RU2815686C9 - Method for detecting single-stranded and double-stranded dna breaks in male germ cells - Google Patents
Method for detecting single-stranded and double-stranded dna breaks in male germ cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815686C9 RU2815686C9 RU2023122864A RU2023122864A RU2815686C9 RU 2815686 C9 RU2815686 C9 RU 2815686C9 RU 2023122864 A RU2023122864 A RU 2023122864A RU 2023122864 A RU2023122864 A RU 2023122864A RU 2815686 C9 RU2815686 C9 RU 2815686C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fluorescence intensity
- hyaluronic acid
- dna
- breaks
- fluorescein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 210000003794 male germ cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 8
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 title abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 27
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 229920002749 Bacterial cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 239000005016 bacterial cellulose Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 231100001074 DNA strand break Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 108010025899 gelatin film Proteins 0.000 description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 238000012288 TUNEL assay Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012897 dilution medium Substances 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 241000032681 Gluconacetobacter Species 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины для выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) половых клеток мужчин и может быть использовано для обнаружения сперматозоидов, имеющих повреждения в ДНК, у мужчин, перенесших Covid-19.The invention relates to the field of medicine for detecting single-strand and double-strand breaks in the genomic deoxyribonucleic acid (DNA) of male germ cells and can be used to detect sperm with DNA damage in men who have had Covid-19.
Мужское бесплодие – это глобальная проблема человечества. Перспективным решением данной проблемы в урологии является исследование жизнеспособности мужских половых клеток и выявление фрагментации геномной ДНК за счёт меченных олигонуклеотидов.
На мировом рынке представлено много различных тестов и методик для определения разрывов в ДНК сперматозоидов. Male infertility is a global problem for humanity. A promising solution to this problem in urology is to study the viability of male germ cells and identify fragmentation of genomic DNA due to labeled oligonucleotides.
There are many different tests and techniques available on the world market for determining breaks in sperm DNA.
Известен TUNEL-тест, сущность которого заключается в том, что при добавлении специального реактива находятся сперматозоиды с поврежденной ДНК и окрашиваются. Отличительной чертой позднего апоптоза является обширная фрагментация геномной ДНК, которая создает множество двунитевых разрывов ДНК (DSBs) с доступной 3'-гидроксил (3'-OH) группой. TUNEL анализ идентифицирует апоптозные клетки с помощью терминальной деоксинуклеотидил трансфераза (TdT)-опосредованного добавления меченых (X) деоксиуридин трифосфат нуклеотидов (X-dUTP) к 3'-OH концу разрыва ДНК цепи, что затем визуализируется способом, соответствующим внедренной метке, таким образом служа показателем процентного соотношения апоптозных клеток в анализируемой клеточной популяции. Чувствительность анализа зависит от эффективности внедрения модицицированных dUTP, что определяется размером прикрепленной метки (Kyrylkova, K. Detection of apoptosis by TUNEL assay / K. Kyrylkova, S. Kyryachenko. – Текст : электронный // Methods Mol Biol : электронный журнал. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22566045/. – Дата публикации: 2012).The TUNEL test is known, the essence of which is that when a special reagent is added, sperm with damaged DNA are found and stained. A hallmark of late apoptosis is extensive fragmentation of genomic DNA, which creates numerous DNA double-strand breaks (DSBs) with an accessible 3'-hydroxyl (3'-OH) group. The TUNEL assay identifies apoptotic cells using terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated addition of (X) deoxyuridine triphosphate (X-dUTP)-labeled nucleotides to the 3'-OH end of the DNA strand break, which is then visualized in a manner consistent with the introduced label, thus serving an indicator of the percentage of apoptotic cells in the analyzed cell population. The sensitivity of the analysis depends on the efficiency of the introduction of modified dUTP, which is determined by the size of the attached label (Kyrylkova, K. Detection of apoptosis by TUNEL assay / K. Kyrylkova, S. Kyryachenko. – Text: electronic // Methods Mol Biol: electronic journal. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22566045/ – Publication date: 2012).
Недостатками TUNEL-теста являются дороговизна данного метода оценки фрагментации ДНК, а также не достаточно стандартизированные пороговые значения. Также данный метод Tunel Assay является неспецифичным, так как используется для оценки других повреждений в организме.The disadvantages of the TUNEL test are the high cost of this method for assessing DNA fragmentation, as well as insufficiently standardized threshold values. Also, this Tunel Assay method is non-specific, as it is used to assess other damage in the body.
Известен другой тест, который также представлен на рынке – HALOSPERM тест (Halotech, Испания). Он основан на обнаружении разрывов ДНК по дисперсии хроматина вокруг ядра клетки после гидролиза. Сперматозоиды обрабатывают раствором кислоты, затем после инкубации клетки прокрашивают и просматривают в световом микроскопе. Сперматозоиды, которые содержат целую ДНК, образуют ореол дисперсии («halo-эффект»). Сперматозоиды с фрагментированной ДНК образуют минимальный ореол или не образуют его вообще. Метод прост в использовании (Феськов, А.М. Исследование фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин с повышенным содержанием незрелых спермиев в эякуляте / А.М. Феськов. – Текст : электронный // Мир медицины и биологии : электронный журнал. – URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=17947630. Дата публикации: 2012).There is another known test that is also on the market - the HALOSPERM test (Halotech, Spain). It is based on the detection of DNA breaks in the chromatin dispersion around the cell nucleus after hydrolysis. Spermatozoa are treated with an acid solution, then after incubation the cells are stained and viewed under a light microscope. Spermatozoa that contain intact DNA form a dispersion halo (“halo effect”). Sperm with fragmented DNA form a minimal or no halo. The method is easy to use (Feskov, A.M. Study of sperm DNA fragmentation in men with an increased content of immature sperm in the ejaculate / A.M. Feskov. – Text: electronic // World of Medicine and Biology: electronic journal. – URL: https: //elibrary.ru/item.asp?id=17947630. Date of publication: 2012).
Недостатком данного способа является относительно низкая чувствительность и специфичность по сравнению с другими методами исследования фрагментации ДНК.The disadvantage of this method is the relatively low sensitivity and specificity compared to other methods for studying DNA fragmentation.
Известен способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, заключающийся в том, что на преаналитическом этапе проводят фиксацию сперматозоидов на предметных стеклах и детектируют в них гидроксиметилированную ДНК с помощью иммунофлуоресценции, затем оценивают при микроскопическом анализе флуоресценцию в не менее чем 5000 индивидуальных сперматозоидов, при этом нормой считают долю сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, не превышающую 0,5% от общего числа проанализированных сперматозоидов (RU 2673472, МПК G01N 33/53, опубл. 27.11.2018).There is a known method for assessing the quality of ejaculate by the content of spermatozoa with hydroxymethylated DNA, which consists in the fact that at the preanalytical stage, spermatozoa are fixed on glass slides and hydroxymethylated DNA is detected in them using immunofluorescence, then fluorescence is assessed by microscopic analysis in at least 5000 individual spermatozoa, in this case, the norm is considered to be the proportion of sperm with hydroxymethylated DNA not exceeding 0.5% of the total number of analyzed sperm (RU 2673472, IPC G01N 33/53, published 11/27/2018).
Недостатками заявленного способа являются сложность подготовки к исследованию, так как на рынке не представлено готового набора для проведения анализа, а также подсчёт клеток осуществляется лаборантом, где не исключается человеческая ошибка, что ведет к недостоверности данных.The disadvantages of the claimed method are the difficulty of preparing for the study, since there is no ready-made kit for analysis on the market, and cell counting is carried out by a laboratory assistant, where human error cannot be ruled out, which leads to unreliable data.
Наиболее близким по сущности к предлагаемому решению является способ оценки генетической полноценности сперматозоидов , включающий использование пробы эякулята in vitro в среде для разбавления, в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми, генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными (RU 2679312, МПК G01N 33/52, опубл. 07.02.2019). Данный способ является прототипом тест-системы.The closest in essence to the proposed solution is a method for assessing the genetic usefulness of sperm, including the use of an in vitro ejaculate sample in a dilution medium; hyaluronic acid labeled with fluorescein is added to the in vitro ejaculate samples in a dilution medium at a concentration of 0.5-1.0 mmol, followed by incubation at 37°C for 5-10 minutes and recording the fluorescence intensity with a maximum of 495 nm, when the fluorescence intensity of the sample is above 50-60 a.u. sperm are considered mature, genetically complete, when the fluorescence intensity of the sample is below 30-35 a.u. sperm are considered genetically inferior (RU 2679312, IPC G01N 33/52, published 02/07/2019). This method is a prototype of a test system.
Недостатками данного способа являются малая специфичность и эффективность, так как молекулы гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, находятся в растворе, что не позволяет зафиксировать клетки.The disadvantages of this method are low specificity and efficiency, since molecules of hyaluronic acid labeled with fluorescein are in solution, which does not allow fixation of cells.
Таким образом, представленные способы оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах малоэффективны, обладают малой чувствительностью и специфичностью, а также некоторые являются недостоверными.Thus, the presented methods for assessing DNA fragmentation in sperm are ineffective, have low sensitivity and specificity, and some are unreliable.
Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов и обеспечении доступности используемых компонентов за счёт природного механизма, основанного на взаимодействии специфических рецепторов с гиалуроновой кислотой, находящейся на поверхностной мембране яйцеклетки и изменении интенсивности флуоресценции флуоресцеина, ковалентно связанного с гиалуроновой кислотой.The technical result of the claimed method is to increase the efficiency of detecting breaks in the genomic DNA of sperm and ensuring the availability of the components used due to a natural mechanism based on the interaction of specific receptors with hyaluronic acid located on the surface membrane of the egg and changing the fluorescence intensity of fluorescein covalently bound to hyaluronic acid.
Сущность изобретения заключается в том, что способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках включает разбавление пробы эякулята мужчин in vitro в среде из гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции регистрируется с максимумом излучения 512 нм, полученные результаты сравниваются с биосовместимым материалом, состоящим из бактериальной целлюлозы, к которой присоединена гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции биосовместимого материала принимается как 100%. Сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными при снижении интенсивности флуоресценции пробы эякулята в среде до 40% относительно контроля. При интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.The essence of the invention lies in the fact that the method for detecting single-stranded and double-stranded DNA breaks in male germ cells involves diluting a sample of male ejaculate in vitro in a medium of hyaluronic acid labeled with fluorescein. The fluorescence intensity is recorded with a maximum emission of 512 nm, the results obtained are compared with a biocompatible material consisting of bacterial cellulose to which fluorescein-labeled hyaluronic acid is attached. The fluorescence intensity of a biocompatible material is taken as 100%. Spermatozoa have a minimal number of DNA breaks and are genetically complete when the fluorescence intensity of the ejaculate sample in the medium decreases to 40% relative to the control. When the fluorescence intensity is 40% or higher relative to the control, it is considered that sperm have a high level of DNA strand breaks and are genetically defective.
Предложенный способ обеспечивает эффективное обнаружение поврежденных сперматозоидов с фрагментированной геномной ДНК за счёт фиксации данных клеток на поверхность бактериальной целлюлозы через сродство гиалуроной кислоты к рецепторам мужских половых клеток. Это улучшает и облегчает проведение дальнейшего анализа. В данном случае используется биоразлагаемая, прочная и с высокой частотой – бактериальная целлюлоза. Одним из главных плюсов также является то, что ее можно «сшить» с любыми молекулами.The proposed method provides effective detection of damaged spermatozoa with fragmented genomic DNA due to the fixation of these cells on the surface of bacterial cellulose through the affinity of hyaluronic acid to the receptors of male germ cells. This improves and facilitates further analysis. In this case, biodegradable, durable and high-frequency bacterial cellulose is used. One of the main advantages is also that it can be “stitched” with any molecules.
В данном способе бактериальная целлюлоза с иммобилизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой используется в качестве контроля для измерения интенсивности флуоресценции, а результаты исследования выражаются в процентах относительно контроля.In this method, bacterial cellulose with fluorescein-immobilized hyaluronic acid is used as a control to measure fluorescence intensity, and the results of the study are expressed as a percentage relative to the control.
Способ осуществляется следующим образом. Для получения бактериальной целлюлозы используют штамм бактерии рода Gluconacetobacter. Культивирование и получение гель-пленки проводят известным способом в среде Шрама Хетрикс. The method is carried out as follows. To obtain bacterial cellulose, a strain of bacteria of the genus Gluconacetobacter is used. Cultivation and production of a gel film are carried out in a known manner in Scar Hetrix medium.
Бактериальную целлюлозу очищают от избытка клеток, промывая 4-5 раз 1Н NaOH с выдержкой 30 мин при 80°С и проводят нейтрализацию избытка щелочи промыванием дистиллированной водой до рН 7. Затем очищенную бактериальную целлюлозу размером 2×4 см, весом 8 мг и толщиной 20 мкм высушивают при комнатной температуре и проводят сшивание флуоресцеин гиалуроновой кислоты с бактерицидной целлюлозой. Bacterial cellulose is cleaned of excess cells by washing 4-5 times with 1N NaOH for 30 minutes at 80°C and the excess alkali is neutralized by washing with distilled water to pH 7. Then the purified bacterial cellulose is 2x4 cm in size, weighs 8 mg and thickness 20 microns are dried at room temperature and fluorescein hyaluronic acid is crosslinked with bactericidal cellulose.
Для этого 5 мг флуоресцеин гиалуроновой кислотой растворяют в 10 мл 1%-ного раствора NaOH. Разведенный раствор флуоресцеин гиалуроновой кислоты поместить в емкость с бактериальной целлюлозой, так чтобы раствор покрывал пленку. Раствор оставляют на 60 мин, периодически перемешивая по 5 мин. Сшивание производят с помощью сшивающего агента 20%-ным 1,4-бутандиол-диглицидиловым эфиром; для этого 3 мл раствора разводят в 1%-ном растворе NaOH в соотношении 1:5, добавляют к бактериальной целлюлозе. Раствор перемешать стерильной лопаточкой в течение 10 мин. Гель-пленку поместить на водяную баню на 3 часа при 52°С для лучшего протекания реакции сшивки. Об эффективности сшивки судят по интенсивности поглощения на FTIR-ИК спектрах в диапазоне 1075-1000 см-1, свидетельствующей об образовании эфирных связей между компонентами композиции.To do this, 5 mg of fluorescein hyaluronic acid is dissolved in 10 ml of 1% NaOH solution. Place the diluted solution of fluorescein hyaluronic acid in a container with bacterial cellulose so that the solution covers the film. The solution is left for 60 minutes, stirring periodically for 5 minutes. Cross-linking is carried out using the cross-linking agent 20% 1,4-butanediol-diglycidyl ether; for this, 3 ml of the solution is diluted in a 1% NaOH solution in a ratio of 1:5 and added to bacterial cellulose. Mix the solution with a sterile spatula for 10 minutes. Place the gel film in a water bath for 3 hours at 52°C for better cross-linking reaction. The effectiveness of crosslinking is judged by the absorption intensity in the FTIR-IR spectra in the range of 1075-1000 cm -1 , indicating the formation of ether bonds between the components of the composition.
После иммобилизации гель-пленку переместить в лабораторную посуду для in vitro исследований (чашка Петри культуральная, 60 мм с центральным отверстием), на поверхность которой наносится препарат спермы (в 1 – биологическая жидкость здоровых мужчин-доноров; во 2 – биологическая жидкость, полученная от мужчин, переболевших Covid-19) – 300-400 мкл. Полученные пробы оставить на 10-15 мин при 37°С для инкубации, после чего регистрируют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения с максимумом при 494 нм и максимумом излучения при 512 нм. After immobilization, transfer the gel film into a laboratory vessel for in vitro studies (culture Petri dish, 60 mm with a central hole), onto the surface of which a sperm preparation is applied (in 1 - biological fluid of healthy male donors; in 2 - biological fluid obtained from men who have recovered from Covid-19) – 300-400 µl. Leave the resulting samples for 10-15 minutes at 37°C for incubation, after which the fluorescence intensity is recorded at the excitation wavelength with a maximum at 494 nm and an emission maximum at 512 nm.
Контрольным образцом является бактериальная целлюлоза с иммобилизованными остатками флуоресцеин гиалуроновой кислоты, интенсивность флуоресценции которой принимается как 100%. Снижение интенсивности флуоресценции при добавлении сперматозоидов до 40% относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными; при интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.The control sample is bacterial cellulose with immobilized fluorescein hyaluronic acid residues, the fluorescence intensity of which is taken as 100%. A decrease in fluorescence intensity when adding sperm to 40% relative to the control, it is believed that sperm have a minimal number of DNA breaks and are genetically complete; when the fluorescence intensity is 40% or higher relative to the control, it is considered that sperm have a high level of DNA strand breaks and are genetically defective.
Было показано, что у мужчин, переболевших Covid-19, процент связавшихся клеток с флуоресцеин гиалуроновой кислотой ниже за счёт снижения интенсивности флуоресценции, что свидетельствует о том, что после перенесенной болезни половые клетки утрачивают рецептор к гиалуроновой кислоте и являются генетически неполноценными. It has been shown that in men who have recovered from Covid-19, the percentage of cells bound to fluorescein hyaluronic acid is lower due to a decrease in fluorescence intensity, which indicates that after the illness, germ cells lose the receptor for hyaluronic acid and are genetically inferior.
Исследование проводилось на сперматозоидах, полученных от мужчин-доноров. У каждого мужчины уточнялись следующие данные: переболел ли Covid-19, период болезни и степень тяжести. С полученным эякулятом проводились исследования на полноценность генетической информации (Пример 1, 2).The study was conducted on sperm obtained from male donors. For each man, the following data was clarified: whether he had been ill with Covid-19, the period of illness and severity. Studies were carried out with the resulting ejaculate to determine the usefulness of genetic information (Example 1, 2).
Пример 1.Example 1.
В соответствии с заявленным способом была взята проба эякулята у пациента А, который официально не болел Covid-19. Далее семенную жидкость в количестве 300-400 мкл нанесли на поверхность бактериальной целлюлозы с иммобилизованной на ней гиалуроновой кислотой, меченной флуоресцеином в чашку Петри. Данный образец оставили на 10-15 мин для инкубации при температуре 37°С. После инкубации проводили измерение интенсивности флуоресценции при длине волны 512 нм против контроля, в качестве которого использовалась бактериальная целлюлоза с иммобилизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой без эякулята. Интенсивность флуоресценции пробы пациента А. составила 19,33%, означающая, что сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными.In accordance with the stated method, a ejaculate sample was taken from patient A, who was not officially sick with Covid-19. Next, seminal fluid in an amount of 300-400 μl was applied to the surface of bacterial cellulose with hyaluronic acid immobilized on it, labeled with fluorescein, in a Petri dish. This sample was left to incubate for 10-15 minutes at 37°C. After incubation, fluorescence intensity was measured at a wavelength of 512 nm against a control, which was bacterial cellulose with fluorescein-immobilized hyaluronic acid without ejaculate. The fluorescence intensity of patient A's sample was 19.33%, which means that the sperm have a minimal number of DNA breaks and are genetically complete.
Пример 2.Example 2.
В соответствии с заявленным способом была взята проба эякулята у пациента Б, который официально переболел Covid-19 в конце 2021 года. Далее семенную жидкость в количестве 300-400 мкл нанесли на поверхность бактериальной целлюлозы с иммобилизованной на ней гиалуроновой кислотой, меченной флуоресцеином в чашку Петри. Данный образец оставили на 10-15 мин для инкубации при температуре 37°С. После инкубации проводили измерение интенсивности флуоресценции при длине волны 512 нм против контроля, в качестве которого использовалась бактериальная целлюлоза с иммобилизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой без эякулята. Интенсивность флуоресценции пробы пациента Б. составила 50,7%, означающая, что сперматозоиды имеют большое количество разрывов ДНК и являются генетически неполноценными.In accordance with the stated method, a ejaculate sample was taken from patient B, who officially recovered from Covid-19 at the end of 2021. Next, seminal fluid in an amount of 300-400 μl was applied to the surface of bacterial cellulose with hyaluronic acid immobilized on it, labeled with fluorescein, in a Petri dish. This sample was left to incubate for 10-15 minutes at 37°C. After incubation, fluorescence intensity was measured at a wavelength of 512 nm against a control, which was bacterial cellulose with fluorescein-immobilized hyaluronic acid without ejaculate. The fluorescence intensity of patient B.'s sample was 50.7%, which means that the sperm have a large number of DNA breaks and are genetically defective.
По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить эффективность обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов и обеспечить доступность используемых компонентов за счёт природного механизма, основанного на взаимодействии специфических рецепторов с гиалуроновой кислотой, находящейся на поверхностной мембране яйцеклетки и изменении интенсивности флуоресценции флуоресцеина, ковалентно связанного с гиалуроновой кислотой.Compared to the known solution, the proposed one makes it possible to increase the efficiency of detecting breaks in the genomic DNA of sperm and ensure the availability of the components used due to a natural mechanism based on the interaction of specific receptors with hyaluronic acid located on the surface membrane of the egg and a change in the fluorescence intensity of fluorescein, covalently bound to hyaluronic acid .
Claims (1)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815686C1 RU2815686C1 (en) | 2024-03-20 |
| RU2815686C9 true RU2815686C9 (en) | 2024-04-16 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2679312C1 (en) * | 2017-09-12 | 2019-02-07 | Общество с ограниченной ответственностью "Генетико-селекционный исследовательский центр "Генология-МГУ" | Method for evaluating the genetic usefulness of spermatozoa |
| RU2730947C1 (en) * | 2020-01-17 | 2020-08-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС" | Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2679312C1 (en) * | 2017-09-12 | 2019-02-07 | Общество с ограниченной ответственностью "Генетико-селекционный исследовательский центр "Генология-МГУ" | Method for evaluating the genetic usefulness of spermatozoa |
| RU2730947C1 (en) * | 2020-01-17 | 2020-08-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС" | Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ROMAN MONTANANA C. Assessment of DNA structure and integrity in the human spermatozoon. Tesis doctoral. Birmingham, 2019, 252 p.. GONZALEZ-MARIN C. et al. Types, Causes, Detection and Repair of DNA Fragmentation in Animal and Human Sperm Cells. Int. J. Mol. Sci. 2012; 13: 14026-14052. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9428810B2 (en) | Detection of a target in a preservative solution | |
| US8026065B2 (en) | Assessment of oocyte competence | |
| CN110198711A (en) | Method for detecting cancer | |
| KR20060069862A (en) | Automated cytological sample classification | |
| JP2009543089A (en) | Methods and tests for analysis of glycosylation patterns related to cellular status (analysis) | |
| CN110108889B (en) | Kit for diagnosing IgA nephropathy and application thereof | |
| US20200166528A1 (en) | Methods for Improving Assays of Biological Samples | |
| RU2815686C9 (en) | Method for detecting single-stranded and double-stranded dna breaks in male germ cells | |
| RU2815686C1 (en) | Method for detecting single-stranded and double-stranded dna breaks in male germ cells | |
| CN115948544B (en) | Use of CITED4 and/or METRN in differential diagnosis of the degree of disc degeneration | |
| JP2013504319A (en) | Peptide nucleic acid probe, kit and method for detecting Helicobacter pylori and / or clarithromycin resistance, and use thereof | |
| WO2019113827A1 (en) | Sandwich and species-specific nucleic acid aptamers against plasmodium lactate dehydrogenase for malaria diagnosis | |
| KR20180081445A (en) | Method for rapidly detecting nucleic acid and rapid diagnosic method of disease using thereof | |
| CN107779503A (en) | The related difference expression gene of Alzheimer and its application | |
| CN113278616B (en) | DNAzyme capable of specifically recognizing toxoplasma gondii and having RNA cutting function and kit | |
| WO2009096429A1 (en) | Method for extraction of nucleotide | |
| Guo et al. | Identification and validation of metabolism-related genes signature and immune infiltration landscape of rheumatoid arthritis based on machine learning | |
| WO2017029450A1 (en) | Individual method predictive of the dna-breaking genotoxic effects of chemical or biochemical agents | |
| CN115287336A (en) | Method for detecting human lymphocyte EB virus infection and immune check point expression level | |
| CN101586165A (en) | Kit for detecting 2975-2978delAG mutation of OTOF gene | |
| EP3882361A1 (en) | Lateral flow assay for detecting the presence of coronavirus in a biological sample | |
| RU2627455C1 (en) | Method for manufacturing of biomechanical sensor for adhesion force measurement in "cell-cell" system | |
| EP2993475A1 (en) | Method for obtaining useful data for the differential diagnosis of liver fibrosis | |
| Salami et al. | Aptamers-Based Gold-Micro-Array for High-Selective Detection of Bacteria Using Fluorescence Microscopy | |
| CN115389505A (en) | Single-particle click chemical sensor for rapidly detecting bacteria in body fluid |