RU2817896C1 - Recombinant vesicular stomatitis virus expressing chimeric il12-gmcsf protein - Google Patents
Recombinant vesicular stomatitis virus expressing chimeric il12-gmcsf protein Download PDFInfo
- Publication number
- RU2817896C1 RU2817896C1 RU2022134627A RU2022134627A RU2817896C1 RU 2817896 C1 RU2817896 C1 RU 2817896C1 RU 2022134627 A RU2022134627 A RU 2022134627A RU 2022134627 A RU2022134627 A RU 2022134627A RU 2817896 C1 RU2817896 C1 RU 2817896C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- vsv
- cell
- csf
- hil12
- Prior art date
Links
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 title claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 29
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 46
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 45
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 38
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 81
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 41
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 24
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 14
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 14
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 11
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 4
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 241000711970 Vesiculovirus Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000004479 myeloid suppressor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229950008461 talimogene laherparepvec Drugs 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 101000932480 Homo sapiens Fms-related tyrosine kinase 3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241001481495 Indiana vesiculovirus Species 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 208000030156 Marburg disease Diseases 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100034514 Protein FAM72A Human genes 0.000 description 1
- 101710183568 Serine/threonine-protein kinase PknK Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012592 cell culture supplement Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 102000004632 fms-Like Tyrosine Kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010003374 fms-Like Tyrosine Kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000003911 head and neck carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005008 immunosuppressive cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000013414 tumor xenograft model Methods 0.000 description 1
- 210000004981 tumor-associated macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000000316 virotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, в частности генной инженерии, а именно к рекомбинантному вирусу везикулярного стоматита, экспрессирующему химерный белок IL12 - GMCSF.The invention relates to the field of biotechnology and molecular biology, in particular genetic engineering, namely to a recombinant vesicular stomatitis virus expressing the chimeric protein IL12 - GMCSF.
Уровень техникиState of the art
Высокий терапевтический потенциал онколитических вирусов раскрылся в последние 2 года в ходе исследований эффекта их применения в комбинации с различными ингибиторами контрольных точек иммунного ответа (immune checkpoint inhibitors) при лечении резистентных, неоперабельных или рецидивирующих форм рака [Russell L. et al. Oncolytic viruses: priming time for cancer immunotherapy // BioDrugs. - 2019. T. 33. №.5. C. 485-501]. Например, эффективность терапии значительно возрастала при использовании препарата knlygic® (talimogene laherparepvec) в комбинации с пембролизумабом, ниволумабом и ипилимумабом [Dummer R, Hoeller С, Gruter IP, Michielin О. Combining talimogene laherparepvec with immunotherapies in melanoma and other solid tumors. Cancer Immunol Immunother. 2017 Jun; 66(6):683-695. doi: 10.1007/s00262-017-1967-1]. В настоящее время разработка онколитических вирусов является одним из приоритетных направлений иммунотерапии опухолей. Ведется более 100 клинических исследований ранних фаз [Pearl Т.М. etal. Oncolytic virus-based cytokine expression to improve immune activity in brain and solid tumors // Molecular Therapy-Oncolytics. - 2019. - T. 13. - C. 14-21; Zheng M. et al. Oncolytic viruses for cancer therapy: barriers and recent advances // Molecular Therapy-Oncolytics. - 2019. T. 15. - C. 234-247].The high therapeutic potential of oncolytic viruses has been revealed in the last 2 years during studies of the effect of their use in combination with various immune checkpoint inhibitors in the treatment of resistant, inoperable or recurrent forms of cancer [Russell L. et al. Oncolytic viruses: priming time for cancer immunotherapy // BioDrugs. - 2019. T. 33. No. 5. P. 485-501]. For example, the effectiveness of therapy increased significantly when using the drug knlygic® (talimogene laherparepvec) in combination with pembrolizumab, nivolumab and ipilimumab [Dummer R, Hoeller C, Gruter IP, Michielin O. Combining talimogene laherparepvec with immunotherapies in melanoma and other solid tumors. Cancer Immunol Immunother. 2017 Jun; 66(6):683-695. doi:10.1007/s00262-017-1967-1]. Currently, the development of oncolytic viruses is one of the priority areas of tumor immunotherapy. More than 100 early phase clinical studies are ongoing [Pearl T.M. et al. Oncolytic virus-based cytokine expression to improve immune activity in brain and solid tumors // Molecular Therapy-Oncolytics. - 2019. - T. 13. - pp. 14-21; Zheng M. et al. Oncolytic viruses for cancer therapy: barriers and recent advances // Molecular Therapy-Oncolytics. - 2019. T. 15. - P. 234-247].
Вирус везикулярного стоматита (VSV, везикуловирус, везикуловирус Индианы) является перспективным для создания на его основе безопасного и эффективного онколитика, в особенности в комбинации с иммунотерапевтическими подходами. Низкая патогенность (вирус поражает крупный домашний скот, а в случае заражения человека вирус чаще всего не вызывает никаких симптомов), репликация в цитоплазме (без интеграции в геном), возможность получения высокого вирусного титра при наработке VSV в культурах клеток млекопитающих (ВНК, НЕК) и простота выделения, легкость генетической модификации, отсутствие в популяции нейтрализующих антител сделали VSV идеальным кандидатом для получения вирусных вакцин и онколитических вирусов [Geisbert Т.W., Feldmann Н. Recombinant vesicular stomatitis virus-based vaccines against Ebola and Marburg virus infections // The Journal of infectious diseases. 2011. T. 204. №. suppl 3. C. S1075-S1081; Zemp F., Rajwani J., Mahoney D. J. Rhabdoviruses as vaccine platforms for infectious disease and cancer // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. - 2018. - T. 34. - №.1. - C. 122-138.; Velazquez-Salinas L. et al. Oncolytic recombinant vesicular stomatitis virus (VSV) is nonpathogenic and nontransmissible in pigs, a natural host of VSV // Human Gene Therapy Clinical Development. 2017. T. 28. №.2. C. 108-115]. Одним из способов модификации VSV является встраивание генов иммуностимулирующих факторов, что может помочь преодолеть основные механизмы устойчивости опухолевых клеток к иммуноопосредованному уничтожению, значительно увеличив эффективность иммунотерапии злокачественных новообразований.Vesicular stomatitis virus (VSV, vesiculovirus, Indiana vesiculovirus) is promising for creating a safe and effective oncolytic based on it, especially in combination with immunotherapeutic approaches. Low pathogenicity (the virus infects large livestock, and in the case of human infection, the virus most often does not cause any symptoms), replication in the cytoplasm (without integration into the genome), the possibility of obtaining a high viral titer when VSV is produced in mammalian cell cultures (BHK, HEK) and ease of isolation, ease of genetic modification, and the absence of neutralizing antibodies in the population made VSV an ideal candidate for obtaining viral vaccines and oncolytic viruses [Geisbert T.W., Feldmann N. Recombinant vesicular stomatitis virus-based vaccines against Ebola and Marburg virus infections // The Journal of infectious diseases. 2011. T. 204. No. suppl 3. C. S1075-S1081; Zemp F., Rajwani J., Mahoney D. J. Rhabdoviruses as vaccine platforms for infectious disease and cancer // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. - 2018. - T. 34. - No. 1. - pp. 122-138.; Velazquez-Salinas L. et al. Oncolytic recombinant vesicular stomatitis virus (VSV) is nonpathogenic and nontransmissible in pigs, a natural host of VSV // Human Gene Therapy Clinical Development. 2017. T. 28. No. 2. P. 108-115]. One way to modify VSV is to insert genes for immunostimulating factors, which can help overcome the basic mechanisms of tumor cell resistance to immune-mediated destruction, significantly increasing the effectiveness of immunotherapy for malignant neoplasms.
В последние годы одной из исследуемых стратегий стала вставка в онколитические вирусы иммуностимулирующих трансгенов (например, GM-SCF [Leveille S, Goulet ML, Lichty BD, et al. Vesicular Stomatitis Virus Oncolytic Treatment Interferes with Tumor-Associated Dendritic Cell Functions and Abrogates Tumor Antigen Presentation. J Virol. 2011; 85(23): 12160-12169; Ramsburg E, Publicover J, Buonocore L, et al. A vesicular stomatitis virus recombinant expressing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces enhanced T-cell responses and is highly attenuated for replication in animals. J Virol. 2005; 79(24): 15043-15053]) для ускорения созревания дендритных клеток и презентации антигена. Кроме того, были предприняты попытки увеличения созревания и дифференцировки Т-клеток с использованием иммуномодулирующих трансгенов (например, IL-12, [Shin EJ, Wanna GB, Choi В, et al. Interleukin-12 expression enhances vesicular stomatitis virus oncolytic therapy in murine squamous cell carcinoma. Laryngoscope. 2007 Feb; 117(2):210-214]). Однако необходима дальнейшая работа с такими подходами для достижения устойчивости ответа и минимизации нецелевых эффектов, таких как трансгены, которые могут влиять как на здоровые, так и на раковые клетки [Munis AM, Bentley ЕМ & Takeuchi Y. A tool with many applications: vesicular stomatitis virus in research and medicine, Expert Opinion on Biological Therapy, 2020; 20:10, 1187-1201].In recent years, one of the strategies being explored has been the insertion of immunostimulatory transgenes into oncolytic viruses (for example, GM-SCF [Leveille S, Goulet ML, Lichty BD, et al. Vesicular Stomatitis Virus Oncolytic Treatment Interferes with Tumor-Associated Dendritic Cell Functions and Abrogates Tumor Antigen Presentation J Virol 2011; 85(23): 12160-12169; Ramsburg E, Publicover J, Buonocore L, et al. A vesicular stomatitis virus expressing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces enhanced T-cell responses. attenuated for replication in animals. J Virol. 2005; 79(24): 15043-15053]) to accelerate dendritic cell maturation and antigen presentation. In addition, attempts have been made to increase the maturation and differentiation of T cells using immunomodulatory transgenes (for example, IL-12, [Shin EJ, Wanna GB, Choi B, et al. Interleukin-12 expression enhances vesicular stomatitis virus oncolytic therapy in murine squamous cell carcinoma. 2007 Feb; 117(2):210-214]. However, further work with such approaches is needed to achieve robustness of response and minimize off-target effects such as transgenes that can affect both healthy and cancer cells [Munis AM, Bentley EM & Takeuchi Y. A tool with many applications: vesicular stomatitis virus in research and medicine, Expert Opinion on Biological Therapy, 2020; 20:10, 1187-1201].
Перспективными мишенями для направленной модификации VSV являются IL12 и GM-CSF. ИЛ-12 это цитокин с плейотропной (многофункциональной) активностью. ИЛ-12 стимулирует дифференцировку Thl-клеток, повышает активность Т- и NK-клеток, ингибирует и/или перепрограммирует иммуносупрессивные клетки, например, опухоль-ассоциированные макрофаги и миелоидные супрессорные клетки (миелоидные супрессоры). Кроме того, ИЛ-12 стимулирует выработку интерферона гамма (IFNy), который, в свою очередь, оказывает цитостатическое/цитотоксическое/антиангиогенное действие и повышает уровень экспрессии главного комплекса гистосовместимости классов I и II (ГКГС классов I и II) на раковых клеток, что способствует улучшению их распознавания лимфоцитами [Toda М, Martuza RL, Kojima Н, Rabkin SD. In situ cancer vaccination: an IL-12 defective vector/replication-competent herpes simplex virus combination induces local and systemic antitumor activity. J Immunol. 1998 May 1; 160(9):4457-64. PMID: 9574551.; Nguyen KG, Vrabel MR, Mantooth SM, et al. Localized Interleukin-12 for Cancer Immunotherapy. Front Immunol. 2020 Oct 15; 11:575597. doi: 10.3389/fimmu.2020.575597. PMID: 33178203; PMCID: РМС7593768].Promising targets for targeted modification of VSV are IL12 and GM-CSF. IL-12 is a cytokine with pleiotropic (multifunctional) activity. IL-12 stimulates Thl cell differentiation, increases T and NK cell activity, and inhibits and/or reprograms immunosuppressive cells such as tumor-associated macrophages and myeloid suppressor cells (myeloid suppressor cells). In addition, IL-12 stimulates the production of interferon gamma (IFNy), which in turn has a cytostatic/cytotoxic/antiangiogenic effect and increases the expression level of major histocompatibility complex classes I and II (MHC classes I and II) on cancer cells, which helps improve their recognition by lymphocytes [Toda M, Martuza RL, Kojima N, Rabkin SD. In situ cancer vaccination: an IL-12 defective vector/replication-competent herpes simplex virus combination induces local and systemic antitumor activity. J Immunol. 1998 May 1; 160(9):4457-64. PMID: 9574551.; Nguyen KG, Vrabel MR, Mantooth SM, et al. Localized Interleukin-12 for Cancer Immunotherapy. Front Immunol. 2020 Oct 15; 11:575597. doi: 10.3389/fimmu.2020.575597. PMID: 33178203; PMCID: РМС7593768].
GM-CSF является фактором роста, который стимулирует дифференцировку, пролиферацию и миграцию миелоидных клеток. Потенциальный положительный эффект от экспрессии GM-CSF в составе вируса простого герпеса человека был продемонстрирован в многочисленных клинических исследованиях онколитика T-VEC (талимоген, лагерпарепвек), который имеет статус первого онколитического вируса, одобренного Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA).GM-CSF is a growth factor that stimulates the differentiation, proliferation and migration of myeloid cells. The potential beneficial effect of GM-CSF expression within human herpes simplex virus has been demonstrated in multiple clinical studies of the oncolytic T-VEC (talimogen, laherparepvec), which is the first oncolytic virus approved by the US Food and Drug Administration ( FDA).
Включение генов IL12 и GM-CSF в состав VSV для ко-экспрессии в ходе репликации вируса в опухоли может привести к активации и пролиферации дендритных клеток и макрофагов, индукции экспрессии IL-12 and INFy внутри опухоли, активации и амплификация Т-клеток и NK- клеток и их инфильтрации в ТМЕ и индукции экспрессии провоспалительных цитокинов (IFN-g, TNF и др.).The inclusion of IL12 and GM-CSF genes in VSV for co-expression during viral replication in the tumor can lead to activation and proliferation of dendritic cells and macrophages, induction of IL-12 and INFy expression within the tumor, activation and amplification of T cells and NK cells. cells and their infiltration into the TME and induction of the expression of pro-inflammatory cytokines (IFN-g, TNF, etc.).
Однако следует учитывать, что, в отличие от многих других вирусов, на репликацию везикуловируса и соответственно онколитическую способность, а также на уровень экспрессии добавляемого трансгена и соответственно на суммарный терапевтический эффект могут влиять позиция трансгена в геноме вируса, состав трансгена, а также способы модификации генома VSV [Wertz GW, Moudy R, Ball LA. Adding genes to the RNA genome of vesicular stomatitis virus: positional effects on stability of expression. J Virol. 2002 Aug; 76(15):7642-50. doi: 10.1128/jvi.76.15.7642-7650.2002]. Это связано с особенностью репликативного цикла VSV. Например, одним из способов аттенюации вируса является изменение последовательности генов в геноме VSV [Flanagan ЕВ, Zamparo JM, Ball LA, Rodriguez LL, Wertz GW. Rearrangement of the genes of vesicular stomatitis virus eliminates clinical disease in the natural host: new strategy for vaccine development. J Virol. 2001 Jul; 75(13):6107-14. doi: 10.1128/JVI.75.13.6107-6114.2001; Wertz GW, Perepelitsa VP, Ball LA. Gene rearrangement attenuates expression and lethality of a nonsegmented negative strand RNA virus. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Mar31; 95(7):3501-6. doi: 10.1073/pnas.95.7.3501].However, it should be taken into account that, unlike many other viruses, the replication of the vesiculovirus and, accordingly, the oncolytic ability, as well as the level of expression of the added transgene and, accordingly, the total therapeutic effect, can be influenced by the position of the transgene in the genome of the virus, the composition of the transgene, as well as methods of genome modification VSV [Wertz GW, Moudy R, Ball LA. Adding genes to the RNA genome of vesicular stomatitis virus: positional effects on stability of expression. J Virol. 2002 Aug; 76(15):7642-50. doi: 10.1128/jvi.76.15.7642-7650.2002]. This is due to the peculiarity of the VSV replication cycle. For example, one way to attenuate the virus is to change the gene sequence in the VSV genome [Flanagan EB, Zamparo JM, Ball LA, Rodriguez LL, Wertz GW. Rearrangement of the genes of vesicular stomatitis virus eliminates clinical disease in the natural host: new strategy for vaccine development. J Virol. July 2001; 75(13):6107-14. doi: 10.1128/JVI.75.13.6107-6114.2001; Wertz GW, Perepelitsa VP, Ball LA. Gene rearrangement attenuates expression and lethality of a nonsegmented negative strand RNA virus. Proc Natl Acad Sci USA. 1998Mar31; 95(7):3501-6. doi:10.1073/pnas.95.7.3501].
Одним из способов преодоления возможного негативного влияния добавленного гена может быть создание химерных конструкций, в которых одна рамка считывания кодирует два полипептида, связанные через линкер. Химерный белок IL12-GM-CSF и его противоопухолевый эффект описан в уровне техники [RU2263118C2], однако неизвестно, как встраивание гена, кодирующего этот химерный белок, отразится на биологических и терапевтических свойствах VSV. В частности, неизвестно, насколько добавление GM-CSF влияет на активность IL12, будет ли активность, например, IL12 сопоставима с активностью белка без добавления GM-CSF в составе экспрессионного вектора и в составе генома VSV и как будет влиять длина линкера между генами IL12 и GM-CSF на активность и уровень синтеза белка и т.д.One way to overcome the possible negative impact of an added gene may be to create chimeric constructs in which one reading frame encodes two polypeptides connected through a linker. The IL12-GM-CSF chimeric protein and its antitumor effect are described in the prior art [RU2263118C2], but it is unknown how the integration of the gene encoding this chimeric protein will affect the biological and therapeutic properties of VSV. In particular, it is unknown to what extent the addition of GM-CSF affects the activity of IL12, whether the activity of, for example, IL12 will be comparable to the activity of the protein without the addition of GM-CSF as part of an expression vector and as part of the VSV genome, and how the length of the linker between the IL12 and IL12 genes will affect GM-CSF for activity and level of protein synthesis, etc.
Из патента RU2263118C2 (Лексиген Фармасьютикэлс Корп) известен слитый белок p40-GM-CSF, мышиный и человеческий, который применяется для активации иммунного ответа при лечении опухолевых заболеваний в виде белка, слитого с антителом или Fc-фрагментом антитела. Последовательность гена, кодирующего слитый белок по патенту RU2263118C2, приведена в Seq Id No: 16.From patent RU2263118C2 (Lexigen Pharmaceuticals Corp.) a fusion protein p40-GM-CSF, mouse and human, is known, which is used to activate the immune response in the treatment of tumor diseases in the form of a protein fused with an antibody or an Fc fragment of an antibody. The sequence of the gene encoding the fusion protein according to patent RU2263118C2 is given in Seq Id No: 16.
Из работы Шин с соавторами известен онколитический вирусный вектор VSV (WSV-IL12) для экспрессии гена мышиного интерлейкина 12 (IL12), который эффективно экспрессирует IL12 и значительно улучшает лечение карциномы головы и шеи у мышей. Этот цитокин-несущий онколитический сравнивали с аналогичным фузогенным вирусом (rVSV-F) не содержащим цитокин при лечении мышиной плоскоклеточной карциномы SCC VII (SCC). Оба вируса продемонстрировали одинаковую инфекционную эффективность, репликацию вируса и цитотоксичность in vitro и in vivo. В модели ортотопического дна ротовой полости SCC VII у иммунокомпетентных мышей С3Н/HeJ множественные внутриопухолевые инъекции каждого вируса вызывали значительное уменьшение объема опухоли по сравнению с инъекциями только физиологического раствора. Опухоли, обработанные rVSV-IL12, показали поразительное уменьшение объема опухоли по сравнению с опухолями, обработанными rVSV-F и физиологическим раствором (Р<0,005). Это поразительное уменьшение объема опухоли привело к существенному улучшению выживаемости у животных, получавших rVSV-IL12. Никакой связанной с лечением токсичности не наблюдалось ни в одной из групп [Shin EJ, Wanna GB, Choi В, et al. mterleukin-12 expression enhances vesicular stomatitis virus oncolytic therapy in murine squamous cell carcinoma. Laryngoscope. 2007 Feb; 117(2):210-4. doi: 10.1097/01.mlg.0000246194.66295.d8].From the work of Shin et al., an oncolytic VSV viral vector (WSV-IL12) for expressing the murine interleukin 12 (IL12) gene is known, which effectively expresses IL12 and significantly improves the treatment of head and neck carcinoma in mice. This cytokine-carrying oncolytic was compared with a similar cytokine-free fusogenic virus (rVSV-F) in the treatment of murine SCC VII squamous cell carcinoma (SCC). Both viruses demonstrated similar infectivity, viral replication, and cytotoxicity in vitro and in vivo. In the SCC VII orthotopic floor of the mouth model in immunocompetent C3H/HeJ mice, multiple intratumoral injections of each virus caused a significant reduction in tumor volume compared with injections of saline alone. Tumors treated with rVSV-IL12 showed a striking reduction in tumor volume compared with tumors treated with rVSV-F and saline (P<0.005). This striking reduction in tumor volume resulted in a significant improvement in survival in animals treated with rVSV-IL12. No treatment-related toxicity was observed in any of the groups [Shin EJ, Wanna GB, Choi B, et al. mterleukin-12 expression enhances vesicular stomatitis virus oncolytic therapy in murine squamous cell carcinoma. Laryngoscope. Feb 2007; 117(2):210-4. doi: 10.1097/01.mlg.0000246194.66295.d8].
В работе Рамсбург с соавторами описан рекомбинантный вирус везикулярного стоматита (VSV-GMCSF1), экспрессирующий высокий уровень GM-CSF с первой позиции в вирусном геноме, который сильно ослаблен с точки зрения вирусной диссеминации и патогенеза после интраназальной доставки мышам. Первичный ответ Т-клеток CD8 и нейтрализующих антител на VSV-GMCSF1 эквивалентен ответу, который вызывает контрольный вирус VSV-EGFP1, несущий GFP, в то время как ответ CD8 Т-клеток памяти был усилены у мышей, инфицированных VSV-GMCSF1 [Ramsburg Е, Publicover J, Buonocore L, et al. A vesicular stomatitis virus recombinant expressing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces enhanced T-cell responses and is highly attenuated for replication in animals. J Virol. 2005 Dec; 79(24): 15043-53. doi: 10.1128/JVI. 79.24.15043-15053.2005]Ramsburg et al describe a recombinant vesicular stomatitis virus (VSV-GMCSF1) expressing high levels of GM-CSF from the first position in the viral genome, which is highly attenuated in terms of viral dissemination and pathogenesis after intranasal delivery to mice. The primary CD8 T cell and neutralizing antibody response to VSV-GMCSF1 is equivalent to that elicited by the GFP-carrying control virus VSV-EGFP1, while the memory CD8 T cell response was enhanced in mice infected with VSV-GMCSF1 [Ramsburg E, Publicover J, Buonocore L, et al. A vesicular stomatitis virus recombinant expressing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces enhanced T-cell responses and is highly attenuated for replication in animals. J Virol. 2005 Dec; 79(24): 15043-53. doi: 10.1128/JVI. 79.24.15043-15053.2005]
В работе Бергман с соавторами описан рекомбинантный реплицирующийся VSV (rrVSV), нацеленный на клетки рака молочной железы, экспрессирующий мышиный GM-CSF. При лечении перитонеальных опухолевых имплантатов клеток D2F2/E2, линии клеток опухоли молочной железы мыши BALB/c нацеленный rrVSV устраняет перитонеальные имплантаты опухоли, экспрессирующей Her2/neu, и вызывает противоопухолевый Т-клеточный иммунологический ответ [Bergman I, Griffin JA, Gao Y, et al. Treatment of implanted mammary tumors with recombinant vesicular stomatitis virus targeted to Her2/neu. Int J Cancer. 2007 Jul 15; 121(2):425-30. doi: 10.1002/ijc.22680].Bergman et al. described a recombinant replicating VSV (rrVSV) targeting breast cancer cells expressing murine GM-CSF. When treating peritoneal tumor implants of D2F2/E2 cells, a mouse mammary tumor cell line BALB/c, targeting rrVSV eliminates peritoneal tumor implants expressing Her2/neu and induces an antitumor T-cell immunological response [Bergman I, Griffin JA, Gao Y, et al. Treatment of implanted mammary tumors with recombinant vesicular stomatitis virus targeted to Her2/neu. Int J Cancer. 2007 Jul 15; 121(2):425-30. doi:10.1002/ijc.22680].
В работе Лемей с соавторами описан рекомбинантный вирус везикулярного стоматита VSV-A51, в который клонирован ген, кодирующий GM-CSF, чтобы усилить иммуностимулирующие свойства онколитического вируса (VSV-A51-GMCSF). VSV-A51-GMCSF предотвращал приживление опухоли B16-F10 у более чем 95% протестированных мышей, однако он не продемонстрировал повышенной эффективности на подкожной модели B16-F10 по сравнению с вирусом VSV-A51-GFP [Lemay CG, Rintoul JL, Kus A, et al. Harnessing oncolytic virus-mediated antitumor immunity in an infected cell vaccine. Mol Ther. 2012 Sep; 20(9): 1791-9. doi: 10.1038/mt.2012.128].The work of Lemay et al described the recombinant vesicular stomatitis virus VSV-A51, into which the gene encoding GM-CSF was cloned to enhance the immunostimulatory properties of the oncolytic virus (VSV-A51-GMCSF). VSV-A51-GMCSF prevented B16-F10 tumor engraftment in more than 95% of mice tested, but it did not demonstrate increased efficacy in the subcutaneous B16-F10 model compared with VSV-A51-GFP virus [Lemay CG, Rintoul JL, Kus A, et al. Harnessing oncolytic virus-mediated antitumor immunity in an infected cell vaccine. Mol Ther. 2012 Sep; 20(9): 1791-9. doi:10.1038/mt.2012.128].
Для создания эффективного онколитика на основе VSV необходимо, с одной стороны, обеспечить безопасность терапии, например, модификацией М гена в геноме VSV или иным способом, а с другой стороны - усилить онколитические свойства вируса и иммуностимулирующий эффект посредством комбинации с одним или более иммуностимулирующими факторами или путем ко-экспрессии генов иммуностимулирующих факторов, встроенных в геном VSV. Следует отметить, что инициация исследований, использующих онколитические вирусы с более чем одним дополнительным геном в геноме говорит о перспективности такого подхода [https://replimune.com/pipeline/, дата обращения 26.12.2022]. Для преодоления опухолевого ингибирующего микроокружения целесообразно задействовать одновременно несколько механизмов иммунного ответа. При этом желательно минимизировать количество генов в геноме VSV для сохранения репликативной активности вируса, что можно сделать с помощью использования химерных конструкций - например IL12-GM-CSF. Модификация VSV должна сохранять цитопатический эффект вируса, а закодированная последовательность химерного гена должна при этом обеспечивать синтез функционального химерного белка. При создании рекомбинантного VSV, который модифицирован иммуностимулирующими факторами, необходимо доказывать эффективность онколитика не только на мышиных моделях с использованием последовательностей генов мыши, но и работоспособность конструкции на клетках человека, чтобы гарантировать эффективность противораковой виротерапии.To create an effective oncolytic based on VSV, it is necessary, on the one hand, to ensure the safety of therapy, for example, by modifying the M gene in the VSV genome or in another way, and on the other hand, to enhance the oncolytic properties of the virus and the immunostimulating effect through combination with one or more immunostimulating factors or by co-expression of genes for immunostimulatory factors integrated into the VSV genome. It should be noted that the initiation of studies using oncolytic viruses with more than one additional gene in the genome indicates the promise of this approach [https://replimune.com/pipeline/, accessed 12/26/2022]. To overcome the tumor inhibitory microenvironment, it is advisable to simultaneously use several mechanisms of the immune response. In this case, it is desirable to minimize the number of genes in the VSV genome to preserve the replicative activity of the virus, which can be done by using chimeric constructs - for example, IL12-GM-CSF. The VSV modification must preserve the cytopathic effect of the virus, and the encoded sequence of the chimeric gene must ensure the synthesis of a functional chimeric protein. When creating a recombinant VSV that is modified with immunostimulating factors, it is necessary to prove the effectiveness of the oncolytic not only in mouse models using mouse gene sequences, but also the performance of the construct on human cells to guarantee the effectiveness of anticancer virotherapy.
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является решение как минимум одной из вышеуказанных в уровне техники проблем.The technical problem to which the present invention is aimed is to solve at least one of the problems mentioned above in the prior art.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Технической решением является использование описанного признаками в пунктах формулы изобретения.The technical solution is to use the features described in the claims.
Одной из возможных технических задач, на решение которой может быть направлено настоящее изобретение, являлось создание средства для иммунотерапии опухолей, в частности создание онколитического вируса, дополнительно экспрессирующего в клетках опухоли цитокины.One of the possible technical problems that the present invention could be aimed at was the creation of a means for immunotherapy of tumors, in particular the creation of an oncolytic virus that additionally expresses cytokines in tumor cells.
Задача может решаться тем, что создан рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, экспрессирующий химерный белок IL12-GMCSF, при этом IL12 и GMCSF в химерном белке соединены посредством аминокислотного линкера.The problem can be solved by creating a recombinant vesicular stomatitis virus expressing the IL12-GMCSF chimeric protein, wherein IL12 and GMCSF in the chimeric protein are connected via an amino acid linker.
В варианте осуществления изобретения химерный белок IL12-GMCSF содержит аминокислотную последовательность SEQ Id No.: 6. В другом варианте осуществления изобретения химерный белок IL12-GMCSF содержит аминокислотную последовательность SEQ Id No.: 7.In an embodiment of the invention, the IL12-GMCSF chimeric protein contains the amino acid sequence of SEQ Id No.: 6. In another embodiment of the invention, the IL12-GMCSF chimeric protein contains the amino acid sequence of SEQ Id No.: 7.
Технический результат может достигаться тем, что рекомбинантный вирус везикулярного стоматита содержит в геноме последовательность SEQ Id No.: 10. В еще одном варианте осуществления изобретения рекомбинантный вирус везикулярного стоматита содержит в геноме последовательность SEQ Id No.: 11The technical result can be achieved in that the recombinant vesicular stomatitis virus contains in the genome the sequence SEQ Id No.: 10. In another embodiment of the invention, the recombinant vesicular stomatitis virus contains in the genome the sequence SEQ Id No.: 11
ФигурыFigures
Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами:The invention is illustrated by the following graphic materials:
На Фиг. 1 представлена структурная карта плазмиды, содержащей последовательность SEQ Id No: 8, для транзиентной (временной) экспрессии генов в клетках млекопитающих.In FIG. 1 shows a structural map of a plasmid containing the sequence SEQ Id No: 8 for transient (temporary) gene expression in mammalian cells.
На Фиг. 2 представлена структурная карта плазмиды, содержащей последовательность SEQ Id No: 9, для транзиентной (временной) экспрессии генов в клетках млекопитающих.In FIG. 2 shows a structural map of a plasmid containing the sequence SEQ Id No: 9 for transient (temporary) gene expression in mammalian cells.
На Фиг. 3 представлена структурная карта плазмиды, содержащей последовательность SEQ Id No: 10, для транзиентной (временной) экспрессии генов в клетках млекопитающих.In FIG. 3 shows a structural map of a plasmid containing the sequence SEQ Id No: 10 for transient (temporary) gene expression in mammalian cells.
На Фиг. 4 представлена структурная карта плазмиды, содержащей последовательность SEQ Id No: 11, для транзиентной (временной) экспрессии генов в клетках млекопитающих.In FIG. 4 shows a structural map of a plasmid containing the sequence SEQ Id No: 11 for transient (temporary) gene expression in mammalian cells.
На Фиг. 5 представлена структурная карта плазмиды pEGFP-N3 для транзиентной (временной) экспрессии гена GFP в клетках млекопитающих.In FIG. Figure 5 shows a structural map of the pEGFP-N3 plasmid for transient (temporary) expression of the GFP gene in mammalian cells.
На Фиг. 6 представлена микрофотография монослоя клеток HEK293TN, трансфицированных плазмидой pEGFP (положительный контроль).In FIG. Figure 6 shows a micrograph of a monolayer of HEK293TN cells transfected with the pEGFP plasmid (positive control).
На Фиг. 7 представлена структурная карта плазмиды pEGFP-N3-mscIL12-mGM-CSF.In FIG. Figure 7 shows a structural map of the plasmid pEGFP-N3-mscIL12-mGM-CSF.
На Фиг. 8 представлена структурная карта плазмиды pVSV-G-GFP-dM51.In FIG. Figure 8 shows a structural map of the pVSV-G-GFP-dM51 plasmid.
На Фиг. 9 представлена структурная карта плазмиды pVSV-G-dM51-mIL12-mGMCSF, содержащей последовательность SEQ ID NO: 15.In FIG. Figure 9 shows a structural map of the plasmid pVSV-G-dM51-mIL12-mGMCSF containing the sequence SEQ ID NO: 15.
На Фиг. 10 представлена визуализация ЦПЭ VSV-mIL12-mGMCSF и конечный титр вируса в кондиционированной культуральной жидкости.In FIG. Figure 10 shows visualization of VSV-mIL12-mGMCSF CPE and the final titer of the virus in the conditioned culture liquid.
На Фиг. 11 представлены результаты подтверждения наличия химерного гена, встроенного в геном VSV-mIL12-mGMCSF с помощью электрофореза в ПААГ и ПЦР.In FIG. 11 presents the results of confirmation of the presence of a chimeric gene inserted into the genome of VSV-mIL12-mGMCSF using PAGE and PCR.
А - фотография ПААГ с образцом неконцентрированного и концентрированного VSV-G-GFP (положительный контроль ПААГ)A - photograph of PAGE with a sample of unconcentrated and concentrated VSV-G-GFP (positive PAGE control)
Б фотография геля с нанесенным концентратом VSV-mIL12-mGMCSF (справа от маркера) и кондиционированной культуральной жидкостью клеток (правее)B photograph of a gel with applied VSV-mIL12-mGMCSF concentrate (to the right of the marker) and conditioned cell culture fluid (to the right)
В - фотография агарозного геля с нанесенными ПЦР-продуктами образцов VSV-mIL12-mGMCSF.B - photograph of an agarose gel with applied PCR products of VSV-mIL12-mGMCSF samples.
На Фиг. 12 представлена диаграмма значений оптической плотности в лунках культурального планшета. Blank фон, DMEM отрицательный контроль (среда DMEM), VSV-GFP - везикуловирус без трансгена, IL12 - положительный контроль (препарат белка IL12), 12 well кондиционированная среда после первой трансфекции в 12-луночном планшете, Т25 кондиционированная среда после второй трансфекции в культуральном флаконе Т25, Т150 - кондиционированная среда после второй трансфекции в культуральном флаконе Т150, ×1 - без разведения, ×0,5 - разведение в 2 раза, хОД - разведение в 10 раз.In FIG. Figure 12 shows a diagram of the optical density values in the wells of a culture plate. Blank background, DMEM negative control (DMEM medium), VSV-GFP - vesiculovirus without transgene, IL12 - positive control (IL12 protein preparation), 12 well conditioned medium after the first transfection in a 12-well plate, T25 conditioned medium after the second transfection in a culture bottle T25, T150 - conditioned medium after the second transfection in a culture bottle T150, ×1 - without dilution, ×0.5 - 2-fold dilution, xOD - 10-fold dilution.
На Фиг. 13 представлены фотографии мышей до (слева) и после (справа) введения VSV-mIL12-mGM-CSF. Место введения отмечено кругом. Наблюдается лизис опухоли, вызванной инъекцией B16F10 клеток.In FIG. Figure 13 shows photographs of mice before (left) and after (right) administration of VSV-mIL12-mGM-CSF. The injection site is marked with a circle. Tumor lysis caused by injection of B16F10 cells is observed.
Детальное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Если не указано иначе, предполагается, что все термины, обозначения и другие научные термины, используемые в данной заявке, имеют значения, которые обычно понимают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. В некоторых случаях определения терминов с общепринятыми значениями приведены в данной заявке для ясности и/или для быстрой справки и понимания, и включение таких определений в настоящее описание не должно истолковываться как наличие существенного отличия значения термина от обычно подразумеваемого в данной области.Unless otherwise indicated, all terms, designations and other scientific terms used in this application are intended to have the meanings commonly understood by those skilled in the art to which the present invention relates. In some cases, definitions of terms with generally accepted meanings are provided in this application for clarity and/or for quick reference and understanding, and the inclusion of such definitions in this specification should not be construed as substantially different in the meaning of the term from that generally understood in the art.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.In addition, unless the context otherwise requires, terms in the singular include plural terms, and plural terms include singular terms. In general, the classification and methods of cell culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics, analytical chemistry, organic synthesis chemistry, medicinal and pharmaceutical chemistry, and hybridization and protein and nucleic acid chemistry described herein are well known to those skilled in the art. widely used in this field. Enzymatic reactions and purification methods are carried out in accordance with the manufacturer's instructions, as is typically carried out in the art, or as described herein.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается вирус везикулярного стоматита, экспрессирующий химерный белок IL12-GMCSF. Термин «экспрессирующий» обозначает, что вирусный геном содержит генетическую конструкцию, которая при инфицировании упомянутым вирусом клеток служит матрицей для трансляции целевого полипептидного, или белкового, продукта. Генетическая конструкция сконструирована и внедрена в геном вируса таким образом, чтобы, с одной стороны, не препятствовать процессу репликации (амплификации) вируса, с другой стороны эффективно экспрессироваться в инфицированной клетке. При этом IL12 и GMCSF в химерном белке соединены посредством аминокислотного линкера.In one embodiment, the present invention provides a vesicular stomatitis virus expressing an IL12-GMCSF chimeric protein. The term “expressing” means that the viral genome contains a genetic construct that, when cells are infected by said virus, serves as a template for translation of the target polypeptide or protein product. The genetic construct is designed and introduced into the genome of the virus in such a way that, on the one hand, it does not interfere with the process of replication (amplification) of the virus, and on the other hand, it is effectively expressed in the infected cell. In this case, IL12 and GMCSF in the chimeric protein are connected via an amino acid linker.
В варианте осуществления изобретения химерный белок IL12-GMCSF содержит аминокислотную последовательность SEQ Id No.: 6. В другом варианте осуществления изобретения химерный белок IL12-GMCSF содержит аминокислотную последовательность SEQ Id No.: 7. Химерные белки, содержащие последовательность SEQ Id No.: 6 или SEQ Id No.: 7, синтезируются в клетках, инфицированных везикуловирусами по настоящему изобретению. При этом химерные белки проявляют свою функциональность, демонстрируя способность активировать компетентные клетки in vitro. Экспериментально показано, что тип и длина линкера не влияют на функциональную активность hIL12 в составе химерного белка с GM-CSF, при этом и уровень экспрессии, и активность hIL12 в клеточном тесте в составе химеры с GM-CSF сопоставимы с уровнем положительных контролей hIL12.In an embodiment of the invention, the IL12-GMCSF chimeric protein contains the amino acid sequence SEQ Id No.: 6. In another embodiment, the IL12-GMCSF chimeric protein contains the amino acid sequence SEQ Id No.: 7. Chimeric proteins containing the sequence SEQ Id No.: 6 or SEQ Id No.: 7, are synthesized in cells infected with the vesiculoviruses of the present invention. In this case, chimeric proteins exhibit their functionality, demonstrating the ability to activate competent cells in vitro. It was experimentally shown that the type and length of the linker do not affect the functional activity of hIL12 as part of the chimeric protein with GM-CSF, while both the expression level and activity of hIL12 in the cell test as part of the chimera with GM-CSF are comparable to the level of hIL12 positive controls.
Технический результат может достигаться тем, что рекомбинантный вирус везикулярного стоматита содержит в геноме последовательность SEQ Id No.: 10. В еще одном варианте осуществления изобретения рекомбинантный вирус везикулярного стоматита содержит в геноме последовательность SEQ Id No.: 11. rVSV, содержащие в геноме последовательность SEQ Id No.: 10 или SEQ Id No.: 11, демонстрируют стабильную экспрессию химерного белка, обладающего цитокиновой активностью.The technical result can be achieved in that the recombinant vesicular stomatitis virus contains in the genome the sequence SEQ Id No.: 10. In another embodiment of the invention, the recombinant vesicular stomatitis virus contains in the genome the sequence SEQ Id No.: 11. rVSVs containing the sequence SEQ in the genome Id No.: 10 or SEQ Id No.: 11 demonstrate stable expression of a chimeric protein having cytokine activity.
Также, in vivo показано, что рекомбинантный вирус везикулярного стоматита по настоящему изобретению обладает выраженной противоопухолевой активностью в животной модели опухолевого ксенотрансплантата. Онколитическая способность рекомбинантного вируса везикулярного стоматита по настоящему изобретению превышала онколитическую способность аналогичного вируса, не экспрессирующего химерный IL12-GMCSF, в 1000 раз.Also, in vivo, the recombinant vesicular stomatitis virus of the present invention has been shown to have significant antitumor activity in an animal tumor xenograft model. The oncolytic ability of the recombinant vesicular stomatitis virus of the present invention exceeded the oncolytic ability of a similar virus not expressing chimeric IL12-GMCSF by 1000 times.
Сущность и промышленная применимость изобретения поясняются следующими примерами:The essence and industrial applicability of the invention are illustrated by the following examples:
Пример 1. Получение плазмид с химерными генами.Example 1. Preparation of plasmids with chimeric genes.
При получении новых плазмид и синтезе конструкций использовали следующие методы, материалы и оборудование. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей применяли программу UniPro UGENE. Трансляцию нуклеотидных последовательностей в аминокислотную проводили при помощи инструмента EMBOSS Transeq [https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/, дата обращения 21.12.2022]. Последовательности генов для модификации генома VSV синтезировали при помощи сервиса TopGenetech (Канада). Клонирование последовательностей, дополнительные модификации проводили с помощью ПЦР и синтезированных in house олигонуклеотидов. При работе с плазмидной ДНК и получение новых плазмид использовали стандартные протоколы генетической инженерии, перечисленные далее. Для трансформации и амплификации плазмид использовали бактериальные штаммы Е. coli (DH5-alpha, NEB® Stable, XLIO-Gold®). Генетическую трансформацию, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, лигирование и гель-электрофорез проводили в стандартных условиях [Green, М. and Sambrook, J. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition, Vol.II, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. Плазмидную ДНК из бактериальных клеток Е. coli и линеаризованные фрагменты ДНК из агарозных гелей выделяли коммерческими наборами «Plasmid Miniprep», «Оеапир Mini» (ЗАО Евроген, Россия) и «Plasmid mini/midi Kits» (QIAGEN Sciences Inc, США). Плазмиды проверяли с помощью рестрикционного анализа и последующего электрофореза в агарозном геле и методом секвенирования по Сэнгеру. Для внесения мутации в последовательности генов использовали методику инвертированной ПЦР (reverse PCR). Полученный ПЦР-продукт вырезали из геля, обрабатывали Т4 полинуклеотид киназой, и самолигировали фрагмент на самого себя. Полученную лигазную смесь использовали для трансформации клеток Е. coli. Для ПЦР-амплификации фрагментов использовали полимеразу Q5 (NEB). Реакционную смесь готовили согласно рекомендациям производителя. Продукты реакции визуализировали и разделяли электрофоретически в 1% агарозном геле. Полученные ПЦР-фрагменты вырезали из геля, выделили и очистили с помощью набора Cleanup Standard (Евроген). Для анализа колоний-трансформантов проводили ПЦР-скрининг на колониях с использованием праймеров для секвенирования и набора Screen mix (Евроген). Реакционную смесь готовили согласно рекомендациям производителя. Продукты реакции визуализировали и разделяли электрофоретически в 1% агарозном геле. Секвенирование по Сэнгеру осуществляли на амплификаторе ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) при стандартных условиях и с использованием реагентов, рекомендованных производителем Applied Biosystems. Олигонуклеотидные последовательности проверяли OligoAnalyzer™ Tool [https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer, дата обращения 21.12.2022]. Длину продукта оценивали с помощью выравнивания на геномную ДНК GRch38/hg38 с помощью Genome Browser [https://genome.ucsc.edu/, дата обращения 21.12.2022].When obtaining new plasmids and synthesizing constructs, the following methods, materials and equipment were used. The UniPro UGENE program was used to align nucleotide sequences. Translation of nucleotide sequences into amino acid sequences was carried out using the EMBOSS Transeq tool [https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/, access date 12/21/2022]. Gene sequences for modifying the VSV genome were synthesized using the TopGenetech service (Canada). Sequence cloning and additional modifications were performed using PCR and in-house synthesized oligonucleotides. When working with plasmid DNA and obtaining new plasmids, standard genetic engineering protocols were used, listed below. Bacterial strains of E. coli (DH5-alpha, NEB® Stable, XLIO-Gold®) were used for transformation and amplification of plasmids. Genetic transformation, restriction endonuclease hydrolysis, ligation and gel electrophoresis were performed under standard conditions [Green, M. and Sambrook, J. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition, Vol.II, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. Plasmid DNA from E. coli bacterial cells and linearized DNA fragments from agarose gels were isolated using commercial kits “Plasmid Miniprep”, “Oeapir Mini” (JSC Evrogen, Russia) and “Plasmid mini/midi Kits” (QIAGEN Sciences Inc, USA). Plasmids were verified by restriction analysis followed by agarose gel electrophoresis and Sanger sequencing. To introduce mutations into gene sequences, the inverted PCR technique was used. The resulting PCR product was excised from the gel, treated with T4 polynucleotide kinase, and the fragment was self-ligated onto itself. The resulting ligase mixture was used to transform E. coli cells. Polymerase Q5 (NEB) was used for PCR amplification of fragments. The reaction mixture was prepared according to the manufacturer's recommendations. The reaction products were visualized and separated electrophoretically in a 1% agarose gel. The resulting PCR fragments were excised from the gel, isolated and purified using the Cleanup Standard kit (Evrogen). To analyze transformant colonies, PCR screening was performed on colonies using sequencing primers and a Screen mix kit (Evrogen). The reaction mixture was prepared according to the manufacturer's recommendations. The reaction products were visualized and separated electrophoretically in a 1% agarose gel. Sanger sequencing was performed on an ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) under standard conditions and using reagents recommended by the manufacturer Applied Biosystems. Oligonucleotide sequences were checked by OligoAnalyzer™ Tool [https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer, accessed 12/21/2022]. Product length was estimated using alignments to GRch38/hg38 genomic DNA using the Genome Browser [https://genome.ucsc.edu/, accessed 12/21/2022].
Для проверки влияния типа линкера и сохранения активности белков в составе химеры, в которой первым компонентом является IL12 создали 4 плазмиды, содержание химеры hIL12-hFlt3L и hIL12-hGM-CSF, где FLT3L - это лиганд fms-подобной тирозинкиназы 3, основного фактора роста дендритных клеток.To test the influence of the type of linker and the preservation of the activity of proteins in the chimera, in which the first component is IL12, 4 plasmids were created, the content of the chimera hIL12-hFlt3L and hIL12-hGM-CSF, where FLT3L is the ligand of fms-like tyrosine kinase 3, the main dendritic growth factor cells.
Для сборки химерного гена hIL12-hFlt3L и hIL12-hGM-CSF использовали последовательности синтезированных генов hFlt3L (SEQ Id No: 1). hIL12 (SEQ Id No: 2), hGM-CSF (SEQ Id No: 3).To assemble the chimeric gene hIL12-hFlt3L and hIL12-hGM-CSF, the sequences of the synthesized hFlt3L genes (SEQ Id No: 1) were used. hIL12 (SEQ Id No: 2), hGM-CSF (SEQ Id No: 3).
В целевых конструкциях использовали классический глицин-сериновый линкер:The target constructs used a classic glycine-serine linker:
- Длинный GGGGS GGGGS GGGGSGGGGS GS (22 АК)- Long GGGGS GGGGS GGGGSGGGGS GS (22 AK)
- Короткий GGGGS GGGGS (10 АК)- Short GGGGS GGGGS (10 AK)
В соответствии с литературными данными более длинный стандартный глицин-сериновый линкер теоретически должен обеспечивать большую подвижность молекул химеры друг относительно друга и соответственно большую биологическую активность химерного белка [Chen X, Zaro JL, Shen WC. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct; 65(10): 1357-69. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.039]. Для оценки влияния длины линкера был также использован более короткий вариант глицин серинового линкера.In accordance with the literature, a longer standard glycine-serine linker should theoretically provide greater mobility of the chimera molecules relative to each other and, accordingly, greater biological activity of the chimeric protein [Chen X, Zaro JL, Shen WC. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct; 65(10): 1357-69. doi:10.1016/j.addr.2012.09.039]. To evaluate the effect of linker length, a shorter version of the glycine serine linker was also used.
Целевые аминокислотные последовательности химерных белков (SEQ Id No: 4) и (SEQ Id No: 5) содержали короткий и длинный линкеры между полипептидом IL12 и Flt3L соответственно.The target amino acid sequences of the chimeric proteins (SEQ Id No: 4) and (SEQ Id No: 5) contained short and long linkers between the IL12 polypeptide and Flt3L, respectively.
Целевые аминокислотные последовательности химерных белков (SEQ Id No: 6) и (SEQ Id No: 7) содержали короткий и длинный линкеры между полипептидом субъединицы IL12 и GM-CSF соответственно.The target amino acid sequences of the chimeric proteins (SEQ Id No: 6) and (SEQ Id No: 7) contained short and long linkers between the IL12 subunit polypeptide and GM-CSF, respectively.
А. Сборку и клонирование последовательности, кодирующей hIL12-hFlt3L с коротким линкером hscIL12-(GS)short-Flt3L проводили по следующей схеме.A. Assembly and cloning of the sequence encoding hIL12-hFlt3L with a short linker hscIL12-(GS)short-Flt3L was carried out according to the following scheme.
1) Проводили ПЦР амплификацию фрагмента гена hIL12 с помощью специфических праймеров:1) PCR amplification of the hIL12 gene fragment was carried out using specific primers:
и выделяли фрагмент размером 1600 п.о.and a 1600 bp fragment was isolated.
2) Проводили ПЦР амплификацию фрагмента гена hFlt3L с помощью специфических праймеров:2) PCR amplification of the hFlt3L gene fragment was carried out using specific primers:
и выделяли фрагмент размером 630 п.о.and a 630 bp fragment was isolated.
3) Проводили отжиг амплифицированных фрагментов друг на друга с последующей ПЦР амплификацией последовательности hscIL12-(GS)short-hFlt3L с использованием праймеров hILl2_Nhel прямой и hFlt3L_XhoI_обратный.3) The amplified fragments were annealed to each other, followed by PCR amplification of the hscIL12-(GS)short-hFlt3L sequence using primers hILl2_Nhel forward and hFlt3L_XhoI_reverse.
4) Проводили встраивание ПЦР продукта (~2200 п.о.) в вектор pEGFP-N3 по сайтам Nhel/Xhol по стандартным методикам рестриктазно-лигазного клонирования.4) The PCR product (~2200 bp) was inserted into the pEGFP-N3 vector at the Nhel/Xhol sites using standard restriction enzyme ligase cloning methods.
5) Проводили анализ полученной конструкции с помощью электрофореза в агарозном геле и секвенированием. Карта полученного вектора представлена на Фиг. 1. Результаты секвенирования подтвердили наличие в векторе целевой последовательности, кодирующей hIL12-(GS)short-hFlt3L (SEQ Id No: 8).5) The resulting construct was analyzed using agarose gel electrophoresis and sequencing. The map of the resulting vector is shown in Fig. 1. Sequencing results confirmed the presence in the vector of the target sequence encoding hIL12-(GS)short-hFlt3L (SEQ Id No: 8).
Б. Сборку и клонирование последовательности, кодирующей hscIL12-hFlt3L с длинным линкером hIL12-(GS)long-hFlt3L проводили по следующей схеме.B. Assembly and cloning of the sequence encoding hscIL12-hFlt3L with the long linker hIL12-(GS)long-hFlt3L was carried out according to the following scheme.
1) Проводили ПЦР амплификацию фрагмента гена hIL12 с помощью специфических праймеров:1) PCR amplification of the hIL12 gene fragment was carried out using specific primers:
и выделяли фрагмент размером 1600 п.о.and a 1600 bp fragment was isolated.
2) Проводили ПЦР амплификацию фрагмента гена hFlt3L с помощью специфических праймеров:2) PCR amplification of the hFlt3L gene fragment was carried out using specific primers:
и выделяли фрагмент размером 630 п.о.and a 630 bp fragment was isolated.
3) Проводили сборку фрагмента, содержащего линкер, с использованием коротких олигонуклеотидов (отжиг)3) The fragment containing the linker was assembled using short oligonucleotides (annealing)
Выделяли целевой фрагмент с последовательностью:The target fragment with the sequence was isolated:
4) Проводили отжиг наработанных трех фрагментов друг на друга (п. 1-3) с последующей ПЦР амплификацей последовательности hscIL12-(GS)long-hFkt3L с использованием праймеров hTL12_NheT прямой и hFlt3L_XhoI_обратный.4) The generated three fragments were annealed to each other (steps 1-3), followed by PCR amplification of the hscIL12-(GS)long-hFkt3L sequence using primers hTL12_NheT forward and hFlt3L_XhoI_reverse.
5) Проводили встраивание ПЦР продукта (~2350 п.о.) в вектор pEGFP-N3 по сайтам Nhel/Xhol по стандартным методикам рестриктазно-лигазного клонирования.5) The PCR product (~2350 bp) was inserted into the pEGFP-N3 vector at the Nhel/Xhol sites using standard restriction enzyme ligase cloning methods.
6) Проводили анализ полученной конструкции с помощью электрофореза в агарозном геле и секвенированием. Карта полученного вектора представлена на Фиг. 2. Результаты секвенирования подтвердили наличие в векторе целевой последовательности, кодирующей hIL12-(GS)long-hFlt3L (SEQ Id No: 9)6) The resulting construct was analyzed using agarose gel electrophoresis and sequencing. The map of the resulting vector is shown in Fig. 2. Sequencing results confirmed the presence in the vector of the target sequence encoding hIL12-(GS)long-hFlt3L (SEQ Id No: 9)
В. Сборку и клонирование последовательности, кодирующей hIL12-hGM-CSF с коротким линкером hscIL12-(GS)short-hGM-CSF проводили по следующей схеме.B. Assembly and cloning of the sequence encoding hIL12-hGM-CSF with a short linker hscIL12-(GS)short-hGM-CSF was carried out according to the following scheme.
1) Проводили ПЦР амплификацию фрагмента гена hIL12 с помощью специфических праймеров:1) PCR amplification of the hIL12 gene fragment was carried out using specific primers:
и выделяли фрагмент размером 1600 п.о.and a 1600 bp fragment was isolated.
2) Проводили ПЦР амплификацию фрагмента гена hGM-CSF с помощью специфических праймеров:2) PCR amplification of the hGM-CSF gene fragment was carried out using specific primers:
и выделяли фрагмент размером 400 п.о.and a 400 bp fragment was isolated.
3) Проводили отжиг наработанных фрагментов друг на друга с последующей ПЦР амплификацей последовательности hscIL12-(GS)short-hGM-CSF с использованием праймеров ML12 Nhel прямой и hGMCSF_XhoI_обратный.3) The generated fragments were annealed to each other, followed by PCR amplification of the hscIL12-(GS)short-hGM-CSF sequence using primers ML12 Nhel forward and hGMCSF_XhoI_reverse.
4) Проводили встраивание ПЦР продукта (~2000 п.о.) в вектор pEGFP-N3 по сайтам Nhel/Xhol по стандартным методикам рестриктазно-лигазного клонирования.4) The PCR product (~2000 bp) was inserted into the pEGFP-N3 vector at the Nhel/Xhol sites using standard restriction enzyme ligase cloning methods.
5) Проводили анализ полученной конструкции с помощью электрофореза в агарозном геле и секвенированием. Карта полученного вектора представлена на Фиг. 3. Результаты секвенирования подтвердили наличие в векторе целевой последовательности, кодирующей hIL12-(GS)short-hGM-CSF (SEQ Id No: 10)5) The resulting construct was analyzed using agarose gel electrophoresis and sequencing. The map of the resulting vector is shown in Fig. 3. Sequencing results confirmed the presence in the vector of the target sequence encoding hIL12-(GS)short-hGM-CSF (SEQ Id No: 10)
Г. Сборку и клонирование последовательности, кодирующей hIL12-hGM-CSF с длинным линкером hIL12-(GS)long-hGM-CSF проводили по следующей схеме.D. Assembly and cloning of the sequence encoding hIL12-hGM-CSF with the long linker hIL12-(GS)long-hGM-CSF was carried out according to the following scheme.
1) Проводили ПЦР амплификацию фрагмента гена hIL12 с помощью специфических праймеров:1) PCR amplification of the hIL12 gene fragment was carried out using specific primers:
и выделяли фрагмент размером 1600 п.о.and a 1600 bp fragment was isolated.
2) Проводили ПЦР амплификацию фрагмента гена hGM-CSF с помощью специфических праймеров:2) PCR amplification of the hGM-CSF gene fragment was carried out using specific primers:
и выделяли фрагмент размером 400 п.о.and a 400 bp fragment was isolated.
3) Проводили сборку фрагмента, содержащего линкер, с использованием коротких олигонуклеотидов (отжиг)3) The fragment containing the linker was assembled using short oligonucleotides (annealing)
Выделяли целевой фрагмент с последовательностью:The target fragment with the sequence was isolated:
4) Проводили отжиг наработанных трех фрагментов друг на друга (п. 1-3) с последующей ПЦР амплификацей последовательности hscIL12-(GS)long-hGM-CSF с использованием праймеров hlLl2_Nhel прямой и hGMCSF_XhoI_обратный.4) The generated three fragments were annealed to each other (steps 1-3), followed by PCR amplification of the hscIL12-(GS)long-hGM-CSF sequence using primers hlLl2_Nhel forward and hGMCSF_XhoI_reverse.
5) Проводили клонирование ПЦР продукта (~2150 п.о.) в вектор pEGFP-N3 по сайтам Nhel/Xhol по стандартным методикам рестриктазно-лигазного клонирования.5) The PCR product (~2150 bp) was cloned into the pEGFP-N3 vector at the Nhel/Xhol sites using standard restriction enzyme ligase cloning methods.
6) Проводили анализ полученной конструкции с помощью электрофореза в агарозном геле и секвенированием. Карта полученного вектора представлена на Фиг. 4. Результаты секвенирования подтвердили наличие в векторе целевой последовательности, кодирующей hscIL12-(GS)long-hGM-CSF (SEQ Id No: 11)6) The resulting construct was analyzed using agarose gel electrophoresis and sequencing. The map of the resulting vector is shown in Fig. 4. Sequencing results confirmed the presence in the vector of the target sequence encoding hscIL12-(GS)long-hGM-CSF (SEQ Id No: 11)
Пример 2. Проведение трансфекции адгезионной клеточной культуры HEK293TNExample 2. Carrying out transfection of adherent cell culture HEK293TN
Для анализа уровня экспрессии химерных белков и их активности проводили трансфекцию клеточной культуры HEK293TN с помощью липофектамина (Lipofectamin 3000 Reagent).To analyze the level of expression of chimeric proteins and their activity, HEK293TN cell culture was transfected using Lipofectamin 3000 Reagent.
В первый день подготавливали клеточную культуру HEK293TN (адгезионная) к трансфекции. Для проведения трансфекции адгезионную клеточную культуру HEK293TN субкультивировали в посевной дозе 1,25⋅104-3,75⋅104 клеток/см2 в полной ростовой среде в течение 3-4 суток до достижения уровня конфлюэнтности 70-90%. Смену среды в культуральных флаконах осуществляли раз в 2-3 дня. Избегали образования монослоя клеток в культуральных флаконах выше 90%. Флакон с клеточной культурой инкубировали в СО2-инкубаторе при температуре (37±1)°С в увлажненном воздухе, содержащем 5% диоксида углерода. Перед проведением трансфекции готовили клеточную суспензию HEK293TN, для этого использовали клетки с одного культурального флакона площадью 25 см2. Клетки HEK293TN, засеянные за 3-4 дня до постановки анализа во флаконы 25 см2 с начальной концентрацией 1,25⋅104-3,75⋅104 клеток/см2 в полной ростовой среде и инкубированные при температуре (37±1)°С в увлажненном воздухе с содержанием углерода диоксида 5%, оценивали визуально под микроскопом. Отбирали с помощью серологической пипетки среду в стерильную центрифужную пробирку вместимостью 50 мл. В культуральный флакон вносили 3 мл раствора PBS, промывали монослой клеток, аккуратно покачивая флакон, находящийся в горизонтальном положении, в течение 3-5 с. Отбирали PBS серологической пипеткой и отбрасывали раствор. Прибавляли в культуральный флакон 1 мл 0,25% раствора трипсина. Помещали культуральный флакон в СО2-инкубатор при температуре (37±1)°С на 2-3 мин. Контролировали отслоение клеток микроскопированием. Останавливали реакцию трипсинизации путем прибавления во флакон ростовой (культуральной) среды, в соотношении (1:4) - 4 мл. Перемешивали клеточную суспензию пипетированием 5 10 раз, не допуская вспенивания. Переносили суспензию в стерильную центрифужную пробирку. Пробирку центрифугировали в течение 5 минут при 200 g. Надосадочную жидкость отбирали стерильной пипеткой и отбрасывали. Прибавляли к клеточному осадку 3-5 мл ростовой (культуральной) среды. Ресуспендировали осадок клеток с помощью стерильной серологической пипетки до получения гомогенной суспензии, отбирали 50 мкл.On the first day, the HEK293TN cell culture (adherent) was prepared for transfection. To carry out transfection, the adherent HEK293TN cell culture was subcultured at a seed dose of 1.25⋅10 4 -3.75⋅10 4 cells/cm 2 in complete growth medium for 3-4 days until a confluence level of 70-90% was achieved. The medium in the culture flasks was changed every 2-3 days. The formation of a monolayer of cells in culture flasks above 90% was avoided. The cell culture bottle was incubated in a CO2 incubator at a temperature of (37±1)°C in humidified air containing 5% carbon dioxide. Before transfection, a HEK293TN cell suspension was prepared using cells from one culture flask with an area of 25 cm2 . HEK293TN cells seeded 3-4 days before analysis into 25 cm 2 vials with an initial concentration of 1.25⋅10 4 -3.75⋅10 4 cells/cm 2 in complete growth medium and incubated at a temperature (37 ± 1) °C in humidified air with a carbon dioxide content of 5%, assessed visually under a microscope. The medium was collected using a serological pipette into a sterile centrifuge tube with a capacity of 50 ml. 3 ml of PBS solution was added to the culture flask, and the cell monolayer was washed by gently shaking the flask in a horizontal position for 3-5 s. PBS was collected using a serological pipette and the solution was discarded. 1 ml of 0.25% trypsin solution was added to the culture flask. The culture flask was placed in a CO 2 incubator at a temperature of (37±1)°C for 2-3 minutes. Cell detachment was monitored by microscopy. The trypsinization reaction was stopped by adding growth (culture) medium to the bottle in a ratio (1:4) - 4 ml. The cell suspension was mixed by pipetting 5–10 times, avoiding foaming. The suspension was transferred to a sterile centrifuge tube. The tube was centrifuged for 5 minutes at 200 g. The supernatant was collected with a sterile pipette and discarded. 3-5 ml of growth (culture) medium was added to the cell sediment. The cell sediment was resuspended using a sterile serological pipette until a homogeneous suspension was obtained, and 50 μl was collected.
Далее проводили трансфекцию клеток по протоколу, рекомендованному производителем, следующими плазмидами:Next, cells were transfected according to the protocol recommended by the manufacturer with the following plasmids:
Для оценки влияния длины линкера на экспрессию и функциональную активность проводили трансфекцию клеток плазмидами:To assess the effect of linker length on expression and functional activity, cells were transfected with plasmids:
- pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkS (короткий линкер)- pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkS (short linker)
- pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkL (длинный линкер)- pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkL (long linker)
- pEGFP-hFLT3L в качестве положительного контроля экспрессии- pEGFP-hFLT3L as a positive expression control
Для оценки экспрессии и функциональной активности химеры hIL-12-hGM-CSF проводили трансфекцию клеток плазмидами:To assess the expression and functional activity of the hIL-12-hGM-CSF chimera, cells were transfected with plasmids:
- pEGFP-N3-hscIL12-hGM-CSFlinkS (короткий линкер)- pEGFP-N3-hscIL12-hGM-CSFlinkS (short linker)
- pEGFP-N3-hscIL12-hGM-CSFlinkL (длинный линкер)- pEGFP-N3-hscIL12-hGM-CSFlinkL (long linker)
- pEGFP_hIL12 - в качестве положительного контроля экспрессии.- pEGFP_hIL12 - as a positive expression control.
- В качестве отрицательного контроля использовали нетрансфицированные клетки.- Untransfected cells were used as a negative control.
- В качестве положительного контроля трансфекции проводили трансфекцию вектором pEGFPN3 (Фиг. 5)- As a positive transfection control, transfection with the pEGFPN3 vector was performed (Fig. 5)
К клеткам HEK293TN с 1 мл среды DMEM+2mM L-Gln+2%FBS добавляли трансфицирующие растворы либо негативный контроль трансфекции по каплям. Перемешивали планшет с помощью покачиваний в горизонтальном положении крест-накрест, переносили в инкубатор для культивирования при температуре (37±1)°С в увлажненном воздухе с содержанием углерода диоксида 5%.Transfection solutions or a negative transfection control were added dropwise to HEK293TN cells with 1 ml of DMEM+2mM L-Gln+2%FBS medium. The plate was mixed by shaking in a horizontal position crosswise, and transferred to an incubator for cultivation at a temperature of (37 ± 1) ° C in humidified air with a carbon dioxide content of 5%.
Схема использованных вариантов трансфицирующих смесей представлена в Таблице 1.The scheme of the transfection mixtures used is presented in Table 1.
Через 24 часа после проведения трансфекции для оценки эффективности трансфекции проводили микроскопирование лунок культурального планшета с помощью флуоресцентного микроскопа. Пример фотографии клеточного монослоя в лунках с положительным контролем эффективности трансфекции представлен на Фиг. 6.24 hours after transfection, microscopy of the wells of the culture plate was performed using a fluorescent microscope to assess the efficiency of transfection. An example photograph of a cell monolayer in wells with a positive control for transfection efficiency is shown in Fig. 6.
При заданных условиях трансфекции через 24 часа подтверждали эффективность трансфекции тем, что наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа наличие флуоресценции белка GFP в лунке положительного контроля трансфекции и отсутствие схожего уровня флуоресценции в лунках со всеми исследуемыми образцами.Under the given transfection conditions, after 24 hours, the efficiency of transfection was confirmed by observing using a fluorescence microscope the presence of GFP protein fluorescence in the well of the positive transfection control and the absence of a similar level of fluorescence in the wells with all the studied samples.
Кондиционированную культуральную жидкость трансфицированной клеточной культуры HEK293TN отбирали и, при необходимости, закладывали на хранение при температуре 80°С или сразу использовали для анализа методом ИФА и на репортерной клеточной линии.The conditioned culture fluid of the transfected HEK293TN cell culture was collected and, if necessary, stored at 80°C or immediately used for ELISA and reporter cell line analysis.
Пример 3. Определение наличия IL-12 человека в кондиционированной культуральной жидкости клеточной линии HEK293TN.Example 3. Determination of the presence of human IL-12 in the conditioned culture liquid of the HEK293TN cell line.
Определение наличия hFLT3L и hIL-12 человека в кондиционированной культуральной жидкости клеточной линии HEK293TN через 24 часа после трансфекции химерными плазмидами pEGFP-hscIL12-hFLT3L и pEGFP-hscIL12-GMCSF с разными вариантами длины линкеров в сравнении с pEGFP-hFLT3L и pEGFP-hIL12 и дополнительными положительными контролями ИФА (стандарт hFLT3L и стандарт hIL12) проводили по методикам, рекомендованным производителями наборов RayBio Human Flt3L ELISA kit (RayBiotech, cat# ELH-FLT3L) и «Human IL-12 p70 Uncoated ELISA Kit» (Invivogen, cat# 88-7126-22) соответственно.Determination of the presence of human hFLT3L and hIL-12 in the conditioned culture liquid of the HEK293TN cell line 24 hours after transfection with chimeric plasmids pEGFP-hscIL12-hFLT3L and pEGFP-hscIL12-GMCSF with different linker lengths in comparison with pEGFP-hFLT3L and pEGFP-hIL12 and additional positive ELISA controls (hFLT3L standard and hIL12 standard) were carried out according to the methods recommended by the manufacturers of the RayBio Human Flt3L ELISA kit (RayBiotech, cat# ELH-FLT3L) and the “Human IL-12 p70 Uncoated ELISA Kit” (Invivogen, cat# 88-7126 -22) respectively.
Целью экспериментов былоThe purpose of the experiments was
А) измерить оптическую плотность (OD, от англ. optical density) исследуемых образцов кондиционированной культуральной жидкости, отобранных через 24 часа после трансфекции клеточной культуры плазмидами с химерными белками и с разными вариантами длины линкеров pEGFP-hscIL12-hFLT3L, pEGFP-hscIL12-GMCSF;A) measure the optical density (OD, from English optical density) of the studied samples of conditioned culture liquid, selected 24 hours after transfection of the cell culture with plasmids with chimeric proteins and with different length options for linkers pEGFP-hscIL12-hFLT3L, pEGFP-hscIL12-GMCSF;
Б) сравнить OD со средним значением OD негативного контроля трансфекции (NC), со средним значением OD положительного контроля ИФА (стандарт hFLT3L, стандарт hIL12,) и средним OD положительного контроля экспресии pEGFP-hFLT3L и pEGFP-hIL12.B) compare OD with the average OD of the negative transfection control (NC), with the average OD of the positive control ELISA (standard hFLT3L, standard hIL12), and the average OD of the positive control expression of pEGFP-hFLT3L and pEGFP-hIL12.
Результаты дополнительных экспериментов определения hFLT3L:Results of additional experiments determining hFLT3L:
- определено наличие hFLT3L человека в образцах кондиционированной культуральной жидкости положительного контроля экспрессии hFLT3L через 24 часа после трансфекции плазмидой pEGFP hFLT3L клеточной культуры HEK293TN, сопоставимое с положительным контролем hFLT3L (относительная разница составляет 9,81%);- the presence of human hFLT3L was determined in samples of conditioned culture liquid of the positive control for hFLT3L expression 24 hours after transfection of the HEK293TN cell culture with the pEGFP hFLT3L plasmid, comparable to the positive control hFLT3L (the relative difference is 9.81%);
- определено наличие hFLT3L человека в образцах кондиционированной культуральной жидкости через 24 часа после трансфекции химерными плазмидами pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkS и pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkL в количестве большем, чем в отрицательном контроле трансфекции: относительная разница составляет 33,46% и 34,92% соответственно, но меньшем, чем в положительном контроле hFLT3L: относительная разница составляет 50,27% и 51,36% соответственно;- the presence of human hFLT3L in samples of conditioned culture liquid was determined 24 hours after transfection with chimeric plasmids pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkS and pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkL in an amount greater than in the negative transfection control: the relative difference is 33.46% and 34.92% respectively, but less than in the hFLT3L positive control: the relative difference is 50.27% and 51.36%, respectively;
- относительная разница по сигналу OD для исследуемых образцов химерных плазмид с разной длиной линкера (коротким и длинным) различается несущественно и составляет 2,23%.- the relative difference in the OD signal for the studied samples of chimeric plasmids with different linker lengths (short and long) differs insignificantly and amounts to 2.23%.
Таким образом, в составе двух типов химерных белков ген hFLT3L экспрессируется, включение Flt3 в состав химеры с hIL12 приводит к более низким значениям уровня экспрессии (относительная разница с положительным контролем трансфекции ~50%), но при этом тип линкера не влияет на уровень экспрессии hFLT3L в составе химеры с hIL12.Thus, the hFLT3L gene is expressed in two types of chimeric proteins; the inclusion of Flt3 in the chimera with hIL12 leads to lower expression levels (relative difference with the positive transfection control ~50%), but the type of linker does not affect the expression level of hFLT3L as part of a chimera with hIL12.
С другой стороны, проверили уровень экспрессии hIL-12 в составе двух типов химер:On the other hand, we checked the expression level of hIL-12 in two types of chimeras:
- определено наличие hIL12 в образцах кондиционированной культуральной жидкости положительного контроля экспрессии РС1 через 24 часа после трансфекции плазмидой pEGFP hscIL12 клеточной культуры HEK293TN;- the presence of hIL12 was determined in samples of conditioned culture liquid of the positive control for PC1 expression 24 hours after transfection of the HEK293TN cell culture with the pEGFP hscIL12 plasmid;
- определено наличие hIL12 в образцах кондиционированной культуральной жидкости через 24 часа после трансфекции химерными плазмидами pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkS HpEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkLB количестве большем, чем в отрицательном контроле трансфекции, но меньшем, чем в положительном контроле экспрессии - относительная разница по средним значениям OD составляет 62,18% и 68,84% от уровня положительного контроля соответственно;- the presence of hIL12 in samples of conditioned culture liquid was determined 24 hours after transfection with chimeric plasmids pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkS HpEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkLB in an amount greater than in the negative transfection control, but less than in the positive expression control - relative difference in average OD values is 62.18% and 68.84% of the positive control level, respectively;
- относительная разница по сигналу OD для исследуемых образцов химерных плазмид между собой pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkS и pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkL составляет 21,39%.- the relative difference in the OD signal for the studied samples of chimeric plasmids between pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkS and pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkL is 21.39%.
- также определено наличие hIL12 в образцах кондиционированной культуральной жидкости через 24 часа после трансфекции химерными плазмидами pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkS и pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkL в количестве сопоставимом с положительным контролем экспрессии РС1, относительная разница с которым составляет 0,71% и 2,52% соответственно. При этом относительная разница по сигналу OD для исследуемых образцов кондиционированной культуральной жидкости химерных плазмид pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkS и pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkL между собой составляет 1,76%, то есть различия незначительны.- the presence of hIL12 in samples of conditioned culture liquid was also determined 24 hours after transfection with chimeric plasmids pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkS and pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkL in an amount comparable to the positive control for PC1 expression, the relative difference with which is 0.71% and 2.52 % respectively. At the same time, the relative difference in the OD signal for the studied samples of conditioned culture liquid of the chimeric plasmids pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkS and pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkL among themselves is 1.76%, that is, the differences are insignificant.
Таким образом, в составе двух типов химерных белков ген hIL12 экспрессируется, однако уровень его экспрессии по ИФА зависит от второго гена в составе химеры: добавление GM-CSF не сказывается на уровне экспрессии hLL12, в то время как при включении Flt3L в состав химеры уровень экспрессии демонстрирует более низкие значения (относительная разница ~60-70%).Thus, in the composition of two types of chimeric proteins, the hIL12 gene is expressed, but its expression level according to ELISA depends on the second gene in the chimera: the addition of GM-CSF does not affect the expression level of hLL12, while when Flt3L is included in the chimera, the expression level shows lower values (relative difference ~60-70%).
При этом тип линкера не влияет на уровень экспрессии IL12 в составе химеры с GM-CSF, в то время как в составе с Flt3L использование длинного линкера приводит к более низкому уровню экспрессии IL12 (относительная разница ~21%.).At the same time, the type of linker does not affect the level of IL12 expression in the chimera with GM-CSF, while in the composition with Flt3L, the use of a long linker leads to a lower level of IL12 expression (relative difference ~21%).
Пример 4. Оценка активности IL-12 в кондиционированной культуральной жидкости после трансфекции клеточной линии HEK293TNExample 4. Evaluation of IL-12 activity in conditioned culture fluid after transfection of the HEK293TN cell line
Активность hIL-12 в кондиционированной культуральной жидкости клеточной линии HEK293TN через 24 часа после трансфекции химерными плазмидами pEGFP-hscIL12-hFLT3L и pEGFP-hscIL12-GMCSF с разными вариантами длины линкеров в сравнении с pEGFP-hscIL12 и положительным контролем (стандарт hIL12) проверяли с использованием репортерной клеточной линии HEK-Blue™ IL-12 (InvivoGen).The activity of hIL-12 in the conditioned culture liquid of the HEK293TN cell line 24 hours after transfection with chimeric plasmids pEGFP-hscIL12-hFLT3L and pEGFP-hscIL12-GMCSF with different linker lengths in comparison with pEGFP-hscIL12 and a positive control (hIL12 standard) was tested using HEK-Blue™ IL-12 reporter cell line (InvivoGen).
Конечной целью эксперимента было измерение OD исследуемых образцов отобранных через 24 часа после трансфекции, сравнение со средним значением OD клеточного контроля, сравнение со средним значением OD положительного контроля (hIL12 1000, 100, 10 нг/мл) с помощью расчета относительной разницы по средним значениям OD Δ, %.The final goal of the experiment was to measure the OD of the test samples taken 24 hours after transfection, compare with the average OD value of the cell control, compare with the average OD value of the positive control (hIL12 1000, 100, 10 ng/ml) by calculating the relative difference according to the average OD values Δ, %.
Ход эксперимента: использовали следующий состав среды роста клеток: DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л, 2 мМ L-глутамина, 10% FBS, 100 мкг/мл Normocin.Procedure of the experiment: the following composition of the cell growth medium was used: DMEM with a glucose content of 4.5 g/l, 2 mM L-glutamine, 10% FBS, 100 μg/ml Normocin.
Для разморозки и культивирования репортерной клеточной культуры HEK-Blue™ IL-12 криопробирку с клетками адгезионной клеточной культуры HEK-Blue™ IL-12, извлеченную из криохранилища с жидким азотом, помещали в водяную баню с температурой (37±1)°С на 1-2 минуты. В стерильную пластиковую коническую центрифужную пробирку вместимостью 15 мл вносили 9 мл предварительно нагретой до (37±1)°С среды роста, переносили в нее содержимое криопробирки с клетками. Центрифугировали пробирку при 200 g в течение 5 мин. Сливали надосадочную жидкость, прибавляли 5 мл предварительно нагретой до (37±1)°С среды роста, ресуспендировали осадок с помощью стерильной серологической пипетки. Переносили полученную клеточную суспензию в культуральный флакон площадью 25 см2, добавляли в него 5-7 мл среды роста. Культуральный флакон с клеточной культурой культивировали в течение 2-3 суток в СО2-инкубаторе при температуре (37±1)°С в увлажненном воздухе с содержанием диоксида углерода 5% до достижения конфлюэнтности монослоя 70-80%, смену среды осуществляли 2 раза в неделю.To defrost and cultivate the HEK-Blue™ IL-12 reporter cell culture, a cryovial with cells of the HEK-Blue™ IL-12 adhesion cell culture, removed from cryostorage with liquid nitrogen, was placed in a water bath with a temperature of (37 ± 1) °C at 1 -2 minutes. 9 ml of growth medium preheated to (37±1)°C was added to a sterile plastic conical centrifuge tube with a capacity of 15 ml, and the contents of the cryovial with cells were transferred into it. The tube was centrifuged at 200 g for 5 minutes. The supernatant liquid was drained, 5 ml of growth medium preheated to (37±1)°C was added, and the sediment was resuspended using a sterile serological pipette. The resulting cell suspension was transferred into a culture flask with an area of 25 cm2 , and 5-7 ml of growth medium was added to it. The culture flask with the cell culture was cultivated for 2-3 days in a CO 2 incubator at a temperature of (37±1)°C in humidified air with a carbon dioxide content of 5% until a monolayer confluency of 70-80% was achieved; the medium was changed 2 times per week.
Пересев клеток осуществляли при достижении конфлюэнтности не менее 70-80%, не допуская образование монослоя клеток со 100% конфлюэнтностью. Для пересева из культурального флакона отбирали с помощью серологической пипетки культуральную среду в стерильную центрифужную пробирку вместимостью 50 мл, в культуральный флакон вносили 3 мл раствора Версена или PBS, промывали монослой клеток аккуратно покачивая флакон, находящийся в горизонтальном положении, в течение 3-5 с. Помещали культуральный флакон в СО2-инкубатор при температуре (37±1)°С на 2 3 мин. Контролировали отслоение клеток микроскопированием. Перемешивали клеточную суспензию пипетированием 5-10 раз, не допуская вспенивания. Переносили суспензию в стерильную центрифужную пробирку. Пробирку центрифугировали в течение 5 минут при 200 g. Надосадочную жидкость отбирали стерильной пипеткой и отбрасывали. Прибавляли к клеточному осадку 3-5 мл среды роста. Ресуспендировали осадок клеток с помощью стерильной серологической пипетки до получения гомогенной суспензии, прибавляли к клеточной суспензии необходимый объем среды роста, предварительно нагретой до (37±1) С, для получения посевной дозы 2,4-105 клеток/см2 или 1,2-106 клеток/мл. Вносили 5 мл клеточной суспензии в культуральный флакон площадью 25 см2. Флакон с клеточной культурой инкубировали в СО2-инкубаторе при температуре (37±1)°С в увлажненном воздухе, содержащем 5% диоксида углерода. Пересев клеточной культуры производили через каждые 2 3 дня при достижении уровня конфлюэнтности монослоя 70-80%.Reseeding of cells was carried out when a confluency of at least 70-80% was achieved, preventing the formation of a monolayer of cells with 100% confluency. For subculture, the culture medium was taken from the culture flask using a serological pipette into a sterile centrifuge tube with a capacity of 50 ml, 3 ml of Versene solution or PBS was added to the culture flask, and the cell monolayer was washed by gently shaking the bottle in a horizontal position for 3-5 s. The culture flask was placed in a CO 2 incubator at a temperature of (37±1)°C for 2–3 minutes. Cell detachment was monitored by microscopy. The cell suspension was mixed by pipetting 5-10 times, avoiding foaming. The suspension was transferred into a sterile centrifuge tube. The tube was centrifuged for 5 minutes at 200 g. The supernatant was collected with a sterile pipette and discarded. 3-5 ml of growth medium was added to the cell sediment. The cell sediment was resuspended using a sterile serological pipette until a homogeneous suspension was obtained, the required volume of growth medium, preheated to (37±1) C, was added to the cell suspension to obtain a seed dose of 2.4-105 cells/ cm2 or 1.2- 106 cells/ml. 5 ml of cell suspension was added to a culture flask with an area of 25 cm2 . The cell culture bottle was incubated in a CO 2 incubator at a temperature of (37±1)°C in humidified air containing 5% carbon dioxide. The cell culture was reseeded every 2-3 days when the monolayer confluency level reached 70-80%.
Первые два пересева проводили без использования селективных антибиотиков. Затем прибавляли антибиотик и добавки к клеточной культуре до конечной концентрации 100 мкг/мл Normocin, 1×HEK-Blue™ Selection.The first two subcultures were carried out without the use of selective antibiotics. Antibiotic and cell culture supplements were then added to a final concentration of 100 µg/ml Normocin, 1×HEK-Blue™ Selection.
Для приготовления Test Medium использовали среду для роста клеток DMEM с содержанием 4,5 г/л глюкозы, 10%, эмбриональной бычьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина.Test Medium was prepared using DMEM cell growth medium containing 4.5 g/L glucose, 10% fetal bovine serum and 2 mM L-glutamine.
При подготовке суспензии клеток HEK-Blue™ I клетки, пересеянные за 2 дня до постановки анализа во флаконы 25 см2 с начальной концентрацией 2,4-105 клеток/см2 или 1,2⋅106 клеток/мл и инкубированные при температуре (37±1)°С в увлажненном воздухе с содержанием СО2 5%, оценивали визуально под микроскопом. Отбирали с помощью серологической пипетки среду в стерильную центрифужную пробирку вместимостью 50 мл, в культуральный флакон вносили 3 мл раствора PBS, промывали монослой клеток аккуратно покачивая флакон. Помещали культуральный флакон в СО2-инкубатор при температуре (37±1)°С на 2-3 мин. Контролировали отслоение клеток микроскопированием. Перемешивали клеточную суспензию пипетированием 5-10 раз, не допуская вспенивания. Переносили суспензию в стерильную центрифужную пробирку. Пробирку центрифугировали в течение 5 минут при 200 g. Надосадочную жидкость отбирали стерильной пипеткой и отбрасывали. Прибавляли к клеточному осадку 3-5 мл Test Medium. Ресуспендировали осадок клеток с помощью стерильной серологической пипетки до получения гомогенной суспензии, отбирали 50 мкл суспензии, смешивали с эквивалентным объемом трипанового синего 0,4%, определяли концентрацию и жизнеспособность клеток в камере Горяева в процентах. Для анализа использовали суспензию с жизнеспособностью клеток не менее 90%. Готовили суспензию клеток с концентрацией (2,8±0,1)⋅105 клеток/мл в Test Medium из расчета 11 мл суспензии для заполнения одного культурального планшета.When preparing a suspension of HEK-Blue™ I cells, cells were seeded 2 days before the analysis into 25 cm 2 vials with an initial concentration of 2.4-10 5 cells/cm 2 or 1.2⋅10 6 cells/ml and incubated at a temperature ( 37±1)°C in humidified air with a CO 2 content of 5%, assessed visually under a microscope. Using a serological pipette, the medium was taken into a sterile centrifuge tube with a capacity of 50 ml, 3 ml of PBS solution was added to the culture flask, and the cell monolayer was washed by gently shaking the bottle. The culture flask was placed in a CO 2 incubator at a temperature of (37±1)°C for 2-3 minutes. Cell detachment was monitored by microscopy. The cell suspension was mixed by pipetting 5-10 times, avoiding foaming. The suspension was transferred into a sterile centrifuge tube. The tube was centrifuged for 5 minutes at 200 g. The supernatant was collected with a sterile pipette and discarded. 3-5 ml of Test Medium was added to the cell sediment. The cell sediment was resuspended using a sterile serological pipette until a homogeneous suspension was obtained, 50 μl of the suspension was taken, mixed with an equivalent volume of trypan blue 0.4%, and the concentration and viability of cells in the Goryaev chamber were determined as a percentage. A suspension with a cell viability of at least 90% was used for analysis. A cell suspension was prepared with a concentration of (2.8±0.1) ⋅105 cells/ml in Test Medium at the rate of 11 ml of suspension to fill one culture plate.
При проведении анализа содержания IL-12 в кондиционированной культуральной жидкости для приготовления положительного контроля IL-12k 10 мкг человеческого IL-12 во флакон прибавляли 50 мкл раствора 0,1% стерильного BSA. Конечная концентрация стокового раствора IL-12 N1 - 0,2 мг/мл. Положительный контроль IL-12 использовали в рабочей концентрации 10 нг/мл, 100 нг/мл, 1 мкг/мл.When analyzing the content of IL-12 in conditioned culture liquid, to prepare a positive control for IL-12k, 10 μg of human IL-12 was added to the vial in 50 μl of a solution of 0.1% sterile BSA. The final concentration of the IL-12 N1 stock solution is 0.2 mg/ml. Positive control IL-12 was used at working concentrations of 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 μg/ml.
Для приготовления негативных контролей активации клеточной линии 1, 2 - в стерильной микропробирке разводили TNFa в Test Medium до концентрации 100 и 10 нг/мл.To prepare negative controls for activation of cell lines 1, 2, TNFa was diluted in Test Medium to a concentration of 100 and 10 ng/ml in a sterile microtube.
В качестве неспецифичных контролей 1 и 2 использовали образцы кондиционированной культуральной жидкости, не содержащие IL12.Samples of conditioned culture fluid that did not contain IL12 were used as nonspecific controls 1 and 2.
Для приготовления исследуемых образцов испытуемые образцы кондиционированной культуральной жидкости после трансфекции размораживали и разводили в Test Medium в 10 раз.To prepare the test samples, the test samples of conditioned culture liquid after transfection were thawed and diluted in Test Medium 10 times.
В 96-луночный плоскодонный культуральный планшет (планшет А) вносили исследуемые и контрольные образцы в тройной повторности по 20 мкл на лунку. Готовую клеточную суспензию HEK-Blue™ IL-12 с концентрацией (2,8±0,1)-105 клеток/мл с жизнеспособностью не менее 90% вносили по 180 мкл в лунки B2-G10 культурального планшета. Культуральный планшет переносили на шейкер для планшетов и перемешивали со скоростью 600 об/мин при комнатной температуре в течение 1-2 мин. После этого культуральный планшет помещали в СО2-инкубатор, и инкубировали при температуре (37±1)°С в увлажненном воздухе с 5% СО2 в течение 16-20 ч.Test and control samples were added in triplicate, 20 μl per well, into a 96-well flat-bottomed culture plate (plate A). The finished HEK-Blue™ IL-12 cell suspension with a concentration of (2.8±0.1)-105 cells/ml with a viability of at least 90% was added in 180 μl to wells B2-G10 of a culture plate. The culture plate was transferred to a plate shaker and mixed at 600 rpm at room temperature for 1–2 min. After this, the culture plate was placed in a CO 2 incubator and incubated at a temperature of (37 ± 1) ° C in humidified air with 5% CO 2 for 16-20 hours.
В новый 96-луночный плоскодонный культуральный планшет В вносили по 180 мкл реактива QUANTI-Blue (Invitrogen, США). Из инкубированного в течение 16-20 ч культурального планшета с клетками отбирали по 20 мкл кондиционированной культуральной жидкости и вносили их в планшет В. Культуральный планшет В помещали в СО2-инкубатор и инкубировали при температуре (37±1)°С в увлажненном воздухе с 5% СО2 в течение 15 мин - 6 ч.180 μl of QUANTI-Blue reagent (Invitrogen, USA) was added to a new 96-well flat-bottomed culture plate B. From a culture plate with cells incubated for 16-20 hours, 20 μl of conditioned culture liquid was taken and added to plate B. Culture plate B was placed in a CO 2 incubator and incubated at a temperature of (37 ± 1) ° C in humidified air with 5% CO 2 for 15 minutes - 6 hours.
Оптическую плотность в лунках культурального планшета В измеряли при помощи прибора для считывания оптической плотности в OD при длине волны 620-655 нм.The optical density in the wells of culture plate B was measured using an OD optical density reader at a wavelength of 620-655 nm.
С помощью программного обеспечения Excel вычисляли среднее значение по трем повторам OD для контрольных и исследуемых образцов, RSD OD %, вычисляли отношение оптической плотности исследуемых и контрольных образцов.Using Excel software, we calculated the average value for three repetitions of OD for the control and test samples, RSD OD%, and calculated the ratio of the optical density of the test and control samples.
Полученные результаты:Results:
А) Содержание функционального hIL12 в образце кондиционированной культуральной жидкости после трансфекции химерной плазмидой pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkS было сопоставимо с положительным контролем hIL12 (в концентрации 10 нг/мл) и было больше, чем в кондиционированной культуральной жидкости после трансфекции химерной плазмидой pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkL. Оказалось, что замена длинного линкера на более короткий в случае химеры hIL12-hFLT3L позволяет повысить количество активного IL12 в более чем 4 раза и приблизить его уровень к уровню положительного контроля, относительная разница конструкций с коротким и длинным линкером при сравнении с положительным контролем составляет - 7,95 и 37,5% соответственно). Эти данные хорошо согласуются с данными ИФА (см. Пример 3), по которым уровень экспрессии ML12 в составе конструкции hIL12-hFLT3 в случае с длинным линкером был на 20% ниже, чем с коротким линкером.A) The content of functional hIL12 in a sample of conditioned culture fluid after transfection with the chimeric plasmid pEGFP-hscIL12-hFLT3LlinkS was comparable to the hIL12 positive control (at a concentration of 10 ng/ml) and was higher than in the conditioned culture fluid after transfection with the chimeric plasmid pEGFP-hscIL12- hFLT3LlinkL. It turned out that replacing a long linker with a shorter one in the case of the hIL12-hFLT3L chimera makes it possible to increase the amount of active IL12 by more than 4 times and bring its level closer to the level of the positive control; the relative difference between constructs with a short and long linker when compared with the positive control is - 7 .95 and 37.5% respectively). These data are in good agreement with ELISA data (see Example 3), according to which the level of ML12 expression in the hIL12-hFLT3 construct in the case of a long linker was 20% lower than with a short linker.
Б) Функциональный hIL12 содержится в образце кондиционированной культуральной жидкости клеток линии HEK293TN через 24 часа после трансфекции химерными плазмидами с разными вариантами длины линкеров pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkS и pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkL в количестве сопоставимом с положительным контролем hIL12 в концентрации 100 нг/мл, относительная разница незначительна и составляет 4,91% и 2,58%. Функциональный hIL12 содержится в образцах кондиционированной культуральной жидкости клеток линии HEK293TN через 24 часа после трансфекции химерными плазмидами pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkS и pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkL, что сопоставимо с образцом препарата монобелка IL12 (стандарт IL12), относительная разница составляет 0,81% и 1,62% соответственно. Результаты экспериментов полностью согласуются с данными ИФА: тип линкера не влияет на функциональную активность hIL12 в составе химерного белка с GM-CSF, при этом и уровень экспрессии, и активность hIL12 в клеточном тесте в составе химеры с GM-CSF сопоставимы с уровнем положительных контролей hIL12.B) Functional hIL12 is contained in a sample of conditioned culture fluid of HEK293TN cells 24 hours after transfection with chimeric plasmids with different linker lengths pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkS and pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkL in an amount comparable to the hIL12 positive control at a concentration of 100 ng/ml, the relative difference is insignificant and amounts to 4.91% and 2.58%. Functional hIL12 is contained in samples of conditioned culture fluid of HEK293TN cells 24 hours after transfection with chimeric plasmids pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkS and pEGFP-hscIL12-GMCSFlinkL, which is comparable to the sample of IL12 monoprotein preparation (IL12 standard), the relative difference is 0.81% and 1.62% respectively. The experimental results are fully consistent with ELISA data: the type of linker does not affect the functional activity of hIL12 as part of the chimeric protein with GM-CSF, while both the expression level and activity of hIL12 in the cell test as part of the chimera with GM-CSF are comparable to the level of hIL12 positive controls .
При этом конструкции hIL12-GM-CSF не только обеспечивают сохранение функциональной активности hIL12, но и демонстрируют уровень экспрессии hIL12 на уровне положительного контроля ЫЫ2 в концентрации 100 нг/мл, что в 10 раз выше, чем в случае использование химеры hIL12-hFlt3L.At the same time, the hIL12-GM-CSF constructs not only ensure the preservation of the functional activity of hIL12, but also demonstrate the level of hIL12 expression at the level of the positive control LI2 at a concentration of 100 ng/ml, which is 10 times higher than in the case of using the hIL12-hFlt3L chimera.
Пример 5. Создание конструкции mI112-mGM-CSF для наработки и проверки VSV.Example 5. Creation of the mI112-mGM-CSF design for development and testing of VSV.
Для проверки активности химеры IL12-GM-CSF в составе рекомбинантного VSV и последующих экспериментов создали генетическую конструкцию (коровый вектор), содержащий последовательности генов mIL12 и mGM-CSF мыши, для возможности в дальнейшем проводить проверку эффективности и безопасности вектора на сингенных мышиных моделях, например, мышах Balb/c или C57BL/6 с опухолевым трансплантатом мышиных опухолевых клеток, например B16F10 - культура меланомы или других.To test the activity of the IL12-GM-CSF chimera as part of the recombinant VSV and subsequent experiments, a genetic construct (core vector) was created containing the sequences of the mouse mIL12 and mGM-CSF genes, to be able to further test the effectiveness and safety of the vector in syngeneic mouse models, for example , Balb/c or C57BL/6 mice with a tumor transplant of mouse tumor cells, for example B16F10 - melanoma culture or others.
Для сборки химерного гена mIL12-mGM-CSF использовали последовательности синтезированных генов mIL12 (SEQ Id No: 12), mGM-CSF (SEQ Id No: 13).To assemble the chimeric gene mIL12-mGM-CSF, the sequences of the synthesized genes mIL12 (SEQ Id No: 12), mGM-CSF (SEQ Id No: 13) were used.
Целевая аминокислотная последовательность mIL12-mGM-CSF представлена (SEQ Id No: 14).The target amino acid sequence of mIL12-mGM-CSF is shown (SEQ Id No: 14).
Сборку и клонирование последовательности, кодирующей mIL12-mGM-CSF проводили по следующей схеме.Assembly and cloning of the mIL12-mGM-CSF coding sequence was carried out according to the following scheme.
1) Клонировали последовательности генов mIL12 и mGM-CSF в вектор pEGFP по сайтам NheFXhoI аналогично схеме из примера 1 с использованием специфичных к мышиным последовательностям праймеров.1) The sequences of the mIL12 and mGM-CSF genes were cloned into the pEGFP vector at the NheFXhoI sites similarly to the scheme from example 1 using primers specific to mouse sequences.
Получили промежуточный вектор pEGFP-N3-mscIL12-mGM-CSF (Фиг. 7).The intermediate vector pEGFP-N3-mscIL12-mGM-CSF was obtained (Fig. 7).
2) Проводили ПЦР амплификацию фрагмента гена mIL12-mGM-CSF с матрицы pEGFP-N3-mscIL12-mGM-CSF помощью специфических праймеров2) PCR amplification of the mIL12-mGM-CSF gene fragment was carried out from the pEGFP-N3-mscIL12-mGM-CSF template using specific primers
3) Проводили клонирование ПЦР продукта (~2050 п.о.) в вектор pVSV-G-GFP-dM51 (Фиг. 8) по сайтам Nhel/Avrll по стандартным методикам рестриктазно-лигазного клонирования.3) The PCR product (~2050 bp) was cloned into the pVSV-G-GFP-dM51 vector (Fig. 8) at the Nhel/Avrll sites using standard restriction enzyme ligase cloning methods.
4) Проводили анализ полученной конструкции с помощью электрофореза в агарозном геле и секвенированием. Карта полученного вектора представлена на Фиг. 9. Результаты секвенирования подтвердили наличие в векторе целевой последовательности, кодирующей mIL12-mGM-CSF (SEQ Id No: 15).4) The resulting construct was analyzed using agarose gel electrophoresis and sequencing. The map of the resulting vector is shown in Fig. 9. Sequencing results confirmed the presence of the target sequence encoding mIL12-mGM-CSF (SEQ Id No: 15) in the vector.
Пример 6. Наработка образца VSV-mIL12-mGMCSF.Example 6. Production of the VSV-mIL12-mGMCSF sample.
Первый этап сборки VSV-mIL12-mGMCSF включал трансфекцию клеток полученной ранее линии HEK293-Т7, экспрессирующей Т7 полимеразу, 4 мя вспомогательными плазмидами, которые экспрессируют кДНК VSV N, VSV Р, VSV G, VSV L белков и коровой плазмидой (pVSV-G-dM51-mIL12-mGMCSF) в соотношении, представленном ниже:The first stage of VSV-mIL12-mGMCSF assembly included transfection of cells of the previously obtained HEK293-T7 line expressing T7 polymerase with 4 auxiliary plasmids that express cDNAs of VSV N, VSV P, VSV G, VSV L proteins and a core plasmid (pVSV-G- dM51-mIL12-mGMCSF) in the ratio shown below:
За день до трансфекции во второй половине дня вносили по 0,9 мл суспензии HEK293-Т7 клеток в лунки 12-луночного планшета из расчета 350000 клеток на лунку. На следующий день при достижении конфлюэнтности 75-90% за два часа до трансфекции меняли питательную среду на среду с более низким содержанием фетальной бычьей сыворотки (FBS, 2%). Приготовление трансфекционных смесей производили последовательным добавлением по отдельности в 2 центрифужные пробирки объемом 1,5 мл плазмид pCAG-VSVN, pCAG-VSVP, pCAG-VSVL, pCAGGS-G, pVSV-G-dM51-mIL12-mGMCSF (в количестве, указанном в таблице с суммарной массой 10,5 мкг на лунку) и PEI (65 мкг для соотношения 5:1). Далее в каждую пробирку вносили бессывороточную среду Opti-Mem из расчета 100 мкл на каждую лунку. После объединения смесей плазмид и PEI перемешивали смесь на вортексе и инкубировали при комнатной температуре в течение 13 минут. Готовые трансфицирующие смеси наносили по каплям на клетки в лунках с 0,9 мл питательной средой с низким содержанием FBS (2%). После этого планшеты переносили в инкубатор для культивирования. Режим культивирования: температура 37,0°С, влажность 90%, содержание СО2 5%. Утром следующего дня после трансфекции меняли среду на среду DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) и низким содержанием FBS (2%). Через 72 часа после трансфекции переносили кондиционированную культуральную жидкость с клетками в стерильные центрифужные пробирки и, при необходимости, хранили при 80°С или использовали сразу.The day before transfection, in the afternoon, 0.9 ml of HEK293-T7 cell suspension was added to the wells of a 12-well plate at a rate of 350,000 cells per well. The next day, when confluency reached 75-90%, two hours before transfection, the culture medium was changed to medium with a lower content of fetal bovine serum (FBS, 2%). The preparation of transfection mixtures was carried out by sequentially adding separately into 2 centrifuge tubes with a volume of 1.5 ml the plasmids pCAG-VSVN, pCAG-VSVP, pCAG-VSVL, pCAGGS-G, pVSV-G-dM51-mIL12-mGMCSF (in the amount indicated in the table with a total mass of 10.5 μg per well) and PEI (65 μg for a 5:1 ratio). Next, serum-free Opti-Mem medium was added to each tube at a rate of 100 μl per well. After combining the plasmid and PEI mixtures, the mixture was vortexed and incubated at room temperature for 13 minutes. The prepared transfection mixtures were applied dropwise onto cells in wells containing 0.9 ml of nutrient medium with a low content of FBS (2%). After this, the plates were transferred to an incubator for cultivation. Cultivation mode: temperature 37.0°C, humidity 90%, CO 2 content 5%. On the morning of the next day after transfection, the medium was changed to DMEM with high glucose (4.5 g/L) and low FBS (2%). 72 hours after transfection, the conditioned culture liquid with cells was transferred into sterile centrifuge tubes and, if necessary, stored at 80°C or used immediately.
Перед вторым этапом наработки вирусных частиц (амплификация вирусных частиц, полученных на первом этапе), при необходимости, проводили разморозку кондиционированной культуральной жидкости с клетками и центрифугировали при максимальных оборотах в течение 10 минут для избавления от дебриса клеток. После центрифугирования отбирали супернатант для последующего инфицирования. Перед этим супернатант разбавляли два раза средой DMEM без сыворотки. Для второго и последующих этапов наработки использовали клетки линии BHK21. За день до трансдукции (инфицирования) вносили по 0,9 мл суспензии BHK21 в лунки 12-луночного планшета из расчета 250000 клеток на лунку. На следующий день при достижении конфлюэнтности 55-75% во всех лунках снимали питательную среду, вносили по 500 мкл разбавленного 2 раза супернатанта после 1 этапа сборки вирусных частиц и инкубировали 2 часа, добавляли по 500 мкл DMEM с 4% FBS. Через 72 ч культивирования снимали клетки с кондиционированной культуральной жидкостью и, при необходимости, хранили при 80°С или использовали сразу.Before the second stage of production of viral particles (amplification of viral particles obtained at the first stage), if necessary, the conditioned culture liquid with cells was defrosted and centrifuged at maximum speed for 10 minutes to get rid of cell debris. After centrifugation, the supernatant was collected for subsequent infection. Before this, the supernatant was diluted two times with DMEM without serum. For the second and subsequent stages of development, cells of the BHK21 line were used. The day before transduction (infection), 0.9 ml of BHK21 suspension was added to the wells of a 12-well plate at a rate of 250,000 cells per well. The next day, when confluency reached 55-75% in all wells, the nutrient medium was removed, 500 μl of the supernatant diluted 2 times was added after the 1st stage of virus particle assembly and incubated for 2 hours, 500 μl of DMEM with 4% FBS was added. After 72 h of cultivation, the cells were removed from the conditioned culture liquid and, if necessary, stored at 80°C or used immediately.
Перед третьим этапом наработки вирусных частиц (амплификация вирусных частиц, полученных на втором этапе наработки) также, при необходимости, проводили разморозку кондиционированной культуральной жидкости с клетками и центрифугирование при максимальных оборотах в течение 10 минут для избавления от дебриса клеток. Далее также как перед вторым этапом наработки супернатант разбавляли два раза DMEM без сыворотки. Для этого этапа за день до трансдукции (инфицирования) вносили по 5,0 мл суспензии BHK21 клеток в культуральные флаконы Т25 с площадью поверхности 25 см2 из расчета 1,5 млн клеток на один флакон. На следующий день при достижении конфлюэнтности 55-75% удаляли питательную среду, вносили по 2,5 мл разбавленного 2 раза супернатанта после 2 этапа наработки вирусных частиц и инкубировали 2 часа, добавляли по 2,5 мл DMEM с 4% FBS. Через 72 ч культивирования снимали клетки с кондиционированной культуральной жидкостью и, при необходимости, хранили при -80°С или использовали сразу. На этом этапе отбирали образцы для подтверждения наличия вирусных частиц посредством методов электрофореза в полиакриламидном геле и ПЦР.Before the third stage of production of viral particles (amplification of viral particles obtained at the second stage of production), if necessary, the conditioned culture liquid with cells was also defrosted and centrifuged at maximum speed for 10 minutes to get rid of cell debris. Then, just as before the second stage of production, the supernatant was diluted twice with DMEM without serum. For this stage, the day before transduction (infection), 5.0 ml of BHK21 cell suspension was added to T25 culture flasks with a surface area of 25 cm2 at the rate of 1.5 million cells per flask. The next day, when confluency reached 55-75%, the nutrient medium was removed, 2.5 ml of supernatant diluted 2 times was added after the 2nd stage of production of viral particles and incubated for 2 hours, 2.5 ml of DMEM with 4% FBS was added. After 72 h of cultivation, the cells were removed from the conditioned culture liquid and, if necessary, stored at -80°C or used immediately. At this stage, samples were collected to confirm the presence of viral particles using polyacrylamide gel electrophoresis and PCR methods.
После подтверждения наличия вирусных частиц проводили 4 этап наработки в культуральных флаконах Т150 с площадью поверхности 150 см2. Для этого за день до трансдукции (инфицирования) вносили по 30,0 мл суспензии BHK21 в культуральные флаконы с площадью поверхности 150 см2 из расчета 9,0 млн клеток на один флакон. На следующий день при достижении конфлюэнтности 55 75% снимали питательную среду, вносили по 15 мл разбавленного 2 раза супернатанта после 3 этапа наработки вирусных частиц и инкубировали 2 часа, добавляли по 15 мл DMEM с 4% FBS. Через 72 ч культивирования снимали клетки с кондиционированной культуральной жидкостью, отбирали образцы для подтверждения наличия вирусных частиц посредством методов электрофореза в полиакрил амид ном геле и ПЦР и, при необходимости, хранили при -80°С.After confirming the presence of viral particles, the 4th stage of production was carried out in T150 culture flasks with a surface area of 150 cm2 . To do this, the day before transduction (infection), 30.0 ml of BHK21 suspension was added to culture flasks with a surface area of 150 cm 2 at the rate of 9.0 million cells per bottle. The next day, when confluency reached 55-75%, the nutrient medium was removed, 15 ml of supernatant diluted 2 times was added after the 3rd stage of production of viral particles and incubated for 2 hours, 15 ml of DMEM with 4% FBS was added. After 72 h of cultivation, cells were removed from conditioned culture fluid, samples were collected to confirm the presence of viral particles using polyacrylamide gel electrophoresis and PCR, and, if necessary, stored at -80°C.
Пример 7. Определение титра и анализ VSV-mIL12-mGMCSFExample 7 Titre determination and analysis of VSV-mIL12-mGMCSF
Оценку титра вируса проводили по цитопатическому эффекту на клетки BHK21. Расчет титра (TCID50/мл) осуществляли по методу Рида-Менча [Lei С, Yang J, Hu J, Sun X. On the Calculation of TCID50 for Quantitation of Virus mfectivity. Virol Sin. 2021 Feb; 36(l): 141-144. doi: 10.1007/sl2250-020-00230-5; Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am J Hygiene. 1938; 27(3):493-497. doi: 10.1093/oxfordj ournals. aj e. a118408].The virus titer was assessed by the cytopathic effect on BHK21 cells. Calculation of the titer (TCID 50 /ml) was carried out using the Reed-Mench method [Lei C, Yang J, Hu J, Sun X. On the Calculation of TCID 50 for Quantitation of Virus mfectivity. Virol Sin. Feb 2021; 36(l): 141-144. doi: 10.1007/sl2250-020-00230-5; Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am J Hygiene. 1938; 27(3):493-497. doi: 10.1093/oxfordj ournals. aj e. a118408].
Клетки BHK21 для анализа засевали на 96-луночный планшет: 10 рядов по 6 лунок в каждом (всего 60 лунок). В каждую из лунок по 25'000 клеток в 100 мкл среды DMEM+5% FBS с расчетом через 24 часа перед проведением эксперимента получить конфлюэнтность около 60-70%. 10 рядов соответствуют 9 рядам разведения вируса 10-1-10-9 и 1 контрольному ряду. В каждом ряду по 6 повторностей. Далее готовили серию разведений VSV-mIL12-mGMCSF в среде DMEM без FBS 10-1-10-9: каждый образец получали из предыдущего разведением в 10 раз. Заражение проводили, используя 50 мкл образца соответствующего разведения на лунку. Оставляли планшет инкубироваться при 37°С в течение 2 часов. Через 2 часа в каждую лунку добавляли по 150 мкл заранее приготовленной среды DMEM+2,7% FBS (для достижения конечной концентрации сыворотки 2%) и оставляли планшет инкубироваться при 37°С в течение 72 часов. Через 72 часа под микроскопом фиксировали проявление цитопатического эффекта вируса в каждой лунке. Далее вычисляли TCIDso/ml, используя стандартный протокол. Картину цитопатического эффекта (ЦПЭ) оформляли в виде схемы (Фиг. 10):BHK21 cells for analysis were seeded into a 96-well plate: 10 rows of 6 wells each (60 wells in total). In each well, 25'000 cells in 100 μl of DMEM + 5% FBS medium with the expectation that 24 hours before the experiment, a confluency of about 60-70% will be obtained. 10 rows correspond to 9 rows of virus dilution 10 -1 -10 -9 and 1 control row. There are 6 repetitions in each row. Next, a series of dilutions of VSV-mIL12-mGMCSF was prepared in DMEM without FBS 10 -1 -10 -9 : each sample was obtained from the previous one by a 10-fold dilution. Infection was performed using 50 μl of appropriately diluted sample per well. The plate was left to incubate at 37°C for 2 hours. After 2 hours, 150 μl of pre-prepared DMEM+2.7% FBS was added to each well (to achieve a final serum concentration of 2%) and the plate was allowed to incubate at 37°C for 72 hours. After 72 hours, the manifestation of the cytopathic effect of the virus in each well was recorded under a microscope. Next, TCIDso/ml was calculated using a standard protocol. The picture of the cytopathic effect (CPE) was presented in the form of a diagram (Fig. 10):
Кондиционированную культуральную жидкость клеток BHK21 после наработки VSV концентрировали с помощью концентраторов (300 кДа, Vivaspin 2) по протоколу производителя и анализировали с помощью электрофореза в полиакрил амид ном геле по стандартному протоколу [Laemmli UK. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature, 1970; V. 227, P. 680-685]. После окрашивания наблюдали полосы, молекулярная масса которых соответствуют пяти белкам VSV (Фиг. 11А, Б).The conditioned culture liquid of BHK21 cells after VSV production was concentrated using concentrators (300 kDa, Vivaspin 2) according to the manufacturer’s protocol and analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis according to the standard protocol [Laemmli UK. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature, 1970; V. 227, P. 680-685]. After staining, bands were observed whose molecular masses corresponded to the five VSV proteins (Fig. 11A, B).
Дополнительно проверяли наличие в геноме VSV гена mIL12-mGMCSF, используя для этого набор универсальных праймеровAdditionally, the presence of the mIL12-mGMCSF gene in the VSV genome was checked using a set of universal primers
3'-конец гена G «vsvG end f»: CGGTCTCAAAATCGTGGACTTCC;3' end of gene G “vsvG end f”: CGGTCTCAAAATCGTGGACTTCC;
5'-конец гена£ «vsvL_start_r»: CATTCAAGACGCTGCTTCGCAAC5' end of gene £ “vsvL_start_r”: CATTCAAGACGCTGCTTCGCAAC
Для этого 500 мкл кондиционированной культуральной жидкости с клеток-продуцентов (BHK21) обрабатывали протеинкиназой-К для высвобождения вирусной РНК. Далее выделяли РНК коммерческим набором «Лира+» (Биолабмикс, РФ). После выделения обрабатывали ДНКазой для ликвидирования возможных остатков сторонней клеточной ДНК. Далее проводили обратную транскрипцию, используя специфичные праймеры, фланкирующие трансген mIL12-mGMCSF.To do this, 500 μl of conditioned culture fluid from producer cells (BHK21) was treated with protein kinase K to release viral RNA. Next, RNA was isolated using a commercial kit “Lira+” (Biolabmix, Russian Federation). After isolation, they were treated with DNase to eliminate possible remnants of extraneous cellular DNA. Next, reverse transcription was performed using specific primers flanking the mIL12-mGMCSF transgene.
После получения кДНК проводили ПЦР с использованием этих же праймеров при следующих условиях: Taq-полимераза, денатурация 95°С 30 сек, отжиг 54°С 20 сек, элонгация 72°С 90 сек. Ампликоны анализировали на электрофорезе в агарозном геле. Наблюдали наличие специфичного ПЦР-продукта, соответствующего размеру ампликонат1Ы2-тОМС8Р (Фиг. 11В)After obtaining cDNA, PCR was performed using the same primers under the following conditions: Taq polymerase, denaturation 95°C for 30 sec, annealing 54°C for 20 sec, elongation 72°C for 90 sec. Amplicons were analyzed by agarose gel electrophoresis. The presence of a specific PCR product corresponding to the size of the 1H2-mOMC8P ampliconate was observed (Fig. 11B)
Пример 8. Оценка активности IL12 в кондиционированной культуральной жидкости после амплификации VSV-mIL12-mGMCSF в культуре BHK21.Example 8. Evaluation of IL12 activity in conditioned culture fluid after amplification of VSV-mIL12-mGMCSF in BHK21 culture.
Активность hIL12 в кондиционированной культуральной жидкости BHK21 на каждом этапе наработки VSV-mIL12-mGMCSF: из 12-луночных планшетов, культуральных флаконов Т25 и Т150, - проверяли с использованием репортерной клеточной линии HEK-Blue™ IL-12 (InvivoGen) по протоколу, описанному ранее в Примере 4. В результате эксперимента выяснили, что в кондиционированной культуральной жидкости содержится функциональный IL12, который вызывает активацию специфичного клеточного репортера на уровне положительного контроля (Фиг. 12).The activity of hIL12 in the conditioned culture liquid of BHK21 at each stage of production of VSV-mIL12-mGMCSF: from 12-well plates, T25 and T150 culture flasks, was tested using the HEK-Blue™ IL-12 reporter cell line (InvivoGen) according to the protocol described previously in Example 4. As a result of the experiment, it was found that the conditioned culture liquid contains functional IL12, which causes activation of a specific cellular reporter at the level of the positive control (Fig. 12).
Пример 9. Оценка эффективности VSV-mIL12-mGMCSF in vivo.Example 9. Evaluation of the effectiveness of VSV-mIL12-mGMCSF in vivo.
В эксперимент брали мышей линии Balb/c возрастом 6 недель. Подкожно в левый бок вводили 100 мкл суспензии, содержащей 10 млн/мл клеток B16F10. В течение недели наблюдали образование опухоли темного цвета, ясно различимой на белом фоне. Когда опухоль достигла линейных размеров 0,5 см, интратуморально проводили инъекцию 50 мкл концентратов VSV-G-GFP (1,0⋅108 TCID50) и VSV-mIL12-mGM-CSF (7⋅104 TCID50). Через 7 дней наблюдали полное исчезновение опухоли у мышей, которые получили инъекцию VSV-mIL12-mGM-CSF, в то время как лизис опухоли препаратом VSV-G-GFP проходил медленнее (разница в 1 неделю) (Фиг. 13). При этом следует отметить, что препарат VSV-mIL12-mGM-CSF обладал терапевтическим эффектом в 1000-кратно меньшей дозе из расчета титров по TCID50.Balb/c mice aged 6 weeks were used in the experiment. 100 μl of a suspension containing 10 million/ml B16F10 cells was injected subcutaneously into the left side. Within a week, the formation of a dark-colored tumor, clearly visible against a white background, was observed. When the tumor reached a linear size of 0.5 cm, 50 μl of VSV-G-GFP (1.0⋅10 8 TCID 50 ) and VSV-mIL12-mGM-CSF (7⋅10 4 TCID 50 ) concentrates were injected intratumorally. After 7 days, complete tumor disappearance was observed in mice that received an injection of VSV-mIL12-mGM-CSF, while tumor lysis with VSV-G-GFP was slower (1 week difference) (Fig. 13). It should be noted that the drug VSV-mIL12-mGM-CSF had a therapeutic effect at a 1000-fold lower dose based on TCID 50 titers.
Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеприведенном описании это изобретение было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов его осуществления, и многие детали были изложены в целях иллюстрации, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные в данном документе, могут значительно изменяться без отклонения от сущности изобретения.All publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference. Although this invention has been described in the foregoing description with respect to certain preferred embodiments and many details have been set forth for purposes of illustration, it will be apparent to those skilled in the art that the invention is capable of additional embodiments and that certain details described herein may vary significantly without departing from the spirit of the invention.
Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту. Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное. Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для использования в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в спецификацию, как если бы оно было отдельно изложено в данном документе. Все способы, описанные в данном документе, могут выполняться в любом подходящем порядке, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено. Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.The use of the singular terms in the context of the description of the invention should be construed to cover both the singular and plural unless otherwise specified herein or clearly inconsistent with the context. The terms “consisting of,” “having,” “including,” and “comprising” are to be construed as non-limiting terms, i.e. meaning "including but not limited to" unless otherwise noted. The listing of ranges of values in this document is simply intended to serve as a shorthand way of individually referring to each individual value falling within that range unless otherwise noted herein, and each individual value is included in the specification as if it were separately set forth herein . All methods described herein may be performed in any suitable order unless otherwise indicated herein or otherwise clearly inconsistent with the context. The use of any and all examples or illustrative language (eg, “such as”) presented herein is intended merely to better describe the invention and is not intended to limit the scope of the invention unless otherwise stated. Nothing in the specification should be construed as indicating any element not claimed as essential to the practice of the invention.
Здесь описаны варианты осуществления этого изобретения, включая лучший из известных изобретателям способа осуществления изобретения. Разновидности этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы предполагают, что изобретение будет реализовано на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты признаков, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных признаков во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.Embodiments of this invention are described herein, including the best method known to the inventors for carrying out the invention. Variations of these embodiments may become apparent to those skilled in the art upon reading the foregoing description. The authors expect that those skilled in the art will use such variations as appropriate, and the authors expect that the invention will be practiced differently than specifically described herein. Accordingly, this invention includes all modifications and equivalents of the features set forth in the appended claims as permitted by applicable law. Moreover, any combination of the above-described features, in all their possible variations, is encompassed by the invention unless otherwise indicated herein or otherwise clearly inconsistent with the context.
Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, экспрессирующий химерный белок IL12-GMCSF» на предмет выдачи патента на изобретение.The applicant requests to consider the submitted materials of the application “Recombinant vesicular stomatitis virus expressing the chimeric protein IL12-GMCSF” for the grant of a patent for the invention.
Claims (6)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2817896C1 true RU2817896C1 (en) | 2024-04-22 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2010124788A (en) * | 2007-12-21 | 2012-01-27 | Ваейт ЭлЭлСи (US) | GENETICALLY MODIFIED ATTENUATED VESICULAR STOMATITIS VIRUS, COMPOSITIONS AND WAYS OF THEIR APPLICATION |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2010124788A (en) * | 2007-12-21 | 2012-01-27 | Ваейт ЭлЭлСи (US) | GENETICALLY MODIFIED ATTENUATED VESICULAR STOMATITIS VIRUS, COMPOSITIONS AND WAYS OF THEIR APPLICATION |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MUNIS AM, et.al. A tool with many applications: vesicular stomatitis virus in research and medicine, Expert Opinion on Biological Therapy, 2020 с.1187-1200. SHIN EJ, WANNA GB, CHOI B, et al. Interleukin-12 expression enhances vesicular stomatitis virus oncolytic therapy in murine squamous cell carcinoma. Laryngoscope. 2007 Feb; 117 (2) с.212-214. LEVEILLE S, GOULET ML, LICHTY BD, et al. Vesicular Stomatitis Virus Oncolytic Treatment Interferes with Tumor-Associated Dendritic Cell Functions and Abrogates Tumor Antigen Presentation. J Virol. 2011; 85 (23): 12160-12169. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6058928B2 (en) | RNA modifications that improve transcript stability and translation efficiency | |
| CN107847577B (en) | Cancer vaccine comprising mRNA encoding M-like protein | |
| CN106062199B (en) | The method for manufacturing adenovirus and corresponding plasmid | |
| JP6377349B2 (en) | DNA expression constructs | |
| CN102268454A (en) | Prostate specific membrane antigen (PSMA) recombinant adeno-associated virus vector and its construction method and use | |
| JP6956416B2 (en) | Transposon system, kits containing it and their use | |
| JP2018521115A5 (en) | ||
| CN104774270B (en) | A kind of gland cancer specificity EpCAM GM CSF gene recombinant fusion proteins and preparation method thereof | |
| WO2023227124A1 (en) | Skeleton for constructing mrna in-vitro transcription template | |
| CN112553079B (en) | Construction method for expressing exogenous fluorescent protein coccidia | |
| US20110206728A1 (en) | Dna vaccines, uses for unprocessed rolling circle amplification product and methods for making the same | |
| RU2817896C1 (en) | Recombinant vesicular stomatitis virus expressing chimeric il12-gmcsf protein | |
| CN102086453A (en) | Tumor DNA vaccine taking mucin 1 and survivin as targets and viral vector vaccine | |
| CN105797152A (en) | Vaccine composition and its preparation method and use | |
| CN116024237A (en) | mRNA vaccine for preventing heat of rift grains and preparation method thereof | |
| CN117940463A (en) | Use of CCL26 | |
| CN105177048B (en) | Carry HPV 16 multipoint mutation type E7mmThe recombined glandulae correlation viral vectors and its construction method of antigen gene and application | |
| CN114134165A (en) | Novel HPV therapeutic nucleic acid vaccine | |
| CN1701120A (en) | Nucleic acid constructs for gene expression | |
| JP2023514337A (en) | RECOMBINANT VIRUS VECTOR, IMMUNICATION COMPOSITION CONTAINING THE SAME, AND USE | |
| CN114907485A (en) | Chimeric antigen receptor with endogenous protein molecule replacing single domain antibody | |
| CN116904489B (en) | Duck tembusu virus nucleic acid vaccine and application thereof | |
| CN114569709B (en) | Preparation method and application of melanoma autologous tumor vaccine with high ADAM-28 expression | |
| KR20150074714A (en) | Infectious clone comprising full-length nucleotide of porcine epidemic diarrhea virus | |
| RU2701692C2 (en) | Pichia pastoris x3351 recombinant yeast strain - bovine leukemia virus gp 51 vaccine protein producer |