RU2788198C1 - Method for isolation and analysis of exosomes - Google Patents
Method for isolation and analysis of exosomes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788198C1 RU2788198C1 RU2022102303A RU2022102303A RU2788198C1 RU 2788198 C1 RU2788198 C1 RU 2788198C1 RU 2022102303 A RU2022102303 A RU 2022102303A RU 2022102303 A RU2022102303 A RU 2022102303A RU 2788198 C1 RU2788198 C1 RU 2788198C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- exosomes
- particle
- exosome
- submicron particles
- particles
- Prior art date
Links
- 210000001808 Exosomes Anatomy 0.000 title claims abstract description 109
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 80
- 229920002395 Aptamer Polymers 0.000 claims abstract description 34
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 102100005827 CD63 Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 101700052224 CD63 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 claims abstract description 12
- 229910000460 iron oxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229920001888 polyacrylic acid Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 108060002563 EPCAM Proteins 0.000 claims description 7
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001575 pathological Effects 0.000 claims description 4
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 abstract description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 10
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 abstract description 6
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000000771 oncological Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 abstract description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 30
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 10
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N Iron(II,III) oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 5
- 102100016662 ERBB2 Human genes 0.000 description 5
- 101700025368 ERBB2 Proteins 0.000 description 5
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 3
- 101710004918 Smlt3054 Proteins 0.000 description 3
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 102000024070 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091007650 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 for example Inorganic materials 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N iron(2+);oxygen(2-) Chemical class [O-2].[Fe+2] VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 Breast Anatomy 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001175 Cerebrospinal Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 210000001723 Extracellular Space Anatomy 0.000 description 1
- 210000000777 Hematopoietic System Anatomy 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000002307 Prostate Anatomy 0.000 description 1
- 241000243335 Prostomatea Species 0.000 description 1
- 210000003705 Ribosomes Anatomy 0.000 description 1
- 210000003296 Saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000001179 Synovial Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 102000009332 Tetraspanins Human genes 0.000 description 1
- 108050000196 Tetraspanins Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 108010027090 biotin-streptavidin complex Proteins 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 239000002069 magnetite nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000004977 physiological function Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к методу для выделения внеклеточных везикул из биологических жидкостей животных и человека, а также идентификации молекул на их поверхности. Изобретение может быть использовано для различных диагностических целей, а также для оценки эффективности терапии.The invention relates to biology and medicine, in particular to a method for isolating extracellular vesicles from biological fluids of animals and humans, as well as identifying molecules on their surface. The invention can be used for various diagnostic purposes, as well as for evaluating the effectiveness of therapy.
Различные внеклеточные, окруженные мембраной везикулы, такие как экзосомы (диаметром 50-150 нм), простасомы (диаметром 50-500 нм) и микровезикулы (диаметром 100-1000 нм), выделяются в межклеточное пространство клетками различных тканей и органов в норме и при патологиях. Эти частицы можно обнаружить практически в любых биологических жидкостях, таких как культуральная среда для роста культур клеток, плазма крови, моча, синовиальная жидкость, спинномозговая жидкость, и др. Основной физиологической функцией экзосом считается перенос веществ и информации от клетки к клетке. Биохимический состав экзосом сохраняет черты сходства с клеткой-продуцентом, то есть эти везикулы содержат определенные специфические наборы молекул, включающие белки, липиды, метаболиты и нуклеиновые кислоты, характерные для материнских клеток. Неопластическая трансформация сопровождается активацией секреции экзосом, причем опухолевые экзосомы играют значимую роль в развитии заболевания. В настоящее время в многочисленных исследованиях продемонстрирована перспективность разработки методов диагностики различных заболеваний (в частности, онкологических) на основе анализа циркулирующих экзосом (Wan M, Ning B, Spiegel S, Lyon CJ, Hu TY. Tumor-derived exosomes (TDEs): How to avoid the sting in the tail. Med Res Rev. 2020 Jan; 40(1):385-412; Lee S, Mankhong S, Kang JH. Extracellular Vesicle as a Source of Alzheimer's Biomarkers: Opportunities and Challenges. Int J Mol Sci. 2019 Apr 8;20(7). pii: E1728), при этом многие методологические аспекты анализа экзосом с целью диагностики нуждаются в дальнейшей проработке. Various extracellular, membrane-surrounded vesicles such as exosomes (50-150 nm in diameter), prostomes (50-500 nm in diameter) and microvesicles (100-1000 nm in diameter) are released into the extracellular space by cells of various tissues and organs in normal and pathological conditions. . These particles can be found in almost any biological fluids, such as the culture medium for the growth of cell cultures, blood plasma, urine, synovial fluid, cerebrospinal fluid, etc. The main physiological function of exosomes is considered to be the transfer of substances and information from cell to cell. The biochemical composition of exosomes retains similarities with the producer cell, i.e., these vesicles contain certain specific sets of molecules, including proteins, lipids, metabolites, and nucleic acids characteristic of mother cells. Neoplastic transformation is accompanied by activation of exosome secretion, and tumor exosomes play a significant role in the development of the disease. At present, numerous studies have demonstrated the promise of developing methods for diagnosing various diseases (in particular, cancer) based on the analysis of circulating exosomes (Wan M, Ning B, Spiegel S, Lyon CJ, Hu TY. Tumor-derived exosomes (TDEs): How to avoid the sting in the tail Med Res Rev. 2020 Jan 40(1):385-412 Lee S, Mankhong S, Kang JH Extracellular Vesicle as a Source of Alzheimer's Biomarkers: Opportunities and Challenges Int J Mol Sci. 2019 Apr 8;20(7).pii:E1728), and many methodological aspects of exosome analysis for diagnostic purposes need further development.
Несмотря на известность ряда способов диагностики онкологических заболеваний на основе анализа содержимого экзосом, на сегодняшний день на рынке сохраняется потребность в новых, специфичных и эффективных способах их выделения или анализа.Despite the well-known methods for diagnosing oncological diseases based on the analysis of exosome content, there is still a need on the market for new, specific, and effective methods for their isolation or analysis.
Известны способы для очистки или выделения микровезикул и экзосом, включающие отбор биологической жидкости, взаимодействие жидкости с подложкой, имеющей поверхность с массивом экзосом-связывающих лигандов, обеспечивающих связывание экзосом или микровезикул с экзосом-связывающими лигандами и отделение подложки от жидкости с получением композиции или изолята экзосом или микровезикул. Причем каждый лиганд находится в форме, богатой электронами группы при рН 4-8, и массив экзосом-связывающих лигандов позволяет экзосомам или микровезикулам связываться с подложкой (см. RU 2748234, МПК G01N 1/18, опубл. 21.05.2021). Known methods for cleaning or isolating microvesicles and exosomes, including the selection of a biological fluid, the interaction of the liquid with a substrate having a surface with an array of exosome-binding ligands, ensuring the binding of exosomes or microvesicles with exosome-binding ligands, and separating the substrate from the liquid to obtain a composition or exosome isolate or microvesicles. Moreover, each ligand is in the form of an electron-rich group at pH 4-8, and the array of exosome-binding ligands allows exosomes or microvesicles to bind to the substrate (see RU 2748234, IPC G01N 1/18, publ. 05/21/2021).
Однако предложенный способ не лишен недостатков, среди которых стоит выделить: 1) сложность модификации подложки массивом экзосом-связывающих лигандов; 2) отсутствие специфически экзосом-связывающих лигандов; 3) необходимость пробподготовки для удаления клеточного дебриса, загрязнения и микровезикул из жидкости до взаимодействия жидкости с подложкой.However, the proposed method is not without drawbacks, among which it is worth highlighting: 1) the complexity of modifying the substrate with an array of exosome-binding ligands; 2) the absence of specific exosome-binding ligands; 3) the need for sample preparation to remove cell debris, contamination, and microvesicles from the liquid before the interaction of the liquid with the substrate.
Известен способ выделения экзосом из плазмы крови, в котором используют комплексы СПМЧ/АптCD63, содержащие супермагнитные частицы (СПМЧ) диаметром 1 мкм, покрытые стрептавидином и ДНК аптамеры АптCD63, модифицированные молекулой биотина, при этом комплексы формируют путем инкубации 1 мкг СПМЧ, покрытых стрептавидином, и 5 наномоль АптCD63, модифицированных молекулой биотина, при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего комплексы СПМЧ/АптCD63 отмывают от несвязавшихся молекул аптамера фосфатно-солевым буфером, добавляют к плазме крови объемом 10-100 мкл и инкубируют в течение 10-12 часов при температуре +4°C с целью образования комплекса СПМЧ/АптCD63/экзосома, который может быть использован для последующего анализа экзосомальных белков методом проточной цитометрии (см. RU2741638, МПК C12N5/00, опубл. 28.01.2021).A method is known for isolating exosomes from blood plasma, which uses SPMP/AptCD63 complexes containing supermagnetic particles (SPMP) with a diameter of 1 μm, coated with streptavidin and DNA aptamers of AptCD63 modified with a biotin molecule, while the complexes are formed by incubation of 1 μg of SPMP coated with streptavidin, and 5 nanomoles of AptCD63 modified with a biotin molecule at room temperature for 30 minutes, after which the SPMP/AptCD63 complexes are washed from unbound aptamer molecules with phosphate-buffered saline, added to blood plasma with a volume of 10-100 μl and incubated for 10-12 hours at a temperature of +4°C in order to form the SPMP/AptCD63/exosome complex, which can be used for subsequent analysis of exosomal proteins by flow cytometry (see RU2741638, IPC C12N5/00, publ. 01/28/2021).
Однако указанный способ обладает рядом недостатков, к которым можно отнести: 1) длительное время инкубации СПМЧ/АптCD63 с образцом для образования комплекса СПМЧ/АптCD63/экзосома; 2) необходимость инкубации СПМЧ/АптCD63 с образцом при температуре +4°C; 3) использование центрифугирования для отделения комплекса СПМЧ/АптCD63/экзосома от не связавшихся компонентов образца, что может приводить к необратимой адгезии (слипание) нескольких комплексов, что в свою очередь может искажать последующих качественный и количественный анализ; 4) использование достаточно крупных СПМЧ (диаметр 1 мкм), имеющих меньшую седиментационную устойчивость (устойчивость частиц против их оседания под действием силы тяжести), что может влиять на эффективность образования комплекса СПМЧ/АптCD63/экзосома.However, this method has a number of disadvantages, which include: 1) a long time of incubation of SPMP/AptCD63 with a sample for the formation of the SPMP/AptCD63/exosome complex; 2) the need for incubation of SPMP/AptCD63 with the sample at a temperature of +4°C; 3) the use of centrifugation to separate the SPAMP/AptCD63/exosome complex from unbound sample components, which can lead to irreversible adhesion (sticking together) of several complexes, which in turn can distort subsequent qualitative and quantitative analysis; 4) the use of rather large SPMPs (
Наиболее близким к заявляемому способу является способ изоляции специфических субпопуляций экзосом и их анализа (см. RU2733884, МПК G01N 33/50, опубл. 07.10.2020), включающий получение образца биологической жидкости, осуществление контакта указанного образца с модифицированной частицей таким образом, чтобы направляющие дарпины модифицированной частицы связались с, по меньшей мере, одним специфичным маркером, содержащимся во внеклеточной везикуле, образуя комплекс частица-везикула; отделение комплекса частица-везикула от несвязавшихся везикул и модифицированных частиц; детектирование отделенного комплекса частица-везикула. Модифицированная частица состоит из ядра диаметром от 100 нм до 1 мкм, состоящего из частиц диоксида кремния; частиц благородного металла, сорбированных на поверхности ядра, где благородным металлом является золото; направляющих дарпинов, иммобилизованных на частицах благородного металла, и имеющих сродство к по меньшей мере одному маркеру, присутствующему в составе внеклеточной везикулы, содержащейся в образце биологической жидкости. Closest to the claimed method is a method for isolating specific subpopulations of exosomes and analyzing them (see RU2733884, IPC G01N 33/50, publ. 07.10.2020), including obtaining a sample of a biological fluid, contacting the specified sample with a modified particle in such a way that DARPins of the modified particle are associated with at least one specific marker contained in the extracellular vesicle, forming a particle-vesicle complex; separating the particle-vesicle complex from unbound vesicles and modified particles; detection of the separated particle-vesicle complex. The modified particle consists of a core with a diameter of 100 nm to 1 μm, consisting of particles of silicon dioxide; noble metal particles sorbed on the surface of the core, where the noble metal is gold; targeting DARPins immobilized on noble metal particles and having an affinity for at least one marker present in the composition of an extracellular vesicle contained in a biological fluid sample.
Недостатком данного способа является использование направляющих молекул, иммобилизованных на наночастицах, специфичных к HER2 или EpCAM рецепторам. Данные рецепторы наблюдаются только у определённых групп экзосом, а значит, вероятность образования комплекса наночастица-экзосома уменьшается, по сравнению с системой, где в качестве лигандов для образования комплекса выступают направляющие молекулы, специфичные к рецептору CD63 (мембранный белок из класса тетраспанинов, который присутствует в мембране большинства экзосом). В патенте также отсутствуют данные о специфичности и чувствительности данного способа выделения экзосом.The disadvantage of this method is the use of targeting molecules immobilized on nanoparticles specific for HER2 or EpCAM receptors. These receptors are observed only in certain groups of exosomes, which means that the probability of formation of a nanoparticle-exosome complex is reduced compared to a system where ligands for complex formation are targeting molecules specific to the CD63 receptor (a membrane protein from the class of tetraspanins, which is present in membrane of most exosomes). The patent also lacks data on the specificity and sensitivity of this method for isolating exosomes.
Техническая проблема заключается в создании быстрого и доступного способа выделения субпопляций экзосом преимущественно из плазмы крови и обеспечении последующего анализа поверхностных экзосомальных белков флуоресцентными методами (методом проточной цитометрии, методом флуоресцентной спектроскопии и микроскопии). Изобретение направлено на создание нового подхода для выделения и анализа циркулирующих экзосом и экзосомальных компонентов с целью создания новых методов диагностики и мониторинга онкологических заболеваний.The technical problem is to create a fast and affordable method for isolating exosome subpopulations mainly from blood plasma and providing subsequent analysis of surface exosomal proteins using fluorescent methods (flow cytometry, fluorescence spectroscopy, and microscopy). The invention is aimed at creating a new approach for isolating and analyzing circulating exosomes and exosomal components in order to create new methods for diagnosing and monitoring oncological diseases.
Технический результат заключается в упрощении и сокращении сроков выделения экзосом, а также в повышении достоверности анализа. Техническим результатом также является повышение чувствительности и специфичности детекции экзосомных маркеров.The technical result consists in simplifying and reducing the time for isolating exosomes, as well as in increasing the reliability of the analysis. The technical result is also an increase in the sensitivity and specificity of the detection of exosomal markers.
Проблема решается тем, что в способе выделения внеклеточных экзосом, содержащих, по меньшей мере, один специфичный маркер, включающем получение образца биологической жидкости; получение модифицированных субмикронных частиц, имеющих сродство к, по меньшей мере, одному маркеру, и содержащих ядро из наночастиц в неорганической матрице из диоксида кремния, покрытое оболочкой, осуществление контакта указанного образца с модифицированными субмикронными частицами с образованием комплексов частица-экзосома; отделение комплексов частица-экзосома от несвязавшихся экзосом и модифицированных субмикронных частиц, согласно решению, субмикронная частица содержит в ядре наночастицы оксида железа, покрытых стрептавидином и полиэлектролитной оболочкой, образованной полиалиламиногирохлоридом и полиакриловой кислотой, а также направляющие аптамеры, иммобилизованные на поверхности субмикронных частиц, и имеющие сродство к по меньшей мере одному маркеру, присутствующему в составе внеклеточной экзосомы, при этом отделение комплекса частица-экзосома осуществляют градиентом магнитного поля, а размер ядра субмикронных частиц выбирают диаметром от 300 нм до 500 нм.The problem is solved by the fact that in the method of isolating extracellular exosomes containing at least one specific marker, including obtaining a sample of biological fluid; obtaining modified submicron particles having an affinity for at least one marker, and containing a core of nanoparticles in an inorganic matrix of silicon dioxide, covered with a shell, contacting said sample with modified submicron particles to form particle-exosome complexes; separation of particle-exosome complexes from unbound exosomes and modified submicron particles , according to the solution, the submicron particle contains in its core iron oxide nanoparticles coated with streptavidin and a polyelectrolyte shell formed by polyallylaminohydrochloride and polyacrylic acid, as well as targeting aptamers immobilized on the surface of submicron particles and having affinity for at least one marker present in the composition of the extracellular exosome, wherein the separation of the particle-exosome complex is carried out by a magnetic field gradient, and the core size of submicron particles is selected with a diameter of 300 nm to 500 nm.
Комплекс частица-экзосома дополнительно содержит дарпин, иммобилизованный на поверхности экзосом, обладающий сродством к другому специфичному маркеру, содержащемуся во внеклеточной экзосоме. The particle-exosome complex additionally contains darpin immobilized on the surface of exosomes, which has an affinity for another specific marker contained in the extracellular exosome.
Дополнительно осуществляют детектирование отделенного комплекса частица-экзосома методом флуоресценции для выделения фракции патологических экзосом. Additionally, the separated particle-exosome complex is detected by fluorescence to isolate the fraction of pathological exosomes.
В качестве аптомера используют направляющие молекулы, специфичные с мембранному белку CD63.As an aptomer, guide molecules specific to the CD63 membrane protein are used.
В качестве дарпина используют дарпин с флуоресцентной меткой, специфичный к мембранному белку EpCam.A fluorescently labeled DARPin specific to EpCam membrane protein is used as a DARPin.
Изобретение поясняется чертежами: The invention is illustrated by drawings:
на фиг. 1 приведена общая структурная организация субмикронной частицы и пример детекции ее взаимодействия с экзосомой; in fig. 1 shows the general structural organization of a submicron particle and an example of detection of its interaction with an exosome;
на фиг. 2. А – гистограммы, показывающие распределения гидродинамического размера внеклеточных экзосом и их концентрации после выделения из плазмы и клеточных культур, используя эксклюзионную хроматографию, В - изображения, полученные после сканирующей электронной микроскопии, образцов внеклеточных экзосом, высушенных на кремниевой подложке, С - результат вестерн-блоттинга выделенных внеклеточных везикул для проверки присутствия/отсутствия маркеров EpCAM и CD63;in fig. Fig. 2. A - histograms showing distributions of the hydrodynamic size of extracellular exosomes and their concentration after isolation from plasma and cell cultures using size exclusion chromatography, B - images obtained after scanning electron microscopy, samples of extracellular exosomes dried on a silicon substrate, C - Western result -blotting isolated extracellular vesicles to check for the presence/absence of EpCAM and CD63 markers;
на фиг. 3 - гистограммы флуоресцентного сигнала A - Cy5 и B - FITC;in fig. 3 - histograms of the fluorescent signal A - Cy5 and B - FITC;
на фиг. 4 - результаты испытания специфичности разработанных субмикронных частиц к экзосомам, выделенных из клеток MCF-7 и CHO, а также из плазмы крови здоровых пациентов, содержащих мембранные белки CD63 и EpCAM;in fig. 4 - the results of testing the specificity of the developed submicron particles to exosomes isolated from MCF-7 and CHO cells, as well as from the blood plasma of healthy patients containing membrane proteins CD63 and EpCAM;
на фиг. 5 - результаты исследования чувствительности разработанных субмикронных частиц к экзосомам, выделенных из клеток MCF-7 и CHO, а также из плазмы крови здоровых пациентов (пунктирная линия и серый прямоугольник соответствуют уровню шума и его отклонению. Исследования проводились методом проточной флуоресцентной цитометрии. MFI – среднее значение флуоресцентного сигнала). in fig. 5 - the results of a study of the sensitivity of the developed submicron particles to exosomes isolated from MCF-7 and CHO cells, as well as from the blood plasma of healthy patients (the dotted line and the gray rectangle correspond to the noise level and its deviation. The studies were carried out by flow fluorescence cytometry. MFI - average fluorescent signal value).
Позициями на чертежах обозначены:Positions in the drawings indicate:
1 – MB-Str (субмикронная частица из диоксида кремния, содержащая наночастицы оксида железа и покрытая стрептавидином); 1 – MB-Str (submicron silica particle containing iron oxide nanoparticles and coated with streptavidin);
2 – инкубация субмикронной частицы с аптамерами (например, биотинулированными олигонуклеотидами); 2 – incubation of a submicron particle with aptamers (for example, biotinulated oligonucleotides);
3 – MB-Str-Apt (субмикронная частица с направляющими молекулами (аптамеры), специфичными к мембранному белку CD63); 3 – MB-Str-Apt (submicron particle with guide molecules (aptamers) specific to the CD63 membrane protein);
4 – инкубация субмикронной частицы с экзосомами; 4 – incubation of a submicron particle with exosomes;
5 – MB-Str-Apt-Exo (комплекс субмикронная частица-экзосома); 5 – MB-Str-Apt-Exo (submicron particle-exosome complex);
6 – инкубация комплекса субмикронная частица-экзосома с дарпинами (DARPins) с флуоресцентной меткой, специфичных к мембранному рецептору экзосом EpCAM, для верификации специфичного взаимодействия экзосом с наночастицами методом флуоресценции; 6 – incubation of a submicron particle-exosome complex with DARPins with a fluorescent label, specific to the EpCAM exosome membrane receptor, to verify the specific interaction of exosomes with nanoparticles by fluorescence;
7 – MB-Str-Apt-Exo-DARPin (комплекс субмикронная частица-экзосома-дарпин);7 – MB-Str-Apt-Exo-DARPin (submicron particle-exosome-darpin complex);
8 – MB-Str-Apt-BSA-DARPin (MB-Str-Apt после последовательной инкубации с бычьим сывороточным альбумином (1 % по массе) и анти- EpCAM дарпином); 8 – MB-Str-Apt-BSA-DARPin (MB-Str-Apt after sequential incubation with bovine serum albumin (1% by mass) and anti-EpCAM darpin);
9 – MB-Str-Apt-BSA-MCF7-DARPin (MB-Str-Apt после последовательной инкубации с бычьим сывороточным альбумином (1% по массе), экзосомами из клеток MCF7 и анти-EpCAM дарпином).9 – MB-Str-Apt-BSA-MCF7-DARPin (MB-Str-Apt after sequential incubation with bovine serum albumin (1% by mass), exosomes from MCF7 cells, and anti-EpCAM darpin).
10 – MB-Str-Apt-DARPin (MB-Str-Apt после инкубации с анти-EpCAM дарпином);10, MB-Str-Apt-DARPin (MB-Str-Apt after incubation with anti-EpCAM DARPin);
11 – MB-Str-Apt-BSA-Plasma-DARPin (MB-Str-Apt после последовательной инкубации с бычьим сывороточным альбумином (1% по массе), экзосомами из плазмы крови здоровых пациентов и анти-EpCAM дарпином); 11 – MB-Str-Apt-BSA-Plasma-DARPin (MB-Str-Apt after sequential incubation with bovine serum albumin (1% by mass), exosomes from blood plasma of healthy patients, and anti-EpCAM darpin);
12 – MB-Str-Apt-BSA-CHO-DARPin (MB-Str-Apt после последовательной инкубации с бычьим сывороточным альбумином (1% по массе), экзосомами из клеток CHO и анти-EpCAM дарпином); 12 – MB-Str-Apt-BSA-CHO-DARPin (MB-Str-Apt after sequential incubation with bovine serum albumin (1% by mass), exosomes from CHO cells, and anti-EpCAM darpin);
Способ реализуется следующим образом. Получают образец биологической жидкости, в качестве которой может использоваться кровь, плазма крови, сыворотка крови, слюна или моча, включающая экзосому. Также экзосомы могут быть выделены из культуральной среды, используемой для роста клеток in vitro. В предпочтительных вариантах изобретения биологической жидкостью, из которой выделяются внеклеточные везикулы, является плазма или сыворотка крови.The method is implemented as follows. A sample of a biological fluid is obtained, which can be blood, blood plasma, blood serum, saliva or urine, including an exosome. Also, exosomes can be isolated from the culture medium used for cell growth in vitro . In preferred embodiments of the invention, the biological fluid from which the extracellular vesicles are isolated is blood plasma or serum.
Для реализации способа получают модифицированные частицы, имеющие сродство к по меньшей мере одному маркеру, присутствующему в составе экзосомы, содержащейся в образце биологической жидкости, в частности, к мембранному белку CD63).To implement the method, modified particles are obtained that have an affinity for at least one marker present in the composition of the exosome contained in the sample of biological fluid, in particular, for the membrane protein CD63).
Процесс получения модифицированной наночастицы заключается в следующем (фиг.1)The process of obtaining a modified nanoparticle is as follows (figure 1)
На субмикронную частицу 1, имеющую субмикронное ядро диаметром 300 нм - 500 нм, состоящее из наночастиц оксида железа, покрытое стрептавидином, наносят направляющие молекулы. Для этого инкубируют субмикронные частицы 1 с направляющими молекулами - биотинулированными олигонуклеотидами (аптамеры) 2, имеющими сродство к по меньшей мере одному маркеру, присутствующему в составе экзосом, содержащемся в образце биологической жидкости. Аптамеры содержат флуоресцентные метки.On the
Полученные субмикронные частицы с аптамерами 3 инкубируют 4 с экзосомами путем контакта образца биологической жидкости с модифицированными субмикронными частицами, таким образом, чтобы направляющие биотинулированные олигонуклеотиды (аптамеры) модифицированной субмикронной частицы 3 связались с по меньшей мере одним специфичным маркером, содержащимся во внеклеточной экзосоме, образуя комплекс субмикронная частица-экзосома 5.The resulting submicron particles with
Далее отделяют комплекс субмикронная частица-экзосома 5 от несвязавшихся экзосом и модифицированных субмикронных частиц. Наличие наночастиц магнетита в составе субмикронного ядра позволяет осуществлять их выделение посредством градиента магнитного поля (магнитной сепарации). Next, the submicron particle-
Отделенный комплекс субмикронная частица-экзосома 5 детектируют для выделения фракции патологических экзосом из общего популяции наноразмерных экзосом, циркулирующих в биологических жидкостях. The separated submicron particle-
В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что детекцию отделенного комплекса субмикронная частица-экзосома 5 осуществляют при помощи детекции флуоресценции.In some embodiments of the invention, this method is characterized in that the detection of the separated submicron particle-
Для анализа экзосом дополнительно осуществляют контакт (инкубацию) 6 отделенного комплекса субмикронная частица-экзосома с направляющим дарпином, обладающим сродством к другому специфичному маркеру, содержащемуся во внеклеточной экзосоме. В результате получают комплекс субмикронная частица-экзосома-дарпин 7. В качестве дарпинов (DARPins) используют дарпины с флуоресцентной меткой, специфичные к мембранному рецептору экзосом EpCam, Полученный комплекс 7 детектируют для верификации специфичного взаимодействия экзосом с наночастицами методом флуоресценции. For the analysis of exosomes, contact (incubation) of the 6 separated submicron particle-exosome complex is additionally carried out with a targeting DARPin having an affinity for another specific marker contained in the extracellular exosome. As a result, a submicron particle-exosome-
Сродством, или аффинностью, лиганда к белку-мишени (например, рецептору), называется сила связывания лиганда с белком-мишенью. Сила связывания лиганда с белком-мишенью определяется не только силой прямых взаимодействий лиганда с данным белком (например, рецептором), но и микроокружением белковой молекулы. В результате связывания направляющей молекулы частиц с маркером, присутствующем в составе внеклеточной везикулы, образуется комплекс частица-везикула. Маркером может служить как поверхностная молекула (например, мембранный рецептор), так и молекула, находящаяся внутри везикулы, и которая может экспонироваться при частичном лизисе везикулы. Маркером может быть белковая молекула, так и биомолекула небелковой природы, ассоциированная с каким-либо заболеванием, например, ганглиозид, ассоциированный с экзосомами.The affinity, or affinity, of a ligand for a target protein (eg, receptor) is the strength of the binding of the ligand to the target protein. The strength of ligand binding to the target protein is determined not only by the strength of direct interactions between the ligand and the given protein (eg, receptor), but also by the microenvironment of the protein molecule. As a result of the binding of the guide molecule of the particles with the marker present in the composition of the extracellular vesicle, a particle-vesicle complex is formed. The marker can be either a surface molecule (for example, a membrane receptor) or a molecule located inside the vesicle, which can be exposed during partial lysis of the vesicle. A marker can be a protein molecule or a non-protein biomolecule associated with a disease, for example, a ganglioside associated with exosomes.
Одной из задач настоящего изобретения является разработка диагностических подходов на основе анализа содержимого экзосом, существующих в биологических жидкостях субъекта, и выделяемых, например, клетками опухоли, при помощи биосенсора, состоящего из субмикронных частиц (содержащих наночастицы предпочтительно, из оксида железа, например, маггемита или магнетита, поверхностно модифицированных стрептавидином, к которому прикреплены распознающие молекулы. Распознающие молекулы специфически связывают рецепторы на поверхности экзосом. Примерами распознающих молекул являются биотинулированные олигонуклеотиды (аптамеры), антитела или их антиген-распознающие фрагменты, или дарпины (DARPin - designed ankyrin repeat proteins).One of the objectives of the present invention is the development of diagnostic approaches based on the analysis of the contents of exosomes that exist in the biological fluids of the subject and are isolated, for example, by tumor cells, using a biosensor consisting of submicron particles (containing nanoparticles, preferably, from iron oxide, for example, maghemite or magnetite surface modified with streptavidin, to which recognition molecules are attached.Recognition molecules specifically bind receptors on the surface of exosomes.Examples of recognition molecules are biotinylated oligonucleotides (aptamers), antibodies or their antigen-recognizing fragments, or DARPins (designed ankyrin repeat proteins).
В настоящее время, антитела или их антиген-распознающие фрагменты являются стандартным подходом для распознавания биомолекул в диагностических целях. Однако в предпочтительных вариантах данного изобретения для распознавания рецепторов на внеклеточных везикулах использовались биотинулированные олигонуклеотиды (аптамеры) и специфические дарпины, которые обладают рядом необходимых функциональных свойств, опережая фрагменты антител по таким показателям как стабильность, простота производства, специфичность и стоимость.Currently, antibodies or their antigen-recognizing fragments are the standard approach for the recognition of biomolecules for diagnostic purposes. However, in the preferred embodiments of the present invention, biotinylated oligonucleotides (aptamers) and specific DARPins were used to recognize receptors on extracellular vesicles, which have a number of necessary functional properties, outperforming antibody fragments in terms of stability, ease of production, specificity, and cost.
Дарпины представляют собой класс неиммуноглобулиновых белков, которые имеют небольшой размер и очень высокую стабильность за счет своей структуры (Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015;55: 489-511). Дарпины состоят из плотно упакованных повторов, состоящих обычно из 33 аминокислотных остатков. Каждый повтор образует структурную единицу, состоящую из β-поворота (β-turn), за которым следуют две антипараллельные α-спирали; при этом белок может состоять из 3-10 повторов, включая 2 повтора с обоих краев, обладающих гидрофильной поверхностью и придающих стабильность всему белку. Специфичность дарпинов к конкретному лиганду на поверхности частицы может быть селектирована при помощи мутагенеза и методов, известных специалистам, таких как рибосомный или фаговый дисплеи (Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489-511), при этом специфичность дарпинов может достигать больших значений, чем стандартная для антител. Например, были отселектированы дарпины, которые специфически связываются с рецептором 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2), сверхэкспрессируемым при раке молочной железы и раке яичников (Jost, C., et al., (2013) Structural Basis for Eliciting a Cytotoxic Effect in HER2-Overexpressing Cancer Cells Via Binding to the Extracellular Domain of HER2. Structure 21, 1979–1991). Также, была продемонстрирована возможность связывания дарпинов с 5 нм наночастицами золота без потери их функциональных свойств; при этом такие конъюгаты эффективно взаимодействовали с клетками, содержащими распознающие рецепторы (Deyev S, et al., Synthesis, Characterization, and Selective Delivery of DARPin-Gold Nanoparticle Conjugates to Cancer Cells. Bioconjug Chem. 2017 Oct 18;28(10):2569-2574). Также существует возможность генерировать специфические дарпины в мультиспецифическом формате, соединяя несколько распознающих дарпинов вместе в одной структуре. Благодаря своей структуре (внутренние гидрофобные повторы фланкированы гидрофильными повторами, вместе образуя структуру типа «соленоид»), дарпины показывают высокую термодинамическую стабильность против разворачивания, вызванного нагреванием или химическими агентами, и стабильны в водных растворах в течение продолжительного времени в высоких концентрациях (> 100 мг/мл). Это выгодно отличает их от фрагментов антител, которые имеют склонность к агрегации. Далее, дарпины могут экспрессироваться с очень высоким выходом в растворимой форме в цитоплазме E. coli, составляя до 30% общего клеточного белка (до 10-20 г на литр жидкой культуры в ферментере, см. http://www.molecularpartners.com). Таким образом, производство дарпинов является простой и отлаженной процедурой, известной специалистам.DARPins are a class of non-immunoglobulin proteins that are small in size and very stable due to their structure (Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015;55: 489-511). DARPins consist of densely packed repeats, usually consisting of 33 amino acid residues. Each repeat forms a structural unit consisting of a β-turn (β-turn) followed by two antiparallel α-helices; in this case, the protein can consist of 3-10 repeats, including 2 repeats from both edges, which have a hydrophilic surface and give stability to the entire protein. The specificity of DARPins for a particular ligand on the particle surface can be selected using mutagenesis and methods known to those skilled in the art, such as ribosomal or phage display (Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489-511), while the specificity of DARPins can reach higher values than the standard for antibodies. For example, DARPins have been selected that specifically bind to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), overexpressed in breast and ovarian cancer (Jost, C., et al., (2013) Structural Basis for Eliciting a Cytotoxic Effect in HER2 -Overexpressing Cancer Cells Via Binding to the Extracellular Domain of HER2 Structure 21, 1979-1991). Also, the possibility of binding DARPins to 5 nm gold nanoparticles without loss of their functional properties was demonstrated; at the same time, such conjugates effectively interacted with cells containing recognition receptors (Deyev S, et al., Synthesis, Characterization, and Selective Delivery of DARPin-Gold Nanoparticle Conjugates to Cancer Cells. Bioconjug Chem. 2017 Oct 18;28(10):2569 -2574). It is also possible to generate specific DARPins in a multispecific format by connecting several DARPins together in a single structure. Due to their structure (internal hydrophobic repeats are flanked by hydrophilic repeats, together forming a "solenoid" type structure), DARPins show high thermodynamic stability against unfolding caused by heat or chemical agents and are stable in aqueous solutions for extended periods at high concentrations (>100 mg /ml). This distinguishes them favorably from antibody fragments, which tend to aggregate. Further, DARPins can be expressed in very high yield in soluble form in the cytoplasm of E. coli, constituting up to 30% of the total cellular protein (up to 10-20 g per liter of liquid culture in a fermenter, see http://www.molecularpartners.com) . Thus, the production of DARPins is a simple and well-established procedure known to specialists.
Альтернативным решением также является применение аптамеров. Аптамеры представляют собой фрагменты ДНК или РНК с уникальными трехмерными структурами, которые с высокой селективностью и аффинностью связываются с низко- и высокомолекулярными мишенями. Поиск аптамеров, как правило, проводится с помощью технологии систематической эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX) [S. Ni et al., Int. J. Mol. Sci. 2017, 18(8), 1683; C. Platella et al., Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2017, 1861(5): 1429-1447; J. Zhou and J. Rossi, Nat Rev Drug Discov. 2017, 6(3): 181–202]. Аптамеры не только не уступают антителам, но и обладают рядом преимуществ - высокой стабильностью in vitro и in vivo, низкой иммуногенностью, малой молекулярной массой. Простота синтеза, возможность химической модификации и конъюгации расширяют возможности применения аптамеров - от создания распознающей части биосенсоров до систем адресной доставки и непосредственном использовании в качестве лекарственных средств. Особенно важным небольшой размер аптамеров становится при модификации различных наночастиц, так как обычно конъюгация приводит к присоединению нескольких аптамеров - от 1 до 20 на частицу. Это позволяет увеличить эффективность связывания с мишенью за счет увеличения авидности при меньшем влиянии на свойства частицы по сравнению с антителами.An alternative solution is also the use of aptamers. Aptamers are DNA or RNA fragments with unique three-dimensional structures that bind with high selectivity and affinity to low and high molecular weight targets. The search for aptamers is usually carried out using the technology of systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) [S. Ni et al., Int. J. Mol. sci. 2017, 18(8), 1683; C. Platella et al., Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2017, 1861(5): 1429-1447; J. Zhou and J. Rossi, Nat Rev Drug Discov. 2017, 6(3): 181–202]. Aptamers not only are not inferior to antibodies, but also have a number of advantages - high stability in vitro and in vivo , low immunogenicity, low molecular weight. The ease of synthesis, the possibility of chemical modification and conjugation expand the possibilities of using aptamers - from the creation of the recognizing part of biosensors to targeted delivery systems and direct use as drugs. The small size of aptamers becomes especially important when modifying various nanoparticles, since usually conjugation leads to the attachment of several aptamers, from 1 to 20 per particle. This makes it possible to increase the efficiency of binding to the target by increasing avidity with less influence on the properties of the particle compared to antibodies.
В настоящем изобретении в состав биосенсора входят субмикронные частицы следующей структуры. Основа (ядро) частиц – неорганическая матрица, например, диоксид кремния, содержащая наночастицы оксида железа, например, маггемит или магнетит. В предпочтительном варианте, в качестве основы могут использоваться частицы диоксида кремния диаметром от 300 нм до 500 нм, содержащие наночастицы оксида железа, покрытые стрептавидином.In the present invention, the composition of the biosensor includes submicron particles of the following structure. The basis (core) of the particles is an inorganic matrix, for example, silicon dioxide, containing iron oxide nanoparticles, for example, maghemite or magnetite. Preferably, silica particles with a diameter of 300 nm to 500 nm containing iron oxide nanoparticles coated with streptavidin can be used as a base.
Заключительный этап синтеза активных частиц для биосенсора – иммобилизация специфичных направляющих молекул (аптамеров). Иммобилизация происходить за счет нековалентного взаимодействия (комплекс биотин-стрептавидин). В предпочтительном варианте в качестве направляющих молекул используются биотинулированные аптамеры, имеющих сродство к по меньшей мере одному маркеру, присутствующему в составе внеклеточной везикулы. The final stage in the synthesis of active particles for a biosensor is the immobilization of specific targeting molecules (aptamers). Immobilization occurs due to non-covalent interaction (biotin-streptavidin complex). Preferably, biotinylated aptamers with affinity for at least one marker present in the extracellular vesicle are used as guide molecules.
Метод детекции экзосомных маркеров при помощи получаемых субмикронных частиц может быть реализован различными способами. После связывания, специфического направляющего аптамера с маркером на экзосоме, комплекс субмикронная частица-экзосома может быть отделен от несвязанных субмикронных частиц и экзосом при помощи градиента магнитного поля, путем приложения постоянного магнита к пробирке с образцом, в результате чего комплекс субмикронная частица-экзосома может удерживаться у стенки пробирки, в то время как несвязанные частицы и экзосомы могут быть удалены пипеткой. Комплекс субмикронная частица-экзосома может быть вновь суспендирован после того, как магнит будет удален от пробирки. Выделение несвязанных субмикронные частиц и экзосом градиентом магнитного поля также может происходить в микрофлюидном устройстве путем приложения постоянного магнита к микроканалу при прохождении в микроканале субмикронных частиц, экзосом и комплекса субмикронная частица-экзосома. Различные методы разделения экзосом известны специалистам (см., например, Nareg Ohannesian et al., Commercial and emerging technologies for cancer diagnosis and prognosis based on circulating tumor exosomes, 2020, J. Phys. Photonics 2 032002). Те же методы могут быть использованы для отделения комплексов субмикронная частица-везикула от несвязавшихся везикул и несвязавшихся модифицированных наночастиц.The method for detecting exosomal markers using the obtained submicron particles can be implemented in various ways. After binding a specific targeting aptamer to a marker on the exosome, the submicron particle-exosome complex can be separated from unbound submicron particles and exosomes using a magnetic field gradient by applying a permanent magnet to the sample tube, whereby the submicron particle-exosome complex can be retained. against the wall of the tube, while unbound particles and exosomes can be removed with a pipette. The submicron particle-exosome complex can be resuspended after the magnet is removed from the tube. Isolation of unbound submicron particles and exosomes by a magnetic field gradient can also occur in a microfluidic device by applying a permanent magnet to the microchannel while passing submicron particles, exosomes, and the submicron particle-exosome complex in the microchannel. Various methods for separating exosomes are known to those skilled in the art (see, for example, Nareg Ohannesian et al., Commercial and emerging technologies for cancer diagnosis and prognosis based on circulating tumor exosomes, 2020, J. Phys. Photonics 2 032002). The same methods can be used to separate submicron particle-vesicle complexes from unbound vesicles and unbound modified nanoparticles.
Дальнейшую детекцию связавшейся везикулы/экзосомы можно проводить при помощи специфичных антител, содержащих флюоресцентную метку (фиг. 1). Для повышения специфичности распознавания опухоль-ассоциированной экзосомы в процессе детекции могут быть применены несколько различных специфических дарпинов к разным опухоль-ассоциированным белкам, предположительно присутствующим в составе экзосомы. При получении положительного сигнала связывания с наночастицами, делается вывод о наличии опухоль-ассоциированных экзосом в тестируемой биологической жидкости.Further detection of the bound vesicle/exosomes can be carried out using specific antibodies containing a fluorescent label (Fig. 1). To increase the specificity of tumor-associated exosome recognition during detection, several different specific DARPins can be applied to different tumor-associated proteins presumably present in the exosome. Upon receipt of a positive signal of binding to nanoparticles, a conclusion is made about the presence of tumor-associated exosomes in the tested biological fluid.
Существенным параметром используемых в изобретении частиц является их размер - от 300 нм до 500 нм. Более крупные частицы обладают малой подвижностью, склонностью к спонтанной седиментации, что существенно уменьшает эффективность связывания с экзосомами. Более мелкие частицы могут иметь пониженную коллоидную стабильность (склонность образовывать агломераты); также, связывание более мелких частиц с экзосомой приведёт к затруднению или невозможности их отделения от других экзосом (размер комплекса наночастица-экзосома не будет существенно отличаться от размера внеклеточных, везикул, присутствующих в растворе).An essential parameter used in the invention of the particles is their size - from 300 nm to 500 nm. Larger particles have low mobility and a tendency to spontaneous sedimentation, which significantly reduces the efficiency of binding to exosomes. Smaller particles may have reduced colloidal stability (tendency to form agglomerates); also, the binding of smaller particles to the exosome will make it difficult or impossible to separate them from other exosomes (the size of the nanoparticle-exosome complex will not differ significantly from the size of extracellular vesicles present in the solution).
Описанная выше предпочтительная структура частиц для биосенсора (основа (Fe3O4)-Streptavidin-BiotinOligo) обладает рядом преимуществ по сравнению с аналогами. Основными преимуществами являются: 1) хорошая коллоидная стабильность частиц за счет свойств комплекса стрептавидин-биотин и аптамера; 2) возможность эффективного связывания с экзосомами за счет авидности аптамера; 3) возможность эффективного разделения комплексов частиц с экзосомами с помощью градиента магнитного поля; 4) возможность использования комбинации градиента магнитного поля и микрофлюидного устройства; 5) возможность использования дарпинов, имеющих сродство к нескольким маркерам, присутствующих в составе внеклеточной везикулы.The preferred particle structure for the biosensor described above ((Fe3O4)-Streptavidin-BiotinOligo base) has a number of advantages over analogues. The main advantages are: 1) good colloidal stability of the particles due to the properties of the streptavidin-biotin complex and the aptamer; 2) the possibility of effective binding to exosomes due to the avidity of the aptamer; 3) the possibility of efficient separation of particle complexes with exosomes using a magnetic field gradient; 4) the possibility of using a combination of a magnetic field gradient and a microfluidic device; 5) the possibility of using DARPins with affinity for several markers present in the composition of the extracellular vesicle.
Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.The following examples of the implementation of the method are given in order to disclose the characteristics of the present invention and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention.
Пример конкретного выполненияExample of a specific implementation
Методика получения частиц. Иммобилизация направляющих молекул на модифицированные стрептавидином магнитные частицыMethod for obtaining particles. Immobilization of guide molecules on streptavidin-modified magnetic particles
Для демонстрации осуществления изобретения в качестве направляющей молекулы был выбран аптамер, специфичный к рецептору CD63 (молекулярная масса 11002), имеющий следующую нуклеотидную последовательность: (Biotin Pro)ca-ccc-cac-ctc-gct-ccc-gtg-aca-cta-atg-cta-(Cy5). CD63 рецептор присутствует на поверхности большего количества экзосом в независимости от источника выделения. To demonstrate the implementation of the invention, an aptamer specific to the CD63 receptor (molecular weight 11002) having the following nucleotide sequence was chosen as a guide molecule: (Biotin Pro)ca-ccc-cac-ctc-gct-ccc-gtg-aca-cta-atg -cta-(Cy5). The CD63 receptor is present on the surface of more exosomes, regardless of the source of release.
В других вариантах изобретения могут быть использованы другие аптамеры, антитела или их антиген-распознающие фрагменты, специфичные к различным структурам, присутствующих в экзосомах.In other embodiments of the invention, other aptamers, antibodies or their antigen-recognizing fragments specific to various structures present in exosomes can be used.
0,05 мл стрептавидин-модифицированных частиц оксида железа (1 мг/мл, 300-500 нм диаметром) были растворены в 0,95 мл ультрачистой воды (MilliQ system, удельное сопротивление 18 МОм см). Затем 0,02 мл биотин-модифицированных аптамеров (100 пкмоль/мкл), специфичных к рецептору CD63, с нуклеотидной последовательность (Biotin Pro)ca-ccc-cac-ctc-gct-ccc-gtg-aca-cta-atg-cta-(Cy5) были добавлены к стрептавидин-модифицированных субмикронных частиц, содержащих наночастицы оксида железа. Далее раствор оставляли при постоянном перемешивании на 12 часов при 4°С. Далее следовала промывка в фосфатном буфере pH 7.4 (не менее 3 раз) частиц от непрореагировавших аптамеров путем осаждения частиц градиентом магнитного поля, используя постоянный магнит (величина остаточной намагниченности не менее 500 мТл). После промывки объем модифицированных частиц оксида железа был доведен до 1 мл фосфатным буфером pH 7.4. 0.05 ml of streptavidin-modified iron oxide particles (1 mg/ml, 300-500 nm diameter) were dissolved in 0.95 ml of ultrapure water (MilliQ system, resistivity 18 MΩ cm). Then 0.02 ml of biotin-modified aptamers (100 pmol/µl) specific for the CD63 receptor with the nucleotide sequence (Biotin Pro)ca-ccc-cac-ctc-gct-ccc-gtg-aca-cta-atg-cta- (Cy5) were added to streptavidin-modified submicron particles containing iron oxide nanoparticles. Next, the solution was left under constant stirring for 12 hours at 4°C. This was followed by washing in phosphate buffer pH 7.4 (at least 3 times) of particles from unreacted aptamers by deposition of particles with a magnetic field gradient using a permanent magnet (the value of residual magnetization was at least 500 mT). After washing, the volume of modified iron oxide particles was adjusted to 1 ml with phosphate buffer pH 7.4.
Флуоресцентный анализ Fluorescence analysis
В качестве распознающей молекулы был выбран дарпин (HE)3-EC1, специфичный к рецептору EpCam (Патент на изобретение RU2733884, заявка № 2020102930, Приоритет от 24.01.2020), имеющий следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1: SHEHEHEGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILVANGADVNAYFGTTPLHLAAAHGRLEIVEVLLKNGADVNAQDVWGITPLHLAAYNGHLEIVEVLLKYGADVNAHDTRGWTPLHLAAINGHLEIVEVLLKNVADVNAQDRSGKTPFDLAIDNGNEDIAEVLQKAAKLNВ качестве распознающей молекулы был выбран дарпин (HE)3-EC1, специфичный к рецептору EpCam (Патент на изобретение RU2733884, заявка № 2020102930, Приоритет от 24.01.2020), имеющий следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1: SHEHEHEGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILVANGADVNAYFGTTPLHLAAAHGRLEIVEVLLKNGADVNAQDVWGITPLHLAAYNGHLEIVEVLLKYGADVNAHDTRGWTPLHLAAINGHLEIVEVLLKNVADVNAQDRSGKTPFDLAIDNGNEDIAEVLQKAAKLN
В других вариантах изобретения могут быть использованы другие дарпины, антитела или их антиген-распознающие фрагменты, специфичные к различным структурам, присутствующих в экзомосах. In other embodiments of the invention, other DARPins, antibodies or their antigen-recognizing fragments specific to various structures present in exomoses can be used.
Для верификации взаимодействия экзосом с направляющими молекулами на поверхности модифицированных стрептавидином частиц, содержащих наночастицы оксида железа, использовали метод проточной флуоресцентной цитометрии. Субмикронные частицы, содержащие наночастицы оксида железа, модифицированные стрептавидином и флуоресцентно-меченными аптамером, специфичным к CD63 рецептору на поверхности экзосом, инкубировали в 1% водном растворе бычьего сывороточного альбумина 20 мин. После инкубации частицы промывали в фосфатном буфере путем осаждения частиц в градиенте магнитного поля. Осадок ресуспендировали в 0,9 мл фосфатного буфера. Затем частицы инкубировали с экзосомами, выделенных из клеточных линий (инвазивной аденокарциномы протоков молочной железы человека - MCF7; яичника хомяка – CHO), а также с экзосомами, выделенных из плазмы крови здоровых доноров при комнатной температуре в течение 20 мин с последующей промывкой в фосфатном буфере с помощью осаждения частиц градиентом магнитного поля. Осадок ресуспендировали в 0,98 мл фосфатного буфера. Далее добавляли 0,02 мл раствора, флуоресцентно-меченного (FITC) дарпина (HE)3-EC1, специфичного к рецептору EpCam (1,3 мг/мл в фосфатном буфере, pH 7.4) и инкубировали в течение 20 мин с последующей промывкой в фосфатном буфере (не менее пяти раз). Осадок ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера. Таким образом, после проведения двух этапов на выходе получали комплекс: субмикронная магнитная частица – экзосома – дарпин. После чего данный комплекс был охарактеризован методом флуоресцентной проточной цитометрии с использованием системы проточной цитометрии CytoFLEX (Beckmann Coulter).Fluorescent flow cytometry was used to verify the interaction of exosomes with guide molecules on the surface of streptavidin-modified particles containing iron oxide nanoparticles. Submicron particles containing iron oxide nanoparticles modified with streptavidin and fluorescently labeled with an aptamer specific for the CD63 receptor on the surface of exosomes were incubated in 1% aqueous solution of bovine serum albumin for 20 min. After incubation, the particles were washed in phosphate buffer by sedimentation of the particles in a magnetic field gradient. The pellet was resuspended in 0.9 ml of phosphate buffer. Then the particles were incubated with exosomes isolated from cell lines (invasive ductal adenocarcinoma of the human breast - MCF7; hamster ovary - CHO), as well as with exosomes isolated from the blood plasma of healthy donors at room temperature for 20 min, followed by washing in phosphate buffer using the deposition of particles by a magnetic field gradient. The pellet was resuspended in 0.98 ml of phosphate buffer. Next, 0.02 ml of a solution of fluorescently labeled (FITC) darpin (HE)3-EC1 specific for the EpCam receptor (1.3 mg/ml in phosphate buffer, pH 7.4) was added and incubated for 20 min, followed by washing in phosphate buffer (at least five times). The pellet was resuspended in 1 ml of phosphate buffer. Thus, after carrying out two stages, a complex was obtained at the output: submicron magnetic particle – exosome – darpin. After that, this complex was characterized by fluorescent flow cytometry using the CytoFLEX flow cytometry system (Beckmann Coulter).
Результаты испытания разработанных субмикронных частицTest results of the developed submicron particles
Результаты испытания специфичности метода с помощью разработанных частиц с анти-CD63 аптамером с Cy5 меткой и анти-EpCам дарпинами с FITC меткой к экзосомам, выделенных из клеток MCF-7 и CHO, а также из плазмы здоровых пациентов, содержащих мембранные белки CD63 и EpCAM, представлены на фиг. 3 и фиг. 4. Взаимодействие анти-CD63 аптамера с Cy5 меткой с частицами MB-Str 1 подтверждается гистограммой флуоресцентного для частиц MB-Str-Apt 3 на фиг. 3А. Образование комплекса частица-экзосома-дарпин следует из данных на фиг. 3В, где показаны гистограммы флуоресцентного сигнала частиц MB-Str 1, MB-Str-Apt 3, Str-Apt-BSA-DARPin 8, MB-Str-Apt-BSA-MCF7-DARPin 9. На фиг. 4 приведены результаты тестирования специфичности разработанной системы, из которых следует, что экзосомы из клеток MCF-7 (MB-Str-Apt-BSA-MCF7-DARPin 9) и из плазмы здоровых пациентов (MB-Str-Apt-BSA-Plasma-DARPin 11) имеют большее количество мембранного белка EpCam при использовании анти-EpCam дарпинов, по сравнению с экзосомами из клеток CHO (MB-Str-Apt-BSA-CHO-DARPin 12). Для сравнения на фиг. 4 приведены, величины флуоресцентного сигнала частиц (MB-Str 1, MB-Str-Apt-DARPin 10, Str-Apt-BSA-DARPin 8), использовавшихся в качестве контрольных образцов.The results of testing the specificity of the method using the developed particles with Cy5-tagged anti-CD63 aptamer and FITC-tagged anti-EpCam DARPins to exosomes isolated from MCF-7 and CHO cells, as well as from the plasma of healthy patients containing membrane proteins CD63 and EpCAM, shown in Fig. 3 and FIG. 4. Interaction of the Cy5 tagged anti-CD63 aptamer with MB-
На фиг. 5 представлены результаты испытания чувствительности метода к экзосомам, полученным от клеточных линий MCF-7 и CHO, и из плазмы крови здоровых пациентов. Экзосомы из клеток MCF-7 и из плазмы крови здоровых пациентов, показали повышенную экспрессию белка EpCam, что подтверждают результаты вестерн-блота (фиг. 2). На фиг. 5 приведены средние значение флуоресцентного сигнала, нормированного на максимальное значение анти-EpCam дарпина с FITC меткой в результате образования комплекса при различной концентрации экзосом в образцах (108 экзосом в миллилитре - верхний предел, 102 экзосом в миллилитре – нижний предел). По результатам проведенных экспериментов удалось определить предел детекции комплекса, который составляет 105 экзосом в миллилитре. In FIG. Figure 5 presents the results of testing the sensitivity of the method to exosomes obtained from the MCF-7 and CHO cell lines and from the blood plasma of healthy patients. Exosomes from MCF-7 cells and from the plasma of healthy patients showed increased expression of the EpCam protein, which was confirmed by the results of Western blot (Fig. 2). In FIG. Figure 5 shows the average value of the fluorescent signal normalized to the maximum value of anti-EpCam DARPin with FITC tag as a result of complex formation at different concentrations of exosomes in the samples (10 8 exosomes per milliliter is the upper limit, 10 2 exosomes per milliliter is the lower limit). Based on the results of the experiments, it was possible to determine the detection limit of the complex, which is 10 5 exosomes per milliliter.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.While the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific instances described in detail are for the purpose of illustrating the present invention only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way. It should be clear that various modifications are possible without departing from the essence of the present invention.
Описываемый способ выделения внеклеточных везикул может быть использован в процессе диагностики, прогнозирования развития или определения риска развития заболевания у субъекта. В некоторых вариантах изобретения медицинские показания для применения указанного способа выбирают из заболеваний кровеносной системы или онкологических заболеваний, например, злокачественных заболеваний кроветворной системы, предстательной железы, рака яичника или других органов и тканей.The described method for isolating extracellular vesicles can be used in the process of diagnosing, predicting the development or determining the risk of developing a disease in a subject. In some embodiments of the invention, the medical indication for the application of this method is selected from diseases of the circulatory system or oncological diseases, for example, malignant diseases of the hematopoietic system, prostate, ovarian cancer or other organs and tissues.
Способ обеспечивает возможность выделения специфичных экзосом для ранней диагностики онкологических заболеваний и оценки эффективности лечения (за счет наличия на поверхности субмикронных частиц молекул, обеспечивающих взаимодействие с характерными белками, находящимися на поверхности экзосом).The method provides the possibility of isolating specific exosomes for early diagnosis of oncological diseases and evaluation of the effectiveness of treatment (due to the presence on the surface of submicron particles of molecules that provide interaction with characteristic proteins located on the surface of exosomes).
Claims (2)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2788198C1 true RU2788198C1 (en) | 2023-01-17 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2806434C1 (en) * | 2022-08-10 | 2023-10-31 | Анастасия Валерьевна Малек | Method for removing extracellular nanovesicles from blood plasma using covalently immobilized dna aptamers |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2733884C1 (en) * | 2020-01-24 | 2020-10-07 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий | Nano- and microparticles for isolating specific subpopulations of exosomes and analysis thereof |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2733884C1 (en) * | 2020-01-24 | 2020-10-07 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий | Nano- and microparticles for isolating specific subpopulations of exosomes and analysis thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BEATRIZ MARTIN-GRACIA et al., Nanoparticle-based biosensors for detection of extracellular vesicles in liquid biopsies, J. Mater. Chem. B, 2020, 8, pp. 6710-6738, DOI:10.1039/D0TB00861C. LIJUN YANG et al., Blood TfR+ exosomes separated by a pH-responsive method deliver chemotherapeutics for tumor therapy, Theranostics., 2019, 9(25), pp. 7680-7696, doi: 10.7150/thno.37220. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2806434C1 (en) * | 2022-08-10 | 2023-10-31 | Анастасия Валерьевна Малек | Method for removing extracellular nanovesicles from blood plasma using covalently immobilized dna aptamers |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lim et al. | Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires | |
| Song et al. | Fluorescent-magnetic-biotargeting multifunctional nanobioprobes for detecting and isolating multiple types of tumor cells | |
| Shen et al. | Current detection technologies for circulating tumor cells | |
| He et al. | Molecular-recognition-based DNA nanodevices for enhancing the direct visualization and quantification of single vesicles of tumor exosomes in plasma microsamples | |
| Otieno et al. | On-line protein capture on magnetic beads for ultrasensitive microfluidic immunoassays of cancer biomarkers | |
| US20210364522A1 (en) | Methods for capturing, isolation, and targeting of circulating tumor cells and diagnostic and therapeutic applications thereof | |
| JP6215902B2 (en) | Assays using surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) active particles | |
| Yang et al. | Multifunctional detection of extracellular vesicles with surface plasmon resonance microscopy | |
| Nie et al. | Folic acid targeting for efficient isolation and detection of ovarian cancer CTCs from human whole blood based on two-step binding strategy | |
| EP3839507A1 (en) | Devices and methods for sample analysis | |
| Xu et al. | Recent progress of exosome isolation and peptide recognition-guided strategies for exosome research | |
| US20180059114A1 (en) | Magnetic nanostructure for detecting and isolating circulating tumor cells comprising antibody- and magnetic nanoparticle-conjugated conductive polymer | |
| Zhang et al. | Characterization and applications of extracellular vesicle proteome with post-translational modifications | |
| Vandghanooni et al. | Recent advances in aptamer-based nanosystems and microfluidics devices for the detection of ovarian cancer biomarkers | |
| Hwang et al. | Aptamer-conjugated live human immune cell based biosensors for the accurate detection of C-reactive protein | |
| Vinaiphat et al. | Advances in extracellular vesicles analysis | |
| Zhang et al. | Real-Time Monitoring of Exosomes Secretion from Single Cell Using Dual-Nanopore Biosensors | |
| Ye et al. | Fluidic membrane accelerating the kinetics of photoactivatable hybridization chain reaction for accurate imaging of tumor-derived exosomes | |
| JP2012194013A (en) | Immunohistochemical staining method and reaction reagent | |
| WO2024001798A1 (en) | Nucleic acid aptamer-based extracellular vesicle fluorescence polarization detection method and application thereof | |
| RU2788198C1 (en) | Method for isolation and analysis of exosomes | |
| Chen et al. | Colorimetric biosensing assays based on gold nanoparticles functionalized/combined with non-antibody recognition elements | |
| KR20140008608A (en) | Particle complex and method for separating target cell | |
| JP2017079635A (en) | Carrier for capturing tumor cell | |
| Liu et al. | Profiling of single-vesicle surface proteins via droplet digital immuno-PCR for multi-subpopulation extracellular vesicles counting towards cancer diagnostics |