RU2805066C2 - Extracellular vesicles originating from mesenchymal stem cells - Google Patents

Extracellular vesicles originating from mesenchymal stem cells Download PDF

Info

Publication number
RU2805066C2
RU2805066C2 RU2021100128A RU2021100128A RU2805066C2 RU 2805066 C2 RU2805066 C2 RU 2805066C2 RU 2021100128 A RU2021100128 A RU 2021100128A RU 2021100128 A RU2021100128 A RU 2021100128A RU 2805066 C2 RU2805066 C2 RU 2805066C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mesenchymal stem
stem cells
extracellular vesicles
culture medium
mscs
Prior art date
Application number
RU2021100128A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2021100128A (en
Inventor
Анжелита ДЕ ФРАНЦИСКО
Чжунчао Хань
Original Assignee
Хелс Энд Биотек Франс (Х Энд Б Франс)
Бейджин Хелс Энд Биотек Стем Селл Текнолоджикал Корпорейшен Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Хелс Энд Биотек Франс (Х Энд Б Франс), Бейджин Хелс Энд Биотек Стем Селл Текнолоджикал Корпорейшен Лтд. filed Critical Хелс Энд Биотек Франс (Х Энд Б Франс)
Publication of RU2021100128A publication Critical patent/RU2021100128A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2805066C2 publication Critical patent/RU2805066C2/en

Links

Abstract

FIELD: pharmaceuticals.
SUBSTANCE: invention relates to therapeutic, diagnostic, veterinary or cosmetic compositions containing extracellular vesicles derived from CD106highCD151+nestin+ mesenchymal stem cells (MSC) of placental tissue, for use as a drug for the treatment of subjects suffering from ischemic disease, system disorders circulatory, immunopathological, organ damage or organ dysfunction.
EFFECT: invention also relates to a specific method of obtaining these extracellular vesicles.
41 cl, 5 dwg, 7 ex

Description

Область изобретенияField of invention

В настоящем изобретении раскрыта композиция, содержащая внеклеточные везикулы (EV, от англ. extracellular vesicles), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC) плацентарной ткани.The present invention discloses a composition containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSC) of placental tissue.

Согласно первому аспекту изобретение относится к конкретному способу получения этих EV.According to a first aspect, the invention relates to a specific method for producing these EVs.

Согласно второму аспекту изобретение относится к терапевтической, диагностической, ветеринарной или косметической композиции, содержащей внеклеточные везикулы, полученные указанным конкретным способом.According to a second aspect, the invention relates to a therapeutic, diagnostic, veterinary or cosmetic composition containing extracellular vesicles obtained by said specific method.

Согласно третьему аспекту изобретение относится к композиции, содержащей эти EV, для применения в качестве лекарственного средства для лечения субъектов, страдающих от ишемической болезни, расстройства системы кровообращения, иммунопаталогии, повреждения органов или нарушения функций органов.According to a third aspect, the invention relates to a composition containing these EVs for use as a medicament for the treatment of subjects suffering from ischemic disease, circulatory disease, immunopathology, organ damage or organ dysfunction.

Предшествующий уровень техникиPrior Art

Всесторонние исследования терапевтического потенциала мезенхимальных стволовых клеток (MSC, от англ. mesenchymal stem cells) для репарации и регенерации пораженных тканей были проведены как на доклинических, так и на клинических стадиях. MSC опосредуют иммуномодулирование, а также прорегенеративное действие. Например, для MSC показано, что они улучшают заживление ран у мышей с диабетом посредством стимулирования эпителизации, ангиогенеза и образования грануляционной ткани. В других исследованиях показано, что происходящие из костного мозга MSC эффективны в лечении ран, в том числе хронических ран, посредством стимулирования ангиогенеза и удаления рубцов. Непосредственное применение MSC, происходящих из костного мозга или пуповины, в случае пациентов с хроническими незаживающими ранами приводит к закрытию ран и восстановлению кожи.Comprehensive studies of the therapeutic potential of mesenchymal stem cells (MSCs) for the repair and regeneration of damaged tissues have been carried out at both preclinical and clinical stages. MSCs mediate immunomodulation as well as pro-regenerative effects. For example, MSCs have been shown to improve wound healing in diabetic mice by promoting epithelialization, angiogenesis, and granulation tissue formation. Other studies have shown that bone marrow-derived MSCs are effective in treating wounds, including chronic wounds, by promoting angiogenesis and scar removal. Direct application of MSCs derived from bone marrow or umbilical cord to patients with chronic non-healing wounds leads to wound closure and skin restoration.

В частности, РСТ/ЕР 2017/082316 относится к способу получения СD106высокаяСD151+нестин+ MSC для различных терапевтических применений, таких как, например, в случае заболеваний сосудов и наличия ран. Эти MSC демонстрируют повышение проангиогенных активностей среди других активностей.In particular, PCT/EP 2017/082316 relates to a method for producing CD106 high CD151 + nestin + MSC for various therapeutic applications, such as, for example, in the case of vascular diseases and wounds. These MSCs exhibit increased proangiogenic activities among other activities.

Были изучены механизмы, лежащие в основе целебных свойств MSC, связанных с заживлением. Интересно, что предыдущие результаты Shabbir и др., полученные согласно анализам заживления ран, не позволили сделать вывод о том, что сами MSC дифференцируются, чтобы заменить поврежденные ткани (фибробласты). Вместо этого было показано, что MSC способствуют миграции фибробластов, что является неотъемлемой частью процесса заживления, даже без прямого контакта (Shabbir и др., 2015). Это подчеркивает важность паракринной передачи сигналов между MSC и пораженными клетками. Считается, что этот паракринный эффект является результатом секреции этими MSC различных факторов и внеклеточных везикул (EV). Эти везикулы содержат двухслойную липидную мембрану, подобную таковой у исходных MSC, и несут различные белки, матричные РНК и микроРНК (карго), происходящие из этих MSC, факторы, которые усиливают эндогенные механизмы репарации и регенерации.The mechanisms underlying the healing properties of MSCs have been studied. Interestingly, Shabbir et al.'s previous results from wound healing assays did not conclude that MSCs themselves differentiate to replace damaged tissue (fibroblasts). Instead, MSCs have been shown to promote fibroblast migration, which is integral to the healing process, even without direct contact (Shabbir et al., 2015). This highlights the importance of paracrine signaling between MSCs and diseased cells. This paracrine effect is thought to result from the secretion of various factors and extracellular vesicles (EVs) by these MSCs. These vesicles contain a lipid bilayer membrane similar to that of parental MSCs and carry various proteins, messenger RNAs, and microRNAs (cargos) derived from these MSCs, factors that enhance endogenous repair and regeneration mechanisms.

Внеклеточные везикулы (EV), такие как экзосомы и микровезикулы, действительно ранее были идентифицированы как основные медиаторы этих паракринных эффектов клеток, действующие в качестве медиаторов передачи сигнала в иммунных биологических процессах (Raposo и др., 1996). С тех пор было обнаружено, что EV опосредуют взаимодействие между иммунными клетками различных типов и также между опухолевыми и иммунными клетками. В зависимости от источника клеток EV могут стимулировать или подавлять провоспалительные реакции.Extracellular vesicles (EVs), such as exosomes and microvesicles, have indeed previously been identified as major mediators of these paracrine cellular effects, acting as signal transduction mediators in immune biological processes (Raposo et al., 1996). Since then, EVs have been found to mediate interactions between different types of immune cells and also between tumor and immune cells. Depending on the cell source, EVs can stimulate or suppress proinflammatory responses.

Клетки и особенно MSC могут высвобождать множество везикул различных типов в окружающую их внеклеточную среду. В совокупности названные как EV, они включают экзосомы (30-150 нм), микровезикулы, которые образуются в виде отростков плазматической мембраны, (100-1000 нм) и апоптотические тельца (более 500 нм). Они содержат липиды, белки и РНК. Они опосредуют целенаправленную межклеточную передачу сигнала в процессах физиологической и патофизиологической коммуникации.Cells and especially MSCs can release many different types of vesicles into their surrounding extracellular environment. Collectively referred to as EVs, they include exosomes (30–150 nm), microvesicles that form as appendages of the plasma membrane (100–1000 nm), and apoptotic bodies (>500 nm). They contain lipids, proteins and RNA. They mediate targeted intercellular signal transmission in the processes of physiological and pathophysiological communication.

EV, выделенные из MSC, набирают популярность в качестве новой стратегии достижения терапевтических эффектов стволовых клеток без рисков и трудностей, отмечаемых при введении клеток пациентам. EV, происходящие из MSC, действительно имеют несколько ключевых преимуществ по сравнению с клеточными продуктами, что оправдывает усилия по внедрению EV в клинику:MSC-derived EVs are gaining popularity as a new strategy to achieve the therapeutic effects of stem cells without the risks and hassles of administering cells to patients. MSC-derived EVs do have several key advantages over cell-based products that justify efforts to bring EVs into the clinic:

- введение EV, происходящих из MSC, может быть безопасным.- administration of MSC-derived EVs may be safe.

EV, происходящие из MSC, были применены на возрастающем количестве различных животных моделей и были протестированы в случае пациента, страдающего от плохо поддающейся лечению стероидами острой формы болезни "трансплантат против хозяина" (острой формы GVHD - (от англ. graft-versus-host disease - болезни "трансплантат против хозяина")), а также в группе пациентов с хроническим заболеванием почек (Giebel и др., 2017). К настоящему времени введение EV, происходящих из MSC, по-видимому является безопасным для людей и во всех протестированных животных моделях.MSC-derived EVs have been used in an increasing number of different animal models and have been tested in a patient suffering from steroid-resistant acute graft-versus-host disease (GVHD). - graft-versus-host disease), as well as in a group of patients with chronic kidney disease (Giebel et al., 2017). To date, administration of MSC-derived EVs appears to be safe in humans and in all animal models tested.

В отличие от клеточных продуктов EV не способны к самовоспроизведению и поэтому лишены какого-либо потенциала эндогенного образования опухолей.Unlike cellular products, EVs are not capable of self-replication and therefore lack any potential for endogenous tumor formation.

Известно, что биологические свойства и функции клеток могут подвергаться влиянию и перепрограммироваться под действием факторов окружающей среды. Поскольку у EV отсутствуют подробно описанные метаболические активности, то маловероятно, что их функция может быть перепрограммирована окружающей средой. Таким образом, биологическая активность и функциональные свойства EV можно определять и контролировать с большей точностью, чем в случае клеток.It is known that the biological properties and functions of cells can be influenced and reprogrammed by environmental factors. Because EVs lack well-described metabolic activities, it is unlikely that their function can be reprogrammed by the environment. Thus, the biological activity and functional properties of EVs can be determined and controlled with greater precision than in the case of cells.

При средних размерах меньше 200 нм EV можно стерилизовать путем фильтрования. Благодаря этому ощутимо снижается риск биологического загрязнения соответствующих терапевтических средств.With average sizes less than 200 nm, EVs can be sterilized by filtration. This significantly reduces the risk of biological contamination of the respective therapeutic agents.

- С EV намного проще работать, чем с клетками.- EVs are much easier to work with than cells.

По-видимому, условия замораживания, размораживания и хранения менее критичны для EV, чем для клеток. Чтобы приготовить клеточные трансплантаты у постели больного, необходимо иметь специально обученный персонал, без которого можно обойтись в случае приготовления терапевтических средств на основе EV y постели больного.Freezing, thawing, and storage conditions appear to be less critical for EVs than for cells. To prepare cell grafts at the bedside, it is necessary to have specially trained personnel, which can be dispensed with when preparing EV-based therapeutics at the bedside.

Терапевтические EV могут быть получены из супернатантов клеточных линий, клетки которых не должны быть использованы для способов терапии с применением самих этих клеток. Таким образом, масштабирование получаемых EV может быть проведено намного проще, чем в случае терапевтических средств на основе клеток.Therapeutic EVs can be obtained from supernatants of cell lines whose cells are not intended to be used for therapies using the cells themselves. Thus, scaling up the resulting EVs can be done much more easily than with cell-based therapeutics.

Применение EV, полученных из MSC, для бесклеточной терапии набирает популярность (Phinney & Pittenger, Stem Cells, 2017), и в нескольких исследованиях продемонстрирована роль EV, секретируемых MSC, в ангиогенезе:The use of MSC-derived EVs for cell-free therapy is gaining popularity (Phinney & Pittenger, Stem Cells, 2017), and several studies have demonstrated a role for MSC-secreted EVs in angiogenesis:

- экзосомы, секретируемые MSC, стимулируют ангиогенез эндотелиальных клеток посредством переноса микроРНК-125а (Liang et al., J. Cell Sci., 2016),- exosomes secreted by MSCs stimulate angiogenesis of endothelial cells through the transfer of microRNA-125a (Liang et al., J. Cell Sci., 2016),

- экзосомы, высвобождаемые из MSC, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, способствуют заживлению ран на коже посредством стимулирования синтеза коллагена и ангиогенеза (Zhang J. и ДР., 2015),- exosomes released from MSCs derived from human induced pluripotent stem cells promote skin wound healing by stimulating collagen synthesis and angiogenesis (Zhang J. and DR., 2015),

- полученные из MSC экзосомы вызывают пролиферацию и миграцию фибробластов в случае обычных и хронических ран и усиливают ангиогенез in vitro (Shabbir и др., 2015),- MSC-derived exosomes induce fibroblast proliferation and migration in common and chronic wounds and enhance angiogenesis in vitro (Shabbir et al., 2015),

- экзосомы, полученные из MSC пуповины человека, усиливают ангиогенез посредством пути WNT4/катенин (Zhang В. и др., 2015).- exosomes derived from human umbilical cord MSCs enhance angiogenesis through the WNT4/catenin pathway (Zhang B. et al., 2015).

В обзоре Than UTT и др. от 2017 г. описаны другие исследования, в которых действительно показано, что EV вовлечены в регуляцию ряда клеточных процессов, необходимых для заживления ран. В частности, EV могли оказывать влияние на процесс коагуляции, клеточную пролиферацию, миграцию, ангиогенез, образование коллагена и ремоделирование внеклеточного матрикса. Помимо передачи информации от исходных секретирующих клеток, матричная РНК (мРНК) и микроРНК из EV также могут стимулировать биологические процессы, включая пролиферацию, ангиогенез и апоптоз.A 2017 review by Than UTT et al describes other studies that do show that EVs are involved in the regulation of a number of cellular processes required for wound healing. In particular, EVs could influence the coagulation process, cell proliferation, migration, angiogenesis, collagen formation, and extracellular matrix remodeling. In addition to transmitting information from parent secreting cells, messenger RNA (mRNA) and microRNA from EVs can also stimulate biological processes, including proliferation, angiogenesis, and apoptosis.

EV-опосредованная регуляция пролиферации клеток, важного для заживления ран процесса, была продемонстрирована с использованием EV, происходящих из клеток множества типов, таких как MSC, фибробласты, мышиные эмбриональные стволовые клетки и пропредшественники эндотелиальных клеток человека. В частности, в результате интернализации EV, происходящих из MSC, фибробластами достигается дозозависимое усиление пролиферации и миграции этих фибробластов независимо от того, произошли ли они от обычных доноров или от пациентов с хроническими ранами.EV-mediated regulation of cell proliferation, an important process for wound healing, has been demonstrated using EVs derived from multiple cell types, such as MSCs, fibroblasts, mouse embryonic stem cells, and human endothelial progenitor cells. In particular, internalization of MSC-derived EVs by fibroblasts results in a dose-dependent increase in the proliferation and migration of these fibroblasts, regardless of whether they are derived from normal donors or from patients with chronic wounds.

EV могут стимулировать пролиферацию клеток посредством активации не только сигнальных путей, непосредственно вовлеченных в стимуляцию клеточного цикла, но также сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию экспрессии факторов роста. Кроме того, такая сверхэкспрессия факторов роста может действовать, в свою очередь, в качестве паракринного или аутокринного сигналов для стимулирования пролиферации клеток.EVs can stimulate cell proliferation by activating not only signaling pathways directly involved in cell cycle stimulation, but also signaling pathways involved in the regulation of growth factor expression. In addition, such overexpression of growth factors may in turn act as paracrine or autocrine signals to promote cell proliferation.

Также было показано, что EV, высвободившиеся из таких клеток, как кератиноциты или MSC человека, оказывают влияние на миграцию эндотелиальных клеток, что является важнейшим фактором для репарации и регенерации сосудов.EVs released from cells such as human keratinocytes or MSCs have also been shown to influence endothelial cell migration, which is critical for vascular repair and regeneration.

Все типы EV (микровезикулы и экзосомы) в той или иной степени способствуют регуляции образования сосудов посредством усиления экспрессии проангиогенных факторов. Например, экзосомы, высвобождаемые под действием человеческих эмбриональных MSC и человеческих эндотелиальных клеток, усиливают ангиогенез посредством стимулирования пролиферации и миграции эндотелиальных клеток к месту раны. На участках, обработанных экзосомами, наблюдали большее количество кровеносных сосудов по сравнению с контрольной обработкой.All types of EVs (microvesicles and exosomes) contribute to varying degrees to the regulation of vascular formation by enhancing the expression of proangiogenic factors. For example, exosomes released by human fetal MSCs and human endothelial cells enhance angiogenesis by promoting proliferation and migration of endothelial cells to the wound site. More blood vessels were observed in exosome-treated areas compared to control treatment.

На основании всех этих анализов можно предположить, что EV, происходящие из MSC, можно с безопасностью применять в лечении ран и в регенеративной медицине сосудистых патологий.Based on all these analyses, it can be assumed that MSC-derived EVs can be safely used in wound treatment and regenerative medicine for vascular pathologies.

Dongdong Ti и др. (Journal of translational medicine, 2015) описали внеклеточные везикулы, очищенные из MSC, полученных из пуповины, которые предварительно обрабатывают провоспалительным фактором липополисахаридом (LPS).Dongdong Ti et al (Journal of translational medicine, 2015) described extracellular vesicles purified from umbilical cord-derived MSCs that were pretreated with the proinflammatory factor lipopolysaccharide (LPS).

Yunbing Wu и др. (BioMed Research International, 2017) описывали противовоспалительные свойства внеклеточных везикул, происходящих из нестимулированных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека.Yunbing Wu et al (BioMed Research International, 2017) described the anti-inflammatory properties of extracellular vesicles derived from unstimulated mesenchymal stem cells obtained from human umbilical cord.

Ни в одной из этих двух публикаций не предлагается добавлять интерлейкин(IL)1β и/или IL4 для стимулирования MSC с целью получения EV, обогащенных по ангиогенному маркеру CD106.Neither of these two publications suggests adding interleukin(IL)1β and/or IL4 to stimulate MSCs to generate EVs enriched for the angiogenic marker CD106.

В более широком смысле, ни в одном из документов предшествующего уровня техники даже не предполагается лечение с применением MSC вместе с IL4, не говоря уже об улучшении их проангиогенных свойств. В этом контексте авторы настоящего изобретения показали в WO 2018/108859, что культивирование MSC вместе с IL4 и IL1β приводит к значительному и неожидаемому повышению на поверхности уровня проангиогенных поверхностных маркеров, таких как CD106. В частности, как показано в примере 4 из WO 2018/108859, усиление экспрессии CD106, наблюдаемое в случае комбинации IL1β и IL4, в 3 раза превышает такое усиление, наблюдаемое в случае применения только IL1β, а усиление экспрессии CD106, наблюдаемое в случае комбинации IL1β и IL4, в 5 раз превышает такое усиление, наблюдаемое в случае применения только IL4. Такой эффект ранее никогда не наблюдали.More broadly, none of the prior art documents even suggest treating MSCs with IL4, let alone improving their pro-angiogenic properties. In this context, the present inventors showed in WO 2018/108859 that culturing MSCs together with IL4 and IL1β leads to a significant and unexpected increase in the surface level of pro-angiogenic surface markers such as CD106. In particular, as shown in Example 4 of WO 2018/108859, the increase in CD106 expression observed with the combination of IL1β and IL4 is 3 times greater than that observed with IL1β alone, and the increase in CD106 expression observed with the combination of IL1β and IL4, 5 times the increase observed with IL4 alone. This effect has never been observed before.

В представленной в данном описании работе продемонстрировано, что проангиогенная и противовоспалительная активности СD106высокаяСD151+нестин+ MSC, полученных согласно способу, описанному в РСТ/ЕР 2017/082316 (WO 2018/108859), по существу обуславливаются EV, происходящими из этих MSC. Поэтому авторы изобретения предлагают использовать биологический продукт, содержащий эти EV, поскольку, - вследствие их выработки благодаря MSC, - они демонстрируют повышенный уровень проангиогенных/провоспалительных поверхностных белков. Соответственно, этот биологический продукт проявляет такую же повышенную проангиогенную активность, что и исходные MSC, без ограничений в отношении их применения в клинической практике и в промышленности.The work presented here demonstrates that the proangiogenic and anti-inflammatory activities of CD106 high CD151 + nestin + MSCs obtained according to the method described in PCT/EP 2017/082316 (WO 2018/108859) are essentially mediated by EVs derived from these MSCs. Therefore, the inventors propose to use a biological product containing these EVs since, due to their production by MSCs, they exhibit increased levels of pro-angiogenic/pro-inflammatory surface proteins. Accordingly, this biological product exhibits the same enhanced pro-angiogenic activity as the parent MSCs, without restrictions on their use in clinical practice and industry.

Помимо наличия у них терапевтического потенциала EV можно использовать в качестве биомаркеров, в частности, при диагностике рака. Среди 35 проводимых в настоящее время клинических испытаний, относящихся к использованию экзосом при раке, приблизительно две три относятся к диагностическим средствам, а остальные к терапевтическим средствам (Roya и др., 2018).In addition to their therapeutic potential, EVs can be used as biomarkers, particularly in the diagnosis of cancer. Among the 35 ongoing clinical trials related to the use of exosomes in cancer, approximately two to three are diagnostic and the rest are therapeutic (Roya et al., 2018).

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

Таким образом, согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей внеклеточные везикулы (EV) из СD106высокаяСD151+нестин+ MSC, которые были получены согласно способу, описанному в заявке РСТ/ЕР 2017/082316 (опубликованной как WO 2018/108859).Thus, according to a first aspect, the present invention relates to a composition containing extracellular vesicles (EVs) of CD106 high CD151 + nestin + MSC, which were obtained according to the method described in the application PCT/EP 2017/082316 (published as WO 2018/108859) .

Этот способ получения включает две приведенные ниже общие стадии:This production method involves the following two general steps:

(1) культивирование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из биологической ткани или жидкости, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from biological tissue or fluid in a first culture medium free of growth factors so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells,

иAnd

(2) приведение в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей провоспалительные факторы роста или воспалительные медиаторы, в результате чего происходит образование представляющих интерес СD106высокаяСD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток, которые будут использованы для получения EV по изобретению.(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing pro-inflammatory growth factors or inflammatory mediators, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells of interest, which will be used to obtain EVs by invention.

Указанная "популяция недифференцированных MSC" может быть получена посредством сбора мононуклеарных клеток, присутствующих в биологической ткани или жидкости, и выращивания их в первой культуральной среде. Эти мононуклеарные клетки могут быть получены любым традиционным способом, например, посредством ферментативного расщепления или культивирования эксплантата в виде кусочков ткани перинатального происхождения (Otte и др., 2013), или выделения из биологических жидкостей (Van Pham и др., 2016).Said “undifferentiated MSC population” can be obtained by collecting mononuclear cells present in biological tissue or fluid and growing them in a first culture medium. These mononuclear cells can be obtained by any conventional method, such as enzymatic digestion or explant culture of perinatal tissue pieces (Otte et al., 2013), or isolation from biological fluids (Van Pham et al., 2016).

Культивирование эксплантата представляет собой особо предпочтительный способ получения таких MSC из пуповины, как показано ниже в примере 3.Explant culture is a particularly preferred method for obtaining such MSCs from umbilical cord, as shown below in Example 3.

Обычно для осуществления этого способа необходимо извлечь образец из раствора для транспортировки, разрезать на секции (длиной ориентировочно 2-3 см), дезинфицировать их антибиотиками и противогрибковыми агентами, которые затем отмывают, чтобы восстановить ткань и избавиться от кусочков указанной ткани в колбах, к которым будет происходить прикрепление (предпочтительно без среды, при комнатной температуре), после чего на прикрепившиеся эксплантаты осторожно добавить полную среду и инкубировать при 37°С в течение нескольких суток. В конечном итоге мигрирующие клетки собирают, используя соответствующие приспособления, и поддерживают в культуре в соответствующей первой среде (см. ниже), пока они не достигнут намеченной конфлюентности.Typically, this method requires removing the sample from the transport solution, cutting it into sections (approximately 2-3 cm long), disinfecting them with antibiotics and antifungal agents, which are then washed to restore the tissue and get rid of pieces of said tissue in the flasks to which Attachment will occur (preferably without medium, at room temperature), after which complete medium is carefully added to the attached explants and incubated at 37°C for several days. Ultimately, the migrating cells are collected using appropriate apparatus and maintained in culture in the appropriate first medium (see below) until they reach the intended confluency.

Указанная "первая культуральная среда" может представлять собой любую классическую среду, обычно используемую, чтобы благоприятствовать росту живых первичных клеток. Предпочтительно, она не содержит ни каких-либо факторов роста, ни каких-либо факторов дифференцировки.Said "first culture medium" may be any classical medium commonly used to promote the growth of living primary cells. Preferably, it does not contain any growth factors or any differentiation factors.

Специалисту хорошо известно, культуральные среды какого типа можно использовать в качестве "первой культуральной среды". Ими являются, например, DMEM, DMEM/F12, MEM (минимальная поддерживающая среда), MEM в альфа-модификации (α-МЕМ), IMDM (модифицированная по методу Исков среда Дульбекко) или RPMI (среда от Мемориального института Розуэлла Парка). Предпочтительно, указанной первой культуральной средой является DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) или DMEM/F12 (модифицированная Дульбекко среда Игла с питательной смесью Хэма F12).The person skilled in the art is well aware of what type of culture media can be used as the "first culture medium". Examples include DMEM, DMEM/F12, MEM (minimal maintenance medium), MEM alpha (α-MEM), IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium), or RPMI (Roswell Park Memorial Institute media). Preferably, said first culture medium is DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) or DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium with Ham's F12 nutrient mixture).

Более предпочтительно, указанная первая культуральная среда содержит 2-20% или 2-10% фетальной телячьей сыворотки. Альтернативно, указанная первая культуральная среда может содержать 1-5% тромбоцитарного лизата. Наиболее предпочтительная среда содержит 2-20% или 2-10% фетальной телячьей сыворотки и 1-5% тромбоцитарного лизата.More preferably, said first culture medium contains 2-20% or 2-10% fetal calf serum. Alternatively, said first culture medium may contain 1-5% platelet lysate. The most preferred medium contains 2-20% or 2-10% fetal bovine serum and 1-5% platelet lysate.

Кроме того, в качестве первой культуральной среды возможно применение среды, которая не содержит сыворотки крови или тромбоцитарного лизата, при условии, что она содержит другие соответствующие агенты, благоприятствующие росту первичных живых клеток.In addition, it is possible to use a medium that does not contain blood serum or platelet lysate as the first culture medium, provided that it contains other appropriate agents that promote the growth of primary living cells.

В предпочтительном воплощении указанная "биологическая ткань" представляет собой какую-либо часть плацентарной ткани или пуповины. В частности, она может включать в себя котиледоны плаценты, амниотическую мембрану или хориальную оболочку плаценты или состоять из них. Кроме того, может присутствовать вартонов студень, обнаруженный в пуповине. Она может включать в себя вены и/или артерии или не иметь их.In a preferred embodiment, said "biological tissue" is any part of placental tissue or umbilical cord. In particular, it may include or be composed of placental cotyledons, amniotic membrane or placental chorionic membrane. In addition, Wharton's jelly, found in the umbilical cord, may be present. It may or may not include veins and/or arteries.

В другом воплощении указанная "биологическая жидкость" представляет собой образец пуповинной крови, плацентарной крови или амниотической жидкости, которые в целом без причинения вреда были отобраны у женщины или млекопитающего. Например, эти ткани и жидкости могут быть получены после рождения ребенка или произведения потомства без каких-либо инвазивных процедур.In another embodiment, said "body fluid" is a sample of umbilical cord blood, placental blood or amniotic fluid that has been collected from a woman or mammal generally without causing harm. For example, these tissues and fluids can be obtained after the birth of a child or procreation without any invasive procedures.

Указанная популяция недифференцированных MSC предпочтительно представляет собой высеянную на пластиковую поверхность популяцию мезенхимальных стволовых клеток, которая была культивирована в указанной первой культуральной среде, не содержащей какого-либо фактора роста, до достижения клетками конфлюентности 85-90%.Said population of undifferentiated MSCs is preferably a plastic-plated population of mesenchymal stem cells that has been cultured in said first culture medium lacking any growth factor until the cells reach 85-90% confluency.

Систематически клетки характеризуют фенотипически методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или любым традиционным способом, чтобы определить уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR (человеческие лейкоцитарные антигены, сублокус DR).Systematically, cells are characterized phenotypically by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or any conventional method to determine the level of surface markers CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 and HLA-DR (human leukocyte antigens, DR sublocus).

Если 95% клеток экспрессируют положительные поверхностные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше 2% экспрессируют отрицательные поверхностные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR, то клетки подвергают трипсинизации и вновь высевают с низкой плотностью, например, с плотностью 1000-5000 MSC на один см2, во вторую культуральную среду.If 95% of the cells express positive surface markers CD73, CD90, CD105 and CD166, and less than 2% express negative surface markers CD45, CD34 and HLA-DR, then the cells are trypsinized and reseeded at a low density, for example, at a density of 1000-5000 MSC per cm 2 into the second culture medium.

Предпочтительно, чтобы указанная "вторая культуральная среда" представляла собой любую классическую среду, обычно используемую, чтобы благоприятствовать росту живых первичных клеток. Это может быть та же среда, что и "первая культуральная среда", или это может быть другая среда, выбранная, например, среди DMEM, DMEM/F12, MEM, альфа-MEM (α-МЕМ), IMDM или RPMI. Более предпочтительно, указанной второй культуральной средой является DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) или DMEM/F12 (модифицированная Дульбекко среда Игла с питательной смесью Хэма F12).Preferably, said "second culture medium" is any classical medium commonly used to promote the growth of living primary cells. This may be the same medium as the "first culture medium" or it may be another medium selected from, for example, DMEM, DMEM/F12, MEM, alpha-MEM (α-MEM), IMDM or RPMI. More preferably, said second culture medium is DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) or DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium with Ham's F12 nutrient mixture).

Еще более предпочтительно, чтобы указанная вторая культуральная среда содержала сыворотку крови или тромбоцитарный лизат, например, в диапазоне 2-20% фетальной телячьей сыворотки и/или 1-5% тромбоцитарного лизата. Наиболее предпочтительной второй средой является DMEM, содержащая 2-20% фетальной телячьей сыворотки и 1-5% тромбоцитарного лизата. Кроме того, в качестве второй культуральной среды возможно применение среды, которая не содержит сыворотки крови или тромбоцитарного лизата, при условии, что она содержит другие соответствующие агенты, благоприятствующие росту первичных живых клеток.Even more preferably, said second culture medium contains blood serum or platelet lysate, for example in the range of 2-20% fetal bovine serum and/or 1-5% platelet lysate. The most preferred second medium is DMEM containing 2-20% fetal bovine serum and 1-5% platelet lysate. In addition, it is possible to use a medium that does not contain blood serum or platelet lysate as the second culture medium, provided that it contains other appropriate agents that promote the growth of primary living cells.

Когда клетки достигают конфлюентности 40-50%, во вторую культуральную среду добавляют провоспалительные факторы роста или воспалительные медиаторы и клетки культивируют в указанной среде до тех пор, пока они не достигнут конфлюентности 90-95%.When the cells reach 40-50% confluency, pro-inflammatory growth factors or inflammatory mediators are added to the second culture medium and the cells are cultured in this medium until they reach 90-95% confluency.

Указанными "провоспалительными факторами роста" обычно являются интерлейкины или хемокины, которые, как известно, оказывают провоспалительный эффект. Примеры интерлейкинов, которые могут быть добавлены во вторую культуральную среду, включают альфа-фактор некроза опухоли (TNFα), IL1, IL4, IL12, IL18 и интерферон-гамма (IFNγ). Примеры хемокинов, которые могут быть добавлены во вторую культуральную среду, включают хемокины СХС-типа CXCL8, CXCL10, CXCL1, CXCL2, CXCL3, хемокины СС-типа CCL2 и CCL5. Можно использовать другие участвующие в воспалении медиаторы (такие как противовоспалительные агенты).Said “pro-inflammatory growth factors” are typically interleukins or chemokines, which are known to have a pro-inflammatory effect. Examples of interleukins that may be added to the second culture medium include tumor necrosis factor alpha (TNFα), IL1, IL4, IL12, IL18, and interferon gamma (IFNγ). Examples of chemokines that can be added to the second culture medium include CXC-type chemokines CXCL8, CXCL10, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CC-type chemokines CCL2 and CCL5. Other mediators involved in inflammation (such as anti-inflammatory agents) can be used.

В предпочтительном воплощении по меньшей мере два провоспалительных фактора роста добавляют во вторую культуральную среду, определенную выше. Эти по меньшей мере два провоспалительных фактора роста выбраны из группы, состоящей из: TNFα, IL1, IL4, IL12, IL18 и IFNγ. В более предпочтительном воплощении указанные провоспалительные факторы роста выбраны среди IL1, IL4, IL12, IL18. Еще более предпочтительно они представляют собой IL1 и IL4.In a preferred embodiment, at least two pro-inflammatory growth factors are added to the second culture medium defined above. These at least two pro-inflammatory growth factors are selected from the group consisting of: TNFα, IL1, IL4, IL12, IL18 and IFNγ. In a more preferred embodiment, said pro-inflammatory growth factors are selected from IL1, IL4, IL12, IL18. Even more preferably they are IL1 and IL4.

Типичная концентрация фактора(ов) роста, который(ые) может(могут) быть добавлен(ы) к MSC, находится в диапазоне 1-200 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-100 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-80 нг/мл. Предпочтительно, продолжительность стадии культивирования MSC вместе с фактором(ами) роста составляет по меньшей мере одни сутки, более предпочтительно двое суток.Typical concentrations of growth factor(s) that may be added to MSCs are in the range of 1-200 ng/ml, preferably in the range of 1-100 ng/ml, more preferably in the range of 10- 80 ng/ml. Preferably, the duration of the MSC culture step along with the growth factor(s) is at least one day, more preferably two days.

Термин "IL1" в данном описании означает любую изоформу интерлейкина 1, в частности, IL1α и IL1β. Изоформы IL1 могут происходить из различных источников, в зависимости от предполагаемого применения. Например, для применений в ветеринарии можно использовать IL1 животного происхождения. Предпочтительно, во вторую культуральную среду по изобретению добавляют только IL1β. В этом конкретном воплощении концентрация добавленного интерлейкина 1β может находиться в диапазоне 1-100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-40 нг/мл.The term "IL1" as used herein means any isoform of interleukin 1, in particular IL1α and IL1β. IL1 isoforms can come from different sources, depending on the intended application. For example, IL1 of animal origin can be used for veterinary applications. Preferably, only IL1β is added to the second culture medium of the invention. In this particular embodiment, the concentration of interleukin 1β added may be in the range of 1-100 ng/ml, preferably in the range of 1-50 ng/ml, more preferably in the range of 10-40 ng/ml.

Человеческий IL1-бета (IL1β или IL1b) снабжен ссылкой на номер доступа NP_000567.1. В продаже имеется рекомбинантный белок, соответствующий условиям GMP (надлежащая производственная практика) (RnD Systems, Thermofisher, Cellgenix, Peprotech).Human IL1-beta (IL1β or IL1b) is referenced under accession number NP_000567.1. GMP (Good Manufacturing Practice) compliant recombinant protein is commercially available (RnD Systems, Thermofisher, Cellgenix, Peprotech).

Термин "IL4", использованный в данном описании, означает любую изоформу интерлейкина 4. IL4 может происходить из различных источников, в зависимости от предполагаемого применения. Например, для применений в ветеринарии можно использовать IL4 животного происхождения.The term "IL4" as used herein means any isoform of interleukin 4. IL4 can be derived from a variety of sources, depending on the intended use. For example, IL4 of animal origin can be used for veterinary applications.

Человеческий IL4 снабжен ссылкой на номер доступа ААА59149. В продаже имеется рекомбинантный белок, соответствующий условиям (RnD Systems, Thermofisher, Cellgenix, Peprotech).Human IL4 is referenced under accession number AAA59149. Recombinant protein that meets the conditions is commercially available (RnD Systems, Thermofisher, Cellgenix, Peprotech).

В указанной второй среде можно использовать любую смесь разных провоспалительных факторов роста. В частности, предпочтительным воплощением является применение смеси IL1 и IL4, более конкретно, IL1β и IL4, как описано ниже в экспериментальной части.Any mixture of different pro-inflammatory growth factors can be used in said second medium. In particular, a preferred embodiment is the use of a mixture of IL1 and IL4, more particularly IL1β and IL4, as described below in the experimental section.

В этом конкретном воплощении добавленный интерлейкин 1β имеет концентрацию, находящуюся в диапазоне 1-100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-40 нг/мл, и добавленный IL4 имеет концентрацию, находящуюся в диапазоне 1-100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-40 нг/мл во второй культуральной среде. Предпочтительно, продолжительность стадии культивирования вместе с интерлейкином 1β и IL4 составляет по меньшей мере одни сутки, более предпочтительно двое суток. Обычно, концентрация добавленного интерлейкина 1β составляет 10 нг/мл, и концентрация добавленного интерлейкина IL4 составляет 10 нг/мл. Поэтому клетки предпочтительно культивируют в культуральной среде, содержащей интерлейкин как 1β, так и IL4 в концентрации 10 нг/мл, при этом продолжительность этой стадии культивирования составляет, например, двое суток.In this particular embodiment, the added interleukin 1β has a concentration in the range of 1-100 ng/ml, preferably in the range of 1-50 ng/ml, more preferably in the range of 10-40 ng/ml, and the added IL4 has a concentration in the range 1-100 ng/ml, preferably in the range of 1-50 ng/ml, more preferably in the range of 10-40 ng/ml in the second culture medium. Preferably, the duration of the culture step together with interleukin 1β and IL4 is at least one day, more preferably two days. Typically, the concentration of added interleukin 1β is 10 ng/ml, and the concentration of added interleukin IL4 is 10 ng/ml. Therefore, the cells are preferably cultured in a culture medium containing both interleukin 1β and IL4 at a concentration of 10 ng/ml, for example two days.

Чтобы определять уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR в ходе их продуцирования, можно оценивать фенотипические характеристики клеток любыми общепринятыми способами. Эти маркеры хорошо известны в данной области техники. Все антитела, полезные для определения уровня экспрессии этих маркеров, имеются в продаже.To determine the level of surface markers CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 and HLA-DR during their production, the phenotypic characteristics of cells can be assessed by any conventional means. These markers are well known in the art. All antibodies useful for determining the expression levels of these markers are commercially available.

В первую очередь экспрессию этих маркеров клеточной поверхности можно оценить, применяя хорошо известные технологии, такие как окрашивание клеточных мембран с использованием биотинилирования или других эквивалентных методов с последующей(им) и ммуно преципитацией специфическими антителами, проточной цитометрией, вестерн-блоттингом, иммуноферментным твердофазным анализом (ELISA) или проведением метода иммуноферментных пятен (ELISPOT), использованием антительных микрочипов или тканевых микрочипов в сочетании с иммуногистохимией. Другие подходящие методы включают метод резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) или резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET), методы микроскопии или гистохимии на одиночных клетках с использованием одной или нескольких длин волн возбуждения и применением любого из адаптированных оптических методов, а также электрохимические методы (методы вольтаметрии и амперометрии), методы атомно-силовой микроскопии и радиочастотные методы, например, многополюсную резонансную спектроскопию, конфокальную и не конфокальную, определение сигнала флуоресценции, люминесценции, хемилюминесценции, поглощения, отражения, пропускания и двойного лучепреломления или показателя преломления (например, методом поверхностного плазмонного резонанса, эллипсометрией, методом резонансного зеркала, методом волновода с решетчатым устройством (англ. grating coupler waveguide method) или интерферометрией), магнитно-резонансную томографию, анализ посредством электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE); фракционирование с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC); времяпролетную масс-спектроскопию с ионизацией посредством лазерной десорбции ионов из матрицы (MALDI-TOF); жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию/масс-спектрометрию (LC-MS/MS). Предпочтительно, уровни маркеров на поверхности клетки оценивают посредством FACS.First of all, the expression of these cell surface markers can be assessed using well-known technologies, such as staining of cell membranes using biotinylation or other equivalent methods, followed by immunoprecipitation with specific antibodies, flow cytometry, Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA) or by enzyme-linked immunospot testing (ELISPOT), using antibody microarrays or tissue microarrays in combination with immunohistochemistry. Other suitable methods include fluorescence resonance energy transfer (FRET) or bioluminescence resonance energy transfer (BRET), microscopy or histochemistry techniques on single cells using one or more excitation wavelengths and using any of the adapted optical techniques, and electrochemical techniques (techniques voltametry and amperometry), atomic force microscopy and radiofrequency methods, e.g. multipole resonance spectroscopy, confocal and non-confocal, fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorption, reflection, transmission and birefringence or refractive index signal determination (e.g. surface plasmon resonance, ellipsometry, resonance mirror method, grating coupler waveguide method or interferometry), magnetic resonance imaging, analysis by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE); fractionation using high performance liquid chromatography (HPLC); time-of-flight mass spectroscopy with ionization by laser desorption of ions from the matrix (MALDI-TOF); liquid chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS). Preferably, cell surface marker levels are assessed by FACS.

Конкретно, для получения представляющих интерес MSC обычно необходимо:Specifically, to obtain MSCs of interest it is usually necessary to:

а) собрать мононуклеарные клетки, содержащиеся в биологической ткани или жидкости перинатального происхождения,a) collect mononuclear cells contained in biological tissue or fluid of perinatal origin,

b) обеспечить условия для роста указанных мононуклеарных клеток в первой культуральной среде до достижения ими конфлюентности 85-90%, предпочтительно на пластиковой поверхности,b) provide conditions for the growth of said mononuclear cells in the first culture medium until they reach a confluence of 85-90%, preferably on a plastic surface,

c) после того, как 95% клеток станут экспрессировать положительные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше 2% станут экспрессировать отрицательные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR, высеять клетки при плотности 1000-5000 MSC на один см2 во вторую культуральную среду,c) after 95% of cells express positive markers CD73, CD90, CD105 and CD166, and less than 2% express negative markers CD45, CD34 and HLA-DR, seed cells at a density of 1000-5000 MSCs per cm 2 in second culture medium,

d) добавить воспалительные медиаторы или провоспалительные факторы роста в диапазоне концентрации 1-100 нг/мл после того, как клетки достигнут конфлюентности 40-50%,d) add inflammatory mediators or pro-inflammatory growth factors in the concentration range of 1-100 ng/ml after the cells reach 40-50% confluency,

e) собрать клетки, когда они достигнут конфлюентности 90-95%.e) collect cells when they reach 90-95% confluency.

Затем собранные клетки можно охарактеризовать фенотипически посредством FACS или любым традиционным способом, чтобы определить уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR. Указанные первая и вторая культуральные среды описаны выше.The collected cells can then be characterized phenotypically by FACS or any conventional method to determine the level of surface markers CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 and HLA-DR. Said first and second culture media are described above.

На стадии d) указанного способа типичная концентрация добавленного(ых) фактора(ов) роста находится в диапазоне 1-200 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-100 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-80 нг/мл. Предпочтительно, продолжительность стадии культивирования вместе с фактором(ами) роста составляет по меньшей мере одни сутки, более предпочтительно двое суток.In step d) of this method, the typical concentration of the added growth factor(s) is in the range of 1-200 ng/ml, preferably in the range of 1-100 ng/ml, more preferably in the range of 10-80 ng/ml. Preferably, the duration of the culture step together with the growth factor(s) is at least one day, more preferably two days.

На стадии d) указанного способа концентрация добавленного интерлейкина 1β или IL4 может находиться в диапазоне 1-100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-40 нг/мл. Предпочтительно, продолжительность стадии культивирования вместе с интерлейкином 1β и IL4 составляет по меньшей мере одни сутки, более предпочтительно двое суток. Обычно, концентрация добавленного интерлейкина 1β составляет 10 нг/мл, и концентрация добавленного интерлейкина IL4 составляет 10 нг/мл. Поэтому клетки предпочтительно культивируют в культуральной среде, содержащей оба интерлейкина 1β и IL4 в концентрации 10 нг/мл, причем продолжительность этой стадии культивирования составляет, например, двое суток.In step d) of this method, the concentration of added interleukin 1β or IL4 may be in the range of 1-100 ng/ml, preferably in the range of 1-50 ng/ml, more preferably in the range of 10-40 ng/ml. Preferably, the duration of the culture step together with interleukin 1β and IL4 is at least one day, more preferably two days. Typically, the concentration of added interleukin 1β is 10 ng/ml, and the concentration of added interleukin IL4 is 10 ng/ml. Therefore, the cells are preferably cultured in a culture medium containing both interleukin 1β and IL4 at a concentration of 10 ng/ml, and the duration of this culture stage is, for example, two days.

Окончательно собранные клетки будут представлять собой "MSC по изобретению", "представляющую интерес клеточную культуру", или "представляющие интерес СD106высокаяСD151+нестин+ MSC", или "EV-продуцирующие клетки". В этой клеточной культуре обычно содержится свыше 60%, предпочтительно от 60 до 70%, предпочтительно свыше 70%, предпочтительно свыше 80%, более предпочтительно свыше 90% и еще более предпочтительно свыше 95% клеток, экспрессирующих CD106. Кроме того, в ней содержится свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих CD151. Кроме того, в ней содержится свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих нестин. И наконец, в ней содержится свыше 95%, предпочтительно свыше 96%, предпочтительно свыше 97%, предпочтительно свыше 98% клеток, экспрессирующих положительные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и содержится меньше 2% клеток, экспрессирующих отрицательные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.The final collected cells will be "MSCs of the invention", "cell culture of interest", or "CD106 high CD151 + nestin + MSCs of interest", or "EV-producing cells". This cell culture typically contains greater than 60%, preferably greater than 60 to 70%, preferably greater than 70%, preferably greater than 80%, more preferably greater than 90%, and even more preferably greater than 95% of cells expressing CD106. In addition, it contains over 98%, preferably over 99% of cells expressing CD151. In addition, it contains over 98%, preferably over 99% of cells expressing nestin. Finally, it contains over 95%, preferably over 96%, preferably over 97%, preferably over 98% of cells expressing positive markers CD73, CD90, CD105 and CD166, and contains less than 2% of cells expressing negative markers CD45, CD34 and HLA-DR.

Известно, что CD106 (также известный как VCAM-1, что расшифровывается как "молекула 1 адгезии сосудистых клеток") имеет три изоформы. Последовательностями этих изоформ a, b и с являются NP_001069.1, NP_542413.1 и NP_001186763.1, соответственно. Антитела для детектирования уровня экспрессии этого конкретного биомаркера имеются в продаже (например, производимые Thermofisher, Abcam, OriGen и т.д.). Экспрессия этого маркера на поверхности MSC является очень важным свойством, поскольку он запускает проангиогенные активности, которые играют существенную роль для их терапевтического применения.CD106 (also known as VCAM-1, which stands for vascular cell adhesion molecule 1) is known to have three isoforms. The sequences of these isoforms a, b and c are NP_001069.1, NP_542413.1 and NP_001186763.1, respectively. Antibodies for detecting the expression level of this particular biomarker are commercially available (eg, manufactured by Thermofisher, Abcam, OriGen, etc.). The expression of this marker on the surface of MSCs is a very important property since it triggers pro-angiogenic activities, which are essential for their therapeutic applications.

Биомаркер нестин у людей зарегистрирован под номером NP_006608.1. Антитела для детектирования уровня экспрессии этого конкретного биомаркера имеются в продаже (например, производимые Thermofisher, Abcam и т.д.).The biomarker nestin in humans is registered under the number NP_006608.1. Antibodies for detecting the expression level of this particular biomarker are commercially available (eg, manufactured by Thermofisher, Abcam, etc.).

Биомаркер CD151 у людей зарегистрирован под номером NP_620599. Антитела для детектирования уровня экспрессии этого конкретного биомаркера имеются в продаже (например, производимые Invitrogen, Sigma-Aldrich, Abeam и т.д.).The biomarker CD151 in humans is registered under the number NP_620599. Antibodies to detect the expression level of this particular biomarker are commercially available (eg, manufactured by Invitrogen, Sigma-Aldrich, Abeam, etc.).

Более конкретно, для получения представляющих интерес MSC обычно необходимо:More specifically, to obtain MSCs of interest it is usually necessary to:

a) осуществить сбор, возможно по отдельности, плацентарных тканей от нескольких доноров;a) collect, possibly separately, placental tissues from several donors;

b) возможно выполнить с использованием 1х PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) трехкратную промывку плацентарной ткани, нарезанной на кубики размером 1 мм3, и промывку этих кубиков ткани вновь для удаления большей части крови из ткани;b) it is possible to wash placental tissue cut into 1 mm 3 cubes three times using 1x PBS (phosphate buffered saline) and wash the tissue cubes again to remove most of the blood from the tissue;

c) возможно провести процесс переваривания коллагеназой плацентарной ткани от каждого донора по отдельности, центрифугирование подвергнутой перевариванию ткани и сбор мононуклеарных клеток;c) it is possible to carry out the process of digestion of placental tissue from each donor separately with collagenase, centrifugation of the digested tissue and collection of mononuclear cells;

d) высеять собранные мононуклеарные клетки в культуральную среду;d) seed the collected mononuclear cells into the culture medium;

e) провести трипсинизацию и пересев клеток после того, как они достигнут конфлюентности 85-90%;e) carry out trypsinization and subculture of cells after they reach 85-90% confluency;

f) охарактеризовать клетки с учетом процентной доли клеток, которые экспрессируют положительные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR;f) characterize the cells based on the percentage of cells that express positive markers CD73, CD90, CD105 and CD166 and negative markers CD45, CD34 and HLA-DR;

g) высеять клетки в культуральную среду, содержащую 90% модифицированной Дульбекко среды Игла/F12-KnockOut (DMEM/F12-KO) и 10% FBS (фетальная телячья сыворотка) и факторы роста, с плотностью посева 1000-5000 MSC на один см2, когда среди них содержатся по меньшей мере 95%, экспрессирующих положительные маркеры, и не больше 2%, экспрессирующих отрицательные маркеры;g) inoculate cells in a culture medium containing 90% Dulbecco's modified Eagle's medium/F12-KnockOut (DMEM/F12-KO) and 10% FBS (fetal bovine serum) and growth factors, at a seeding density of 1000-5000 MSC per cm 2 , when among them there are at least 95% expressing positive markers, and no more than 2% expressing negative markers;

h) осуществить добавление интерлейкина 1β в диапазоне 1-100 нг/мл и возможно IL4 в диапазоне 1-100 нг/мл, как только клетки достигнут конфлюентности 40-50%,h) add interleukin 1β in the range of 1-100 ng/ml and possibly IL4 in the range of 1-100 ng/ml, once the cells reach 40-50% confluency,

i) провести трипсинизацию и сбор клеток после того, как они достигнут конфлюентности 90-95%; иi) trypsinize and harvest the cells once they reach 90-95% confluency; And

j) возможно охарактеризовать клетки с учетом процентной доли клеток, которые экспрессируют положительные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.j) it is possible to characterize cells based on the percentage of cells that express positive markers CD73, CD90, CD105 and CD166 and negative markers CD45, CD34 and HLA-DR.

Клетки, полученные посредством этих способов, далее используют для получения EV по изобретению.Cells obtained through these methods are further used to produce EVs according to the invention.

Термин "внеклеточные везикулы" (EV) представляет собой общий термин для обозначения клеточных везикул, размер которых изменяется в диапазоне от приблизительно 30 нм до нескольких мкм. Экзосомы среди них составляют наиболее полно описанные классы EV. Экзосомы имеют диаметр меньше примерно 150 нм и являются производными эндосомного компартмента. EV содержат цитозольные и мембранные белки, происходящие из родительских клеток. Содержание белка в EV зависит от их клеточного происхождения, и EV обогащены определенными молекулами, особенно эндосома-ассоциированными белками (например, CD63) и белками, вовлеченными в образование мультивезикулярных телец, а также содержат направляющие молекулы/молекулы адгезии. Примечательно, что EV содержат не только белки, но также функционально активную мРНК, длинные некодирующие РНК и микроРНК, и показано, что в некоторых случаях они доставляют этот генетический материал в реципиентные клетки.The term "extracellular vesicles" (EV) is a general term for cellular vesicles whose size ranges from approximately 30 nm to several microns. Among them, exosomes constitute the most fully characterized class of EVs. Exosomes have a diameter of less than approximately 150 nm and are derived from the endosomal compartment. EVs contain cytosolic and membrane proteins derived from parental cells. The protein content of EVs depends on their cellular origin, and EVs are enriched in certain molecules, especially endosome-associated proteins (eg, CD63) and proteins involved in multivesicular body formation, and also contain targeting/adhesion molecules. Notably, EVs contain not only proteins, but also functionally active mRNA, long noncoding RNAs, and microRNAs, and have been shown in some cases to deliver this genetic material to recipient cells.

Под "внеклеточными везикулами" или "EV" понимают мембранные везикулы, высвобождаемые клетками в свое микроокружение из своей плазматической мембраны, или внутриклеточные везикулы, извлеченные после разрушения клеточной мембраны. В контексте настоящего изобретения EV обычно имеют диаметр меньше или равный примерно 500 нм, в частности, от примерно 30 до примерно 500 нм, или от примерно 40 до примерно 500 нм, или от примерно 50 до примерно 250 нм. EV окружены фосфолипидной мембраной, которая предпочтительно содержит холестерин, сфингомиелин и церамид с относительно высокими уровнями и также предпочтительно содержит устойчивые к детергентам мембранные домены (липидные рафты).By “extracellular vesicles” or “EVs” we mean membrane vesicles released by cells into their microenvironment from their plasma membrane, or intracellular vesicles recovered after disruption of the cell membrane. In the context of the present invention, EVs typically have a diameter of less than or equal to about 500 nm, in particular from about 30 to about 500 nm, or from about 40 to about 500 nm, or from about 50 to about 250 nm. EVs are surrounded by a phospholipid membrane, which preferentially contains cholesterol, sphingomyelin and ceramide at relatively high levels and also preferably contains detergent-resistant membrane domains (lipid rafts).

Состав белков в мембранах EV аналогичен таковому в мембранах клеток. Обычно EV характеризуются наличием актина β, белков, вовлеченных в мембранный транспорт и слияние мембран (таких как Rab, ГТФазы (гуанозинтрифосфатазы), аннексины и флотиллин), компонентов эндосомального комплекса сортировки, необходимого для транспорта (ESCRT, от англ. endosomal sorting complexes required for transport) (таких как Alix), гена 101 восприимчивости к опухоли (TSG101), белков теплового шока (HSP, таких как HSPA8, HSP90AA1, HSC70 и HSC90), интегринов (таких как CD62L, CD62E или CD62P) и тетраспанинов (в частности, CD63, CD81, CD82, CD53, CD9 и/или CD37). В приведенных ниже примерах их присутствие определяют по комбинации маркеров CD9 и CD81 и по отсутствию калнексина.The protein composition of EV membranes is similar to that of cell membranes. EVs are typically characterized by the presence of actin β, proteins involved in membrane transport and membrane fusion (such as Rab, GTPases (guanosine triphosphatases), annexins and flotillin), components of the endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT, from the English endosomal sorting complexes required for transport) (such as Alix), tumor susceptibility gene 101 (TSG101), heat shock proteins (HSPs, such as HSPA8, HSP90AA1, HSC70 and HSC90), integrins (such as CD62L, CD62E or CD62P) and tetraspanins (especially CD63, CD81, CD82, CD53, CD9 and/or CD37). In the examples below, their presence is determined by the combination of CD9 and CD81 markers and the absence of calnexin.

Кроме того, в объеме изобретения рассматривается применение секретома клеток СD106высокаяСD151+нестин+ MSC, которые были получены согласно способу, описанному в РСТ/ЕР 2017/082316. Использованный в данном описании термин "секретом" обозначает все факторы, которые секретируются клеткой, включая EV, белки (факторы роста, хемокины, цитокины, молекулы адгезии, протеазы и т.д.), липиды, микроРНК, мРНК. Полагают, что секретом клеток СD106высокаяСD151+нестин+ MSC, которые были получены согласно способу, описанному в РСТ/ЕР 2017/082316, оказывает те же проангиогенные биологические эффекты, что и CD106высокаяCD151+нестин+ MSC, описанные в РСТ/ЕР 2017/082316.In addition, within the scope of the invention is the use of the secretome of CD106 high CD151 + nestin + MSC cells, which were obtained according to the method described in PCT/EP 2017/082316. As used herein, the term “secretome” refers to all factors that are secreted by a cell, including EVs, proteins (growth factors, chemokines, cytokines, adhesion molecules, proteases, etc.), lipids, microRNAs, mRNA. The secretome of CD106 high CD151 + nestin + MSC cells, which were obtained according to the method described in PCT/EP 2017/082316, is believed to have the same pro-angiogenic biological effects as CD106 high CD151 + nestin + MSC described in PCT/EP 2017/082316.

EV могут быть очищены от представляющих интерес MSC клеток различными методами, такими как методы, описанные в работах Konoshencko и др., 2018 или Lai и др., 2010.EVs can be purified from MSC cells of interest by various methods, such as those described in Konoshencko et al., 2018 or Lai et al., 2010.

Дифференциальное центрифугированиеDifferential centrifugation

Метод включает несколько стадий, в том числе по меньшей мере следующие три стадии от 1) до 3):The method includes several stages, including at least the following three stages from 1) to 3):

1) центрифугирование на малых оборотах для удаления клеток и клеточного дебриса (меньше 10000 × g),1) centrifugation at low speed to remove cells and cellular debris (less than 10,000 × g),

2) центрифугирование на более высоких оборотах для устранения более крупных везикул и, окончательно2) centrifugation at higher speeds to eliminate larger vesicles and, finally

3) высокоскоростное центрифугирование для осаждения EV (выше 100000 × g).3) high-speed centrifugation to sediment EVs (above 100,000 × g).

Полученный препарат EV далее очищают и выделенные везикулы отбирают в соответствии с их размером, используя микрофильтрацию суспензии. Центрифугирование в градиенте плотностиThe resulting EV preparation is further purified and the isolated vesicles are selected according to their size using suspension microfiltration. Density Gradient Centrifugation

Этот подход сочетает ультрацентрифугирование и применение градиента плотности сахарозы. Более конкретно, центрифугирование в градиенте плотности используют для отделения EV от не являющихся везикулами частиц, таких как белки и агрегаты белок/РНК. Таким образом, этот метод позволяет осуществлять отделение везикул от частиц, обладающих другой плотностью. Очень важным является надлежащее время центрифугирования, в противном случае во фракциях EV могут все еще присутствовать загрязняющие частицы, если они характеризуются близкой плотностью. Согласно результатам недавних исследований, для проведения центрифугирования в градиенте плотности сахарозы рекомендуется использовать EV в виде осадка после ультра центрифугирования.This approach combines ultracentrifugation and the application of a sucrose density gradient. More specifically, density gradient centrifugation is used to separate EVs from non-vesicle particles such as proteins and protein/RNA aggregates. Thus, this method allows the separation of vesicles from particles with a different density. Proper centrifugation time is very important, otherwise contaminants may still be present in the EV fractions if they are close in density. Recent studies recommend using EVs as pellets from ultracentrifugation for sucrose density gradient centrifugation.

Гельпроникающая хроматографияGel Permeation Chromatography

Гельпрон икающую хроматографию используют для разделения макромолекул на основании их размера и формы, а не молекулярной массы. В этом методе применяется колонка, заполненная пористыми полимерными шариками, содержащими многочисленные поры и каналы. Прохождение молекул через эти шарики зависит от диаметра молекул. Молекулам небольшого радиуса требуется больше времени для миграции через поры в шариках колонки, в то время как макромолекулы элюируются из колонки раньше. Гельпроникающая хроматография позволяет осуществить точное разделение молекул большого и малого размера. Кроме того, в этом методе могут быть применены разные элюирующие растворы.Gelprone chromatography is used to separate macromolecules based on their size and shape rather than molecular weight. This method uses a column filled with porous polymer beads containing numerous pores and channels. The passage of molecules through these balls depends on the diameter of the molecules. Molecules with a small radius take longer to migrate through the pores in the column beads, while macromolecules elute from the column sooner. Gel permeation chromatography allows for the precise separation of large and small molecules. In addition, different elution solutions can be used in this method.

УльтрафильтрацияUltrafiltration

Для выделения EV также можно использовать ультрафильтрационные мембраны. В зависимости от размера микровезикул этот метод позволяет осуществлять отделение EV от белков и других макромолекул с большой молекулярной массой. Кроме того, EV можно выделять посредством их захвата при прохождении через пористую структуру. Наиболее распространенные фильтрационные мембраны имеют размеры пор 0,8 мкм, 0,45 мкм или 0,22 мкм, и их можно использовать для сбора EV размером выше 800 нм, 400 нм или 200 нм. В частности, для выделения EV размером 40-100 нм была разработана реснитчатая структура на основе микростолбиков из пористого кремния (англ. micropillar porous silicon ciliated structure). На начальной стадии удаляются более крупные везикулы. На следующей стадии совокупность EV концентрируют на фильтрационной мембране. Стадия выделения является относительно короткой, но для осуществления этого метода требуется предварительная инкубация кремниевой структуры с буфером на основе PBS. На следующей стадии совокупность EV концентрируют на фильтрационной мембране.Ultrafiltration membranes can also be used to isolate EVs. Depending on the size of the microvesicles, this method allows the separation of EVs from proteins and other large molecular weight macromolecules. In addition, EVs can be released by trapping them as they pass through a porous structure. The most common filtration membranes have pore sizes of 0.8 µm, 0.45 µm or 0.22 µm and can be used to collect EVs above 800 nm, 400 nm or 200 nm. In particular, to isolate EVs with a size of 40–100 nm, a ciliated structure based on micropillar porous silicon ciliated structure was developed. At the initial stage, larger vesicles are removed. In the next step, the aggregate of EVs is concentrated on a filtration membrane. The isolation step is relatively short, but the method requires pre-incubation of the silica structure with a PBS-based buffer. In the next step, the aggregate of EVs is concentrated on a filtration membrane.

Осаждение с использованием полимеровDeposition using polymers

Метод осаждения, основанного на использовании полимеров, обычно включает смешивание биологической жидкости с содержащим полимер раствором, предназначенным для осаждения, инкубирование при 4°С и ультрацентрифугирование. Одним из наиболее распространенных полимеров, применяемых для основанного на использовании полимеров осаждения, является полиэтилен гликоль (ПЭГ), предпочтительно ПЭГ 6000 или ПЭГ 8000. Осаждение с использованием этого полимера имеет ряд преимуществ, включая умеренное воздействие на выделяемую EV и использование нейтральных рН. Разработано несколько коммерческих наборов, в которых для выделения EV применяется ПЭГ. Наиболее часто используемым набором является ExoQuick™ (System Biosciences, Mountain View, CA, USA). В недавних исследованиях было продемонстрировано, что самый высокий выход EV получали, используя метод ультрацентрифугирования совместно с набором ExoQuick™.The polymer-based sedimentation method typically involves mixing a biological fluid with a polymer-containing precipitation solution, incubating at 4°C, and ultracentrifuging. One of the most common polymers used for polymer-based deposition is polyethylene glycol (PEG), preferably PEG 6000 or PEG 8000. Deposition using this polymer has a number of advantages, including moderate impact on EV release and use of neutral pH. Several commercial kits have been developed that use PEG to isolate EVs. The most commonly used kit is ExoQuick™ (System Biosciences, Mountain View, CA, USA). Recent studies have demonstrated that the highest EV yields were obtained using the ultracentrifugation method in conjunction with the ExoQuick™ kit.

Иммунологическое выделениеImmunological isolation

Разработано несколько методов иммунологического выделения EV, основанных на использовании внешних или внутренних по отношению к поверхности мембраны EV белков либо внутриклеточных белков EV. Однако эти методы обычно применяют для обнаружения, анализа и количественного определения белков EV.Several methods have been developed for the immunological isolation of EVs, based on the use of proteins external or internal to the EV membrane surface or intracellular EV proteins. However, these methods are commonly used to detect, analyze, and quantify EV proteins.

В приведенных ниже примерах использована ультрафильтрация.The examples below use ultrafiltration.

EV, полученные путем очистки от клеток MSC, полученных согласно вышеупомянутому способу получения, в дальнейшем именуются как "EV по изобретению". Они проявляют повышенную проангиогенную активность (как и производящие их клетки MSC) по сравнению с EV предшествующего уровня техники.EVs obtained by purification from MSC cells obtained according to the above-mentioned production method are hereinafter referred to as "EVs according to the invention". They exhibit increased proangiogenic activity (as do the MSCs that produce them) compared to prior art EVs.

Как показано в приведенном ниже примере 8, эти EV характеризуются, в частности, тем, что они демонстрируют наличие:As shown in Example 8 below, these EVs are characterized in particular by the fact that they demonstrate the presence of:

(1) CD106 на детектируемом уровне, и(1) CD106 at a detectable level, and

(2) CD200 на детектируемом уровне.(2) CD200 at detectable levels.

Важно отметить, что они демонстрируют наличие проангиогенных маркеров CD106/VCAM и CD200 на более высоком уровне, чем EV предшествующего уровня техники (см. Фиг. 3). Они также демонстрируют наличие ряда других ангиогенных маркеров, таких как фактор 7 роста фибробластов (FGF7), CCL2 и ангиопоэтин 1 (см. Фиг. 4).Importantly, they demonstrate the presence of the proangiogenic markers CD106/VCAM and CD200 at higher levels than prior art EVs (see Figure 3). They also demonstrate the presence of a number of other angiogenic markers such as fibroblast growth factor 7 (FGF7), CCL2 and angiopoietin 1 (see Fig. 4).

Эти маркеры хорошо известны в данной области техники, и детектирующие их антитела имеются в продаже. Их присутствие можно оценить любым традиционным методом, таким как вестерн-блоттинг.These markers are well known in the art, and antibodies that detect them are commercially available. Their presence can be assessed by any traditional method such as Western blotting.

Согласно настоящему изобретению EV "демонстрирует наличие маркера на детектируемом уровне", если уровень присутствия указанного маркера оказывается значительным, т.е. если сигнал, связанный с окрашиванием указанного маркера (обычно полученный с использованием антитела, распознающего указанный маркер, причем антитело, например, связано с флуоресцентным красителем), который измеряют для указанного EV, превосходит сигнал, соответствующий окрашиванию EV, которые известны как не демонстрирующие наличие указанного маркера. Специалист хорошо осведомлен в том, как идентифицировать указанные клетки/маркеры, поэтому нет необходимости подробно описывать эти протоколы в данном документе.According to the present invention, an EV "demonstrates the presence of a marker at a detectable level" if the level of presence of said marker is significant, i.e. if the signal associated with staining of a specified marker (usually obtained using an antibody recognizing the specified marker, the antibody, for example, associated with a fluorescent dye) that is measured for the specified EV is greater than the signal corresponding to the staining of EVs that are known not to demonstrate the presence of the specified marker. One skilled in the art will be well versed in how to identify these cells/markers, so there is no need to describe these protocols in detail herein.

Композиция по изобретению в основном содержит внеклеточные везикулы (EV) по изобретению, образованные MSC клетками, описанными в РСТ/ЕР 2017/082316.The composition according to the invention mainly contains extracellular vesicles (EV) according to the invention, formed by MSC cells described in PCT/EP 2017/082316.

В контексте настоящего изобретения количество EV, присутствующих в композиции, предпочтительно определяют, используя устройство NanoSight (выпускаемое фирмой Malvern), и в этом случае количество EV обозначают как "рр", что соответствует количеству частиц, обнаруживаемых устройством NanoSight.In the context of the present invention, the amount of EV present in the composition is preferably determined using a NanoSight device (manufactured by Malvern), in which case the amount of EV is designated as "pp", which corresponds to the number of particles detected by the NanoSight device.

Обычно композиция по изобретению содержит от 1×108 до 1×1014 ppEV в одном мл, более предпочтительно от 1×1011 до 1×1012 ppEV в одном мл.Typically, the composition of the invention contains from 1×10 8 to 1×10 14 ppEV per ml, more preferably from 1×10 11 to 1×10 12 ppEV per ml.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение также относится к способу приготовления композиции, содержащей EV из MSC, полученных вышеупомянутым способом, включающему:According to a second aspect, the present invention also relates to a method for preparing a composition containing EVs from MSCs obtained by the above-mentioned method, comprising:

a) культивирование указанных MSC в не содержащей EV культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; иa) culturing said MSCs in an EV-free culture medium under conditions allowing their proliferation; And

b) очистку EV от этих клеток.b) purification of EVs from these cells.

Термин "не содержащая EV культуральная среда", который может быть использован в данном описании, относится, например, к классической базовой среде без добавок (такой как альфа-MEM, DMEM, DMEM/F12…) или к классической базовой среде, дополненной не содержащим везикул тромбоцитарным лизатом в количестве от 1 до 10%, предпочтительно 5%, более предпочтительно 8%. Перед приведением в контакт с MSC по изобретению она не содержит какой-либо экзогенной EV (после контакта с MSC по изобретению в этой среде начнут присутствовать EV, которые продуцируются MSC по изобретению). Таким образом, она не содержит ни сыворотки крови, ни тромбоцитарного лизата, которые могут содержать экзогенные везикулы.The term "EV-free culture medium" which may be used herein refers, for example, to a classical basal medium without additives (such as alpha-MEM, DMEM, DMEM/F12...) or to a classical basal medium supplemented with no additives. vesicles with platelet lysate in an amount of from 1 to 10%, preferably 5%, more preferably 8%. Before being brought into contact with the MSC of the invention, it does not contain any exogenous EV (after contact with the MSC of the invention, EVs that are produced by the MSC of the invention will begin to be present in this environment). Thus, it contains neither serum nor platelet lysate, which may contain exogenous vesicles.

Указанная не содержащая EV культуральная среда предпочтительно дополнена добавленным(ыми) фактором(ами) роста, концентрация которого(ых) находится в диапазоне 1-200 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-100 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-80 нг/мл. Более предпочтительно, указанная культуральная среда дополнена интерлейкином 1β и/или IL4, концентрация которых находится в диапазоне 1-100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне 1-50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне 10-40 нг/мл. Обычно, концентрация добавленного интерлейкина 1β в указанной среде составляет 10 нг/мл, и концентрация добавленного интерлейкина IL4 в указанной среде составляет 10 нг/мл. Поэтому клетки предпочтительно культивируют в не содержащей EV культуральной среде, которая содержит оба интерлейкина 1β и IL4 в концентрации 10 нг/мл, причем продолжительность этой стадии культивирования составляет, например, двое суток.Said EV-free culture medium is preferably supplemented with added growth factor(s), the concentration of which is in the range of 1-200 ng/ml, preferably in the range of 1-100 ng/ml, more preferably in the range of 10-80 ng/ml. More preferably, said culture medium is supplemented with interleukin 1β and/or IL4, the concentration of which is in the range of 1-100 ng/ml, preferably in the range of 1-50 ng/ml, more preferably in the range of 10-40 ng/ml. Typically, the concentration of added interleukin 1β in said medium is 10 ng/ml, and the concentration of added interleukin IL4 in said medium is 10 ng/ml. Therefore, the cells are preferably cultured in an EV-free culture medium that contains both interleukin 1β and IL4 at a concentration of 10 ng/ml, for example two days.

Условия, допускающие размножение MSC клеток, были описаны выше. Важный момент заключается в том, что клетки должны быть в удовлетворительном состоянии, поскольку вследствие гибели клеток и наличия апоптотических телец препарат EV может оказаться загрязненным. Таким образом, следует применять условия, допускающие амплификацию MSC клеток и поддержание их экспоненциального роста, и очистку EV необходимо проводить до окончания экспоненциальной фазы роста, т.е. до выхода на плато, когда гибель клеток становится значительной. В случае сред, содержащих компоненты из сырья животного происхождения (например, сыворотку крови), следует проводить истощение среды по EV. Для этого можно осуществить центрифугирование культуральной среды при 100000 × g в течение 8-16 часов (например, в течение ночи) при примерно 4°С.Conditions allowing the proliferation of MSC cells have been described above. An important point is that the cells must be in good condition, since due to cell death and the presence of apoptotic bodies, the EV preparation may become contaminated. Thus, conditions that allow MSC cell amplification and maintenance of exponential growth should be used, and EV purification should be carried out before the end of the exponential growth phase, i.e. until reaching a plateau, when cell death becomes significant. For media containing components of animal origin (e.g. blood serum), EV depletion of the media should be carried out. This can be done by centrifuging the culture medium at 100,000 x g for 8-16 hours (eg overnight) at approximately 4°C.

Культивирование MSC в указанных условиях обычно продолжается от 1 до 7 суток, предпочтительно от 1 до 5 суток, более предпочтительно от 2 до 3 суток, еще более предпочтительно в течение 72 ч.Cultivation of MSCs under these conditions usually lasts from 1 to 7 days, preferably from 1 to 5 days, more preferably from 2 to 3 days, even more preferably for 72 hours.

Для терапевтических целей данный способ в полном объеме предпочтительно следует проводить в стерильных условиях.For therapeutic purposes, this entire method should preferably be carried out under sterile conditions.

Очистка EV может быть проведена любым из вышеупомянутых методов (предпочтительно посредством ультрафильтрации, как показано в приведенном ниже экспериментальном разделе).Purification of EVs can be done by any of the above methods (preferably through ultrafiltration, as shown in the experimental section below).

Описанные ниже результаты также показывают, что применение способов по изобретению обеспечивает возможность образования EV, демонстрирующих высокий уровень мембранного белка CD106/VCAM1. Важно отметить, что этот белок ассоциирован с экспрессией проангиогенных цитокинов и провоспалительных белков (Han Z.C., et al., Bio-medical Materials and Engineering, 2017, и Du W. et al., Stem Cell research & therapy, 2016). Таким образом, EV no изобретению, которые демонстрируют высокий уровень белка CD106, можно использовать вследствие наличия у них проангиогенной/провоспалительной эффективности.The results described below also show that the use of the methods of the invention enables the generation of EVs exhibiting high levels of the membrane protein CD106/VCAM1. Importantly, this protein is associated with the expression of proangiogenic cytokines and proinflammatory proteins (Han Z.C., et al., Bio-medical Materials and Engineering, 2017, and Du W. et al., Stem Cell research & therapy, 2016). Thus, EVs of the invention that exhibit high levels of CD106 protein can be used due to their proangiogenic/proinflammatory efficacy.

Katoh & Katoh [Stem Cell Investig., 2019, 6: 10) упоминают, что CD200 участвует во множестве физиологических и патологических процессов на стыке ремоделирования сосудов и иммунной регуляции. CD200 представляет собой трансмембранный белок, который экспрессируется в ряде клеток, таких как В- и Т-лимфоциты, эндотелиальные клетки, нейроны и островковые клетки поджелудочной железы, и экспрессия которого усиливается под действием IL4. CD200 передает сигналы через рецептор CD200 (CD200R), трансмембранный белок. Опосредуемая CD200-CD200R передача сигнала играет критическую роль в случаях рака и нераковых заболеваний посредством регуляции иммунитета и ангиогенеза. Например, по сравнению с CD200- клетками меланомы В16, CD200+ клетки меланомы В16 демонстрируют усиленный онкогенез вследствие размножения клеток этой миелоидной линии и повышенного опухолевого ангиогенеза, что показано на мышах с нокаутом гена Cd200r.Katoh & Katoh [Stem Cell Investig., 2019, 6: 10] mention that CD200 is involved in a variety of physiological and pathological processes at the interface of vascular remodeling and immune regulation. CD200 is a transmembrane protein that is expressed in a number of cells, such as B and T lymphocytes, endothelial cells, neurons and pancreatic islet cells, and whose expression is upregulated by IL4. CD200 signals through the CD200 receptor (CD200R), a transmembrane protein. CD200-CD200R-mediated signaling plays a critical role in cancer and non-cancer diseases through the regulation of immunity and angiogenesis. For example, compared with CD200− B16 melanoma cells, CD200+ B16 melanoma cells demonstrate enhanced tumorigenesis due to proliferation of cells of this myeloid lineage and increased tumor angiogenesis, as shown in Cd200r knockout mice.

В связи с этим, согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей внеклеточные везикулы, происходящие из СD106высокаяСD151+нестин+ MSC, полученных согласно способу, описанному в РСТ/ЕР 2017/082316, для применения для лечения субъектов, страдающих от ишемической болезни, расстройства системы кровообращения, иммунопаталогии, повреждения органов или нарушения функций органов. Другими словами, изобретение относится к применению указанных EV для приготовления лекарственного средства, предназначенного к использованию для лечения субъектов, страдающих от ишемической болезни или от расстройства системы кровообращения. Кроме того, лекарственное средство по изобретению можно применять в отношении капиллярной сети сосудов кожи и можно включать в состав наносимых на кожу дерматологических и косметических композиций.In this regard, according to a third aspect, the present invention relates to a composition containing extracellular vesicles derived from CD106 high CD151 + nestin + MSC, obtained according to the method described in PCT/EP 2017/082316, for use in the treatment of subjects suffering from ischemic diseases, circulatory system disorders, immunopathologies, organ damage or organ dysfunction. In other words, the invention relates to the use of said EVs for the preparation of a medicament intended for use in the treatment of subjects suffering from coronary artery disease or a circulatory system disorder. In addition, the medicinal product according to the invention can be applied to the capillary network of blood vessels of the skin and can be included in dermatological and cosmetic compositions applied to the skin.

Предпочтительно, композиция по изобретению не содержит каких-либо клеток; в частности, она не содержит каких-либо MSC клеток. Обычно в качестве единственного действующего начала она содержит только EV по изобретению. Кроме того, она может содержать фармацевтический носитель или адъювант, указанный ниже.Preferably, the composition according to the invention does not contain any cells; in particular, it does not contain any MSC cells. Typically it contains only the EV according to the invention as the only active principle. In addition, it may contain a pharmaceutical carrier or adjuvant as specified below.

Композицию, содержащую EV по изобретению, вводят в терапевтически эффективных количествах.The EV-containing composition of the invention is administered in therapeutically effective amounts.

Использованный в данном описании термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, достаточному для предполагаемого применения. В случае проангиогенных композиций по изобретению он относится к количеству, достаточному, чтобы вызвать миграцию и/или пролиферацию эндотелиальных клеток.As used herein, the term “therapeutically effective amount” refers to an amount sufficient for the intended use. In the case of proangiogenic compositions according to the invention, it refers to an amount sufficient to induce migration and/or proliferation of endothelial cells.

Вводимая доза может варьировать в зависимости от возраста субъекта, площади поверхности тела или массы тела либо от пути введения и связанной с ним биодоступности. Такая адаптация дозы хорошо известна специалистам в данной области техники.The dose administered may vary depending on the age of the subject, body surface area or body weight, or the route of administration and associated bioavailability. Such dose adaptation is well known to those skilled in the art.

Лечению композициями/EV по изобретению может быть подвергнуто любое млекопитающее. Указанным млекопитающим может быть домашнее животное (собака, кошка, лошадь и т.д.) или животное - представитель крупного рогатого скота (овца, коза, корова и т.д.). Специалисту очевидно, что, если животное получает лечение согласно способу по изобретению, то изначальные недифференцированные MSC будут получены из биологического образца от того же вида животных (аллогенного трансплантата) или от схожего вида (гетерологичного трансплантата), и факторы роста, которые используются во второй культуральной среде, будут соответствовать факторам роста животного того же вида. Например, если получает лечение кошка, то изначальные MSC будут получены из ткани перинатального происхождения или биологической жидкости кошки, и во вторую культуральную среду будет добавлен IL1β кошки (рекомбинантный или нет), возможно наряду с IL4 кошки.Any mammal can be treated with the compositions/EVs of the invention. Said mammal may be a domestic animal (dog, cat, horse, etc.) or a livestock animal (sheep, goat, cow, etc.). It will be apparent to one skilled in the art that if an animal is treated according to the method of the invention, the initial undifferentiated MSC will be obtained from a biological sample from the same animal species (allogeneic graft) or from a similar species (heterologous graft), and the growth factors that are used in the second culture environment will correspond to the growth factors of an animal of the same species. For example, if a cat is being treated, the initial MSCs will be derived from perinatal tissue or body fluid of the cat, and feline IL1β (recombinant or not) will be added to the second culture medium, possibly along with feline IL4.

В предпочтительном воплощении указанным млекопитающим является человек. В этом случае изначальные MSC будут получены из ткани перинатального происхождения или биологической жидкости, полученной от женщины, и во вторую культуральную среду будет добавлен человеческий IL1β (рекомбинантный или нет), возможно наряду с человеческим IL4.In a preferred embodiment, said mammal is a human. In this case, the initial MSCs would be derived from perinatal tissue or body fluid obtained from the woman, and human IL1β (recombinant or not) would be added to the second culture medium, possibly along with human IL4.

С этой целью указанному субъекту можно вводить или применять местно композицию по изобретению любым общепринятым способом. В этом случае, настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего от ишемической болезни, расстройства системы кровообращения, иммунопаталогии, повреждения органов или нарушения функций органов, причем указанный способ включает стадию введения описанной выше композиции указанному субъекту. Такое введение может быть осуществлено посредством использования имплантируемого резервуара, или путем инъекции EV in situ в мышцу, или посредством внутривенных инъекций, или с использованием любой соответствующей системы доставки. Кроме того, введение можно выполнить местно путем непосредственного приведения в контакт EV с кожей или слизистой оболочкой, либо путем нанесения EV на кожу или на любую слизистую оболочку с использованием устройства, либо путем доставки EV с использованием любой соответствующей системы доставки в кожу или любую слизистую оболочку.For this purpose, the composition of the invention can be administered or applied topically to said subject by any conventional method. In this case, the present invention relates to a method of treating a subject suffering from coronary artery disease, circulatory system disorder, immunopathology, organ damage or organ dysfunction, said method comprising the step of administering the above-described composition to said subject. Such administration may be accomplished through the use of an implantable reservoir, or by in situ injection of the EV into the muscle, or by intravenous injection, or using any suitable delivery system. In addition, administration can be accomplished locally by directly bringing the EV into contact with the skin or mucosa, or by applying the EV to the skin or any mucosa using a device, or by delivering the EV using any suitable delivery system to the skin or any mucosa .

Предпочтительно, указанное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из: сахарного диабета 1 типа, диабета II типа, GVHD, апластической анемии, рассеянного склероза, мышечной дистрофии Дюшенна, ревматоидного артрита, мозгового инсульта, идиопатического легочного фиброза, дилатационной кардиомиопатии, остеоартрита, цирроза, печеночной недостаточности, почечной недостаточности, окклюзионного заболевания периферических артерий, критической ишемии конечностей, заболевания периферических сосудов, сердечной недостаточности, диабетической язвы или любого дегенеративного заболевания, синехии, патологии эндометрия или фиброзного поражения желудочно-кишечного тракта, такого как свищ прямой кишки. Более предпочтительно, указанное заболевание или расстройство представляет собой окклюзионное заболевание периферических артерий, критическую ишемию конечностей, заболевание периферических сосудов или диабетическую язву. В конкретном воплощении указанное заболевание или расстройство представляет собой заболевание кожи или слизистой оболочки, включая (но не ограничиваясь этим) диабетическую язву, язву, травму, ожог, ожог паром или жидкостью, рану или проблему с заживлением ран, пролежень, бородавку и так далее.Preferably, said disease or disorder is selected from the group consisting of: diabetes mellitus type 1, diabetes type II, GVHD, aplastic anemia, multiple sclerosis, Duchenne muscular dystrophy, rheumatoid arthritis, cerebral stroke, idiopathic pulmonary fibrosis, dilated cardiomyopathy, osteoarthritis, cirrhosis , liver failure, renal failure, peripheral arterial occlusive disease, critical limb ischemia, peripheral vascular disease, heart failure, diabetic ulcer or any degenerative disease, synechia, endometrial pathology or fibrotic lesion of the gastrointestinal tract such as rectal fistula. More preferably, said disease or disorder is peripheral arterial occlusive disease, critical limb ischemia, peripheral vascular disease or diabetic ulcer. In a specific embodiment, said disease or disorder is a skin or mucosal disease, including (but not limited to) a diabetic ulcer, ulcer, injury, burn, steam or liquid burn, wound or wound healing problem, bedsore, wart, and so on.

EV по изобретению более конкретно можно использовать в дерматологическом препарате, цель создания которого заключается в лечении таких кожных патологий, как ожоги, раны, язвы, рубцы, бородавки или другие заболевания, такие как синехия или фиброзные поражения желудочно-кишечного тракта (например, свищ прямой кишки).EV according to the invention can be more specifically used in a dermatological preparation, the purpose of which is to treat skin pathologies such as burns, wounds, ulcers, scars, warts or other diseases such as synechia or fibrous lesions of the gastrointestinal tract (for example, fistula rectum intestines).

В другом конкретном воплощении указанное заболевание или расстройство представляет собой свищ прямой кишки или повреждение эндометрия.In another specific embodiment, said disease or disorder is a rectal fistula or endometrial injury.

Настоящей заявкой охватываются и другие применения. В частности, существует возможность применения EV и композиций по изобретению для решения диагностических, дерматологических и косметических задач, например, для регенерации клеток кожи или слизистой оболочки, улучшения внешнего вида кожи или слизистой оболочки, исправления дефекта кожи или слизистой оболочки либо для заживления обожженного участка кожи или слизистой оболочки.Other applications are covered by this application. In particular, it is possible to use EVs and compositions according to the invention to solve diagnostic, dermatological and cosmetic problems, for example, to regenerate cells of the skin or mucous membrane, improve the appearance of the skin or mucous membrane, correct a defect in the skin or mucous membrane, or heal a burned area of the skin or mucous membrane.

Чтобы повысить эффективность и облегчить введение лекарственного средства по изобретению, EV по изобретению можно смешивать с любым агентом, композицией агентов или сочетать с другим биологически совместимым материалом или устройством. Кроме того, EV по изобретению могут быть инкапсулированы или включены в любую соответствующую систему доставки или любой соответствующий биосовместимый материал. EV или композиции, содержащие их, можно применять вместе с медицинским устройством, таким как эндоскоп, стент или шприц, например. Его также можно наносить местно путем приведения в контакт EV с кожей или слизистой оболочкой.To increase the effectiveness and facilitate the administration of the drug of the invention, the EV of the invention can be mixed with any agent, composition of agents, or combined with other biocompatible material or device. In addition, the EVs of the invention can be encapsulated or included in any suitable delivery system or any suitable biocompatible material. EVs or compositions containing them can be used in conjunction with a medical device such as an endoscope, stent or syringe, for example. It can also be applied topically by bringing the EV into contact with the skin or mucous membrane.

В случае внутривенного, внутриопухолевого или интраназального введения могут быть использованы водные суспензии, изотонические физиологические растворы или стерильные инъекционные растворы, которые содержат фармакологически совместимые диспергирующие агенты и/или увлажняющие агенты. В качестве эксципиента можно использовать, воду, спирты, пол иолы, глицерин, растительные масла и так далее.In the case of intravenous, intratumoral or intranasal administration, aqueous suspensions, isotonic saline solutions or sterile injection solutions that contain pharmacologically compatible dispersing agents and/or wetting agents can be used. As an excipient you can use water, alcohols, polyols, glycerin, vegetable oils and so on.

В случае местного введения композиции могут быть представлены в форме геля, пасты, мази, крема, лосьона, водной или водной-спиртовой жидкой суспензии, масляного раствора, дисперсии типа лосьона или сыворотки, безводного или липофильного геля, эмульсии жидкой или полутвердой консистенции типа молока, приготовленной путем диспергирования жировой фазы в водной фазе или наоборот, суспензий или эмульсий мягкой или полутвердой консистенции типа крема или геля либо, альтернативно, микроэмульсий, микрокапсул, микрочастиц или везикулярных дисперсий ионного и/или неионного типа. Эти композиции готовят согласно стандартным способам. Кроме того, в композицию можно включить поверхностно-активное вещество, чтобы обеспечить более глубокое проникновение EV. Агент, обеспечивающий улучшенное проникновение, может быть выбран, например, из минерального масла, этанола, триацетина, глицерина и пропиленгликоля; агенты когезии выбраны, например, из группы, содержащей полиизобутилен, поливинилацетат, поливиниловый спирт и загустители.In the case of local administration, the compositions may be presented in the form of a gel, paste, ointment, cream, lotion, aqueous or aqueous-alcoholic liquid suspension, oily solution, lotion or serum-type dispersion, anhydrous or lipophilic gel, liquid or semi-solid milk-type emulsion, prepared by dispersing a fatty phase in an aqueous phase or vice versa, suspensions or emulsions of a soft or semi-solid consistency such as a cream or gel or, alternatively, microemulsions, microcapsules, microparticles or vesicular dispersions of the ionic and/or non-ionic type. These compositions are prepared according to standard methods. In addition, a surfactant can be included in the composition to provide deeper penetration of the EV. The penetration enhancing agent may be selected from, for example, mineral oil, ethanol, triacetin, glycerol and propylene glycol; the cohesive agents are selected, for example, from the group consisting of polyisobutylene, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol and thickeners.

Подходящие составы для перорального введения, предназначенные для введения стандартных доз, в первую очередь включают таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, пилюли, капсулы и мягкие желатиновые капсулы, пероральные порошки, гранулы, растворы и суспензии.Suitable oral formulations for unit dosage administration primarily include tablets, film-coated tablets, pills, capsules and soft gelatin capsules, oral powders, granules, solutions and suspensions.

В случае приготовления твердой композиции в форме таблетки основной активный ингредиент можно смешивать с фармацевтическим разбавителем, таким как желатин, крахмал, лактоза, стеариновая кислота или стеарат магния, тальк, аравийская камедь или аналоги. Таблетки могут быть покрыты оболочкой из сахарозы или других подходящих материалов или даже быть обработаны таким образом, чтобы они оказывали пролонгированное или замедленное действие и непрерывно высвобождали определенное заранее количество активного ингредиента.If a solid composition is prepared in tablet form, the main active ingredient may be mixed with a pharmaceutical diluent such as gelatin, starch, lactose, stearic acid or magnesium stearate, talc, gum acacia or analogues. The tablets may be coated with sucrose or other suitable materials, or even processed so that they have a sustained or delayed action and continuously release a predetermined amount of the active ingredient.

Препарат в форме капсулы может быть приготовлен путем смешивания активного ингредиента с разбавителем и заливки полученной смеси в мягкие или твердые капсулы вместе с такими эксципиентами, как растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и так далее.The capsule formulation can be prepared by mixing the active ingredient with a diluent and filling the resulting mixture into soft or hard capsules along with excipients such as vegetable oils, waxes, fats, semi-solid or liquid polyols and so on.

Препарат в форме сиропа или эликсира может содержать активный ингредиент вместе с подсластителем, антисептиком, а также придающим вкус агентом и подходящим красителем. Можно использовать такие эксципиенты, как вода, полиолы, сахароза, инвертированный сахар, глюкоза и так далее.The preparation in the form of a syrup or elixir may contain the active ingredient together with a sweetener, an antiseptic, a flavoring agent and a suitable coloring agent. Excipients such as water, polyols, sucrose, invert sugar, glucose and so on can be used.

Порошки или диспергируемые в воде гранулы могут содержать активный ингредиент в смеси с диспергирующими агентами, увлажняющими агентами и суспендирующими агентами вместе с корректорами вкуса и подсластителями.Powders or water-dispersible granules may contain the active ingredient mixed with dispersing agents, wetting agents and suspending agents together with flavor correctors and sweeteners.

В случае подкожного введения можно использовать любой подходящий фармацевтически приемлемый разбавитель. В частности, можно использовать фармацевтически приемлемый масляный разбавитель, такой как кунжутное масло.For subcutaneous administration, any suitable pharmaceutically acceptable diluent may be used. In particular, a pharmaceutically acceptable oily diluent such as sesame oil may be used.

Настоящее изобретение также направлено на разработку медицинского устройства назначения, содержащего EV по изобретению. Под "медицинским устройством" в данном описании понимается любой инструмент, прибор, приспособление, машина, оборудование, имплантат, реагент для введения терапевтической композиции. В контексте данного изобретения указанным медицинским устройством является, например, пластырь, стент, эндоскоп или шприц.The present invention is also directed to the development of a medical device containing the EV of the invention. By “medical device” as used herein is meant any instrument, device, fixture, machine, equipment, implant, reagent for administering a therapeutic composition. In the context of the present invention, said medical device is, for example, a patch, a stent, an endoscope or a syringe.

Настоящее изобретение также направлено на разработку системы доставки, содержащей EV по изобретению. Под "системой доставки" в данном описании понимается любая система (среда или носитель) для введения фармацевтического продукта пациенту. Это может быть система для пероральной доставки или система с регулируемым высвобождением. В контексте изобретения указанной системой доставки являются, например, липосомы, пролипосомы, микросферы, микро- или нановезикулы из биополимеров, липиды или наночастицы.The present invention is also directed to the development of a delivery system containing the EVs of the invention. By "delivery system" as used herein is meant any system (medium or carrier) for administering a pharmaceutical product to a patient. This may be an oral delivery system or a controlled release system. In the context of the invention, said delivery system is, for example, liposomes, proliposomes, microspheres, micro- or nanovesicles made of biopolymers, lipids or nanoparticles.

В предпочтительном воплощении изобретения EV по изобретению включены в гидрогель или другой биосовместимый материал или эксципиент.Указанный гидрогель в первую очередь может включать гидрогель на основе альгината натрия, гидрогель на основе гиалуроновой кислоты, гидрогель на основе хитозана, гидрогель на основе коллагена, гидрогель на основе гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМС), гидрогель на основе поли-L-лизина, гидрогель на основе поли-L-глутаминовой кислоты, гидрогель на основе поливинилового спирта (PVA), гидрогель на основе полиакриловой кислоты, гидрогель на основе полиметилакриловой кислоты, гидрогель на основе полиакриламида (РАМ) и гидрогель на основе поли-N-акриламида (PNAM).In a preferred embodiment of the invention, the EVs of the invention are included in a hydrogel or other biocompatible material or excipient. Said hydrogel may primarily include a sodium alginate hydrogel, a hyaluronic acid hydrogel, a chitosan hydrogel, a collagen hydrogel, a hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. (HPMC), poly-L-lysine hydrogel, poly-L-glutamic acid hydrogel, polyvinyl alcohol (PVA) hydrogel, polyacrylic acid hydrogel, polymethylacrylic acid hydrogel, polyacrylamide (PAM) hydrogel ) and hydrogel based on poly-N-acrylamide (PNAM).

Настоящее изобретение также относится к гидрогелю, содержащему EV по изобретению и возможно другой биосовместимый материал или эксципиент. В данном изобретении предпочтителен гидрогель на основе альгината, такой как гидрогель на основе альгината, описанный в CN 106538515.The present invention also relates to a hydrogel containing the EV of the invention and possibly other biocompatible material or excipient. In the present invention, an alginate-based hydrogel such as the alginate-based hydrogel described in CN 106538515 is preferred.

В контексте настоящего изобретения "биосовместимые материалы" представляют собой материалы, традиционно используемые в биомедицинских приложениях. Ими являются, например, металлы (такие как нержавеющая сталь, кобальтовые сплавы, титановые сплавы), керамика (оксид алюминия, диоксид циркония, фосфаты кальция), полимеры (силиконы, полиэтилен, поливинилхлорид, полиуретаны, полилактиды) или природные полимеры (альгинат, коллаген, желатин, эластин и т.д.). Эти материалы могут быть синтетическими или натуральными. Биосовместимые эксципиенты хорошо известны в данной области техники, и поэтому нет необходимости в их подробном описании.In the context of the present invention, "biocompatible materials" are materials traditionally used in biomedical applications. These are, for example, metals (such as stainless steel, cobalt alloys, titanium alloys), ceramics (aluminum oxide, zirconium dioxide, calcium phosphates), polymers (silicones, polyethylene, polyvinyl chloride, polyurethanes, polylactides) or natural polymers (alginate, collagen , gelatin, elastin, etc.). These materials can be synthetic or natural. Biocompatible excipients are well known in the art and therefore need not be described in detail.

Такой гидрогель можно использовать для косметических или терапевтических целей.This hydrogel can be used for cosmetic or therapeutic purposes.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или ветеринарной композиции, содержащей EV по изобретению, а также к ее применению для лечения заболеваний и расстройств, упомянутых выше. Оно также относится к дерматологической или косметической композиции, содержащей EV по изобретению.The present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition containing the EVs of the invention, as well as its use for the treatment of diseases and disorders mentioned above. It also relates to a dermatological or cosmetic composition containing an EV according to the invention.

Такая фармацевтическая, ветеринарная или косметическая композиция может дополнительно содержать другие биосовместимые агенты (например, гидрогель), которые описаны выше.Such pharmaceutical, veterinary or cosmetic composition may further contain other biocompatible agents (eg, hydrogel) as described above.

Указанная композиция предпочтительно содержит от 1×108 до 1×1014 ppEV на один мл; более предпочтительно от 1×1011 до 1×1012 ppEV на один мл.Said composition preferably contains from 1×10 8 to 1×10 14 ppEV per ml; more preferably 1×10 11 to 1×10 12 ppEV per ml.

Описание фигурDescription of the figures

На Фиг. 1 представлены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие наличие/отсутствие маркеров CD9, CD81 и калнексина во внеклеточных везикулах, очистка которых описана в разделе Примеры. Дорожка А - клеточный лизат MDA клеток; дорожка В - клеточный лизат MSC по изобретению в альфа-MEM; дорожка С - EV по изобретению в альфа-МЕМ.In FIG. Figure 1 shows the results of Western blotting demonstrating the presence/absence of CD9, CD81 and calnexin markers in extracellular vesicles, the purification of which is described in the Examples section. Lane A - cell lysate of MDA cells; Lane B - MSC cell lysate according to the invention in alpha-MEM; Lane C - EV according to the invention in alpha-MEM.

На Фиг. 2 представлены результаты анализа хемотаксической миграции в камере Бойдена, демонстрирующие паракринный эффект клеток, использованных для получения EV по изобретению, в отношении ECFC (от англ. endothelial colony forming cells - эндотелиальных колониеобразующих клеток) в присутствии или в отсутствие сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). Столбец Т - уровень миграции в контрольной среде в отсутствие (-)/присутствии (+) VEGF (50 нг/мл). Столбец 1 - уровень миграции клеток из партии 1 в отсутствие (-)/присутствии (+) VEGF (50 нг/мл). Столбец 2 - уровень миграции клеток из партии 2 в отсутствие (-)/присутствии (+) VEGF (50 нг/мл). Столбец 3 - уровень миграции клеток из партии 3 в отсутствие (-)/присутствии (+) VEGF (50 нг/мл).In FIG. Figure 2 presents the results of a Boyden chamber chemotactic migration assay demonstrating the paracrine effect of the cells used to obtain the EVs of the invention on ECFC (endothelial colony forming cells) in the presence or absence of vascular endothelial growth factor (VEGF) . Column T is the level of migration in the control medium in the absence (-)/presence (+) of VEGF (50 ng/ml). Column 1 - level of cell migration from batch 1 in the absence (-)/presence (+) of VEGF (50 ng/ml). Column 2 - level of cell migration from batch 2 in the absence (-)/presence (+) of VEGF (50 ng/ml). Column 3 - level of cell migration from batch 3 in the absence (-)/presence (+) of VEGF (50 ng/ml).

На Фиг. 3 представлены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие содержимое EV, происходящих из MSC, предварительно обработанных в трех разных условиях: дорожка А - EV, происходящие из нестимулированных MSC, дорожка В - EV, происходящие из MSC, стимулированных IL1β и IL4 (EV по изобретению), и дорожка С - EV, происходящие из MSC, стимулированных LPS, как описано в примере 8. Протестировано шесть маркеров (CD9, CD81, Alix (от англ. ALG-2-interacting protein X - белок X, взаимодействующий с ALG-2), калнексин, VCAM (англ. vascular cell adhesion molecule - васкулярная молекула клеточной адгезии) и CD200). В лунку добавлено 20 мкг EV.In FIG. 3 shows Western blot results showing the content of EVs derived from MSCs pretreated under three different conditions: Lane A - EVs derived from unstimulated MSCs; Lane B - EVs derived from MSCs stimulated with IL1β and IL4 (EVs of the invention) , and track C - EVs originating from MSCs stimulated with LPS, as described in example 8. Six markers were tested (CD9, CD81, Alix (ALG-2-interacting protein X) , calnexin, VCAM (English vascular cell adhesion molecule - vascular cell adhesion molecule) and CD200). 20 µg EV was added to the well.

На Фиг. 4 демонстрируется различное содержание разных, связанных с ангиогенезом белков, определенное с использованием набора белков для EV, происходящих из MSC, предварительно обработанных в трех разных условиях (из нестимулированных, IL-стимулированных и LPS-стимулированных). Для каждого белка приводится средняя пиксельная интенсивность.In FIG. Figure 4 demonstrates the differential abundance of different angiogenesis-related proteins determined using a panel of proteins for MSC-derived EVs pretreated under three different conditions (unstimulated, IL-stimulated, and LPS-stimulated). The average pixel intensity is given for each protein.

На Фиг. 5 представлены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие содержимое MSC, предварительно обработанных в трех разных условиях: дорожка А - нестимулированные MSC, дорожка В - MSC, стимулированные IL1β и IL4 (MSC по изобретению), и дорожка С - MSC, стимулированные LPS, как описано в примере 8. Протестировано шесть маркеров (CD9, CD81, Alix, калнексин, VCAM и CD200). В лунку добавлен лизат в количестве, соответствующем 20 мкг белка.In FIG. 5 shows Western blot results showing the contents of MSCs pretreated under three different conditions: Lane A - unstimulated MSCs, Lane B - MSCs stimulated with IL1β and IL4 (MSCs of the invention), and Lane C - MSCs stimulated with LPS as described in example 8. Six markers were tested (CD9, CD81, Alix, calnexin, VCAM and CD200). Lysate was added to the well in an amount corresponding to 20 μg of protein.

ПримерыExamples

Для простоты и в иллюстративных целях настоящее изобретение описывается со ссылкой на свои типичные воплощения. Однако, специалисту средней квалификации в данной области техники будет очевидно, что настоящее изобретение может быть реализовано на практике без ограничения этими конкретными подробностями. В других случаях хорошо известные способы подробно не описаны, чтобы излишне не затруднять понимание настоящего изобретения.For simplicity and illustrative purposes, the present invention is described with reference to its typical embodiments. However, it will be apparent to one of ordinary skill in the art that the present invention can be practiced without limitation to these specific details. In other cases, well-known methods are not described in detail so as not to unduly obscure the understanding of the present invention.

Все приведенные ниже стадии 1-4 проведены так, как описано в разделе Примеры заявки РСТ/ЕР 2017/082316, которая тем самым включена посредством ссылки.All steps 1-4 below are carried out as described in the Examples section of application PCT/EP 2017/082316, which is hereby incorporated by reference.

1. Выделение проангиогенных происходящих из пуповины мезенхимальных стволовых клеток (UCMSC)1. Isolation of pro-angiogenic umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSC)

Пуповину извлекали из раствора для транспортировки и разрезали на секции длиной 2-3 см. Каждый сегмент, содержащий сгусток крови, который невозможно было удалить, отбрасывали, чтобы избежать загрязнения прикрепившимися клетками крови. Затем эти секции дезинфицировали, промывая в ванне с антибиотиками и противогрибковыми агентами, содержащей αМЕМ плюс ванкомицин (1 г/л) плюс амоксициллин (1 г/л) плюс амикацин (500 мг/л) плюс амфотерицин В (50 мг/л), в течение 30 мин при комнатной температуре (КТ). Антибиотики растворяли в стерильной воде для инъекций экстемпорально.The umbilical cord was removed from the transport solution and cut into 2-3 cm sections. Each segment containing a blood clot that could not be removed was discarded to avoid contamination by attached blood cells. These sections were then disinfected by washing in an antibiotic and antifungal bath containing αMEM plus vancomycin (1 g/L) plus amoxicillin (1 g/L) plus amikacin (500 mg/L) plus amphotericin B (50 mg/L), for 30 min at room temperature (RT). Antibiotics were dissolved in sterile water for injection extemporaneously.

Секции пуповины извлекали из ванны и быстро промывали в 1× PBS при комнатной температуре (КТ). Делали легкие надрезы на поверхностном слое эпителия, не затрагивая сосуды. Затем секцию разделяли на более мелкие срезы толщиной 0,5 см и помещали на дно площадью 150 см2 пластиковой колбы с крышкой. Срезы в количестве от 6 до 10 на одну колбу размещали так, чтобы вокруг каждого среза оставалось свободное пространство радиусом по меньшей мере 1 см, и оставляли прикрепляться в течение 15 мин при КТ без добавления среды.Umbilical cord sections were removed from the bath and quickly washed in 1× PBS at room temperature (RT). Light incisions were made on the surface layer of the epithelium without affecting the vessels. The section was then divided into smaller 0.5 cm thick sections and placed in the bottom of a 150 cm 2 plastic flask with a lid. Slices of 6 to 10 per flask were placed so that there was a free space of at least 1 cm radius around each slice and allowed to attach for 15 min at RT without adding medium.

После прикрепления осторожно добавляли полную среду (аМЕМ плюс 5% тромбоцитарного лизата для клинического применения плюс гепарин (2 ед./мл)) для удержания эксплантатов в прикрепленном ко дну колбы состоянии. Затем содержимое колб инкубировали при 37°С, влажности 90% и 5% СО2.Once attached, complete medium (aMEM plus 5% clinical grade platelet lysate plus heparin (2 U/ml)) was carefully added to keep the explants attached to the bottom of the flask. Then the contents of the flasks were incubated at 37°C, 90% humidity and 5% CO 2 .

Культуральную среду меняли через 5-7 суток.The culture medium was changed after 5-7 days.

На 10-е сутки после выделения миграцию клеток из эксплантатов контролировали с использованием инвертированного микроскопа. Если вокруг большинства эксплантатов отмечали ореол прикрепленных клеток, то их осторожно извлекали, вынимая их из колбы через крышку с помощью стерильного, находящегося в распоряжении пинцета, предназначенного для одноразового использования.On the 10th day after isolation, cell migration from the explants was monitored using an inverted microscope. If a halo of attached cells was noted around most of the explants, they were carefully removed by lifting them out of the flask through the lid using sterile, disposable tweezers.

Начиная с этого этапа, конфлюентность клеток визуально проверяли через сутки и при необходимости на 17-е сутки выполняли замену среды.Starting from this stage, the confluency of the cells was visually checked every other day and, if necessary, the medium was replaced on the 17th day.

Когда клетки достигали конфлюентности 70-90% или значения D20, среду удаляли, клетки промывали, используя по 30 мл 1× PBS из расчета на одну колбу. Затем клетки открепляли с помощью трипсина, собирали вместе со старой средой и центрифугировали в течение 10 мин при 300×g. Супернатант отбрасывали, далее клетки суспендировали в растворе для криоконсервации, содержащем αМЕМ плюс сывороточный альбумин человека (HSA; 100 мг/мл) плюс 10% диметилсульфоксида (DMSO), и подвергали криоконсервации.When the cells reached 70-90% confluency or D20 value, the medium was removed and the cells were washed using 30 ml of 1× PBS per flask. Cells were then detached using trypsin, collected along with the old medium, and centrifuged for 10 min at 300 × g. The supernatant was discarded, and the cells were then suspended in a cryopreservation solution containing αMEM plus human serum albumin (HSA; 100 mg/ml) plus 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and cryopreserved.

2. Размораживание и культивирование MSC клеток2. Thawing and culturing MSC cells

Клетки размораживали, следуя классическому протоколу. Кратко, криопробирки извлекали из жидкого азота и быстро погружали в водяную баню с температурой 37°С. Как только в пробирке не оставалось льда, клетки разбавляли в предварительно нагретой (37°С) полной среде (αМЕМ плюс 0,5% (об./об.) ципрофлоксацина плюс гепарин (2 ед./мл) плюс 5% (об./об.) тромбоцитарного лизата (PL)) и быстро центрифугировали (300×g КТ, 5 мин).Cells were thawed following the classical protocol. Briefly, cryovials were removed from liquid nitrogen and quickly immersed in a 37°C water bath. Once the tube was free of ice, cells were diluted in prewarmed (37°C) complete medium (αMEM plus 0.5% (v/v) ciprofloxacin plus heparin (2 U/mL) plus 5% (v/v) ciprofloxacin). /vol.) platelet lysate (PL)) and quickly centrifuged (300×g RT, 5 min).

После центрифугирования клетки суспендировали в предварительно нагретой полной среде и оценивали на предмет количества и жизнеспособности (используя трипановый синий/гемоцитометр Малассе).After centrifugation, cells were suspended in prewarmed complete medium and assessed for number and viability (using trypan blue/Malasses hemocytometer).

Клетки рассевали при плотности 4000 клеток/см2 в пластиковую колбу для культивирования, содержащую полную среду, и инкубировали (при влажности 90%, 5% CO2, 37°С).Cells were seeded at a density of 4000 cells/cm 2 in a plastic culture flask containing complete medium and incubated (90% humidity, 5% CO 2 , 37°C).

3. Стимуляция MSC клеток3. Stimulation of MSC cells

После нескольких дней размножения выполняли проверку клеток на предмет конфлюентности. Когда конфлюентность достигала 30-50%, старую среду отбрасывали и заменяли либо на свежую полную среду для условий роста без стимуляции, либо на свежую среду, дополненную IL-1β (10 нг/мл) и IL-4 (10 нг/мл).After several days of propagation, cells were checked for confluency. When confluence reached 30–50%, the old medium was discarded and replaced with either fresh complete medium for unstimulated growth conditions or fresh medium supplemented with IL-1β (10 ng/ml) and IL-4 (10 ng/ml).

Затем клетки инкубировали в течение по меньшей мере 2 суток, после чего проводили эксперимент с использованием проточной цитометрии.The cells were then incubated for at least 2 days, after which the experiment was performed using flow cytometry.

Эта стадия стимуляции была важна в плане придания MSC проангиогенного фенотипа, как описано в РСТ/ЕР 2017/082316.This stimulation step was important in conferring a pro-angiogenic phenotype on MSCs, as described in PCT/EP 2017/082316.

Ангиогенную активность клеток из несколько партий тестировали в анализе с использованием камеры Бойдена (см. Фиг. 2).The angiogenic activity of cells from several batches was tested in a Boyden chamber assay (see Figure 2).

Кратко, миграцию ECFC в ответ на градиент проангиогенных веществ оценивали в 24-луночной модифицированной камере Бойдена, на поликарбонатном мембранном фильтре с диаметром пор 8 мкм (BD Biosciences), покрытом фибронектином (20 мкг/мл) из плазмы крови крупного рогатого скота (Sigma-Aldrich - F1141). Перед проведением эксперимента дно лунок 24-луночного планшета засевали MSC клетками при плотности 6000 клеток/см2 в шести повторах и клетки культивировали в течение 4 суток в αМЕМ плюс 1% SVF (стромально-васкулярная фракция). Готовили ряд лунок с контрольной средой, заполненных αМЕМ плюс 1% FBS.Briefly, ECFC migration in response to a gradient of proangiogenic substances was assessed in a 24-well modified Boyden chamber on an 8-μm polycarbonate membrane filter (BD Biosciences) coated with fibronectin (20 μg/ml) from bovine plasma (Sigma- Aldrich - F1141). Before the experiment, the bottom of the wells of a 24-well plate was seeded with MSC cells at a density of 6000 cells/cm 2 in six replicates and the cells were cultured for 4 days in αMEM plus 1% SVF (stromal vascular fraction). A series of control media wells filled with αMEM plus 1% FBS were prepared.

После голодания в течение ночи в базовой среде ЕВМ-2 (базовой среде-2 для роста эндотелиальных клеток) (Lonza - СС-3156), дополненной 0,2% FBS, проводили загрузку ECFC в среде для голодания в верхнюю часть микрокамеры в количестве 200000 клеток/лунка.After overnight fasting in EBM-2 basal medium (Endothelial Cell Growth basal medium-2) (Lonza - CC-3156) supplemented with 0.2% FBS, 200,000 ECFCs in starvation medium were loaded into the top of the microchamber cells/well.

В качестве положительного контроля для каждого из условий в три лунки из шести добавляли VEGF (Miltenyi - 130-109-383) в концентрации 50 нг/мл.As a positive control for each condition, VEGF (Miltenyi - 130-109-383) was added to three of the six wells at a concentration of 50 ng/ml.

Через 5 ч инкубирования осуществляли удаление клеток с верхней поверхности мембранного фильтра посредством протирания ватным тампоном. Затем все мембраны окрашивали по методу Май-Грюнвальда-Гемза (MGG), монтировали и фотографировали.After 5 hours of incubation, cells were removed from the upper surface of the membrane filter by wiping with a cotton swab. All membranes were then stained using the May-Grünwald-Gemsa (MGG) method, mounted, and photographed.

На Фиг. 2 во всех колонках со знаком (-) представлено количество мигрировавших ECFC в отсутствие VEGF, тогда как во всех колонках со знаком (+) представлено количество мигрировавших ECFC в присутствии VEGF. Для контрольных условий (Т- и Т+) показано, что ECFC способны усиливать свою миграцию в присутствии VEGF. В условиях проведения испытаний (1, 2, 3) показано, что хотя партия 1, по-видимому, не оказывает влияния на поведение ECFC, обе партии 2 и 3 усиливают влияние VEGF на ECFC, и кроме того, партия 3 даже усиливает миграцию ECFC в отсутствие VEGF.In FIG. 2, all columns with a (-) sign represent the number of migrated ECFCs in the absence of VEGF, whereas all columns with a (+) sign represent the number of migrated ECFCs in the presence of VEGF. For control conditions (T- and T+), it was shown that ECFCs are able to enhance their migration in the presence of VEGF. Test conditions (1, 2, 3) show that while batch 1 appears to have no effect on ECFC behavior, both batches 2 and 3 enhance the effect of VEGF on ECFC, and furthermore, batch 3 even enhances ECFC migration in the absence of VEGF.

Поскольку в камерах Бойдена предотвращается контакт клетки с клеткой, этот эффект безусловно опосредован растворимыми внеклеточными медиаторами, либо растворимыми белками, либо внеклеточными везикулами.Since cell-to-cell contact is prevented in Boyden's chambers, this effect is certainly mediated by soluble extracellular mediators, either soluble proteins or extracellular vesicles.

4. Сбор и криоконсервация MSC клеток4. Collection and cryopreservation of MSC cells

Через 2-3 суток размножения/стимуляции выполняли проверку клеток на предмет конфлюентности. Если конфлюентность составляла до 80% включительно, то проводили сбор клеток. Кратко, старую среду отбрасывали и клетки промывали 1× DPBS (забуференный фосфатом физиологический раствор по Дульбекко). Добавляли трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и клетки инкубировали в течение 5 мин при 37°С. Действие трипсина нейтрализовали добавлением по меньшей мере двукратного объема среды, клеточную суспензию собирали и оценивали на предмет количества и жизнеспособности.After 2-3 days of expansion/stimulation, cells were checked for confluency. If confluence was up to 80% inclusive, then cells were collected. Briefly, old media was discarded and cells were washed with 1× DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline). Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) was added and the cells were incubated for 5 min at 37°C. The effect of trypsin was neutralized by adding at least two times the volume of medium, and the cell suspension was collected and assessed for quantity and viability.

Клетки центрифугировали в течение 10 мин при 300×g. Супернатант отбрасывали, далее клетки суспендировали в растворе для криоконсервации, содержащем αМЕМ плюс HSA (100 мг/мл) плюс 10% DMSO, и подвергали криоконсервации.Cells were centrifuged for 10 min at 300×g. The supernatant was discarded, and the cells were then suspended in a cryopreservation solution containing αMEM plus HSA (100 mg/ml) plus 10% DMSO and cryopreserved.

5. Размораживание MSC клеток и приготовление кондиционированной среды5. Thawing MSC cells and preparing conditioned medium

Клетки размораживали, следуя классическому протоколу. Кратко, криопробирки или криопакеты извлекали из жидкого азота и быстро погружали в водяную баню с температурой 37°С. Как только в пробирке не оставалось льда, клетки разбавляли в предварительно нагретой (37°С) αМЕМ и быстро центрифугировали (300×g, КТ, 5 мин).Cells were thawed following the classical protocol. Briefly, cryovials or cryopouches were removed from liquid nitrogen and quickly immersed in a 37°C water bath. Once the tube was free of ice, cells were diluted in prewarmed (37°C) αMEM and quickly centrifuged (300 × g, RT, 5 min).

После центрифугирования клетки суспендировали в предварительно нагретой полной среде и оценивали на предмет количества и жизнеспособности (используя трипановый синий/гемоцитометр Малассе).After centrifugation, cells were suspended in prewarmed complete medium and assessed for number and viability (using trypan blue/Malasses hemocytometer).

Клетки рассевали при плотности 2000 клеток/см2 в необходимом количестве пластиковых колб для культивирования площадью 300 см2 для получения требуемого количества кондиционированной среды (1 (одна колба) Т300 соответствует 30 мл кондиционированной среды). Клетки инкубировали при влажности 90%, 5% CO2, 37°С в αМЕМ, дополненной 0,5% (об./об.) циплофлоксацина, гепарином (2 ед./мл) и 8% (об./об.) подвергнутого центрифугированию PL. Подвергнутый центрифугированию PL получали путем центрифугирования PL в течение 1 ч при 6000×g и 10°С и извлечения супернатанта.Cells were seeded at a density of 2000 cells/cm 2 in the required number of plastic culture flasks with an area of 300 cm 2 to obtain the required amount of conditioned medium (1 (one flask) T300 corresponds to 30 ml of conditioned medium). Cells were incubated at 90% humidity, 5% CO 2 , 37°C in αMEM supplemented with 0.5% (v/v) cilofloxacin, heparin (2 units/ml) and 8% (v/v) centrifuged PL. Centrifuged PL was obtained by centrifuging the PL for 1 h at 6000 × g and 10 °C and recovering the supernatant.

Через 5 суток среду заменяли. Когда клетки достигали конфлюентности 80% (на 6-е сутки), среду удаляли и клетки 3 раза промывали PBS. Добавляли не содержащую добавок αМЕМ из расчета 50 мл/Т300 и выдерживали в течение 24 ч. Через 24 ч среду заменяли на 30 мл либо не содержащей добавок αМЕМ, либо αМЕМ, дополненной везикулами в количестве 8% без PL (тромбоцитарного лизата).After 5 days, the medium was replaced. When the cells reached 80% confluency (on day 6), the medium was removed and the cells were washed 3 times with PBS. Unsupplemented αMEM was added at a rate of 50 ml/T300 and maintained for 24 hours. After 24 hours, the medium was replaced with 30 ml of either unsupplemented αMEM or αMEM supplemented with 8% vesicles without PL (platelet lysate).

Клетки оставляли для протекания секреции в течение 36 ч, среду извлекали, центрифугировали в течение 5 мин при 400×g и КТ в Heraeus Multifuge 3 S-R. Супернатант извлекали и замораживали при -80°С.The cells were left to secrete for 36 hours, the medium was removed, centrifuged for 5 minutes at 400×g and RT in Heraeus Multifuge 3 S-R. The supernatant was removed and frozen at -80°C.

Клетки подвергали трипсинизации и анализировали на предмет их количества и жизнеспособности.Cells were trypsinized and analyzed for cell number and viability.

6. Выделение и определение характеристик внеклеточных везикул6. Isolation and characterization of extracellular vesicles

Внеклеточные везикулы, происходящие из таких MSC, могут быть выделены любыми методами, известными в данной области техники, такими как, но не ограничиваясь этим, ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, центрифугирование в градиенте плотности, гель-проникающая хроматография, использование набора для осаждения, иммуноаффинный захват, применение микрофлюидных устройств.Extracellular vesicles derived from such MSCs can be isolated by any methods known in the art, such as, but not limited to, ultracentrifugation, ultrafiltration, density gradient centrifugation, gel permeation chromatography, use of a precipitation kit, immunoaffinity capture, application of microfluidic devices.

В этом эксперименте фракцию, обогащенную внеклеточными везикулами, отделяли посредством ультра фильтрации кондиционированной среды с последующей гель-проникающей жидкостной хроматографией (SEC).In this experiment, the fraction enriched in extracellular vesicles was separated by ultrafiltration of the conditioned medium followed by gel permeation liquid chromatography (SEC).

Анализ количества и распределения внеклеточных везикул по размерам проводили с использованием метода анализа траекторий движения наночастиц (Nanosight).Analysis of the number and size distribution of extracellular vesicles was carried out using the nanoparticle trajectory analysis method (Nanosight).

Кроме того, содержимое EV по изобретению можно оценить посредством вестерн-блоттинга, используя приведенные далее условия.In addition, the content of the EVs of the invention can be assessed by Western blotting using the following conditions.

Материалы и реагентыMaterials and reagents

Буфер для лизиса (RIPA) (от англ. radioimmunoprecipitation assay buffer - радиоиммуннопреципитационный анализ):Lysis buffer (RIPA) (from the English radioimmunoprecipitation assay buffer - radioimmunoprecipitation assay):

- дезоксихолат натрия 1%;- sodium deoxycholate 1%;

- SDS 0,1%;- SDS 0.1%;

- трис⋅Cl, рН 7,4 20 мМ;- Tris⋅Cl, pH 7.4 20 mM;

- EDTA 1 мМ;- EDTA 1 mM;

- NaCl 150 мМ;- NaCl 150 mM;

- Тритон х-100 1%;- Triton x-100 1%;

- коктейль ингибиторов протеаз (CIP, 100х), номер по каталогу Sigma Р8340.- protease inhibitor cocktail (CIP, 100x), Sigma catalog number P8340.

Лизис клетокCell lysis

К MSC клеткам в количестве 1×106 добавляли 100 мкл холодного RIPA-буфера, содержащего CIP в 1× конечной концентрации.100 μl of cold RIPA buffer containing CIP at 1× final concentration was added to MSC cells in an amount of 1×10 6 .

Полученную смесь инкубировали в течение 10 мин на льду, центрифугировали в течение 15 мин при 4°С в течение 20 мин и затем извлекали супернатант.The resulting mixture was incubated for 10 min on ice, centrifuged for 15 min at 4°C for 20 min, and then the supernatant was recovered.

Определение концентрации белков осуществляли с использованием набора для анализа микроколичеств белков с бицинхониновой кислотой (ВСА), номер по каталогу Pierce 23235.Protein concentration determinations were performed using the Bicinchoninic Acid (BCA) Trace Protein Assay Kit, Pierce part number 23235.

Электрофорез проводили в используемых для разделения белков 4-12%-ных бис-трис-гелях с толщиной слоя 1,5 мм, имеющих 10 лунок, Novex Nosex (Life Technologies, NP0335PBOX) или NuPAGE® (рабочий буфер на основе 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS) с SDS (20х)) (Life Technologies, NP0001). Образцы подвергали денатурации в течение 10 мин при 70°С, используя ¼ объема буфера, содержащего додецилсульфат лития (LDS) (Invitrogen, NP0007, 4х) с добавлением или без добавления 500 мМ дитиотреита (DTT). Перенос осуществляли электрофоретически с использованием мембранной системы Mini Trans-Blot, номер по каталогу: 170-3930, на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) (Amersham, номер по каталогу: RPN303LFP), активированную абсолютным этанолом и подвергнутую промывке.Electrophoresis was carried out in 4-12% bis-Tris gels with a layer thickness of 1.5 mm, having 10 wells, Novex Nosex (Life Technologies, NP0335PBOX) or NuPAGE® (working buffer based on 3-(N -morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) with SDS (20x)) (Life Technologies, NP0001). Samples were denatured for 10 min at 70°C using ¼ volume lithium dodecyl sulfate (LDS) buffer (Invitrogen, NP0007, 4x) with or without 500 mM dithiothreitol (DTT). Transfer was carried out electrophoretically using a Mini Trans-Blot membrane system, part number: 170-3930, to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Amersham, part number: RPN303LFP) activated with absolute ethanol and subjected to washing.

Для выявления белков использовали следующие вещества:The following substances were used to identify proteins:

забуференный трисом физиологический раствор (TBS), 10х, номер по каталогу BioRad 1706435;Tris-buffered saline (TBS), 10x, BioRad part number 1706435;

блокирующий буфер (TBS-молоко): 1х TBS_0,1% твина_5% обезжиренного молока;blocking buffer (TBS milk): 1x TBS_0.1% Tween_5% skim milk;

буфер для промывки (TBS): 1х TBS_0,1% твина;Wash buffer (TBS): 1x TBS_0.1% Tween;

АС-буфер (TBS_AC): 1х TBS_0,1% твина_0,3% молока.AC buffer (TBS_AC): 1x TBS_0.1% Tween_0.3% milk.

Анализ наличия мембранных белков CD9 (Biolegend - 312102) и CD81 (Biolegend - 349501) проводили с использованием вестерн-блоттинга (Фиг. 1). Оба маркера, CD9 и CD81, присутствовали во фракции очищенных EV (дорожка С), а также в лизате клеток MDA (дорожка А - положительный контроль) и в исходном клеточном лизате (колонка В). Маркер ретикулума калнексин (Elabscience - Е-АВ-30723) отсутствовал, и это свидетельствует о том, что данная фракция была очищена корректно.Analysis of the presence of membrane proteins CD9 (Biolegend - 312102) and CD81 (Biolegend - 349501) was carried out using Western blotting (Fig. 1). Both markers, CD9 and CD81, were present in the purified EV fraction (lane C), as well as in the MDA cell lysate (lane A - positive control) and in the original cell lysate (column B). The reticulum marker calnexin (Elabscience - E-AB-30723) was absent, indicating that this fraction was purified correctly.

Флуориметрический анализ проводили с использованием антитела, меченного Alexa Fluor 680, GAM (от англ. goat anti-mouse - антитело козы к IgG мыши; номер по каталогу: А21058) или GAR (от англ. goat anti-rabbit - антитело козы к IgG кролика; номер по каталогу: А21076) от Thermofisher, при разведении 1/10000.Fluorimetric analysis was performed using an antibody labeled with Alexa Fluor 680, GAM (goat anti-mouse - goat anti-mouse IgG; catalog number: A21058) or GAR (goat anti-rabbit - goat anti-rabbit IgG) ; catalog number: A21076) from Thermofisher, at a dilution of 1/10000.

Анализ хемилюминесценции проводили с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) антитела, GAM (номер по каталогу: 170-6516) или GAR (номер по каталогу: 170-6515) от BioRad, при разведении 1/5000.Chemiluminescence assays were performed using horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody, GAM (cat. no.: 170-6516) or GAR (cat. no.: 170-6515) from BioRad, at a dilution of 1/5000.

7. Сравнение EV, происходящих из UCMSC, стимулированных LPS, и EV, происходящих из UCMSC, стимулированных комбинацией IL1β и IL4 (EV по изобретению)7. Comparison of UCMSC-derived EVs stimulated with LPS and UCMSC-derived EVs stimulated with a combination of IL1β and IL4 (EVs of the invention)

Dongdong Ti и др. (Journal of translational medicine, 2015) описывают внеклеточные везикулы, очищенные из MSC, полученных из пуповины, которые предварительно обрабатывают провоспалительным фактором LPS.Dongdong Ti et al (Journal of translational medicine, 2015) describe extracellular vesicles purified from umbilical cord-derived MSCs that were pretreated with the proinflammatory factor LPS.

Yunbing Wu и др. (BioMed Research International, 2017) описывают противовоспалительные свойства внеклеточных везикул, происходящих из нестимулированных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека.Yunbing Wu et al (BioMed Research International, 2017) describe the anti-inflammatory properties of extracellular vesicles derived from unstimulated human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.

Ни в одной из этих публикаций не предлагается добавлять IL1β и/или IL4 для стимулирования MSC, из которых происходят EV по изобретению.None of these publications suggest adding IL1β and/or IL4 to stimulate MSCs from which the EVs of the invention are derived.

Цель представленного примера заключается в демонстрации того, что EV, происходящие из СD106высокаяСD151+нестин+ MSC по изобретению, отличаются от таковых, описанных в документах предшествующего уровня техники, тем, что они секретируются клетками, которые культивировали в конкретной среде для кондиционирования, содержащей провоспалительные факторы роста, такие как IL1β и IL4.The purpose of the presented example is to demonstrate that EVs derived from CD106 high CD151 + nestin + MSCs of the invention differ from those described in prior art documents in that they are secreted by cells that have been cultured in a specific conditioning medium containing pro-inflammatory growth factors such as IL1β and IL4.

Сравнение EV по изобретению с EV, происходящими из нестимулированных MSC или из MSC, стимулированных LPS, продемонстрировало, что EV по изобретению проявляют свойства молекул, которые действительно отличают их от EV предшествующего уровня техники, например, в плане содержания белка или поверхностных маркеров.Comparison of the EVs of the invention with EVs derived from unstimulated MSCs or from MSCs stimulated with LPS demonstrated that the EVs of the invention exhibit molecular properties that truly differentiate them from prior art EVs, for example in terms of protein content or surface markers.

7.1. Получение кондиционированных сред (культуральных супернатантов) MSC, происходящих из пуповины, культивированных в 3-х разных средах для кондиционирования7.1. Preparation of conditioned media (culture supernatants) of umbilical cord-derived MSCs cultured in 3 different conditioning media

7.1.1. Получение 3-х сред для кондиционирования7.1.1. Preparation of 3 conditioning media

Три среды для кондиционирования готовили так, как приведено ниже.Three conditioning media were prepared as follows.

NS обозначает контрольную среду (без обработки провоспалительным фактором).NS indicates control medium (no pro-inflammatory factor treatment).

Для пакета с 675 мл αМЕМ (конечная концентрация: 10 нг/мл).For a 675 ml packet of αMEM (final concentration: 10 ng/ml).

1. Поместить устройство для введения в один из выходных портов.1. Place the insertion device into one of the exit ports.

2. Ввести, используя иглу, 290 мкл раствора гепарина (5000 ед./мл; конечная концентрация 2 ед./мл). Убедиться путем отсасывания/сливания в отсутствии гепарина в устройстве для введения.2. Using a needle, inject 290 µl of heparin solution (5000 units/ml; final concentration 2 units/ml). Verify by suction/draining that there is no heparin in the administration device.

3. Поместить устройство для введения в выходной порт пакета с тромбоцитарным лизатом для клинического применения (CPL) и отобрать 56,8 мл подвергнутого центрифугированию CPL с помощью шприца объемом 50 мл с креплением иглы типа Луер-Лок (LL).3. Place the injection device into the outlet port of the clinical platelet lysate (CPL) bag and withdraw 56.8 mL of centrifuged CPL using a 50 mL syringe with a Luer-Lock (LL) needle.

S1 обозначает среду для кондиционирования, содержащую IL1β и IL4 ("вторую среду" в способе, описанном в WO 2018/108859).S1 denotes conditioning medium containing IL1β and IL4 ("second medium" in the method described in WO 2018/108859).

Для пакета с 675 мл αМЕМ (конечная общая концентрация интерлейкинов: 10 нг/мл).For a 675 ml packet of αMEM (final total interleukins concentration: 10 ng/ml).

4. Поместить устройство для введения в один из выходных портов.4. Place the insertion device into one of the exit ports.

5. Ввести, используя иглу, 290 мкл раствора гепарина (5000 ед./мл; конечная концентрация 2 ед./мл). Убедиться путем отсасывания/сливания в отсутствии гепарина в устройстве для введения.5. Using a needle, inject 290 µl of heparin solution (5000 units/ml; final concentration 2 units/ml). Verify by suction/draining that there is no heparin in the administration device.

6. Поместить устройство для введения в выходной порт пакета с CPL и отобрать 56,8 мл подвергнутого центрифугированию CPL с помощью LL шприца объемом 50 мл.6. Place the insertion device into the outlet port of the CPL bag and withdraw 56.8 ml of centrifuged CPL using a 50 ml LL syringe.

7. Ввести CPL в пакет с аМЕМ и выполнить гомогенизацию с помощью шприца.7. Inject CPL into the aMEM bag and homogenize using a syringe.

8. Осуществить добавление цитокинов:8. Add cytokines:

1) разморозить аликвоту (73,2 мкл) каждого из интерлейкинов (IL) (С = 100 мкг/мл);1) defrost an aliquot (73.2 μl) of each interleukins (IL) (C = 100 μg/ml);

2) для отбора 400 мкл полной среды и перемешивания ее с IL использовать оснащенный иглой шприц объемом 1 мл;2) to select 400 μl of complete medium and mix it with IL, use a 1 ml syringe equipped with a needle;

3) взять среду, содержащую IL, и добавить ее в пакет с полной средой.3) take the environment containing the IL and add it to the complete environment package.

Среда для кондиционирования, содержащая LPSConditioning medium containing LPS

Для пакета с 675 мл αМЕМ (конечная концентрация LPS: 100 нг/мл).For a 675 ml packet of αMEM (final LPS concentration: 100 ng/ml).

1. Поместить устройство для введения в один из выходных портов.1. Place the insertion device into one of the exit ports.

2. Ввести, используя иглу, 290 мкл раствора гепарина (5000 ед./мл; конечная концентрация 2 ед./мл). Убедиться путем отсасывания/сливания в отсутствии гепарина в устройстве для введения.2. Using a needle, inject 290 µl of heparin solution (5000 units/ml; final concentration 2 units/ml). Verify by suction/draining that there is no heparin in the administration device.

3. Поместить устройство для введения в выходной порт пакета с CPL и отобрать 56,8 мл подвергнутого центрифугированию CPL с помощью LL шприца объемом 50 мл.3. Place the insertion device into the exit port of the CPL bag and withdraw 56.8 ml of centrifuged CPL using a 50 ml LL syringe.

4. Ввести CPL в пакет с аМЕМ и выполнить гомогенизацию с помощью шприца.4. Inject CPL into the aMEM bag and homogenize using a syringe.

5. Осуществить добавление LPS:5. Add LPS:

1) разморозить аликвоту (73,2 мкл) LPS (С = 1 мг/мл);1) defrost an aliquot (73.2 μl) of LPS (C = 1 mg/ml);

2) для отбора 400 мкл полной среды и перемешивания ее с LPS использовать оснащенный иглой шприц объемом 1 мл;2) to select 400 μl of complete medium and mix it with LPS, use a 1 ml syringe equipped with a needle;

3) взять среду, содержащую LPS, и добавить ее в пакет с полной средой.3) take the environment containing LPS and add it to the complete environment package.

Подготовка центрифугированного тромбоцитарного лизата для клинического применения (CPL)Preparation of Centrifuged Platelet Lysate for Clinical Use (CPL)

Чтобы начать "очистку" клеток от экзогенных EV, происходящих из CPL, на стадии стимуляции использовали подвергнутый центрифугированию CPL.To begin “clearing” cells of exogenous CPL-derived EVs, centrifuged CPL was used in the stimulation step.

1. Поместить устройство для введения в выходной порт.1. Place the insertion device into the exit port.

2. Перенести CPL в пластиковые пробирки емкостью 50 мл.2. Transfer CPL into 50 ml plastic tubes.

3. Провести центрифугирование при 6000×g и 4°С в течение 1 часа.3. Perform centrifugation at 6000×g and 4°C for 1 hour.

4. Перенести супернатант в новый контейнер. 7.1.2. Размораживание и амплификация4. Transfer the supernatant to a new container. 7.1.2. Thawing and amplification

Происходящие из пуповины мезенхимальные стволовые клетки, хранящиеся в газообразном азоте после выделения и 1-ого пересева, размораживали, следуя классическому протоколу. Кратко, пакет извлекали из места хранения и быстро погружали в водяную баню с температурой 37°С. Как только в пакете не оставалось льда, клетки разбавляли в предварительно нагретой (37°С) полной среде (αМЕМ плюс 0,5% (об./об.) ципрофлоксацина плюс гепарин (2 ед./мл) плюс 5% (об./об.) PL) и быстро центрифугировали (300×g, КТ, 5 мин).Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, stored in nitrogen gas after isolation and first subculture, were thawed following the classical protocol. Briefly, the bag was removed from storage and quickly immersed in a 37°C water bath. Once no ice remained in the bag, cells were diluted in prewarmed (37°C) complete medium (αMEM plus 0.5% (v/v) ciprofloxacin plus heparin (2 units/ml) plus 5% (v/v) ciprofloxacin. /vol.) PL) and quickly centrifuged (300×g, RT, 5 min).

После центрифугирования клетки суспендировали в предварительно нагретой полной среде и оценивали на предмет количества и жизнеспособности клеток (используя трипановый синий/гемоцитометр Малассе).After centrifugation, cells were suspended in prewarmed complete medium and assessed for cell number and viability (using trypan blue/Malasses hemocytometer).

Клетки рассевали при плотности 2000 клеток/см2 в двух 1-слойных камерах для культивирования клеток CellSTACK-1 (CS1) в полной среде и инкубировали (при влажности 90%, 5% CO2, 37°С) в течение семи суток.Cells were seeded at a density of 2000 cells/cm 2 in two 1-layer CellSTACK-1 (CS1) cell culture chambers in complete medium and incubated (90% humidity, 5% CO 2 , 37°C) for seven days.

Через семь суток CS1 промывали, используя 100 мл PBS, и для сбора клеток добавляли Trypzean из расчета по 25 мл на одну CS1. По истечении 10 мин нахождения в инкубаторе Trypzean нейтрализовали, добавляя в общей сложности 100 мл полной среды (из расчета по 50 мл на одну CS1). Клетки объединяли и оценивали на предмет количества и жизнеспособности.After seven days, CS1 was washed using 100 ml of PBS, and Trypzean was added to collect cells at a rate of 25 ml per CS1. After 10 min in the incubator, Trypzean was neutralized by adding a total of 100 ml of complete medium (at a rate of 50 ml per CS1). Cells were pooled and assessed for number and viability.

7.1.3. Стимуляция7.1.3. Stimulation

Посев в Т300 осуществляли при плотности 6000 клеток/см2.Seeding in T300 was carried out at a density of 6000 cells/ cm2 .

Через одни сутки среду заменяли на соответствующую кондиционированную среду. Стимуляцию клеток проводили в течение 2 суток без замены среды.After one day, the medium was replaced with the appropriate conditioned medium. Cell stimulation was carried out for 2 days without changing the medium.

7.1.4. Голодание и секреция EV7.1.4. Fasting and EV secretion

После стимуляции среду отбрасывали и клетки три раза промывали PBS. Затем клетки подвергали голоданию в течение 24 ч в условиях αМЕМ плюс/минус провоспалительный фактор (комбинация IL1β (10 нг/мл) и IL4 (10 нг/мл) или LPS (100 нг/мл)).After stimulation, the medium was discarded and the cells were washed three times with PBS. Cells were then starved for 24 h under αMEM plus/minus pro-inflammatory factor (combination of IL1β (10 ng/ml) and IL4 (10 ng/ml) or LPS (100 ng/ml)).

По прошествии периода голодания клетки еще раз трижды промывали PBS, затем в каждую колбу на 72 часа загружали по 30 мл αМЕМ плюс/минус провоспалительный фактор (IL или LPS).After the starvation period, the cells were washed three more times with PBS, then each flask was loaded with 30 ml of αMEM plus/minus pro-inflammatory factor (IL or LPS) for 72 hours.

Супернатант собирали в пластиковые пробирки емкостью 50 мл и центрифугировали в течение 5 мин при 400×g при комнатной температуре. Супернатант для каждого из условий объединяли в бутылки емкостью 500 мл и вместе с бутылками отдельно замораживали при -80°С небольшую аликвоту объемом 1 мл.The supernatant was collected in 50 ml plastic tubes and centrifuged for 5 min at 400 × g at room temperature. The supernatant for each condition was combined into 500 ml bottles and, together with the bottles, a small 1 ml aliquot was separately frozen at -80°C.

Чтобы оценить количество клеток для каждого из условий, проводили трипсинизацию для 3-х колб Т300, и клетки подвергали криоконсервации в криопробирках.To estimate the number of cells for each condition, trypsinization was performed for 3 T300 flasks, and the cells were cryopreserved in cryovials.

Культура клеток и применяемые для обработки реагентыCell culture and processing reagents

7.2. Фенотипическая характеристика клеток, содержащихся в 3-х кондиционированных средах7.2. Phenotypic characteristics of cells contained in 3 conditioned media

Для оценки эффективности стимуляции с применением цитометрического анализа выполняли фенотипическую характеристику клеток, культивированных с использованием 3-х кондиционированных сред.To assess the effectiveness of stimulation using cytometric analysis, phenotypic characterization of cells cultured using 3 conditioned media was performed.

Как и ожидалось, клетки, предварительно обработанные в среде S1 и в среде с LPS, демонстрировали разный фенотип, при этом проангиогенный маркер CD106 экспрессировался на более высоких уровнях в кондиционированной среде S1 (благодаря стимуляции клеток под действием IL, как описано в WO 2018/108859).As expected, cells pretreated in S1 and LPS medium exhibited different phenotypes, with the proangiogenic marker CD106 expressed at higher levels in S1 conditioned medium (due to cell stimulation with IL, as described in WO 2018/108859 ).

Реагенты для цитометрии, использованные для проведения цитометрического анализа:Cytometry reagents used for cytometric analysis:

7.3. Очистка EV7.3. EV Cleaning

В этом эксперименте фракции, обогащенные внеклеточными везикулами, выделяли посредством ультрафильтрации 3-х кондиционированных сред.In this experiment, fractions enriched in extracellular vesicles were isolated by ultrafiltration of 3 conditioned media.

Анализ количества и распределения внеклеточных везикул по размерам проводили с использованием метода анализа траекторий движения наночастиц (Nanosight 300 от Malvern-Panalytical).The number and size distribution of extracellular vesicles were analyzed using the nanoparticle trajectory analysis method (Nanosight 300 from Malvern-Panalytical).

Результаты очистки EV представлены ниже.EV purification results are presented below.

Выход Exit

Размер Size

Выход/клеткиOutput/Cages

7.3. Характеристика EV, полученных из MSC, предварительно обработанных NS/S1/LPS7.3. Characterization of MSC-derived EVs pretreated with NS/S1/LPS

7.3.1. Анализ содержания белков в EV и MSC с применением вестерн-блоттинга7.3.1. Analysis of protein content in EVs and MSCs using Western blotting

Содержимое EV и MSC, полученных в 3-х условиях (NS/S1/LPS), оценивали посредством вестерн-блоттинга, используя приведенные далее условия.The contents of EVs and MSCs obtained under 3 conditions (NS/S1/LPS) were assessed by Western blotting using the following conditions.

Материалы и реагентыMaterials and reagents

Буфер для лизиса (для RIPA):Lysis buffer (for RIPA):

- дезоксихолат натрия 1%;- sodium deoxycholate 1%;

- SDS 0,1%;- SDS 0.1%;

- трис⋅Cl, рН 7,4 20 мМ;- Tris⋅Cl, pH 7.4 20 mM;

- EDTA 1 мМ;- EDTA 1 mM;

- NaCl 150 мМ;- NaCl 150 mM;

NP40 (от англ. nonyl phenoxypolyethoxyethanol - нонилфеноксиполиэтоксиэтанол) 1%;NP40 (from the English nonyl phenoxypolyethoxyethanol - nonylphenoxypolyethoxyethanol) 1%;

- коктейль ингибиторов протеаз (CIP, 100х), номер по каталогу Sigma Р8340.- protease inhibitor cocktail (CIP, 100x), Sigma catalog number P8340.

Лизис клеток (в случае MSC)Cell lysis (in case of MSC)

К MSC клеткам в количестве 1х106 добавить 100 мкл холодного RIPA-буфера, содержащего CIP в 1х конечной концентрации.To MSC cells in an amount of 1x10 6 add 100 µl of cold RIPA buffer containing CIP in 1x final concentration.

Инкубировать в течение 10 мин на льду, провести центрифугирование при 4°С в течение 20 мин при 10000×g и затем извлечь супернатант.Incubate for 10 min on ice, centrifuge at 4°C for 20 min at 10,000 x g and then remove the supernatant.

Содержащую EV фракцию солюбилизировали после добавления равного объема охлажденного во льду 2х RIPA-буфера для лизиса.The EV-containing fraction was solubilized after adding an equal volume of ice-cold 2× RIPA lysis buffer.

Определение концентрации белков осуществляли с использованием набора для анализа белков Micro ВСА, номер по каталогу Pierce 23235.Protein concentration determinations were performed using the Micro BCA Protein Assay Kit, Pierce part number 23235.

Электрофорез проводили в используемых для разделения белков 4-12%-ных бис-трис-гелях с толщиной слоя 1,5 мм, имеющих 10 лунок, Novex Nosex (Life Technologies, NP0335PBOX) или NuPAGE® (рабочий буфер на основе MOPS с SDS (20х)) (Life Technologies, NP0001). Образцы подвергали денатурации в течение 10 мин при 70°С, используя ¼ объема буфера для образцов, содержащего LDS (Invitrogen, NP0007, 4×) с добавлением или без добавления DTT (500 мМ). Перенос осуществляли электрофоретически с использованием мембранной системы Mini Trans-Bio, номер по каталогу: 170-3930, на мембрану из PVDF (Amersham, номер по каталогу: RPN303LFP), активированную абсолютным этанолом и подвергнутую промывке.Electrophoresis was carried out in 4-12% bis-Tris gels with a layer thickness of 1.5 mm, having 10 wells, Novex Nosex (Life Technologies, NP0335PBOX) or NuPAGE® (MOPS-based working buffer with SDS) used for protein separation. 20x)) (Life Technologies, NP0001). Samples were denatured for 10 min at 70°C using ¼ volume of sample buffer containing LDS (Invitrogen, NP0007, 4×) with or without DTT (500 mM). Transfer was carried out electrophoretically using a Mini Trans-Bio membrane system, part number: 170-3930, to a PVDF membrane (Amersham, part number: RPN303LFP) activated with absolute ethanol and subjected to washing.

Для выявления белков использовали следующие вещества: TBS, 10х, номер по каталогу BioRad 1706435;The following substances were used to identify proteins: TBS, 10x, BioRad catalog number 1706435;

блокирующий буфер (TBS-молоко): 1х TBS_0,1% твина_5% обезжиренного молока;blocking buffer (TBS milk): 1x TBS_0.1% Tween_5% skim milk;

буфер для промывки (TBS): 1х TBS_0,1% твина;Wash buffer (TBS): 1x TBS_0.1% Tween;

АС-буфер (TBS_AC): 1х TBS_0,1% твина_0,3% молока.AC buffer (TBS_AC): 1x TBS_0.1% Tween_0.3% milk.

Флуориметрический анализ проводили с использованием антитела, меченного Alexa Fluor 680, GAM (номер по каталогу: А21058) или GAR (номер по каталогу: А21076) от Thermofisher, при разведении 1/10000.Fluorimetric analysis was performed using Alexa Fluor 680-labeled antibody, GAM (cat. no.: A21058) or GAR (cat. no.: A21076) from Thermofisher, at a dilution of 1/10,000.

Анализ хемилюминесценции проводили с использованием конъюгированного с HRP антитела, GAM (номер по каталогу: 170-6516) или GAR (номер по каталогу: 170-6515) от BioRad, при разведении 1/5000.Chemiluminescence assays were performed using an HRP-conjugated antibody, GAM (cat. no.: 170-6516) or GAR (cat. no.: 170-6515) from BioRad, at a dilution of 1/5000.

Антитела к CD9: Biolegend - 312102.Antibodies to CD9: Biolegend - 312102.

Антитела к CD81: Biolegend - 349501.Antibodies to CD81: Biolegend - 349501.

Антитела к калнексину: Elabscience - Е-АВ-30723.Antibodies to calnexin: Elabscience - E-AB-30723.

Антитела к VCAM: Bio-Rad - VMA00461.Antibodies to VCAM: Bio-Rad - VMA00461.

Антитела к CD200: Bio-Techne - 2AF2724.Antibodies to CD200: Bio-Techne - 2AF2724.

Результатыresults

Как и ожидалось, проангиогенный маркер CD106/VCAM обнаруживали на дорожке В (MSC по изобретению), и он полностью отсутствовал на дорожке С (MSC в среде с LPS) и на дорожке А (отрицательный контроль). Мембранный гликопротеин CD200, второй проангиогенный маркер, присутствовал в MSC из фракции S1, и не присутствовал ни в MSC из фракции LPS, ни на дорожке А (отрицательный контроль) (см. Фиг. 5).As expected, the proangiogenic marker CD106/VCAM was detected in lane B (MSC of the invention) and was completely absent in lane C (MSC in LPS medium) and lane A (negative control). The membrane glycoprotein CD200, a second proangiogenic marker, was present in MSCs from the S1 fraction, and was not present in either MSCs from the LPS fraction or in lane A (negative control) (see Fig. 5).

В очищенных EV (Фиг. 3) оба мембранных белка CD9 и CD81 присутствовали во всех фракциях (дорожки А, В и С), а также в лизате клеток MDA (положительный контроль) (Фиг. 3).In purified EVs (Fig. 3), both membrane proteins CD9 and CD81 were present in all fractions (lanes A, B, and C) as well as in the MDA cell lysate (positive control) (Fig. 3).

Маркер ретикулума калнексин не обнаруживали, и это свидетельствует о том, что фракция EV была очищена корректно.The reticulum marker calnexin was not detected, indicating that the EV fraction was purified correctly.

Проангиогенный маркер CD106/VCAM обнаруживали на дорожке В (EV по изобретению), и он полностью отсутствовал на дорожке С (EV в среде с LPS) и на дорожке А (отрицательный контроль), и это свидетельствует о том, что мембранные маркеры MSC по изобретению переносятся на EV (Фиг. 3).The proangiogenic marker CD106/VCAM was detected in lane B (EV of the invention) and was completely absent from lane C (EV in LPS medium) and lane A (negative control), indicating that the MSC membrane markers of the invention transferred to EV (Figure 3).

Мембранный гликопротеин CD200, второй проангиогенный маркер, присутствовал в EV из фракции S1, и не присутствовал ни в EV из фракции LPS, ни на дорожке А (отрицательный контроль) (см. Фиг. 3).The membrane glycoprotein CD200, a second proangiogenic marker, was present in EVs from the S1 fraction, and was not present in either EVs from the LPS fraction or in lane A (negative control) (see Fig. 3).

7.3.2. Набор белков, участвующих в ангиогенезе7.3.2. Set of proteins involved in angiogenesis

EV, происходящие из MSC, культивированных в кондиционированных NS, S1 и LPS средах, сравнивали с набором для протеомных исследований ангиогенеза (R&D Systems - ARY007).EVs derived from MSCs cultured in NS, S1 and LPS conditioned media were compared with the Angiogenesis Proteomics Kit (R&D Systems - ARY007).

Буфер для лизиса готовили так, как приведено ниже.Lysis buffer was prepared as follows.

1. Из расчета на 50 мл: растворить 157,6 мг трис-HCl в 10 мл воды; 400,3 мг NaCl в 10 мл воды и 37,2 мг EDTA в 10 мл воды.1. Based on 50 ml: dissolve 157.6 mg Tris-HCl in 10 ml of water; 400.3 mg NaCl in 10 ml water and 37.2 mg EDTA in 10 ml water.

2. Подвести значение рН до 8.2. Adjust pH value to 8.

3. Добавить 0,5 мл тритона Х-100, 5 мл глицерина, 50 мкл раствора апротинина (10 мг/мл), 50 мкл раствора леупептина (10 мг/мл) и 500 мкл раствора пепстатина (1 мг/мл).3. Add 0.5 ml Triton X-100, 5 ml glycerol, 50 µl aprotinin solution (10 mg/ml), 50 µl leupeptin solution (10 mg/ml) and 500 µl pepstatin solution (1 mg/ml).

4. Добавить стерильную воду в достаточном количестве (QSP) до 50 мл.4. Add sufficient sterile water (QSP) to 50 ml.

EV, происходящие из MSC, полученных в NS, S1 и LPS средах, солюбилизировали в буфере для лизиса:EVs derived from MSCs obtained in NS, S1 and LPS media were solubilized in lysis buffer:

- NS: 150 мкл EV суспендировали в 1 мл буфера для лизиса;- NS: 150 μl EVs were suspended in 1 ml lysis buffer;

- S1: 130,4 мкл EV суспендировали в 1 мл буфера для лизиса;- S1: 130.4 μl EVs were suspended in 1 ml lysis buffer;

- LPS: 125 мкл EV суспендировали в 1 мл буфера для лизиса.- LPS: 125 μl EVs were suspended in 1 ml lysis buffer.

С использованием ВСА-анализа было определено общее содержание белка (300 мкг) в лизатах, что тем самым подтвердило эффективность лизиса.Using the BCA assay, the total protein content (300 μg) in the lysates was determined, thereby confirming the efficiency of lysis.

Лизаты EV далее ресуспендировали, перемешивая с использованием пипетки вверх и вниз, и осторожно встряхивали при 2-8°С в течение 30 минут, затем центрифугировали с применением микроцентрифуги при 14000×g в течение 5 минут. Супернатант переносили в чистую пробирку и анализировали, следуя инструкциям производителя.EV lysates were further resuspended by pipetting up and down and gently vortexed at 2-8°C for 30 minutes, then centrifuged using a microcentrifuge at 14,000×g for 5 minutes. The supernatant was transferred to a clean tube and analyzed following the manufacturer's instructions.

Реагенты набора для протеомных исследований ангиогенезаAngiogenesis Proteomics Kit Reagents

На графике, представленном на Фиг. 4, показаны результаты для белков, которые значительно различались по уровню экспрессии в 3 образцах. Для 28 проангиогенных белков из 59 проанализированных в указанном наборе, представлены различия в экспрессии в образцах S1 и LPS, и это подтверждает, что EV по изобретению демонстрируют характеристики, отличающиеся от таковых для EV предшествующего уровня техники, в частности, в отношении содержания проангиогенных белков.In the graph presented in Fig. Figure 4 shows results for proteins that were significantly different in expression levels across the 3 samples. For 28 proangiogenic proteins out of 59 analyzed in this set, differences in expression are presented in the S1 and LPS samples, and this confirms that the EVs of the invention exhibit characteristics different from those of prior art EVs, in particular with regard to the content of proangiogenic proteins.

Библиографические ссылкиBibliographical references

Shabbir, А.; Сох, A.; Rodriguez-Menocal, L.; Salgado, М.; Badiavas, E.V. Mesenchymal stem cell exosomes induce proliferation and migration of normal and chronic wound fibroblasts, and enhance angiogenesis in vitro. Stem Cells Dev., 2015, 24, 1635-1647.Shabbir, A.; Soh, A.; Rodriguez-Menocal, L.; Salgado, M.; Badiavas, E.V. Mesenchymal stem cell exosomes induce proliferation and migration of normal and chronic wound fibroblasts, and enhance angiogenesis in vitro. Stem Cells Dev., 2015, 24, 1635-1647.

Uyen Thi Trang Than, Dominic Guanzon, David Leavesley and Tony Parker -Association of Extracellular Membrane Vesicles with Cutaneous Wound healing - Int. John Mol. Sci., 2017, 18, 956.Uyen Thi Trang Than, Dominic Guanzon, David Leavesley and Tony Parker -Association of Extracellular Membrane Vesicles with Cutaneous Wound healing - Int. John Mol. Sci., 2017, 18, 956.

Graca Raposo, HansW. Nijman, Willem Stoorvogel, Richtje Leijendekker, Clifford V. Harding, Cornelis J.M. Melief and Hans J. Geuze - В Lymphocytes Secrete Antigen-presenting Vesicles - J. Exp.Med., Объем 183, March 1996, 1161-1172.Graca Raposo, HansW. Nijman, Willem Stoorvogel, Richtje Leijendekker, Clifford V. Harding, Cornelis J.M. Melief and Hans J. Geuze - In Lymphocytes Secrete Antigen-presenting Vesicles - J. Exp.Med., Volume 183, March 1996, 1161-1172.

Bernd Giebel, Lambros Kordelas, Verena Borger - Clinical potential of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles - Stem Cell Investig., 2017, 4: 84.Bernd Giebel, Lambros Kordelas, Verena Borger - Clinical potential of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles - Stem Cell Investig., 2017, 4: 84.

Donald. G. Phinney, Mark Pittenger - Concise Review: MSC-Derived Exosomes for Cell-Free Therapy - Stem Cells, 2017, 35: 851-858.Donald. G. Phinney, Mark Pittenger - Concise Review: MSC-Derived Exosomes for Cell-Free Therapy - Stem Cells, 2017, 35: 851-858.

Liang, X.; Zhang, L.; Wang, S.; Han, Q.; Zhao, R.C. Exosomes secreted by mesenchymal stem cells promote endothelial cell angiogenesis by transferring miR-125a. J. Cell Sci., 2016, 129, 2182-2189.Liang, X.; Zhang, L.; Wang, S.; Han, Q.; Zhao, R.C. Exosomes secreted by mesenchymal stem cells promote endothelial cell angiogenesis by transferring miR-125a. J. Cell Sci., 2016, 129, 2182-2189.

Zhang, В.; Wu, X.; Zhang, X.; Sun, Y.; Yan, Y.; Shi, H.; Zhu, Y.; Wu, L; Pan, Z.; Zhu, W. Human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes enhance angiogenesis through the WNT4/_-catenin pathway. Stem Cells Trans. Med., 2015, 4, 513-522.Zhang, W.; Wu, X.; Zhang, X.; Sun, Y.; Yan, Y.; Shi, H.; Zhu, Y.; Wu, L; Pan, Z.; Zhu, W. Human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes enhance angiogenesis through the WNT4/_-catenin pathway. Stem Cells Trans. Med., 2015, 4, 513-522.

Uyen Thi Trang Than, Dominic Guanzon, David Leavesley и Tony Parker -Association of Extracellular Membrane Vesicles with Cutaneous Wound healing - Int. J. Mol. Sci., 2017.Uyen Thi Trang Than, Dominic Guanzon, David Leavesley and Tony Parker - Association of Extracellular Membrane Vesicles with Cutaneous Wound healing - Int. J. Mol. Sci., 2017.

Sabrina Roya, Fred H. Hochberg b and Pamela S. Jonesc - Extracellular vesicles: the growth as diagnostics and therapeutics; a survey - J. of Extracellular Vesicles, 2018.Sabrina Roya, Fred H. Hochberg b and Pamela S. Jonesc - Extracellular vesicles: the growth as diagnostics and therapeutics; a survey - J. of Extracellular Vesicles, 2018.

Anna Otte, Vesna Bucan, Kerstin Reimers и Ralf Hass. Mesenchymal Stem Cells Maintain Long-Term In Vitro Sternness During Explant culture. Tissue Engineering Part C: Methods. November 2013, 19(12): 937-948.Anna Otte, Vesna Bucan, Kerstin Reimers and Ralf Hass. Mesenchymal Stem Cells Maintain Long-Term In Vitro Sternness During Explant culture. Tissue Engineering Part C: Methods. November 2013, 19(12): 937-948.

Van Pham, P., Truong, N.C., Le, P.TB. et al. Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications. Cell Tissue Bank, 2016, 17: 289.Van Pham, P., Truong, N.C., Le, P.TB. et al. Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications. Cell Tissue Bank, 2016, 17: 289.

Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. Biomed. Res. Int., 2018.Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. Biomed. Res. Int., 2018.

Ruenn Chai Lai, Fatih Arslan May May Lee, Newman Siu Kwan Sze, Andre Choo, Tian Sheng Chen, Manuel Сольо-Tellez, Leo Timmers, Chuen Neng Lee, Reida Menshawe El Oakley, Gerard Pasterkamp, Dominique P.V. de Kleijn, Sai Kiang Lia -Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/re perfusion injury - Stem Cell Research, 2010, 4, 214-222.Ruenn Chai Lai, Fatih Arslan May May Lee, Newman Siu Kwan Sze, Andre Choo, Tian Sheng Chen, Manuel Soglio-Tellez, Leo Timmers, Chuen Neng Lee, Reida Menshawe El Oakley, Gerard Pasterkamp, Dominique P.V. de Kleijn, Sai Kiang Lia -Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury - Stem Cell Research, 2010, 4, 214-222.

Han Z.C., et al. New insights into the heterogeneity and functional diversity of human mesenchymal stem cells. Bio-medical Materials and Engineering, 28 (2017), S29-S45.Han Z.C., et al. New insights into the heterogeneity and functional diversity of human mesenchymal stem cells. Bio-medical Materials and Engineering, 28 (2017), S29-S45.

Du W. et al. VCAM-1+ placenta chorionic villi-derived mesenchymal stem cells display potent pro-angiogenic activity. Stem Cell research & therapy (2016) 7: 49.Du W. et al. VCAM-1+ placenta chorionic villi-derived mesenchymal stem cells display potent pro-angiogenic activity. Stem Cell research & therapy (2016) 7: 49.

Dongdong Ti et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of translational medicine, 2015, vol. 13, №1.Dongdong Ti et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of translational medicine, 2015, vol. 13, no. 1.

Yunbing Wu et al. Exosomes derived from Human Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells relieve Inflammatory Bowel Disease in Mice. BioMed Research International, 2017, pages 53566760-12.Yunbing Wu et al. Exosomes derived from Human Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells relieve Inflammatory Bowel Disease in Mice. BioMed Research International, 2017, pages 53566760-12.

Katoh M. & Katoh M. CD157 and CD200 at the crossroads of endothelial remodeling and immune regulation. Stem CellInvestig, 2019, 6: 10.Katoh M. & Katoh M. CD157 and CD200 at the crossroads of endothelial remodeling and immune regulation. Stem Cell Investig, 2019, 6: 10.

Claims (110)

1. Композиция для лечения цирроза печени, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:1. A composition for the treatment of liver cirrhosis, containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь интерлейкина (IL)-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of interleukin (IL)-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 2. Композиция для лечения диабета, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:2. A composition for the treatment of diabetes containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь интерлейкина (IL)-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of interleukin (IL)-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 3. Композиция для лечения апластической анемии, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:3. A composition for the treatment of aplastic anemia, containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь интерлейкина (IL)-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of interleukin (IL)-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 4. Композиция для индуцирования ангиогенеза, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:4. A composition for inducing angiogenesis containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь интерлейкина (IL)-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of interleukin (IL)-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 5. Композиция по любому из пп. 1-4, где указанные внеклеточные везикулы получены из недифференцированных MSC, происходящих из перинатальной ткани, выбранной из плаценты, пуповины или оболочек плаценты или их компонентов, либо из перинатальной жидкости.5. Composition according to any one of paragraphs. 1-4, wherein said extracellular vesicles are derived from undifferentiated MSCs derived from perinatal tissue selected from the placenta, umbilical cord or placental membranes or components thereof, or from perinatal fluid. 6. Композиция по любому из пп. 1-5, где указанные внеклеточные везикулы получены из недифференцированных MSC, происходящих из пуповинной крови, плацентарной крови или амниотической жидкости.6. Composition according to any one of paragraphs. 1-5, wherein said extracellular vesicles are derived from undifferentiated MSCs derived from umbilical cord blood, placental blood or amniotic fluid. 7. Композиция по любому из пп. 1-6, где указанные внеклеточные везикулы получены из недифференцированных MSC, происходящих из пуповины, предпочтительно посредством выделения клеток из эксплантата фрагмента пуповины.7. Composition according to any one of paragraphs. 1-6, wherein said extracellular vesicles are obtained from undifferentiated umbilical cord-derived MSCs, preferably by isolating cells from an umbilical cord fragment explant. 8. Композиция по любому из пп. 1-7, где указанные внеклеточные везикулы получены из недифференцированных MSC, происходящих из плаценты, предпочтительно посредством выделения клеток из фрагмента плацентарной ткани.8. Composition according to any one of paragraphs. 1-7, wherein said extracellular vesicles are obtained from undifferentiated placenta-derived MSCs, preferably by isolating cells from a piece of placental tissue. 9. Фармацевтическая композиция для лечения цирроза печени, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:9. A pharmaceutical composition for the treatment of liver cirrhosis, containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 10. Фармацевтическая композиция для лечения диабета, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:10. A pharmaceutical composition for the treatment of diabetes containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 11. Фармацевтическая композиция для лечения апластической анемии, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:11. A pharmaceutical composition for the treatment of aplastic anemia, containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSC), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 12. Фармацевтическая композиция для индуцирования ангиогенеза, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:12. A pharmaceutical composition for inducing angiogenesis containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 13. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 9-12, где указанный биологически совместимый материал представляет собой гидрогель.13. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 9-12, where the specified biocompatible material is a hydrogel. 14. Косметическая композиция для регенерации клеток кожи, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:14. Cosmetic composition for skin cell regeneration containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106highCD151+nestin+ mesenchymal stem cells (MSC), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 15. Косметическая композиция для регенерации клеток слизистой оболочки, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:15. A cosmetic composition for the regeneration of mucosal cells containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSC), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106ысокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 16. Косметическая композиция для улучшения внешнего вида кожи, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:16. A cosmetic composition for improving the appearance of the skin, containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSC), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 17. Косметическая композиция улучшения внешнего вида слизистой оболочки, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:17. A cosmetic composition for improving the appearance of the mucous membrane, containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 18. Косметическая композиция для исправления дефекта кожи, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:18. A cosmetic composition for correcting a skin defect, containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 19. Косметическая композиция для исправления дефекта слизистой оболочки, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:19. A cosmetic composition for correcting a mucosal defect, containing extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 20. Косметическая композиция для заживления кожного повреждения или расстройства, содержащая внеклеточные везикулы (EV), происходящие из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и биологически совместимый материал, причем указанные внеклеточные везикулы получены посредством:20. A cosmetic composition for healing a skin lesion or disorder, comprising extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs), and a biocompatible material, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3).(4) purifying extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 21. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для коррекции пигментных пятен.21. Use of a cosmetic composition according to any one of paragraphs. 14-20 for correction of age spots. 22. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для коррекции пятен.22. Use of a cosmetic composition according to any one of paragraphs. 14-20 for spot correction. 23. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для коррекции акне.23. Use of a cosmetic composition according to any one of paragraphs. 14-20 for acne correction. 24. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для коррекции морщин.24. Use of a cosmetic composition according to any one of paragraphs. 14-20 for wrinkle correction. 25. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для коррекции сухости.25. Use of a cosmetic composition according to any one of paragraphs. 14-20 to correct dryness. 26. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для заживления ожога.26. Use of a cosmetic composition according to any one of paragraphs. 14-20 for burn healing. 27. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для заживления рубца.27. Use of a cosmetic composition according to any one of paragraphs. 14-20 for scar healing. 28. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для заживления ангиомы.28. Use of a cosmetic composition according to any one of paragraphs. 14-20 for angioma healing. 29. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для заживления невуса.29. Use of a cosmetic composition according to any one of paragraphs. 14-20 for nevus healing. 30. Применение косметической композиции по любому из пп. 14-20 для заживления бородавки.30. Use of a cosmetic composition according to any one of paragraphs. 14-20 for wart healing. 31. Система для введения внеклеточных везикул (EV), происходящих из CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), пациенту, где указанные внеклеточные везикулы получены посредством:31. A system for administering extracellular vesicles (EVs) derived from CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells (MSCs) to a patient, wherein said extracellular vesicles are obtained by: (1) культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells derived from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приведения в контакт указанной популяции культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивирования указанных MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions allowing their proliferation; And (4) очистки внеклеточных везикул от клеток, полученных на стадии (3),(4) purification of extracellular vesicles from cells obtained in step (3), и где указанная система представляет собой липосомы, пролипосомы, микросферы, микро- или нановезикулы из биополимеров, липиды или наночастицы, включающие указанные EV.and wherein said system is liposomes, proliposomes, microspheres, micro- or nanovesicles of biopolymers, lipids or nanoparticles comprising said EVs. 32. Система по п. 31, представляющая собой микро- или нановезикулы из биополимеров, липиды или наночастицы.32. The system according to claim 31, which is micro- or nanovesicles made of biopolymers, lipids or nanoparticles. 33. Способ получения внеклеточных везикул, при этом указанный способ включает стадии, на которых:33. A method for producing extracellular vesicles, wherein said method includes the stages of: (1) культивируют мезенхимальные стволовые клетки, полученные из перинатальной ткани, в первой культуральной среде, не содержащей факторов роста, таким образом, чтобы создать популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,(1) culturing mesenchymal stem cells obtained from perinatal tissue in a first growth factor-free culture medium so as to create a population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells, (2) приводят в контакт указанную популяцию культивированных недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток со второй культуральной средой, содержащей смесь IL-4 и IL1β, в результате чего образуются CD106высокаяCD151+нестин+ мезенхимальные стволовые клетки,(2) contacting said population of cultured undifferentiated mesenchymal stem cells with a second culture medium containing a mixture of IL-4 and IL1β, resulting in the formation of CD106 high CD151 + nestin + mesenchymal stem cells, (3) культивируют указанные MSC в не содержащей внеклеточных везикул культуральной среде в условиях, допускающих их размножение; и(3) culturing said MSCs in a culture medium free of extracellular vesicles under conditions that allow them to multiply; And (4) очищают внеклеточные везикулы от клеток, полученных на стадии (3).(4) purify extracellular vesicles from cells obtained in step (3). 34. Способ по п. 33, где указанные недифференцированные MSC происходят из перинатальной ткани, выбранной из плаценты, пуповины или оболочек плаценты или их компонентов, либо из перинатальной жидкости.34. The method of claim 33, wherein said undifferentiated MSCs are derived from perinatal tissue selected from the placenta, umbilical cord or placental membranes or components thereof, or from perinatal fluid. 35. Способ по п. 33, где указанные недифференцированные MSC получают посредством выделения клеток из эксплантата перинатальных тканей.35. The method of claim 33, wherein said undifferentiated MSCs are obtained by isolating cells from a perinatal tissue explant. 36. Способ по п. 33, где указанные недифференцированные MSC происходят из пуповины, предпочтительно посредством выделения клеток из эксплантата фрагмента пуповины.36. The method of claim 33, wherein said undifferentiated MSCs are derived from the umbilical cord, preferably by isolating cells from an umbilical cord fragment explant. 37. Способ по п. 33, где указанные недифференцированные MSC происходят из плаценты, предпочтительно посредством выделения клеток из фрагмента плацентарной ткани.37. The method of claim 33, wherein said undifferentiated MSCs are derived from the placenta, preferably by isolating cells from a fragment of placental tissue. 38. Способ по любому из пп. 33-37, где указанная вторая культуральная среда содержит интерлейкин 1β в диапазоне от 1 до 100 нг/мл.38. Method according to any one of paragraphs. 33-37, wherein said second culture medium contains interleukin 1β in the range of 1 to 100 ng/ml. 39. Способ по любому из пп. 33-38, где указанная вторая культуральная среда содержит интерлейкин 4 в диапазоне от 1 до 100 нг/мл.39. Method according to any one of paragraphs. 33-38, wherein said second culture medium contains interleukin 4 in the range of 1 to 100 ng/ml. 40. Способ по любому из пп. 33-39, где указанная не содержащая внеклеточных везикул культуральная среда дополнена смесью IL1 и IL4, предпочтительно IL1β и IL4.40. Method according to any one of paragraphs. 33-39, wherein said extracellular vesicle-free culture medium is supplemented with a mixture of IL1 and IL4, preferably IL1β and IL4. 41. Способ по любому из пп. 33-40, где внеклеточные везикулы очищают ультрафильтрацией.41. Method according to any one of paragraphs. 33-40, where extracellular vesicles are purified by ultrafiltration.
RU2021100128A 2018-06-11 2019-06-11 Extracellular vesicles originating from mesenchymal stem cells RU2805066C2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IBPCT/IB2018/000796 2018-06-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2021100128A RU2021100128A (en) 2022-07-11
RU2805066C2 true RU2805066C2 (en) 2023-10-11

Family

ID=

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018108859A1 (en) * 2016-12-12 2018-06-21 Health And Biotech France (H & B France) Perinatal tissue derived mesenchymal stem cells: method of preparation and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018108859A1 (en) * 2016-12-12 2018-06-21 Health And Biotech France (H & B France) Perinatal tissue derived mesenchymal stem cells: method of preparation and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU L. et al., Tetraspanin CD151 promotes cell migration by regulating integrin trafficking, 2007, vol. 282, N. 43, pp. 31631-31642. YANG Z.X. et al., CD106 Identifies a Subpopulation of Mesenchymal Stem Cells with Unique Immunomodulatory Properties, PLOS One, 2013, vol. 8, N. 3, e59354. ABUMAREE M.H. et al., Phenotypic and Functional Characterization of Mesenchymal Stem/Multipotent Stromal Cells From Decidua Parietalis of Human Term Placenta, Reproductive Science, 2016 Sep., vol. 23, N. 9, pp.1193-1207. FEI MAO et al., Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells relieve inflammatory bowel disease in mice, Biomed Res Int., 2017, 5356760. ВЕРЯСОВ В.Н. и др., Получение мезенхимальных стромальных клеток из внезародышевых тканей и их характеристика, Клеточные технологии в биологии и мецицине, Т.1, No.1, 2014, с.3-9. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7363003B2 (en) Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles
Komaki et al. Exosomes of human placenta-derived mesenchymal stem cells stimulate angiogenesis
JP6952761B2 (en) Use of cord blood-derived exosomes for tissue repair
Pourakbari et al. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis
US11541078B2 (en) Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders
EP3479831B1 (en) Composition comprising thrombin-treated stem cell-derived exosome for use in treating skin wound
JP7275441B2 (en) Perinatal Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells: Methods of Making and Using Them
CA2609260A1 (en) Rna-containing microvesicles and methods therefor
CN112870228B (en) Multifunctional microenvironment protection exosome hydrogel and preparation method and application thereof
JP2022538004A (en) Exosomes for disease treatment
CN111182890A (en) Methods and compositions for treating epidermolysis bullosa
JP2013528230A (en) Compositions and methods for treating no option severe ischemic limb (CLI)
TW202108151A (en) Precursory regulatory cytotrophoblast cells and uses thereof
EP2643028B1 (en) Composition and method to improve the therapeutic effect of stem cells
RU2805066C2 (en) Extracellular vesicles originating from mesenchymal stem cells
CN115361956A (en) Anti-fibrosis agent and method for producing extracellular vesicle having anti-fibrosis effect
JP2017538411A (en) Method for development and use of minimally polarized functional cell microaggregate units using LGR4, LGR5 and LGR6 expressing epithelial stem cells in tissue applications
WO2021011779A2 (en) Mesenchymal stem cell compositions
RU2780179C2 (en) Mesenchymal stem cells originating from perinatal tissue: method for their production and use
WO2023219119A1 (en) Method for producing extracellular vesicles containing bioactive substance
JP2007222155A (en) Cell line originated from human lymphatic vessel and diagnostic kit using the same
KR20230128452A (en) Mesenchymal stem cells and their culture
WO2024107102A1 (en) Use of conditioned medium derived from cultivation of mesenchymal stem cells of the umbilical cord for inducing, stimulating and promoting hair growth and regeneration