SU904325A1

SU904325A1 - Method of producing l-treonin

Info

Publication number: SU904325A1
Application number: SU802969838A
Authority: SU
Inventors: В.А. Лившиц; А.К. Соколов; В.Г. Дебабов; Н.И. Жданова; Ю.И. Козлов; Л.В. Генинга; Е.М. Хургес; Т.А. Бачина; Л.Ф. Козырева
Original assignee: Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Генетики И Селекции Микроорганизмов
Priority date: 1980-08-06
Filing date: 1980-08-06
Publication date: 1990-08-23

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА, предусматривающий проведение операций приготовлени посевного материала путем выращивани процудентов треонинабактерии Escherchia coli в посевной питательной среде, введени посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода , азота и минеральные соли, добавлени гидролизата белоксодержащего субстрата и последующую ферментацию в глубинных услови х, отличающийс тем, что, с целью расширени сырьевой базы, а также удешевлен ни способа, в качестве продуцентов треонина используют штамм Escherchia coll (ВНИИгенетика - 472Т), при этом выращивание продуцентов ведут в жидкой посевной среде, а добавление гидролизата белоксодержащего субстрата осуществл ют непосредственно в посевс Ф ную питательную среду. A method for producing L-TREONIN, which involves performing seed preparation operations by growing Escherchia coli threonine bacteria in a cultured nutrient medium, introducing the seed material into a fermentation culture medium containing carbon sources, nitrogen and mineral salts, adding a protein containing hydrolyzate substrate and a subsequent synthesis agent, followed by subsequent synthesis of the seed containing substrate, followed by a source of carbon, nitrogen and mineral salts, adding a protein containing substrate and a subsequent sample of the seed containing carbon, nitrogen and mineral salts x, characterized in that, in order to expand the resource base, it also reduces the cost of the method, as producers of threonine is The user strain Escherchia coll (VNIIgenetika - 472T), thus producing the cultivation is carried out in a liquid seed medium, and adding proteinaceous substrate a hydrolyzate is carried out directly in posevs F hydrochloric medium.

Description

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, в частности к способу получени аминокислоты L-треонина.The invention relates to the microbiological industry, in particular to a method for producing the amino acid L-threonine.

Известен способ получени L-треонина , предусматриваюн5ий культивирование его продуцентов бактерий Escherchia coli на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и антибиотик, с после.дующим выделением целевого продукта.A known method for producing L-threonine involves the cultivation of its producers of Escherchia coli bacteria on a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen, mineral salts and an antibiotic, with a subsequent release of the target product.

Недостатком известного способа вл етс невысокий уровень накоплени треонина, а также больша продолжительность ферментации.The disadvantage of this method is the low level of accumulation of threonine, as well as the long duration of fermentation.

Ближайшим техническим решением по технической сущности и достигаемому эффекту вл етс способ получени The closest technical solution to the technical essence and the achieved effect is the method of obtaining

L-треонина, предусматриваюпщй приготовление посевного материала путем вырапщвани продуцентов треонина бактерий Escherchia coli в посевной питательной среде, введение посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода , азота и минеральные соли, добавление гидролизата белоксодержащего субстрата с последующей ферментациейL-threonine, involving the preparation of seed by growing the producers of threonine of Escherchia coli bacteria in the seed culture medium, introducing the seed into the fermentation medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts, adding a protein-containing substrate hydrolyzate, followed by fermentation

в глубинных услови х.in deep conditions.

Сущность способа заключаемс в том, том, что в качестве продуцента Lтреонина используют штамм микроорганизмов Escherchia coli ВНИИ генетики М-1, содержащий амплифицированную гибридную плазмиду, а в ферментационную .среду ввод т питательную добавкуThe essence of the method lies in the fact that the producer of Escherchia coli microorganism strain of the All-Russian Research Institute of Genetics M-1 containing the amplified hybrid plasmid is used as a producer of Threonine, and a nutrient supplement is introduced into the fermentation medium.

в виде гидролизатов белоксодержащих субстратов и процесс ферментации ведут в присутствии пенициллина. Посевной материал выращивают в присутствии пенициллина и в виде клеточной суспензии ввод т непосредственно в ферментационную среду.in the form of hydrolysates of protein-containing substrates and the fermentation process is carried out in the presence of penicillin. The seed is grown in the presence of penicillin and, as a cell suspension, is introduced directly into the fermentation medium.

Недостатком этого способа вл етс сравнительно высокий расход таких компонентов ферментационной среды, как глюкоза, пенициллин и гидролизат белоксодержащих субстратов.The disadvantage of this method is the relatively high consumption of components of the fermentation medium, such as glucose, penicillin, and the hydrolyzate of protein-containing substrates.

Целью -предлагаемого изобретени вл етс расширение сырьевой базы, а также удешевление способа.The purpose of the proposed invention is to expand the resource base as well as reduce the cost of the process.

Поставленна цель достигаетс тем, что в способе получени 1.-трёонина, предусматривающем проведение приготовлени посевного материала путем выращивани продуцентов треонина бактерий Escherchia coli в посевной питательной среде, введени посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода , азота и минеральные соли, добавлени гидролизата белоксодержащего субстрата и последующую ферментацию в глубинных услови х, в качестве продуцента треонина используют штамм Escherchia coli ВНИИгенетика 472Т, при этом выращивание продуцентов осуществл ют в жидкой посевной среде, а добавление гидролизата белоксодержащего субстрата осуществл ют непосредственно в посевную питательную среду.The goal is achieved by the fact that in the method of producing 1.-threonine, which involves preparing the seed by growing the producers of threonine of Escherchia coli bacteria in the seed nutrient medium, introducing the seed to a fermentation nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts, adding a hydrolyzate protein-containing substrate and subsequent fermentation in deep conditions, as a producer of threonine using Escherchia coli strain VNIIgenetika 472T, while growing Table of producing is carried out in a liquid seed medium, and adding proteinaceous substrate a hydrolyzate is carried out directly into the seed medium.

Сущность предлагаемого способа заключаетс в следун цем.The essence of the proposed method consists in the following.

Штамм E.coli ВНИИ генетика 472Т получен на основе штамма E.coli ВНИИ генетика М-1 путем введени в клетки этого штамма генетических детерминантов усвоени сахарозы с последующей селекцией на устойчивость к треонину и гомосерину. В качестве донорного штамма, имеющего детерминанты усвоени сахарозы, использовали соответствующий штамм E.coli; в частности, штамм Н-155.The E.coli strain of the All-Russia Research Institute of Genetics 472T was obtained on the basis of the E.coli strain of the All-Union Research Institute of Genetics M-1 by introducing into the cells of this strain genetic determinants of sucrose absorption, followed by selection for resistance to threonine and homoserine. As a donor strain having determinants of sucrose absorption, the corresponding E. coli strain was used; in particular, strain H-155.

Указанные детерминанты методом конъюгации были введены в штамм E.coli 458 требук ций дл роста треонин , метионин и устойчивый к стрептомицину , а затем из штамма 458 таким же методом - в штамм ВНИИгенетика Ml, продуцирунмций треонин. Отбор рекомбинантов вели на минимальной среде, содержащей сахарозу в качестве единственного источника углерода. В результате был отобран штамм ВНИИгенетика 472, который сохранил способность продуцировать треонин на среде с глюкозой и приобрел способность к накоплению этой аминокислоты на среде с сахарозой или мелассой. В св зи с тем, что рост этого штамма подавл лс в присутствии высоких концентраций треонина и гомосерина в среде, были получены спонтанные мутанты, устойчивые к этим аминокислотам при содержании их в среде в количестве более 0,5 г/л. Среди указанных мутантов был отобран штамм ВНИИгенетика 472Т.These determinants by the conjugation method were introduced into the E. coli strain 458 requirements for growth of threonine, methionine and resistant to streptomycin, and then from strain 458 by the same method into the All-Union Research Institute of Metarine, threonine products. Selection of recombinants was conducted on a minimal medium containing sucrose as the sole carbon source. As a result, the VNIIGetika 472 strain was selected, which retained the ability to produce threonine on the medium with glucose and acquired the ability to accumulate this amino acid on the medium with sucrose or molasses. Due to the fact that the growth of this strain was suppressed in the presence of high concentrations of threonine and homoserine in the medium, spontaneous mutants resistant to these amino acids were obtained with their content in the medium in excess of 0.5 g / l. Among these mutants, a VNIIgenetika 472T strain was selected.

Характеристика штамма Escherchia coli ВНИИгенетика 472Т.Characterization of Escherchia coli strain VNIIgenetics 472T.

Штамм E.coli ВНИИгенетика 472Т, продуцирующий 1-треонин, хранитс в Центральном музее промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер ЦМ11М В-1960.The E.coli strain VNIIgenetika 472T, producing 1-threonine, is stored in the Central Museum of Industrial Microorganisms of the Institute VNIIgenetika and has a registration number CM11M B-1960.

Морфологи . Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами, размером 1,5-2 мм в длину.Morphology. Gram-negative weakly moving thin sticks with rounded ends, 1.5-2 mm in size.

Культурально-физиологические признаки .Cultural and physiological signs.

М со-пепТонный агар. Через 24 ч роста при образует круглые беловаТые , полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колонии гладка , слегка блест ща , кра ровные или немного волнистые, центр колоний приподн т, структура однородна , консистенци пастообразна , легко эмульгируетс .M co-pepton agar. After 24 hours of growth, it forms round white, translucent colonies with a diameter of 1.5-3 mm, the surface of the colony is smooth, slightly glossy, the edges are even or slightly wavy, the center of the colonies is raised, the structure is uniform, paste-like consistency, is easily emulsified.

Агаризованна минимальна среда Адамса с глюкозой. Через 40-48 ч роста при 37°С образует колонии диаметром 0,5-1,5 мм, серовато-белые, слегка выпуклые, с блест щей поверхностью через 4-5 суток колонии приобретают слизистую консистенцию.Agarized minimal Adams medium with glucose. After 40–48 h of growth at 37 ° C, it forms colonies with a diameter of 0.5–1.5 mm; grayish-white, slightly convex, with a shiny surface, after 4–5 days, colonies acquire a mucous consistency.

Рост в м со-пептонном бульоне. После 24 ч роста при сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, запах характерный.Growth in m-peptone broth. After 24 hours of growth with a strong uniform turbidity, a small sediment, the smell is characteristic.

Рост в жидкой минимальной среде Адамса. Через двое суток роста в услови х аэрировани при 37°С сильное равномерное помутнение, запах характерный .Growth in Adams liquid minimal medium. After two days of growth under aeration conditions at 37 ° C, there is a strong uniform turbidity, the smell is characteristic.

Рост по уколу в м со-пептонном агаре хороший по всему укьлу.Prick growth in m-co-peptone agar is good all over.

Желатину не разжижает. 5 На молоке - хороший рост с коагул цией молока. Индол - образует. Рост на углеводах: хорошо растет на глюкозе, сахарозе, лактозе, маннозе , галактозе, ксилозе, фруктозе. глицерине, манните. Устойчивость к антибиотикам устойчив к пенициллину. Штамм не патогенен. Содержание плазмиды. В экспоненциальной стадии роста культуры клетк содержат многокопийную плазмиду (молекул рньй вес 5,8 мегадальтон),обес печивающую устойчивость штамма к пенициллину и несущую гены треонинового оперона. Клетки продуцента ВНИИ-генетика 472т выращивают на агаризованной минимальной среде в присутствии пенициллина , а затем суспензией клеток, смытых со скошенного агара, засевают жидкую питательную посевную среду, содержащую источники углерода, азота необходимые минеральные соли, мел, пеницщтин и питательную добавку в виде гидролизатов белок-содержащих субстратов. Посевной материал выращи вают в колбах на качалке или в ферментерах при непрерывном аэрировании и перемешивании при температуре 3537°С в течение 20-30 ч. Выращенный посевной материал внос т в ферментационную среду, содержа щую источники углерода, азота и необ ходимые минеральные соли. В качестве источников углерода примен ют сахаро зу глюкозу технический сахар, мелас су. Ферментацию продуцента треонина осуществл ют на ферментерах, оснащен ных системой РН-статировани , при непрерывном аэрировании и перемешива нии при температуре . В качестве титрующего агента примен ют аммиачную воду, либо сбаланси рованную (по углероду и азоту) подпитку . Продолжительность культивировани 30-55 ч. К концу ферментации в культуральной жидкости накапливает с до 32 г/л 1-треонина. Выделение L-треонина осуществл ют одним из известных способов. П р и м е р 1. Культуру продуцент E.coli ВНИИгенётика 472Т, выращенную на агаризованной минимальной среде с глюкозой в присутствии пенициллина пересевали на жидкую посевную питательную среду следующего состава, %: Сахароза4 Сульфат аммони 1 Калий фосфорнокислый 0,2 Двузамещенный магний сернокислый0,04 Гидролизат белоксодержащего субстрата 0,5 Пенициллин0,5 г/л Мел1 Выращивание посевного материала проводили в колбах Эрленнейера емкостью 750 мл (объем среды - 100 мл) на качалке (240 об/мин) при температуре 35-37°С. Продолжительность выращивани посевного материала 20 ч. Полученным посевным материалом засевали ферментационную среду (в количестве 5% от объема среды) следующего состава, %: Глюкоза2 Сульфат аммони 1 Калий фосфорнокислый О,2 Двузамещенный магний сернокислый0,04 Ферментацию проводили в ферментере с рабочим объемом 0,5 л, оборудованном системой РН-статировани . Режим ферментации: расход воздуха 0,5 л/мин, перемешивание 900 об/мин РН-{хтатирование на уровне 7,0-7,2 за счет подачи щелочного титрующего агента, подпитки , имеющей состав: Аммиачна вода 25%-на , мл . 25 Глюкоза, г60 Вода водопроводна , мл150 Ферментацию вели при температуре З7с. Через 36 ч культивировани накопление L-треонина в культуральной жидкости составило 20 г/л; расход глюкозы на 1 г треонина 4,5 г. П р и м е р 2. Продуцент L-треонина и услови выращивани посевного материала те же, что и в примере 1, за исключением содержани гидролизата белоксодержащего субстрата, который был использован в количестве 0,2%. Через 28 ч выращивани посевной мате-г риал (в количестве 10% от объема среды ) ввели в ферментационную питательную среду, имеющую состав, %: СахарозаВ Сульфат аммони . 1 Калий фосфорнокислый Двузамещенный магний сернокислый0,04 90 Ферментацию проводили в ферментере с рабочим объемом 0,5 л, оборудованном системой РН-статировани . Услови культивировани продуцента треонина те же, что и в примере 1. Дл поддержани РН на уровне 7,0-7,2 использовали водный раствор аммиака с концент рацией 3%. В ходе ферментации по мере снижени концентрации сахарозы в куль туральной среде в ферментер дробно вводили 402-ный раствор сахарозы. Через 54 ч культивировани в культуральной жидкости накопилось 32 г/л L-треонина, расход сахарозы составил 4 г на 1 г треонина. П р и м е р 3. Продуцент L-треонина и услови выращивани посевного материала те же, что и в примере 1. Выращенный посевной материал вводили в ферментационную питательную среду, имеющую тот же состав, что и в примере 2. Отличие от щжмера 2 состо ло в использовании мелассы в количестве 16% (по техническому весу), вме8 вместо сахарозы. Услови культивировани продуцента L-треонина и методика РН-статировани те же, что и в примере 2. Через 29 ч ферментации в культу -, ральной среде накопилось 16 г/л Lтреонина , расход сахара на 1 г треонина составил 4,8 г. Как видно из примеров, предлагаемый способ получени L-треонина позвол ет использовать в качестве источника углерода доступные технические источники углеводов, при одновременном снижении расхода углеводов в 1,2-1,5 раза по сравнению с известным способом. Кроме того, расход гидролизата белоксодержащих субстратов и пенициллина снижаетс в 10 раз, При этом, благодар снижению содержани посторонних примесей, облегчаетс процесс вьщелени L-треонина из культуральной жидкости.Gelatin does not dilute. 5 Milk - good growth with coagulation of milk. Indole - forms. Growth on carbohydrates: grows well on glucose, sucrose, lactose, mannose, galactose, xylose, fructose. glycerol, mannitol. Antibiotic resistance is resistant to penicillin. Strain is not pathogenic. The content of the plasmid. At the exponential stage of cell culture growth, they contain a multi-copy plasmid (molecules with a weight of 5.8 megadaltons), providing resistance of the strain to penicillin, and carrying the genes of the threonine operon. The producer cells of the All-Russia Scientific Research Institute of Genetics 472t are grown on minimal agar medium in the presence of penicillin, and then a suspension of cells washed from oblique agar is seeded with a liquid nutrient inoculum containing carbon sources, nitrogen, necessary mineral salts, chalk, penitschtine and a nutritional supplement in the form of protein hydrolysates -containing substrates. The seed is grown in flasks on a rocking chair or in fermenters with continuous aeration and stirring at 3537 ° C for 20-30 hours. The grown seed is introduced into a fermentation medium containing sources of carbon, nitrogen and the necessary mineral salts. As carbon sources, sugar, glucose, technical sugar, and molasses are used. Fermentation of the threonine producer is carried out on fermenters equipped with a PH-staging system with continuous aeration and stirring at a temperature. Ammonia water or balanced (carbon and nitrogen) feed is used as a titrating agent. The duration of cultivation is 30-55 hours. By the end of the fermentation in the culture fluid accumulates with up to 32 g / l of 1-threonine. Isolation of L-threonine is carried out by one of the known methods. PRI me R 1. Culture producing E.coli VNIIgenetika 472T grown on minimal agar medium with glucose in the presence of penicillin was transferred to liquid seed culture medium of the following composition,%: Sucrose4 Ammonium sulfate 1 Potassium phosphate 0.2 Dioxide magnesium sulfate 0 04 Protein-containing substrate hydrolyzate 0.5 Penicillin 0.5 g / l Mel1 The inoculum was grown in 750 ml Erlennier flasks (medium volume 100 ml) on a rocking chair (240 rpm) at a temperature of 35-37 ° C. Duration of growing the seed material was 20 hours. The obtained seed was seeded with fermentation medium (5% of the volume of the medium) of the following composition,%: Glucose2 Ammonium sulfate 1 Potassium phosphate O, 2 Disubstituted magnesium sulfate 0.04 Fermentation was carried out in a fermenter with a working volume of 0, 5 liters, equipped with a PH-statisation system. Fermentation mode: air consumption 0.5 l / min, mixing 900 rpm PH- {testing at the level of 7.0-7.2 by supplying an alkaline titrating agent, make-up, having the composition: Ammonia water 25%, ml . 25 Glucose, g60 Water tap, ml 150 Fermentation was carried out at a temperature of 37 ° C. After 36 h of cultivation, the accumulation of L-threonine in the culture fluid was 20 g / l; glucose consumption per 1 g of threonine 4.5 g. EXAMPLE 2 L-threonine producer and seed culture conditions are the same as in Example 1, except for the content of protein-containing substrate hydrolyzate, which was used in the amount of 0 , 2%. After 28 h of growing, the seed material (10% of the volume of the medium) was introduced into the fermentation nutrient medium having the composition,%: Sucrose. Ammonium sulfate. 1 Potassium phosphate Disubstituted magnesium sulphate0.04 90 Fermentation was carried out in a fermenter with a working volume of 0.5 liters, equipped with a PH-statisation system. The cultivation conditions of the threonine producer are the same as in Example 1. To maintain the pH at 7.0-7.2, an aqueous solution of ammonia with a concentration of 3% was used. During fermentation, as the sucrose concentration in the culture medium was reduced, a 402 sucrose solution was fractionally introduced into the fermenter. After 54 hours of cultivation, 32 g / l of L-threonine accumulated in the culture fluid, the sucrose consumption was 4 g per 1 g of threonine. PRI me R 3. The producer of L-threonine and the conditions for growing the seed are the same as in Example 1. The grown seed was introduced into the fermentation culture medium having the same composition as in Example 2. Difference from 2 consisted of using molasses in an amount of 16% (by technical weight), instead of 8 instead of sucrose. The cultivation conditions of the producer of L-threonine and the PH-staging technique are the same as in example 2. After 29 hours of fermentation in the culture medium, 16 g / l of threonine accumulated, the sugar consumption per 1 g of threonine was 4.8 g. As is seen from the examples, the proposed method for producing L-threonine makes it possible to use available technical sources of carbohydrates as a carbon source, while reducing the consumption of carbohydrates by 1.2-1.5 times as compared with the known method. In addition, the consumption of protein-containing substrates hydrolyzate and penicillin is reduced by a factor of 10, and, due to the reduction in the amount of impurities, the process of scission of L-threonine from the culture fluid is facilitated.

Claims

A METHOD FOR PRODUCING L-THREONINE, which provides for the preparation of seed by cultivating Escherchia coll threonine bacteria in a seed culture medium, introducing the seed into a fermentation nutrient medium containing carbon, nitrogen and mineral salts, adding a protein-containing substrate hydrolyzate and subsequent fermentation to a deep conditions, characterized in that, in order to expand the raw material base, as well as reduce the cost of the method, as producers of threonine using Coziness is a strain of Escherchia coli (VNIIgenetika - 472T), while the producers are grown in a liquid seed medium, and the protein-containing substrate hydrolyzate is added directly to the seed nutrient medium.

Q

F