TR201807750T4 - Anti-TIM-3 antikoru. - Google Patents

Anti-TIM-3 antikoru. Download PDF

Info

Publication number
TR201807750T4
TR201807750T4 TR2018/07750T TR201807750T TR201807750T4 TR 201807750 T4 TR201807750 T4 TR 201807750T4 TR 2018/07750 T TR2018/07750 T TR 2018/07750T TR 201807750 T TR201807750 T TR 201807750T TR 201807750 T4 TR201807750 T4 TR 201807750T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
tim
leu
human
amino acid
Prior art date
Application number
TR2018/07750T
Other languages
English (en)
Inventor
Takayanagi Shin-Ichiro
Tomura Hitomi
Tawara Tomonori
Inagaki Yoshimasa
Kubota Tsuguo
Akashi Koichi
Kikushige Yoshikane
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Univ Kyushu Nat Univ Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd, Univ Kyushu Nat Univ Corp filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Publication of TR201807750T4 publication Critical patent/TR201807750T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, molekül-3?ü (bundan sonra "TIM-3" olarak atıfta bulunulur) içeren ve antikora bağımlı hücresel sitotoksisite (bundan sonra "ADCC" olarak atıfta bulunulur) sergileyen T-hücre immünoglobulin ve musin bölgesinin hücre dışı alanına bağlanan bir monoklonal antikor; antikoru kodlayan bir DNA; DNA?yı içeren bir vektör; vektörün dönüştürülmesiyle elde edilen bir transformant; transformant kullanılarak bir antikor veya bunun bir antikor fragmanını üretmeye yönelik bir işlem; bir beşeri TIM-3?ü immünolojik olarak saptamak veya ölçmek için bir in vitro usul; ve bir beşeri TIM-3 pozitif hücreyle ilgili bir kanseri tedavi etmede kullanım için bir monoklonal antikora ilişkindir.

Description

TARIFNAME ANTI-TIM-3 ANTIKORU Teknik Alan Mevcut bulus, molekül-?ü (bundan sonra "TIM-3" olarak atifta bulunulur) içeren ve antikora bagimli hücresel sitotoksisite (bundan sonra "ADCC" olarak atiita bulunulur) sergileyen T- hücre immünoglobulin ve musin bölgesinin hücre disi alanina baglanan bir monoklonal antikor; antikoru kodlayan bir DNA; DNAlyi içeren bir vektör; vektörün dönüstürülmesiyle elde edilen bir transformant; transformantin kullanildigi bir antikor veya bunun bir antikor fragmanini üretmeye yönelik bir islein; bir beseri TIM-?ü immünolojik olarak saptamak veya ölçmek için bir in vitro usul; ve bir beseri TIM-3 pozitif hücreyle ilgili bir kanseri tedavi etmede kullanim için bir monoklonal antikora iliskindir.
Bulusla ilgili Bilinen Hususlar TIM-3 gen ailesi farede sekiz gen ve insanda üç genden olusur, ve bu genlerin her biri sirasiyla kromozom 11 ve kromozom 5q33”te (Patent olmayan doküman 1) bulunur. Bu gen alanlarinin, otoimmün hastaliklar ve alerjik hastaliklarla ilgili oldugu bilinmektedir. TIM protein, bir yapisal olarak korunmus immünoglobulin degisken (IgV) bölgesi ve bir musin bölgesine sahip bir tip I transmembran proteinidir.
TIM proteininin, T hücreler üzerinde spesifik olarak eksprese edilecegi ve T hücre aktivitesini dogrudan düzenleyecegi kabul edilmistir, fakat antijen-sunucu hücrelerde TIM-3 proteininin ekspresyonu üzerine ve bunlarin fonksiyonlari üzerine (Patent olmayan doküman 2) yakin zamandaki raporlar mevcuttur. Kristal yapi analizine göre, TIM protein, bir korunmus protein yapisina sahiptir ve [gV bölgede bir liganda sahiptir.
TIM-3, fare Thl hücrelerinde spesifik olarak eksprese edilen bir molekül olarak tanimlanmistir, fakat Th2 hücrelerinde tanimlanmamistir (Patent olmayan doküinan 3). TIM- 3°ün DNA dizisi, amino asit dizisi ve üç-boyutlu yapisi GenBank erisim numarasi HAVCR2 olarak bilinmektedir.
Insanlarda, farelere benzer sekilde, TIM-3, T-hücrelerde ayni zamanda fagositik hücrelerde, Örnegin makrofajlar ve dendritik hücrelerde eksprese edilir. TlM-3°ün bir protein ligandina (örnegin, galektin-9) baglanmasi, apoptoz baslatma mekanizmasiyla Thl yanitini inhibe edebilir, ve dolayisiyla, örnegin, periferal toleransin baslatilmasina yol açabilir.
Beseri TIM-3iün siRNA ile ekspresyonunda azalma veya bloke edici antikorla beseri TIM- 3”ün inhibisyonu, CD4 pozitif T-hücrelerden interferon y (lFN-y) salgilanmasini arttirdi, bu, TIM-3 in beseri T hücrelerde inhibisyon yapan rolünü desteklemektedir. Fagositlerde, TIM-3 ayrica apoptoz hücrelerini tanimak için bir reseptör olarak fonksiyon gösterir.
Otoimmün hastaligi olan hastalardan klinik numunelerin analizi, CD4 pozitif hücrelerinde hiç TIM-3 ekspresyonu göstermedi. Özellikle, inultipl sklerozlu hastalarin serebrospinal sivisindan elde edilen T hücre klonlarinda, TIM-?Yün ekspresyon seviyesi daha düsüktü ve lFN-y”nin salgilanma seviyesi, normal saglikli insanlardan elde edilen klonlarinkinden daha yüksekti (Patent olmayan doküman 4). Alerjik hastaliklari veya astimi olan TIM-3 ile ilgili raporlar vardir (Patent Dokümanlari 1 ve 2).
Akut miyeloid lösemili (bundan sonra "AML" olarak atifta bulunulur) hastalardan hematopoietik kök hücrelerin ve normal hematopoietik kök hücrelerin mikrodiziliin analizine göre, TIM-3, AML kök hücreleri üzerinde eksprese edilir ve dolayisiyla analiz, hematolojik malignitede, TIM-37ün katilimini önerir (Patent olmayan doküman 5 ve Patent Dokümani 3).
Simdiye kadar olusturulan anti-TlM-3 monoklonal antikorlarin örnekleri arasinda anti-beseri TIM-3 siçan monoklonal antikoru (Klon 344823, R&D Systems tarafindan iinal edilir) ve anti-beseri TIM-3 fare monoklonal antikoru (Klon F38-2E2, R&D Systems tarafindan imal edilir) yer alir.
Patent Literatürü 4,de TIM-3 modülatörlerinin terapötik kullanimlari açiklanmaktadir.
Patent Literatürü 53te bir antijen ve bir TIM hedeIleme molekülü içeren bilesimler, ve bir antijen ve bir TIM hedefleme molekülünün uygulanmasiyla bir immün yanitin uyarilmasi usulleri açiklanmaktadir.
Ilgili Saha Patent Literatürü Patent olmayan Literatür Patent olmayan Literatür 5 Majeti R ve digerleri, Proc Natl Acad Sci ABD 2009 Mar 3; 106 (9): 3396-401.
Bulusun Açiklamasi Bulusla Çözülecek Sorunlar Ancak ADCC aktivitesine sahip beseri TIM-3,6 karsi monoklonal antikor üzerine hiçbir rapor yoktur. Dolayisiyla, mevcut bulusun amaci, TIM-?ün hücre disi alaninin amino asit dizisine veya üç-boyutlu yapisina baglanan ve ADCC aktivitesini eksprese eden bir monoklonal antikor veya bir antikor fragmani sunmaktir. Ilaveten, mevcut bulusun amaci, monoklonal antikor veya bunun antikor fragmaniyla rekabete giren bir anti-beseri TIM-3 antikorun taranmasiyla yüksek ADCC aktivitesine sahip bir anti-beseri TIM-3 antikorunu sunmaktir.
Ilaveten, mevcut bulus, antikoru üreten bir hibridom; antikoru kodlayan bir DNA; DNA'yi içeren bir vektör; vektörün dönüstürülmesiyle elde edilen bir transformant; hibridom veya transformant kullanilarak bir antikor veya bunun bir antikor fragmanini üretmeye yönelik bir islem; ve bir aktif bilesen olarak antikor veya bunun antikor fragmaninin kullanildigi bir tani maddesi veya bir terapötik madde sunmak içindir.
Sorunlari çözmek için Yollar Mevcut bulusun özü asagidakilerle ilgilidir. (1) beseri TIM-37ün bir hücre disi alanina baglanan bir monoklonal antikor veya bunun bir antikor fragmani, burada antikor ADCC aktivitesi sergiler ve DIZI TANIM NO: 8'in amino asitleri 20 ila 140 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren bir antikorun VH7sini içeren ve DIZI TANIM NO: lO°un amino asitleri 21 ila 127 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren bir antikorun VL”sini içeren bir monoklonal antikordur . (2) bir rekombinant antikor olan yukarida (l),de açiklanan monoklonal antikor. (3) yukarida (1) veya (2)”de açiklanan monoklonal antikoru kodlayan bir DNA. (4) yukarida (3)7te açiklanan DNA”yi içeren bir rekombinant vektör. (5) yukarida (4)°te açiklanan rekombinant vektörün, bir konakçi hücreye katilmasiyla elde edilebilen, yukarida (1) veya (2)”de açiklanan monoklonal antikoru dengeli sekilde eksprese eden bir hücre olan bir transformant. (6) yukarida (1) veya (2),de açiklanan monoklonal antikorun olusturulmasi ve biriktirilmesi için kültürde yukarida (5),te açiklanan transformantin kültürlenmesini, ve kültürden monoklonal antikorun veya bunun antikor fragmaninm geri kazanilmasini içeren yukarida (1) veya (2)”de açiklanan monoklonal antikoru üretmeye yönelik bir islem. (7) yukarida (1) veya (2)”de açiklanan monoklonal antikorun kullanilmasini içeren bir beseri TIM-37ü immünolojik olarak saptamak veya ölçmek için bir in vitro usul. (8) bir beseri TIM-3 pozitif hücreyle ilgili bir hastalik için bir terapi usulünde kullanim için yukarida (1) veya (2)”de açiklanan monoklonal antikor, söz konusu hastalik bir kanserdir.
Bulusun Etkileri Mevcut bulusun monoklonal antikoru, beseri TIM-3`ün hücre disi alaninin amino asit dizisi veya üç-boyutlu yapisini spesifik olarak tanir, ve hücre disi alana baglanir. Mevcut bulusun monoklonal antikoruyla taninan beseri TIM-yün hücre disi alaninin amino asit dizisi veya üç-boyutlu yapisi, bilinen anti-TIM-3 monoklonal antikorlarla taninanlardan farklidir.
Dolayisiyla, mevcut bulusun monoklonal antikoni, daha yüksek ADCC aktivitesine sahiptir.
Beseri TIM-Siün hücre disi alanina spesifik olarak baglanan ve daha yüksek ADCC aktivitesine sahip olan mevcut bulusun inonoklonal antikoru, bir beseri TIM-3 pozitif hücreyle ilgili bir hastalik için bir terapötik madde ve bir tani maddesi olarak yararlidir.
Mevcut bulus, antikoru kodlayan bir DNA; DNA,yi içeren bir vektör; vektörün dönüstürülmesiyle elde edilen bir transformant; transformantin kullanildigi bir antikor üretmek için bir islem; antikorun kullanildigi bir in vitro tani usulü; ve bir terapi usulünde kullanim için antikor sunabilir. Çizimlerin Kisa Açiklamasi HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HVlO, ve HV12”sini temsil eden amino asit dizileridir.
LV5, LV6, LV7, ve LV9iunu temsil eden amino asit dizileridir.
Bulusu gerçeklestirmek için Düzenlemeler Beseri TIM-3 DIZI TANIM NO: 53 veya NCBl Erisim No. NM_O32782 ile temsil edilen ve bir TIM-3 fonksiyonuna sahip amino asit dizisini içeren bir polipeptit; DIZI TANIM NO: 53 veya NCBI Erisim No. NMý032782 ile temsil edilen ve bir TIM-3 fonksiyonuna sahip amino asit dizisiyle, en az %60 homoloji, tercihen en az %80 homoloji, daha tercih edilen haliyle en az %90 homoloji, ve en tercih edilen haliyle en az %95 homolojiye sahip bir amino asit dizisi içeren bir polipeptit, ve benzerlerini içerir.
Bir amino asit dizisi içeren polipeptit; burada bir veya daha fazla amino asit kalinti çikarilir, ikame edilir ve/veya DIZI TANIM NO: 53 veya NCBI Erisim No. NM_O32782 ile temsil edilen amino asit dizisine ilave edilir, örnegin, bir alana yönelik mutasyonun, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ikinci baski (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, , Gene, 34, 315 (, veya benzerlerinde açiklanan alana yönelik mutagenezle DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen amino asit dizisi içeren polipeptidi kodlayan DNA°ya katilimiyla elde edilebilir. Çikarilan, ikame edilen veya ilave edilen amino asit kalintilarin sayisi özellikle sinirli degildir, ve sayi tercihen, 1 ila birkaç düzine, örnegin 1 ila 20, ve daha tercih edilen haliyle 1 ila muhtelif sayilar, örnegin 1 ila 5 arasindadir.
Beseri TIM-yü kodlayan bir gen olarak, örnekler arasinda DIZI TANIM NO: 52 veya NCBI Erisiin No. NM_032782 ile temsil edilen nükleotid dizi yer alir. Örnekler arasinda ayrica en az bir nükleotidin çikarildigi, ikame edildigi veya DIZI TANIM NO: 52 veya NCBI Erisim No. NM_032782 ile temsil edilen nükleotid diziye ilave edildigi bir nükleotid dizi içeren ve bir TIM-3 fonksiyonuna sahip bir polipeptidi kodlayan bir DNA içeren bir gen; DIZI TANIM homoloji, tercihen en az %80 homoloji, ve daha tercih edilen haliyle en az %95 homolojiye sahip bir nükleotid dizi içeren ve bir TIM-3 fonksiyonuna sahip bir polipeptidi kodlayan bir DNA içeren bir gen; siki kosullar altinda DIZI TANIM NO: 52 veya NCBI Erisim No.
NM_032782 ile temsil edilen nükleotid diziden olusan DNA'yla melezlesen ve bir TIM-3 fonksiyonuna sahip bir polipeptidi kodlayan bir gen; ve benzerleri yer alir.
Siki kosullar altinda melezlesen DNA ile bir prob olarak DIZI TANIM NO: 52 veya NCBI Erisiin No. NM_032782 ile temsil edilen nükleotid diziden olusan bir DNA kullanilarak koloni melezlesmesi, plak melezlesmesi, Southern blot melezlesmesi, DNA mikrodizilim analizi, veya benzerleriyle elde edilebilen bir DNAlya atifta bulunulabilir.
Bu tür DNA°nin spesifik bir örnegi, koloniden- veya plaktan türetilen DNA, PCR ürünleri veya bunun üzerine immobilize edilen DNA dizisini kodlayan oligo DNA ile bir filtre veya bir lam kullanilarak 0.7 ila 1.0 mol/L sodyum klorür varliginda 65°C'de melezlesmenin gerçeklestirilmesiyle, ve ardindan filtrenin veya bir lamin 65°C,de bir 0.] ila 2-kat konsantrasyonlu SSC çözeltisi (l-kat konsantrasyonlu SSC çözeltisi: 150 mmol/L sodyum klorür ve 15 mmol/L sodyum sitrat) ile yikanmasiyla tanimlanabilen bir DNA,dir.
Melezlesme Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ikinci baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987- 1997); DNA Clom'rig 1.' Core Techniques, A Practical Approach, Ikinci baski, Oxford University (1995); ve benzerlerinde açiklanan usullere göre gerçeklestirilebilir.
Spesifik olarak, melezlesebilen DNA, DIZI TANIM NO: 52 veya NCBI Erisim No.
NM_O32782 ile temsil edilen nükleotid diziye en az %60 veya daha fazla homoloji, tercihen sahip DNA içerir.
Bir ökaryotun bir proteinini kodlayan genin nükleotid dizisinde, genetik polimorfizm çogu kez bilinir. TIM-3 geni ayrica küçük modifikasyonun bu tür polimorfizmle nükleotid dizide Homoloji sayisi baska türlü belirtilmedikçe uzman kisi tarafindan bilinen bir homoloji arastirma programi kullanilarak hesaplanan bir sayi olabilir. Nükleotid diziyle ilgili olarak, kullanilarak hesaplanabilir, ve amino asit dizisiyle ilgili, sayi, BLAST2 [Nucleic Acids Res., http://WWW.ncbi.n1m.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html] veya benzerlerinde varsayilan bir parametre kullanilarak hesaplanabilir, Varsayilan parameter olarak, G (araligi açmak için maliyet), nükleotid dizi için 5 ve amino l°dir; -e (beklenen deger) 10,dur; -W (sözcük uzunlugu) nükleotid dizi için 11 kalinti ve amino asit dizisi için 3 kalintidir; -y (bit olarak blast uzantilar için azalma (X)) blastn için 20 ve blastn disindan bir program için Tüm -X (bit olarak aralikli hizalama için X azalmasi degeri) 157tir; ve Z (bit olarak aralikli hizalama için nihai X azalmasi degeri) blastn için 50 ve blastn disinda bir program için 25 ,tir (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/html/blastcgihelphtml).
DIZI TANIM NO: 53 veya NCBI Erisim No. NM_032782 ile temsil edilen amino asit dizisinin bir kismi dizisini içeren polipeptit, uzman kisi tarafindan bilinen bir usule göre hesaplanabilir. Örnegin, bu, DIZI TANIM NO: 52 ile temsil edilen amino asit dizisini kodlayan DNA°nin bir parçasinin çikarilmasiyla ve DNA içeren bir ekspresyon vektörününün katildigi bir transformantin kültürlenmesiyle hesaplanabilir.
Ayrica, bu sekilde hazirlanan polipeptit veya DNA baz alinarak, bir veya daha fazla amino asidin çikarildigi, ikame edildigi veya DIZI TANIM NO: 53 veya NCBI Erisim No.
NM_O32782 ile temsil edilen amino asit dizisinin bir kismi dizisine ilave edildigi bir ainino asit dizisini içeren bir polipeptit yukarida açiklandigi gibi ayni sekilde hesaplanabilir.
DIZI TANIM NO: 53 veya NCBI Erisim No. NM_032782 ile temsil edilen amino asit edildigi veya DIZI TANIM NO: 53 veya NCBI Erisim No. NM_032782 ile temsil edilen amino asit dizisinin bir kismi dizisine ilave edildigi bir ainino asit dizisi içeren polipeptit ayrica bir kimyasal sentez usulüyle, örnegin tluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) usulü veya t- butiloksikarbonil (tBoc) usulüyle üretilebilir.
Mevcut bulusun beseri TIM-37ünün hücre disi alani, örnegin, geleneksel olarak bilinen transmembran alan tahmin programi SOSUI (http://bp.nuap.nag0ya- u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html), TMHMM ver. 2 (http://WWW.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), ExPASy Proteomics Sunucusu (http://Ca.expasy.org/) veya SMART (http:/,›-"sinart.embl-heidelberg.de/) ile DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen polipeptidin amino asit dizisinin kullanilmasiyla tahmin edilen alanlari içerir.
Beseri TlM-3iün hücre disi alaninin amino asit dizisi, SMART ile tahmin edilen hücre disi alanin alani olan, DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen amino asit dizisinde pozisyonlar 1 ila 201 ,deki amino asit dizisini içerir.
Beseri TIM-3”ün hücre disi alaninin üç-boyutlu yapisi, DIZI TANIM NO: 53 veya GenBank hücre disi alani, dogal halde oldugu gibi ayni yapiya sahip sahip oldugu sürece sinirli degildir. Dogal haldeki beseri TIM-yün hücre disi alaninin üç-boyutlu yapisi, hücre membrani yüzeyinde eksprese edilen beseri TIM-3 ,ün üç-boyutlu yapisinin bir dogal tipidir.
Beseri TIM-3”ün fonksiyonuyla ilgili olarak, TlM-3”ün bir protein ligandiyla (örnegin, galektin 9) baglanmasi, Thl yanitini, Thl hücrelerinde apoptoz baslatma gibi mekaniziriayla inhibe edebilir, dolayisiyla bu da periferal toleransin baslamasina yol açabilir. Fagositlerde, beseri TIM-3, apoptoz hücrelerini tanimak için bir reseptör olarak fonksiyon gösterir.
Mevcut bulusta antikorun, beseri TIM-3iün bir hücre disi alaninin bir amino asit dizisine veya bunun bir üç-boyutlu yapisina baglanmasi, beseri TIM-?ü eksprese eden hücreler kullanilarak geleneksel olarak bilinen bir immünolojik saptaina usulüyle, örnegin bir kati faz sandviç usulüyle bir radyoimmün analizi veya enzime-bagli immünosorban analizi (ELISA) , ve tercihen belirli bir antijeni eksprese eden bir hücrenin ve spesifik antijen için bir antikorun baglanabilme özelliginin dogrulandigi bir floresan hücre boyama usulüyle dogrulanabilir.
Spesifik örnekler arasinda bir FMATSIOOHTS Sistemi (Applied Biosystems tarafindan imal edilir) [Cancer lmmunol. lmmunother., 36, 373 (1993)] veya benzerlerinin kullanildigi bir tloresan antikor boyama usulü, akis sitometrisinin kullanildigi bir tloresan hücre boyama usulü, bir Biacore Sisteminin (GE Healthcare tarafindan imal edilir) veya benzerlerinin kullanildigi yüzey plazmon rezonansi, ve benzerleri yer alir.
Bundan baska, bilinen bir immünolojik saptama usulü [Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Üçüncü baski, Academic Press (1996), Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experimental Manual, Kodan-sha Scientific (1987)] ve benzerleri baglanmayi dogrulamak için birlestirilebilir.
Beseri TIM-3”ü eksprese eden hücre, beseri TIM-3`ü eksprese ettigi sürece, herhangi bir hücre olabilir, ve örnekler arasinda insan vücudunda dogal olarak bulunan bir hücre, insan vücudunda dogal olarak bulunan hücreden olusturulan bir hücre hatti, bir rekombinant teknigi ve benzerleriyle elde edilen bir hücre yer alir.
Insan vücudunda dogal olarak bulunan hücrenin örnekleri arasinda kanser, otoimmün hastalik veya alerjik hastaliktan muzdarip bir hastanin vücudunda TIM-yü eksprese eden bir hücre yer alir, somut olarak, hücreler, Thl hücreleri, makrofajlar, dendritik hücreler, ve benzerleridir.
Insan vücudunda dogal olarak bulunan hücreden olusturulan bir hücre hattinin örnekleri arasinda yukaridaki kanser hastalarindan elde edilen beseri TIM-3-eksprese edici hücrelerim olustuiulmasiyla hazirlanan hücre hatlari arasinda beseri TIM-3°ü eksprese eden bir hücre hatti yer alir, ve örnekler arasinda bir beseri hücreden olusturulan beseri akut miyeloid lösemi hücre hatti KG-l (ATCC Erisim No: CCL-246), beseri Burkitt lenfoma hücre hatti Daudi (ATCC Erisim No: CCL-213) ve benzerleri yer alir.
Bir rekombinant teknigiyle elde edilen hücrenin spesifik örnekleri arasinda bir beseri TIM- 3iü kodlayan cDNA'yi içeren bir ekspresyon vektörününo bir böcek hücresi, bir hayvan hücresi veya benzerlerine katilimiyla elde edilen bir beseri TIM-?Wii eksprese edici hücre, ve digerleri yer alabilir.
Mevcut bulus, beseri TIM-?ün bir hücre disi alaninin bir amino asit dizisini veya bir üç- boyutlu yapisini taniyan ve ADCC aktivitesi sergileyen bir monoklonal antikorla ilgilidir.
Mevcut bulusun ADCC aktivitesi, hücre yüzeyi üzerinde beseri TlM-3”e baglanan bir antikorun çogunlukla Fc alaniyla bir dogal öldürücü hücrenin yüzeyi üzerinde FcyRIIIa,ya baglandigi (bundan sonra NK hücre olarak atifta bulunulur) bir reaksiyondur ve dolayisiyla bir sitotoksin molekülü, örnegin moleküller perforin ve bir NK hücreden salinan granzim, hücre lizizine yol açar [Clark M, Chemical Immunology, 65, 88 (1997); Gorter A ve digerleri, Immunol. Today, 20, 576 (1999)].
Mevcut bulusun antikoru, beseri TIM-yün bir hücre disi alanina baglar ve ADCC aktivitesine sahiptir. Bulusun antikoru, beseri TIM-37ün bir hücre disi alaninin bir amino asit dizisini veya bunun bir üç-boyutlu yapisini tanir.
Mevcut bulusun antikoru, DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen dizide pozisyonlar 1 ila 201”deki diziyi içeren beseri TIM-yün hücre disi alaninin amino asit dizisi veya bunun üç- boyutlu yapisi arasinda tercihen pozisyonlar 67 ila 105”te, daha tercih edilen haliyle pozisyonlar 67 ila 96”da, ve en tercih edilen haliyle pozisyonlar 67 ila 87'deki dizilerden seçilen amino asit dizisine baglanabilir.
Monoklonal antikor sirasiyla DIZI TANIM NO: 1 ila 3 ile temsil edilen amino asit dizilerini içeren tamamlayici belirleyici alanlar (bundan sonra "CDR" olarak atifta bulunulur) 1 ila 3”ü içeren bir antikorun bir agir zincirini (bundan sonra "H zinciri" olarak atifta bulunulur) bir agir zincir (bundan sonra "H zinciri" olarak atifta bulunulur), ve sirasiyla DIZI TANIM NO: 4 ila 6 ile temsil edilen amino asit dizilerini içeren CDRs 1 ila 3°ü içeren bir antikorun bir hafif zincirini (bundan sonra "L zinciri" olarak atifta bulunulur) içerir.
Monoklonal antikor, DIZI TANIM NO: 8'in amino asitleri 20 ila 140 ile temsil edilen ainino asit dizisini içeren bir antikorun VHiini içeren ve DIZI TANIM NO: lOiun ainino asitleri 21 ila 127 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren bir antikor içeren VL içeren bir monoklonal Mevcut bulusun monoklonal antikoru, bir hibridomla üretilen bir antikor ve antikoru kodlayan bir gen içeren bir ekspresyon vektöiüyle dönüstürülen bir transformantla üretilen bir rekombinant antikor içerir.
Monoklonal antikor, bir tek klon antikor üreten hücreyle salgilanan bir antikordur, ve sadece bir epitopu (ayrica antijen belirleyici olarak adlandirilir) tanir ve tek düze amino asit dizisine (primer yapi) sahiptir.
Epitopun örnekleri arasinda bir monoklonal antikor ile taninan ve baglanan, bir tek amino asit dizisi, bir seker zincirine bagli amino asit dizisi içeren bir üç-boyutlu yapi, ve benzerleri yer Mevcut bulusun monoklonal antikoru tercihen DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen beseri TIM-3”ün hücre disi alanlarinda beseri TIM-3'ün IgV bölgesinin pozisyonlar 22 ila l3l”de amino asit dizisine baglanir. Spesifik olarak, mevcut bulusun monoklonal antikorunun baglandigi amino asit dizisi tercihen DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen amino asit dizisinde pozisyonlar 67 ila 105°te amino asit dizisi, daha tercih edilen haliyle pozisyonlar 67 ila 96”da amino asit dizisi, ve en tercih edilen haliyle pozisyonlar 67 ila 87ide amino asit Mevcut bulusun monoklonal antikorunun baglandigi epitop may tercihen DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen beseri TIM-3°ün hücre disi alaninda pozisyonlar 22 ila 13 1 ”de amino asit dizisiyle temsil edilen beseri TIM-?ün IgV bölgesine dahil edilebilir. Spesifik olarak, mevcut bulusun monoklonal antikorunun baglandigi epitop, DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen amino asit dizisinde, tercihen pozisyonlar 67 ila 105'te amino asit dizisine dahil edilebilir, daha tercih edilen haliyle i pozisyonlar 67 ila 96,da amino asit dizisine dahil edilebilir, ve en tercih edilen haliyle pozisyonlar 67 ila 873de amino asit dizisine dahil edilebilir.
Mevcut bulusun monoklonal antikorunun baglandigi epitopun amino asit dizisi tercihen beseri TIM-3'ün IgV bölgesinde DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen amino asit dizisinde pozisyonlar 67 ila 87,de amino asit dizisinden seçilen en az bir amino asit içerebilir, ve daha pozisyon 81, pozisyon 83 ve pozisyon 85ste amino asitlerden seçilen en az bir amino asit içerebilir.
Mevcut bulusun monoklonal antikorunun baglandigi epitopun amino asit dizisi tercihen beseri TIM-3 IgV bölgesinin pozisyonlar 67 ila 87,den seçilen en az iki veya daha fazla sürekli amino asitler içerebilir; ve daha tercih edilen haliyle DIZI TANIM NO: 53 ile temsil pozisyon 81, pozisyon 83 ve pozisyon 85,te amino asitlerden seçilen en az bir amino asit içerebilir ve pozisyonlar 67 ila 87,de amino asit dizisinden seçilen en az iki veya daha fazla sürekli amino asitler içerebilir.
Spesifik olarak, mevcut bulusun monoklonal antikorunun baglandigi epitopun amino asit dizisi örnekleri arasinda, DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen amino asit dizisinde, pozisyonlar 67 ila 74,te amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 67 ila 76”da amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 67 ila 78,de amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 67 ila 797da amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 67 ila 81,de amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 67 ila 83°te amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 67 ila 85lte amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 74 ila 76lda amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 74 ila 78,de amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 74 ila 79”da amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 74 ila 81 'de amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 74 ila 83,te amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 74 ila 8 5,te ainino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 76 ila 78,de amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 76 ila 79°da amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 76 ila 8l”de amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 76 ila 839de ainino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 76 ila 85 ,te amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 78 ila 79”da amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 78 ila 81°de amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 78 ila 83ite amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 78 ila 85°te amino asitler içeren ainino asit pozisyonlar 79 ila 81 “de amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 79 ila 83,te amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 79 ila 853te amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyon 81 ila 83,te amino asitler içeren ainino asit dizisi, pozisyonlar 81 ila 85*te amino asitler içeren amino asit dizisi, pozisyonlar 83 ila 857te amino asitler içeren amino asit dizisi, ve benzerleri yer alir.
Hibridom, örnegin, bir antijen olarak TlM-3”ü eksprese eden yukaridaki hücrenin hazirlanmasiyla, antijenle bagisiklik kazandirilmis bir hayvandan antijen özgüllügüne sahip bir antikor üreten hücrenin indüklenmesiyle, ve antikor üreten hücrenin bir miyelom hücreyle kaynastirilmasiyla hesaplanabilir. Anti-TIM-3 antikor, hayvanda assitler tümörüne neden olmak için hibridomun kültürlenmesiyle veya hibridom hücrenin bir hayvana uygulanmasiyla ve kültürün veya assitlerin ayrilmasi ve satlastirilmasiyla elde edilebilir.
Bir antijenle bagisiklik kazandirilan hayvan, bir hibridom hesaplanabildigi, ve fare, siçan, hamster, tavuk, tavsan veya benzerleri uygun olarak kullanildigi sürece herhangi bir hayvan olabilir. Ayrica, antikor üreten aktiviteye sahip hücre, bu tür bir hayvandan elde edilebilir, ve mevcut bulusun antikoru, bir miyeloin hücreyle in vitro immünizasyondan sonra hücrenin füxzyonuyla elde edilen bir hibridomla üretilen bir antikor içerrir.
Mevcut bulusta, rekombinant antikor, gen rekombinasyonuyla üretilen bir antikoru, örnegin bir beseri antikoru içerir. Rekombinant antikorlar arasinda, bir yaygin monoklonal antikor karakterine, düsük immünojenesiteye ve kanda uzatilmis yari-ömre sahip olan, bir terapötik madde olarak tercih edilebilmektedir. Rekombinant antikorun örnekleri arasinda bir rekoinbinant teknigi kullanilarak mevcut bulusun yukaridaki monoklonal antikorunun modifiye edilinesiyle hazirlanan bir antikor yer alir.
Mevcut bulusun inonoklonal antikoru spesifik olarak beseri TIM-?ü taniyan ve hücre disi alanin bir amino asit dizisine veya bunun üç-boyutlu yapisina baglanan mevcut bulusun monoklonal antikorunun kimyasal olarak veya genetik olarak bir radyoizotopa, bir düsük moleküler agirliga sahip bir maddeye, bir yüksek moleküler agirliga sahip bir maddeye, bir proteine, bir terapötik antikora veya benzerlerine baglandigi bir antikor konjugatini içerir.
Mevcut bulusun antikor konjugati, bir radyoizotop, bir düsük moleküler agirliga sahip bir madde, bir yüksek moleküler agirliga sahip bir madde, bir adjuvan, bir protein, bir terapötik antikor veya benzerlerinin, spesifik olarak beseri TIM-yü taniyan ve hücre disi alanin bir amino asit dizisine veya bunun üç-boyutlu yapisina baglanan mevcut bulusun monoklonal antikorunun, bir H zinciri veya bir L zincirinin, yeterli sübstitüent veya yan-zincirinin, seker- zincirinin, ve benzerlerinin N-terminal tarafina veya C-terminal tarafina kimyasal olarak konjüge edilmesiyle üretilebilir [Kotai Kogaku Nyumon, Chijin Shokan (1994) tarafindan yayinlanmistir].
Ayrica, antikor konjugati spesifik olarak beseri TIM-?ü taniyan ve hücre disi alanin bir amino asit dizisine veya bunun üç-boyutlu yapisina baglanan mevcut bulusun monoklonal antikorunu kodlayan bir DNA,n1n, konjüge edilecek bir protein veya bir terapötik antikoru kodlayan baska DNA”ya baglanmasiyla, DNA°nin ekspresyon için bir vektöre yerlestirilmesiyle, ve ekspresyon vektörünün, bir uygun konakçi hücreye katilmasiyla genetik olarak üretilebilir.
Kloramin-T usulü veya benzerleriyle dogrudan antikorla konjüge edilebilir. Ayrica, radyoizotopu selatlayan bir madde, antikorla konjüge edilebilir. Selatlayici madde, 1- izotiyosiyanatobenzi ve benzerlerini Bir düsük moleküler agirliga sahip madde bir anti-tümör maddesi, örnegin bir alkilleyici madde, bir nitrozoüre maddesi, bir metabolizma antagonisti, bir antibiyotik madde, bir bitkiden üretilen bir alkaloid, bir topoizomeraz inhibitör, hormonoterapi için bir madde, bir hormon antagonisti, bir aroinataz inhibitörü, bir P glikoprotein inhibitörü, bir platin kompleks türevi, bir M-faz inhibitörü ve bir kinaz inhibitörü [Rinsho Syuyo-gaku (Clinical Oncology), Gan ila Kagakuryoho-Sha (1996)], bir steroid madde, örnegin hidrokoitizon ve prednison, bir steroidal olmayan madde, örnegin aspirin ve indometasin, immünomodülatör madde, örnegin aurotiyomalat, penisilamin, immüno-bastirici madde, örnegin siklofosfamid ve azatiyoprin, anti-enflamatuar madde, öregin anti-histamin madde, örnegin, klorfeniramin maleat ve klemastin [Ensho ila Kouensho-Ryoho (lnflammation and Anti-inflammation Therapy), lshiyaku Shuppann (1982)] ve benzerlerini içerir.
Antitümör maddesinin örnekleri arasinda amifostin (Etiyol), sisplatin, dakarbazin (DTIC), daktinomisin, mekloretamin (azot hardali), streptozosin, siklofosfamid, ifosfamid, karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), doksorubisin (adriamisin), epirubisin, gemsitabin (Gemsal), daunorubisin, prokarbazin, mitomisin, sitarabin, etoposid, metotreksat, S-Horourasil, florourasil, Vinblastin, vinkristin, bleomisin, daunomisin, peplomisin, estramustin, paklitaksel (Taksol), dosetaksel (Taksotea), aldesleukin, asparaginaz, busulfan, karboplatin, oksaliplatin, nedaplatin, kladribin, kamptotesin, 10-hidroksi-7-etilkampt0tesin (SN38), floksuridin, Iludarabin, hidroksiüre, ifosfamid, idambisin, mesna, irinotekan (CPT-ll), nogitekan, mitoksantron, topotekan, löprolid, megestrol, melfalan, merkaptopurin, hidroksikarbamid, plikamisin, mitotan, pegasparagaz, pentostatin, pipobroman, streptozosin, tamoksifen, goserelin, löprorelin, flutamid, teniposid, testolakton, tiyoguanin, tiyotepa, urasil hardal, vinorelbin, klorambusil, hidrokortizon, prednisolon, metilprednisolon, vindesin, nimustin, semustin, kapesitabin, Tomudeks, azasitidin, UFT, oksaliplatin, gefitinib (Iressa), imatinib (STI inhibitörü, vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptör (VEGFR) inhibitörü, fibroblast büyüme faktörü reseptör (FGFR) inhibitörü, Epidermal Büyüme faktörü Reseptör (EGFR) inhibitörü, örnegin Iressa ve Tarceva, radisikol, 17-allilamino-17-demetoksigeldanamisin, rapamisin, amsakrin, all-trans- retinoik asit, talidomid, anastrozol, fadrozol, letrozol, eksemestan, altin tiyomalat, D- penisilamin, busillamin, azatiyoprin, mizoribin, siklosporin, rapamisin, hidrokortizon, beksaroten (Targretin), tamoksifen, deksametason, progestin maddeleri, östrojen maddeleri, anastrozol (Arimideks), Leuplin, aspirin, indometasin, selekoksib, azatiyoprin, penisilamin, altin tiyomalat, klorfeniramin maleat, klorfeniramin, klemastin, tretinoin, beksaroten, arsenik, voltezomib, allopurinol, kalisamisin, ibritumomab tiuksetan, Targretin, ozogamin, klaritromisin, lökovorin, ifosfamid, ketokonazol, aminoglutetimid, suramin, metotreksat, maytansinoid ve bunlarin türevleri yer alir.
Düsük moleküler agirliga sahip maddenin, antikorla konjüge edilmesine yönelik usul söz konusu maddenin ve antikorun bir amino grubunun glutaraldehidle konjüge edildigi bir usul, söz konusu maddenin bir amino grubunun ve antikorun bir karboksil grubunun are konjugatd through suda çözünür karbodiimidle konjüge edildigi bir usul, ve benzerlerini içerir.
Bir yüksek moleküler agirliga sahip madde polietilen glikol (bundan sonra "PEG" olarak atiüa bulunulur), albumin, dekstran, polioksietilen, stiren-maleik asit kopolimer, polivinilpirrolidon, piran kopolimer, hidroksipropilmetakrilamid, ve benzerlerini içerir. Bir yüksek moleküler agirliga sahip bu bilesiklerin, bir antikor veya antikor fragmanina baglanmasiyla, asagidaki etkiler beklenmektedir: (1) çesitli kimyasal, fiziksel veya biyolojik faktörlere karsi stabilitenin gelistirilmesi, (2) kanda yari ömrün dikkate deger uzatilmasi, (3) immünogenisitenin kaybolmasi veya antikor üretiminin bastitilmasi, ve benzerleri [Bioconjugate Drug, Hirokawa Shoten (1993)]. Örnegin, PEG,nin bir antikora baglanmasi için usul, bir antikorun, bir PEG-modifiye edici reaktif maddeyle reaksiyona girmesine izin verildigi bir usulü içerir [Bioconjugate Drug, Hirokawa Shoten (l993)]. PEG-modifiye edici reaktif madde, lizinin s-amino grubunun bir modifiye edici maddesi (Japon Yayinlanmis Incelenmemis Patent Basvurusu No. 178926/86), aspartik asit ve glutamik asidin bir karboksil grubunun bir modifiye edici maddesi (Japon Yayinlanmis Incelenmemis Patent Basvurusu No. 23587/81), argininin bir guanidino grubunun bir modifiye edici maddesini (Japon Yayinlanmis Incelenmemis Patent Basvurusu No. 117920/90) ve benzerlerini içerir.
Immüno-uyarici, immünoadjuvanlar olarak bilinen herhangi bir dogal ürün olabilir. Bir madde güçlendirici immünojenin örnekleri arasinda ß(1-›3)glukan (lentinan, sizofilan), (1- galaktosilseramid ve benzerleri yer alir.
Protein A immünokompetan hücreyi, örnegin NK hücreyi aktive eden bir sitokin veya bir büyüme faktörü, makrofaj veya nötrofil, bir toksik protein, ve benzerlerini içerir.
Sitokin veya büyüme faktörünün örnekleri arasinda interferon (bundan sonra ”IFN" olarak atifta bulunulur)-0t, IFN-ß, IFN-y, interlökin (bundan sonra "IL" olarak atifta bulunulur)-2, makrofaj-koloni uyarici faktör (GM-CSF), makrofaj-koloni uyarici faktör (M-CSF) ve benzerleri yer alir.
Toksik protein risin, difteri toksin, ONTAK ve benzerlerini içerir, ve ayrica bir toksik protein içerir, burada mutasyon, toksisiteyi kontrol altinda tutmak amaciyla bir protein katilir.
Terapötik antikor apoptozun, antikorun baglanmasiyla baslatildigi bir antijene karsi bir antikor, tümörün patolojik durumunun olusumunda bir antijene karsi bir antikor, immünolojik fonksiyonu düzenleyen bir antijene karsi bir antikor ve patolojik bölümde anjiyogenezle ilgili bir antijene karsi bir antikoru içerir.
Apoptozun, antikorun baglanmasiyla baslatildigi antijen diferansiyon kümesi (bundan sonra CD86 (B-Sinif II, epidermal büyüme faktörü reseptörü Tümöiün patolojik durumunun olusumuna katkida bulunan antijen veya immünolojik fonksiyonu düzenleyen antijen CD40, CD40 ligand, B7 ailesi molekülü (CD80, CD86, ailesi molekülü (DR4, DR5, TNFRl, TNFR2), TNF ile ilgili apoptoz baslatici ligand reseptörü (TRAIL) ailesi molekülü, TRAIL ailesi molekülünün reseptör ailesi (TRAIL-Rl, TRAIL-RZ, TRAIL-R3, TRAIL-R4), nükleer faktör kappa B reseptör aktivatörü (RANK), RANK ligand, CD25, folik asit reseptörü 4, sitokin [IL-let, IL-lß, lL-4, lL-5, lL-6, lL-lO, [L- 13, dönüstürücü büyüme faktörü (TGF) ß, TNFd, vs.], bu sitokinlerin reseptörleri, kemokin (SLC, ELC, ve bu kemokinlerin reseptörlerini içerir.
Patolojik bölümde anjiyogenezi inhibe eden antikor için antijen, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), anjiopoietin, fibroblast büyüme faktörü (FGF), EGF, trombosit kaynakli büyüme faktörü (PDGF), insülin-benzeri büyüme faktörü (IGF), eritropoietin (EPO), TGFB, lL-8, Efilin, SDF-l , bunlarin reseptörleri ve benzerlerini içerir.
Bir protein veya terapötik antikorla bir füzyon antikoru, bir monoklonal antikor veya antikor fragmanini kodlayan bir cDNA°nin proteini kodlayan bir cDNAiya baglanmasiyla, füzyon antikorunu kodlayan bir DNA'nin olusturulmasiyla, DNA,nin prökaryot veya ökaryot için bir ekspresyon vektörüne yerlestirilmesiyle, ve ardindan ekspresyon vektörünün, füzyon antikorunu eksprese etmek için bir prökaryot veya ökaryota katilmasiyla üretilebilir.
Yukaridaki antikor konjugatinin, saptama usulü için kullanildigi durumda, mevcut bulusta kantitatif belirleme için usul, saptama reaktif maddesi, kantitatif belirleme için reaktif madde veya tam maddesi, spesifik olarak beseri TIM-yü taniyan ve hücre disi alanin bir amino asit dizisine veya bunun üç-boyutlu yapisina baglanan mevcut bulusun monoklonal antikoruna baglanan maddenin örnekleri, rutin immünolojik saptama veya ölçme usulünde kullanilan bir etiket içerir.
Etiket enzimler, örnegin alkalin fosfataz, peroksidaz ve lusiferaz, luininesan malzemeler, Örnegin akridinum ester ve lofin, floresan malzemeler, örnegin floresan izotiyosiyanat (FITC) ve tetrametil rodamin izotiyosiyanat (RlTC), ve benzerlerini içerir.
Bundan baska, mevcut bulus, bir aktif bilesen olarak mevcut bulusun monoklonal antikorunu içeren bir TIM-3 pozitif hücresiyle ilgili bir hastaligi tedavi etmek için bir madde içerir.
TIM-3 pozitif hücresiyle ilgili hastalik kanserdir.
Kanser kan kanseri, meme kanseri, uterin kanser, kolorektal kanser, özofageal kanser, gastrik kanser, yumurtalik kanseri, akciger kanser, renal kanser, rektal kanser, tiroid kanseri, uterin serviks kanser, ince bagirsak kanseri, prostat kanseri ve pankreatik kanseri içerir. Kanserin tercih edilen örnekleri arasinda kan kanseri, özofageal kanser, gastrik kanser, kolorektal kanser, karaciger kanseri ve prostat kanseri yer alir.
Kan kanserinin örnekleri arasinda akut miyeloid lösemi (AML), kronik miyeloid lösemi (CML), miyelodisplastiksendromlar (MDS), multipl miyelom, kütanöz T hücre lenfoina (CTCL), periferal T-hücre lenfoma (PTCL), anaplastik büyük hücre lenfoma (ALCL), akut lenfositik lösemi (ALL), kronik lenfositik lösemi (CLL), baska lenfoid lösemi, NK hücre lenfomasi, Hodgkin lenfoma, Hodgkin olmayan lenfoma, örnegin Burkitt lenfomasi, ve benzerleri yer alir.
Terapötik madde, bir aktif bilesen olarak mevcut bulusun yukaridaki monoklonal antikorunu Mevcut bulusun monoklonal antikorunu içeren terapötik madde, veya bunun konjugati sadece bir aktif bilesen olarak antikor, veya bunun konjugatini içerebilir. Genellikle terapötik maddenin, farmasötiklerin teknik alaninda iyi bilinen uygun bir usulle üretilen farmasötik bir preparasyon olarak, ve bunun bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilen tasiyiciyla karistirilmasiyla hazirlanmasi tercih edilir.
Terapötik maddenin, tedavi için en etkili olan yolla uygulanmasi tercih edilir. Örnekler arasinda agizdan uygulama ve parenteral uygulama, örnegin yanaktan, trakeal, rektal, subkütanöz, kas içi veya intravenöz uygulama yer alir ve intravenöz uygulama tercih edilir.
Farmasötik preparasyon Spreyler, kapsüller, tabletler, tozlar, granüller, suruplar, emülsiyonlar, süppozituarlar, enjeksiyonlar, merhemler, bantlar ve benzerlerini içerir.
Uygulama dozu veya sikligi, amaçlanan terapötik etki, uygulama usulü, tedavi süresi, yas, vücut agirligi ve benzerlerine bagli olarak degisse dahi, beher gün veye beher yetiskin için çogu kez 10 tig/kg ila 10 mg/kgldir.
Ayrica, mevcut bulus, spesifik olarak beseri TIM-3°ü taniyan ve bir aktif bilesen olarak hücre disi alanin bir amino asit dizisine veya bunun üç-boyutlu yapisina baglanan mevcut bulusun monoklonal antikoru kullanilarak TIM-3`ü immünolojik olarak saptamak veya ölçmek bir in vitro usul, TIM-?ü immünolojik olarak saptamak veya ölçmek için bir reaktif madde, TIM- 3”ü eksprese eden bir hücreyi immünolojik olarak saptamak veya ölçmek için bir usulle Mevcut bulusta, TIM-3 miktarini saptamak veya ölçmek için usul bilinen herhangi bir usul olabilir. Örnegin, bu, bir immünolojik saptama veya ölçme usulünü içerir.
Immünolojik saptaina veya ölçme usulü, bir antikor miktari veya bir antijen miktarinin, bir etiketli antijen veya antikor kullanilarak saptandigi veya belirlendigi bir usuldür.
Immünolojik saptama veya ölçme usulünün örnekleri arasinda radyoaktif madde-etiketli immünoantikor usulü (RIA), enzim immünoanalizi (EIA veya ELISA), floresan immünoanalizi (FIA), luminesan immünoanaliz, Western blotting usulü, fizikokimyasal usul ve benzerleri yer alir.
Bir TIM-3 pozitif hücreyle ilgili yukaridaki hastalik, mevcut bulusun monoklonal antikoru veya antikor fragmani kullanilarak TIM-?ü eksprese eden bir hücrenin saptanmasiyla veya ölçülmesiyle teshis edilebilir.
Polipeptidi eksprese eden hücrenin saptanmasi için, known immünolojik saptama usuller kullanilabilir, ve bir immüno-çökeltme usulü, bir floresan hücre boyama usulü, bir immün doku boyama usulü ve benzerleri tercihen kullanilir. Ayrica, FMAT 8100 HTS sisteminin (Applied Biosystem) kullanildigi bir Iloresan antikor boyama usulü ve benzerleri kullanilabilir.
Mevcut bulusta, TlM-3`ü eksprese eden bir hücre, örnegin doku hücreleri, kan, kan plazmasi, serum, pankreatik sivi, ürin, diski maddesi, doku sivisi veya kültür sivisi içeren bir olasiliga sahip oldugu sürece, TIM-3”ü saptamak veya ölçmek için kullanilacak canli vücut numunesi Özellikle sinirli degildir.
Mevcut bulusun monoklonal antikoru, veya bunun konjugatinin içeren bir tani maddesi ayrica arzu edilen tani usulüne bagli olarak reaksiyonun saptanmasina yönelik bir antijen-antikor reaksiyon veya bir reaktif maddenin gerçeklestirilmesi için bir reaktif madde içerebilir.
Antijen-antikor reaksiyonunu gerçeklestirmek için reaktif madde bir tampon, bir tuz, ve benzerlerini içerir. Saptaina için reaktif madde genellikle immünolojik saptama veya ölçme usulü için kullanilan bir reaktif madde, örnegin monoklonal antikor, bunun antikor fragmani veya bunun konjugatlarini taniyan etiketli sekonder antikor ve etiketlemeye karsilik gelen madde ve benzerlerini içerir.
Mevcut bulusun antikorunu üretmek için bir islem, hastaligi tedavi etmek için bir usul ve hastaligin teshisi için bir usul spesifik olarak asagida açiklanmaktadir. 1. M0n0klonal antikorun preparasyon usulü (1) Antijen preparasyonu Bir antijen olarak TIM-3 veya TIM-3'ü eksprese eden bir hücre, TIM-?ün bir tam uzunlugunu kodlayan cDNAayi içeren bir ekspresyon vektörünün katilmasiyla elde edilebilir veya bunun bir kismi uzunlugu Escheri'chi'a coli, maya, bir böcek hücresi, bir hayvan hücresi veya benzerlerine katilir. Ilaveten, TIM-3 saflastirilabilir ve büyük bir miktarda TIM-?ü eksprese eden çesitli beseri tümör hücre hatlari, beseri doku ve benzerlerinden elde edilebilir.
Tümör hücre hatti ve doku, antijenler olarak kullanilmaya dogrudan izin verilebilir. Bundan baska, TIM-33ün bir kismi dizisine sahip olan bir sentetik peptid, bir kimyasal sentez usulü, örnegin Fmoc usulü veya tBoc usulüyle hesaplanabilir ve bir antijen olarak kullanilabilir.
TIM-3, asagidaki usule göre Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ikinci baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley hücrede TIM-37ü kodlayan bir DNA”nin eksprese edilmesiyle üretilebilir.
Ilk olarak, bir rekombinant vektör, uygun bir ekspresyon vektörünün bir promotörünün asagi akimina TIM-yü kodlayan alani içeren bir tam uzunlukta cDNA*nin yerlestirilmesiyle hazirlanabilir. Bu sirada, gerekirse, tam uzunlukta cDNAsyi baz alarak hazirlanan polipeptidi kodlayan bir alan içeren uygun bir uzunluga sahip bir DNA fragmani, yukarida tam uzunlukta cDNA,nin yerine kullanilabilir. Ardindan, polipeptit üreten bir transformant, rekombinant vektörün, ekspresyon vektörü için uygun bir konakçi hücreye katilmasiyla elde edilebilir.
Ekspresyon vektörü, kullanilmak için konakçi hücrede otonom olarak çogalabildigi sürece veya polipeptit kodlayan DNA°nin kopyalanabildigi gibi bir pozisyonda uygun bir promotör içeren bir kromozoma entegre edilebildigi sürece herhangi biri olabilir.
Konakçi hücre, amaçlanan geni eksprese edebildigi sürece herhangi biri olabilir. Örnekler arasinda Escherichi'a cinsine ait olan bir mikroorganizma, örnegin Escheri'chi'a coli, maya, bir böcek hücresi, bir hayvan hücresi ve benzerleri yer alir.
Bir prokaryot, örnegin Escheri'chi'a coli' konakçi hücre olarak kullanildiginda, mevcut bulusta kullanilan rekombinant vektörün, prokaryotta otonom olarak yinelenebilir olmasi ve bir promotör, bir ribozom baglanma dizisi, TIM-3lü kodlayan DNA ve bir transkripsiyon terminasyon dizisini içermesi tercih edilir. Rekombinant vektörün, bir transkripsiyon terminasyon dizisine illa sahip olmasi gerekmez, fakat bir transkripsiyon terminasyon dizisi tercihen yapisal genin hemen altina ayarlanir. Rekombinant vektör ayrica promotörü Ayrica, yukaridaki rekombinant vektör tercihen ribozom baglanma dizisi olan Shine- Dalgarno dizisi, ve baslangiç kodonu arasinda boslugun uygun bir mesafeye (örnegin, 6 ila 18 nükleotid) ayarlandigi bir plazmiddir.
Bundan baska, TIM-yü kodlayan DNA”mn nükleotid dizisi, bir konakçi hücreyi eksprese etmek için uygun bir kodon olmasi ainaciyla baska bir bazla sübstitüe edilebilir, böylelikle amaçlanan TIM-yün üretkenligi gelistirilir.
Herhangi bir ekspresyon vektörü, kullanilacak konakçi hücrede fonksiyon gösterebilecegi sürece kullanilabilir. Ekspresyon vektörünün örnekleri arasinda pBTrpZ, pBTacl, pBTacZ (hepsi Roche Diagnostics tarafindan imal edilir), pKK233-2 (Pharmacia tarafindan imal edilir), pSE, pGEMEX-l (Promega tarafindan imal edilir), pQE-8 ( Qiagen tarafindan imal edilir), pKYPlO (Japon Yayinlanmis Incelenmemis (], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. ABD, JMlO9/pTrS32 (F ERM BP-5408),den hazirlanir], pGHA2 [Escherichia coli' lGHA2 (FERM pGKAZ [Escheri'chi'a coli' IGKA2 (FERM BP-6798)”den hazirlanir, Japon Yayinlanmis pGEX (Pharmacia tarafindan imal edilir), pET sistem (Novagen tarafindan iinal edilir), pME18SFL3 ve benzerleri yer alir.
Herhangi bir promotör, kullanilacak konakçi hücrede fonksiyon gösterebildigi sürece kullanilabilir. Örnekler arasinda Escheri'chia colfden elde edilen promotörler, faj ve benzerleri, örnegin trp promotör (Ptrp), lac promotör, PL promotör, PR promotör ve T7 promotör ve benzerleri yer alir. Ayrica, yapisal olarak tasarlanmis ve modifiye edilmis promotörler, örnegin iki Ptrpinin tandem olarak baglandigi bir promotör, tac promotör, lacT7 promotör ve letI promotörü kullanilabilir.
Konakçi hücrenin örnekleri arasinda Escheri'chi'a coli XLl-Blue, Escheri'chia coli' XL2-Blue, Escheri'chi'a coli' DHl, Escheri'chi'a coli' MClOOO, Escheri'chi'a coli' KY3276, Escheri'chi'a coli Rekombinant vektörün herhangi bir katilma usulü, DNA”n1n konakçi hücresini katinaya yönelik bir usul oldugu sürece kullanilabilir, ve Örnekler arasinda Proc. Natl. Acad. Sci. ( 1979) ve benzerlerinde açiklanan bir kalsiyum iyonunun kullaniladigi bir usul yer alir.
Bir hayvan hücresi, konakçi hücre olaak kullanildiginda, hayvan hücresi olarak fonksiyon gösterebildigi sürece herhangi bir ekspresyon vektör kullanilabilir. Örnekler arasinda pcDNAl, pcDM8 (Funakoshi tarafindan imal edilir), pAGElO7 [Japon Yayinlanmis tarafindan imal edilir), pREP4 (Invitrogen tarafindan imal edilir), pAGE103 [J. Biochemistry, ve benzerleri yer Herhangi bir promotör, bir hayvan hücresinde fonksiyon gösterdigi sürece kullanilabilir. Örnekler arasinda sitomegalovirüsün hemen erken (IE) geninin (CMV) bir promotörü, SV40 erken promotörü, bir retrovirüs promotörü, bir inetallotiyonein promotörü, bir isi soku promotörü, SR& promotörü, Molony murin lösemi Virüs promotörü veya güçlendirici, ve benzerleri yer alir. Ayrica, beseri CMVlnin IE geninin güçlendiricisi, promotörle birlikte kullanilabilir.
Konakçi hücre, beseri Namalwa lösemi hücre, maymun COS hücresi, Çin hamster yumurtalik CCL-61), DUkXBll (ATCC Erisim N02CCL-, CHO-S (Life Technologies, Kat#11619), Pro-3, siçan miyelom hücre YBZ/3HL.P2.G, fare miyelom hücre NSO, fare miyelom hücre SP2/0-Ag14, Suriye hamster hücre BHK veya HBT5637 (Japon Yayinlanmis Incelenmemis Patent Basvurusu No. 299/88) ve benzerleri yer alir.
Rekombinant vektörün herhangi bir katilma usulü, bu, DNA,nin bir hayvan hücresine katilmasi için bir usul oldugu sürece kullanilabilir, ve örnekler arasinda elektroporasyon 7413 (1987)], ve benzerleri yer alir.
TIM-3, kültürde TIM-3'ü olusturan ve biriktiren bir ortamda TIM-yü kodlayan DNA içeren bir rekombinant vektöre sahip bir mikroorganizma, bir hayvan hücresi veya benzerlerinden elde edilen transformantin kültürlenmesiyle, ve bunun kültürden geri kazanilmasiyla üretilebilir. Transformantin ortamda kültürlenmesi için usul, konakçilarin kültürlenmesinde kullanilan herzamanki usule göre gerçeklestirilir.
TIM-3, ökaryottan elde edilen bir hücre eksprese edildiginde, sekerler veya seker zincirlerine baglanan TIM-3 elde edilebilir.
Bir indüklenebilen promotör içeren bir rekombinant vektörle dönüstürülen bir mikroorganizma kültürlendiginde, bir baslatici gerekirse ortama ilave edilebilir. Örnegin, izopropil-ß-D-tiyogalaktopiranosid veya benzerleri, Zac promotör kullanilarak bir rekombinant vektörle dönüstürülen bir mikroorganizma kültürlendiginde, ortama ilave edilebilir; veya indoleakrilik asit veya benzerleri, trp promotörü kullanilarak bir rekombinant vektörle dönüstürülen bir mikroorganizma kültürlendiginde, buna ilave edilebilir.
Konakçi hücre olarak bir hayvan hücresi kullanilarak elde edilen bir transformant kültürlendiginde, ortam, genellikle kullanilan RPMI 1640 ortami [The Journal of the (] ve 199 ortami Dulbecco oitami (IMDM), fetal buzagi serumu, vsfnin ilave edildigi ortam ve benzerlerini gerçeklestirilir. Gerekirse, bir antibiyotik, örnegin kanamisin veya penisilin, kültürleme sirasinda ortama ilave edilebilir.
TIM-3”ü kodlayan genin ekspresyon usulüyle ilgili olarak dogrudan ekspresyona ilaveten, salgi üretimi, füzyon protein ekspresyonu ve benzerleri Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ikinci baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press°te (1989) açiklanan usule göre gerçeklestirilebilir.
TIM-?ü üretmeye yönelik islem, bir konakçi hücrede hücre içi ekspresyonun bir usulü, bir konakçi hücreden hücre disi salginin bir usulü, bir konakçi hücre dis membranda üretmeye yönelik bir usul, ve benzerlerini içerir. Uygun usul, kullanilan konakçi hücrenin ve üretilen TIM-3 yapisinin degistirilmesiyle seçilebilir.
TIM-3, bir konakçi hücrede veya bir konakçi hücre membran dis zarfi üzerinde üretildiginde, 94/23021,de açiklanan usuller, ve benzerlerine göre pozitif olarak hücre disi seklinde salgilanabilir.
Ayrica, TIM-yün üretim miktari, bir dihidrofolat redüktaz geni kullanilarak bir gen amplifikasyon sisteminin kullanilmasiyla Japon Yayinlanmis Incelenmemis Patent Basvurusu No. 227075/90”da açiklanan usule göre arttirilabilir.
Elde edilen TIM-3, örnegin, asagidaki gibi izole edilebilir ve saflastirilabilir.
TIM-3, hücre içine bir çözündürülmüs halde eksprese edildiginde, kültürlendikten sonra hücreler santrilügasyonla geri kazanilir, bir sulu tamponda süspansiyon halinde tutulur ve daha sonra bir hücre disi ekstrakti elde etmek için ultrasonikatör, French pres, Manton Gaulin homojenlestirici, dinomil veya benzerleri kullanilarak dagitilir.
Bir üst fazi elde etmek için hücre disi ekstrakt santrilîijlenir, ve bir saflastirilmis preparasyon, tek basina veya kombinasyon halinde kullanilabilen, üst fazin, bir genel protein izolasyon ve saflastirina tekniklerine, örnegin çözücü ekstraksiyonuna tabi tutulmasiyla; amonyuin sülfat vs. ile tuzla çökeltmeyle; tuz giderineyle; bir organik çözücüyle çökeltmeyle; bir reçine, örnegin dietilaminoetil (DEAE)-sefaroz, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical tarafindan imal edilir) kullanilarak anyon degisim kromatografisiyle; bir reçine, örnegin S-Sefaroz FF (Pharmacia tarafindan imal edilir) kullanilarak katyon degisim kromatografisiyle; bir reçine, örnegin butil-Sefaroz veya fenil-Sefaroz kullanilarak hidrofobik kromatografisiyle; bir moleküler elek kullanilarak jel filtrasyonuyla; afinite kromatografisiyle; kromato- odaklanmayla; elektroforez, örnegin izoelektrik odaklanmayla; ve benzerleriyle elde edilebilir.
TIM-3, bir inklüzyon cisimciginin olusturulmasiyla hücre içine eksprese edildiginde, hücreler ayni sekilde geri kazanilir, dagitilir ve santrifüjlenir, ve TIM-?ün inklüzyon cisimcigi, bir çökeltine fraksiyonu olarak geri kazanilir. TIM-3 proteininin geri kazanilmis inklüzyon cisiincigi, bir protein denatüre edici maddeyle çözündürülür. Protein, çözündürülmüs çözeltinin seyreltilmesi veya diyalize edilmesiyle bir normal üç-boyutlu yapiya dönüstürülür, ve ardindan polipeptidin saflastirilmis bir preparasyonu, yukaridaki gibi ayni izolasyon saflastirma usulüyle elde edilebilir.
TIM-3 veya söz konusu türevi, örnegin bir glikosile edilmis ürünü, hücre disi sekilde salgilandiginda, TIM-3 veya söz konusu türev, örnegin bir glikozile edilmis ürün, kültür üstfazindan geri kazanilabilir.
Yani, kültür, bir çözünür fraksiyon elde etmek için yukaridaki gibi ayni sekilde bir usulle, örnegin santriûigasyonla muamele edilir, TIM-3°ün bir satlastirilmis preparasyonu, yukaridaki gibi ayni izolasyon saflastirma usulüyle çözünür fraksiyondan elde edilebilir.
Ayrica, mevcut bulusta kullanilan TIM-3, bir kimyasal sentez usulü, örnegin Fmoc usulü veya tBoc usulüyle üretilebilir. Ayrica, bu, Advanced ChemTech, Perkin-Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation tarafindan imal edilen bir peptid sentezleyici veya benzerleri kullanilarak kimyasal olarak sentezlenebilir. (2) Hayvanin immünizasyonu ve füzyon için antikor üreten hücre preparasyonu 3 ila 20-haftalik olan bir fare, siçan veya hamster ve benzerleri, yukarida (1)”de hazirlanan antijenle immünize edilir, ve hayvanin dalak, lenf` boguinu veya periferal kaninda antikor üreten hücreler toplanir. Ayrica, yukaridaki hayvanda düsük immünojenesite nedeniyle bir yeterli titre artisi taninmadiginda, bir TIM-3 nakavt fare, immünize edilecek bir hayvan olarak kullanilabilir.
Iinmünizasyon, antijenin hayvana, uygun bir adjuvanla (örnegin, tam Freund adjuvani, alüminyum hidroksit jelin pertusis asisiyla kombinasyonu, veya benzerleri) subkütanöz, intravenöz veya intraperitoneal enjeksiyonla birlikte uygulanmasiyla gerçeklestirilir. Antijen, bir kismi peptid oldugunda, bir konjugat, antijen olarak kullanilan bir tasiyici protein, örnegin BSA (bovin serum albumin), KLH (anahtardeligi limpet hemosianin) veya benzerleriyle üretilir.
Antijenin uygulanmasi, ilk uygulamadan sonra her hafta veya iki haftada bir 5 ila 10 kez gerçeklestirilir. Her bir uygulamadan sonra 3. ila 7. günde, bir kan numunesi, göz dibinden toplanir, serumun antijenle reaktivitesi, örnegin, enzim immünoanaliziyle [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] veya benzerleriyle test edilir.
Immünizasyon için kullanilan antijene karsi bunlarin serasinda bir yeterli antikor titresi gösteren bir hayvan, füzyon için antikor üreten hücrelerin kaynagi olarak kullanilir.
Antijenin nihai uygulanmasindan üç ila yedi gün sonra, antikor üreten hücreleri içeren doku, Örnegin dalak, antikor üreten hücreleri toplamak için immünize edilen hayvandan kesilir.
Dalak hücreleri kullanildiginda, dalak kesilerek çikarilir ve gevsetilir, bunu santrifügasyon takip eder. Ardindan, füzyon için antikor üreten hücreler, eritrositlerin çikarilmasiyla elde Fareden elde edilen olusturulmus bir hücre hatti, miyelom hücreler olarak kullanilir. Örnekler arasinda 8-azaguanine dirençli fare (BALB/dden elde edilir) miyelom hücre hatti P3- Miyelom hücreler bir normal ortamda [glutamin, 2-merkaptoetanol, gentamisin, FBS ve 8- azaguaninin RPMI-1640 ortamina ilave edildigi bir ortam] alt-kültürlenir ve bunlar, füzyon gününde 2><107 veya daha fazla olan hücre sayisini saglamak için hücre füzyonundan 3 veya 4 gün önce normal ortamda alt-kültürlenir. (4) Monoklonal antikor üretmek için hücre füzyonu ve hibridom preparasyonu Yukarida (2),yle elde edilen füzyon için antikor üreten hücreler ve yukarida (3)”le elde edilen miyelom hücreler, bir asgari gerekli ortam (MEM) veya PBS (1.83 g disodyum hidrojen fosfat, 0.21 g potasyum dihidrojen fosfat, 7.65 g sodyum klorür, 1 litre damitik su, pH 7.2) ile yeterli sekilde yikanir ve antikor üreten hücreler: miyelom hücrelerin bir orani = 5 - 10: 1`i sunmak için karistirilir, bunu santrifügasyon takip eder. Sonra, üst faz atilir. Çökeltilen hücre grubu yeterli sekilde gevsetilir. Çökeltilen hücre gevsetildikten sonra, polietilen glikol-IOOO (PEG-lOOO), MEM ve dimetilsülfoksit karisimi 37°C”de karistirilarak hücreye ilave edilir. Ilaveten, 1 ila 2 mL MEM ortami, her bir veya iki dakika birkaç kez ilave edilir, ve 50 mL,lik bir toplam miktar sunmak için MEM ilave edilir. Santriiügasyondan sonra, üst faz atildi. Hücreler hafifçe gevsetildikten sonra, hücreler HAT ortaminda tutulur. Süspansiyon 7 ila 14 gün 37°C,de bir %5 C02 inkübatörde kültürlenir.
Kültürlemeden sonra, bir porsiyon kültür üst fazi numunelendirilir ve TIM-3 içeren bir antijene reaktif olan ve TIM-3 içermeyen bir antijene reaktif olmayan bir hibridom, asagida açiklandigi gibi baglanma analiziyle seçilir. Sonra klonlama, bir sinirlayici seyreltme usulüyle iki kez gerçeklestirilir [Ilk olarak, HT ortam (aminopterinin giderildigi HAT ortami) kullanilir, ve ikinci olarak, normal ortam kullanilir], ve dengeli sekilde bir yüksek antikor titresi gösteren bir hibridom, monoklonal antikor üreten hibridom olarak seçilir. (5) Saflastirilmis monoklonal antikor preparasyonu Yukarida (4) ile elde edilen bir monoklonal antikor üreten hibridom hücrelere 8- ila 10- haftalik farelere intraperitoneal enjeksiyonla uygulanir veya 0.5 mL pristan (2,6,10,l4- tetrametilpentadekan (pristan) ile muamele edilmis çiplak farelere intraperitoneal olarak uygulanir, bunu 2 hafta besleme takip eder). Hibridom, 10 ila 21 günde assitler tumörü gelistirir. Assitik sivi, farelerden toplanir, katilari gidermek için santrifüjlenir, %40 ila %50 amonyum sülfatla tuzla çökeltmeye tabi tutulur ve ardindan kaprilik asitle çökeltilir, bir sailastirilmis monoklonal antikor olarak bir IgG veya IgM fraksiyonunu toplamak için bir DEAE-Sefaroz kolonu, bir protein A kolonu veya bir jel Iiltrasyonu kolonundan geçirilir.
Bundan baska, yukarida (4),le elde edilen bir monoklonal antikor üreten hibridom, %10 FBS veya benzerlerini içeren RPM11640 ortaminda kültürlenir ve üst faz, santriiügasyonla giderilir. Çökeltilen hücreler, Hibridom-SFM ortaminda süspansiyon halinde tutulur ve 3 ila 7 gün kültürlenir. Saflastirilmis monoklonal antikor, elde edilen hücre Süspansiyonunun santrifujlenmesiyle elde edilebilir, bunu, IgG fraksiyonlari toplamak için Protein A kolonu veya Protein G kolonuyla elde edilen üst fazdan satlastirma takip eder. Ilaveten, Hibridom- SFM ortami, %5 DIGO GF21 içerebilir.
Antikorun altsinifi, enzim immünoanaliziyle bir altsinif yazan kit kullanilarak belirlenebilir.
Protein miktari, Lowry usulüyle veya 280 nm°de absorbanstan belirlenebilir. (6) Monoklonal antikorun seçimi Monoklonal antikorun seçimi, bir enzim immünoanaliz usulü kullanilarak müteakip baglanma analiziyle ve amino asitlerin hücre içi aliminin inhibisyon analiziyle gerçeklestirilir. (6-2) Baglanma analizi Antijen olarak, (1)”de elde edilen TIM-3'ü kodlayan bir cDNA içeren bir ekspresyon vektörünün, Escheri'chi'a coli, maya, bir böcek hücresi, bir hayvan hücresi veya benzerlerine katilmasiyla elde edilen bir gen tanitici hücre, bir rekombinant proteini, veya bir beseri dokudan elde edilen bir saflastirilmis polipeptit veya kismi peptid kullanilir. Antijen bir kismi peptid oldugunda, bir tasiyici proteinle bir konjugat hazirlanir, örnegin BSA veya KLH hazirlanir ve kullanilir.
Bu antijenlerin, bir 96-kuyucuklu plakada dagitilarak bir kati tabakaya dönüstürülmesinden sonra, test edilecek bir madde, örnegin serum, bir hibridom veya bir saflastirilmis monoklonal antikorun bir kültür üst fazi, primer antikor olarak burada dagitilir ve reaksiyona girmesine imkan verilir. PBS, PBS-Tween ve benzerleri ile tamamen yikandiktan, biotin, bir enzim, bir kemiluminesan malzeme, bir radyasyon bilesigi veya benzerleriyle etiketli bir anti- immünoglobulin antikor, sekonder antikor olarak burada dagitilir ve reaksiyona girmesine imkan verilir. PBS-Tween ile tamamen yikandiktan sonra, sekonder antikorun etiketine uygun reaksiyon, spesifik olarak antijenle reaksiyona giren bir monoklonal antikoru seçmek için gerçeklestirilir.
Ilaveten, beseri TIM-?ün bir hücre disi alaninin baglanmasinda mevcut bulusun antikoru anti-TlM-3 monoklonalla rekabet eden bir monoklonal antikor, reaksiyona girmesine imkan vermek için bir söz konusu antikorun yukaridaki baglanma analiz sistemine ilave edilmesiyle elde edilebilir. Yani, beseri TlM-3'ün hücre disi alaninin bir amino asit dizisi veya bunun bir üç-boyutlu yapisinin baglanmasinda elde edilen monoklonal antikorla rekabet eden bir monoklonal antikor, antikora ilave edildikten sonra monoklonal antikorun baglanmasini inhibe eden söz konusu bir antikorun taranmasiyla elde edilebilir.
Bundan baska, TlM-3iün hücre disi alaninin bir amino asit dizisine veya bunun üç-boyutlu yapisina baglanan mevcut bulusun monoklonal antikorunun ayni epitopuna baglanan bir antikor, yukaridaki baglanma analiz sistemiyle elde edilen antikorun bir epitopunun tanimlanmasiyla, epitopun bir kismi sentetik peptidinin veya epitopun üç-boyutlu yapisini taklit eden bir sentetik peptidin hazirlanmasiyla ve peptidin immünize edilmesiyle elde edilebilir. (6-b) Biacore ile kinetik analiz Bir antijen ve bir test maddesi arasinda kinetikler, Biacore TlOO kullanilarak ölçülür ve ardindan elde edilen sonuçlar, cihaza eslik eden analiz yazilimi kullanilarak analiz edilir.
Anti-fare lgG antikoru, bir amin kenetleme usulüyle bir CM 5 sensörü çipi üzerine iinmobilize edildikten sonra, bir test maddesi, örnegin bir hibridomun kültür üst fazi, bir saflastirilmis monoklonal antikorun uygun bir miktarda akmasina ve baglanmasina izin verilir, ve çoklu bilinen konsantrasyonlarda bir antijenin ayrica akmasina izin verilir, ve ardindan, baglanma ve ayrilma ölçülür.
Elde edilen veriler ve cihaza eslik eden yazilim kullanilarak, kinetikler analizi, gerekli parametreleri elde etmek için l:l baglanmasi modeli kullanilarak gerçeklestirilir. Baska türlü, beseri TIM-3, bir amino kenetleme usulüyle sensör çipine immobilize edildikten sonra, bir satlastirilmis monoklonal antikorun, çoklu bilinen konsantrasyonlarda akmasina imkan verilir, bunu baglanma ve ayrilmanin ölçülmesi takip eder. Elde edilen veriler ve cihaza eslik eden yazilim kullanilarak, gerekli parametreleri elde etmek için kinetikler analizi, çift degerli analit modeli kullanilarak gerçeklestirilir. 2. Rekombinant antikor preparasyonu Rekombinant antikorlarin üretim örnekleri olarak, bir beseri kimerik antikor ve bir beseri CDR asili antikor üretmeye yönelik islemler asagida gösterilmektedir. (l) Rekombinant antikorun ekspresyonu için vektörün yapimi Rekombinant antikorun ekspresyonu için bir vektör, bir beseri antikorun CH ve CL,sini kodlayan DNAlara yerlestirilmis olan hayvan hücresi için bir ekspresyon vektörüdür, ve bir beseri antikorun CH ve CLssini kodlayan DNA”larin her birinin, hayvan hücresi için bir ekspresyon vektörüne klonlanmasiyla olusturulur.
Bir beseri antikorun C alani, herhangi bir beseri antikorun CH ve CL,sini kullanilabilir. Örnekler arasinda yl altsinifina ait CH, K sinifina ait CL, ve benzerleri yer alir. Bir beseri antikorun CH ve CL°sini kodlayan DNA`lar olarak, cDNA genellikle kullanilabilir ve bir ekson ve bir intron içeren bir kromozomal DNA ayrica kullanilabilir.
Hayvan hücresi için ekspresyon vektörü olarak, bir beseri antikorun C alanini kodlayan bir gen buna yerlestirilebildigi ve burada eksprese edilebildigi sürece herhangi bir ekspresyon vektörü kullanilabilir. Örnekler arasinda pAGE], pAGE103 Hayvan hücresi için bir ekspresyon vektörü için kullanilan bir promotör ve güçlendiricinin (1983)] ve benzerleri yer alir.
Rekombinant antikorun ekspresyonu için vektör, bir antikor H zincirini kodlayan bir gen ve bir antikor L zincirini kodlayan bir genin ayri vektörler üzerinde mevcut oldugu bir tipinki veya her iki genin, ayni vektör üzerinde mevcut oldugu bir tipinki (tandein tip) olabilir.
Rekombinant antikorun ekspresyonu için bir vektör yapiminin kolayligi, hayvan hücrelerine katilim kolayligi, ve hayvan hücrelerinde antikor H ve L zincirlerinin ekSpresyon miktarlari arasinda dengeyle ilgili olarak, rekombinant antikorun ekspresyonu için vektörün bir tandem ekspresyonu için vektörün tandem tipi örnekleri arasinda pKANTEX93 (WO 97/ 10354), (2) Insan olmayan hayvandan elde edilen antikorun V alanini kodlayan cDNA,nin elde edilmesi ve amino asit dizisi analizi Bir beseri olmayan antikorun VH ve VL”sini kodlayan cDNAlarin elde edilmesi ve amino asit dizisi analizi asagidaki gibi gerçeklestirilir. mRNA, cDNA”y1 sentezlemek için bir beseri olmayan antikor üreten hibridom hücrelerden ekstrakte edilir. Sentezlenen cDNA, bir cDNA kütüphanesini hazirlamak için bir vektöre, örnegin bir faj veya bir plazmide klonlanir.
VH veya VL,yi kodlayan cDNA`yi içeren bir rekombinant faj veya rekombinant plazmidin her biri, prob olarak bir fare antikorunun C alani veya V alaninin bir parçasini kodlayan DNA”nin kullanildigi kütüphaneden izole edilir. Rekombinant faj veya rekombinant plazmid üzerinden ilgilenilen bir fare antikorunun VH ve VL,sinin nükleotid dizilerinin tam uzunlugu belirlenir, ve VH ve VL,nin amino asit dizilerinin tam uzunlugu sirasiyla nükleotid dizilerden ortaya çikarilir.
Bir beseri olmayan antikor üreten bir hibridom hücrenin hazirlanmasi için insan olmayan hayvan örnekleri arasinda fare, siçan, hamster, tavsan veya benzerleri yer alir. Bundan bir hibridom hücre üretilebildigi sürece herhangi bir hayvan kullanilabilir.
Bir hibridom hücreden toplam RNA”y1 hazirlamak için usul örnekleri arasinda bir guanidin tiyosiyanat-sezyum trifloroasetat usulü [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], bir kit, örnegin RNA easy kit (Qiagen tarafindan imal edilir) ve benzerlerinin kullanimi yer alir.
Toplam RNASdan mRNA”yi hazirlamak için usulün örnekleri arasinda bir oligo (dT) immobilize selüloz kolon usulü [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ikinci baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], bir kit, örnegin Oligo-dT3O mRNA Saflastirma Kiti (Takara Bio tarafindan imal edilir) ve benzerlerinin kullanildigi bir usul yer alir. Ilaveten, mRNA”y1 hazirlamak için usulün örnekleri arasinda bir kit Fast Track mRNA Izolasyon kiti (Invitrogen tarafindan imal edilir) veya QuickPrep mRNA Saflastirma Kitinin (Pharmacia tarafindan imal edilir) kullanildigi usul ve benzerleri yer alir. cDNA”nin sentezlenmesi için ve bir cDNA kütüphanesinin hazirlanmasi için usulün örnekleri arasinda bilinen usuller [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ikinci baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (l987-l997)]; bir kit, örnegin cDNA Sentezi ve Plazmid Klonlamasi için Super Script Plazmid System (lnvitrogen tarafindan imal edilir), ZAP-cDNA Sentez Kiti (Stratagene tarafindan imal edilir), vs. ,nin kullanildigi bir usul; ve benzerleri yer alir.
Bir cDNA kütüphanesini hazirlamak için sablon olarak bir hibridom hücreden ekstrakte edilen mRNA kullanilarak sentezlenen cDNA”ya yerlestirilen vektör, cDNA yerlestirilebilecegi sürece herhangi bir vektör olabilir. Örnekler arasinda ZAP ExPress ÄZAPII (Stratagene tarafindan imal edilir), kgtlO ve ?gül [DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech tarafindan imal edilir), kExCell ve cDNA kütüphanesi katilabildigi, eksprese edilebildigi ve korunabildigi sürece bir faj veya plazmid vektörüyle olusturulan cDNA kütüphanesinin katilmasi için herhangi bir Escherichi'a Biol., 166, 1 (1983)], K], ve benzerleri yer alir.
Bir izotop- veya floresan-etiketli probun kullanildigi bir koloni melezlesme veya plak melezlesme usulü, cDNA kütüphanesinden bir beseri olmayan antikor veya benzerlerinin VH veya VL”sini kodlayan cDNA klonlarini seçmek için kullanilabilir [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ikinci baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
Ayrica, VH ve VL”yi kodlayan cDNA”lar, (bundan sonra "PCR"; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ikinci baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997) olarak atifta bulunulur) polimeraz zincir reaksiyonuyla, primerler hesaplanarak ve sablon olarak mRNA veya bir cDNA kütüphanesinden hazirlanan cDNA kullanilarak hesaplanabilir. cDNA”nin nükleotid dizisi uygun restriksiyon enzimleri ve benzerleriyle seçilen cDNA°nm sindirilmesiyle, fragmanlarin bir plazmide, örnegin pBluescript SK(-),ye (Stratagene tarafindan imal edilir) klonlanmasiyla, reaksiyonun çogunlukla kullanilan bir nükleotid dizi analiz edici usulle gerçeklestirilmesiyle belirlenebilir. Örnegin, bir nükleotid dizi analiz edici usul, bir reaksiyondan sonra bir otomatik nükleotid dizi analiz edicisi, örnegin ABI PRISM ve A.L.F. DNA dizici (Pharmacia kullanilarak gerçeklestirilir.
Elde edilen cDNAlar, bir salgi sinyal dizisi içeren antikorun VH ve VL°sinin tam amino asit dizilerini kodlasin ya da kodlamasin, belirlenen nükleotid diziden VH ve VL,nin amino asit dizilerinin tam uzunlugunun hesaplanmasiyla ve bunlarin, bilinen antikorlarin VH ve VLasinin amino asit dizilerinin tam uzunluguyla kiyaslanmasiyla dogrulanabilir [A.L.F. DNA dizici, US Dept. Health and Human Services (1991)].
Bir salgi sinyal dizisi içeren antikorun VH ve VL,sinin tam amino asit dizileriyle ilgili olarak, salgi sinyal dizisi ve N-terminal ainino asit dizisi uzunlugu, bunlarin, bilinen antikorlarin VH ve VL,sinin amino asit dizilerinin tam uzunluguyla kiyaslanmasiyla hesaplanabilir [A.L.F.
DNA dizici, US Dept. Health and Human Services (1991)], ve bundan baska, ait olduklari alt grupla belirlenebilir. ilaveten, VH ve VL7nin her bir CDR9sinin amino asit dizisi, bunlarin, bilinen antikorlarin VH ve VL”sinin amino asit dizilerinin tam uzunluguyla kiyaslanmasiyla belirlenebilir [A.L.F. DNA dizici, US Dept. Health and Human Services (1991)].
Bundan baska, VH ve VLinin amino asit dizisinin tam uzunlugunun yeniligi, örnegin, amino asit dizilerinin elde edilen tam uzunlugu kullanilarak, herhangi bir veri tabani, örnegin, SWlSS-PROT, PIR-Protein veya benzerlerinde dizilerle bir homoloji arastirmasinin gerçeklestirilmesiyle incelenebilir. (3) Beseri kimerik antikorun ekspresyonu için vektör yapimi Insan olmayan hayvan antikorunun VH ve VL,sinin her birini kodlayan cDNA, böylelikle beseri kimerik antikorun ekspresyonu için bir vektörü olusturmak için, yukarida (1)”de belirtilen rekombinant antikorun ekspresyonu için vektörün beseri antikorunun CH veya CL,sini kodlayan genlerin yukari akiminda klonlanir.
Insan olmayan hayvan antikorunun VH veya VL7sinin 3'-tenninalinin bir nükleotid dizisini ve beseri antikorun CH veya CL”sinin 5'-tenninalinin bir nükleotid dizisini içeren cDNA7y1 baglamak için, bir insan olmayan hayvan antikorunun VH veya VLlsini kodlayan her bir cDNA hazirlanir, böylelikle uygun amino asitler kodlanir ve bir baglanti kisminda bir restriksiyon enziminin uygun bir tanima dizisine sahip olunur.
Antikorun VH ve VL°sini kodlayan hazirlanan cDNAlar sirasiyla klonlanir Böylelikle bunlarin her biri, beseri kimerik antikorun ekspresyonu için bir vektörü olusturmak amaciyla, yukarida (1),de belirtilen beseri CDR-asili antikorun ekspresyonu için vektörün beseri antikorunun CH veya CL”sini kodlayan genin yukari akiminda uygun bir formda eksprese edilir.
Ilaveten, bir insan olmayan hayvan antikorunun VH veya VL'sini kodlayan cDNA, her iki uçta uygun bir restriksiyon enziminin bir tanima dizisine sahip bir sentetik DNA kullanilarak PCR ile güçlendirilir ve bunlarin her biri, yukarida (l),de elde edilen rekombinant antikorun ekspresyonu için vektöre klonlanir. (4) Beseri CDR-asili antikorun V alanini kodlayan cDNAlnin yapimi Bir beseri CDR-asili antikorun VH veya VL`sini kodlayan cDNAllar asagidaki gibi elde edilebilir.
CDRllerin amino asit dizilerinin, bir insan olmayan hayvan antikordan elde edilen bir antikorun VH veya VL,sinde transplante edildigi, bir beseri antikorun VH veya VLasinde çerçeve alanin amino asit dizileri (bundan sonra "FR" olarak atifta bulunulur) sirasiyla seçilir.
Insandan elde edildigi sürece bir beseri antikorun FR°sinde herhangi bir amino asit dizisi kullanilabilir. Örnekler arasinda veri tabaninda, örnegin Protein Veritabani Bankasi veya benzerlerinde kayitli olan beseri antikorlarin FRilerinin amino asit dizileri, ve beseri antikorlarin FR°lerinin altgruplarina özgü amino asit dizileri [Sequences of Proteins of lmmunological Interest, US Dept. Health and Human Services (l99l)], ve benzerleri yer alir. Antikorun baglanma aktiviesindeki azalmayi engellemek amaciyla, orijinal antikorun VH veya VL°sinde FRlnin amino asit dizisiyle yüksek homolojiye (en az %60 veya daha fazla) sahip amino asit dizileri seçilir.
Sonra, orijinal antikorun CDR°lerinin amino asit dizileri, bir insanlastirilmis antikorun VH veya VL'sinin her bir amino asit dizisini tasarlamak için sirasiyla beseri antikorun VH veya VLlsinde FR°nin seçilen amino asit dizisine asilanir. Tasarlanmis amino asit dizileri, antikorlarin genlerinin nükleotid dizilerinde bulunan kodon kullaniminin sikligi dikkate alinarak DNA dizilerine dönüstürülür [Sequence of Proteins of lmmunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] ve bir insanlastirilmis antikorun VH veya VL°sinin amino asit dizisini kodlayan DNA dizisi tasarlanir.
Tasarlanmis nükleotid dizisi baz alinarak, yaklasik 100 nükleotidin bir uzunluguna sahip çesitli sentetik DNA'lar sentezlenir, ve PCR, bunlari kullanarak gerçeklestirilir. Bu durumda, beher H zinciri ve L zincirinin, sentezlenebilen PCRlnin reaksiyon etkisi ve DNA°larin uzunluklari bakimindan, her biri için 6 sentetik DNA°nin tasarlanmasi tercih edilir.
Bundan baska, bir beseri CDR-asili antikorun VH veya VL”yi kodlayan cDNA°si, her iki uç üzerinde mevcut sentetik DNA71arlin 5' terminaline uygun bir restriksiyon enziminin tanima dizisinin katilmasiyla (l),de olusturulan beseri CDR-asili antikorun ekspresyonu için vektöre kolaylikla klonlanabilir.
Baska türlü, bu, tasarlanmis DNA dizisini baz alan tam uzunlukta H zinciri ve tam uzunlukta L zincirinin her birini kodlayan bir DNA olarak bir sentetik DNA kullanilarak gerçeklestirilebilir.
PCRsden sonra, bir güçlendirilmis ürün, bir plazmide, örnegin pBluescript SK (-)'ye (Stratagene tarafindan imal edilir) veya benzerlerine klonlanir, ve nükleotid dizi, bir arzu edilen insanlastirilmis antikorun VH veya VL”sinin amino asit dizisini kodlayan bir DNA dizisine sahip bir plazmidi elde etmek için (2),de açiklanan usule benzer bir usule göre belirlenir. (5) Beseri CDR-asili antikorun V alaninin amino asit dizisinin modiükasyonu Bir beseri CDR-asili antikorun, sadece CDR,lerin, bir insan olmayan hayvandan elde edilen bir antikorun VH ve VL”sinde, bir beseri antikorun VH ve VLlsinin F Ralerine basitçe asilanmasiyla üretildigi, bunun antijen baglanma aktivitesinin, bir insan olmayan hayvandan elde edilen orijinal antikorunkinden daha düsük oldugu bilinmektedir [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
Beseri CDR-asili antikorlarinda, bir beseri antikorun VH ve VL”sinde FR°lerin amino asit dizileri arasinda, dogrudan bir antijene baglanmayla ilgili olan bir amino asit kalintisi, CDR,de bir amino asit kalintiyla etkilesime giren bir amino asit kalintisi, ve bir antikorun üç- boyutlu yapisini koruyan ve bir antijene baglanmayla dolayli ilgili olan bir amino asit kalintisi tanimlanir ve böylelikle azaltilmis olan antijen baglanma aktivitesini arttirmak için orjinal insanlastirilmamis antikorda bulunan bir amino asit kalintiya modifiye edilir.
FRide antijen baglanina aktivitesiyle ilgili amino asit kalintilari tanimlamak amaciyla, bir antikorun üç-boyutlu yapisinin olusturulmasi ve analiz etme, X-isini kristallografisiyle [J. veya benzerleriyle yapilabilir. Ilaveten, antijene karsi yeterli baglanma aktivitesine sahip modifiye edilmis beseri CDR-asili antikor, çesitli denemelerle, örnegin her bir antikorun çesitli modifiye edilmis antikorlarinin üretilmesiyle ve bunlarin baglanina aktivitelerinin incelenmesiyle elde edilebilir.
Bir beseri antikorun VH ve VL,sinde FR”nin amino asit dizisinin modifikasyonu, (4),te açiklandigi gibi PCR`ye göre modifikasyon için çesitli sentetik DNA kullanilarak gerçeklestirilebilir. PCR ile elde edilen güçlendirilmis ürünle ilgili olarak, nükleotid dizi, (2)”de açiklanan usule göre belirlenir, böylelikle amaçlanan modifikasyonun gerçeklestirilmis olup olmadigi do grulanir. (6) Beseri CDR-asili antikorun ekspresyonu için vektörün yapimi Beseri CDR-asili antikorun ekspresyonu için bir vektör, (1)”de açiklandigi gibi rekombinant antikorun ekspresyonu için vektörde, beseri antikorun CH veya CL,sini kodlayan genin her birinin yukari akimina bir olusturulmus rekombinant antikorun VH veya VLisini kodlayan cDNAinin klonlanmasiyla olusturulabilir. Örnegin, uygun bir restriksiyonun dizileri tanimlanirken, enzimler, (4) ve (5),te beseri CDR- asili antikorun VH veya VL”sinin yapiminda kullanilan sentetik DNAilar arasinda her iki uçta pozisyonlanan sentetik DNA”larin 5'-terminaline katilir, klonlama gerçeklestirilebilir, böylelikle bunlar, (l)°de açiklandigi gibi bir beseri CDR-asili antikorun ekspresyonu için vektörde beseri antikorun CH veya CLasini kodlayan genin her birinin yukari akiminda uygun bir formda eksprese edilir. (7) Rekombinant antikorun geçici ekspresyonu Üretilen çesitli beseri CDR-asili antikorlarin antijen baglanma aktivitesini etkili sekilde degerlendirmek amaciyla, rekombinant antikorlar, (3) ve (6),da açiklandigi gibi antikorun ekspresyonu için vektör veya bunun modifiye edilmis ekspresyon vektörü kullanilarak eksprese edilebilir.
Herhangi bir hücre, konakçi hücre, bir rekombinant antikoru eksprese edebildigi sürece, bir konakçi hücre olarak kullanilabilir. Örnegin, COS-7 hücresi (ATCC CRL1651), bunun yüksek ekspresyon miktari bakimindan kullanilir [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Ekspresyon vektörünün, COS-7 hücresine katmak için usulün örnekleri arasinda bir DEAE- dekstran usulü [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)], bir lipofeksiyon Ekspresyon vektörünün katilinasindan sonra, kültür üst fazinda rekombinant antikorun ekspresyon miktari ve antijen baglanma aktivitesi, enzim immünoanalizi [Monoklonal Antikorlar-Principles ve practice, Üçüncü baski, Academic Press (1996), Antibodies -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experimental, Kodansha Scientific (1987)] ve benzerleriyle belirlenebilir. (8) Rekombinant antikoru dengeli bir sekilde eksprese eden transformantin elde edilmesi ve rekombinant antikorun preparasyonu Bir rekombinant antikoru dengeli sekilde eksprese eden bir transformant, (3) ve (6)*da açiklanan rekombinant antikorun ekspresyonu için vektörün, uygun bir konakçi hücreye katilmasiyla elde edilebilir.
Ekspresyon vektörünün, bir konakçi hücreye katilmasi için usulün örnekleri arasinda elektroporasyon [Japon Yayinlanmis Incelenmemis Patent Basvurusu No. 257891/90, Cytotechnology, 3, 133 (1990)] ve benzerleri yer alir.
Bir rekombinant antikorun ekspresyonu için bir vektörün katildigi konakçi hücre olarak, , bu, rekombinant antikor üretebilen bir konakçi hücre oldugu sürece, herhangi bir hücre kullanilabilir. Örnekler arasinda CHO-Kl (ATCC CCL-61), DUkXBll (ATCC CCL-9096), Pro-5 (ATCC CCL-, siçan miyelom hücresi (ATCC No. CRL1580), bir dihidrofolat redüktaz geninin (bundan sonra "dhfr" olarak atifta siçan YB, ve benzerleri yer alir.
Ilaveten, bir protein aktivitesinin, örnegin bir hücre içi seker nükleotidinin senteziyle ilgili bir enzimin, GDP-fukozu, bir proteinin, örnegin bir kompleks tipte N-glikoside bagli seker zincirinde (it-bag ile indirgenen uçta, fukozun l-pozisyonunun, N-asetilglukosamininin 6- pozisyonuna baglandigi bir seker zincirinin modifikasyonun modifikasyonuyla ilgili bir enzimin,veya bir hücre içi seker nükleotidi, GDP-fukozun Golgi hacmine tasinmasiyla ilgili bir proteinin azaltildigi veya çikarildigi konakçi hücreler, tercihen (11,6-fukosiltransferaz CHO hücresi ayrica kullanilabilir.
Ekspresyon vektörünün katilmasindan sonra, bir rekombinant antikoru dengeli sekilde eksprese eden transformantlar bir madde, örnegin G418 sülfat (bundan sonra "G418" olarak atifta bulunulur) veya benzerlerini (Japon Yayinlanmis Incelenmemis Patent Basvurusu No. 257891/90) içeren hayvan hücresi kültürü için bir ortamda kültürlenerek seçilir.
Hayvan hücresi kültürü için ortam örnekleri arasinda RPMI164O ortami (Invitrogen tarafindan imal edilir), GIT ortami (Nihon Pharmaceutical tarafindan imal edilir), EX- hücre, IMDM ortami (Invitrogen tarafindan imal edilir), Hibridom-SFM ortami (lnvitrogen tarafindan imal edilir), çesitli katki maddelerinin, örnegin FBSinin bu ortamlara ilave edilmesiyle elde edilen ortam, ve benzerleri yer alir.
Rekombinant antikor üretilebilir ve bir ortamda elde edilen transformantlar kültürlenerek bir kültür üst fazinda biriktirilebilir. Kültür üst fazinda rekombinant antikorun ekspresyon miktari ve antijen baglanma aktivitesi, ELISA veya benzerleriyle ölçülebilir. Ayrica, transformantta, rekombinant antikorun ekspresyon miktari, Japon Yayinlanmis Incelenmemis Patent Basvurusu No. 257891/90`da açiklanan usule göre DHFR güçlendirme sistemi veya benzerleri kullanilarak arttirilabilir.
Rekombinant antikor, bir protein A kolonu kullanilarak transformantin kültür üst fazindan saflastirilabilir [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Üçüncü baski, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
Ilaveten, rekombinant antikor, saflastirma için usullerin bir kombinasyonuyla, örnegin jel filtrasyonu, iyondegisim kromatograiisi, ultrafiltrasyon ve benzerleriyle saflastirilabilir.
Sailastirilmis rekombinant antikorunun H zinciri veya L zincirinin veya bir bütün olarak antikor molekülünün moleküler agirligi, poliakrilainid jel elektroforez (bundan sonra "SDS- Antikorlar-Principles and practice, Üçüncü baski, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)], ve benzerleriyle belirlenir. 3. Monoklonal antikor veya antikor fragmaninin degerlendirme aktivitesi Mevcut bulusun saflastirilmis inonoklonal antikoru veya antikor fragmaninin aktivitesi, asagidaki sekilde degerlendirilebilir.
TIM-3°ü eksprese edici hücrenin baglanma aktivitesi, yukarida 1-(6a)°da açiklanan baglanma analiziyle ve örnegin yukarida (6b)”de açiklanan Biacore sistemi kullanilarak bir yüzey plazmon rezonansi usulüyle degerlendirilir. Bundan baska, floresan antikor teknigi [Cancer Bir antijen pozitif hücre hattina karsi Kompleman-Bagimli Sitotoksisite (bundan sonra, "CDC aktivitesi" olarak atifta bulunulur) veya ADCC aktivitesi, bilinen bir usulle degerlendirilir 4. Antikorun efektör aktivitesini kontrol altinda tutma usulü Mevcut bulusun monoklonal antikorunun bir efektör aktivitesini kontrol altinda tutmak için WOOO/6l739) bir PC alaninin pozisyon 297lsinde asparagine (Asn) baglanan bir kompleks tipte N-baglantili seker zincirinin bir indirgeyici ucunda mevcut N-asetilglukosamine (GlcNAc) bagli olan bir fukoz miktarini kontrol altinda tutmak için bir usul (bundan sonra, ayrica "çekirdek fukoz" olarak atifta bulunulur), antikorun bir PC alaninin amino asit grubunun(gruplarinin) modifiye edilmesiyle bir monoklonal antikorunun bir efektör aktivitesini kontrol altinda tutmak için bir usul ve benzerleri bilinmektedir. Mevcut bulusun anti-TlM-3 inonoklonal antikorunun efektör aktivitesi, usullerin herhangi birinin kullanilmasiyla kontrol altinda tutulabilir. anlamindadir. Efektör aktivitesi olarak, ADCC aktivitesi, CDC aktivitesi, fagositle, örnegin makrofajlar veya dendritik hücrelerle bir antikora bagimli fagositoz (ADP aktivitesi), ve benzerleri bilinmektedir.
Bir antikorun Fc'sinin bir kompleks tipte N-baglantili seker zincirinin çekirdek fukozunun bir içeriginin control altinda tutulmasiyla, antikorun bir efektör aktivitesi arttirilabilir veya azaltilabilir. Antikorun Fcisine bagli bir kompleks tipte N-baglantili seker zincirine bagli olan bir fukoz içerigini düsürmek için bir usule göre, fukozun bagli olmadigi bir antikor, (11,6- fukosiltransferazi kodlayan bir geride yoksun olan bir CHO hücresi kullanilarak bir antikorun ekspresyonu elde edilebilir. Fukozun bagli olmadigi antikor, yüksek bir ADCC aktivitesine sahiptir.
Diger yandan, bir antikorun Fc”sine bagli bir kompleks tipte N-baglantili seker zincirine bagli olan bir fukoz içerigini arttirmak için bir usule göre, Iiikozun bagli oldugu bir antikor, 011,6- fukosiltransferazi kodlayan bir gene katilan bir konakçi hücre kullanilarak bir antikorun ekspresyonuyla elde edilebilir. Fukozun bagli oldugu antikor, fukozun bagli olmadigi antikordan daha düsük bir ADCC aktivitesine sahiptir.
Ayrica, bir antikorun bir PC alaninda amino asit kalintisinin(kalintilarinin) modifiye edilmesiyle, ADCC aktivitesi veya CDC aktivitesi arttirilabilir veya azaltilabilir. Örnegin, bir antikora baglanma aktivitesi, USZOO7/Ol48165,te açiklanan FC alaninin amino asit dizisi kullanilarak arttirilabilir. Ayrica, ADCC aktivitesi veya CDC aktivitesi, US Patent No. edilmesiyle arttirilabilir veya azaltilabilir.
Bundan baska, efektör aktivitesinin kontrol altinda tutuldugu bir antikor, bir antikor içerisinde yukaridaki usulün birlestirilmesiyle elde edilebilir.
. Mevcut bulusun anti-TIM-3 monoklonal antikoru veya antikor fragmaninin kullanildigi hastaligi tedavi etmek için usul Mevcut bulusun monoklonal antikoru, bir TIM-3 pozitif hücreyle ilgili bir hastaligi tedavi etmek için kullanilabilir.
Mevcut bulusun antikoru veya bunun türevlerini içeren terapötik madde, bir aktif bilesen olarak sadece antikor veya antikor fragmani veya bunun türevleri olabilir, ve tercihen farmasötikler teknik alaninda iyi bilinen uygun bir usulle üretilen, bunun, bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilen tasiyiciyla karistirilmasiyla farmasötik bir preparasyon olarak tedarik edilir.
Bir uygulama yolu örnekleri arasinda agizdan uygulama ve agizdan olmayan uygulama, örnegin yanaktan, trakeal, rektal, subkütanöz, kas içi veya intravenöz uygulama yer alir.
Dozaj form örnekleri arasinda Spreyler, kapsüller, tabletler, toz, granüller, suruplar, emülsiyonlar, süppozituarlar, enjeksiyonlar, merhemler, bantlar ve benzerleri yer alir.
Agizdan uygulama için uygun farmasötik preparasyon emülsiyonlar, suruplar, kapsüller, tabletler, tozlar, granüller ve benzerlerini içerir.
Sivi preparasyonlar, örnegin emülsiyonlar ve suruplar, katki maddeleri olarak, su; sekerler, örnegin sükroz, sorbitol ve fruktoz; glikoller, örnegin polietilen glikol ve propilen glikol; yaglar, örnegin susam yagi, zeytinyagi ve soya fasülyesi yagi; antiseptik, örnegin p- hidroksibenzoik asit esterler; aroma vericiler, örnegin çilek aromasi ve nane; ve benzerleri kullanilarak üretilebilir.
Kapsüller, tabletler, tozlar, granüller ve benzerleri, katki maddeleri olarak, eksipiyanlar, örnegin laktoz, glukoz, sükroz ve mannitol; parçalayici maddeler, örnegin nisasta ve sodyum alginat; kayganlastiricilar, örnegin magnezyum stearat ve talk; baglayicilar, örnegin polivinil alkol, hidroksipropilselüloz ve jelatin; yüzey aktif maddeler, örnegin yag asidi esteri; plastiklestiriciler, örnegin gliserin; ve benzerleri kullanilarak üretilebilir.
Parenteral uygulama için uygun farmasötik preparasyon arasinda enjeksiyonlar, Süppozituarlar, Spreyler ve benzerleri yer alir.
Enjeksiyonlar bir tasiyici, örnegin bir tuz çözeltisi, bir glukoz çözeltisi veya bunlarin her ikisinin bir karisimi kullanilarak hesaplanabilir.
Süppozituarlar bir tasiyici, örnegin kakao yagi, hidrojenlenmis yag veya karboksilik asit kullanilarak hesaplanabilir.
Spreyler, antikor veya bunun gibi antikor fragmani kullanilarak veya bu, hastanin yanagi veya hava yolu mukoz membranini stimüle etmeyen bir tasiyiciyla birlikte kullanilarak hesaplanabilir ve ince parçaciklar olarak dagitarak bilesigin absorpsiyonunu kolaylastirilabilir. Tasiyici laktoz, gliserol ve benzerlerini içerir. Farmasötik preparasyonlar, örnegin aerosoller ve kuru tozlar üretinek mümkündür.
Ilaveten, oral preparasyonlar için katki maddeleri olarak örneklendirilen bilesenler ayrica parenteral preparasyonlara ilave edilebilir. 6. Mevcut bulusta anti-TIM-3 monoklonal antikor kullanilarak hastaligi teshis etmek için usul TIM-3 ile ilgili bir hastalik, mevcut bulusun monoklonal antikoru veya antikor fragmani kullanilarak TIM-3 veya TlM-3”ü eksprese eden bir hücrenin saptanmasiyla veya belirlenmesiyle teshis edilebilir.
TIM-3 ile ilgili hastaliklarin biri olan bir kanser tanisi, örnegin, TIM-3'ün müteakip saptanmasi veya ölçümüyle gerçeklestirilebilir.
Kanser tanisi, bir hasta'nin vücudundan hücre üzerinde TIM-3 ekspresyonunun in vitro saptanmasiyla bir immünolojik usulle, örnegin bir akis sitometrisiyle gerçeklestirilebilir.
Bir immünolojik usul, bir antikor miktari veya bir antijen miktarinin, bir etiketli antijen veya antikor kullanilarak saptandigi veya belirlendigi bir usuldür. Immünolojik usulün örnekleri arasinda radyoaktif madde-etiketli immünoantikor usul, enzim immünoanalizi, floresan immünoanalizi, luminesan immünoanalizi, Western blotting usulü, fiziko-kimyasal araç-lar ve benzerleri yer alir.
Radyoaktif madde-etiketli immünoantikor usulünün örnekleri arasinda mevcut bulusun antikor veya antikor fragmaninin, bir antijenle, bir antijen eksprese eden bir hücreyle veya benzerleriyle reaksiyona girmesine imkan verildigi, ardindan bir radyoaktif etiketlemeye veya bunun bir baglanma fragmanina tabi tutulan anti-immünoglobulin antikorun bunlarla reaksiyon girmesini imkan verildigi, bunu bir sintilasyon sayaci veya benzerleri kullanilarak belirlenmesinin takip ettigi bir usul yer alir.
Enzim immünoanalizinin örnekleri arasinda mevcut bulusun antikor veya antikor fragmaninin, bir antijen, bir antijen eksprese eden bir hücre veya benzerleriyle reaksiyona girmesine imkan verildigi, ardindan antikor etiketlemeye tabi tutulan bir anti- immünoglobulin antikor veya bunun bir baglanma fragmaninin bununla reaksiyona girmesine imkan verildigi ve renklendirilmis pigmentin bir spektrofotometreyle ölçüldügü, ve, örnegin, sandviç ELISAlnin kullanilabildigi bir usul yer alir.
Enzim immünoanalizde kullanilan bir etiket olarak, herhangi bir bilinen enzim etiketi (Enzyme Immunoassay, Igaku Shoin tarafindan yayinlanir, 1987) açiklandigi gibi kullanilabilir. Örnekler arasinda alkalin fosfataz etiketleme, peroksidaz etiketleme, lusiferaz etiketleme, biyotin etiketleme ve benzerleri yer alir.
Sandviç ELISA, bir antikorun, bir kati faza bagli oldugu, saptanacak veya ölçülecek antijenin yakalandigi ve baska bir antikorun, yakalanan antijenle reaksiyona sokulmasina imkan verildigi bir usuldür. ELISA”da, saptanacak veya ölçülecek antijeni taniyan iki tür antikor veya bunun, antijeni taniyan alanin farkli oldugu antikor fragmani hazirlanir ve birinci antikor veya antikor fragmanlari bir plaka üzerinde (örnegin bir 96-kuyucuklu plaka) önceden adsorbe edilir ve ikinci antikor veya antikor fragmani bir Iloresan maddesi, örnegin FITC, bir enzim, örnegin peroksidaz, veya biotinle etiketlidir.
Yukaridaki antikorun adsorbe edildigi plakanin, canli vücuttan ayrilan hücre veya bunun dagitilmis hücre süspansiyonu, doku veya bunun dagitilmis çözeltisi, hücre kültürünün üst fazi, serum, plevral effüzyon, assitler, göz çözeltisi veya benzerleriyle reaksiyona sokulmasina imkan verilir, ardindan bir etiketli inonoklonal antikor veya bir antikor fragmanla reaksiyona girmesine imkan verilir ve etiketlenen maddeye karsilik gelen bir saptama reaksiyonu gerçeklestirilir. Test edilecek numunede antijen konsantrasyonu bir kalibrasyon egrisinden hesaplanabilir ve bilinen konsantrasyonun antijenin bir asamali seyreltmesiyle hazirlanabilir.
Sandviç ELISA için kullanilan antikor olarak, poliklonal antikor ve monoklonal antikorun herhangi biri kullanilabilir veya antikor fragmanlar, örnegin Fab, F ab' ve F (ab)2 kullanilabilir.
Sandviç ELISA”da kullanilan 2 tür antikorun bir kombinasyonu olarak, farkli epitoplari taniyan monoklonal antikorlar veya antikor fragmanlarinin bir kombinasyonu kullanilabilir veya poliklonal antikorun monoklonal antikorla veya antikor fragmanlarla bir kombinasyonu kullanilabilir.
Bir floresan immünoanaliz literatürde açiklanan bir usulü [Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Üçüncü baski, Academic Press (1996); Manual for Monoclonal Antibody Experiments, Kodansha Scientific (1987)] ve benzerlerini içerir. Floresan immünoanaliz için bir etiket olarak, bilinen Iloresan etiketlerin herhangi biri [Fluorescent FITC, RITC ve benzerleri yer alir.
Luminesan immünoanaliz, literatürde açiklanan usuller [Bioluminescence and Chemical Luminescence, Rinsho Kensa, 42, Hirokawa Shoten (1998)] ve benzerleri kullanilarak gerçeklestirilebilir. Luminesan immünoanaliz için kullanilan bir etiket olarak, bilinen luminesan etiketlerinin herhangi bir dahil edilebilir. Örnekler arasinda akridinuin ester, lofin veya benzerleri yer alir, bunlar kullanilabilir.
Western blotting, bir antijen veya bir antijen eksprese eden bir hücrenin, SDS (Sodyum dodesil sülfat)-PAGE [Antibodies-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)] ile parçalandigi bir usuldür, jel, PVDF membrani veya nitroselüloz membrani üzerinde lekelenir, membran, antijen-taniyan antikor veya antikor fragmaniyla reaksiyona girmesine imkan verilir, ayrica bir floresan maddesiyle, örnegin FITC, bir enzim etiketi, Örnegin peroksidaz, bir biyotin etiketleme, veya benzerleri ile etiketli olan bir anti-fare IgG antikor veya antikor fragmaniyla reaksiyona girmesine imkan verilir, ve etiket, reaksiyonun dogrulanmasi için görsellestirilir. Bunun bir örnegi asagida açiklanmaktadir.
DIZI TANIM NO: 53 ile temsil edilen amino asit dizisine sahip bir polipeptidin eksprese edildigi hücreler veya dokular bir çözelti içinde çözündürülür ve, indirgeme kosullari altinda, beher serit için bir protein miktari olarak 0.1 ila 30 tig, bir SDS-PAGE usulüyle elektroforezlenir. Elektroforezlenen protein, bir PVDF membranina aktarilir ve oda sicakliginda 30 dakika bloke etmek için %1 ila %10 BSA (bundan sonra "BSA-PBS" olarak atifta bulunulur) içeren PBS ile reaksiyona girmesine imkan verilir.
Burada, mevcut bulusun inonoklonal antikorunun, bununla reaksiyona girmesine imkan verilir, %005 ila %01 Tween 20 içeren PBS ile (bundan sonra "Tween-PBS" olarak atifta bulunulur) yikanir ve oda sicakliginda 2 saat peroksidazla etiketli keçi anti-fare lgG ile reaksiyona girmesine imkan verilir. Bu, Tween-PBS ile yikanir ve böylelikle DIZI TANIM NO: 1 ile temsil edilen amino asit dizisine sahip bir polipeptidi saptamak için monoklonal antikorun baglandigi bir serit, ECL Western Blotting Saptaina Reaktif maddeleri (Amersham tarafindan imal edilir) veya benzerleri kullanilarak saptanir. Western blotting,de saptamak için kullanilan bir antikor olarak, bir dogal tipte hiç üç-boyutlu yapisi olmayan bir polipeptide baglanan bir antikor kullanilir.
Fizikokimyasal usulü, bir agrega olusturmak için antijen olarak TIM-3°ün, mevcut bulusun antikor veya antikor fragmaniyla reaksiyona sokulmasiyla, ve detecting bu agreganin saptanmasiyla spesifik olarak gerçeklestirilebilir. Fizikokimyasal usullerin baska örnekleri arasinda bir kapiler usulü, bir tek boyutlu immünodifûizyon usulü, bir immünoturbidimetri, bir lateks immünoturbidimetri [Handbook of Clinical Test Methods, Kanehara Shuppan, (1988)] ve benzerleri yer alir. Örnegin, bir lateks immünodifüizyon usulü, bir tasiyici, örnegin antikor veya antijenle duyarlastirilan yaklasik 0.] ila 1 um,lik bir parçacik boyutuna sahip polisitiren lateks kullanilabilir ve bir antijen-antikor reaksiyonu, karsilik gelen antijen veya antikor kullanilarak gerçeklestirildiginde, iletilen isik azaliken, reaksiyon çözeltisindeki saçilmis isik artar. Bu tür bir degisiklik, absorbans veya integral küre turbidite olarak saptandiginda, test edilecek numunede antijen konsantrasyonu, vsfyi ölçmek mümkündür. ilaveten, TIM-3`ü eksprese eden hücrenin saptanmasi için, bilinen immünolojik saptama usuller kullanilabilir, ve bir immüno-çökeltme usul, bir immüno hücre boyama usulü, bir immün doku boyama usulü, bir floresan antikor boyama usulü ve benzerleri tercihen kullanilir.
Bir immüno-çökeltme usulü, TlM-3”ü eksprese eden bir hücrenin, mevcut bulusun monoklonal antikoru veya antikor fragmaniyla reaksiyona girmesine imkan verildigi ve ardindan immunoglobuline, örnegin protein G-Sefaroza, spesifik baglanma özelligine sahip bir tasiyicinin ilave edildigi bir usuldür, böylelikle bir antijen-antikor kompleksi çökeltilir.
Ayrica, asagidaki usul gerçeklestirilebilir. Mevcut bulusun yukarida açiklanan antikor veya antikor fragmani, ELISA için bir 96-kuyucuklu plaka üzerinde kati fazlidir ve ardindan BSA- PBS ile bloke edilir.
Antikor, hibridom hücrenin bir kültür üst fazi gibi bir saflastirilmamis halde oldugunda, anti- fare immünoglobulin veya siçan immünoglobulin veya Protein A veya Protein G veya benzerleri ELISA için bir 96-kuyucuklu plaka üzerinde önceden adsorbe edilir ve BSA-PBS ile bloke edilir ve hibridom hücrenin bir kültür üst fazi baglanma için buna dagitilir. After BSA-PBS atildiktan ve kalinti PBS ile yeterli sekilde yikandiktan sonra, reaksiyon, TlM-3'ü eksprese eden hücreleri veya dokularinin bir çözündürülmüs çözeltisiyle gerçeklestirilir. Bir immün çökelti, iyi yikanmis plakadan, SDS-PAGE için bir numune tamponuyla ekstrakte edilir ve yukarida açiklanan Western blotting ile saptanir.
Bir immün hücre boyama usulü veya bir immün doku boyama usulü, bir antikorun, hücrelere veya dokulara kolaylikla nüfuz etmesini saglamak için antijenin eksprese edildigi hücrelerin veya dokularin, gerekirse, bir yüzey aktif madde, metanol veya benzerleriyle muamele edildigi bir usuldür, ardindan mevcut bulusun monoklonal antikorunun, bununla reaksiyona girmesine izin verilir, ardindan ayrica bir anti-immünoglobulin antikorla veya bunun Iloresan etiketlemesi, örnegin FITC, enzim etiketi, örnegin peroksidaz veya biyotin etiketlemesine tabi tutulan baglanma fragmaniyla reaksiyona girmesine izin verilir ve etiket görsellestirilir ve bir mikroskop altinda gözlemlenir.
Ilaveten hücreler, bir immünotloresan boyama usulüyle saptanabilir, burada hücrelerin bir floresan-etiketli antikoruyla reaksiyona girmesini izin verilir ve bir akis sitometresiyle analiz edilir [Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Üçüncü Baski, Academic Press (1996), Manual for Experiments of Monoclonal Antibodies, Kodansha Scientific ( 1987)] burada hücrelerin, bir floresan-etiketli antikorla reaksiyona girmesine ve bir akis sitometresiyle analiz edilmesine imkan verilir. Özellikle, TIM-?ün bir hücre disi alaninin amino asitler dizilerine baglanan mevcut bulusun monoklonal antikoru veya bunun bir üç-boyutlu yapisi, bir floresan antikor usulüyle bir dogal üç-boyutlu yapiyla korunan polipeptidi eksprese eden bir hücreyi saptayabilir.
Ilaveten, Iloresan antikor boyama usulleri arasinda FMATSIOOHTS sistemi (Applied Biosystems tarafindan imal edilir) ve benzerlerinin kullanildigi durumda, antijen miktari veya antikor miktari, antikor-antijen kompleksinin olusumuyla ilgisi olmayan, olusturulan antikor- antijen kompleksi ve serbest antikor veya antijeni ayrilmadan ölçülebilir.
Mevcut bulus, TlM-3”ün bir hücre disi alaninin amino asitler dizilerine baglanan ve ADCC aktivitesini eksprese eden bir monoklonal antikor veya bir üç-boyutlu yapi; antikoru kodlayan bir DNA; DNA°yi içeren bir vektör; vektörün dönüstürülmesiyle elde edilen bir transformant; transformantin kullanildigi bir antikor üretmek için bir islem; beseri TIM-?ü immünolojik olarak saptamak veya ölçmek için bir in vitro usul; ve bir beseri TIM-3 pozitif hücreyle ilgili bir kanser için bir terapi usulünde kulanim için bulusun monoklonal antikorunu sunabilir.
Bundan sonra, mevcut bulusun örnek teskil edici düzenlemeleri spesifik olarak açiklanacaktir. Ancak, mevcut bulus, asagida açiklanan örnek teskil edici düzenlemelerle sinirli degildir.
(Beseri TIM-3 cDNA3nin moleküler klonlanmasi ve stabil ekspresyon hücresinin yerlestirilmesi) Beseri TIM-3 cDNA, bir sablon olarak ExTaq (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) ve Human MTC panel (Clontech tarafindan imal edilir) kullanilarak PCR ile güçlendirildi.
Primerler için, TIM-3 FW2 (DIZI TANIM NO: 31) ve TIM-3 Re2 (DIZI TANIM NO: 32) kullanildi. Elde edilen PCR ürünü, pGEM-T Easy vektörüne (Promega Corp. tarafindan imal edilir) yerlestirildi, ve plasmid, güçlendirmek için TOPlO One shot rekabetçi hücrelere (Invitrogen tarafindan imal edilir) katildi. Plazmid DNA, miniprep usulüyle ekstrakte edildi.
Primerler TIM-3 FW ve TIM-3 Re2 kullanilarak saflastirilmis DNA dizisinin analiz edilmesiyle, GenBank erisim numarasi NM_0327825nin kodlama alani olarak ayni diziye sahip klon seçildi. Bir beseri TIM-3 retrovirus (hTIM-3/pMCs-IG), seçilen klonun, Retrovirus Constructive System Ampho (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) kullanilarak pMCs-IRES-GFP vektörüne (hücre Biolabs Inc. tarafindan imal edilir) yerlestirilmesinin rekombinasyonuyla olusturuldu.
Beseri TIM-3 retrovirüs, TIM-3”ü endojen olarak eksprese etmedigini dogrulamak için Jurkat L enfekte edildi, bu, akis sitometri analiziyle dogrulandi. Çesitli geçislerden sonra, TIM-3 pozitif hücreler, FACSAria (BD Biosciences tarafindan imal edilir) ile toplandi. Beseri TIM-3 stabil ekspresyon hücre hatti, çesitli geçislerden sonra FACSAria ile TIM-3 pozitif hücrelerin yeniden toplanmasiyla olusturuldu. (Çözünür hücre disi beseri TIM-3-beseri Fc,nin füzyon proteininin ekspresyon vektörünün preparasyonu) Beseri TIM-3sün hücre disi alanini kodlayan cDNA, ExTaq (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) ve bir sablon olarak Örnek l°de olusturulan hTIM-3/pMCs-Ig kullanilarak PCR ile güçlendirildi. Primerler için, pMCs-Fw (DIZI TANIM NO: 33) ve TIMSED-FcReXba 2 (DIZI TANIM NO: 34) kullanildi.
Güçlendirilmis PCR ürünü, pTracer-CMV-FLAG-beseri FC vektörüne [beseri IgGl ,in FLAG ve F c bölgesinin Xbal alan ve Apal alan arasinda pTracer-CMV (lnvitrogen tarafindan imal edilir) vektörüne yerlestirildigi modifiye edilmis vektör] yerlestirildi. Plazmid, güçlendirmek için TOPlO One shot rekabetçi hücrelerine katildiktan sonra (Invitrogen tarafindan imal edilir), plazmid DNA (sTlM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV) miniprep usulüyle ekstrakte edildi.
Bir primer olarak T7 (DIZI TANIM NO: 35) ve hTIM-3 Fwl (DIZI TANIM NO: 36) kullanilarak DNA dizisi analiziyle, sailastirilmis sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMVinin, GenBank erisim numarasi NM_032782'de karsilik gelen alan olarak ayni nükleotid dizisine sahip oldugu dogrulandi. Nükleotid dizi (EcoRl tanima alani ila Apal tanima alani) DIZI TANIM NO: 37 ile temsil edilen nükleotid dizisiyle özdesti. (Çözünür hücre disi beseri TIM-yün ekspresyon vektörünün preparasyonu) Beseri TIM-37ün hücre disi alanini kodlayan cDNA, bir sablon olarak Örnek 27de olusturulan ExTaq (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) ve sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV kullanilarak PCR ile güçlendirildi. Primerler olarak, TIM-3 Fw2 (DIZI TANIM NO: 31) ve TIM3ED-FLAG4aa (DIZI TANIM NO: 39) kullanildi.
Ardindan, FLAG epitopu, primerler olarak EXTaq (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir), TIM-3 Fw2 (DIZI TANIM NO: 31) ve C-FLAG-NotR2 (DIZI TANIM NO: 40) ve bir sablon olarak elde edilen PCR ürünü kullanilarak PCR usulüyle baglandi. PCR ürünü, pGEM-T Easy vektörüne (Promega Corp. tarafindan imal edilir) yerlestirildi. Plazmid, plazmid DNAiyi (sTlM-3-FLAG/pEF6Myc_HisC) güçlendirmek için TOPlO One shot rekabetçi hücrelere (Invitrogen tarafindan imal edilir) katildiktan sonra miniprep usulüyle ekstrakte Bir primer olarak T7 (DIZI TANIM NO: 35) ve BGH-R (DIZI TANIM NO: 41) kullanilarak DNA dizisi analiziyle, saflastirilmis sTlM-3-FLAG-Fc/pEF6 Myc_HisC, GenBank erisim numarasi NM_032782,de karsilik gelen alan olarak ayni nükleotid diziye sahip oldugu dogrulandi. (Çözünür hücre disi beseri TIM-3-beseri Pc ve çözünür hücre disi beseri TIM-yün Sirasiyla Örnek 2 ve Örnek 3ide elde edilen sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV plazmid DNA ve sTlM-3-FLAG-Fc/pEF6 Myc_HisC plazmid DNA”n1n her biri, HEK293F hücrelere (lnvitrogen tarafindan imal edilir) katildi ve geçici olarak eksprese edildi. Alti gün sonra, hücre üst fazinin her biri geri kazanildi ve protein satlastirmasi için kullanildi. Çözünür hücre disi beseri TIM-3-beseri Fe veya çözünür hücre disi beseri TIM-yün füzyon proteinini içeren kültür üst fazi, transfeksiyondan alti gün sonra santriûigasyonla geri kazanildi. Füzyon proteinleri imalatçinin protokollerine göre Anti-FLAG M2 Agarose Alinite jel (Sigma-Aldrich Co., LLC. tarafindan imal edilir) kullanilarak hazirlanan bir anti-FLAG kolonuyla ve FLAG peptidlerle (Sigma-Aldrich Co., LLC. tarafindan imal edilir) saflastirildi.
Elute edilen numuneler parçalara ayrildi ve ardindan her bir fraksiyon, indirgenmis kosullar altinda SDS-PAGE ile analiz edildi, ve ardindan gümüs lekeleme ve Western blotting gerçeklestirildi. Western blotting için, bir anti-FLAG M2 antikoru (Sigma-Aldrich C0., LLC. tarafindan imal edilir) ve bir alkalin fosfataz etiketli tavsan anti-fare immünoglobulin antikoru kullanildi (Dako tarafindan imal edilir). Hedef proteini içeren fraksiyon, Amicon Ultra 4 10K (Millipore tarafindan imal edilir) kullanilarak konsantre edildi ve Superdex 200 gp kolonu (GE Healthcare tarafindan imal edilir) kullanilarak jel filtrasyonu kromatografisi için uygulandi.
Parçalara ayirdiktan sonra, her bir fraksiyon, indirgenmis kosullar altinda SDS-PAGE°a uygulandi, gümüs lekelendi ve ardindan Western blot'a tabi tutuldu. Hedef proteinin bulundugu fraksiyon konsantre edildi ve 0.5 mL PBS ile yikandi. Çözünür hücre disi beseri TIM-3-beseri Fc lüzyon proteini veya çözünür hücre disi beseri TIM-3, 0.22 um,lik bir gözenek çapina sahip MlLLEX-GV sterilize edici filtre ile (Millipore tarafindan imal edilir) süzüldükten sonra toplandi. Protein safligi, endotoksini saptamak için bir kit Limulus ES-ll kit Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. tarafindan imal edilir) ile ölçüldü ve fraksiyonun yeterli sekilde saflastirildigi dogrulandi.
(Fare eksprese eden beseri antikor preparasyonu) Immünizasyon için kullanilan fareler, endojen lg agir zincir yeri ve K hafif zincir yerinin her ikisinin homozigot olarak dagitildigi ve ayni zamanda bir beseri agir zincir transkromozom, ve bir beseri IgK zincir transgen (KC05) içeren bir kromozom 14 fragmaninin (SC20) elde edildigi bir genetik ardalana sahiptir. Bu fare susu, beseri lg agir zincir yerine sahip çapraz soy fareler sus A ve beseri ng zincir transgenini elde eden fareler sus B ile olusturuldu.
Fare sus A, endojen Ig agir zincir yeri ve K hafif zincir yerinin her ikisinin homozigot olarak dagitildigi, ve döle iletilebilen bir kromozom 14 fragmaninin (SC20) korundugu, ve örnegin, Tomizuka ve digerleri, (Tomizuka, K. ve digerleri, 2000, Free. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727),de açiklanan bir homozigottur.
Fare Sus B, endojen Ig agir zincir yeri ve K hafif zincir yerinin her ikisinin homozigot olarak dagitildigi, ve bir beseri IgK hafif zincir transgeninin (KC05) korundugu (transgenik fare), ve fare susudur.
Hayvan birey, sus Alnin çapraz soy erkek faresi ve sus B'nin disi faresi, veya sus Asnin disi faresi ve sus B”nin erkek faresiyle elde edildi ve beseri Ig agir zincir ve IgK hafif zincirin, ayni zamanda bunlarin serumunda saptanabildigi bir fareydi[Ishida& Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering, Abstract 2000] ayrica immünolojikdeneyler için kullanildi. Bilginiz için, fare eksprese eden beseri antikor (bundan sonra "KM fare" olarak atifta bulunulur) bir lisans olusturularak Kyowa Hakko Kirin9den elde edilebilir.
(Anti-beseri TIM-3 monoklonal antikor preparasyonu) Mevcut Örneklte monoklonal antikor preparasyonu, Monoclonal Antibody Experiment Manual“de yayinlananlar gibi (Yasuhigashi Tamie ve digerleri, Kodansha, 1991) genel usullere göre gerçeklestirildi. Örnek 1`de hazirlanan L929 hücreyi eksprese edilen TIM-3 ya da Örnek 4”de hazirlanan çözünür hücre disi beseri TlM-3-beseri Fc füzyon proteini, bir TIM-3 immünogen olarak kullanildi. Immünize edilen hayvan, yukarida açiklanan KM faresiydi.
L929 hücreyi eksprese eden TIM-3, bir 1><107 hücre/hayvan dozunda farelere intraperitoneal olarak enjekte edildi. Birinci immünizasyondan sonra, ayni hücre ayrica bundan sonra baska bir üç kez veya daha fazla uygulandi. Dalagi elde etmeden üç gün önce, Örnek 4lte hazirlanan çözünür hücre disi beseri TIM-3-beseri FC Hizyon proteini, 20 ug/farede kuyruk damarindan uygulandi. Dalak, iminünize edilen fareden cerrahi olarak giderildi, 4 mL PBS7ye koyuldu ve bir Siringa piston kullanilarak bir ag üzerinde ezilir (hücre süzgeci: Falcon tarafindan imal edilir).
Hücreler, agdan geçirilen hücre süspansiyonunun santriiüjlenmesiyle çökeltilir, ve hücreler, 1 mL Kirmizi Kan hücre Liziz Tamponu (Sigma-Aldrich C0., LLC. tarafindan imal edilir) içinde yeniden süspansiyon halinde tutulur. 5 dakika oda sicakliginda inkübe edildikten sonra, 50 birim/ml penisilin ve 50 tig/ml streptomisin içeren 10 mL serum içermeyen DMEM ortami (lnvitrogen tarafindan imal edilir) (bundan sonra "serum içermeyen DMEM ortami" olarak atifta bulunulur) ilave edildi, ve hücreler santriiîigasyonla çökeltildi.
Hücre pelletleri, serum içermeyen DMEM ortami içinde süspansiyon halinde tutuldu. Diger yandan, miyelom hücre hatti SP %10 FBS, 50 birim/ml penisilin ve 50 ug/ml streptomisin (bundan sonra "serum içeren DMEM ortami" olarak atifta bulunulur) içeren DMEM ortaminda kültürlendi ve böylelikle 1><106 hücre/ml hücre sayisini asmayacak sekilde 37°C°de %5 COZ altinda inkübe edildi.
SP2/0 hücreleri, 10 mL serum içermeyen DMEM ortamiyla yikandi ve dalaktan elde edilen hücreler durumunda oldugu gibi serum içermeyen DMEM ortaminda süspansiyon halinde tutuldu. Dalaktan elde edilen hücrelerin bu süspansiyonu ve miyelom hücre süspansiyonu bir :] oranda karistirildi, santrifüjlendi, ve üst faz tamamen giderildi. Hücreleri kaynastirmak için, pellet, pipet tiple karistirilirken, 1 mL %50 (21/11) polietilen glikol (Boehringer Mannheim Corp. tarafindan imal edilir) yavas yavas ilave edildi, ve ardindan 37°C,de önceden isitilan l mL serum içermeyen DMEM ortaini ilave edildi. Yavas yavas, 5 ml ve 10 mL serum içermeyen DMEM ilave edildi, bunu 37°Clde, %5 C02 altinda 5 dakika inkübasyon takip Santrifügasyondan ve üst fazin giderilmesinden sonra, kaynasik hücreler %10 PES (Invitrogen tarafindan imal edilir), penisilin-streptomisin-glutamin (Invitrogen tarafindan merkaptoetanol (lnvitrogen tarafindan imal edilir, Katalog No. 21985-023lün lOOO-kat seyreltmesi) (bundan sonra "IL-6 içeren DMEM ortami" olarak atifta bulunulur) içeren 50 mL DMEM ortaminda yeniden süspansiyon halinde tutuldu ve 37°C”de %5 COz altinda inkübe edildi.
Ertesi gün, hücreler, pipetlenerek toplandi, santrifiijlendi ve pellet 10 mL IL-6 içeren DMEM ortaminda yeniden süspansiyon halinde tutuldu. Ertesi gün, Hipoksantin-aminopterin-timidin (bundan sonra "HAT" olarak atifta bulunulur, Sigma-Aldrich C0., LLC. tarafindan iinal edilir) ilave edildi. Yaklasik 7 ila 10 gün inkübe edildikten sonra, kültür üst fazi, hibridom taramasi için toplandi.
(Anti-beseri TIM-3 fare monoklonal antikor preparasyonu) Mevcut Örnekte monoklonal antikorun preparasyonu, Introduction to Monoclonal Antibody Experiinent (Yasuhigashi Tamie ve digerleri, Kodansha, 1991),de yayinlanan genel usullere göre gerçeklestirildi. Örnek lide açiklanan L929 hücreyi eksprese eden TIM-3 ya da Örnek 4,de hazirlanan çözünür hücre disi beseri TIM-3 bir TIM-3 immünogen olarak kullanildi.
Immünize edilen hayvan, Balb/c fareydi (Nihon Charles River”dan satin alindi).
Ilk olarak, bir Balb/c faresi, bir l> hücrelerini eksprese eden TlM-3iün enjekte edilmesiyle immünize edildi. Birinci immünizasyondan sonra, ayni hücre ayrica bundan sonra baska bir üç kez veya daha fazla uygulandi. Dalagin ekstrakte edilmesinden üç gün önce, Örnek 4“te hazirlanan çözünür hücre disi beseri TIM-3 proteini 20 ug/farede kuyruk damarindan uygulandi. Dalak immünize edilen fareden cerrahi olarak giderildi, 4 mL PBS,ye koyuldu ve bir siringa piston kullanilarak bir ag üzerinde (hücre süzgeci: Falcon tarafindan imal edilir) ezildi.
Hücreler, agdan geçirilen hücre Süspansiyonunun santrifîijlenmesiyle çökeltildi, ve hücreler l mL Kirmizi Kan hücre Liziz Tamponunda (Sigma-Aldrich Co., LLC. tarafindan imal edilir) yeniden süspansiyon halinde tutuldu. 5 dakika oda sicakliginda inkübe edildikten sonra, 10 mL serum içermeyen DMEM ortami ilave edildi, ve ardindan hücreler santrifügasyonla çökeltildi. Pelletler, serum içermeyen DMEM ortaminda yeniden süspansiyon halinde tutuldu. Diger yandan, miyelom hücre hatti SP, DMEM ortaminda 37°C3de %5 COz altinda inkübe edilerek 1 X 106 hücre/ml veya daha az hücre sayisina kültürlendi.
Dalaktan elde edilen hücrelere benzer sekilde, SP2/0 hücreleri, 10 inL serum içermeyen DMEM ortamiyla yikandi ve serum içermeyen DMEM ortaminda süspansiyon halinde tutuldu. Dalak hücresinin süspansiyonu ve miyeloin hücresinin süspansiyonu bir 5:1 oranda karistirildi. Santrifügasyondan sonra, üst faz giderildi. Bu pelete, l mL %50 (a/h) polietilen glikol (Boehringer Mannheim Corp. tarafindan iinal edilir), pellet, pipet tiple karistirilirken yavas yavas ilave edildi, ve ardindan 37°C°ye önceden isitilan l mL serum içermeyen DMEM ortami ilave edildi.
Bu süspansiyona, 5 mL DMEM ortami yavas yavas ilave edildi. 10 mL serum içermeyen DMEM ayrica ilave edildikten sonra, süspansiyon 5 dakika 37°Cide %5 CO2 altinda inkübe edildi. Süspansiyon santrifüjlendikten sonra, hücre pelletleri 50 mL IL-6 içeren DMEM ortaminda yeniden süspansiyon halinde tutuldu ve 37°C”de %5 COg altinda kültürlendi. Bir gün inkübasyondan sonra, hücreler pipetlenerek toplandi. Santriûigasyondan sonra, pellet, 10 mL IL-6 içeren DMEM ortaminda yeniden süspansiyon halinde tutuldu. Ertesi gün, HAT ortami (Sigma-Aldrich C0., LLC. tarafindan imal edilir) ilave edildi. Yaklasik 7 ila 10 gün inkübasyondan sonra, kültür üst fazi geri kazanildi ve hibridom taramasi için kullanildi.
(Beseri TIM-ye baglanan bir beseri veya fare monoklonal antikoru üreten hibridomun taranmasi) Hibridom, Örnek 6 ve Örnek 77de hazirlanan hücre üst fazi kullanilarak tarandi. Kullanilacak usul, hücre hatlarini eksprese eden beseri TIM-3`ün kullanildigi bir akis sitometri usulüydü.
Ilk olarak, Örnek llde hazirlanan lurkat hücre veya EoL-l hücreyi eksprese eden beseri TIM- 3, lekeleme ortamiyla (%2 PES ve % yikandi, ve ardindan 1 X 106 hücre/minik bir hücre yogunlugunu sunmak için 1 mL lekeleme ortaminda yeniden süspansiyon halinde tutuldu. Hücre süspansiyonu 10 pl/kuyucukta bir 96-kuyucuklu kültür plakaya dagitildi.
Sonra, 50 pl hibridom üst fazi ilave edildi ve 30 dakika 4°C°de inkübe edildi. Hücreler lekeleme ortamiyla iki kez yikandiktan sonra, lekeleme ortamiyla 200-kat seyreltilen 50 pl etiketli antikor her bir kuyucuga ilave edildi ve 30 dakika 4°C7de inkübe edildi. Etiketli antikorlar için, Keçi F(ab')2 Anti-Beseri IgG (y zincir spesifik)-R-PE (SouthernBiotech tarafindan imal edilir) beseri monoklonal antikor için kullanildi ve Keçi F(ab')2 Anti-Fare kullanildi.
Lekeleme ortamiyla iki kez yikandiktan sonra, hücreler, bir primer tarama olarak FACSCalibur (BD Biosciences tarafindan imal edilir) kullanilarak analiz edildi. Pozitif klonlar seçildikten ve genisletildikten sonra, hibridom hücreler, FACSAria (BD Biosciences tarafindan imal edilir) ile klonla ayrildi ve ayrica Hipoksantin-timidin (bundan sonra "HT" olarak atifta bulunulur, Sigma-Aldrich Co., LLC, tarafindan imal edilir) içeren IL-6 içeren DMEM ortaminda yedi gün kültürlendi.
Toplanan üst fazlar, anti-beseri TIM-3 beseri monoklonal antikoru eksprese eden hibridomlarin ve anti-beseri TIM-3 fare monoklonal antikoru eksprese eden hibridomlarin klonlanmasi için primer tarama usulündekiyle ayni sekilde tarandi ve seçilen hibridom klon, monoklonal antikorun saflastirilmasi için kullanildi.
(Hibridom kaynakli monoklonal antikorun saflastirmasi) Bir anti-TlM-3 beseri veya fare monoklonal antikoru, Örnek 8,de hazirlanan hibridomu eksprese eden anti-beseri TIM-3 beseri veya fare monoklonal antikordan saflastirildi. Kisaca, bir yüksek konsantrasyonda anti-TIM-3 antikoru içeren hibridom üst fazi, bir CELLine antikor üretimi sistemi (BD Biosciences tarafindan imal edilir) kullanilarak hazirlandi ve anti-beseri TIM-3 monoklonal antikoru, üst fazdan satlastirildi. Ilk olarak, klonlanan hibridomun, serum içermeyen ortama adapte olmasi için, hibridomlar, HT ve IL-6,yi içeren DMEM ortaminin ve BD hücre MAb serum içermeyen ortamiyla (BD Biosciences tarafindan imal edilir) bir 121 oranda karistirilan bir ortamda birkaç gün kültürlendi, ve ardindan bir 122 karistirma oranina sahip bir ortamda birkaç gün kültürlendi.
Ardindan, hibridomlar, bir BD hücre MAb serum içermeyen ortamda (BD Biosciences tarafindan imal edilir) kültürlendi ve hibridoinlar, serum içermeyen ortama adapte edildi.
Serum içermeyen ortama adapte edilen hibridom hücreler, imalatçinin talimatlarina göre CL- 1000 deney siselerinde kültürlendi ve yüksek konsantrasyonda anti-TlM-3 antikoru içeren hibridomun üst fazi deney siselerinden toplandi. Hibridomun üst fazindan antikor, Protein A kullanilarak standart prosedürlere uygun olarak saflastirildi.
Spesifik olarak, MabSelect (GE Healthcare tarafindan imal edilir) bir açik kolonda ambalajlandi ve PBS ile 2-kat seyreltilen üst faz dolduruldu ve ardindan 0.1 mol/L Glisin- HCl (pH 2.7) ile elute edildi, bunu, Amicon Ultra (Millipore tarafindan iinal edilir) ile konsantrasyon takip etti. Ardindan, bir NAP-5 kolonunun (GE Healthcare tarafindan imal edilir) kullanilmasiyla, elde edilen çözelti, PBS tamponuyla dengelendi, ve ardindan anti- beseri TIM-3 beseri monoklonal antikorlarin 4 klonunu (antikor 512, antikor 644, antikor 4545 ve antikor 4177) ve anti-beseri TIM-3 fare monoklonal antikorun bir klonunu (antikor 8213) elde etmek için filtrasyonla sterilize edildi.
(Anti-TIM-3 beseri monoklonal antikorun izotipinin tanimlanmasi) Örnek 9”da hazirlanan anti-TlM-3 beseri monoklonal antikorlarin izotipinin her biri, bir kati- faz ELISA ve akis sitometrisiyle belirlendi.
Spesifik olarak, kati-faz ELISA için oldugu gibi, Örnek 4,te elde edilen çözünür hücre disi beseri TIM-3, 1 ug/mFlik bir konsantrasyon sunmak için bir Karbonat-Biakarbonat Tamponuyla (Sigma-Aldrich C0., LLC. tarafindan imal edilir) seyreltildi ve bir 96-kuyucuklu kültür plakasina (Maxisorp, Nunc tarafindan imal edilir) 50 ul/kuyucukta dagitildi. Çözünür hücre disi beseri TIM-3, mikroplakaya 4°C°de gece boyunca inkübe edilerek adsorbe edildi. Üst faz bosaltildiktan sonra, TBS°de SuperBlock Blocking Tampon (PIERCE tarafindan imal edilir) plakaya ilave edildi ve ardindan 10 dakika oda sicakliginda inkübe edildi ve hibridomun 50 pl kültür üst faz ilave edildi ve ardindan 30 dakika oda sicakliginda inkübe edildi. Her bir kuyucuk %0.l Tween20 (TBS-T) içeren Tris-tamponlu tuzlu suyla yikandiktan sonra, HRP-etiketli fare anti-beseri lgGl, anti-beseri lgG2, anti-beseri lgG3 veya anti-beseri edildi; her bir antikor, sirasiyla %10 SuperBlock Blocking Tampon (SouthernBiotech Her bir kuyucuk TBS-T ile yikandiktan sonra, 50 pl substrat tampon (TMB, DAKO tarafindan imal edilir) ilave edildi ve ardindan 20 dakika oda sicakliginda inkübe edildi.
Reaksiyon, 50 pl 0.5 mol/L süliîîrik asit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. tarafindan imal edilir) ilave edilerek durduruldu. 450 nm dalga boyunda absorbans (referans dalga boyu: 570 nm) bir mikroplaka okuyucusu (VersaMaX, Molecular Devices, LLC. tarafindan iinal edilir) üzerinde ölçüldü.
Ilaveten, akis sitometri usulünde, Örnek 1'de hazirlanan beseri TIM-Saü eksprese eden Jurkat hücresi, lekeleme ortamiyla yikandi, ve ardindan hibridomun 50 pl üst fazi ilave edildi ve 30 dakika 4°C”de inkübe edildi. Yikandiktan sonra, 100-kat seyreltilen Fare anti-Beseri lgGl- PE, Fare anti-beseri IgG2-PE, Fare anti-beseri IgG3 (Hinge)-PE ve Fare anti-beseri ortamiyla ilave edildi, 4°Cide 30 dakika beklemeye birakilir ve ardindan FACSCalibur akis sitometresi (BD Biosciences tarafindan imal edilir) kullanilarak analiz edilir.
(Beseri TIM-3 için fare monoklonal antikor izotipinin tanimi) Örnek 9,da hazirlanan anti-beseri TIM-3 fare monoklonal antikorunun izotipi, Iso Strip Fare Monoklonal Antikor Izotipleme Kiti (Roche-diagnostics tarafindan imal edilir) kullanilarak belirlendi. Örnek 89de hazirlanan anti-TlM-3 antikorunu içeren hibridomun üst fazi kullanilarak, izotip, imalatçinin talimatlarina göre belirlendi. Sonuç olarak, antikor 82133ün izotipi, IgGZb olarak belirlendi.
(Anti-TIM-3 monoklonal antikor geninin izolasyonu) Örnek 93da hazirlanan anti TIM-3 beseri veya fare monoklonal antikorun geni, hibridomdan Which produced Örnek 9ida hazirlanan anti-beseri TIM-3 beseri veya fare monoklonal antikoru üreten hibridomdan izole edildi. Toplam RNA, imalatçinin talimatlarina göre High Pure RNA Izolasyon Kiti (Roche-diagnostics tarafindan imal edilir) kullanilarak klonlanmis hibridomdan ekstrakte edildi. Degisken alani kodlayan cDNA°nin klonlanmasi, buna eklenmis talimatlara göre SMART RACE CDNA amplifikasyon kiti (Clontech tarafindan imal edilir) kullanilarak gerçeklestirildi.
Beseri monoklonal antikorun agir zinciri (VH), UPM (SMART RACE cDNA amplifikasyon Kiti; Clontech tarafindan imal edilir) ve primer hh-6 (DIZI TANIM NO: 44) kullanilarak PCR ile güçlendirildi. Bir sablon olarak reaksiyon ürününün bir parçasi kullanilarak, PCR, NUP (SMART RACE cDNA amplifikasyon Kit; Clontech tarafindan imal edilir) ve primer hh-3 (DIZI TANIM NO: 45) kullanilarak gerçeklestirildi. PCR ürününün klonlanmasi, Zero Blunt TOPO PCR Klonlama Kiti (Invitrogen tarafindan imal edilir) kullanilarak gerçeklestirildi. Nükleotid dizi, vektörün evrensel primerleriyle (örnegin, T7 veya M13R primer) analiz edildi ve amino asit dizisi, nükleotid diziden ortaya çikarildi.
Sonuç olarak, antikor 512,nin VHasinin nükleotid dizisi ve amino asit dizisi sirasiyla DIZI TANIM NO: 54, ve DIZI TANIM NO: 55 tarafindan temsil edildi, antikor 644”ün VH,sinin nükleotid dizi ve amino asit dizisi sirasiyla DIZI TANIM NO: 58 ve DIZI TANIM NO: 59 tarafindan temsil edildi, antikor 4545lin VH°sinin nükleotid dizisi ve amino asit dizisi sirasiyla DIZI TANIM NO: 7 ve DIZI TANIM NO: 8 tarafindan temsil edildi, ve antikor 41 77°nin VH,sinin nükleotid dizi ve amino asit dizisi sirasiyla DIZI TANIM NO: 17 ve DIZI TANIM NO: 18 tarafindan temsil edildi. Elde edilen degisken alanlarin her biri ve beseri tarafindan imal edilir) baglandi.
Beseri monoklonal antikor hafif zinciri (VL), UPM (SMART RACE cDNA amplitikasyon Kiti; Clontech tarafindan imal edilir) ve primer hk-2 (DIZI TANIM NO: 46) kullanilarak PCR ile güçlendirildi. Bir sablon olarak reaksiyon ürününün bir parçasinin kullanilmasi, PCR, NUP (SMART RACE cDNA amplitikasyon Kiti; Clontech tarafindan imal edilir) ve primer hk-6 (DIZI TANIM NO: 47) kullanilarak gerçeklestirildi. PCR ürünü, Zero Blunt TOPO PCR Klonlama Kiti (lnvitrogen tarafindan imal edilir) kullanilarak klonlandi.
Nükleotid dizi, vektörün evrensel primerleriyle (örnegin, T7 veya M13R) analizi edildi ve amino asit dizisi, nükleotid diziden ortaya çikarildi.
Sonuç olarak, antikor 512inin VUsinin nükleotid dizisi ve amino asit dizisi sirasiyla DIZI TANIM NO: 56 ve DIZI TANIM NO: 57 tarafindan temsil edildi, antikor 6447ün VL,sinin nükleotid dizisi ve amino asit dizisi sirasiyla DIZI TANIM NO: 60 ve DIZI TANIM NO: 6 tarafindan temsil edildi, antikor 4545iin VL°sinin nükleotid dizisi ve amino asit dizisi sirasiyla DIZI TANIM NO: 9 ve DIZI TANIM NO: 10 tarafindan temsil edildi, ve antikor 4177'nin VL'sinin nükleotid dizisi ve amino asit dizisi sirasiyla DIZI TANIM NO: 19 ve DIZI TANIM NO: 20 tarafindan temsil edildi. Elde edilen degisken alanlarin her biri ve K zincirinin sabit alani yerlestirildi ve ekspresyon vektörü, N5KG1,e (Biogen IDEC Inc. tarafindan imal edilir) baglandi.
Fare monoklonal antikorun agir zinciri (VH), UPM (SMART RACE cDNA amplifikasyon Kiti; Clontech tarafindan imal edilir) ve bir primer, mH_va (DIZI TANIM NO: 48) kullanilarak PCR ile güçlendirildi. Sablon olarak reaksiyon ürünü e,nin bir parçasi kullanilmasiyla, PCR, NUP (SMART RACE cDNA amplifikasyon Kiti; Clontech tarafindan imal edilir) ve primer mH_RV2 (DIZI TANIM NO: 49) kullanilarak gerçeklestirildi.
PCR ürününün klonlanmasi, Zero Blunt TOPO PCR Klonlama Kiti (Invitrogen tarafindan imal edilir) kullanilarak gerçeklestirildi. Nükleotid dizi, vektörün evrensel primerleriyle (örnegin, T7 veya M13R) analiz edildi ve amino asit dizisi, nükleotid diziden ortaya çikarildi.
Sonuç olarak, antikor 8213'ün VHSSInin nükleotid dizisi ve amino asit dizisi sirasiyla DIZI TANIM NO: 27 ve DIZI TANIM NO: 28 tarafindan temsil edildi. Elde edilen degisken alan ve fare IgG2a,nin sabit alani baglandi ve ekspresyon vektörü, N5KGl”e (Biogen IDEC Inc. tarafindan imal edilir) yerlestirildi.
Fare monoklonal antikorun hafif zinciri (VL), UPM (SMART RACE cDNA ampliiikasyon Kiti; Clontech tarafindan imal edilir) ve primer mK_va (DIZI TANIM NO: 50) kullanilarak PCR ile güçlendirildi. Ilaveten, reaksiyon ürününün bir parçasi, bir sablon olarak kullanildi, ve PCR, NUP (SMART RACE cDNA amplifikasyon Kiti; Clontech tarafindan imal edilir) ve primer mK_Rv2 (DIZI TANIM NO: 51) kullanilarak gerçeklestirildi. PCR ürünü, Zero Blunt TOPO PCR Klonlama Kiti (Invitrogen tarafindan imal edilir) kullanilarak klonlandi.
Nükleotid diziler, vektörün evrensel primerleriyle (örnegin, T7 veya M13R) analiz edildi ve amino asit dizisi, nükleotid diziden ortaya çikarildi.
Sonuç olarak, antikor 8213,ün VL”sinin nükleotid dizisi ve ainino asit dizisi sirasiyla DIZI TANIM NO: 29 ve DIZI TANIM NO: 30 tarafindan temsil edildi. Elde edilen degisken alan ve K zincirinin sabit alani baglandi ve antikor 8213”ün VH,sini kodlayan yukarida belirtilen ekspresyon vektörüne yerlestirildi.
Ilaveten, bir negatif control olarak anti-dinitrofenil (DNP) beseri IgGl antikorunu elde etmek amaciyla, antikorun agir zincirinin (VH) nükleotid dizisi (DIZI TANIM NO: 62), antikorun hafif zincirinin nükleotid dizisi (DIZI TANIM NO: 64), ve beseri IgGl'in sabit alani ve K zinciri, ekspresyon vektörü N5KG1,e (Biogen IDEC Inc. tarafindan imal edilir) yerlestirildi.
(Rekombinant anti-TIM-3 beseri monoklonal defukoz antikorun saflastirilmasi) Bir rekombinant antikoru eksprese eden bir hücre, Örnek 127de hazirlanan rekombinant antikor ekspresyon vektörünün konakçi hücreye katilmasiyla üretildi. Ekspresyon için konakçi hücre olarak, FUT8`J'CHO hücreleri, bir yayinlanmis rapora (Clin Cancer Res 2006: 4177”nin her biri için ekspresyon vektörleri, FreeStileTM MAX Reaktif maddesi (lnvitrOgen tarafindan imal edilir) kullanlarak FUT8+ CHO hücreye katildi. FUT8"I`CHO hücreleri, %5 C0; altinda 37°C ,de bir çalkalayici üzerinde kültürlendi. Kültür üst fazi, yaklasik bes gün sonra geri kazanildi.
Geri kazanilan üst faz, Protein A (GE Healthcare tarafindan imal edilir) ve ayrica numune miktarina bagli olarak 0.8X40 cm kolonu (BioRad tarafindan imal edilir) ve benzerleri kullanilarak saflastirildi. Antikorlar, baglayici tampon olarak PBS ve elüsyon tamponu olarak 0.02 mol/L sodyum sitrat (pH 2.7, 50 mmol/L NaCl) tampon kullanilarak afiniteyle saflastirildi. Elüsyon fraksiyonu, 0.2 mol/L sodyum fosfat tamponuyla (pH 7.0) ilave edildi.
Hazirlanan antikor çözeltisi, NAP-25 kolon (GE Healthcare tarafindan imal edilir) kullanilarak PBS ile dengelendi ve Amicon Ultra (10000 kesim, Millipore tarafindan imal edilir) ile konsantre edilir. Filtrasyonla sterilizasyonda sonra, rekombinant anti-TIM-3 beseri edildi. Protein safligi, Limulus ES-II kit Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. tarafindan imal edilir) ile belirlendi ve bu antikorlarin yeterli sekilde saflastirildigi bulundu. Örnek 12sde hazirlanan anti-DNP°yi eksprese etmek için vektör, CHO-DG44 hücrelerine katildi. CHO-DG44 hücreleri, bir çalkalayici üzerinde 37°C,de %5 C02 altinda kültürlendi.
Kültürlenen üst faz, 5 gün inkübasyondan sonra geri kazanildi. Toplanan üst faz, numune miktarina bagli olarak Protein A (GE Healthcare tarafindan imal edilir) kullanilarak ve ayrica 0.8><40 cm kolon (BioRad tarafindan imal edilir) ve benzerleri kullanilarak saflastirildi.
Antikorlarin afinite satlastirmasi, baglayici tampon olarak PBS ve elüsyon tampon olarak 0.02 mol/L sodyum sitrat (pH 2.7, 50 mmol/L NaCl) tamponu kullanilarak gerçeklestirildi.
Elüsyon fraksiyonu, 0.2 mol/L sodyum fosfat tamponuyla (pH 7.0) ilave edildi. Hazirlanan antikor çözeltisi, PBS ile dengelendi ve sirasiyla Amicon Ultra (10000 kesim, Millipore tarafindan imal edilir) ile NAP-25 kolon (GE Healthcare tarafindan imal edilir) kullanilarak konsantre edildi. Filtrasyonla sterilizasyondan sonra, rekombinant anti-DNP antikor elde edildi. Protein safligi, bir Liinulus ES-II kit Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. tarafindan imal edilir) kullanilarak belirlendi ve antikorun yeterli sekilde saflastirildigi (Rekombinant anti-TIM-3 fare monoklonal antikorun satlastirilmasi) Örnek 12'de hazirlanan antikor 8213,ü eksprese etmek için vektör, 293 fektin (Invitrogen tarafindan imal edilir) kullanilarak HEK293F hücrelerine (Invitrogen tarafindan imal edilir) katildi. HEK293F hücreleri, 37°C'de %5 C02 altinda bir çalkalayici üzerinde inkübe edildi.
Kültürlenen üst faz, bes gün inkübasyondan sonra toplandi. Toplanan üst faz, numune miktarina bagli olarak Protein A (GE Healthcare tarafindan imal edilir) kullanilarak ve ayrica O.8><40 cm kolon (BioRad tarafindan imal edilir) ve benzerleri kullanilarak saflastirildi.
Antikorun afinite sailastirmasi, bir baglayici tampon olarak PBS ve bir elüsyon tampon olarak 0.02 mol/L sodyum sitrat tampon (pH 2.7, 50 mmol/L NaCl) kullanilarak gerçeklestirildi.
Elüsyon fraksiyonuna, 0.2 mol/L sodyum fosfat tampon (pH 7.0) ilave edildi. Hazirlanan antikor çözeltisi, NAP-25 kolon (GE Healthcare tarafindan imal edilir) kullanilarak PBS ile dengelendi ve Amicon Ultra (10000 kesim, Millipore tarafindan imal edilir) ile konsantre edildi. Filtrasyonla sterilizasyondan sonra, rekombinant anti-TIM-3 fare monoklonal antikor (8213 antikor) elde edildi. Protein safligi bir Limulus ES-ll kit Wako (Wako Pure Chemical (Sailastirilmis monoklonal antikorun floresan etiketlemesi) Hibridom kaynakli monoklonal antikor ve rekombinant monoklonal antikorun floresan etiketlemesi, imalatçinin talimatlarina göre Alexa Fluor 647 Monoklonal Antikor etiketleme Kiti (Invitrogen tarafindan imal edilir) kullanilarak gerçeklestirildi. Etiketlemeden sonra, her bir antikor, hücreleri eksprese eden TIM-3 için FACSCalibur (BD Biosciences tarafindan imal edilir) analiziyle Alexa Fluor 647 (bundan sonra "Alexa-647" olarak atifta bulunulur) ile pozitif olarak etiketli olacak sekilde do grulandi.
(Rekabet testi-1 kullanilarak epitoplarin siniflandirilmasi) Örnek 13 ve Örnek 14”te hazirlanan antikorlar ve piyasada satilan anti-TIM-3 antikor arasinda epitoplarin iliskisi bir rekabet testiyle analiz edildi. Kisaca, test antikorunun, Örnek l”de hazirlanan TIM-3 ekspresyon hücresiyle etkilesime girmesine imkan verilir, ve ardindan r baska bir anti-TIM-3 antikoru ayrica TIM-?ü eksprese eden hücrelere baglanabilsin ya da baglanamasin, akis sitometri usulüyle degerlendirildi.
Birinci asamada, Örnek 13 ve Örnek 14”te hazirlanan monoklonal antikorlarin her biri olsun ya da olmasin incelendi. Ilk olarak, beseri TIM-3”ü eksprese eden EoL-l hücreleri ve ana hücre, EoL-l hücreleri, lekeleme ortamiyla yikandi ve ardindan saflastirilmis sübjektif dakika) her biriyle reaksiyona birakilir. Nihai konsantrasyon 10 ug/mFydi. Ardindan, PE etiketli antikor ilave edildi ve reaksiyona girmeye birakilir (4°C, 30 dakika). Lekeleme ortamiyla yikandiktan sonra, 7- ADD (BD Biosciences tarafindan imal edilir) ilave edildi ve FACSCalibur (BD Biosciences tarafindan imal edilir) kullanilarak analiz edildi.
Sonuç olarak, keçiden elde edilen anti-beseri TIM-3 poliklonal antikoru ( R&D Systems tarafindan imal edilir) bir pozitif kontrol olarak kullanildi ve antikor 644 PE-etiketli antikor 344823°ün TlM-3”ü eksprese eden hücreye baglanmasini neredeyse tamamen bloke etti. eksprese eden hücrelere baglanmasini inhibe etti, fakat bu inhibisyon, antikor 644°ünkinden birbiriyle rekabete girdigi, fakat bunlarin kisinen rekabete girdigi tespit edildi.
Ikinci asamada, test edilen anti-TIM-3 monoklonal antikorlar arasinda, antikor 344823 ile incelendi. Deney, bir etiketli antikor olarak Örnek 157te hazirlanan Alexa-647 etiketli antikor antikor 512inin TIM-?ü eksprese eden hücrelere baglanmasini inhibe etmedi. baglanmasini inhibe etti. Dolayisiyla, antikor 4545 ve antikor 82133ün birbiriyle rekabete girdigi tespit edildi, fakat bu iki antikor, antikor 512 ile rekabete girmedi. Bu sonuç, antikor Üçüncü asamada, antikor 512 ve antikor 8213 ile bir rekabetçi analiz, birinci asamada antikor ikinci asamada açiklandigi gibi ayni sekilde gerçeklestirildi. Sonuç olarak, antikor 4177, Alexa-647 etiketli antikor 512”nin TIM-?ü eksprese eden hücrelere baglanmasini inhibe etmedi, fakat Alexa-647 etiketli antikor 8213°ün TIM-yü eksprese eden hücrelere baglanmasini inhibe etti. Dolayisiyla, antikor 4177°nin, antikor 512 ile rekabete girmedigi, fakat sadece antikor 8213 ile rekabete girdigi tespit edildi.
Bu sonuçlar baz alinarak, Örnek 13 ve Örnek 14,& hazirlanan 5 antikor arasinda, antikor 644, epitoptan farkli olan bir epitopu tanidi. ileri sürüldü. Antikor 4545”in, antikor 8213”ün tanidigi epitopa yakin olan bir epitopu tanidigi ileri sürüldü. Ancak, antikor 4177, antikor 8213,ün tanidigi epitopa yakin olan epitopu tanidi, ve ayrica antikor 3448231ün tanidigi epitopa yakin olan bir epitopu yetersiz sekilde tanidi.
(Rekombinant anti-TIM-3 beseri monoklonal defukoz antikorun antikora bagimli hücresel sitotoksisite testi) Antikorla hücresel sitotoksin aktivitesiyle ilgili, hedef hücreye karsi ADCC aktivitesi, antikor varliginda bir efektör olarak beseri Periferal Kan Mononükleer hücreler (bundan sonra donöründen toplandi ve antikoagülanla karistirildi. Elde edilen kan, Ficoll-Plak Plus (GE Healthcare tarafindan imal edilir) üzerine dolduruldu, ve siniri bozmamak için bir büyük Ölçekli santrifîij (CF9RX, Hitachi Koki Co., Ltd. tarafindan imal edilir) kullanilarak 2000 rpm”de 20 dakika santriûijlendi.
Hücreler içeren orta fraksiyon toplandi ve PBS ile yikandi, ve ardindan trombositleri gidermek için 900 rpmlde 20 dakika santrifüjlendi. Bu sekilde elde edilen PBMC ölçüm için kullanildi. Ardindan, Daudi hücre, bir hedef hücre olarak kullanildi ve PBMC, efektör/hedef orani: 50,de karistirildi. Örnek 13 ve Örnek l4°te hazirlanan rekombinant anti-beseri monoklonal defukoz antikorlarin olarak anti-DNP antikor, l ug/mlllik bir nihai konsantrasyon ve 100 ulllik bir toplam hacim sunmak için ortamda süspansiyon halinde tutuldu. Karistirildiktan sonra, çözelti, 37°Cide %5 C02 altinda 4 saat inkübe edildi. Hedef hücrenin liziz orani, ortama salinan LDH miktari baz alinarak degerlendirildi. LDH aktivitesi ve liziz orani, buna eklenmis talimatlara göre CytoTox 96 Radyoaktif olmayan Sitotoksisite Analizi (Promega Corp. tarafindan imal edilir) kullanilarak hesaplandi. Istatistiksel analiz olarak, 0.05,ten az bir risk oranina (p) sahip olan bir numunenin, anlamli olarak farkli olan numune olarak kabul edildigi standart Ögrenci t- testi kullanildi.
Daudi hücreleri üzerinde ADCC aktivitesinin ölçülmesi sonucunda, antikor 4545 ve antikor 41777nin anti-DNP antikoruna kiyasla hedef hücrenin liziz oraninda anlamli artis sergiledigi bulundu. Bu sonuç, anti-TIM-3 fare antikor 82l3°le rekabete giren anti-TIM-3 fare antikor 8213 ve anti-TIM-3 antikorun, yüksek ADCC aktivitesine sahip oldugunu ileri sürmektedir.
Benzer sekilde, ADCC aktivitesi, Örnek l3”te hazirlanan rekombinant anti-TIM-3 beseri monoklonal defukoz antikorlar (antikor 4545 ve antikor 4177), piyasada satilan anti-TIM-3 monoklonal antikor 344823, ve bir negatif kontrol olarak anti-DNP antikor kullanilarak Ilk olarak, periferal kan, saglikli insan donöründen toplandi ve antikoagülanla karistirildi.
Elde edilen kan daha sonra Ficoll-Plak Plus (GE Healthcare tarafindan imal edilir) üzerine dolduruldu, ve siniri bozmamak için bir büyük ölçekli santriiüj (CF9RX, Hitachi Koki Co., Ltd. tarafindan imal edilir) kullanilarak 2000 rpmide 20 dakika santriûijlenir. Hücreler içeren orta fraksiyon toplandi ve PBS ile yikandi, ve ardindan troinbositleri gidermek için 900 rpm°de 20 dakika santrifiijlendi. Bu sekilde elde edilen PBMC fraksiyonu, ADCC aktivitesinin ölçümü için kullanildi.
Ardindan, bir hedef hücre olarak kullanilan Daudi hücre ve PBMC, efektör/hedef orani = her biri, 1 ug/mlalik bir nihai konsantrasyonu ve 100 ;11'lik bir toplam hacmi sunmak için ortamda süspansiyon halinde tutuldu. Karistirildiktan sonra, çözelti 37°C,de %5 C0; altinda 4 saat inkübe edildi. Hedef hücrenin liziz orani, ortamda salinan LDH miktarinin kullanilmasi baz alinarak degerlendirildi.
LDH aktivite ve liziz orani, buna eklenmis talimatlara göre CytoTox 96 Radyoaktif olmayan Sitotoksisite Analiz (Promega Corp. tarafindan imal edilir) kullanilarak hesaplandi.
Istatistiksel analizde, 0.05,ten az bir risk oranina sahip (p) bir nuinunenin anlamli olarak farkli kabul edilen numune oldugu standart Ögrenci t-testi kullanildi. Daudi hücreleri üzerinde ADCC aktivitesinin ölçülmesinin sonucu olarak, antikor 4545 ve antikor 4177”nin anti-DNP antikora kiyasla hedef hücrenin liziz oraninda anlamli artis sergiledigi bulundu.
Diger yandan, antikor 344823, anti-DNP antikoru ve PBS,ye kiyasla hedef hücrenin liziz oraninda hiç anlamli artis sergilemedi.
(Anti-TlM-3 antikoru kullanilarak baglanma/ayrisma sabitinin hesaplanmasi) Baglanma/ayrisma sabiti, biyosensör (Biacore, GE Healthcare tarafindan imal edilir) baz alinarak yüzey plazmon rezonansi kullanilarak analiz edildi. Kisaca, bir anti-beseri antikor veya bir anti-fare antikoru, CMS sensör çipleri üzerinde immobilize edildi. Ardindan, anti- TIM-3 beseri veya fare antikoru, çipi baglamak için akmasi saglandi, ve ardindan Örnek 4,te hazirlanan çözünür hücre disi beseri TIM-3, TIM-yün anti-TIM-3 antikoruna baglanma/ayrisma sabitini incelemek için akmasi saglandi. Deneysel islem boyunca, baglanma/ayrisma sabitinin hesaplanmasi için GE Healthcare ile sunulan temelde deneysel usul kullanildi.
Spesifik olarak, CMS, sensör çipi (Research grade, GE Healthcare tarafindan imal edilir) olarak kullanildi. Ilk olarak, CMS çipi, esit parçalarda 400 mmol/L EDC (N-etil-N'-(3- dimetilaminopropil)karb0diimid hidrokolorid) ve 100 mmol/L NHS”nin (N- hideroksisüksinimid) bir karisik çözeltisiyle akitilarak aktive edildi. Ardindan, beseri antikor Capture Kit”e (GE Healthcare tarafindan imal edilir) baglanan anti-beseri antikor, kite bagli olan çözeltiyle seyreltildi ve elde edilen çözeltinin akmasi saglandi, böylelikle antikorun gereken miktarinin bir beseri antikor için bir antikora, CMS çipi üzerinde immobilize edildi.
Fare antikoru için, fare antikoruna karsi antikor, Fare Antikor Capture Kitinde (GE Healthcare antikoru tarafindan imal edilir) sunulan çözelti içinde seyreltilerek CMS yüzeyi üzerinde immobilize edildi. Aktive edilmis çip yüzeyi, etanolamid hidroklorür için 1 mol/Eden geçirilerek bloke edildi ve inaktive edildi.
Ardindan, anti-TIM-3 antikorlarin bir türü, beher akis hücresi için HBS-EP tamponuyla (GE Healthcare tarafindan imal edilir) seyreltildi ve beseri antikor için antikoru veya çip yüzeyi üzerinde iinmobilize edilen fare antikoru için antikoru baglamak için burada geçirildi.
Ardindan çözünür hücre disi beseri TIM-3 buradan akitildi. Bagli anti-TlM-3 antikorunu, çözünür hücre disi beseri TIM-3`ten ayristirmak için, beseri antikor Capture Kite bagli olan toplam hacimde 3 m0 1/ L MgC12 ya da Fare Antikor Capture Kitine bagli olan Glisin-HCl (pH 1.7) hücreden akitildi.
Yukarida açiklanan prosedürler, bir asama olarak kabul edildi, ve benzer prosedür, baglanma/ayrisma sabitini hesaplamak için veriler toplamak için (sensorgram) farkli konsantrasyonlarda çözünür hücre disi beseri TIM-3 kullanilarak tekrarlandi. Bir analit olarak kullanilan çözünür hücre disi beseri TIM-3°ün konsantrasyonu, 280 nm”de absorbans ölçülerek ve ardindan 1.4 OD,un degeri 1 mg/mL”ye dönüstürülerek hesaplandi. Çözünür hücre disi beseri TIM-?ün moleküler agirligi, elektroforez üzerinde mobilite baz alinarak 42.8 kDa olarak hesaplandi. Veriler, Biaevaluation Software El kitapçigina göre Biaevaluation yazilimi (GE Healthcare tarafindan imal edilir) kullanilarak analiz edildi.
Spesifik olarak, eszamanli Kinetics analizi gerçeklestirildi ve iliskilendirme orani sabiti (Ka) ve ayrisma orani sabiti (Kd) hesaplandi, temelde bir 1:l Langmuir Binding reaksiyon modeli alinarak uydurma için kullanildi. Daha sonra ayrisma sabiti (KD) degeri, Kd/Kasdan hesaplandi.
Anti-beseri TIM-3 beseri monoklonal antikorun çogu, 10`9 mol/L sirasinin KD degerine sahipti. Bu baglamda, ADCC aktivitesi ve TIM-39ü hedefleyen baglanma afinitesi arasinda hiç iliski yoktu.
Anti-beseri TIM-3 monoklonal antikor izlendiginde (örnegin, 30 dakika ayrisma hali izlendi), bir antijen olarak antijen çözünür hücre disi beseri TIM-3 ile saptanan hiç ayrisma yoktu.
Sonuç olarak, beseri TIM-3 için çok yüksek bir afiniteye sahip bir monoklonal antikor üretmenin mümkün oldugu tespit edildi.
(Rekabet testi-2 kullanilarak epitoplarin siniflandirilmasi) analizle analiz edildi. Kisaca, etiketli olmayan hedef antikor, Örnek lide hazirlanan TIM-3 ekspresyon hücresiyle etkilesime girmeye birakildi, ve baska floresan etiketli anti-TIM-3 antikoru ayrica TIM-3 ekspresyon hücrelerine bagli olsun ya da olmasin, akis sitometri usulüyle degerlendirildi.
Beseri TlM-3'ü eksprese eden EoL-l hücreleri, lekeleme ortamiyla yikandi ve satlastirilmis edilir)] (4°C, 30 dakika) reaksiyona girmeye birakildi. Nihai konsantrasyon 10 ug/m17ydi.
Systems tarafindan imal edilir) ve antikor F38-2E2 (eBiosciences tarafindan imal edilir)] ilave edildi ve (4°C, 30 dakika) reaksiyona girmeye birakildi. Lekeleme ortamiyla yikandiktan sonra, 7-ADD (BD Biosciences tarafindan imal edilir), FACSCalibur (BD Biosciences tarafindan imal edilir) ile analiz edilmeden önce ilave edildi.
Sonuçlar, Tablo lide gösterilmektedir. Tablo '1`de gösterildigi gibi, etiketli olmayan anti- TlM-3 antikorun baglandigi TIM-3 ekspresyon hücresine baglanma derecesi durumu, bir negatif kontrolünkine benzemekteydi, "+" olarak belirtildi, etiketli olmayan anti-TIM-3 antikorun baglandigi TIM-3 ekspresyon hücresine baglanma derecesi durumu tespit edilmis, fakat bir negatif kontrolünkinden daha düsükse "+/-" olarak belirtildi ve TIM-3 ekspresyon hücresinin bagli oldugu, etiketli olmayan anti-TIM-3 antikoruna baglandigi durum saptanamadigi durumda, bu "-" olarak belirtildi.
Etiketli olmayan antikor 512 + - + + + + + 644 + + +/- + + +/- +/- Alexa-647 veya APC etiketli 4545 + + + - - + + antikor 8213 + + + _ _ + + 344823 + + - + + - +/_ Tablo 17de gösterildigi gibi, Alexa-647 etiketli antikor 5123nin, baska etiketli olmayan anti- TIM-3 antikorlarin bagli oldugu TIM-?ü eksprese eden hücreye baglandigi tespit antikor F3 8-2E2 ile rekabete girmeyen bir bagimsiz epitopu tanidigi ileri sürüldü.
Alexa-647 etiketli antikor 644,ün baglanmadigi veya etiketli olmayan anti-TIM-3 antikor indirgenmedigi tespit edildiginden, bu antikorun, birbirine yakin epitopun taninmasinda antikor 344823 veya F 38-E2E ile rekabete girdigi belirtildi.
TIM-3”ü eksprese eden hücreye baglanmadigi tespit edildiginden, bu antikorun, birbirine yakin epitopun taninmasinda antikor 8213 ile rekabete girdigi belirtildi.
TIM-3”ü eksprese eden hücreye baglanmadigi tespit edildiginden, bu antikorun, birbirine yakin epitopun taninmasinda, antikor 4545 ile rekabete girdigi belirtildi. bagli oldugu TIM-?ü eksprese eden hücreye baglanmadigi tespit edildiginden, bu antikomn, birbirine yakin epitopun taninmasinda antikor 644 veya F38-E2E antikorla rekabete girdigi belirtildi. bagli oldugu TIM-3°ü eksprese eden hücreye baglanmadigi tespit edildiginden, bu antikorun birbirine yakin epitopun taninmasinda antikor 644 veya antikor 344823 ile rekabete girdigi belirtildi.
(Fare T IM-3 cDNA,nin moleküler klonlanmasi) Fare TIM-3°ün oDNAssi Örnek lldeki gibi ayni sekilde hazirlandi. Toplam RNA, High Pure RNA izolasyon Kit (Roche tarafindan imal edilir) kullanilarak Balb/c fareden elde edilen kemik iligi hücrelerinden ekstrakte edildi. Sablon CDNA, ThermoScript RT-PCR sistemi (Invitrogen tarafindan imal edilir) kullanilarak sentezlendi. Primerler için, mTim-3 Fw3 (DIZI TANIM NO: 70) ve mTim-3 Re3 (DIZI TANIM NO: 71) kullanildi. cDNA, pGEM-T Easy Vektörüne (Promega Corp. tarafindan iinal edilir) yerlestirildi, ve dizi analiz edildi.
GenBank erisim numarasi AF4502417in kodlama alaniyla özdes nükleotid diziye sahip klon seçildi.
PCR, sablon olarak seçilen klon kullanilarak ve DNA, pEF6/Myc-HisC vektörünün NotI alanina yerlestirilerek (lnvitrogen tarafindan imal edilir) (mTim-3/pEF6 Myc_HisC) gerçeklestirildi. PCR primerler için, mTim-3 FW4NotI (DIZI TANIM NO: 72) ve mTim-3 Re kullanildi. (hTim-3/pEF6 Myc_HisC yapimi) Örnek llde hazirlanan plazmid DNA hTIM-3/pMCs-IG ve pEF6 Myc_HisCînin her ikisi, beseri TIM-?ü eksprese eden pEF6 Myc_HisC vektörünü (hTim-3/pEF6 Myc_HisC) olusturmak için NotI ile sindirildi. DNA dizi analizi, vektör dizisinin, GenBank erisim numarasi NM_032782,nin kodlama alaniyla eslestigini dogruladl.
(Anti-beseri TIM-3 antikorun anti-fare TIM-3 antikoruna çapraz reaktivitesi) Örnek 20 ve Örnek 21,de hazirlanan plazmid DNAlar, mTim-3/pEF6 Myc HisC ve hTim- 3/pEF6 Myc_HisCnin her biri, ve bir bos vektör kontrolü, Örnek 4,tekiyle ayni ayni sekilde HEK293F hücresine katildi. Iki gün sonra, Örnek 15,tekiyle ayni sekilde, Alexa-647 etiketli satilan PE etiketli anti-fare TIM-3 antikorun (RMT3-23 antikor, BioLegend Inc. tarafindan imal edilir), beseri TIM-3 ve fare TIM-35e baglanma aktivitesi, akis sitometri analizi kullanilarak degerlendirildi.
F38-2E2, beseri TlM-3”ü eksprese eden 293F hücrelerle özellikle etkilesime girdi. Ancak, RMT3-23 antikor, fare TIM-yü eksprese eden 293F hücrelerle özellikle etkilesime girdi.
F38-2E2”nin fare TIM-3 ile çapraz reaksiyona girmedigi tespit edildi.
(Fare TIM-3 için sübstitüe edilmis IgV bölgeyle TIM-3 kimerik protein için ekspresyon sisteminin yapimi) Amaçlanan dizi, bir sablon olarak hTim-3/pEF6 Myc_HisC plazmid DNAinin kullanildigi PCR, hTIM3+mIgV_vecRl primer (DIZI TANIM NO: 74) ve hTIM3+mIgV_vecFl primer (DIZI TANIM NO: 75), ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) ile güçlendirildi. Amaçlanan dizi, bir sablon olarak mTim-3/pEF6 Myc HisC plazmid DNA kullanilarak PCR, hTIM3+inIgV_insFl primer (DIZI TANIM NO: 76) ve hTIM3+mIgV_insR1 primer (DIZI TANIM NO: 77), ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) ile güçlendirildi.
Elde edilen iki PCR ürünü, GENEART kusursuz klonlama ve birlestirme kiti (Invitrogen tarafindan imal edilir) kullanilarak baglandi. Transformanttan dizi, analiz edildi ve PCR ürünlerinin, amaçlanan dizilere (IgV kimeraTIM-3/pEF6 Myc_HisC, DIZI TANIM NO: 78) sahip oldugu tespit edildi.
(Fare TIM-3 için sübstitüe edilen Musin bölgeyle TIM-3 kimerik protein için ekspresyon sisteminin yapimi) Amaçlanan dizi, bir sablon olarak hTim-3/pEF 6 Myc_HisC plazmid DNA kullanilarak PCR, hTIM3+mMusin_vecR2 primer (DIZI TANIM NO: 80) ve hTIM3+mMusin_veeF2 primer (DIZI TANIM NO: 81), ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) ile güçlendirildi. Amaçlanan dizi, bir sablon olarak mTim-3/pEF6 MycýHisC plazmid DNA kullanilarak PCR, hTIM3+mMuicn_insF2 primer (DIZI TANIM NO: 82) ve hTIM3+mMusin_insR2 primer (DIZI TANIM NO: 83), ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) ile güçlendirildi.
Elde edilen iki PCR ürünü, GENEART kusursuz klonlama ve birlestirme kiti (lnvitrogen tarafindan iinal edilir) kullanilarak baglandi. Transformanttan dizi, analiz edildi ve PCR ürünlerinin, amaçlanan dizilere (Musin kimeraTlM-3/pEF6 Myc_HisC, DIZI TANIM NO: 84) sahip oldugu tespit edildi.
(Anti-TIM-3 antikorun, TIM-3 kimerik proteine baglanma analizi, burada IgV bölge, Musin bölgenin, fare TIM-3 ile sübstitüe edildigi fare TIM-3 ve TIM-3 kimerik proteinle sübstitüe edilir) Örnek 23 ve Örnek 24'te hazirlanan plazmid DNAlarin her biri,, IgV kimeraTlM-3/pEF6 Myc_HisC, Musin kimeraTIM-3/pEF6 Myc_HisC, hTim-3/pEF6 Myc_HisC, mTim-3/pEF6 Myc_HisC, ve bir bos vektör kontrolü HEK293F hücresine Örnek 4,tekiyle ayni sekilde katildi. Iki gün sonra, Örnek 22ldekiyle ayni sekilde, anti-TIM-3 antikoruii baglanma aktivitesi akis sitometrisi kullanilarak degerlendirildi. kimeraTIM-3°ü eksprese eden hücrelere baglandi. Ancak, RMT-23 antikoru sadece fare TIM- 37ü eksprese eden hücrelere ve IgV kimeraTIM-3°ü eksprese eden hücrelere baglandi.
Dolayisiyla, sonuç olarak, test edilen anti-beseri TIM-3 antikorlarin hepsi (antikor 512, antikorunun (antikor RMT3-23) IgV bölgesini tanidigi tespit edildi.
(TIM-3 kimera 22-47/pEF6 Myc_HisC yapimi) TIM-3 kimerik protein eksprese eden bir vektör olusturuldu, burada pozisyon 22 ila pozisyon 47îde beseri TIM-3”ün (DIZI TANIM NO: 53) amino asidi, fare TIM-39ün karsilik gelen amino asidiyle (bundan sonra "TIM-3 kimera 22-47" olarak atifta bulunulur) sübstitüe edildi.
Bir sablon olarak Örnek 21,de hazirlanan hTim-3/pEF6 Myc_HisC plazmid DNA, ve hTIM3kimera ve hTIM3kimera22-47Rl primer (DIZI TANIM NO: 87), ve PCR kullanilarak, PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Bir sablon olarak elde edilen PCR ürünü kullanilarak, amaçlanan dizi, hTlM3kimera22-47F2 primer (DIZI TANIM NO: 88) ve hTIM3kimera kullanilarak PCR ile ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) kullanilarak güçlendirildi.
Bir sablon olarak elde edilen PCR ürünü kullanilarak, amaçlanan dizi, hTlM3kimera22-47F3 primer (DIZI TANIM NO: 90) ve hTIMSkimera kullanilarak PCR ile, ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) kullanilarak güçlendirildi. Üçüncü PCRlden elde edilen, elde edilmis PCR ürünü Dpnl (New England Biolabs tarafindan imal edilir) ile sindirildikten sonra, agaroz jel elektroforeze tabi tutuldu. DNA ekstrakte edildi ve GENEART kusursuz klonlama ve birlestirme kiti (Invitrogen tarafindan imal edilir) kullanilarak baglandi. Transformanttan elde edilen klon dizisi analiz edildi ve klonun, amaçlanan diziye (TIM-3 kimera sahip oldugu dogrulandi.
(TIM-3 kimera 57-66/pEF6 Myc_HisC yapimi) TIM-3 kimerik protein eksprese eden bir vektör olusturuldu, burada pozisyon 57 ila pozisyon 66”da beseri TIM-3`ün (DIZI TANIM NO: 53) amino aside, fare TIM-3°ün karsilik gelen amino asidiyle sübstitüe edildi (bundan sonra " TIM-3 kimera 57-66" olarak atiûa bulunulur).
PCR, amaçlanan diziyi güçlendirmek için bir sablon olarak Örnek 21”de hazirlanan hTim- 3/pEF6 Myc_HisC plazmid DNA, T4 Polinükleotid Kinaz ile(NeW England Biolabs tarafindan imal edilir) fosforlanan hTIM3kimera ve hTIM3kimera ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) kullanilarak gerçeklestirildi.
Elde edilen PCR ürünü, Dpnl (New England Biolabs tarafindan imal edilir) ile sindirildikten sonra, agaroz jel elektroforeze tabi tutuldu. DNA ekstrakte edildi ve LigaFastTM Rapid DNA Ligation Sistem (Promega Corp. tarafindan imal edilir) ile baglandi. Transformanttan elde edilen klon dizisi analiz edildi ve bunun, amaçlanan dizi (TIM-3 kimera 57-66/pEF6 Myc_HisC, DIZI TANIM NO: 96) oldugu dogrulandi.
(TIM-3 kimera 67-105/pEF6 Myc_HisC yapimi) TIM-3 kimerik proteini eksprese eden bir vektör olusturuldu, burada pozisyon 67 ila pozisyon amino aside, fare TIM-33ün karsilik gelen amino asidiyle (bundan sonra "TIM-3 kimera 67-105" olarak atiIîa bulunulur) sübstitüe edildi. PCR bir sablon olarak hTim-3/pEF6 Myc_HisC plazmid DNA, hTIM3kimera ve hTIM3kimera67-105R primer (DIZI TANIM NO: 99) kullanilarak ve amaçlanan diziyi güçlendirmek için PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) kullanilarak gerçeklestirildi.
PCR bir sablon olarak mTim-3/pEF6 Myc_HisC plazmid DNA, mTlM3kimera67-105F primer (DIZI TANIM NO: kullanilarak ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) kullanilarak gerçeklestirildi. Iki PCR ürünü, GENEART kusursuz klonlama ve birlestirme kitiyle (Invitorgen tarafindan imal edilir) baglandi. Transformanttan elde edilen klon dizisi analiz edildi ve bunun amaçlanan dizi (TIM-3 kimera 67-105/pEF6 Myc_HisC, DIZI TANIM NO: 102) oldugu dogrulandi.
(TIM-3 kimera 74-81/pEF6 Myc_HisC yapimi) TIM-3 kimerik proteinini eksprese eden bir vektör olusturuldu, burada pozisyon 74 ila pozisyon Slide beseri TIM-3'ün amino asidi (DIZI TANIM NO: 53) fare TIM-3,ün karsilik gelen amino asidiyle (bundan sonra " TIM-3 kimera 74-81" olarak atiûa bulunulur) sübstitüe edildi. PCR bir sablon olarak Örnek 21 ”de hazirlanan hTim-3/pEF6 Myc_HisC plazmid DNA, hTIM3kimera ve hTIM3kimera74-81R primer (DIZI TANIM NO: 105) kullanilarak ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) kullanilarak gerçeklestirildi.
PCR ürünü, Dpnl (New England Biolabs tarafindan imal edilir) ile sindirildikten sonra, agaroz jel elektroforeze tabi tutuldu. DNA ekstrakte edildi ve GENEART kusursuz klonlama ve birlestirme kitiyle (Invitrogen tarafindan imal edilir) baglandi. Transformanttan elde edilen klon dizisi analiz edildi ve bunun amaçlanan dizi (TIM-3 kimera 74-8l/pEF6 Myc_HisC, DIZI TANIM NO: 106) oldugu dogrulandi.
(TIM-3 kimera 88-96/pEF6 Myc_HisC yapimi) TIM-3 kimerik protein eksprese eden bir vektör olusturuldu, burada pozisyon 88 ila pozisyon 96°da beseri TIM-3°ün amino asidi (DIZI TANIM NO: 53), fare TIM-3”ün karsilik gelen amino asidiyle (bundan sonra "TIM-3 kimera 88-96" olarak atifta bulunulur) sübstitüe edildi.
PCR, bir sablon olarak Örnek 21”de hazirlanan hTim-3/pEF6 Myc_HisC plazmid DNA, hTIM3kimera ve hTIM3kimera88-96R primer (DIZI TANIM NO: 109) içeren bir reaksiyon çözeltisi hazirlanarak ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) kullanilarak gerçeklestirildi.
Elde edilen PCR ürünü, DpnI (New England Biolabs tarafindan imal edilir) ile sindirildikten sonra, agaroz jel elektroforeze tabi tutuldu. DNA ekstrakte edildi ve GENEART kusursuz klonlama ve birlestirme kitiyle (Invitrogen tarafindan imal edilir) baglandi. Transformanttan elde edilen klon dizisi analiz edildi ve bunun, amaçlanan dizi (TIM-3 kimera 88 -96/pEF6 Myc_HisC, DIZI TANIM NO: 110) oldugu do grulandi.
(TIM-3 kimera 96-105/pEF6 Myc_HisC yapimi) TIM-3 kimerik protein eksprese eden bir vektör olusturuldu, burada pozisyon 96 ila pozisyon fare TIM-3'ün karsilik gelen amino asidiyle (bundan sonra "TIM-3 kimera 96-105" olarak atifta bulunulur) sübstitüe edildi. PCR, bir sablon olarak Örnek 21,de hazirlanan hTim-3/pEF6 Myc_I-IisC plazmid DNA, hTIM3kimera ve hTIM3kimera96-105R primer (DIZI TANIM NO: 113) içeren bir reaksiyon çözeltisi hazirlanarak ve PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz (Takara Bio Inc. tarafindan imal edilir) kullanilarak gerçeklestirildi.
Elde edilen PCR ürünü, Dpnl (New England Biolabs tarafindan imal edilir) ile sindirildikten sonra, agaroz jel elektroforeze tabi tutuldu. DNA ekstrakte edildi ve GENEART kusursuz klonlama ve birlestirme kitiyle (lnvitrogen tarafindan imal edilir) baglandi. Transformanttan elde edilen klon dizisi analiz edildi ve bunun amaçlanan dizi (TIM-3 kimera 96 - 105/pEF6 MycýHisC, DIZI TANIM NO: 114) oldugu do grulandi.
(Anti-TlM-3 antikorun TIM-3 kimerik proteine baglanma analizi, burada IgV bölgesinin bir kismi, fare TIM-3 ile sübstitüe edildi) Örnek 26 ila 31 'de hazirlanan çesitli TIM-3 vektörlerinin her biri ve bir kontrol olarak bos bir vektör Örnek 43tekiyle ayni sekilde HEK293F7ye katildi. Katilan vektörler ve bunlarin eksprese edilen TIM-3 kimerik proteinleri asagidaki gibidir: dizisinin (DIZI TANIM NO: 53), fare TIM-yün karsilik gelen amino asitleriyle sübstitüe edildigi TIM-3 kimerik protein; dizisinin (DIZI TANIM NO: 53), fare TIM-3iün karsilik gelen amino asitleriyle sübstitüe edildigi TIM-3 kimerik protein; asit dizisinin (DIZI TANIM NO: 53), fare TIM-37ün karsilik gelen amino asitleriyle sübstitüe edildigi TIM-3 kimerik protein; dizisinin (DIZI TANIM NO: 53), fare TIM-37ün karsilik gelen amino asitleriyle sübstitüe edildigi TIM-3 kimerik protein; dizisinin (DIZI TANIM NO: 53), fare TIM-37ün karsilik gelen amino asitleriyle sübstitüe edildigi TIM-3 kimerik protein; ve asit dizisinin (DIZI TANIM NO: 53), fare TIM-37ün karsilik gelen amino asitleriyle sübstitüe edildigi TIM-3 kimerik protein.
Transfeksiyondan iki gün sonra, Örnek 223dekiyle ayni sekilde, anti-TIM-3 antikorun baglanma aktivitesi, akis sitometrisi kullanilarak degerlendirildi.
Sonuçlar, Tablo 27de gösterilmektedir. Tablo 2,de gösterildigi gibi, antikorun transfekte edilen hücreye baglandigi saptandigi durum "+" olarak belirtildi, antikorun transfekte edilen hücreye baglandigi saptandigi, fakat baglanma derecesinin indirgendigi durum "+/-" olarak belirtildi ve antikorun transfekte edilen hücreye baglandigi saptanmadigi durum "-" olarak belirtildi. transfekte edilmis hücrelere baglandi. Ancak, bu antikorlar, TIM-3 kimera 67-105,in katildigi hücreye baglanmadi. 512 TIM-3 kimera 22-47 ile transfekte edilmis hücrelere baglanmadi. hücrelere baglandi. Ancak, bu antikorlar TIM-3 kimera 57-66 ile transfekte edilmis hücrelere baglanmadi. transfekte edilmis hücrelere baglandi. Antikor 4177 TIM-Te yetersiz sekilde baglandi, Örnek 16 ve Örnek 195dan yukaridaki sonuç ve sonuçlara baz alinarak, antikor 4545 ve baglanmadigindan, antikor 4545 ve antikor 8213”ün beseri TIM-Te baglanmasi için gereken amino asitlerin pozisyon 74 ila 81 ,de amino aside katildigi ileri sürüldü.
Ilaveten, antikor 512`nin pozisyon 47sde beseri TlM-3'ün amino asitlerine kadar baglandigi 3,ün amino asit dizisine baglandigi ileri sürüldü.
T1M-3”ün amino asitleri içerisinde pozisyon 74 ila 81,dekinde oldugundan baska amino asitlere baglandigi ileri sürüldü.
(Anti-beseri TIM-3 antikor 8213 insanlastirilmis antikorun preparasyonu) (1) Antikor 8213 insanlastirilmis antikorun VH ve VL”sinin amino asit dizilerinin dizayni Antikor 8213 insanlastirilmis antikorun VH”sinin amino asit dizisi, asagidaki sekilde tasarlandi. Antikor 8213iün CDRleri 1 ila 3,ün amino asit dizilerinin (DIZI TANIM NOilar: 21 ila 23) asilanmasi için uygun olan beseri antikorun VH°sinde FR7lerin amino asit dizileri asagidaki sekilde seçildi.
Kabat ve digerleri, geleneksel olarak bilinen çesitli beseri antikorlarinin VHii, bunlarin amino asit dizilerinin homolojisi baz alinarak üç alt-gruba (HSG I ila III) siniflandirilmis ve alt-gruplarin her biri için konsensus dizileri bildirilmistir [Sequences of Proteins of antikorlarin VH alt-gruplari 1 ila lII”ün FRisinin amino asit konsensus dizilerinin homoloji arastirmasi, antikor 82131ün VH°sinin FRisinin amino dizisiyle yürütüldü.
Homoloji arastirmasinin bir sonucu olarak, HSGI, HSGII, ve HSGIII homolojileri sirasiyla dizisi, alt-grup Iie en yüksek homolojiye sahipti.
Yukaridaki sonuçlar baz alinarak, antikor 8213”ün VH”sinin CDR”sinin amino asit dizisi (DIZI TANIM NOilar: 21 ila 23), beseri antikor VH”nin alt-grup I7inin konsensus dizisinin FR amino asit dizisinin uygun bir pozisyonuna asilandi. Bu sekilde, DIZI TANIM NO: 67 ile temsil edilen 8213 antikor HVO, yani, bir anti-beseri TIM-3 antikor 8213 insanlastirilmis antikorun VH°sinin amino asit dizisi tasarlandi.
Ardindan, antikor 8213 insanlastirilmis antikorunun VL7sinin amino asit dizisi, asagidaki sekilde tasarlandi. Antikor 82l3°ün VL”sinde CDRlerl ila 3,ün amino asit dizilerini (DIZI TANIM NOlar: 24 ila 26) asilamak için uygun olan beseri antikorun VL”sinde FRisinin amino asit dizileri asagidaki sekilde seçildi.
Kabat ve digerleri, çesitli bilinen beseri antikorlarin VLisi, bunlarin amino asit dizilerinin homolojisi baz alinarak dört alt-gruba (HSG I ila IV) siniflandirmistir ve alt-gruplarin her biri için konsensus dizileri bildirildi [Sequences of Proteins of Immugolojic Interest, US Dept.
Health and Human Services (1991)]. Dolayisiyla, beseri antikorlarin VL alt-gmbu 1 ila lV”ün FR amino asit konsensus dizileri arasinda homoloji arastirmasi, antikor 8213'ün VLisinin FR amino dizisiyle dizi homolojisi için arastirildi.
Homoloji arastirmasinin bir sonucu olarak, HSGI, HSGII, HSGIII ve HSGIV homolojileri FR”sinin amino asit dizisi, alt-grup I”e en yüksek homolojiye sahipti.
Yukaridaki sonuçlar baz alinarak, antikor VLlsinin CDRlerinin amino asit dizilerinin her biri, bir beseri antikorun VL°sinin alt-grubu Pin konsensus dizisinin FR`sinin amino asit dizisinde uygun bir pozisyona asilandi. Bu sekilde, DIZI TANIM NO: 69, yani, bir anti-beseri TIM-3 antikor 8213 insanlastirilmis antikorunun VL”sinin amino asit dizisi ile temsil edilen 8213 antikor LVO tasarlandi.
Yukarida tasarlanmis antikor 8213 insanlastirilmis antikorun VH,SI olan 8213 antikor HVOlnun amino asit dizisi; ve antikor 8213 insanlastirilmis antikorun VLlsi olan 8213 antikor LVO”nun amino asit dizisi sadece fare monoklonal antikor 8213°ün CDRlerinin amino asit dizilerinin, beseri antikorun seçilen FRisinin amino asit dizisine asilandigi dizilerdi.
Ancak, genelde, bir fare antikorunun CDRlerinin, sadece bir `beseri antikorun FRlerine asilanmasiyla bir insanlastirilmis antikorun, bir düsük baglanma aktivitesine hazirlandigi bilinmektedir. Baglanma aktivitesinin azalmasindan kaçinmak amaciyla, denemeler, düsürülmüs baglanma aktivitesini arttirmak için, bir fare antikorundan farkli olan bir beseri antikorun FRilerinin amino asit dizileri arasinda baglanma aktivitesi üzerinde etkiye sahip oldugu kabul edilen amino asit kalintilarinin modifiye edilmesiyle, ayni zamanda CDRlerin amino asit dizilerinin asilanmasiyla bir insanlastirilmis antikorun preparasyonunda hazirlanmistir. Dolayisiyla, Örneklerde, bulus sahipleri, asagidaki sekilde baglanma aktivitesi üzerinde etkiye sahip oldugu kabul edilen FR,nin amino asit kalintilarini tanimlamaya ve modifiye etmeye karar verdi.
Ilk olarak, antikor 8213 insanlastirilmis antikorun VH”si olan antikor 8213 HVolnun amino asit dizisini ve antikor 8213 insanlastirilmis antikorun VLlsi olan antikor 8213 LVO”nun amino asit dizisini içeren yukarida tasarlanmis antikor V alaninin üç-boyutlu yapisi (bundan sonra "HVOLUO" olarak atifta bulunulur) bir bilgisayar modelleme teknigi kullanilarak olusturuldu. Discovery Studio (Accelrys Inc. tarafindan imal edilir) üç-boyutlu yapinin preparasyonu ve üç-boyutlu yapinin görünümü için kullanildi. Antikor 82139ün V alaninin üç-boyutlu yapisinin bir bilgisayar modeli ayni sekilde olusturuldu.
Bundan baska, HVOLVO”nun VH ve VL°sinin FRlerin amino asit dizisinde antikor 8213iünkilerden farkli olan amino asit kalintilar seçildi, bir amino asit dizisi hazirlandi, burada bu tür amino asit kalintilar, 8213 antikorun karsilik gelen amino asit kalintilariyla sübstitüe edildi ve ardindan bir üç-boyutlu yapi model ayni sekilde olusturuldu. Baglanma aktivitesi üzerinde etkiye sahip oldugu kabul edilen amino asitler, antikor 8213 ve HVOLVO ve modifiye edilmis ürünün V alanlarinin üç-boyutlu yapilarinin kiyaslanmasiyla seçildi.
Sonuç olarak, antijen baglanma alaninin üç-boyutlu yapisini degistirdigi ve baglanma aktivitesi üzerinde etkiye sahip oldugu kabul edilen HVOLVO°da F R7nin amino asit kalintilari olarak, pozisyon 12lde Lys, pozisyon 20lde Val, pozisyon 38,de Arg, pozisyon 40,ta Ala, pozisyon 48ide Met, pozisyon 67ide Arg, pozisyon 68sde Val, pozisyon 70”te lle, pozisyon HV07da seçildi; ve pozisyon llade Leu, pozisyon 137te Ala, pozisyon 157te Val, pozisyon ve pozisyon 85'te Thr antikor 8213 LV07da seçildi.
Seçilen amino asit kalintilar arasinda, en az bir veya daha fazla amino asit kalintisi, antikor 8213°ün karsilik gelen alanlarinda mevcut olan amino asit kalintilarla sübstitüe edildi ve çesitli modifikasyonlar içeren insanlastirilmis antikorun VH°leri ve VL”leri olusturuldu, Spesifik olarak, VH bakimindan, en az bir modifikasyon, DIZI TANIM NO: 67' ile temsil edilen amino asit dizisinde pozisyon 12'de Lys”in Va] ile, Valiin pozisyon 20,de Leu ile, Arglin pozisyon 38Sde Lys ile, Alainin pozisyon 40,ta Arg ile, Met°in pozisyon 487de Ile ile, Arg'in pozisyon 67”de Lys ile, Val°in pozisyon 68,de Ala ile, Ile7nin pozisyon 70°te Leu ile, Ala°nin pozisyon 72ide Val ile, Thfnin pozisyon 74°te Lys ile, Arg°1n pozisyon 98°de Gly ile, veya Valiin pozisyon ll3”te Leu ile sübstitüe edilmesi için katildi.
VL bakimindan, en az bir modifikasyon, DIZI TANIM NO: 69 ile temsil edilen amino asit dizisinde Leusnun pozisyon 11”de Met ile, Ala”nin pozisyon 13°te Val ile, Va1”in pozisyon 15ite Leu ile, Tyr°nin pozisyon 367da Leu ile, Ala”nin pozisyon 43°te Ser ile, Prosnun pozisyon 44,te Phe ile, Leuinun pozisyon 46, da Gly ile, Pheinin pozisyon 71 ”de Tyr ile ve Thrinin pozisyon 857te Asp ile sübstitüsyonu için amino asit modifikasyonlar arasina katildi. 8213 antikorla insanlastirilmis antikorun antikor V alani olarak, burada HVOLVO”da FRsde mevcut olan en az bir amino asit modifiye edildi, HVOLVO, HVOLVZ, HVOLV4, HVOLVS, H zinciri degisken alanlarinin her birinin amino asit dizileri, HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HVlO ve HV12; ve L zinciri degisken alaninin amino asit dizisi, LV2, LV4, LVS, LV6, LV7 ve LV9 sirasiyla Sekil 1 ve Sekil 2,de gösterildi. (2) 8213 antikorla-insanlastirilmis antikorun preparasyonu 8213 antikorla-insanlastirilmis antikorun degisken alaninin amino asit dizisini kodlayan DNA, sirasiyla 8213 antikorun VHasinin ve 8213 antikorun VL”sinin amino asit dizisini kodlayan DNAlarda (DIZI TANIM NO: 27 ve 29) kullanilan kodonlar kullanilarak tasarlandi. Amino asit modifikasyonu katildiginda, DNA, bir memeli hücrede, bir yüksek siklikla kullanilan bir kodon kullanilarak tasarlandi.
Bu DNA dizileri kullanilarak, bir antikoru eksprese etmek için vektörler olusturuldu ve insanlastirilmis antikorlar eksprese edildi.
Sinai Uygulanabilirlik Bu bulus, beseri TIM-?ün hücre disi alaninin amino asit dizisine veya bunun üç-boyutlu yapisina baglanan bir monoklonal antikor sunabilir ve ADCC aktivitesi; antikoru kodlayan bir DNA; DNA”yi içeren bir vektör; vektörün aktarilmasiyla elde edilebilen bir transformant; transformant kullanilarak bir antikor veya bunun bir antikor fragmanini üretmeye yönelik bir islem; bir beseri TIM-3'ü immünolojik olarak saptamak veya ölçmek için bir in vitro usul; ve bir beseri TIM-3 pozitif hücreyle ilgili bir kanseri tedavi etmede kullanim için bir monoklonal antikora sahiptir.
Dizi Listesinin Serbest Metni DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANlM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: 1: Beseri 4545 H zinciri CDR17in amino asit dizisi 2: Beseri 4545 H zinciri CDR2,nin amino asit dizisi 3: Beseri 4545 H zinciri CDR3”ün amino asit dizisi 4: Beseri 4545 L zinciri CDR'l 'in amino asit dizisi : Beseri 4545 L zinciri CDR21nin amino asit dizisi 6: Beseri 4545 L zinciri CDR3'ün amino asit dizisi 1 1: Beseri 4177 H zinciri CDRl ,in amino asit dizisi 12: Beseri 4177 H zinciri CDR2,nin amino asit dizisi 13: Beseri 4177 H zinciri CDR3,ün amino asit dizisi 14: Beseri 4177 L zinciri CDR1”in amino asit dizisi : Beseri 4177 L zinciri CDR2snin amino asit dizisi 16: Beseri 4177 L zinciri CDR3”ün amino asit dizisi 21: Fare 8213 H zinciri CDR] ,in amino asit dizisi 22: Fare 8213 H zinciri CDR2°nin amino asit dizisi 23: Fare 8213 H zinciri CDR3,ün amino asit dizisi 24: Fare 8213 L zinciri CDRl amino asit dizisi : Fare 8213 L zinciri CDR2 amino asit dizisi 26: Fare 8213 L zinciri CDR3 amino asit dizisi 31: Primer TIM-3 FW27nin nükleotid dizisi DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANlM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: Primer TIM-3 Re2”nin nükleotid dizisi Primer pMCs-Fwjnin nükleotid dizisi Primer TIM3ED-FcReXbain1n nükleotid dizisi Primer hTIM-3 Fw17in nükleotid dizisi Insert hTIM-3 ECD FC Hizyonun nükleotid dizisini Insert hTIM-3 ECD Fc Iüzyonunun amino asit dizisi Primer TIM3ED-FLAG4aa”nin nükleotid dizisi Primer C-FLAG-NotRTnin nükleotid dizisi Primer hh-6°n1n nükleotid dizisi Primer hh-3 ”ün nükleotid dizisi Primer hk-2inin nükleotid dizisi Primer hk-6,nin nükleotid dizisi Primer mH_Rv1'in nükleotid dizisi Primer mHýRVZ'nin nükleotid dizisi Primer mK_RV1`in nükleotid dizisi Primer mKýRV27nin nükleotid dizisi DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANlM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: Antikor HVO degisken alanin nükleotid dizisi 8213 antikor HVO degisken alaninin amino asit dizisi 8213 antikor LVO degisken alaninin nükleotid dizisi 8213 antikor LVO degisken alaninin amino asit dizisi Primer mTim-3 Fw3,ün nükleotid dizisi Primer mTim-3 Re3 *ün nükleotid dizisi Primer mTim-3 Fw4N0tlsin nükleotid dizisi Primer mTim-3 Re4Notlsin nükleotid dizisi Primer hTIM3+mIgVývecRl ,in nükleotid dizisi Primer hTlM3+mIgV_VecFl 'in nükleotid dizisi Primer hTIM3+mIgV_insFl ,in nükleotid dizisi Primer hTlM3+mIgV_insRl ”in nükleotid dizisi Primer hTIM3+mMusin_vecR2°nin nükleotid dizisi Primer hTIM3+mMusinývecF29nin nükleotid dizisi Primer hTIM3+mMusin_insF2,nin nükleotid dizisi Primer hTIM3+mMusinýinsR2,nin nükleotid dizisi DIZI TANIM NO DIZI TANIM NO DIZI TANIM NO DIZI TANIM NO DIZI TANIM NO DIZI TANIM NO dizisi: insert TIM-3 kimera 22-47/pEF6 Myc_HisC,nin nükleotid dizisi DIZI TANIM NO DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO 94: Primer hTIM3kimeraS7-66F3nin nükleotid dizisi 95: Primer hTIM3kimera57-66R,nin nükleotid dizisi 96: Insert TIM-3 kimera 57-66/pEF6 Myc_HisC,nin nükleotid dizisi 97: Insert TIM-3 kimera 57-66/pEF6 Myc_HisC,nin amino asit dizisi 98: Primer hTIM3kimera67-105F7nin nükleotid dizisi 99: Primer hTIM3kimeraö7-105Rinin nükleotid dizisi 101: Primer mTIM3kimera67-105R,nin nükleotid dizisi 104: Primer hTIM3kimera74-81Pnin nükleotid dizisi 105: Primer hTIM3kimera74-81R”nin nükleotid dizisi DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: DIZI TANIM NO: Insert TIM-3 kimera 74-81/pEF6 Myc_HisC°nin amino asit dizisi Primer hTIM3kimera88-96F7nin amino asit dizisi nükleotid dizisi Primer hTIM3kimera88-96R,nin nükleotid dizisi Insert TIM-3 kimera 88-96/pEF6 Myc_HisC amino asit dizisi Primer hTIM3kimera96-105Fanin nükleotid dizisi Primer hTIM3kimera96-105R7nin nükleotid dizisi Insert TIM-3 kimera 96-105/pEF6 Myc_HisC,nin nükleotid dizisi DIZI LISTESI <110> Kyovva Hakko Kirin Co., Ltd.
Kyushu University, National University Corporation <120> Anti-TIM-3 antikor <130> W50253l <150> USöl/353836 <160> 115 <170> Patentln versiyon 3.3 <210> l <211> 7 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4545 H-zinciri CDR] <400> l <210>2 <211> 16 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4545 H-zinciri CDR2 <400> 2 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210>3 <211>11 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4545 H-Zinciri CDR3 <400> 3 Asp His Tyr Ser Ser Ser Trp Thr Phe Asp Tyr <210>4 <211>ll <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4545 L-zinciri CDRl <400> 4 Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala <210>5 <211>7 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4545 L-Zinciri CDR2 <400> 5 <210>6 <211>9 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4545 L-zinciri CDR3 <400> 6 Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr <210>7 <211> 420 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1 )..(420) <400> 7 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Aia Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser ?be 40 45 Ser Arg Gly Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Giu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp His Tyr Ser Ser Ser Trp Thr Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210>8 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Ala Ala Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Ser Arg Gly Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly 65 70 75 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala 100 105 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp His Tyr Ser Ser Ser 115 120 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 9 <211>381 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <400> 9 <210> 10 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 t99gca Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala 65 70 75 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Ty: Tyr Cys 100 105 Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Giy Thr Lys Leu 115 120 <210>11 <211>5 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4177 H-zinciri CDRl <400> 11 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4177 H-zinciri CDR2 <400> 12 Tyr Ile Phe His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4177 H-Zinciri CDR3 <400> 13 Asp Giy Glu Tyr Phe Asp Met Leu Thr Giy Phe Asp Tyr <210> 14 <211>ll <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4177 L-zinciri CDRl <400> 14 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala <210> 15 <211>7 <212> PRT <2 1 3> Yapay <220> <223> Beseri4177 L-zinciri CDR2 <400> 15 <210> 16 <211>9 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Beseri4177 L-zinciri CDR3 <400> 16 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr <210> 17 <211> 420 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1 )..(420) <400> 17 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 25 30 Pro Ser Giu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Giy Giy Ser Ile 40 45 Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Giu Trp Ile Gly Tyr Ile Phe His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Giu Tyr Phe Asp Met Leu Thr Gly Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Giy Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 18 <211>140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 <210> 19 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <400> 19 991'- <210> 20 <211>129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Aia Ala Ser Ser 65 70 75 Pro Ser Arg Phe Ser Giy Ser Gly Ser Gly Thr 100 105 Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly 115 120 <210> 21 <21 1> 5 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Fare8213 H-zinciri CDRl <400> 21 <210> 22 <211> 17 <2 12> PRT <213> Yapay <220> <223> Far68213 H-Zinciri CDR2 <400> 22 Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 <210> 23 <211>8 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> FareSZl3 H-zinciri CDR3 <400> 23 Gly Tyr Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr <210> 24 <211>11 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Fare8213 L-zinciri CDRI <400> 24 His Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asn Ile Gly <210> 25 <211>7 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Fare8213 L-Zinciri CDR2 <400> 25 <210> 26 <211>9 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Far68213 L-zinciri CDR3 <400> 26 Val Gln Tyr Gly Gln Phe Pro Trp Thr <210> 27 <211> 408 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(408) <400> 27 <210> 28 <211> 136 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Val His Ser Gln Vai Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu val Lys 25 30 Pro Gly Ala Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Giy Tyr Thr Phe 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 BD Glu Lys Phe Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Giy Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 29 <211> 387 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <400> 29 <210> 30 <211> 129 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 <210> 31 <211>26 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer TIM-3 FW2 <400> 31 <210> 32 <211>20 <212> DNA <2 1 3> Yapay <220> <223> Primer TIM-3 Re2 <400> 32 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer pMCs-Fw <400> 33 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer TIM3ED-FCReXba <400> 34 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer T7 <400> 35 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM-3 Fwl <400> 36 <210> 37 <211> 1333 <212> DNA <2 1 3> Yapay <220> <223> Insert hTlM-3 ECD Fc füzyon <220> <221> CDS <222> (11)..(1333) <400> 37 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu 20 25 Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro 35 40 45 Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Giy Ala Cys Pro Val Phe 50 55 60 Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Vai Asn Tyr 65 70 75 Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val 80 85 90 Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys 95 100 105 Cys Arg Ile Gln Ile Pro Giy Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln 130 135 140 Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His 145 150 155 Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu 160 165 170 Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala 175 180 185 <210> 38 <211>440 <212> PRT (3012 <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 38 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Vai Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Vai Gly Gln 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Giy Asn Leu 40 45 Val Pro Val Cys Trp Giy Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Giy Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Giy Asp Phe Arg Lys Giy Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 100 105 110 Gln Ile Pro Giy Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Giy Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu Giy Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ser Arg Ala Asp Tyr Lys Asp Asp 195 200 205 <210> 39 <211>30 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer TIM3ED-FLAG4aa <400> 39 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer C-FLAG-NotR2 <400> 40 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer BGH-R <400> 41 <210> 42 <211> 645 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Insert hTIM-3 ECD <220> <221> CDS <222> (19)..(645) <400> 42 <210> 43 <211> 208 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 43 <210> 44 <211>27 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hh-6 <400> 44 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hh-3 <400> 45 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hk-2 <400> 46 <210> 47 <211> 26 <2 12> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hk-6 <400> 47 <210> 48 <211>32 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer mH_Rv1 <400> 48 <210> 49 <211>30 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer mHýRvZ <400> 49 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer mK_Rv1 <400> 50 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer mKýRv2 <400> 51 <210> 52 <211> 906 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(906) <400> 52 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Giu Vai Giu Tyr Arg Ala Giu Val Gly Gin 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 40 45 vai Pro Val Cys Trp Giy Lys Giy Ala Cys Pro Vai Phe Giu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Giu Arg Asp Vai Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 100 105 110 Gin Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Giu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Vai 115 120 125 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Giu Thr Gin Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gin Ile <210> 53 <211> 301 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 <210> 54 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <22l> CDS <222> (1)..(426) <400> 54 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 40 45 Asn Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Giu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Ile Trp Phe Gly Glu Met Phe Ser Glu Tyr Phe Gin 115 120 125 His Trp Gly Gln Giy Thr Leu Vai Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 55 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 <210> 56 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <400> 56 991'- <210> 57 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 <210> 58 <211> 432 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(432) <400> 58 Met Giu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Vai Ala Ile Ile Lys Gly 1'-99 <210> 59 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 991'- Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Ser Ser Trp Tyr Tyr Tyr Gly 115 120 125 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 60 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(390) <400> 60 <210> 61 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 <210> 62 <211>414 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(414) <400> 62 <210> 63 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 991'- <210> 64 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(390) <400> 64 <210> 65 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Met Asp Met Arg Vai Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys <210> 66 <211> 351 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> HVO Fare8213 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 66 <210> 67 <211> 117 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 67 99115 <210> 68 <211> 321 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> LVO Fare8213 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 68 <210> 69 <211>107 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 69 Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gin Tyr Gly Gin Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gin Giy Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 70 <211>22 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer mTim-3 FW3 <400> 70 <210> 71 <211>20 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer mTim-3 Re3 <400> 71 <210> 72 <211> 33 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer mTim-3 FW4N0tI <400> 72 <210> 73 <211>30 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer mTim-3 Re4N0tl <400> 73 <210> 74 <211>20 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3+mIgV_vecR1 <400> 74 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3+mIgV_vecF1 <400> 75 <210> 76 <211> 35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTlM3+mlgVýinsF1 <400> 76 <210> 77 <211> 35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3+mIgV_insR1 <400> 77 <210> 78 <211>909 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> IgV kimeraTlM-B/pEF 6 Myc_HisC <220> <221> CDS <222> (1)..(909) <400> 78 999 agc 993 gat 399 993 <210> 79 <211> 302 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 79 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Arg Ser Leu Glu Asp Gly Tyr Lys vai Glu Val Gly Lys 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Giy Thr Leu 40 45 Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr 50 55 60 Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser 65 70 75 80 Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu 100 105 110 115 120 125 Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp 130 135 140 Phe Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTlM3+mMusin_vecR2 <400> 80 <210> 81 <211> 23 <2 12> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3+mMusin_vecF2 <400> 81 <210> 82 <211>35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTlM3+mMusin_insF2 <400> 82 <210> 83 <211>35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTlM3+mMusinýinsR2 <400> 83 <210> 84 <211> 876 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Musin kimeraTIM-3/pEF6 Myc_HisC <220> <221> CDS <222> (1)..(876) <400> 84 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Asn vai Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val 65 70 75 Arg Tyr Trp Leu Asn Giy Asp Phe Arg Lys Gly 100 105 <210> 85 <211>29l <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 85 Ser Arg Gin Gin Pro Ser Gin Pro Leu Giy Cys Arg Phe Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 611,1 A511. <210> 86 <211> 35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3kimera22-47F1 <400> 86 <210> 87 <211>35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTlM3kimera22-47Rl <400> 87 <210> 88 <211>35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3kimera22-47F2 <400> 88 <210> 89 <211> 35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3kimera22-47R2 <400> 89 <210> 90 <211> 35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTlM3kimera22-47F3 <400> 90 <210> 91 <211> 33 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3kimera22-47R3 <400> 91 <210> 92 <211>906 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> TIM-3 kimera 22-47/pEF6 Myc_HisC <220> <221> CDS <222> (1)..(906) <400> 92 <210> 93 <211> 301 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 93 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Leu Glu Asp Gly Tyr Lys Val Glu Val Gly Lys 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Gly Thr Leu 40 45 Val Pro Vai Cys Trp Giy Lys Gly Ala Cys Pro Vai Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Vai Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 100 105 110 Gin Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala G1u Thr Gin Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gin Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arq Ile Gly Ile Tyr Ile Giy Ala Gly 195 200 205 210 215 220 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gin Asn Leu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Vai Ala Glu 245 250 255 Giy Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Vai Tyr 260 265 270 Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gin 275 280 285 Gin Pro Ser Gin Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 <210> 94 <211> 35 <212> DNA <213> Yapay <220> <400> 94 <210> 95 <211>33 <212> DNA <213> Yapay <220> <400> 95 <210> 96 <211> 906 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> TIM-3 kimera 57-66/pEF6 Myc_HisC <220> <221> CDS <222> (1)..(906) <400> 96 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Vai Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr 50 55 60 Asn Glu Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 <210> 97 <211>301 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 97 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 40 45 Va1 Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr 50 55 60 Asn Glu Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 100 105 110 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly 195 200 205 210 215 220 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Giy Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr 260 265 Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr 275 280 Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe 290 295 <210> 98 <211> 34 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3kimera67-105F <400> 98 <210> 99 <211> 33 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3kimera67-105R <400> 99 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Yapay <220> <400> 100 <210> 101 <211>20 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer mTlM3kimera67-105R <400> 101 <210> 102 <211> 909 <212> DNA <213> Yapay <220> <220> <221> CDS <222> (1)..(909) <400> 102 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Vai Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Giu Vai Giu Tyr Arg Ala Giu Vai Giy Gln 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Giy Asn Leu 40 45 Val Pro Val Cys Trp Giy Lys Giy Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser 65 70 75 80 Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Giy Asp Leu Asn Lys Giy Asp Val Ser Leu 85 90 95 100 105 110 115 120 125 Val Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp 130 135 140 Phe Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Giy His Giy Pro Ala Giu Thr Gln Thr Leu Giy Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln 165 170 175 <210> 103 <211> 302 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 103 <210> 104 <211> 35 <212> DNA <213> Yapay <220> A511. <400> 104 <210> 105 <211> 35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTIM3kimera74-81 R <400> 105 <210>106 <211> 909 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> TIM-3 kimera 74-8l/pEF6 MycýHisC <220> <221> CDS <222> (1 )..(909) <400> 106 <210> 107 <211> 302 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 107 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser 65 70 75 80 Ser Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Vai Ser Leu 85 90 95 Thr Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg 100 105 110 115 120 125 Val Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp 130 135 140 Phe Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln 165 170 175 180 185 190 Leu Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala 195 200 205 Gly Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile 210 215 220 Phe Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu 245 250 255 Glu Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val 260 265 270 Tyr Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg 275 280 285 Gln Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 <210> 108 <211> 35 <212> DNA <213> Yapay <220> <400> 108 <210> 109 <211> 35 <212> DNA <213> Yapay <220> <400> 109 <210> 110 <211> 906 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> TIM-3 kimera 88-96/pEF6 Myc_HisC <220> <221> CDS <222> (1)..(906) <400> 1 10 <210> 111 <211> 301 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> 1 1 1 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Giu Tyr Arg Ala Giu Val Gly Gln 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Giy Asn Leu 40 45 Val Pro Val Cys Trp Giy Lys Giy Ala Cys Pro Val Phe Giu Cys Gly 50 55 60 Asn Vai Val Leu Arg Thr Asp Giu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Giy Asp Leu Asn Lys Gly Asp Vai Ser Leu Ile 85 90 95 100 105 110 Gln Ile Pro Giy Iie Met Asn Asp Giu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Vai 115 120 125 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Giy His Giy Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu Giy Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asu Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Giy Ile Tyr Ile Gly Ala Giy 195 200 205 210 215 220 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Giu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Giu 245 250 255 Giy Ile Arg Ser Giu Giu Asn Ile Tyr Thr Ile Giu Giu Asn Val Tyr 260 265 270 Giu Val Giu Giu Pro Asn Giu Tyr Tyr Cys Tyr vai Ser Ser Arg Gln 275 280 285 Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 <210> 112 <211>35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTlM3kimera96-105F <400> 1 12 <210> 113 <211>35 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> Primer hTlM3kimera96-105R <400> 1 13 <210> 114 <211> 906 <212> DNA <213> Yapay <220> <223> TIM-3 kimera 96- lOS/pEFö Myc_HisC <220> <221> CDS <222> (1)..(906) <400> l 14 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Giu Val Gly Gln 25 30 Asn Ala Ty: Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 61.3( *:9*- Ser Gin Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro <210> 115 <211>301 <212> PRT <213> Yapay <220> <223> Sentetik Olusum <400> l 15 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Ile 85 90 95 100 105 110 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asu Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Giy Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Giy Ala Gly

Claims (8)

ISTEMLER
1. Beseri TIM-3'ün bir hücre disi alanina baglanan bir monoklonal antikor olup, burada antikor ADCC aktivitesi sergiler ve DIZI TANIM NO: 8°in amino asitleri 20 ila 140 ile temsil edilen amino asit dizisi içeren bir antikorun VH,sini içeren ve DIZI TANIM NO: 10°un amino asitleri 21 ila 127 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren bir antikorun VL7sini içeren bir monoklonal antikordur.
2. Istem 1”e göre monoklonal antikor olup, bu bir rekombinant antikordur.
3. Istem 1 veya 2,ye göre monoklonal antikoru kodlayan bir DNA.
4. Istem 3”e göre DNA içeren bir rekombinant vektör.
5. Istein 4”e göre rekombinant vektörün bir konakçi hücreye katilmasiyla elde edilebilen Istem 1 veya 2,nin monoklonal antikorunu dengeli sekilde eksprese eden bir hücre olan bir beseri olmayan trans formant.
6. Istem 1 veya 27ye göre monoklonal antikor üretmeye yönelik bir islem olup, istem 1 veya 29ye göre monoklonal antikoru olusturmak ve toplamak için kültürde istem 5°e göre transformantin kültürlenmesini, ve kültürden monoklonal antikorun geri kazanilmasini içerir.
7. Istem 1 veya 2°de tanimlandigi gibi monoklonal antikorun kullanilmasini içeren bir beseri TIM-3”ü immünolojik olarak saptamak veya ölçmek için bir in vitro usul.
8. Istem 1 veya 2”ye göre monoklonal antikor olup, bir beseri TIM-3 pozitif hücreyle ilgili bir hastaliga yönelik bir terapi usulünde kullanim içindir, bu hastalik, bir kanserdir.
TR2018/07750T 2010-06-11 2011-06-10 Anti-TIM-3 antikoru. TR201807750T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35383610P 2010-06-11 2010-06-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201807750T4 true TR201807750T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=45098210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/07750T TR201807750T4 (tr) 2010-06-11 2011-06-10 Anti-TIM-3 antikoru.

Country Status (14)

Country Link
US (3) US8552156B2 (tr)
EP (2) EP2581113B1 (tr)
JP (2) JP6158511B2 (tr)
KR (1) KR101846590B1 (tr)
CN (1) CN103079644B (tr)
AU (1) AU2011262758B8 (tr)
CA (1) CA2814155C (tr)
ES (1) ES2682078T3 (tr)
HU (1) HUE040213T2 (tr)
PL (1) PL2581113T3 (tr)
PT (1) PT2581113T (tr)
TR (1) TR201807750T4 (tr)
TW (1) TWI629483B (tr)
WO (1) WO2011155607A1 (tr)

Families Citing this family (292)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2359834T5 (en) 2006-03-15 2017-02-06 Alexion Pharma Inc Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients with a complement inhibitor
WO2009120905A2 (en) * 2008-03-26 2009-10-01 Cellerant Therapeutics, Inc. Immunoglobulin and/or toll-like receptor proteins associated with myelogenous haematological proliferative disorders and uses thereof
EP2417984B1 (en) * 2009-04-10 2016-03-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for treatment of blood tumor using anti-tim-3 antibody
CA2769464C (en) * 2009-08-07 2017-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Humanized anti-amyloid-.beta. oligomer antibody
EP2581113B1 (en) 2010-06-11 2018-05-09 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-tim-3 antibody
JP5982409B2 (ja) 2011-03-16 2016-09-07 アルゲン−エックス エヌ．ブイ． Ｃｄ７０に対する抗体
US8841418B2 (en) 2011-07-01 2014-09-23 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to TIM3
WO2013013188A1 (en) 2011-07-21 2013-01-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic protein kinase inhibitors
PT3378535T (pt) 2011-10-28 2023-02-06 Prothena Biosciences Ltd Anticorpos humanizados que reconhecem a alfa-sinucleína
BR112014018561A8 (pt) 2012-01-27 2017-07-11 Neotope Biosciences Ltd Anticorpo; ácido nucleico; célula hospedeira; composição farmacêutica; uso de um anticorpo; método para produção de um anticorpo; e método para produção de uma linhagem celular que produz um anticorpo
US10513540B2 (en) 2012-07-31 2019-12-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of the immune response
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
US20160185853A1 (en) * 2013-03-14 2016-06-30 Parkash Gill Cancer treatment using antibodies that bind cell surface grp78
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
EP3049442A4 (en) 2013-09-26 2017-06-28 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
CN104072615B (zh) * 2014-01-26 2016-08-24 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种能阻断Tim-3信号通路的人Tim-3融合蛋白
JOP20200096A1 (ar) * 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
US9993551B2 (en) 2014-09-13 2018-06-12 Novartis Ag Combination therapies of EGFR inhibitors
KR20170066546A (ko) 2014-10-03 2017-06-14 노파르티스 아게 조합 요법
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
TWI716362B (zh) 2014-10-14 2021-01-21 瑞士商諾華公司 針對ｐｄ－ｌ１之抗體分子及其用途
CA2965960A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Agency For Science, Technology And Research Anti-tim-3 antibodies
GB201419094D0 (en) * 2014-10-27 2014-12-10 Agency Science Tech & Res Anti-TIM-3-antibodies
MX2017005920A (es) * 2014-11-06 2017-06-27 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-tim3 y metodos de uso.
WO2016073860A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Medimmune, Llc Binding molecules specific for staphylococcus protein a and uses thereof
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
WO2016100882A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Combination therapies
WO2016111947A2 (en) * 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
CN107922484A (zh) * 2015-03-06 2018-04-17 索伦托治疗有限公司 结合tim3的抗体治疗剂
JP6692826B2 (ja) 2015-03-10 2020-05-13 アドゥロ バイオテック，インク． 「インターフェロン遺伝子刺激因子」依存性シグナル伝達の活性化のための組成物及び方法
MA41867A (fr) * 2015-04-01 2018-02-06 Anaptysbio Inc Anticorps dirigés contre l'immunoglobuline de cellule t et protéine 3 de mucine (tim-3)
CA2992238A1 (en) 2015-07-14 2017-01-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A therapeutic agent for a tumor comprising an ido inhibitor administered in combination with an antibody
US10786547B2 (en) 2015-07-16 2020-09-29 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions, articles of manufacture and methods for treating cancer
US20180207273A1 (en) 2015-07-29 2018-07-26 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
PT3317301T (pt) 2015-07-29 2021-07-09 Novartis Ag Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3
US11014983B2 (en) 2015-08-20 2021-05-25 Sutro Biopharma, Inc. Anti-Tim-3 antibodies, compositions comprising anti-Tim-3 antibodies and methods of making and using anti-Tim-3 antibodies
JP6653054B2 (ja) * 2015-09-17 2020-02-26 ナショナル キャンサー センター Ｔｉｍ−３をターゲットとする脳損傷疾患治療用組成物及びこのスクリーニング方法
WO2017055484A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for determining the metabolic status of lymphomas
CR20180161A (es) 2015-10-02 2018-05-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecíficos para pd1 y tim3
US10894830B2 (en) 2015-11-03 2021-01-19 Janssen Biotech, Inc. Antibodies specifically binding PD-1, TIM-3 or PD-1 and TIM-3 and their uses
JP2019503349A (ja) 2015-12-17 2019-02-07 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子およびその使用
ES2837155T3 (es) 2016-01-04 2021-06-29 Inst Nat Sante Rech Med Uso de PD-1 y Tim-3 como medida de células CD8+ para predecir y tratar el carcinoma de células renales
CA3009001A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Universitat Zurich Immune-stimulating humanized monoclonal antibodies against human interleukin-2, and fusion proteins thereof
US10822415B2 (en) 2016-01-28 2020-11-03 Inserm (Institut National De La Santéet De La Recherche Médicale) Methods for enhancing the potency of the immune checkpoint inhibitors
US10918737B2 (en) 2016-01-28 2021-02-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of cancer
CA3013333A1 (en) 2016-02-26 2017-08-31 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Antibodies having specificity for btla and uses thereof
MD3443009T2 (ro) * 2016-04-12 2022-02-28 Symphogen As Anticorpi anti-TIM-3 și compoziții
IL295538B2 (en) 2016-04-13 2024-02-01 Vivia Biotech Sl In vitro bite-activated T cells
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
WO2017202962A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of non small cell lung cancer (nsclc) that coexists with chronic obstructive pulmonary disease (copd)
CN109476751B (zh) 2016-05-27 2024-04-19 艾吉纳斯公司 抗tim-3抗体及其使用方法
AU2017283480A1 (en) 2016-06-13 2019-01-24 Torque Therapeutics, Inc. Methods and compositions for promoting immune cell function
WO2017214943A1 (zh) * 2016-06-16 2017-12-21 毛侃琅 促进 tim-3 基因表达的慢病毒表达载体及其应用
CN109475603B (zh) 2016-06-20 2023-06-13 科马布有限公司 抗pd-l1抗体
EP3507367A4 (en) 2016-07-05 2020-03-25 Aduro BioTech, Inc. CYCLIC DINUCLEOTID COMPOUNDS WITH INCLUDED NUCLEIC ACIDS AND USES THEREOF
MY200602A (en) 2016-07-14 2024-01-04 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against tim3 and uses thereof
JOP20190013A1 (ar) * 2016-08-25 2019-01-31 Lilly Co Eli أجسام مضادة لـ (تي آي ام -3)
KR102460525B1 (ko) 2016-08-26 2022-11-01 베이진 엘티디 항-tim-3 항체 및 그의 용도
WO2018046738A1 (en) 2016-09-12 2018-03-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of patients suffering from cancer
WO2018046736A1 (en) 2016-09-12 2018-03-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of patients suffering from cancer
EP3515453A1 (en) 2016-09-22 2019-07-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for reprograming immune environment in a subject in need thereof
CA3036564A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific antibody molecules comprising lambda and kappa light chains
CN110062885A (zh) 2016-11-01 2019-07-26 安奈普泰斯生物有限公司 针对t细胞免疫球蛋白和粘蛋白3（tim-3）的抗体
WO2018094275A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
JOP20190133A1 (ar) 2016-12-08 2019-06-02 Innovent Biologics Suzhou Co Ltd أجسام مضادة لـ Tim-3 لمزجها بأجسام مضادة لـ PD-1
WO2018106529A1 (en) * 2016-12-08 2018-06-14 Eli Lilly And Company Anti-tim-3 antibodies for combination with anti-pd-l1 antibodies
CA3047508A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Virttu Biologics Limited Treatment of cancer
WO2018122249A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of patients suffering from a microsatellite stable colorectal cancer
WO2018122245A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting the survival time of patients suffering from cms3 colorectal cancer
AU2018205401A1 (en) 2017-01-09 2019-07-25 Tesaro, Inc. Methods of treating cancer with anti-TIM-3 antibodies
WO2018146128A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Detection of kit polymorphism for predicting the response to checkpoint blockade cancer immunotherapy
WO2018146148A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) A method for predicting the response to checkpoint blockade cancer immunotherapy
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
EP3587452A4 (en) 2017-02-27 2021-03-03 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. ANTI-TIM-3 ANTIBODIES, ANTIGEN BINDING FRAGMENT OF IT, AND MEDICAL USES OF IT
US20210186982A1 (en) 2017-03-24 2021-06-24 Universite Nice Sophia Antipolis Methods and compositions for treating melanoma
PL3606946T3 (pl) 2017-04-03 2022-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunokoniugaty przeciwciała anty-PD-1 ze zmutowaną IL-2 lub z IL-15
EP4116328A1 (en) 2017-04-05 2023-01-11 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Combination therapies targeting pd-1, tim-3, and lag-3
BR112019019821A2 (pt) 2017-04-05 2020-04-22 Hoffmann La Roche anticorpo biespecífico, polinucleotídeo, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, métodos de produção do anticorpo biespecífico, de tratamento de um indivíduo que tem câncer ou uma infecção viral crônica e de inibição do crescimento de células de tumor, composição farmacêutica e uso do anticorpo biespecífico
AU2018256406A1 (en) 2017-04-19 2019-10-17 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific molecules and uses thereof
AR111651A1 (es) 2017-04-28 2019-08-07 Novartis Ag Conjugados de anticuerpos que comprenden agonistas del receptor de tipo toll y terapias de combinación
EP3615566B1 (en) 2017-04-28 2023-12-20 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific molecules comprising a non-immunoglobulin heterodimerization domain and uses thereof
UY37695A (es) 2017-04-28 2018-11-30 Novartis Ag Compuesto dinucleótido cíclico bis 2’-5’-rr-(3’f-a)(3’f-a) y usos del mismo
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
WO2018222901A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
WO2018223004A1 (en) 2017-06-01 2018-12-06 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd20 and cd3
CA3065929A1 (en) 2017-06-01 2018-12-06 Michael Wayne SAVILLE Bispecific antibodies that bind cd123 and cd3
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
EP3641739A1 (en) 2017-06-20 2020-04-29 Institut Curie Inhibitor of suv39h1 histone methyltransferase for use in cancer combination therapy
WO2018235056A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag IL-1BETA BINDING ANTIBODIES FOR USE IN THE TREATMENT OF CANCER
EA202090104A1 (ru) 2017-06-22 2020-04-09 Новартис Аг Молекулы антител к cd73 и пути их применения
US20200172628A1 (en) 2017-06-22 2020-06-04 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
KR20200019865A (ko) 2017-06-22 2020-02-25 노파르티스 아게 암 치료에 사용하기 위한 il-1베타 결합 항체
AU2018292618A1 (en) 2017-06-27 2019-12-19 Novartis Ag Dosage regimens for anti-TIM-3 antibodies and uses thereof
CN111163798A (zh) 2017-07-20 2020-05-15 诺华股份有限公司 用于抗lag-3抗体的给药方案及其用途
US11926664B2 (en) 2017-07-25 2024-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating monocytopoiesis
WO2019023410A1 (en) * 2017-07-28 2019-01-31 Phanes Therapeutics, Inc. ANTI-TIM-1 ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
CN111094982A (zh) * 2017-08-28 2020-05-01 百时美施贵宝公司 用于治疗和诊断癌症的tim-3拮抗剂
CA3073953A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Io Therapeutics, Inc. Rar selective agonists in combination with immune modulators for cancer immunotherapy
WO2019055579A1 (en) 2017-09-12 2019-03-21 Tolero Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT REGIME FOR CANCERS THAT ARE INSENSITIVE TO BCL-2 INHIBITORS USING THE MCL-1 ALVOCIDIB INHIBITOR
US20210060158A1 (en) 2017-09-19 2021-03-04 Institut Curie Agonist of aryl hydrocarbon receptor for use in cancer combination therapy
US10927180B2 (en) 2017-10-13 2021-02-23 Harpoon Therapeutics, Inc. B cell maturation antigen binding proteins
CA3079310A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Vivia Biotech, S.L. Bite-activated car-t cells
WO2019081983A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Novartis Ag CD32B TARGETING ANTIBODIES AND METHODS OF USE
CA3079844A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Armo Biosciences, Inc. Compositions and methods of use of interleukin-10 in combination with immune checkpoint pathway inhibitors
WO2019099838A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Novartis Ag Combination therapies
MX2020005651A (es) 2017-11-30 2020-10-28 Novartis Ag Receptor de antigeno quimerico dirigido a bcma y usos del mismo.
JP7348899B2 (ja) 2017-12-08 2023-09-21 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 多重特異性分子及びその使用
CN108794630A (zh) * 2017-12-18 2018-11-13 镇江爱必梦生物科技有限公司 鼠抗人tim3蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途
EP3735590A1 (en) 2018-01-04 2020-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma resistant
US20200368268A1 (en) 2018-01-08 2020-11-26 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
CN111886255A (zh) * 2018-01-12 2020-11-03 百时美施贵宝公司 抗tim3抗体及其用途
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
CN111868091A (zh) 2018-01-16 2020-10-30 百时美施贵宝公司 用抗tim3抗体治疗癌症的方法
AU2019215031A1 (en) 2018-01-31 2020-08-20 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
EP3756012A1 (en) 2018-02-21 2020-12-30 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of sk1 as biomarker for predicting response to immunecheckpoint inhibitors
US20200405853A1 (en) 2018-03-06 2020-12-31 Institut Curie Inhibitor of setdb1 histone methyltransferase for use in cancer combination therapy
EP3765085A1 (en) 2018-03-12 2021-01-20 Université de Paris Use of caloric restriction mimetics for potentiating chemo-immunotherapy for the treatment of cancers
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
US20210238280A1 (en) 2018-03-14 2021-08-05 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CN110272489B (zh) * 2018-03-15 2023-08-22 上海健信生物医药科技有限公司 一种针对tim-3的全人源化抗体分子, 抗原结合片段及其医药用途
CN110305216B (zh) * 2018-03-20 2022-09-02 无锡智康弘义生物科技有限公司 新型抗tim-3抗体
EP3768725A4 (en) * 2018-03-20 2021-06-02 Wuxi Biologics Ireland Limited NEW ANTI-TIM-3 ANTIBODIES
US11242393B2 (en) 2018-03-23 2022-02-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
WO2019185792A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Philogen S.P.A Cancer treatment using immunoconjugates and immune check-point inhibitors
WO2019196911A1 (en) * 2018-04-12 2019-10-17 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. Antibody binding tim-3 and use thereor
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
WO2019204665A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
CA3097625A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Il-15/il-15ra heterodimeric fc fusion proteins and uses thereof
US11884725B2 (en) 2018-04-24 2024-01-30 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Antibody against TIM-3 and application thereof
WO2019207030A1 (en) 2018-04-26 2019-10-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting a response with an immune checkpoint inhibitor in a patient suffering from a lung cancer
TW202015726A (zh) 2018-05-30 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
CA3098420A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Binding molecules against bcma and uses thereof
AU2019276656A1 (en) 2018-06-01 2021-01-07 Novartis Ag Dosing of a bispecific antibody that bind CD123 and CD3
CA3103629A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
EP3810189A1 (en) 2018-06-19 2021-04-28 Armo Biosciences, Inc. Compositions and methods of use of il-10 agents in conjunction with chimeric antigen receptor cell therapy
TW202016145A (zh) * 2018-06-29 2020-05-01 財團法人生物技術開發中心 抗人類tim-3之人類化抗體及其用途
US11845797B2 (en) 2018-07-03 2023-12-19 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
FI3820573T3 (fi) 2018-07-10 2023-11-01 Novartis Ag 3-(5-hydroksi-1-oksoisoindolin-2-yyli)piperidiini-2,6-dionijohdannaisia ja niiden käyttö ikaros-perheen sinkkisormi 2 (ikzf2) -riippuvaisten sairauksien hoidossa
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
SG11202012148RA (en) * 2018-08-21 2021-01-28 Albert Einstein College Of Medicine Monoclonal antibodies against human tim-3
US20210261663A1 (en) * 2018-08-28 2021-08-26 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-tim3 antibody pharmaceutical composition and use thereof
WO2020047299A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
JP7449292B2 (ja) 2018-08-30 2024-03-13 エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド 加齢関連障害の治療法
US11401324B2 (en) 2018-08-30 2022-08-02 HCW Biologics, Inc. Single-chain chimeric polypeptides and uses thereof
WO2020048942A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cytotoxic t lymphocyte-dependent immune responses
EP3853251A1 (en) 2018-09-19 2021-07-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of cancers resistant to immune checkpoint therapy
KR20210086623A (ko) 2018-09-25 2021-07-08 하푼 테라퓨틱스, 인크. Ddl3 결합 단백질 및 사용 방법
AU2019346645A1 (en) 2018-09-27 2021-04-29 Marengo Therapeutics, Inc. CSF1R/CCR2 multispecific antibodies
EP3860578A1 (en) 2018-10-01 2021-08-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of inhibitors of stress granule formation for targeting the regulation of immune responses
WO2020070062A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tim-3 inhibitors for the treatment of exacerbations in patients suffering from severe asthma
CA3115096A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
EP3867269A1 (en) 2018-10-18 2021-08-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combination of a big-h3 antagonist and an immune checkpoint inhibitor for the treatment of solid tumor
CN110655566B (zh) * 2018-10-25 2021-06-18 浙江大学 可溶性Tim-3重组蛋白及其突变型蛋白的制备和应用
WO2020104479A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cancers and resistant cancers with anti transferrin receptor 1 antibodies
WO2020104496A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bispecific antibody targeting transferrin receptor 1 and soluble antigen
WO2020109355A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kit for assaying lytic potential of immune effector cells
CN111253485A (zh) * 2018-11-30 2020-06-09 上海开拓者生物医药有限公司 抗人tim-3单克隆抗体及其应用
AU2019391097A1 (en) 2018-12-04 2021-05-20 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. CDK9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer
US20220018835A1 (en) 2018-12-07 2022-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of cd26 and cd39 as new phenotypic markers for assessing maturation of foxp3+ t cells and uses thereof for diagnostic purposes
WO2020115261A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
US20210340252A1 (en) * 2018-12-12 2021-11-04 WuXi Biologics Ireland Limited Anti-tim-3 antibodies and uses thereof
WO2020120592A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating melanoma
US20220047556A1 (en) 2018-12-17 2022-02-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of sulconazole as a furin inhibitor
TW202038958A (zh) 2018-12-18 2020-11-01 比利時商阿根思公司 Ｃｄ７０組合治療
EP3898699A1 (en) 2018-12-19 2021-10-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cancers by immuno-modulation using antibodies against cathespin-d
CA3123511A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
CN113194952A (zh) 2018-12-20 2021-07-30 诺华股份有限公司 Hdm2-p53相互作用抑制剂和bcl2抑制剂的组合及其治疗癌症的用途
CN113438961A (zh) 2018-12-20 2021-09-24 Xencor股份有限公司 含有IL-15/IL-15Rα和NKG2D抗原结合结构域的靶向异二聚体Fc融合蛋白
WO2020127885A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions for treating cancers and resistant cancers
EP3898674A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Novartis AG Use of il-1beta binding antibodies
WO2020128637A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novartis Ag Use of il-1 binding antibodies in the treatment of a msi-h cancer
CN113227137A (zh) 2018-12-21 2021-08-06 诺华股份有限公司 IL-1β抗体在骨髓增生异常综合征的治疗或预防中的用途
KR20210109564A (ko) 2018-12-21 2021-09-06 옹쎄오 신규의 컨쥬게이티드 핵산 분자 및 이의 용도
EP3897613A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Novartis AG Use of il-1beta binding antibodies
AU2019407814A1 (en) 2018-12-21 2021-07-22 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-PD-1/IL-7 molecule
SG11202107257UA (en) 2019-01-03 2021-07-29 Inst Nat Sante Rech Med Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cd8+ t cell-dependent immune responses in subjects suffering from cancer
US20220098264A1 (en) 2019-01-15 2022-03-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Mutated interleukin-34 (il-34) polypeptides and uses thereof in therapy
EP3918332A1 (en) 2019-01-30 2021-12-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for identifying whether a subject suffering from a cancer will achieve a response with an immune-checkpoint inhibitor
WO2020161083A1 (en) 2019-02-04 2020-08-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating blood-brain barrier
WO2020167990A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Formulations comprising heterocyclic protein kinase inhibitors
US20220098674A1 (en) 2019-02-13 2022-03-31 Inserm (Institut National De La Santé Et Dr La Recherch Médicale) Methods and compositions for selecting a cancer treatment in a subject suffering from cancer
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
CA3123519A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020165833A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020169472A2 (en) 2019-02-18 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing phenotypic changes in macrophages
US11793802B2 (en) 2019-03-20 2023-10-24 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure
EP3941463A1 (en) 2019-03-22 2022-01-26 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Compositions comprising pkm2 modulators and methods of treatment using the same
EP3947737A2 (en) 2019-04-02 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
EP3952850A1 (en) 2019-04-09 2022-02-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of sk2 inhibitors in combination with immune checkpoint blockade therapy for the treatment of cancer
EP3956446A1 (en) 2019-04-17 2022-02-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treatment of nlrp3 inflammasome mediated il-1beta dependent disorders
US20220220565A1 (en) 2019-04-30 2022-07-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
WO2020227159A2 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity
KR20220016155A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 면역-종양학 (i-o) 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법
CN114174537A (zh) 2019-05-30 2022-03-11 百时美施贵宝公司 细胞定位特征和组合疗法
US20220363760A1 (en) 2019-05-30 2022-11-17 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signature for suitability to immuno-oncology therapy
EP3987010A1 (en) 2019-06-21 2022-04-27 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
BR112021026832A2 (pt) 2019-07-02 2022-05-10 Hutchinson Fred Cancer Res Vetores ad35 recombinantes e aprimoramentos da terapia gênica relacionada
KR20220028075A (ko) 2019-07-03 2022-03-08 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. 티로신 키나제 비-수용체 1 (tnk1) 억제제 및 그의 용도
CN110498855A (zh) * 2019-07-25 2019-11-26 钟小泉 一种tim-3抗体及其用途
CN110407938B (zh) * 2019-08-12 2020-03-06 北京昭衍生物技术有限公司 抗tim-3单克隆抗体、表达载体及其应用
WO2021048292A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
WO2021053490A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Novartis Ag Use of high-affinity, ligand-blocking, humanized anti-t-cell immunoglobulin domain and mucin domain-3 (tim-3) igg4 antibody for the treatment of myelofibrosis
CN114502590A (zh) 2019-09-18 2022-05-13 诺华股份有限公司 Entpd2抗体、组合疗法、以及使用这些抗体和组合疗法的方法
WO2021051351A1 (zh) * 2019-09-19 2021-03-25 上药生物治疗（香港）有限公司 一种分离的抗原结合蛋白及其用途
EP3800201A1 (en) 2019-10-01 2021-04-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Cd28h stimulation enhances nk cell killing activities
EP4037714A1 (en) 2019-10-03 2022-08-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating macrophages polarization
CN115916233A (zh) 2019-10-03 2023-04-04 Xencor股份有限公司 靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白
US20220363776A1 (en) 2019-10-04 2022-11-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of ovarian cancer, breast cancer or pancreatic cancer
EP4045686A1 (en) 2019-10-17 2022-08-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for diagnosing nasal intestinal type adenocarcinomas
CN114786679A (zh) 2019-10-21 2022-07-22 诺华股份有限公司 具有维奈托克和tim-3抑制剂的组合疗法
EP4048285A1 (en) 2019-10-21 2022-08-31 Novartis AG Tim-3 inhibitors and uses thereof
EP4051286A1 (en) 2019-10-29 2022-09-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and compositions for treating uveal melanoma
CN114599372A (zh) 2019-11-04 2022-06-07 阿斯利康(瑞典)有限公司 用于治疗癌症的组合疗法
WO2021127217A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
AU2020406083A1 (en) 2019-12-17 2022-06-16 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an IL-7 variant
CA3164754A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and vaccine compositions to treat cancers
CN115175937A (zh) 2019-12-20 2022-10-11 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓纤维化和骨髓增生异常综合征的抗TIM-3抗体MBG453和抗TGF-β抗体NIS793与或不与地西他滨或抗PD-1抗体斯巴达珠单抗的组合
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
US20230076415A1 (en) 2020-01-17 2023-03-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
IL293752A (en) 2020-01-17 2022-08-01 Novartis Ag A combination containing a tim-3 inhibitor and a substance that causes hypomethylation for use in the treatment of myeloplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia
WO2021156360A1 (en) 2020-02-05 2021-08-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for discontinuing a treatment with a tyrosine kinase inhibitor (tki)
CA3169231A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 HCW Biologics, Inc. Methods of treating age-related and inflammatory diseases
AU2021220196A1 (en) 2020-02-11 2022-08-04 HCW Biologics, Inc. Methods of activating regulatory T cells
KR20220140535A (ko) 2020-02-11 2022-10-18 에이치씨더블유 바이올로직스, 인크. 크로마토그래피 수지 및 이의 용도
WO2021171264A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Novartis Ag Dosing of a bispecific antibody that binds cd123 and cd3
EP4110955A1 (en) 2020-02-28 2023-01-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing, prognosing and managing treatment of breast cancer
WO2021175191A1 (zh) * 2020-03-02 2021-09-10 信达生物制药(苏州)有限公司 抗tim-3抗体及其用途
CN115836087A (zh) 2020-04-29 2023-03-21 Hcw生物科技公司 抗cd26蛋白及其用途
WO2021247003A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
KR20230031280A (ko) 2020-06-01 2023-03-07 에이치씨더블유 바이올로직스, 인크. 노화 관련 장애의 치료 방법
AR122644A1 (es) 2020-06-19 2022-09-28 Onxeo Nuevas moléculas de ácido nucleico conjugado y sus usos
JP2023531676A (ja) 2020-06-23 2023-07-25 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピぺリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与レジメン
JP2023532339A (ja) 2020-06-29 2023-07-27 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド サノトランスミッションを促進するためにエンジニアリングされたウイルス及び癌の処置におけるそれらの使用
WO2022002873A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of recurrence and/or death of patients suffering from a solid cancer after preoperative adjuvant therapies
WO2022002874A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of recurrence and/or death of patients suffering from a solid cancer after preoperative adjuvant therapy and radical surgery
JP2023535610A (ja) 2020-07-28 2023-08-18 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ガンを予防及び処置するための方法及び組成物
WO2022029573A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
AU2021333779A1 (en) 2020-08-26 2023-04-13 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting TRBC1 or TRBC2
EP4204021A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
WO2022043558A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
AU2021334361A1 (en) 2020-08-31 2023-05-11 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and immunotherapy
IL300314A (en) 2020-10-08 2023-04-01 Affimed Gmbh Coupling materials with triple specificity
WO2022084531A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating glioma
EP4240491A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Cd19 binding molecules and uses thereof
US20230416838A1 (en) 2020-11-16 2023-12-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating uveal melanoma
WO2022101481A1 (en) 2020-11-16 2022-05-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating uveal melanoma
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
TW202237119A (zh) 2020-12-10 2022-10-01 美商住友製藥腫瘤公司 Ａｌｋ﹘５抑制劑和彼之用途
EP4267172A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
MX2023007734A (es) 2020-12-28 2023-08-21 Bristol Myers Squibb Co Composiciones de anticuerpos y metodos de uso de las mismas.
WO2022148781A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Institut Curie Combination of mcoln activators and immune checkpoint inhibitors
CA3204162A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 Robert Kastelein Compositions and methods related to receptor pairing
CN112979809B (zh) * 2021-02-24 2021-11-09 北京昭衍生物技术有限公司 一种与抗原tim-3结合的靶向分子
CN112961239B (zh) * 2021-02-24 2021-09-10 北京昭衍生物技术有限公司 Tim抑制剂及其应用
EP4308118A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and compositions for treating melanoma
EP4313109A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
JP2024514530A (ja) 2021-04-02 2024-04-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 切断型ｃｄｃｐ１に対する抗体およびその使用
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
GB2623199A (en) 2021-04-08 2024-04-10 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules binding to TCR and uses thereof
WO2022214652A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
IL307419A (en) 2021-04-09 2023-12-01 Ose Immunotherapeutics A new scaffold for bifunctional molecules with improved properties
US20220363696A1 (en) 2021-04-13 2022-11-17 Nuvalent, Inc. Amino-substituted heterocycles for treating cancers with egfr mutations
EP4326903A1 (en) 2021-04-23 2024-02-28 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating cell senescence accumulation related disease
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
CA3224374A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
CA3216098A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Uwe Reusch Duplexbodies
WO2023078900A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating triple negative breast cancer (tnbc)
CN114934065A (zh) * 2021-11-25 2022-08-23 浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司 携带免疫检查点分子tim-3抗体基因的溶瘤腺病毒构建方法和应用
WO2023111203A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Onxeo New conjugated nucleic acid molecules and their uses
WO2023118165A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
WO2023168363A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 HCW Biologics, Inc. Method of treating pancreatic cancer
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
WO2024028386A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28
WO2024033399A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Sigmar1 ligand for the treatment of pancreatic cancer
WO2024033400A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Sk2 inhibitor for the treatment of pancreatic cancer
WO2024052356A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Inhibitors of the ceramide metabolic pathway for overcoming immunotherapy resistance in cancer
WO2024056716A1 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of dilated cardiomyopathy
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024084013A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024084034A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of osteoarthritis
WO2024089417A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Tumour stratification for responsiveness to an immune checkpoint inhibitor
WO2024089418A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Cancer Research Technology Limited Tumour sensitisation to checkpoint inhibitors with redox status modifier

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5623587A (en) 1979-08-03 1981-03-05 Mitsuwa Seiki Co Ltd Vane type compressor
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
WO1985003934A1 (en) 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein and process for its preparation
JPS60221091A (ja) 1983-12-21 1985-11-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プロモ−タ−
JP2564268B2 (ja) 1985-08-28 1996-12-18 協和醗酵工業株式会社 融合抗原ポリペプチド
ZA872705B (en) 1986-04-22 1987-10-05 Immunex Corporation Human g-csf protein expression
JP2958019B2 (ja) 1988-05-06 1999-10-06 住友製薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
JP2928287B2 (ja) 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
JP3131322B2 (ja) 1991-12-17 2001-01-31 協和醗酵工業株式会社 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
WO1994023021A1 (en) 1993-03-29 1994-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α-1,3-FUCOSYLTRANSFERASE
US6066322A (en) 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
ATE283926T1 (de) 1995-09-11 2004-12-15 Kyowa Hakko Kogyo Kk Antikörper gegen die alpha-kette von humanem interleukin 5 rezeptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
MXPA03002974A (es) * 2000-10-06 2004-05-05 Kyowa Hakko Kogyo Kk Celulas que producen composiciones de anticuerpo.
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP1467759A4 (en) 2002-01-30 2006-05-31 Brigham & Womens Hospital COMPOSITIONS AND METHODS ASSOCIATED WITH TIM-3, TH1-SPECIFIC CELL SURFACE MOLECULE
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
AU2005231685A1 (en) 2004-03-24 2005-10-20 Telos Pharmaceuticals Llc Compositions as adjuvants to improve immune responses to vaccines and methods of use
CN101035561A (zh) * 2004-03-24 2007-09-12 特罗斯药品公司 作为改善对疫苗的免疫反应的佐剂的组合物和使用方法
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
EP2081961A2 (en) * 2006-11-15 2009-07-29 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Therapeutic uses of tim-3 modulators
US9274119B2 (en) * 2008-01-11 2016-03-01 The University Of Tokyo Anti-CLDN6 antibody
ES2796085T3 (es) 2008-01-15 2020-11-25 Univ Leland Stanford Junior Marcadores de células madre de leucemia mieloide aguda
EP2417984B1 (en) 2009-04-10 2016-03-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for treatment of blood tumor using anti-tim-3 antibody
EP2581113B1 (en) * 2010-06-11 2018-05-09 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-tim-3 antibody

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011262758B2 (en) 2014-04-24
ES2682078T3 (es) 2018-09-18
US10550181B2 (en) 2020-02-04
PL2581113T3 (pl) 2018-11-30
HUE040213T2 (hu) 2019-02-28
CN103079644B (zh) 2017-02-15
CA2814155C (en) 2019-10-22
WO2011155607A1 (ja) 2011-12-15
CN103079644A (zh) 2013-05-01
JPWO2011155607A1 (ja) 2013-08-15
JP2017189168A (ja) 2017-10-19
AU2011262758A8 (en) 2014-09-04
EP2581113A4 (en) 2013-12-25
AU2011262758B8 (en) 2014-09-04
KR20130132695A (ko) 2013-12-05
US20140044728A1 (en) 2014-02-13
TWI629483B (zh) 2018-07-11
AU2011262758A1 (en) 2013-01-10
KR101846590B1 (ko) 2018-04-09
JP6158511B2 (ja) 2017-07-05
US20120189617A1 (en) 2012-07-26
US8552156B2 (en) 2013-10-08
EP2581113A1 (en) 2013-04-17
CA2814155A1 (en) 2011-12-15
US9556270B2 (en) 2017-01-31
EP3363499A1 (en) 2018-08-22
EP2581113B1 (en) 2018-05-09
TW201207397A (en) 2012-02-16
PT2581113T (pt) 2018-07-04
US20170088616A1 (en) 2017-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10550181B2 (en) Anti-TIM-3 antibody
EP2374883B1 (en) Anti-cd4 antibody
CA2785964C (en) Anti-cd27 antibody
US9695237B2 (en) Anti-FOLR1 antibody
CA2729567C (en) Anti-cd27 antibody
JP7311425B2 (ja) ＣＤ４０とＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体
WO2012074097A1 (ja) 抗ｃｄ３３抗体
WO2013005649A1 (ja) 抗ヒトｃｃｒ６抗体
US20240026017A1 (en) Anti-human ccr1 monoclonal antibody