸送至核内 ，因此顯示將變異導入染色體DNA或修復變異之效率高。 藉由本發明之方法可以進行基因之失活，在該情況，例 如將為起始密碼子之Atg中之一個或二個鹼基置換，可以 86645 -14- 200411052 妨礙蛋白質之轉譯。又，在標的基因中之適當位置、曾炊 止密碼子，可以阻礙全長轉譯產物之 V入終 人 丹考，調《太 標的基因之鹼基序列中插入（或刪除）一個或二個鹼美、、， 方向反覆D N A，利用其可以在標的基因中編碼蛋：二： 域之鹼基序列中使譯碼區位移，而達成基因之失活Y舉= 言之’期望使下列驗基變異：基因之起始密碼子驗基：： 起始密碼子起之2〜30値鹼基内之鹼基，於酵素蛋白質之= 況編碼相當於酵素活性部位之胺基酸殘基之鹼基，以及= 發出螢光之情況編碼決定螢光之胺基酸殘基之鹼基。、 雖然可以同時修復二個或二個以上分離之變異鹼基為本 發明最重要之特徵。若使在數百個至數千個鹼基之間含有 能修復標的核酸中之複數個變異鹼基之鹼基，並使用數百 至數千個驗基之逆方向反覆DNA，將可與修復單一變異驗 基同樣，修復複數個變異。例如，如實施例5所述，基因中 相隔200個鹼基之二個變異鹼基可以一次修復。 依照上述態樣，將變異導入2個以上部位之情況，對於上 述部位間之距離無特殊限定，可以相隔數百個鹼基。從變 異導入效率之觀點言之，以相隔2〇〇個鹼基以内為較佳，以 相隔100個鹼基以内為更佳，以相隔3〇個鹼基以内為特佳。 本發明提供一種供上述本發明之變異導入用之套組。在 一貫施態樣中，該套組含有將變異導入標的核酸用之具有 逆方向反覆序列之DNA。再者，可含有將上述DNA導入細 胞用之試藥。 再者，藉由本發明之方法將變異導入基因中之細胞可被 86645 -15- 200411052 移植於身體。如此可以在身體内進行使變異基因表現或使 變異被修復之基因表現之基因治療。 對於上述細胞無特殊限定，例如血液細胞（造血細胞、造 血幹細胞、骨髓細胞、臍帯血液細胞、末梢血幹細胞、單 核球、淋巴球、B細胞及T細胞等）、纖維母細胞、神經母細 胞、神經細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、肌肉 母細胞、骨絡肌細胞、平滑肌細胞、癌細胞及白血病細跑 等。 ,v丨不π、卿肥又丞囚治療藉由 下操作實施。首先，從提供者採取含有造血幹細胞之材: ’例如骨趙組織、末梢血液及濟带血液等。此等材料雖 以原樣用於基因導入操作，作 .^ 1一通吊猎由密度梯度離心等， 法凋衣包含造血幹細胞之單核 鈿旳主1 极、、、田胞邛分，然後利用適當f :胞表面標記進行造血幹細胞之精製。對於此 幹細胞之材料，使用本發明 ” 夕伙A 乃^貝知變異之導入或蠻] 之修设。如此得到之細胞， ^ 他方法移植至接受者。接受者投广 進行同種異系移植，例如在以脾％ 者本身，亦可i 可以進行同種異系移植。“血液做為材料之情況， 依照本發明之基因治療，例如以在 或者由於變異以致機能降低或失去之:中之表現充進， 之，起因於單一鹼基置換 土*為對象。舉例t 土且佚之基因病如 、於藉由本發明之方法治 八、、工血球貧血症為 疋〈疾病。 上述基因治療可適用於人 、以及人類以外之脊椎動物 86645 -16 - 200411052 及非脊椎動物。 再者，本發明之適用之一例，例如 性幹細胞、屌4緒^ 為使用生殖糸細胞（胚 母"， 殖細胞、卵母細胞、卵原細胞、印子、精 、、田匕及知子等）做為標的細胞之 广 便製作。依昭太a B0 頒轉基因動物之簡 其因^ 月之方法’ ^製作僅特異性抑制目的 土口之表現之基因失活動物。上 U ^ Γ； U ^ ^ ^ 夭/舌動物在基因機能之 =析乂及與该基因之機能相關之藥劑之筛選上非常有用。 貫施例 以下雖以實施例詳細地說明本發明，但本發明非限於實 施例之範圍内。 零 實施例1 將變異基因導入紅轉綠螢光蛋白質基因 對於被插入質體pQBI25(量子生物科技公司製）中之編碼 紅轉綠螢光蛋白質（以下簡稱為GFP)之基因（序列表之序列 編號1)’將驗基序列中之一個驗基置換，以不使該基因表 現。使用PCRi式管内突變誘導套組（Takara Bio公司製），將 對於GFP之赏光頗為重要之第6 6〜6 8號胺基酸殘基中，編碼_ 第67號之酪胺酸之密碼子tat變換成為終止密碼子之tag 。將如此製作之變異GFP (mGFP)基因及編碼未導入變異之 GFP之基因分別插入質體pDON-AI (Takara Bio公司製），以 構築pDON-mGFP及PDON-GFP。將包含此等質體1 pg之TE 缓衝液 50 μΐ 與包含 1 之 Lipofectamine 2000 (LF2000， Gibco BRL公司製）之 50 μΐ Optimen培養基（Gibco BRL 公司 製）混合，並轉染293細胞，4日後用螢光顯微鏡觀察。在加 -17- 86645 200411052 入pD〇N-GFP之細胞中，雖然觀察到強的綠色螢光，但在力口 入pD〇N-mGFP之細胞中未觀察έιΐ螢光。結果，構築出在細 胞内未發出螢光之變異墓因。將該mGFP基因用在以下之實 驗中。 實施例2 爲了製作具有GFP基因之鹼基序列之逆方向反覆DNA(以 下稱為irDNA)。首先將做為irDNA增幅模板之二個逆向GFP 基因片段插入質體中。將插在質體PQBI25中之GFP基因之 全序列用引子Us-EcoRI及DEND(序列表之序列編號2及3) _ 增幅之片段以EcoRI及BamHI(皆為Takara Bio公司製）消化 所得之760 bp DNA片段，插在質體pUC19 (Takara Bio公司 製）之EcoRI及BamHI部位間。繼而，將在該質體之Hindlll 及BamHI部位間之GFP基因之全序列用引子Us-hindIII(序 列表之序列編號4)及DEND增幅所得之DNA片段，插在用 Hindlll (Takara Bio 公司製）及 BamHI 消化所得之 760 bp DNA片段中，將如此構築之質體命名為pucGFPO-O。 又，將GFP基因之全序列用引子Us-EcoRI及DEND增幅所暴 得之片段用EcoRI及PvuII (Takara Bio公司製）消化所得之 714 bp之DNA片段，插在質體pUC19之EcoRI與Smal部位之 間。繼而，在該質體Hindlll與BamHI部位之間，插入將GFP 基因之全序列用引子Us-hindIII及DEND增幅所得之DNA片 段以Hindlll及BamHI消化所得之760 bp DNA片段。將如此 構築得之質體命名為pucGFPO-2。 再者，將GFP基因用引子UlOOhindlll及UlOObamhI(序列 -18- 86645 200411052 表之序列編號5及6)增幅所得之DNA片段用HindiII及

BamHI ’肖化’以調製11 0 bp之DNA片段。將上述質體 PUCGFP〇一0 中之 76〇 bp Hindlll-BamHI 片段與 11〇 bp 之 DNA 片段父換’以構築質體pucGFp〇-6。 pucGFPO-O ’具有編碼GFP之基因之全長之逆方向反覆序 歹J且插子DNA之長度為;[518 bp。pucGFPO-2，反覆序列中 之一者缺失從終止密碼子起之3 8個鹼基序列且插子Dn a之 長度為1479 bP。質體pucGFPO-6，具有編碼GFP之基因之全 長及從GFP基因中之第ι5〇〜25〇號鹼基形成之逆方向反覆_ 序列’且插子DNA之長度為868 bp。圖1A圖示pucGFPO-O ’圖 1B 圖示 pUCGFP0-2，以及圖 1C 圖示 pucGFPO-6。 分別以 pucGFPO-O，pucGFPO-2 以及 pucGFPO-6為模板， 藉由PCR製作為逆方向反覆DNA之0-0 irDNA、0-2 irDNA 及0-6 irDNA。在〇-〇 irDNA及0-2 irDNA之製作上，使用弓I 子Us-ecoRI-1及Us-hindIII-1 (序列表之序列編號7及8)，又 在0-6 irDNA之製作上，使用引子Us-ecoRI-Ι及U100 hindIII-Ι (序列表之序列編號9)。將導入mGFP基因之變異鹼修 基G及C恢復為野生型GFP基因之鹼基用之T及A，分別相當 於0-0 irDNA、0_2 irDNA及0-6 irDNA中從意義鏈之5’側或 反義鏈之3’側（EcoRI site)算起之第237及1282號鹼基、第 237及1243號鹼基、以及第237及81 3號鹼基。在圖1中，將 mGFP基因之意義鏈或反義鏈中與變異驗基之修復相關之 驗基之位置以*及#表不。 -19- 86645 200411052 實施例3 在游離基因（episome)實驗模型中mGFP基因之單一變異鹼 基之修復 藉由逆方向反覆DNA進行基因修復實驗，並調查與標的 核酸之結合以及標的核酸之變異鹼基之修復。為了避免數 次導入DNA造成對細胞之毒性，將插入為標的核酸之1t1gfp 基因之質體（pcep-mGFP)，與修復用之三種逆方向反覆 DNA(irDNA)或對照組所用之單股募核苷酸（ss 〇lig〇)之任 一者同時導入細胞質中。ss 〇ligo之驗基序列被示於序列表籲 之序列編號1 0中。 (1)藉由以熱變性2irDNA修復游離基因mGFP基因 為了製作貫驗模型’從在實施例1中構築之pD〇N-mGFP 單離包含mGFP基因之760 bp Hindlll-BamHI片段，將其次 選殖在為游離基因之哺乳動物表現載體之pCEp4 (Invitrogen公司製）之Hindlll與BamHI部位之間，以製作質 體pcep-mGFP。在48穴平皿中播種293個細胞（8萬個），並在 含10%FBS之DEME培養基中培養一夜。將〇_〇 irDNA、籲 irDNA及0-6 irDNA各2 μ§分別於94°C熱變性5分鐘，然後用 冰水急冷。將2 pg 之 ss 〇lig0、〇-〇 irDNA、〇-2 irDNA 及 0-6 irDNA以及1.5 gg之pcep-mGFp或PUC19(陰性對照組】）用 3 7·5 μΐ Optimen培養基稀釋，並與同量之包含2叫LF2〇〇〇 之Optimen培養基混合。另外將只含3·5 之 37.5 μΐ Optimen培養基與同量之包含2叫LF2〇〇〇之 Optimen培養基混合，將如此所得之混合物做為陰性對照組 -20- 86645 200411052 2 〇 培育20分鐘後，將此等DNA_LF2〇〇〇試劑複合物添加至細 胞中，並置於室溫3〇分鐘，然後添加15〇 W之培養 基轉染6小時後，添加1 ml包含10% FBS之DEME培養基 。48小時後，在陰性對照組丨及陰性對照組2中未見到發出 綠色螢光之細胞（GFP陽性細胞），相對於此，在用包含變異 修復用ss〇lig〇或三種irDNAw及標的DNA之pcep-mGFP轉 染之穴中已可見到GFP陽性細胞，在第4曰GFP陽性細胞成 為最多者。將該細胞用胰蛋白酶處理並從平板取出細胞， 然後用FACS測定GFP陽性細胞。從該測定值減去相當於背 景之陰性對照組1之值，並將結果示於表1中。 每1萬個239細胞（為mGFP基因上之變異鹼基之修復指標） 之GFP陽性細胞之數目，在〇_〇 irDNA之情況最多，該修復 效果為ss Oligo之修復效果之約3倍。就4次獨立實驗之 Mann-Whitney之U檢定結果言之，〇-〇 irDNA之修復效率與 ss Oligo之修復效率相較，顯示有意義差（p< 〇.〇5)。 表1 DNA 每104個細胞之GF P陽性細胞數 0-0 irDNA 18.21 ±4.22 個 0-2 irDNA 11.79 ±2.84個 0-6 irDNA 5.26 ±0.74個 ss Oligo 5.40 ±2.644固 -21 86645 200411052 (2)未經熱變性之irDNA所造成之游離基因mGFP基因之修 復 除了未將藉PCR增幅而調製之irDNA熱變性之外，以與上 述實施例3-(1)相同之操作調查mGFP基因之修復。將1萬個 2 93細胞中出現之GFP陽性細胞之數目示於表2中。使用未 熱變性之irDNA之情況之修復效率皆比ss〇1 ig〇高。就4次獨 立實驗之Mann-Whitney之U檢定結果言之，〇-〇 irDNA及0-2 irDNA之修復效率與ss Oligo之修復效率相較，顯示有意義 差（p< 0.05)。 表.2 DNA 每104個細胞之GFP陽性細胞數 0-0 irDNA 39.27 ±9.21 個 0-2 irDNA 20.78 ±2.80個 0-6 irDNA 13.12±2.15 個 ss Oligo 6.54 ± 2.644固 另 方面’在將為標的核酸之p c e p - m G F P及變異修復用 0-0 irDNA以6小時之間隔依次轉染之情況，亦得到比使用 s s 01 i g 〇之情況南之修復效率。 由於已明白在上述（2)之實驗中，為標的核酸之質體未被 導入全部使用之細胞，因此將pcep-GFP及〇-〇 irDNA在與上 述相同之條件下導入293細胞，然後調查GFP陽性細胞數。 結果’質體僅被導入21·22±4·67%之細胞中。因此，表2所 不之結果，若除掉未導入質體之細胞來換算，每1萬個導入 peep-mGFP之細胞，變異驗基被修復之gj?p陽性細胞之數目 86645 -22- 200411052 如表3所示。就4次獨立貫驗之Mann-Whitney之U檢a 6士 疋結果 吕之’ 0-0 irDNA之修復效率與ss 〇Hg0之修復效率相車六 顯示有意義差（Ρ< 〇·〇5)。 表3 DNA 每104個導入pcep-mGFP之 細胞之GFP陽性細胞數 0-0 irDNA 201.42 ±58.42個 0-2 irDNA 109.12 ±27.48個1 0-6 irDNA 72.24 ±23.97個 ss Oligo 39.76 ± 20.94#] 在上述實驗中，於轉染時使用三種類之irDNA及ss〇lig〇 各2 pg’若將其各個換算為莫耳數，ss〇Hg〇之莫耳數為Mg nmol，〇-〇 irDNA、0-2 irDNA及 0-6 irDNA之莫耳數分別為 9·5、1〇·1 及 16.6 nmol。因此，三種 irDNA 之任一者與ssQHg〇 相比，變異鹼基之修復率較高。縱使在未變性下轉染之情 況，與用熱變性irDNA後轉染之情況一樣，包含全部GFp 基因領域之0-0 irDNA修復效率高，為ss 〇丨^〇之5倍以上。籲 〇-〇 irDNA之數目儘管比ss〇iig〇少數1〇倍，但修復效率比 ss Oligo高數倍之實驗結果，暗示irDNA插靶於標的核酸之 活性比ss 01ig〇高，導致修復效率提高。 實施例4 將mGFP基因導入細胞之染色體 使用 病毒套組（Retrovirus packaging kit amph〇)(Takara Bio公司製）製作將mGFP基因導入細胞染色體之逆病毒粒 86645 -23- 7 、將在貝細> 例1中記載之重組逆病毒載體pD〇N-niGFP及 上述套組之套裝載體，藉由磷酸鈣法同時導入293細胞。培 養48小時後’採取培養上清液及經由濾器過濾。再者，將 该培養上清液（逆病毒溶液）稀釋並添加於293細胞之培養 基中在從其選殖之細胞（293-10細胞）中mGFP基因之導入 ，藉由解析用PCR增幅之DNA片段之序列而確認。又，萃 取出該293-10細胞之染色體組DNA，解析逆病毒載體之整 口。卩位及與該部位鄰接之細胞側之染色體dna序列，以及 確w有一套GFP基因導入細胞中。在以下之實驗中使用該馨 純系化之細胞。 實施例5 用甲基化核糖核苷酸修飾之修復用〇-〇 irDNA之製作及 mGFP變異基因之修復 使用2f-〇-曱基rna磷醯胺化物及CE-磷醯胺化物並以磷 驢胺化物法合成之5’引子RNA-ecoR][及3,引子RNA-hindlll 之驗基序列被分別示於序列表之序列編號丨丨及丨2中。此二 引子之最初6個鹼基為曱基化之核糖核苷酸。使用該二個引籲 子以及用pucGFPO-O做為模板進行PCR，在得到之〇_〇 irDNA之意義股及反義股之5’末端帶有6個甲基化之核糖核 苷酸。將該在細胞内難以被核酸酶分解之〇-〇 ir]DNA命名為 RO-O irDNA 〇 將40萬個293-10細胞或293細胞（陰性對照組甩）播種在24 穴平板之各穴中，在含10% FBS之DEME培養基中培養一夜 。將 4 μg之 ss Oligo 以及 〇-〇 irDNA 或 RO-O irDNA 用 Optimen 86645 -24- 200411052 ^養基稀釋成75 μΐ，並與包含4 pg LF2000之同量Optimen 培養基混合。培育20分鐘後，將該DNA-LF2000試劑複合物 直接加入細胞中，然後添加9〇 μ1包含i 〇% FBS之DJEMJE培養 基並進行轉染。在培養基中ssOligo之莫耳數為992.00nmol 〇-〇 irDNA為 17.83 nmol 以及 RO-O irDNA為 17.82 nmol。6 小時後，添加1·5 ml包含10% FBS之DEME培養基。16〜18 小時後’將培養基交換成包含3% FBS之DEME，並於32°C 培養2曰半。 爲了正確計算GFP陽性細胞，將用PBS洗淨之細胞用胰蛋_ 白酶剝下，移至新平板之加有培養基之穴中，然後用螢光 顯微鏡計算各穴（160〜190萬個細胞）中各個GFP陽性細胞。 從加有修復用DNA之293-10細胞中GFP陽性細胞之數目減 去在對照293細胞中之背景值而算出。結果，在使用ss 〇Hg〇 、0-OlrDNA及RO·OirDNA之情況，平均每穴中存在54,23oo 及3800個GFP陽性細胞。將每}萬個293-10細胞中之GFP陽 性細胞之數目示於表4中。 就4次獨立實驗之Mann-Whitney之U檢定結果言之，二種· 類irDNA之修復效率與ss 〇ng0之修復效率相較，顯示有 意義差（P< 0.05)。 表4 DNA 每104個細胞之GFP陽性細胞數 0-0 irDNA 12.32 ±4.08個] RO-O irDNA 24.20 土 3.84#] ss Oligo 0.31 ±0.08#] 86645 -25- 200411052 以上293-10細胞染色體中之變異鹼基藉由11〇_〇卜〇^八之 修復率比藉由ss Oligo及〇_〇 irDNA之修復率高，該實驗結 果暗不甲基化核糖核苷酸由於對於核酸酶等之分解作用具 有耐性，因此RO-O irDNA在細胞質或核中之時間比〇/_〇 irDNA保持得長，以致變異修復效率高。 實施例6 包含能與轉錄因子結合之序列之irDNA所造成之變異鹼基 之修復 轉錄因子為與信號轉導於核有關之重要因子，其扮演控鲁 制基因表現之角色。多個轉錄因子在細胞質中被合成，通 常在細胞質中等待機會出任務。當接收到活化信號時，轉 錄因子移行至核内發揮機能。 抑制為轉錄因子之NF-κΒ及其之活性之Ι-κΒ多以結合形 式存在於細胞質中，當被TNFa等細胞激素刺激時，^⑼被 磷酸化以及NF-κΒ被活性化並移行至核中[]^〇(：1以1.八以(1·

Sci. USA，Vol. 91，p 1 1 884〜1 1 888 (1994)]。NF-κΒ與在基因 上游所明NF-κΒ基元序列（NF-κΒ motif)之短DNA序列結合鲁 ，並促進基因之轉錄。 .在293細胞中存在NF_KB，能與其結合之DNA序列 (5’-gattgCtttagCttggaaattCCggagCtg-3f，序列編號 13)曾被報 告[Eur. J. Biochem，Vol. 268, p 1 828〜1 836 (2001 )]。爲了將 該序列導入在irDNA中央之逆方向反覆序列中，合成三種 引子GFP-kB卜GFP_kB2A GFP_kB3(各引子之鹼基序列被分 別示於序列表之序列編號1 4，1 5及1 6中）。首先使用GFP-kB 1 86645 -26- 200411052 及上述之引子Us-EcoRI，以及用從pucGFP0-0切出之包含 GFP基因之EcoRI-BamHI片段做為模板DNA，進行PCR反應 ’得到增幅之DN A片段。繼而以該增幅片段做為模板，以 及使用GFP-KB2及Us-EcoRI進行PCR，得到增幅片段。然後 ’以該增幅片段做為模板，使用GFp_KB3及Us-EcoRI進行 PCR ’得到增幅片段。將得到之增幅片段用Ec〇R]^ BamHI 消化’將該片段入替pucGFPO-O中之EcoRI-BamHI片段。將 如此構築之質體命名為pucGFP0nf-0。 在pucGFPOnf-θ中包含具有GFP基因之逆方向反覆序列春 及NF-κΒ結合基元序列之插子，且插子之長度為1548 bp。 以該質體做為模板DNA，使用RNA-ecoRI引子及 RNA_hlndI11引子，或者S-ecoRI引子及S-hindIII引子（就序 列言之，RNA-ecoRI引子與RNA-hindIII引子雖然大體相同 ’但别者為從5 ’側起之6個驗基變更為去氧核糖核苷酸，同 時其中之磷酸基被硫分子修飾之引子）進行PCR。被增幅之 片段被分別命名為R0nf_0 irDNA及S0nf-0 irDNA。 293-10細胞及為陰性對照組之293細胞之前培養條件以鲁 及轉染修復用DNA之方法雖然與實施例5相同，但導入ss 〇hg〇、RO-O irDNA、ROnfO irDNA& s〇nf-()卜]〇^^八後 6小時 在添加之培養基中加入8 ng/ml之TNF α。 如實施例5般處理細胞，在螢光顯微鏡下計算各穴之GFP 陽性細胞之數目。從導入修復用DNA細胞中之GFP陽性細 胞之數目減去為對照組之293細胞中之背景值而算出。在ss 〇hg〇之情況，平均GFP陽性細胞數為88個，相對於此，在 86645 -27- 200411052 RO-O irDNA之情況為約 6〇〇〇個，在 ROnf_〇 ir]〇NA及s〇nf-〇 irDNA之情況分別超過1萬個。使用ss〇lig〇、r〇_〇 irDNA 、R0nf-0irDNA及S0nf-OirDNA之情況，每l萬個 293- 1 0細 胞之GFP陽性細胞之數目被示於表5中。使用修復效率最高 之S0nf-0 irDNA之情況，顯示修復效率為ss〇lig〇者之138 倍。 就4次獨立貫驗之Mann-Whitney之U檢定結果言之，三種 •類irDNA之修復效率與ss 〇1丨§0之修復效率相較，顯示有意 義差（ρ< 0·〇5)。又，導入轉錄因子之結合基元序列之R〇nf_〇修 lrDNA及S0nf-0 irDNA之修復效率，與R〇-〇 irDNA之修復效 率相較，顯示有意義之差（p<〇.〇5)。 表5 DNA 每104個細胞之GFP陽性細胞數 RO-O irDNA 28.19 ± 6.54個 R0nf-0 irDNA 61.02 ± 13.72個 S0nf-0 irDNA 67.58 ±20.31 個 ss Oligo 〇·49±〇·14 個 用lipofectamine導入細胞質中之“ 〇lig〇及〇_〇 irDNA為 被動擴散之形態 ’沿著濃度梯度自由擴散入核中。〇_〇 irDNA之濃度由於為ss Oligo之數目之十分之一，進入核中 之數目少’所以起初認為0-0 irDNA對於變異驗基之修復率 比ss Oligo低，但實際結果顯示比ss 〇Hg〇之修復效率高。 該結果暗示縱使0-0 irDNA進入細胞核之套數少，但由於具 -28- 86645 200411052 有高插靶活性，所以變異鹼基之修復率高。又，藉由將可 與轉錄因子結合以致能促進irDNA輸送至核内之短DNA序 列導入irDNA中，可以提高修復之效果。該irDNA25，側用 難以被核酸酶分解之甲基化核糖核苷酸或硫化去氧核糠核 苷酸修飾，效果將更為提高。 但是，在不具逆方向反覆構造且具有與標的DNA相同之 序列之單一DNA中，縱使加入NF_KB之結合基元序列，修 復效果只有逆方向反覆0>^ (0-nf_〇 irDNA)之數分之_。 又，若將二分子彼此為逆向2NF_kB之結合基元序列導入鲁 〇-〇 irDNA中央之DNA中，則修復效果為導入一分子〇nf_〇 irDNA之效果之約一半。 實施例7 具有雙重突變之GFP基因之修復。 使用在試管内突變誘發法中使用之PCR，將為gFP基因之 起始密碼子之ATG中之G變換為T。將該突變GFP (mlGFP) 基因次選殖入pCEP4中，然後轉染293細胞，確認未見到螢 光。然後使用該mlGFP基因之Hindlll-Nhel片段（-36-1 74) % 入替在貫施例1中製作之mGFP基因之上游側之Hindlll-

Nhel片段（-36-174)，以構築雙重突變GFP(dmGFP)基因。 在邊dmGFP基因中，有第三位之τ及第2〇1位之〇之二個 4異驗基’兩者相隔198個鹼基。將導入該dmGFP基因中之 760 bp Hindlll-BamHI 片段次選殖入pCEP4 之 Hindlll 與

BamHI之間’以製作做為標的核酸之質體pcep-dmGFP。

在貫驗條件為與實施例3相同之條件下，調查〇-〇 irDNA 86645 -29- 200411052 結果，顯示可於一次修 母1萬個細胞可以得到 對於雙重突變之同時修復之效率 復二個變異鹼基之GFP陽性細胞 1 5·85±2·〇〇 個。 產業上利用之可能性 :由本發明’提供一種以高效率將變異導入基因之鹼美 法。依照本發明，可以將人工的變異導入細胞内 之DNA，或者修復發生變異而無機能之基因。本發明 法可用於基因治療、失活生物f 衣作以及基因機能之解析 # 〇 序列一覽表 序列編號1 ··編碼紅轉綠螢光蛋白質之美因 序列編號2 :用於增幅編碼紅轉绛

知、、求赏先蛋白質之基因之PCF 引子 Us-EcoRI。 序列編號3 : 用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋 引子DEND。

白質之基因之PCR 白質之基因之PCR 白質之基因之一部 序列編號4 ·用於增幅編碼紅轉綠勞光蛋 引子 Us-HindIII。 序列編號5 ·用於增幅編瑪紅轉綠營光疋 份之 PCR 弓I 子 UlOOHindlll 〇 序列編號6 :用於增幅編碼紅轅蛑烛 和、、、眾赏先蛋白質之基因之一部 份之 PCR 引子 DlOOBamHl 〇 序列編號7 ·用於增幅編碼紅轉蜂恶止

才、夺贡先蛋白質之基因之PCR 引子 Us-EcoRI-l。 序列編號8 :用於增幅編石馬紅轉绛馨伞

耔、、、录霄先蛋白質之基因之PCR 86645 '30- 200411052 引子 Us-HindIII-1。 序列編號9 :用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之一部 份之 PCR 弓I 子 U100HindIII-l。 序列編號10 :嵌合募核苷酸SS Oligo。”核苷酸1至4及50至 53為2’-0-曱基尿苷 序列編號11 :用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之一 部份之PCR引子RNA-ecoRI。’’核苷酸1至6為2、〇-曱基核糖 核苷酸一其他核苷酸為去氧核糖核苷酸π。 序列編號1 2 :用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之一 部份之PCR引子RNA-hindIII。’’核苷酸1至6為2’-〇-曱基核糖 核苷酸一其他核苷酸為去氧核糖核苷酸”。 序列編號1 4 :用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之一 部份之PCR引子GFP-kBl。 序列編號1 5 :用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之一 部份之PCR引子GFP-kB2。 序列編號16 :用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之一 部份之PCR引子GFP-kB3。 【圖式簡單說明】 圖1 A-1 C :在本發明中製作之具有逆方向反覆序列之質體 之模式圖。 86645 200411052 序列表 <110〉日商寶生物股份有限公司 <12〇>對標的核酸導入變異之方法 <130〉 <140〉 092118857 <141〉2003-07-10 <150〉 IP 2002-204887 <151〉 2002-07-12 <150〉 JP 2003-113534 <151〉 2003-04-18 <160〉 16 〈170> Patentln Ver. 2. 1 <210> 1 <211〉 720 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列之說明··編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因。 <400〉 1 atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60 86645 200411052 ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120 ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca 180 ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa 240 cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc 300 ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360 gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggaaacat tctgggacac 420 aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480 ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540 gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600 tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660 cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga 720 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白 之PCR 引子Us-EcoRI。 、 土 <400〉 2 cttgaattcg gtaccgagct cggatcgggc gcgcaagaaa <210〉 3 <211> 20 86645 .ο. 200411052 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之PCR引子DEND。 <400〉 3 cactggcggc cgttactagt 20 <210〉 4 <211> 40 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之PCR引子Us-HindIII。 <400> 4 cttaagcttg gtaccgagct cggatcgggc gcgcaagaaa 40 <210〉 5 <211> 40 <212〉 DNA <213〉人造序列 86645 <220〉 <220〉200411052 〈223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之

之一部分之PCR引子UlOOHindlll。 、土 U <400> 5 ctaagcttct ggcaaactgc ctgttccatg gccaacacta 40 <210〉 6 <211〉 40 <212〉 DNA <213>人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部分之PCR引子DIOOBamHI。 、 土 <400〉 6 tcggatccaa gtcatgccgt ttcatatgat ccgggtatct 40 <210〉 7 <211> 37 <212〉 DNA <213>人造序列 86645 • 4- <220〉 <220〉200411052 <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之 PCR 引子 Us-EcoRI-1。 ' <400> 7 gaattcggta ccgagctcgg atcgggcgcg caagaaa 37 <210〉 8 <211〉 37 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之 PCR 引子 Us-HindIII-卜 <400〉 8 aagcttggta ccgagctcgg atcgggcgcg caagaaa 37 <210〉 9 <211〉 38 <212〉 DNA 〈213〉人造序列 86645 <220〉 200411052 〈223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部分之PCR引子UlOOHindlll-卜 、土 <400> 9 aagcttctgg caaactgcct gttccatggc caacacta 38 <210〉 10 <211> 54 <212〉 DNA <213>人造序列 <220〉 <221>修飾之鹼基 <222> (1)..(4) <223> um <220〉<221〉修飾之鹼基 <222〉 （50)·· (53) <223> um 〈220〉 <223>人造序列之說明：嵌合寡核苷酸ss〇ng0。 <400> 10 uuuuatcttg aaaagcattg aacaccatag cacagagtag tgactagtgu uuut 54 86645 200411052 <210> 11 <211〉 35 <212〉 DNA <213〉人造序列 〈223〉人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部份之PCR引子RNA-ecoRI。”核苷酸1至6為2、〇广 甲基核糖核苷酸一其他核苷酸為去氧核糖核苷酸”。 <400〉 11 gaauucggta ccgagctcgg atcgggcgcg caaga <210〉 12 、

<211〉 35 <212〉 DNA 〈213〉人^造序^歹丨J <220> <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部份之PCR引子RNA-hindIII。’，核苷酸!至6為 甲基核糖核普酸一其他核普酸為去氧核糖核苦酸”。 <400> 12 aagcuuggta ccgagctcgg atcgggagag caaga 86645 -7- 200411052 <210〉 13 <211〉 30 <212> DNA <213〉人類 <400〉 13 gattgcttta gcttggaaat tccggagctg 30 <210〉 14 <211〉 40 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部分之PCR引子GFP-kBl。 <400> 14 agctaaagca atctcagttg tacagttcat ccatgccatg <210〉 15 <211〉 40 <212> DNA <213〉人造序列 86645 200411052 <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光 之一部分之PCR引子GFP-kB2。 白貝之暴口 <400> 15 tccggaattt ccaagctaaa gcaatctcag ttgtacagtt <210> 16 <211〉 40 <212〉 DNA <213〉人造序列 <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋 之一部分之PCR引子GFP-kB3。 貝之基因 <400〉 16 ttttggatcc cagctccgga atttccaagc taaagcaatc 86645 -9-

Claims (1)

1. 200411052 拾、申請專利範圍： 1 · 一種將變異導入標的核酸之方法，其為將變異導入標的 核酸之鹼基序列之方法，其特徵為包含： (1) 調製具有逆方向反覆序列之DNA之步驟，其中該具 有逆方向反覆序列之DNA之驗基序列具有與標的核 酸同源，且含欲導入標的核酸中之變異之鹼基序列 ;以及 (2) 將上述具有逆方向反覆序列之DNA導入細胞内之步 驟。 2·如申請專利範圍第1項之將變異導入標的核酸之方法， 其中該具有逆方向反覆序列之DNA具有針對含核定位 信號（nclear localization signal)之蛋白質之結合基元序 列（binding motif sequence) 〇 3 ·如申請專利範圍第2項之將變異導入標的核酸之方法， 其中該針對含核定位信號之蛋白質之結合基元序列為 針對轉錄因子之結合基元序列。 4·如申請專利範圍第1項之將變異導入標的核酸之方法， 其中該具有逆方向反覆序列之DN A具有經修飾之核酸 驗基。 5 ·如申請專利範圍第1項之將變異導入標的核酸之方法， 其中該具有逆方向反覆序列之DNA為雙股DNA。 6.如申請專利範圍第1項之將變異導.入標的核酸之方法， 其中該具有逆方向反覆序列之DNA為單股DNA。 7 •如申請專利範圍第1項之將變異導入標的核酸之方法， 86645 200411°52 其中該標的核酸為存在於細胞質中之核酸。 8. 如申请專利範圍第1項之將變異導入標的核酸之方法， 其中该標的核酸為存在於核中之核酸。 9. 如申請專利範圍第1項之將變異導入標的核酸之方法， 其中將複數個變異同時導入標的核酸中。 i〇·如申請專利範圍第1項之將變異導入標的核酸之方法， 其中導入標的核酸中之變異為鹼基之取代、缺失及/或 插入。 i i •一種套組’其為藉由申請專利範圍第1項之方法將變異· 導入標的核酸用之套組，其特徵為含有具逆方向反覆序 列之DNA ’該DNA具有與標的核酸同源且含欲導入標的 核酸之變異的驗基序列。 12. 如申請專利範圍第11項之套組，其中該具有逆方向反覆 序列之D N A具有針對含核定位信號之蛋白質之結合基 元序列（binding motif sequence)。 13. 如申請專利範圍第12項之套組，其中該針對含核定位信 號之蛋白質之結合基元序列為針對轉錄因子之結合基· 元序列。 14·如申請專利範圍第叫之套組，其中該具有逆方向反覆 序列之DNA具有經修飾之核酸鹼基。 1 5.如申請專利範圍第i i項之套組，其中該具有逆方向反覆 序列之DNA為雙股DNA。 16.如中請專利範圍第⑴頁之套組，其中該具有逆方向反覆 序列之DNA為單股DNA。 86645