RU2791738C1

RU2791738C1 - Method for obtaining autologous regulatory t-lymphocytes by ex vivo cultivation in presence of human chorionic gonadotropin

Info

Publication number: RU2791738C1
Application number: RU2022122345A
Authority: RU
Inventors: Ксения Юрьевна Шардина; Светлана Анатольевна Заморина; Мария Станиславовна Бочкова; Валерия Павловна Тимганова; Михаил Борисович Раев
Filing date: 2022-08-17
Publication date: 2023-03-13

Abstract

FIELD: biotechnology; cellular biotechnology.

SUBSTANCE: objective of the invention is to develop a composition of culture medium factors intended to improve the technology of cultivating CD4⁺-lymphocytes, leading to their effective differentiation into T-regulatory cells (Treg), expressing the FOXP3 transcription factor, which indicates the suppressor function of the resulting Tregs. To solve this problem, human chorionic gonadotropin was added to the composition of the traditionally used medium for cultivating CD4⁺ cells, among the physiologically significant functions of which its ability to cause mild immunosuppression is known. As a result, a method was developed for culturing and differentiating CD4⁺ cells into T-regulatory lymphocytes, which makes it possible to obtain a greater number of functionally active cells in a shorter cultivation time.

EFFECT: development of approaches to the treatment of a number of autoimmune disorders, as well as to reduce the risk of developing host-versus-graft reaction (“РХПТ”), which occurs when tissues and organs are rejected in cases of allogeneic transplantation.

1 cl, 1 dwg, 1 tbl, 1 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии и может применяться в медицине для лечения ряда аутоиммунных расстройств, а также в реакции «хозяин против трансплантата» (РХПТ), которая возникает при отторжении тканей и органов в случаях их аллогенной пересадки. Кроме того, изобретение может найти применение в научных исследованиях. Изобретение направлено на разработку способа получения композиции, основу которой составляют регуляторные Т-клетки, пригодной для лечения и профилактики таких заболеваний и состояний, как отторжение трансплантата, аутоиммунные патологии.The invention relates to the field of cellular biotechnology and can be used in medicine for the treatment of a number of autoimmune disorders, as well as in the host-versus-graft reaction (ECPT), which occurs when tissues and organs are rejected in cases of allogeneic transplantation. In addition, the invention may find application in scientific research. The invention is aimed at developing a method for obtaining a composition based on regulatory T cells, suitable for the treatment and prevention of diseases and conditions such as transplant rejection, autoimmune pathologies.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

В настоящее время известные методы получения регуляторных Т- клеток (Treg) можно разделить на две основные стратегические группы: выделение Treg из периферической крови различными методами сортировки или выделение Т-хелперов и дальнейшая направленная дифференцировка в Treg in vitro с использованием специально разработанных для этого наборов.At present, the known methods for obtaining regulatory T cells (Treg) can be divided into two main strategic groups: isolation of Treg from peripheral blood by various sorting methods or isolation of T helpers and further directed differentiation into Treg in vitro using specially designed kits.

К первой группе относится технология получения регуляторных Т-лимфоцитов из цельной крови с использованием позитивной и негативной селекции клеток [1]. Суть ее сводится к тому, что методом иммуномагнитной сепарации из суспензии сначала удаляют CD8⁺ CD14⁺ и CD19-клетки, а затем оставшиеся клеточные популяции подвергают позитивной селекции по маркеру CD25⁺. Минусом данной стратегии является невозможность выделения Treg сразу по нескольким характеристикам.The first group includes the technology for obtaining regulatory T-lymphocytes from whole blood using positive and negative cell selection [1]. Its essence boils down to the fact that CD8 ⁺ CD14 ⁺ and CD19 cells are first removed from the suspension by immunomagnetic separation, and then the remaining cell populations are subjected to positive selection for the CD25 ⁺ marker. The disadvantage of this strategy is the impossibility of isolating Treg by several characteristics at once.

Известен метод выделения Treg, основанный на сортировке клеток по нескольким маркерам. Данный метод предполагает использование проточной сортировки сразу по нескольким соответствующим маркерам, тем самым позволяя получить чистую популяцию целевых Treg. В целом приведенный метод решает проблему использования сразу нескольких клеточных характеристик, однако для подтверждения супрессорной функции Treg осуществляется внутриклеточное измерение уровня транскрипционного фактора FOXP3. Несмотря на очевидные плюсы этой стратегии, есть также очевидные недостатки, в частности, малочисленность Treg в периферической крови (5-10% среди всех CD4 Т-лимфоцитов), а также непригодность дальнейшего использования клеток в клинической практике из-за необходимой пермеабилизации и фиксации клеточной мембраны. Этот минус критичен для проведения клинических исследований, при котором важен большой выход функционально - активной клеточной популяции, поскольку известно, что для подавления РХПТ требуются большие дозы Treg. Эта проблема может быть решена разработкой протоколов генерации и экспансии функционально-активных регуляторных клеток ex vivo.A known method for isolating Treg based on cell sorting by several markers. This method involves the use of flow sorting for several relevant markers at once, thereby allowing a clean population of target Tregs to be obtained. In general, this method solves the problem of using several cellular characteristics at once, however, to confirm the suppressor function of Treg, an intracellular measurement of the level of the FOXP3 transcription factor is carried out. Despite the obvious advantages of this strategy, there are also obvious disadvantages, in particular, the small number of Treg in the peripheral blood (5-10% of all CD4 T-lymphocytes), as well as the unsuitability of further use of cells in clinical practice due to the necessary permeabilization and fixation of the cell wall. membranes. This minus is critical for conducting clinical trials, in which a large yield of a functionally active cell population is important, since it is known that large doses of Treg are required to suppress ECPT. This problem can be solved by developing protocols for the generation and expansion of functionally active regulatory cells ex vivo.

С этой точки зрения привлекают внимание две описанных стратегии генерации регуляторных Т-клеток in vitro.From this point of view, two described strategies for generating regulatory T cells in vitro attract attention.

Одна из таких стратегий - направленная цитокиновая индукция дифференцировки наивных Т-клеток (CD4⁺CD45R0⁺) в фенотип регуляторных Т-лимфоцитов. Особенностью данной методики является получение пула наивных Т-хелперных клеток из периферической крови донора и дальнейшее их культивирование с цитокинами IL-2 и TGF-β [2], а также с антителами против CD3 и CD28 [3]. В ряде случаев в среду культивирования вносят ретиноевую кислоту, рапамицин и бутират [4]. Стоит отметить, что количество наивных Т-хелперов (CD4⁺CD45R0⁺) в периферической крови крайне мало, что создает препятствия для получения этих клеток.One such strategy is targeted cytokine induction of differentiation of naive T cells (CD4 ⁺ CD45R0 ⁺ ) into the phenotype of regulatory T lymphocytes. A specific feature of this technique is obtaining a pool of naive T-helper cells from the peripheral blood of a donor and their further cultivation with cytokines IL-2 and TGF-β [2], as well as with antibodies against CD3 and CD28 [3]. In some cases, retinoic acid, rapamycin, and butyrate are added to the culture medium [4]. It should be noted that the number of naive T-helpers (CD4 ⁺ CD45R0 ⁺ ) in the peripheral blood is extremely small, which creates obstacles for obtaining these cells.

Второй путь основан на получении пула Т-хелперов (CD4⁺) из периферической крови донора, с дальнейшим их культивированием с цитокинами, что на сегодняшний день является наиболее перспективным и оправданным, поскольку позволяет получить популяцию Treg в достаточном для адаптивного переноса объеме, с сохранением функциональной активности клеток [5].The second way is based on obtaining a pool of T-helpers (CD4 ⁺ ) from the donor's peripheral blood, with their further cultivation with cytokines, which is the most promising and justified today, since it allows obtaining a Treg population in a volume sufficient for adaptive transfer, while maintaining the functional cell activity [5].

Наиболее близким к заявляемому решению по технической сущности и достигаемому результату является способ, предложенный Быковской и соавт. [6]. Суть его сводится к тому, что из крови выделяют мононуклеарные клетки периферической крови, которые подвергают позитивной селекции CD4⁺-клеток методом магнитной сепарации. После чего полученные клетки помещают во флаконы 25 см³ в полную питательную среду и добавляют смесь цитокинов - IL-2, TGF-β и антитела к CD2, CD3 и CD28. Затем клетки инкубируют в СО₂-инкубаторе в условиях содержания 5% СО₂ при 37°С в течение 7-12 суток. Смена среды производится каждые 3-4 суток. В итоге можно получить популяцию CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Т-лимфоцитов человека.Closest to the claimed solution in terms of technical essence and the achieved result is the method proposed by Bykovskaya et al. [6]. Its essence boils down to the fact that peripheral blood mononuclear cells are isolated from the blood, which are subjected to positive selection of CD4 ⁺ cells by magnetic separation. After that, the obtained cells are placed in 25 cm ³ flasks in a complete nutrient medium and a mixture of cytokines - IL-2, TGF-β and antibodies to CD2, CD3 and CD28 is added. Then the cells are incubated in CO ₂ -incubator under conditions of 5% CO ₂ at 37°C for 7-12 days. The medium is changed every 3-4 days. As a result, a population of CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ human T-lymphocytes can be obtained.

С позиции критики необходимо отметить, что, несмотря на эффективность схемы, в данном случае происходит пролиферация и эффекторных клеток тоже, поскольку активированные Т-клетки начинают временно экспрессировать молекулу CD25, правда в меньшей степени. Поэтому главной проблемой культивирования Treg является существенная контаминация CD25⁺FOXP3^- Т-клетками. Существует и другой аспект проблемы получения Treg, связанный со стабильностью молекулы FOXP3, которая индуцируется только TGF-β. Дело в том, что под действием таких цитокинов, как IL-6 или IL-1 может произойти переход Treg в Th17-клетки и экспрессия FOXP3 будет потеряна [7].From the standpoint of criticism, it should be noted that, despite the effectiveness of the scheme, in this case, proliferation of effector cells also occurs, since activated T cells begin to temporarily express the CD25 molecule, although to a lesser extent. Therefore, the main problem of Treg cultivation is a significant contamination of CD25 ⁺ FOXP3 ^- T-cells. There is another aspect of the problem of obtaining Treg, associated with the stability of the FOXP3 molecule, which is induced only by TGF-β. The fact is that under the action of cytokines such as IL-6 or IL-1, Treg can be transferred to Th17 cells and FOXP3 expression will be lost [7].

Заявляемый способ позволяет решать задачу повышения стабильности экспрессии белка FOXP3 за счет добавления в ростовую среду при культивировании Treg хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Хорионический гонадотропин - это гормон, вырабатываемый тканью хориона после имплантации эмбриона. Помимо своих прямых функций, а именно, стероидогенеза и поддержания функциональной активности плаценты, он способен проявлять также иммуномодулирующие функции во время беременности. В данном случае важно, что одним из известных свойств этого белка является определенный молекулярный механизм передачи сигнала через цАМФ, повышение которого приводит к экспрессии молекулы FOXP3 [8]. Этот аспект может послужить дополнительным сигналом, приводящим к экспрессии FOXP3, что отразится на стабильности функционально активных Treg.The claimed method makes it possible to solve the problem of increasing the stability of FOXP3 protein expression by adding human chorionic gonadotropin (hCG) to the growth medium during Treg cultivation. Chorionic gonadotropin is a hormone produced by the chorion tissue after embryo implantation. In addition to its direct functions, namely, steroidogenesis and maintaining the functional activity of the placenta, it is also able to exhibit immunomodulatory functions during pregnancy. In this case, it is important that one of the known properties of this protein is a certain molecular mechanism of signal transduction through cAMP, the increase of which leads to the expression of the FOXP3 molecule [8]. This aspect can serve as an additional signal leading to FOXP3 expression, which will affect the stability of functionally active Tregs.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE INVENTION

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка эффективного способа выделения и культивирования регуляторных Т-лимфоцитов (Treg) в количестве и качестве, удовлетворяющем перспективам применения их в осуществлении способов лечения заболеваний, при которых свойственно снижение концентрации и/или функциональной активности Treg. Такой способ подразумевает изначальное выделение CD4⁺-Т-лимфоцитов из крови пациентов, для их дальнейшей обработки смесью цитокинов, антител и ХГЧ с целью последующего введения аутологичных клеток, обогащенных регуляторными Т-лимфоцитами, этому же пациенту. Кроме того, предлагаемый способ получения Treg может быть использован при трансплантации органов для уменьшения реакции «хозяин против трансплантата» (РХПТ), что заметно повышает шансы приживления аллотрансплантата. Преимуществом использования клеточной аллоспецифичной терапии является также то, что Treg будут осуществлять свою модулирующую функцию в области аллоантигена, а не системно во всем организме, как при применении медикаментозной терапии.The task to be solved by the claimed invention is to develop an effective method for isolating and cultivating regulatory T-lymphocytes (Treg) in an amount and quality that satisfies the prospects for their use in the implementation of methods for treating diseases in which a decrease in the concentration and / or functional activity of Treg is characteristic. This method involves the initial isolation of CD4 ⁺ -T-lymphocytes from the blood of patients, for their further processing with a mixture of cytokines, antibodies and hCG with the aim of subsequent introduction of autologous cells enriched in regulatory T-lymphocytes to the same patient. In addition, the proposed method for obtaining Treg can be used in organ transplantation to reduce the host-versus-graft reaction (HRPT), which significantly increases the chances of engraftment of the allograft. The advantage of using cellular allospecific therapy is also that Tregs will carry out their modulating function in the alloantigen region, and not systemically throughout the body, as in the case of drug therapy.

Представленная работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа «Умник»).The presented work was carried out with the financial support of the Foundation for the Promotion of Small Forms of Enterprises in the Scientific and Technical Sphere (Umnik program).

Сущность изобретения.The essence of the invention.

Достигаемый изобретением технический результат заключается в том, что достигается значимый прирост числа Т-регуляторньгх клеток, позволяющий сократить время культивирования с 7-14 суток до трех.The technical result achieved by the invention lies in the fact that a significant increase in the number of T-regulatory cells is achieved, which makes it possible to reduce the cultivation time from 7-14 days to three.

Из крови, полученной венепункцией, выделяют мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) путем ее центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (ρ=1,077). После чего из фракции МПК методом магнитной сепарации выделяют CD4⁺ Т-лимфоциты. Полученную клеточную суспензию помещают в 96-луночный планшет, добавляя смесь цитокинов и антител, которые обеспечивают дальнейшее развитие клеток в популяцию Treg. Эта смесь содержит цитокины IL-2, TGF-β, моноклональные антитела к CD2, CD3, CD28 - антигену человека, а также гормон беременности - хорионический гонадотропин человека. После этого планшет с клетками, активирующей смесью и полной питательной средой культивируют в СО₂-инкубаторе при 5% СО₂, 37°С в течение трех суток. В результате происходит дифференцировка и пролиферация функционально активных регуляторных Т-клеток.Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are isolated from the blood obtained by venipuncture by centrifugation in ficoll-urografin density gradient (ρ=1.077). After that, CD4 ⁺ T-lymphocytes are isolated from the IPC fraction by magnetic separation. The resulting cell suspension is placed in a 96-well plate, adding a mixture of cytokines and antibodies, which ensure the further development of cells in the Treg population. This mixture contains cytokines IL-2, TGF-β, monoclonal antibodies to CD2, CD3, CD28 - human antigen, as well as pregnancy hormone - human chorionic gonadotropin. After that, the plate with cells, activating mixture and complete nutrient medium is cultured in CO ₂ -incubator at 5% CO ₂ , 37°C for three days. As a result, differentiation and proliferation of functionally active regulatory T cells occur.

Признаки способа, отвечающие критерию новизны, состоят в том, что предлагаемый способ увеличения количества аутологичных регуляторных Т-лимфоцитов пациента в условиях in vitro с использованием смеси цитокинов, антител и ХГЧ для обработки CD4⁺- клеток пациента. В результате достигается высокая гомогенность получаемой популяции лимфоцитов, а также стабильность маркера FOXP3, отражающего функциональную активность Treg. Помимо того, что достигается значимый прирост клеток (в среднем на 64%), данная экспериментальная схема предполагает и сокращение времени культивирования клеток- с 7-14 суток до трех. В целом данная технология позволяет получить стабильную экспрессию FOXP3 за счет применения ХГЧ, сократить объем забираемого образца и времени культивирования клеток.Features of the method that meet the criterion of novelty are that the proposed method of increasing the number of autologous regulatory T-lymphocytes of the patient in vitro using a mixture of cytokines, antibodies and hCG to treat CD4 ⁺ cells of the patient. As a result, a high homogeneity of the resulting population of lymphocytes is achieved, as well as the stability of the FOXP3 marker, which reflects the functional activity of Treg. In addition to the fact that a significant increase in cells is achieved (on average by 64%), this experimental scheme also implies a reduction in the time of cell cultivation - from 7-14 days to three. In general, this technology makes it possible to obtain a stable expression of FOXP3 through the use of hCG, to reduce the volume of the sample taken and the time of cell cultivation.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS

Сущность заявляемого изобретения поясняется графическими изображениями.The essence of the claimed invention is illustrated by graphic images.

На фигуре 1 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg в популяции клеток, выделенных методом магнитной сепарации до начала культивирования клеток.The figure 1 shows representative graphs of the expression of Treg markers in a population of cells isolated by magnetic separation before cell culture.

Фиг. 1а. График прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. На графике выделен гейт лимфоцитов (19%).Fig. 1a. Direct scatter (FSC) and side scatter (SSC) graph. The gate of lymphocytes (19%) is highlighted on the graph.

Фиг. 1б. График жизнеспособных лимфоцитов, несущих маркер CD3 (CD3⁺ 7-AAD^-, Т-лимфоциты) - 98,13%. Жизнеспособность была определена с помощью витального красителя 7-AAD. Фиг. 1в. Гистограмма общего пула жизнеспособных Т-лимфоцитов, несущих маркер CD4 (CD3⁺CD4⁺, Т-хелперы) - 99,58%.Fig. 1b. Graph of viable lymphocytes carrying the CD3 marker (CD3 ⁺ 7-AAD ^- , T-lymphocytes) - 98.13%. Viability was determined using the 7-AAD vital stain. Fig. 1c. Histogram of the total pool of viable T-lymphocytes carrying the CD4 marker (CD3 ⁺ CD4 ⁺ , T-helpers) - 99.58%.

Фиг. 1г. График четырех популяций Т-хелперов, основанных на экспрессии молекул CD25 и CD127. Левый верхний квадрант - эффекторные Т- клетки (CD3⁺CD4⁺CD25^-CD127⁺), правый верхний квадрант - активированные Т-хелперы (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127⁺), левый нижний квадрант - неактивированные Т-хелперы (CD3⁺CD4⁺CD25^-CD127^-), правый нижний квадрант - регуляторные Т-лимфоциты (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^-). Уровень Treg периферической крови после магнитной сепарации - 3,15%.Fig. 1g Graph of four T helper populations based on the expression of CD25 and CD127 molecules. Upper left quadrant - effector T cells (CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ^- CD127 ⁺ ), upper right quadrant - activated T helper cells (CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127 ⁺ ), lower left quadrant - inactivated T helper cells (CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ^- CD127 ^- ), lower right quadrant - regulatory T-lymphocytes (CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127 ^- ). The Treg level of peripheral blood after magnetic separation is 3.15%.

На фигуре 2 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg, после трех суток культивирования клеток с добавлением ХГЧ в концентрации 10 МЕ/ мл. Тактика гейтирования соответствует таковой на фигуре 1.The figure 2 shows representative graphs of the expression of Treg markers after three days of cell cultivation with the addition of hCG at a concentration of 10 IU/ml. The gating tactic corresponds to that in figure 1.

Фиг. 2а. Общий гейт лимфоцитов (32%). Увеличение процента лимфоцитов в сравнении с первым днем культивирования связано с активированием клеток.Fig. 2a. Total lymphocyte gate (32%). The increase in the percentage of lymphocytes in comparison with the first day of cultivation is associated with cell activation.

Фиг. 2б. живые CD3⁺- лимфоциты (96,69%).Fig. 2b. live CD3 ⁺ lymphocytes (96.69%).

Фиг. 2в. Т-хелперы (98,22%).Fig. 2c. T-helpers (98.22%).

Фиг. 2г. Treg (62,02%).Fig. 2y. Treg (62.02%).

После трех суток инкубирования растет процент Treg (%), при этом роста остальных популяций не происходит, что показывает специфичность действия выбранных цитокинов, активатора и ХГЧ.After three days of incubation, the percentage of Treg (%) increases, while the growth of the remaining populations does not occur, which shows the specificity of the action of the selected cytokines, activator, and hCG.

На фигуре 3 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg, после трех суток культивирования клеток с добавлением ХГЧ в концентрации 100 МЕ/ мл.The figure 3 shows representative graphs of the expression of Treg markers after three days of cell cultivation with the addition of hCG at a concentration of 100 IU/ml.

Фиг. 3а. Общий гейт лимфоцитов (28,91%).Fig. 3a. Total lymphocyte gate (28.91%).

Фиг. 3б. Живые CD3⁺- лимфоциты (96,55%).Fig. 3b. Live CD3 ⁺ - lymphocytes (96.55%).

Фиг. 3в. Т-хелперы (97,82%).Fig. 3c. T-helpers (97.82%).

Фиг. 3г. Treg (64,43%). При сравнении двух схем культивирования с добавлением разных физиологических концентраций ХГЧ, является очевидным отсутствие дозозависимого эффекта, что позволяет использовать белок в диапазоне концентраций 10-100 МЕ/мл.Fig. 3y. Treg (64.43%). When comparing two cultivation schemes with the addition of different physiological concentrations of hCG, it is obvious that there is no dose-dependent effect, which allows the use of the protein in the concentration range of 10-100 IU/ml.

Предлагаемое техническое решение иллюстрируется следующими примерами.The proposed technical solution is illustrated by the following examples.

Нижеследующие примеры приводятся только с целью демонстрации возможностей настоящего изобретения, и не ограничивают спектр клеток-мишеней и их свойств, которые могут быть использованы и/или улучшены при помощи предлагаемого способа культивирования.The following examples are provided only for the purpose of demonstrating the possibilities of the present invention, and do not limit the range of target cells and their properties that can be used and/or improved using the proposed method of cultivation.

Приводимые в тексте и примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемого способа.The specific quantitative parameters given in the text and examples, even in the indicated ranges, are not fixed by the claims, because they are not fundamental conditions for the implementation of the proposed method.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯIMPLEMENTATION OF THE INVENTION

Пример 1Example 1

1. Способ выделения и культивирования CD3⁺CD4⁺CD25^high CD 127 ^low/- 1. Method for isolating and cultivating CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ^high CD 127 ^low/-

Все процедуры проводят в ламинарных шкафах II класса биологической защиты с использованием стерильной одноразовой посуды и реагентов.All procedures are carried out in laminar cabinets of class II biological protection using sterile disposable tableware and reagents.

Периферическую кровь получают методом венепункции из локтевой вены в стерильные пробирки с гепарином (2 пробирки объемом по 9 мл).Peripheral blood is obtained by venipuncture from the cubital vein into sterile tubes with heparin (2 tubes of 9 ml each).

Выделение мононуклеарных клетокIsolation of mononuclear cells

Образцы крови разводят в соотношении 1:1 раствором Хэнкса (ПанЭко, Россия), после чего наслаивают на раствор фиколл-урографина (ρ=1,077 г/см³, ДиаМ, Россия) в пробирках объемом 15 мл. Пробирки центрифугируют при 400g в течение 40 минут при комнатной температуре. В процессе центрифугирования происходит стандартное разделение крови на фракции: эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, а кольцо мононуклеарных клеток располагается на границе градиента. Отобранную пипеткой фракцию МПК разводят раствором Хэнкса в два раза, проводят двукратную отмывку центрифугированием в течение 20 минут при 350 g и комнатной температуре, после чего ее избавляют от тромбоцитов. Для этого извлекают супернатант, а клетки ресуспендируют в растворе Хенкса, до конечного объема суспензии 14 мл и центрифугируют при 200 g и 4°С в течение 20 минут.Blood samples are diluted in a ratio of 1:1 with Hanks' solution (PanEco, Russia), after which they are layered on a solution of ficoll-urografin (ρ=1.077 g/cm ³ , DiaM, Russia) in 15 ml test tubes. The tubes are centrifuged at 400g for 40 minutes at room temperature. During centrifugation, the standard separation of blood into fractions occurs: erythrocytes and granulocytes settle to the bottom of the tube, and the ring of mononuclear cells is located at the gradient boundary. The IPC fraction selected with a pipette is diluted with Hanks solution twice, washed twice by centrifugation for 20 minutes at 350 g and room temperature, after which it is disposed of platelets. To do this, the supernatant is removed, and the cells are resuspended in Hank's solution to a final suspension volume of 14 ml and centrifuged at 200 g and 4°C for 20 minutes.

Супернатант удаляют пипеткой, а осадок клеток ресуспендируют в 1 мл раствором Хэнкса для дальнейшего подсчета общего количества выделенных МПК и оценки числа жизнеспособности клеток.The supernatant is removed with a pipette, and the cell pellet is resuspended in 1 ml of Hanks' solution for further calculation of the total number of isolated MICs and evaluation of cell viability.

Для определения количества живых МПК к 25 мкл суспензии клеток добавляют 25 мкл красителя трипанового синего (Sigma Aldrich, Англия). Подсчет жизнеспособности клеток проводят в камере Горяева, процент живых клеток при описанных условиях составляет не менее 96%.To determine the amount of live PBMCs, 25 µl of trypan blue dye (Sigma Aldrich, England) was added to 25 µl of cell suspension. Cell viability is calculated in a Goryaev chamber; the percentage of living cells under the described conditions is at least 96%.

Иммуномагнитная сепарация CD4⁺-клеток из МПК по технологии MACSImmunomagnetic separation of CD4 ⁺ cells from MPCs using MACS technology

Суспензию МПК осаждают центрифугированием 10 минут при 300 g. Осадок клеток ресуспендируют в буфере Auto Macs Rinse Solution, содержащем 0,5% BSA, из расчета 80 мкл на каждые 10⁷ клеток. В полученную суспензию добавляют парамагнитные микрочастицы, конъюгированные с мышиными моноклональными антителами против молекулы CD4 лимфоцитов человека (Miltenyi Biotec, Германия), исходя из расчета 20 мкл частиц на 10⁷ клеток. Полученную смесь инкубируют 15 минут при 4°С.The IPC suspension is precipitated by centrifugation for 10 minutes at 300 g. The cell pellet is resuspended in Auto Macs Rinse Solution buffer containing 0.5% BSA at a rate of 80 μl for every 10 ⁷ cells. Paramagnetic microparticles conjugated with mouse monoclonal antibodies against the CD4 molecule of human lymphocytes (Miltenyi Biotec, Germany) are added to the resulting suspension, based on the calculation of 20 μl of particles per 10 ⁷ cells. The resulting mixture is incubated for 15 minutes at 4°C.

После инкубации к смеси клеток и магнитных частиц добавляют буфер Auto Macs Rinse Solution, содержащий 0,5% BSA, из расчета 1-2 мл на 10⁷ клеток и проводят процедуру отмывки центрифугированием в течение 10 минут при 300g и 4°С.After incubation, the Auto Macs Rinse Solution buffer containing 0.5% BSA is added to the mixture of cells and magnetic particles at the rate of 1-2 ml per 10 ⁷ cells, and washing is carried out by centrifugation for 10 minutes at 300g and 4°C.

Супернатант удаляют и ресуспендируют клетки в том же буфере из расчета 500 мкл на 10⁸ клеток. В колонку, находящуюся в магнитном поле, вносят 500 мкл буфера для ее промывки, а затем весь объем полученной клеточной суспензии. Колонку промывают буфером, извлекают ее из магнитного поля сепаратора и резким нажатием поршня проводят элюцию CD4⁺-лимфоциты в стерильную пробирку. Все процедуры магнитной сепарации проводят на холоде. Описанную процедуру позитивной селекции осуществляют по протоколу изготовителя набора (Miltenyi Biotec, Германия).The supernatant is removed and the cells are resuspended in the same buffer at a rate of 500 μl per 10 ⁸ cells. 500 μl of buffer for washing it is added to the column in a magnetic field, and then the entire volume of the resulting cell suspension. The column is washed with buffer, removed from the magnetic field of the separator, and by sharply pressing the piston, CD4 ⁺ lymphocytes are eluted into a sterile tube. All magnetic separation procedures are carried out in the cold. The described positive selection procedure is carried out according to the protocol of the kit manufacturer (Miltenyi Biotec, Germany).

Часть клеток отбирают для подсчета в камере Горяева, а часть для оценки чистоты полученных CD4⁺- клеток. Для этого клетки окрашивают антителами и анализируют методом проточной цитофлуориметрии. Тактика гейтирования представлена на фиг. 1 Чистота составляла CD4+- клеток составляет в среднем 97% (n=5). На фигуре 2 представлены основные маркеры Treg и чистота выделенных CD4-лимфоцитов.Some of the cells are selected for counting in the Goryaev chamber, and some for assessing the purity of the resulting CD4 ⁺ - cells. For this, cells are stained with antibodies and analyzed by flow cytometry. The gating strategy is shown in Fig. 1 Purity of CD4+ cells averaged 97% (n=5). Figure 2 shows the main Treg markers and the purity of isolated CD4 lymphocytes.

2. Направленная дифференцировка и экспансия Treg (CD4⁺CD25^highCD127^-/low) ex vivo2. Targeted differentiation and expansion of Treg (CD4 ⁺ CD25 ^high CD127 ^-/low ) ex vivo

Полученные CD4⁺- клетки вносят в лунки 96-луночного планшета в концентрации 1 млн/мл в культуральную среду, содержащую среду TexMACS (Miltenyi Biotec), 1% смеси антибиотиков (стрептомицин, амфотерицйн, пенициллин, «BI», Израиль), 10% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка, BI, Израиль), 2 мМ L-глутамина и 10 мМ Hepes («ICN Ph.», США). Кроме того, в культуральную среду добавляют цитокины TGF-β (в подобранной концентрации 5 нг/мл, Miltenyi Biotec, Германия) и IL-2 (166 нг/мл, Miltenyi Biotec, Германия). Концентрации рассчитаны исходя из биологической активности каждого цитокина. Помимо этого, в культуру вносят активатор, включающий мышиные моноклональные антитела к рецептору CD2, CD3 и CD28 (Miltenyi Biotec, Германия) из расчета 25 мкл активирующих частиц на каждые 5 млн клеток. Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) (Ovidrell, Merck Serono, Италия) вносят в двух физиологических концентрациях 10 и 100 МЕ/мл, которые характеризуют начало и окончание первого триместра беременности.The resulting CD4 ⁺ - cells are introduced into the wells of a 96-well plate at a concentration of 1 million/ml in a culture medium containing TexMACS medium (Miltenyi Biotec), 1% of a mixture of antibiotics (streptomycin, amphotericin, penicillin, BI, Israel), 10% FBS (fetal calf serum, BI, Israel), 2 mM L-glutamine, and 10 mM Hepes (ICN Ph., USA). In addition, the cytokines TGF-β (adjusted concentration of 5 ng/ml, Miltenyi Biotec, Germany) and IL-2 (166 ng/ml, Miltenyi Biotec, Germany) are added to the culture medium. Concentrations are calculated based on the biological activity of each cytokine. In addition, an activator is added to the culture, including mouse monoclonal antibodies to the CD2, CD3 and CD28 receptor (Miltenyi Biotec, Germany) at the rate of 25 µl of activating particles for every 5 million cells. Human chorionic gonadotropin (hCG) (Ovidrell, Merck Serono, Italy) is applied at two physiological concentrations of 10 and 100 IU/ml, which characterize the beginning and end of the first trimester of pregnancy.

Клетки культивируют в плоскодонных 96-луночных планшетах в СО₂ -инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение трех суток.Cells are cultured in flat-bottomed 96-well plates in a CO ₂ incubator at 37°C in an atmosphere of 5% CO ₂ for three days.

Для идентификации Treg на проточном цитометре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США) клетки окрашивают антителами к CD3 (АРС / Су7), CD4 (FITC), CD25 (АРС) и CD 127 (РЕ / Су7) (BioLegend, США) по методике, предложенной производителем. Для оценки жизнеспособности клеток используют краситель 7-AAD (PC 5.5), входящий в панель идентификации Treg. В результате после трех суток культивирования жизнеспособность клеток варьирует от 89 до 98%.To identify Treg on a CytoFLEX S flow cytometer (Beckman Coulter, USA), cells are stained with antibodies to CD3 (APC / Cy7), CD4 (FITC), CD25 (APC) and CD 127 (PE / Cy7) (BioLegend, USA) according to the method suggested by the manufacturer. Cell viability was assessed using the 7-AAD dye (PC 5.5) included in the Treg identification panel. As a result, after three days of cultivation, cell viability varies from 89 to 98%.

Для оценки уровня FOXP3 производят внутриклеточное окрашивание с предварительной пермеабилизацией клеток.To assess the level of FOXP3, intracellular staining is performed with preliminary cell permeabilization.

В таблице представлены результаты цитофлуориметрического анализа CD4+-клеток до начала и после трех суток культивирования.The table shows the results of cytofluorimetric analysis of CD4+ cells before and after three days of cultivation.

После трех суток культивирования CD4⁺- лимфоцитов с ХГЧ, общее количество Treg увеличивается на 64±4,4%, при этом процент эффекторных Т-лимфоцитов уменьшается (табл. 1). Использование ХГЧ в качестве дополнительной стимуляции увеличивает общий выход Treg на 23±4,1%. Уровень регуляторных Т-лимфоцитов, экспрессирующих FOXP3, увеличивается в 2 раза (данные не представлены). Обе концентрации ХГЧ (10 и 100 МЕ/ мл) демонстрируют одинаковый эффект на дифференцировку Treg и экспрессию FOXP3, что позволяет использование ХГЧ в диапазоне выбранных концентраций.After three days of culturing CD4 ⁺ - lymphocytes with hCG, the total amount of Treg increases by 64±4.4%, while the percentage of effector T-lymphocytes decreases (Table 1). The use of hCG as an additional stimulation increases the total Treg output by 23±4.1%. The level of regulatory T-lymphocytes expressing FOXP3 increased by 2 times (data not shown). Both concentrations of hCG (10 and 100 IU/ml) show the same effect on Treg differentiation and FOXP3 expression, which allows the use of hCG in the range of selected concentrations.

Таким образом предложенный способ направленной дифференцировки CD4⁺-клеток в фенотип регуляторных Т-лимфоцитов позволяет получить существенное увеличение количества функционально активных жизнеспособных Treg за счет добавления в культуру ХГЧ. При этом получаемый эффект позволяет сократить время культивирования до трех суток, что в свою очередь не требует замены среды. Данное обстоятельство обеспечивает стабильность процесса культивирования, что существенным образом нивелирует негативное влияние процедурных операций.Thus, the proposed method for the directed differentiation of CD4 ⁺ cells into the phenotype of regulatory T-lymphocytes makes it possible to obtain a significant increase in the number of functionally active viable Tregs by adding hCG to the culture. At the same time, the obtained effect makes it possible to reduce the cultivation time to three days, which, in turn, does not require replacement of the medium. This circumstance ensures the stability of the cultivation process, which significantly eliminates the negative impact of procedural operations.

Применение разработанного способа может найти свою реализацию не только в научных исследованиях, но и в разработке подходов к лечению ряда аутоиммунных расстройств и снижении рисков возникновения реакции «хозяин против трансплантата».The application of the developed method can find its implementation not only in scientific research, but also in the development of approaches to the treatment of a number of autoimmune disorders and reduce the risk of host-versus-graft reactions.

Библиографический списокBibliographic list

1. Riley J.L., June С.Н., Blazar B.R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning // Immunity. 2009. Vol. 30. №5. P. 656-65. DOI: 10.1016/j.immuni.2009.04.006.1. Riley J.L., June S.N., Blazar B.R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning // Immunity. 2009 Vol. 30. No. 5. P. 656-65. DOI: 10.1016/j.immuni.2009.04.006.

2. Schmidt A., Éliás S., Joshi R.N., Tegner J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naive CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol // J Vis Exp. 2016. Vol. 118. DOI: 10.3791/55015.2. Schmidt A., Éliás S., Joshi R.N., Tegner J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naive CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol // J Vis Exp. 2016. Vol. 118. DOI: 10.3791/55015.

3. Earle K.E., Tang Q., Zhou X., Liu W., Zhti S., Bonyhadi M.L., Bluestone J.A. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation // Clin Immunol. 2005. Vol. 115. №1. P. 3-9. DOI: 10.1016/j. clim 2005.02.017.3. Earle K.E., Tang Q., Zhou X., Liu W., Zhti S., Bonyhadi M.L., Bluestone J.A. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation // Clin Immunol. 2005 Vol. 115. No. 1. P. 3-9. DOI: 10.1016/j. climate 2005.02.017.

4. Schmidt A., Eriksson M., Shang M.-M., Weyd H., Tegnér J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate// PLoS ONE. 2016. Vol. 11. №2.4. Schmidt A., Eriksson M., Shang M.-M., Weyd H., Tegnér J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid , Rapamycin and Butyrate // PLoS ONE. 2016. Vol. 11. No. 2.

5. Kanjana K., Paisooksantivatana K., Matangkasombut P., Chevaisrakul P., Lumjiaktase P. Efficient short-term expansion of human peripheral blood regulatory T cells for co-culture suppression assay // J Immunoassay Immunochem. 2019. Vol. 40. №6. P. 573-589. DOI: 10.1080/15321819.2019.1659813.5. Kanjana K., Paisooksantivatana K., Matangkasombut P., Chevaisrakul P., Lumjiaktase P. Efficient short-term expansion of human peripheral blood regulatory T cells for co-culture suppression assay // J Immunoassay Immunochem. 2019 Vol. 40. No. 6. P. 573-589. DOI: 10.1080/15321819.2019.1659813.

6. СПОСОБ ОБОГАЩЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ CD4+CD25+FOXP3+T-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ex vivo //Патент РФ №2010131841/10. 2008 / Быковская Светлана Нюневна, Караулов Александр Викторович, Лысюк Елена Юрьевна.6. METHOD OF ENRICHMENT OF REGULATORY CD4+CD25+FOXP3+T-HUMAN CELLS ex vivo // RF Patent No. 2010131841/10. 2008 / Bykovskaya Svetlana Nyunevna, Karaulov Alexander Viktorovich, Lysyuk Elena Yurievna.

7. Yang Х.О., Nurieva R., Martinez G.J., Kang H.S., Chung Y., Pappu B.P. et al. Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs // Immunity. 2008. Vol. 29. №1. P. 44-56.7. Yang H.O., Nurieva R., Martinez G.J., Kang H.S., Chung Y., Pappu B.P. et al. Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs // Immunity. 2008 Vol. 29. No. 1. P. 44-56.

8. Bodor J., Bopp T., Vaeth M., Klein M. et al. Cyclic AMP underpins suppression by regulatory T cells // Eur J Immunol. 2012. Vol. 42. №6. P. 1375-84.8. Bodor J., Bopp T., Vaeth M., Klein M. et al. Cyclic AMP underpins suppression by regulatory T cells // Eur J Immunol. 2012. Vol. 42. No. 6. P. 1375-84.

Claims

A method for obtaining autologous regulatory T-lymphocytes by ex vivo cultivation, including the isolation of CD4 ⁺ T-lymphocytes by magnetic separation and the cultivation of a cell suspension in a complete nutrient medium in the presence of cytokines IL-2, TGF-β and monoclonal antibodies to CD2, CD3, CD28 - human antigens in a CO ₂ incubator with a CO ₂ concentration of 5%, at a temperature of 37 ° C, characterized in that human chorionic gonadotropin is added to the cell culture medium at a concentration of 10-100 IU / ml, which ensures the differentiation and proliferation of functionally active regulatory T cells, as evidenced by the stable expression of FOXP3 cells.