SE467410B - ANALOGS OF CYCLOLINOPEPTIDE AND USE THEREOF - Google Patents
ANALOGS OF CYCLOLINOPEPTIDE AND USE THEREOFInfo
- Publication number
- SE467410B SE467410B SE9003040A SE9003040A SE467410B SE 467410 B SE467410 B SE 467410B SE 9003040 A SE9003040 A SE 9003040A SE 9003040 A SE9003040 A SE 9003040A SE 467410 B SE467410 B SE 467410B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- amino acid
- cys
- mpa
- acid residues
- configuration
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
“A67 410 10 15 20 25 30 35 2 som ett immunosuppressivt medel, och detta har beskrivits i vår tidigare svenska patentansökan nr 8804640-4 inlämnad den 23 december 1988 (motsvarande PCT-ansökan PCT/SE89/00732). “A67 410 10 15 20 25 30 35 2 as an immunosuppressive agent, and this has been described in our previous Swedish patent application no. 8804640-4 filed December 23, 1988 (corresponding to the PCT application PCT / SE89 / 00732).
Immunosuppressiv behandling av en patient som är i behov därav kräver att stora mängder av det immunosuppres- siva medlet används. När cyklolinopeptid A syntetiseras i enlighet med den metod som användes i var tidigare patent- ansökan gär 60-70% av den linjära peptiden förlorad under cykliseringen. Det är uppenbart att storskalig produktion av cyklolinopeptid A är mycket dyr, och industriell pro- duktion av cyklolinopeptid A har därför skjutits upp.Immunosuppressive treatment of a patient who is in need for it requires that large amounts of the immunosuppressant siva agent is used. When cyclolinopeptide A is synthesized in in accordance with the method used in each previous patent the application loses 60-70% of the linear peptide during the cyclization. It is obvious that large-scale production of cyclolinopeptide A is very expensive, and industrial production of cyclolinopeptide A has therefore been postponed.
Vi fann emellertid överraskande att den immuno- suppressiva aktiviteten hos cyklolinopeptid A bibehålls när dess sekvens utökas med en cystinderivatrest. De nya analogerna av cyklolinopeptid A möjliggör storskalig pro- duktion därav, eftersom praktiskt taget ingen linjär pep- tid går förlorad vid cykliseringssteget.However, we found surprisingly that the immuno- the suppressive activity of cyclolinopeptide A is maintained when its sequence is extended with a cystine derivative residue. The new the analogues of cyclolinopeptide A enable large-scale pro- production thereof, since virtually no linear pep- time is lost in the cyclization step.
Beskrivning av uppfinningen I en aspekt av uppfinningen àstadkommes nya analoger av cyklolinopeptid A som har en cyklisk formel som härrör fràn cyklolinopeptid A-sekvensen Val-Pro-Pro-Phe ha Lau-Ile-Ile-Lau*//I vilken sekvens är utökad mellan vilka som helst tvà amino- syrarester med följande cystinderivatrest c-o NH | I x-c-H H-c-Y I I CHZ cnz 10 15 20 25 30 35 467 410 3 i vilken X är vald bland -H och -OH, och Y är vald bland -C=O och -H, "H2 vari aminosyraresterna har L- eller D-konfiguration.Description of the invention In one aspect of the invention, novel analogs are provided of cyclolinopeptide A having a cyclic formula derived from from the cyclolinopeptide A sequence Val-Pro-Pro-Phe have Lau-Ile-Ile-Lau * // I which sequence is extended between any two amino acids acid residues with the following cystine derivative residue c-o NH | IN x-c-H H-c-Y I I CHZ cnz 10 15 20 25 30 35 467 410 3 in which X is selected from -H and -OH, and Y is selected from -C = O and -H, "H2 wherein the amino acid residues have an L or D configuration.
I en föredragen utföringsform av denna aspekt av upp- finningen är den ovan angivna cystinderivatresten belägen mellan aminosyraresterna Leu och Phe i formeln för cyklo- linopeptid A. I själva verket var läget för nämnda cystin- derivatrest i cyklolinopeptid A-sekvensen vald pá máfà.In a preferred embodiment of this aspect of the finding is the cystine derivative residue indicated above between the amino acid residues Leu and Phe in the formula for linopeptide A. In fact, the position of said cystine derivative residue in the cyclolinopeptide A sequence selected on the map.
Sålunda kan man vänta sig att den immunosuppressiva akti- viteten hos cyklolinopeptid A bibehålls oberoende av mellan vilka tvâ aminosyrarester i sekvensen därav cystin- derivatresten införs. ' I en ytterligare aspekt av uppfinningen àstadkommes en analog enligt uppfinningen för användning som ett läke- medel.Thus, the immunosuppressive activity can be expected to the viability of cyclolinopeptide A is maintained independently of between which two amino acid residues in the sequence thereof cystine the derivative residue is introduced. ' In a further aspect of the invention there is provided an analog of the invention for use as a medicament average.
I en annan aspekt av uppfinningen åstadkommas använd- ning av en analog enligt uppfinningen för framställning av ett läkemedel för immunosuppressiv behandling.In another aspect of the invention there is provided the use of an analogue according to the invention for the production of a drug for immunosuppressive therapy.
I ytterligare en annan aspekt av uppfinningen åstad- kommes ett sätt att behandla ett däggdjur, inbegripet människan, som är i behov av immunosuppressiv behandling, vilket omfattar administrering åt nämnda däggdjur av en farmakologiskt effektiv mängd av en analog enligt upp- finningen.In yet another aspect of the invention, come a way to treat a mammal, including human beings in need of immunosuppressive therapy, which comprises administering to said mammal a pharmacologically effective amount of an analogue according to the finding.
I ännu en annan aspekt av uppfinningen àstadkommes ett farmaceutiskt preparat som omfattar en analog enligt uppfinningen tillsammans med en eller flera farmaceutiskt acceptabla bärare, konstituenter och/eller spädmedel.In yet another aspect of the invention, it is provided a pharmaceutical composition comprising an analog according to the invention together with one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients and / or diluents.
Den mängd av en analog enligt uppfinningen som skall administreras àt ett däggdjur som är i behov av immuno- suppressiv behandling måste avgöras av en läkare som har erfarenhet av immunosuppressiv terapi. .ré- O\ -q 10 15 20 25 30 35 ...._\ 4 Den farmaceutiska beredningen som omfattar en analog enligt uppfinningen kan formuleras till orala preparat eller preparat för infusion med användning av en eller flera farmaceutiskt acceptabla bärare, konstituenter och/eller spädmedel som är lämpliga för sådana preparat, varvid man bör komma ihág att nämnda analog är olöslig i vatten. Det farmaceutiska preparatet kan t ex omfatta en analog enligt uppfinningen i en farmakologiskt effektiv mängd suspenderad i en olivolja.The amount of an analog according to the invention to be administered to a mammal in need of immunosuppression Suppressive treatment must be decided by a physician who has experience in immunosuppressive therapy. .ré- O\ -q 10 15 20 25 30 35 ...._ \ 4 The pharmaceutical preparation comprising an analogue according to the invention can be formulated into oral preparations or preparations for infusion using one or more several pharmaceutically acceptable carriers, excipients and / or diluents suitable for such preparations, wherein it should be remembered that said analog is insoluble in water. The pharmaceutical preparation may, for example, comprise a analog of the invention in a pharmacologically effective amount suspended in an olive oil.
Föreliggande uppfinning avslöjar att analogerna en- ligt uppfinningen har immunosuppressiv aktivitet, vilken är jämförbar med den hos Ciclosporin (även kallad Cyclo- sporin A) och Cyklolinopeptid A. Följaktligen skall analo- gerna enligt uppfinningen användas i läkemedel för immuno- suppressiv behandling av däggdjur, inbegripet människan, för alla de indikationer där immunosuppressiv behandling är motiverad. Exempel på när immunosuppressiv behandling är motiverad är för förebyggande av allograft-avstötning efter organtransplantation och benmärgstransplantation, profylaktisk eller terapeutisk behandling av graft-versus- host-disease (GVHD), och autoimmuna sjukdomar, såsom systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid artrit (RA) och diabetes mellitus.The present invention discloses that the analogs according to the invention has immunosuppressive activity, which is comparable to that of Ciclosporin (also called Cyclo- sporin A) and Cyclolinopeptide A. Consequently, the analog the compounds of the invention are used in medicinal products for immunological suppressive treatment of mammals, including humans, for all the indications where immunosuppressive therapy is justified. Examples of when immunosuppressive therapy is justified is for the prevention of allograft rejection after organ transplantation and bone marrow transplantation, prophylactic or therapeutic treatment of graft-versus- host disease (GVHD), and autoimmune diseases, such as systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA) and diabetes mellitus.
Kort beskrivningkav ritningarna Fig 1 visar ett diagram avseende inhibering av PPIas aktivitet genom Cyklosporin A.Brief description of the drawings Fig. 1 shows a diagram regarding inhibition of PPIases activity by Cyclosporin A.
Fig 2 visar ett diagram avseende inhibering av PPIas aktivitet genom CLA, LA och 1-Mpa-LA-Cys-NH L___| Syntes av CLA-analgger enligt uppfinningen 20 CLA-analogerna enligt uppfinningen kan framställas genom vilken som helst känd metod på peptidkemiomràdet, varigenom en linjär peptid bildas, vilken sedan underkas- tas ett oxidationssteg för att cyklisera tvà cysteinbe- släktade rester, varigenom en svavelbrygga bildas mellan nämnda rester, sålunda bildande en cystinderivatrest. ä!! 10 15 20 25 30 35 467 410 5 De linjära linopeptid(LA)-analogerna enligt uppfin- ningen kan sålunda syntetiseras på konventionellt sätt, t ex genom stegvis koppling av en aminosyrarest till nästa i vätskefas, t ex i enlighet med metoden enligt Law, H.B. & Du Vigneaud, V.:J. Am. Chem. Soc. §g (1960) 4579-4581; Zhuze, A.L., Jost, K. Kasafirek, E. & Rudinger, J.: Coll. Czechslovak Chem Commun. 22 (1964) 2648-2662, modifierad av Larsson L.-E., Lindeberg, G., Melin, P. & Pliska, V.: J. Med. Chem. gl (1978) 352-356. Kopplingen av aminosyrarester till varandra, varigenom s k peptidbind- ningar bildas, kan också utföras utgående från en fast fas (vanligen ett harts) till vilken den första aminosyrans C-terminal kopplas, varpå nästa aminosyras C-terminal kopplas till den första aminosyrans N-terminal, etc, och slutligen frisätts den uppbyggda peptiden från den fasta fasen. I de nedan angivna exemplen har den s k fastfas- tekniken utnyttjats i enlighet med metoden enligt Merri- field, R.B.: J. Am. Chem. Soc. §§ 1963) 2149; Merrifield, R.B.: Biochem. § (1964) 1385 och König, W, & Geiger, R.: Chem. Ber. lQ§ (1970) 788.Fig. 2 shows a diagram regarding inhibition of PPIases activity by CLA, LA and 1-MPa-LA-Cys-NH L ___ | Synthesis of CLA analogs of the invention 20 The CLA analogs of the invention can be prepared by any known method in the field of peptide chemistry, thereby forming a linear peptide, which is then subjected to an oxidation step is taken to cyclize two cysteine related residues, whereby a sulfur bridge is formed between said residues, thus forming a cystine derivative residue. ä !! 10 15 20 25 30 35 467 410 5 The linear linopeptide (LA) analogs of the invention the compound can thus be synthesized in a conventional manner, for example by gradually coupling one amino acid residue to the next in liquid phase, eg in accordance with the method according to Law, H.B. & Du Vigneaud, V.:J. Am. Chem. Soc. §G (1960) 4579-4581; Zhuze, A.L., Jost, K. Kasafirek, E. & Rudinger, J .: Coll. Czechslovak Chem Commun. 22 (1964) 2648-2662, modified by Larsson L.-E., Lindeberg, G., Melin, P. & Pliska, V .: J. Med. Chem. gl (1978) 352-356. The connection of amino acid residues to each other, whereby so-called peptide binding can also be carried out on the basis of a solid phase (usually a resin) to which the first amino acid C-terminal is connected, whereupon the next amino acid C-terminal connected to the N-terminus of the first amino acid, etc., and finally, the constructed peptide is released from the solid phase. In the examples given below, the so-called solid-phase technology has been used in accordance with the method field, R.B .: J. Am. Chem. Soc. §§ 1963) 2149; Merrifield, R.B .: Biochem. § (1964) 1385 and König, W, & Geiger, R .: Chem. Ber. lQ§ (1970) 788.
Generell syntesbeskrivning Alla peptiderna i de nedan angivna exemplen synteti- serades på en Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer med användning av ett dubbelkopplingsprogram med termine- ringssteg efter den andra kopplingen. Det harts som använ- des var av 4-metyl-benshydrylamintyp med en teoretisk be- lastning av 0,66 meq/g (Peptides International, Louis- ville, KY, USA). Syntesslutprodukten torkades i vakuum över natten. Sedan spjälkades peptiden från hartset genom behandling med flytande vätefluorid i närvaro av anisol och etyl-metyl-sulfid som scavangers (katjonfångare) (HF:anisol:EMS-10:05:05). Efter avlägsnande av vätefluo- riden genom avdunstning suspenderades återstoden i etyl- acetat (100 ml) och filtrerades. Fastämnet tvättades på filter med ytterligare etylacetat (3 x 100 ml) och den spjälkade peptiden extraherades med ättiksyra (100 ml).General synthesis description All the peptides in the examples given below are synthetic was applied to an Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer using a dual-connection program with terminals step after the second connection. The resin used was of the 4-methyl-benzhydrylamine type with a theoretical loading of 0.66 meq / g (Peptides International, Louis- ville, KY, USA). The final synthesis product was dried in vacuo overnight. Then the peptide was cleaved from the resin treatment with liquid hydrogen fluoride in the presence of anisole and ethyl methyl sulfide as scavangers (HF: anisole: EMS-10: 05: 05). After removal of hydrogen fluoride by evaporation, the residue was suspended in ethyl acetate. acetate (100 ml) and filtered. The solid was washed on filter with additional ethyl acetate (3 x 100 ml) and the the digested peptide was extracted with acetic acid (100 ml).
Extraktet spåddes genast till en volym av 2 cma med 20% ¶Å4e7 410 10 15 20 25 30 35 6 ättiksyra i metanol och behandlades med 0,1 M lösning av jod i metanol tills en svagt brun färg kvarstod. Sedan tillsattes Dowex 1 x 8 jonbytare i acetatform (3 g) (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) och blandningen filtrerades.The extract was immediately predicted to a volume of 2 cma by 20% ¶Å4e7 410 10 15 20 25 30 35 6 acetic acid in methanol and treated with 0.1 M solution of iodine in methanol until a pale brown color remained. Then Dowex 1 x 8 ion exchangers in acetate form (3 g) were added (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) and the mixture was filtered.
Filtratet indunstades och återstoden frystorkades ur 1% ättiksyra i vatten. Produkten renades sedan genom "reversed phase" vätskekromatografi på en kolonn som var fylld med Vydac 20-25 p (Separation Group, CA, USA) i ett lämpligt system innehållande acetonitril i O,1% trifluoro- ättiksyra-vattenlösning. Proverna som uppsamlades från kolonnen analyserades genom analytisk HPLC (Varian 5500, Sunnyvale, CA, USA) som var utrustad med en Bondapak C18 kolonn (Millipore, Milford, Mass., USA). Fraktioner som innehöll ren substans sammanfördes, lösningsmedlet av- dunstades och produkten frystorkades ur 1% ättiksyra i vatten. Den slutliga HPLC-analysen utfördes pà färdig pro- dukt och strukturen för peptiden ifråga bekräftades genom aminosyraanalys samt FAB-MS (Fast atom bombardment spect- rometry). FAB-MS-analyserna utfördes av M-Scan Ltd.The filtrate was evaporated and the residue was lyophilized from 1%. acetic acid in water. The product was then purified through "reversed phase" liquid chromatography on a column which was filled with Vydac 20-25 p (Separation Group, CA, USA) in one suitable system containing acetonitrile in 0.1% trifluoro- acetic acid-aqueous solution. The samples collected from the column was analyzed by analytical HPLC (Variant 5500, Sunnyvale, CA, USA) equipped with a Bondapak C18 column (Millipore, Milford, Mass., USA). Fractions such as pure substance was combined, the solvent was removed was evaporated and the product was lyophilized from 1% acetic acid in water. The final HPLC analysis was performed on finished product and the structure of the peptide in question was confirmed by amino acid analysis and FAB-MS (Fast atom bombardment spectra- rometry). The FAB-MS analyzes were performed by M-Scan Ltd.
Sunninghill, Ascot, Berkshire, England.Sunninghill, Ascot, Berkshire, England.
Alla aminosyror som användes under syntesen skyddades med tert-butoxikarbonylgrupp vid a-aminofunktionen. Tiol- funktionen hos Mpa, Hmp och Cys skyddades med 4-metoxiben- sylgrupp. Aminosyraderivaten levererades av Bachem AG, Schweiz.All amino acids used during the synthesis were protected with tert-butoxycarbonyl group at the α-amino function. Thiol the function of MPa, Hmp and Cys was protected with 4-methoxybenzene sylgrupp. The amino acid derivatives were supplied by Bachem AG, Switzerland.
I de nedanstående exemplen används förkortningen LA för den linjära peptiden Leu-Ile-Ile-Leu-Val-Pro-Pro- -Phe-Phe.In the examples below, the abbreviation LA is used for the linear peptide Leu-Ile-Ile-Leu-Val-Pro-Pro- -Phe-Phe.
EXEMPEL 1 1-Mpa-LA-Cys-NH L___| Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna syntesbeskrivningen. 3-merkaptopropionsyra [S-(p-me- 2 toxi-)bensyl] användes för position 1. 10 15 20 25 30 35 4657 4'1Û Renhet (HPLC):99,8% Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och genom FAB-Ms. [M+u]*- 1246.EXAMPLE 1 1-Mpa-LA-Cys-NH L ___ | The peptide was prepared according to the general the synthesis description. 3-mercaptopropionic acid [S- (p-me- 2 toxi-) benzyl] was used for position 1. 10 15 20 25 30 35 4657 4'1Û Purity (HPLC): 99.8% The structure was confirmed by amino acid analysis and by FAB-Ms. [M + u] * - 1246.
EXEMPEL II 1-Mpa-LA-D-Cys-NH l_____| Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna syntesbeskrivningen. 3-merkaptopropionsyra[S-(p-me- toxi-)bensyl] användes för position 1 och Boc-D-cys- 2 tein[-(p-metoxi-)-bensyl] för position 2.EXAMPLE II 1-Mpa-LA-D-Cys-NH l _____ | The peptide was prepared according to the general the synthesis description. 3-mercaptopropionic acid [S- (p-me- toxic) benzyl] was used for position 1 and Boc-D 2 tein [- (p-methoxy-) -benzyl] for position 2.
Renhet (HPLC):95,7% Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och genom FAB-MS. [M+H]+- 1246.Purity (HPLC): 95.7% The structure was confirmed by amino acid analysis and by FAB-MS. [M + H] + - 1246.
EXEPEL III 1-Hmp-LA-Cys-NH2 Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna syntesbeskrivningen. 2-hydroxi-3-merkaptopropionsyra an- vändes för position 1.EXAMPLE III 1-Hmp-LA-Cys-NH2 The peptide was prepared according to the general the synthesis description. 2-hydroxy-3-mercaptopropionic acid turned for position 1.
Renhet (HPLC):97,5% Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och genom FAB-MS. [M+H]+- 1262.Purity (HPLC): 97.5% The structure was confirmed by amino acid analysis and by FAB-MS. [M + H] + - 1262.
EXEMPEL IV 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH l__| Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna syntesbeskrivningen med användning av aminosyror med 2 D-konfiguration. '4-67 410 8 3-merkaptopropionsyra[S-(p-metoxi-)bensyl] användes för position 1.EXAMPLE IV 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH l__ | The peptide was prepared according to the general the synthesis description using amino acids with 2 D-configuration. 4-67 410 8 3-Mercaptopropionic acid [S- (p-methoxy-) benzyl] was used for position 1.
Renhet (HPLC):98,0% Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och 5 genom FAB-MS: [M+H]+= 1246.Purity (HPLC): 98.0% The structure was confirmed by amino acid analysis and By FAB-MS: [M + H] + = 1246.
Lista pà föreningar som använts som enzyminhibitorer och som immunosuppressiva medel CS-A = Cyklosporin A (Referens) 10 CLA = Cyklolinopeptid A (Referens) 1fMpa-LA-Cys-NH2 Lau-Val-Pro-Pro-Phe = /Pfi-xe 15 . Ile~Ile-Leu-Mpa Cys-NH2 (Förening enligt exempel 1) 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 Leu-Val-Pro-Pro-Phe \ = Phe 20 Ile-Ile-Lau-Mpa D-Cys-NH2 (Förening enligt exempel 2) 25 1-Hmp-LA-Cys-NH2 Lau-Val-Pro-Pro-Phe Phe ll Ile-Ile-Leu-Hmp Cys-NH2 30 (Förening enligt exempel 3) 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 D-Leu-D-Val-D-Pro-D-Pro-D-PQÉ = D-Phe 35 D-Ile-D-Ile-D-Leu-Mpa D-Cys-NH (Förening enligt exempel 4) 10 15 20 25 30 35 467 410 9 där Mpa är 3-merkapropropionylrest (-S-CH2-CH2-CO-) och Hmp är 2-hydroxi-3-merkaptopropionylrest OH (-S-CH2-CH-CO-) Inhibering av enzymet PPIas Det är känt att peptidyl-prolyl-cis-trans-isomeras (PPIas) katalyserar cis-trans-isomeriseringen av prolin- imid-peptid-bindningar i oligopeptider och Nobuhiro Takahashi, et al (Nature vol. 337, Letters to Nature, pp 473-475, 1989) föreslog att PPIasets peptidyl-prolyl- cis-trans-isomeriserande aktivitet kan vara involverad i i T-cellakti- Gunter företeelser, såsom de som förekommer tidigt vering, vilka undertrycks av cyklosporin A.List of compounds used as enzyme inhibitors and as immunosuppressive agents CS-A = Cyclosporin A (Reference) CLA = Cyclolinopeptide A (Reference) 1fMpa-LA-Cys-NH2 Lau-Val-Pro-Pro-Phe = / P fi- xe 15. Ile ~ Ile-Leu-Mpa Cys-NH2 (Compound of Example 1) 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 Leu-Val-Pro-Pro-Phe \ = Phe 20 Ile-Ile-Lau-Mpa D-Cys-NH2 (Compound of Example 2) 25 1-Hmp-LA-Cys-NH2 Lau-Val-Pro-Pro-Phe Phe ll Ile-Ile-Leu-Hmp Cys-NH2 (Compound of Example 3) 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 D-Leu-D-Val-D-Pro-D-Pro-D-PQÉ = D-Phe D-Ile-D-Ile-D-Leu-Mpa D-Cys-NH (Compound of Example 4) 10 15 20 25 30 35 467 410 9 where MPa is 3-mercropropropionyl residue (-S-CH 2 -CH 2 -CO-) and Hmp is 2-hydroxy-3-mercaptopropionyl residue OH (-S-CH2-CH-CO-) Inhibition of the enzyme PPIase It is known that peptidyl-prolyl-cis-trans isomerase (PPIas) catalyzes the cis-trans isomerization of proline imide-peptide bonds in oligopeptides and Nobuhiro Takahashi, et al (Nature vol. 337, Letters to Nature, pp. 473-475, 1989) suggested that the peptidyl-prolyl cis-trans isomerizing activity may be involved in and T cell Gunter phenomena, such as those that occur early which are suppressed by cyclosporin A.
Fischer, et al (Nature vol. 337, Letters to pp 476-478, 1989) rapporterade att PPIas antagligen är identiskt med cyklofilin, ett nyligen upptäckt däggdjurs- protein som starkt binder till cyklosporin A. Vi har renat Nature, PPIas och testat analoger enligt uppfinningen som PPIas- inhibitorer.Fischer, et al (Nature vol. 337, Letters to pp 476-478, 1989) reported that PPIas probably are identical to cyclophilin, a recently discovered mammalian protein that strongly binds to cyclosporin A. We have purified Nature, PPIases and tested analogs of the invention as PPIases inhibitors.
Rening av PPIas Cortex frán grisnjure homogeniserades i lika volym sackaros (0,2 M) och centrifugerades 60 min vid 10 000 x g. Supernatanten justerades till PH 5,5 genom tillsättning av l M acetatbuffert, pH 4,0. Fällningen kasserades och supernatanten brinades till pH 7,0.Purification of PPIs Cortex from porcine kidneys was homogenized in equal volume sucrose (0.2 M) and centrifuged for 60 min at 10,000 x g. The supernatant was adjusted to pH 5.5 genome addition of 1 M acetate buffer, pH 4.0. The precipitate was discarded and the supernatant was brined to pH 7.0.
Extraktet bringades till 40% mättnad av ammoniumsul- fat. Till supernatanten som erhölls efter 15 min centrifu- gering vid 20 000 x g sattes fast natriumsulfat för erhål- lande av en slutlig mättnad av 60%. Fällningen som erhölls genom centrifugering löstes i en liten volym 10 mM tris- buffert, pH 7,6 och dialyserades 24 h mot samma buffert.The extract was brought to 40% saturation of ammonium sulfate. barrel. To the supernatant obtained after 15 minutes of centrifugation at 20,000 x g, solid sodium sulfate was added to obtain of a final saturation of 60%. The precipitate obtained by centrifugation was dissolved in a small volume of 10 mM buffer, pH 7.6 and dialyzed against the same buffer for 24 hours.
Den dialyserade lösningen sattes pà en DEAE-Sephadex A-50 kolonn, vilken i förväg hade jämviktsinställts med samma buffert, och eluerades utan att bufferten ändrades. Elua- tet som var rikt pà PPIas-aktivitet passerade genom kolonnen i en aktiv topp. -467 410 10 15 20 25 30 35 10 De aktiva fraktionerna sattes på en CM-Sephadex C-50 kolonn och eluerades med en linjär gradient av KCl (0-1,2 M) som en aktiv topp.The dialyzed solution was applied to a DEAE-Sephadex A-50 column, which had previously been equilibrated with the same buffer, and eluted without changing the buffer. Elua- The richness of PPIs activity passed through column in an active peak. -467 410 10 15 20 25 30 35 10 The active fractions were loaded onto a CM-Sephadex C-50 column and eluted with a linear gradient of KCl (0-1.2 M) as an active peak.
Enzymet lagrades som suspension 1 60% mättat ammo- niumsulfat. Efter 5 månader uppvisade enzymet full ezyma- tisk aktivitet.The enzyme was stored as a suspension in 60% saturated ammonia. nium sulfate. After 5 months, the enzyme showed full enzyme technical activity.
Bestämning av PPIas-aktivitet Cis-transisomerisering av Ala-Pro-peptidbindningen hos peptiden N-succinyl-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid mättes i en kopplad analys med kymotrypsin. Substrat (50 pM), i förväg upplöst i DMSO, jämviktsinställdes vid l0°C med den lämpliga mängden PPIas i termostaterad elektrofotometer- cell. Reaktionen påbörjades vid tillsättning av kymotryp- sin (slutlig koncentration 21 pM). Trans-peptiden spjälka- des inom dödtiden. Cis-transisomeriseringshastigheten följdes genom minskningen av transmittans vid 390 nm.Determination of PPIase activity Cis-transisomerization of the Ala-Pro peptide bond of the peptide N-succinyl-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide was measured in a coupled assay with chymotrypsin. Substrate (50 pM), i pre-dissolved in DMSO, equilibrated at 10 ° C with it appropriate amount of PPIs in thermostated electrophotometer cell. The reaction was started by the addition of chymotryps. sin (final concentration 21 pM). The trans-peptide cleaves within the time of death. The rate of cis transisomerization was followed by the decrease in transmittance at 390 nm.
Spektrofotometern Specord UV-Vis (Jena, GDR) som var ut- rustad med en cellomrörare användes.The Specord UV-Vis spectrophotometer (Jena, GDR) which was equipped with a cell stirrer was used.
Inhibitorernas effekt på PPIas undersöktes genom blandning av den studerade substansen med PPIas under 1 min före inkubering av substratet. Substanserna som testades löstes i dioxan som innehöll 0,5-1% Triton X-100 eller i DMSO. Ingen skillnad observerades ifråga om effekt pà PPIas-aktivitet beroende pá typen av lösningsmedel.The effect of the inhibitors on PPIs was investigated by mixing of the studied substance with PPIs below 1 min before incubation of the substrate. The substances that tested was dissolved in dioxane containing 0.5-1% Triton X-100 or in DMSO. No difference was observed in terms of effect on PPIase activity depending on the type of solvent.
Resultaten ges i fig 1 och fig 2, där log av skill- naden mellan transmittans vid stationärt tillstànd Ax och transmittans vid en given tidpunkt At plottades mot tiden.The results are given in Fig. 1 and Fig. 2, where the log of the station between transmittance at steady state Ax and transmittance at a given time Att was plotted against time.
Hastighetskonstanten av första ordningen k (s_1) beräk- nades fràn de resulterande räta linjerna.The first order rate constant k (s_1) is calculated from the resulting straight lines.
Immunosuppressiv aktivitet hos CLA, CS-A och analogerna enligt uppfinningen Material och metoder Djur: CBA/Iiw möss 8-10 veckor gamla Antigen: SRBC (röda blodkroppar fràn får) 1-Mpa-LA-Cys-NH2, 1-Mpa-D-La-D-Cys-NH |__||___| Reagens: 2, 10 15 20 25 30 35 467 410 11 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2, och CLA framställdes av l___| FERRING AB, Sverige, och cyklosporin A (CS-A), Sandimmun Sandoz, Basel, Schweiz Lösningsmedel: Blandning av Cremophor El (SIGMA) och 94% etanol (6,5 : 3,5), etanol 96%, olivolja, intralipid och PBS (fosfatbuffertlösning) Behandling av möss med reagens intraperitonealt (ip) eller intravenöst (iv): Reagensen lösta i ett av lösningsmedlen späddes till den önskade koncentrationen i PBS eller i intralipid, och 0,2 ml därav infördes ip i tvâ doser. Den första 3 h före antigenet, den andra 24 h senare. Aktiviteten hos de stu- derade analogerna jämfördes med aktiviteten hos CLA och CS-A.Immunosuppressive activity of CLA, CS-A and the analogues according to the invention Materials and methods Animals: CBA / Iiw mice 8-10 weeks old Antigen: SRBC (red blood cells from sheep) 1-Mpa-LA-Cys-NH2, 1-Mpa-D-La-D-Cys-NH | __ || ___ | Reagents: 2, 10 15 20 25 30 35 467 410 11 1-MPa-LA-D-Cys-NH 2, and CLA was prepared from l ___ | FERRING AB, Sweden, and cyclosporin A (CS-A), Sandimmun Sandoz, Basel, Switzerland Solvent: Mixture of Cremophor El (SIGMA) and 94% ethanol (6.5: 3.5), ethanol 96%, olive oil, intralipid and PBS (phosphate buffer solution) Treatment of mice with reagents intraperitoneally (ip) or intravenous (iv): The reagents dissolved in one of the solvents were diluted the desired concentration in PBS or in intralipid, and 0.2 ml of it was introduced into two doses. The first 3 hours before the antigen, the other 24 hours later. The activity of the students analogues were compared with the activity of CLA and CS-A.
Behandling av möss med reagens per os (po), direkt i EEHÉE* Reagensen lösta i ett av lösningsmedlen, spädda till den önskade koncentrationen i olivolja, PBS eller i intra- lipid, infördes i volymen 0,2 ml i djuret. Första dosen 3 h före antigenet, andra dosen 24 h eller 48 h senare.Treatment of mice with reagents per os (po), directly in EEHÉE * The reagents are dissolved in one of the solvents, diluted the desired concentration in olive oil, PBS or in intra- lipid, was introduced in the volume of 0.2 ml into the animal. First dose 3 hours before the antigen, the second dose 24 hours or 48 hours later.
De studerade derivatens aktivitet jämfördes med akti- viteten hos CLA och CS-A.The activity of the derivatives studied was compared with the levels of CLA and CS-A.
Effekt av CLA-analoger pá humoral immun respons 1 möss som immuniserats med SRBC Möss injicerades intraperitonealt med 0,2 ml av en 10% suspension av SRBC i PBS, 3 h före antigenet infördes den första dosen av reagenset ip, po eller iv. Efter 4 da- gar bestämdes antalet plackbildande celler (PFC) i mjälten i enlighet med Mishell-Dutton (Mishell R.I., Dutton R.W.: J. Exp. Med., 1967, 126, 423). Den humorala immunrespon- sens magnitud uttrycktes som antalet PFC per 106 spleno- cyter. De erhållna resultaten ges i tabellerna A, B och C.Effect of CLA analogues on humoral immune response in mice as immunized with SRBC Mice were injected intraperitoneally with 0.2 ml of one 10% suspension of SRBC in PBS, 3 hours before the antigen was introduced the first dose of reagent ip, po or iv. After 4 days The number of plaque-forming cells (PFCs) in the spleen was determined in accordance with Mishell-Dutton (Mishell R.I., Dutton R.W .: J. Exp. Med., 1967, 126, 423). The humoral immune response magnitude was expressed as the number of PFCs per 106 spleno- cyter. The results obtained are given in Tables A, B and C.
Effekt av CLA-analoger pà humoral immunrespons till SRBC in vitro Grundning av möss och isolering av mjältceller: Möss 7467 410 10 15 20 25 30 35 12 grundades intravenöst med 0,2 ml av en 1% suspension av SRBC i PBS. Fyra dagar senare dödades djuren och deras mjältar finhackades, pressades genom en plastsikt in i 0-83% NH4Cl som var buffrad med 0,017 M trisbuffert för avlägsnande av erytrocyter. Sedan tvättades cellerna tre ggr med PBS och àtersuspenderades slutligen i RPMI-medium som var utökat med 10% fetalt kalvserum.Effect of CLA analogues on humoral immune response to SRBC in vitro Priming of mice and isolation of spleen cells: Mice 7467 410 10 15 20 25 30 35 12 was administered intravenously with 0.2 ml of a 1% suspension of SRBC and PBS. Four days later, the animals and theirs were killed spleens were finely chopped, pressed through a plastic sieve into 0-83% NH 4 Cl buffered with 0.017 M Tris buffer for removal of erythrocytes. Then the three cells were washed times with PBS and finally resuspended in RPMI medium which was augmented with 10% fetal calf serum.
Odlingsbetingelser och bestämning av PFC-antal: Till 1 ml mjältcellsuspension (5 x 106 celler/ml) sattes 0,1 ml av reagenset, följt av tillsättning av 0,1 ml av en 0,005% suspension av SRBC i cellodlingsmediet, och inkube- rades under 4 dagar vid 37°C, 5% C02 och 100% fuktighet.Cultivation conditions and determination of PFC number: To 1 ml of spleen cell suspension (5 x 10 6 cells / ml) was added 0.1 ml of the reagent, followed by the addition of 0.1 ml of a 0.005% suspension of SRBC in the cell culture medium, and incubated for 4 days at 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity.
Antalet PFC mättes med användning av förfarandet enligt Mishell-Dutton. Som en kontroll användes PBS eller lämplig koncentration av lösningsmedlet. Experimenten utfördes med användning av NUNC 24-well Tissue Culture Plate. Resulta- ten visas i tabellerna D och E.The number of PFCs was measured using the procedure according to Mishell-Dutton. As a control, PBS or appropriate was used concentration of the solvent. The experiments were performed with use of NUNC 24-well Tissue Culture Plate. Result- are shown in Tables D and E.
Effekt av CLA-analgger pá hypersensitivitet av fördröjd typ (DTH) Resultaten och beskrivning av testet ges i tabell F.Effect of CLA analogs on delayed-onset hypersensitivity type (DTH) The results and description of the test are given in Table F.
Immunosuppressiv aktivitet hos CLA-analoger i Graft- versus-host-reakton (GvH) Djur: Hybrid Fl (C33/Iiw x B6/Iiw) och B6-honmöss, 8-10 veckor gamla.Immunosuppressive activity of CLA analogues in Graft versus-host reaction (GvH) Animals: Hybrid F1 (C33 / Iiw x B6 / Iiw) and female B6 mice, 8-10 weeks old.
Preparering av parenterala celler: B6-honmöss dödades, deras nodus popliteus pressades genom en plastsikt i PBS. Sedan tvättades cellerna tre ggr med PBS och àtersuspenderades i RPMI medium.Preparation of parenteral cells: B6 female mice were killed, their nodus popliteus pressed through a plastic sieve in PBS. Then the cells were washed three times with PBS and resuspended in RPMI medium.
GvH-test: GVH-reaktion utfördes i enlighet med Twist and Barnes (Twist V.S., Barnes R.D.: Transplantation, 1973, 15, 1982). Hybridmöss, Fl (C3H x B6) injicerades subkutant i vänstra baktrampdynan med 5 x 106 parenterala lymfoid- celler (B). Éfter 7 dagar isolerades och vägdes dränerande lymfknutor. Som en kontroll mättes vikten hos nodus popli- teus som isolerats från det högra benet. 10 15 20 25 30 35 467 410 13 GVH-reaktionens intensitet uttrycktes som ett förhål- lande mellan vikten hos popliteuslymfknutor isolerade fràn vänster och höger ben (GvH-reaktionsindex). Resultaten ges i tabell G.GvH test: GVH reaction was performed according to Twist and Barnes (Twist V.S., Barnes R.D .: Transplantation, 1973, 15, 1982). Hybrid mice, F1 (C3H x B6) were injected subcutaneously in left hind foot pad with 5 x 106 parenteral lymphoid cells (B). After 7 days, draining was isolated and weighed lymph nodes. As a control, the weight of the nodus population was measured. teus isolated from the right leg. 10 15 20 25 30 35 467 410 13 The intensity of the GVH reaction was expressed as a ratio between the weight of poplite lymph nodes isolated from left and right legs (GvH reaction index). Results are given in Table G.
Tabell A Antalet PFC i mjåltcell hos möss som behandlats intraperi- tonealt med tvà doser (-3 h och + 24 h efter SRBC) av 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2, 1-Mpa-LA-Cys-NH2 och CLA löst i Intralipidß (int.) (Fettemulsion för intravenös nutrition från Kabi, Stockholm, Sverige) Reagens P pm/mus PFC/106 1 SE Studenttest Kontroll int. 3047 358 - 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 1,0 1139 162 0,01 I I 10,0 586 77 0,001 1-Mpa-LA-Cys-NH2 1,0 860 64 0,001 I I 10,0 798 32 0,001 CLA 1,0 1649 339 0,05 10,0 864 74 0,001 Preparering och introduktion av substansen, se för- klaring efter tabell C.Table A The number of PFCs in the spleen cell of mice treated intraperitoneally tonally with two doses (-3 h and + 24 h after SRBC) of 1-MPa-LA-D-Cys-NH 2, 1-MPa-LA-Cys-NH 2 and CLA dissolved in Intralipidß (int.) (Fat emulsion for intravenous nutrition from Kabi, Stockholm, Sweden) Reagent P pm / mouse PFC / 106 1 SE Student Test Control int. 3047 358 - 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 1.0 1139 162 0.01 I I 10.0 586 77 0.001 1-Mpa-LA-Cys-NH2 1.0 860 64 0.001 I I 10.0 798 32 0.001 CLA 1.0 1649 339 0.05 10.0 864 74 0.001 Preparation and introduction of the substance, see clearance according to Table C.
Resultaten är uttryckta som ett medeltal 1 SE (stan- dardfel) av 6 möss. 10 15 20 25 30 35 '3467 4.10 14 Tabell B Antalet PFC 1 mjälte hos möss som behandlats med tvá doser (-3 h och 24 h efter SRBC) av CLA, CS-A och analoger en- ligt uppfinningen lösta i olivolja, infört per os (po).The results are expressed as an average of 1 SE (standard dard error) of 6 mice. 10 15 20 25 30 35 '3467 4.10 14 Table B The number of PFC 1 spleens in mice treated with two doses (-3 h and 24 h after SRBC) of CLA, CS-A and analogues according to the invention dissolved in olive oil, introduced per os (po).
Reagens P pm/mus PFC/106 1 SE Studenttest Kontroll olivolja 2183 166 - CLA 10 1016 125 0,05 100 314 73 0,001 CS-A 10 1092 209 0,01 100 753 51 0,001 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 10 802 112 0,01 I I 100 680 86 0,001 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 10 764 60 0,01 I I 100 477 45 0,001 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 687 136 0,01 I I 100 501 109 0,001 Resultaten är uttryckta som ett medeltal 1 SE av 6 möss. f), 10 15 20 25 30 35 467 410 15 Tabell C Antalet PFC i mjälte hos möss som behandlats intravenöst (iv) med tvà doser av 1-Mpa-LA-Cys-NH CLA och CS-A L___| 2! lösta i intralipid (int) Reagens P pm/mus PFC/106 1 SE Studenttest Kontroll PBS 1985 82 - Kontroll int 2326 67 NS 1-Mpa-LA-Cys-NH2 0,01 1649 126 0,05 I I 0,1 1364 43 0,01 1,0 903 39 0,001 CLA 0,01 1943 77 NS 0,1 1475 97 0,02 1,0 1203 85 0,01 CS-A 0,01 1842 122 NS 0,1 1633 181 0,05 1,0 1158 50 0,01 Preparaten i en volym av 0,2 ml infördes tvà ggr, första dosen 3 h före sensibilisering med antigen, den andra 24 h senare. Preparering av CLA och 1-Mpa-LA-Cys-NH2: L___| 2 mg av substansen löstes i 0,15 ml het etanol och 0,35 ml intralipid, och späddes sedan till den önskade koncentra- tionen i intralipid.Reagent P pm / mouse PFC / 106 1 SE Student Test Control olive oil 2183 166 - CLA 10 1016 125 0.05 100 314 73 0.001 CS-A 10 1092 209 0.01 100 753 51 0.001 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 10 802 112 0.01 I I 100 680 86 0.001 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 10 764 60 0.01 I I 100 477 45 0.001 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 687 136 0.01 I I 100 501 109 0.001 The results are expressed as an average of 1 SE of 6 mice. f), 10 15 20 25 30 35 467 410 15 Table C The number of PFCs in the spleen of mice treated intravenously (iv) with two doses of 1-MPa-LA-Cys-NH CLA and CS-A L ___ | 2! dissolved in intralipid (int) Reagent P pm / mouse PFC / 106 1 SE Student Test Control PBS 1985 82 - Control int 2326 67 NS 1-Mpa-LA-Cys-NH 2 0.01 1649 126 0.05 I I 0.1 1364 43 0.01 1.0 903 39 0.001 CLA 0.01 1943 77 NS 0.1 1475 97 0.02 1.0 1203 85 0.01 CS-A 0.01 1842 122 NS 0.1 1633 181 0.05 1.0 1158 50 0.01 The preparations in a volume of 0.2 ml were introduced twice, first dose 3 hours before sensitization with antigen, the other 24 hours later. Preparation of CLA and 1-MPa-LA-Cys-NH 2: L ___ | 2 mg of the substance was dissolved in 0.15 ml of hot ethanol and 0.35 ml intralipid, and then diluted to the desired concentration. tion in intralipid.
CS-A späddes direkt i intralipid till den önskade koncentrationen. I kontrollen infördes 0,2 ml PBS eller intralipid.CS-A was diluted directly in intralipid to the desired one concentration. 0.2 ml of PBS or intralipid.
Resultaten är uttryckta som ett medeltal 1 SE av 6 möss. _7467 410 10 15 20 25 30 35 16 Tabell D Antalet PFC i mjältcellkulturer som behandlats med CLA, CS-A och analoger enligt uppfinningen lösta i intralipid (int) Reagens P um/brunn PFC/106 1 SE Studenttest Kontroll PBS 4212 404 - Kontroll int 4495 268 NS CLA 0,01 2879 236 NS 0,1 865 27 0,001 1,0 537 80 0,001 CS-A 0,01 3020 184 NS 0,1 892 31 0,001 1,0 569 84 0,001 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 0,01 3047 370 NS I I 0,1 2178 306 0,05 1,0 841 89 0,001 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 0,01 2985 272 NS | o, 1 3100 279 ns Z 1,0 119 45 0,001 1-Mpa-CLA-Cys-NH2 0,01 2388 226 0,05 I I 0,1 2286 301 0,05 1,0 436 70 0,001 Bg - 65 17 - Resultaten är uttryckta som ett medeltal t SE av 6 brunnar.The results are expressed as an average of 1 SE of 6 mice. _7467 410 10 15 20 25 30 35 16 Table D The number of PFCs in spleen cell cultures treated with CLA, CS-A and analogs of the invention dissolved in intralipid (int) Reagent P um / brunn PFC / 106 1 SE Studenttest Control PBS 4212 404 - Control int 4495 268 NS CLA 0.01 2879 236 NS 0.1 865 27 0.001 1.0 537 80 0.001 CS-A 0.01 3020 184 NS 0.1 892 31 0.001 1.0 569 84 0.001 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 0.01 3047 370 NS I I 0.1 2178 306 0.05 1.0 841 89 0.001 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 0.01 2985 272 NS | o. 3100 279 ns Z 1.0 119 45 0.001 1-Mpa-CLA-Cys-NH 2 0.01 2388 226 0.05 I I 0.1 2286 301 0.05 1.0 436 70 0.001 Bg - 65 17 - The results are expressed as an average t SE of 6 wells.
Bg - bakgrund 10 15 20 25 30 35 467 410 17 Tabell E Immunosuppressiv aktivitet hos CS-A och analoger enligt uppfinningen mätt genom antalet PFC. I in vivo studier be- handlades möss med två doser av preparaten lösta i Cremo- phor eller olivolja. Första dosen 3 h före immunisering, andra 24 h senare.Bg - background 10 15 20 25 30 35 467 410 17 Table E Immunosuppressive activity of CS-A and analogues according to invention measured by the number of PFCs. In vivo studies mice were traded with two doses of the preparations dissolved in Cremo- phor or olive oil. First dose 3 hours before immunization, other 24 hours later.
Reagens Administre- P pm/mus ringssätt PFC/106 i SE Kontroll "C" i.p. 1330 109 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 1 pg i.p. 1263 124 NS l I 10 pg i.p. 700 90 0,01 1-Hmp-LA-Cys-NH2 1 pg i.p. 1178 111 NS | I 10 pg i.p. 831 58 0,05 Kontroll PBS i.p. 1186 109 - CS-A 1 pg i.p. 1350 120 NS 10 pg i.p. 839 105 0,05 Kontroll "C" i.p. 1122 144 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 238 23 0,001 Kontroll PBS i.p. 1056 95 - CS-A 10 pg i.p. 124 36 0,001 Kontroll "C" - cremophor i lämplig koncentration som krävs för preparering av 10 pg av peptiden.Reagent Administre- P pm / mouse ring mode PFC / 106 in SE Control "C" i.p. 1330 109 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 1 pg i.p. 1263 124 NS l I 10 pg i.p. 700 90 0.01 1-Hmp-LA-Cys-NH2 1 pg i.p. 1178 111 NS | I 10 pg i.p. 831 58 0.05 Control PBS i.p. 1186 109 - CS-A 1 pg i.p. 1350 120 NS 10 pg i.p. 839 105 0.05 Control "C" i.p. 1122 144 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 238 23 0.001 Control PBS i.p. 1056 95 - CS-A 10 pg i.p. 124 36 0.001 Control "C" cremophor in appropriate concentration required for preparation of 10 pg of the peptide.
CS-A - löst i PBS. 4-67 410 18 Forts.CS-A - solved in PBS. 4-67 410 18 Continued.
Kontroll "0l" p.o. 2428 329 - 5 1-Mpa-LA-Cys-NH 10 pg p.o. 1214 91 0,02 2 I I 100 pg p.o. 406 73 0,001 CS-A 10 pg p.o. 1888 272 NS lo 100 pg p.o. 834 142 0,01 Kontroll "01" p.o. 1693 133 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 100 pg p.o. 444 66 0,001 15 I I 1-Hmp-LA-Cys-NH2 100 pg p.o. 672 74 0,001 20 Kontroll PBS p.o. 1788 219 - CS-A 100 pg p.o. 561 88 0,001 25 Kontroll "C" in vitro 3690 321 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 1 pg/ml in vitro 65 11 0,001 30 CS-A 1 pg/ml in vitro 20 12 0,001 Kontroll "01" - olivolja 35 10 15 20 25 30 35 4-67 410 19 Tabell F Effekten av CLA, CS-A och analoger enligt uppfinningen lösta i olivolja pà hypersensitivitet av fördröjd typ (DTH) i möss. Preparaten infördes per os (po) två ggr, första dosen 3 h före sensibilisering, andra 48 h senare.Control "0l" p.o. 2428 329 - 5 1-Mpa-LA-Cys-NH 10 pg p.o. 1214 91 0.02 2 I I 100 pg p.o. 406 73 0.001 CS-A 10 pg p.o. 1888 272 NS lo 100 pg p.o. 834 142 0.01 Control "01" p.o. 1693 133 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 100 pg p.o. 444 66 0.001 15 I I 1-Hmp-LA-Cys-NH2 100 pg p.o. 672 74 0.001 20 Control PBS p.o. 1788 219 - CS-A 100 pg p.o. 561 88 0.001 Control "C" in vitro 3690 321 - 1-Mpa-LA-Cys-NH 2 1 pg / ml in vitro 65 11 0.001 30 CS-A 1 pg / ml in vitro 20 12 0.001 Control "01" - olive oil 35 10 15 20 25 30 35 4-67 410 19 Table F The effect of CLA, CS-A and analogs of the invention dissolved in olive oil on delayed-type hypersensitivity (DTH) in mice. The preparations were introduced per os (po) twice, first dose 3 hours before sensitization, second 48 hours later.
Reagens P pm/mus Enheter 1 SE Studenttest Kontroll olivolja 22,50 1,60 - CLA 10 15,20 1,26 0,05 100 10,90 0,62 0,001 CS-A 10 13,5 0,86 0,01 100 10,2 0,95 0,001 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 10 12,6 0,70 0,01 I I 100 10,00 0,71 0,001 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 10 13,70 0,94 0,02 I I 100 11,20 0,65 0,001 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 11,7 0,50 0,01 I I 100 8,50 0,71 0,001 En enhet - 0,1 mm DTH introducerades i möss i enlighet med Lagrange et al (Lagrange P.H., Mackaness G.B., Miller T.E., Pardon P: J. Immunol., 1975, 114, 447). Möss sensibiliserades intra- venöst med 105 SRBC. Efter 4 dagar framkallades reaktionen 8 SRBC i vänstra baktrampdynan. Reaktionens magnitud mättes som ökning av genom en intradermal introduktion av 10 trampdynans tjocklek vid 24 h efter administrering av den retande dosen.Reagent P pm / mouse Units 1 SE Student test Control olive oil 22.50 1.60 - CLA 10 15.20 1.26 0.05 100 10.90 0.62 0.001 CS-A 10 13.5 0.86 0.01 100 10.2 0.95 0.001 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 10 12.6 0.70 0.01 I I 100 10.00 0.71 0.001 1-Mpa-LA-D-Cys-NH 2 10 13.70 0.94 0.02 I I 100 11.20 0.65 0.001 1-MPa-LA-Cys-NH2 10 11.7 0.50 0.01 I I 100 8.50 0.71 0.001 One unit - 0.1 mm DTH was introduced in mice in accordance with Lagrange et al (Lagrange P.H., Mackaness G.B., Miller T.E., Pardon P: J. Immunol., 1975, 114, 447). Mice were sensitized intra- venous with 105 SRBC. After 4 days, the reaction was elicited 8 SRBC on the left baktrampdynan. The magnitude of the reaction was measured as the increase of by an intradermal introduction of 10 the thickness of the pedal pad at 24 hours after its administration correcting dose.
Resultaten är uttryckta som ett medeltal i SE av 10 möss. 1467 410 10 15 20 25 30 35 20 Tabell G Immunosuppressiv aktivitet hos 1-Mpa-LA-Cys-NH2 och 1-Hmp-LA-Cïs-NH2 i GvH-reaktion (celllulär immunitet). fl L__J x? Preparaten lösta i cremophor gavs i.p. -4 och 48 h före respektive efter introduktion av parenterala celler.The results are expressed as an average in SE of 10 mice. 1467 410 10 15 20 25 30 35 20 Table G Immunosuppressive activity of 1-MPa-LA-Cys-NH 2 and 1-Hmp-LA-C 18 -NH 2 in GvH reaction (cellular immunity). fl L__J x? The preparations dissolved in cremophor were given i.p. -4 and 48 hours before respectively after introduction of parenteral cells.
Reagens Administre- GVH 1 SE P pm/mus ringssätt (index) Kontroll "C" i.p. 3,17 0,36 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 1,96 0,27 0,05 1-Hmp-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 1,54 0,22 0,01 Kontroll PBS i.p. 3,09 0,42 - CS-A 10 pg i.p. 1,41 0,16 0,001 Kontroll PBS - fosfatbuffertlösning Kontroll "C" cremophor vid en koncentration som krävs för att lösa 10 pg av peptiderna eller 1 pg (i in vitro) Kontroll "0l" - olivolja I)Reagent Administre- GVH 1 SE P pm / mouse ring mode (index) Control "C" i.p. 3.17 0.36 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 1.96 0.27 0.05 1-Hmp-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 1.54 0.22 0.01 Control PBS i.p. 3.09 0.42 - CS-A 10 pg i.p. 1.41 0.16 0.001 Control PBS - phosphate buffer solution Control "C" cremophor at a required concentration to dissolve 10 pg of the peptides or 1 pg (in vitro) Control "0l" - olive oil IN)
Claims (10)
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9003040A SE467410B (en) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | ANALOGS OF CYCLOLINOPEPTIDE AND USE THEREOF |
| HU93847A HU9300847D0 (en) | 1990-09-25 | 1991-09-18 | Cyclolinopeptone a-analogues and their utilization |
| EP19910917536 EP0553133A1 (en) | 1990-09-25 | 1991-09-18 | Analogues of cyclolinopeptide a and the use thereof |
| PCT/SE1991/000628 WO1992005189A1 (en) | 1990-09-25 | 1991-09-18 | Analogues of cyclolinopeptide a and the use thereof |
| AU86531/91A AU8653191A (en) | 1990-09-25 | 1991-09-18 | Analogues of cyclolinopeptide a and the use thereof |
| CA 2090859 CA2090859A1 (en) | 1990-09-25 | 1991-09-18 | Analogues of cyclolinopeptide a and the use thereof |
| FI931259A FI931259A0 (en) | 1990-09-25 | 1993-03-22 | ANALOGER AV CYCLOLINOPEPTID A OCH DERAS FRAMSTAELLNING |
| NO93931091A NO931091L (en) | 1990-09-25 | 1993-03-24 | ANALOGS OF CYCLOINOPEPTIDE A AND USE thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9003040A SE467410B (en) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | ANALOGS OF CYCLOLINOPEPTIDE AND USE THEREOF |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE9003040D0 SE9003040D0 (en) | 1990-09-25 |
| SE9003040L SE9003040L (en) | 1992-03-26 |
| SE467410B true SE467410B (en) | 1992-07-13 |
Family
ID=20380440
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE9003040A SE467410B (en) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | ANALOGS OF CYCLOLINOPEPTIDE AND USE THEREOF |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0553133A1 (en) |
| AU (1) | AU8653191A (en) |
| CA (1) | CA2090859A1 (en) |
| FI (1) | FI931259A0 (en) |
| HU (1) | HU9300847D0 (en) |
| SE (1) | SE467410B (en) |
| WO (1) | WO1992005189A1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1768662A2 (en) | 2004-06-24 | 2007-04-04 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Small molecule immunopotentiators and assays for their detection |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8804640L (en) * | 1988-12-23 | 1990-06-24 | Ferring Ab | MEDICINAL COMPREHENSIVE CYCLOLINOPEPTIDE A |
-
1990
- 1990-09-25 SE SE9003040A patent/SE467410B/en not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-09-18 AU AU86531/91A patent/AU8653191A/en not_active Abandoned
- 1991-09-18 WO PCT/SE1991/000628 patent/WO1992005189A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-09-18 HU HU93847A patent/HU9300847D0/en unknown
- 1991-09-18 EP EP19910917536 patent/EP0553133A1/en not_active Withdrawn
- 1991-09-18 CA CA 2090859 patent/CA2090859A1/en not_active Abandoned
-
1993
- 1993-03-22 FI FI931259A patent/FI931259A0/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0553133A1 (en) | 1993-08-04 |
| AU8653191A (en) | 1992-04-15 |
| WO1992005189A1 (en) | 1992-04-02 |
| FI931259A (en) | 1993-03-22 |
| SE9003040D0 (en) | 1990-09-25 |
| FI931259A0 (en) | 1993-03-22 |
| SE9003040L (en) | 1992-03-26 |
| CA2090859A1 (en) | 1992-03-26 |
| HU9300847D0 (en) | 1993-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5780021A (en) | Method for treating type 1 diabetes using α-interferon and/or β-i | |
| JP4350898B2 (en) | Novel cyclosporine with improved activity characteristics | |
| US9879047B2 (en) | Template-fixed peptidomimetics | |
| US5177189A (en) | Polypeptide analogs of Apolipoprotein E | |
| US5464816A (en) | Method and pharmaceutical compositions for treating immunodeficiencies | |
| US10357537B2 (en) | Cyclotides as immunosuppressive agents | |
| JPH07507330A (en) | Polypeptide bombesin antagonist | |
| SE501677C2 (en) | Biologically active vasopressin analogs, pharmaceutical preparations containing them and their use in the manufacture of drugs | |
| JPH02504274A (en) | Human insulin analogs | |
| SE467410B (en) | ANALOGS OF CYCLOLINOPEPTIDE AND USE THEREOF | |
| US4347242A (en) | Hypocalcaemic peptides and process for their manufacture | |
| JPH04500363A (en) | Atrial peptide derivative | |
| Marastoni et al. | Structure–activity relationships of cyclic and linear peptide T analogues | |
| Ciardelli et al. | Activity of synthetic thymosin. alpha. 1 C-terminal peptides in the azathioprine E-rosette inhibition assay | |
| WO1990007523A1 (en) | Medicament comprising cyclolinopeptide a | |
| JPH09502175A (en) | Novel tripeptide useful for immunity and CNS therapy | |
| USRE32347E (en) | Hypocalcaemic peptides and process for their manufacture | |
| KR0141973B1 (en) | Physiologically active peptide and calcium metabolism-regulating agent comprising said peptide as active ingredient | |
| JP2628082B2 (en) | Immunosuppressants | |
| JPH01233225A (en) | Use of cyclophiline ad anti-inflammatory agent and immune regulator | |
| EP1937710B1 (en) | Kinin b1 receptor peptide agonists and uses thereof | |
| KR820000188B1 (en) | Process for the preparation of thymosin | |
| Różycki et al. | New cyclosporin a analogue: Synthesis and immunosuppressive activity | |
| IE903416A1 (en) | Medicament comprising antamanide | |
| JPH05271280A (en) | New polypeptide, its production and pharmaceutical containing the polypeptide as active component |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 9003040-4 Effective date: 19940410 Format of ref document f/p: F |