RU2782271C2 - Differentiation of human embryonic stem cells - Google Patents
Differentiation of human embryonic stem cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782271C2 RU2782271C2 RU2018120334A RU2018120334A RU2782271C2 RU 2782271 C2 RU2782271 C2 RU 2782271C2 RU 2018120334 A RU2018120334 A RU 2018120334A RU 2018120334 A RU2018120334 A RU 2018120334A RU 2782271 C2 RU2782271 C2 RU 2782271C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- population
- markers characteristic
- expressing markers
- endoderm lineage
- Prior art date
Links
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title abstract description 38
- 210000001671 Embryonic Stem Cells Anatomy 0.000 title description 35
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 354
- 210000001900 Endoderm Anatomy 0.000 claims abstract description 121
- 101700077314 PDX1 Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102100015783 NKX6-2 Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 101710012719 NKX6-2 Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102100017571 PDX1 Human genes 0.000 claims abstract description 69
- 101710014878 PDHX Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 32
- SHGAZHPCJJPHSC-NWVFGJFESA-N Tretinoin Chemical compound OC(=O)/C=C(\C)/C=C/C=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-NWVFGJFESA-N 0.000 claims abstract description 23
- 229960001727 Tretinoin Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims abstract description 23
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- -1 HNF3 beta Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000018233 Fibroblast growth factor family Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108050007372 Fibroblast growth factor family Proteins 0.000 claims abstract description 15
- WDHRPWOAMDJICD-BWBMXWGBSA-N N-[2-[(3'R,7'aR)-3',6',10,11b-tetramethyl-3-oxospiro[1,2,4,6,6a,6b,7,8,11,11a-decahydrobenzo[a]fluorene-9,2'-3,3a,5,6,7,7a-hexahydrofuro[3,2-b]pyridine]-4'-yl]ethyl]-6-(3-phenylpropanoylamino)hexanamide Chemical compound C([C@@H]1C2[C@H](C3(C(=C4CC5C6(C)CCC(=O)CC6=CCC5C4CC3)C)O1)C)C(C)CN2CCNC(=O)CCCCCNC(=O)CCC1=CC=CC=C1 WDHRPWOAMDJICD-BWBMXWGBSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 102100002212 CXCR4 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 101710003734 CXCR4 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 101700002184 GATA4 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102100012697 GATA4 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 101700057304 SOX17 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102100016532 CD99 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101700009240 CER1 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102100016596 CER1 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 101710010695 ONECUT1 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102100019962 ONECUT1 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 101700070147 OTX2 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102100006821 OTX2 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 102100005389 SOX17 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 101710030334 ATHB-9 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100013076 CD48 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101700012453 CD48 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100015286 DKK4 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101700042484 DKK4 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 101700000156 FGF17 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100015617 FGF17 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 102100007406 FGF4 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101700036125 FGF4 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100015613 FGF8 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101700012405 FGF8 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 101700008134 GATA6 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100012696 GATA6 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101710025792 GL1-5 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100016995 HNF1A Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101700018864 HNF1A Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100016992 HNF4A Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101700059151 HNF4A Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100017977 MNX1 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101700072663 MNX1 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 101700078220 PROX1 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100010938 PROX1 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101700030874 SOX9 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100015788 SOX9 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 41
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 34
- 102000008872 noggin protein Human genes 0.000 claims description 27
- 108091005284 noggin protein Proteins 0.000 claims description 27
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 25
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 22
- BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N Phorbol 12,13-dibutyrate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(=O)CCC)C1(C)C BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N 0.000 claims description 21
- 102100007405 FGF7 Human genes 0.000 claims description 12
- 101700033323 FGF7 Proteins 0.000 claims description 12
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 10
- 102100000261 FGF10 Human genes 0.000 claims description 8
- 101700052889 FGF10 Proteins 0.000 claims description 8
- PHEDXBVPIONUQT-LQLWEASQSA-N 63597-44-4 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-LQLWEASQSA-N 0.000 claims description 7
- 108009000295 TGF-beta Receptor Signaling Proteins 0.000 claims description 7
- LUZOFMGZMUZSSK-LRDDRELGSA-N Indolactum Chemical compound C1[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C2=CC=CC3=C2C1=CN3 LUZOFMGZMUZSSK-LRDDRELGSA-N 0.000 claims description 4
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 claims 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 37
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 2
- 102100009844 EOMES Human genes 0.000 abstract 1
- 101700075959 EOMES Proteins 0.000 abstract 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 78
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 239000002609 media Substances 0.000 description 26
- 210000003890 endocrine cells Anatomy 0.000 description 21
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 13
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 13
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 13
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 12
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 11
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 11
- 210000001915 nurse cell Anatomy 0.000 description 11
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 230000000268 renotropic Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 229960004666 Glucagon Drugs 0.000 description 8
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 8
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N Glucagonum Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 8
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 8
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 8
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 8
- 210000001654 Germ Layers Anatomy 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 6
- 101700069518 ISL1 Proteins 0.000 description 6
- 102100001409 ISL1 Human genes 0.000 description 6
- 101710022625 NEUROG3 Proteins 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 6
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 5
- 102100016957 NEUROD1 Human genes 0.000 description 5
- 101710006166 NEUROD1 Proteins 0.000 description 5
- 102100018315 NEUROG3 Human genes 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 5
- 210000002660 Insulin-Secreting Cells Anatomy 0.000 description 4
- 241000142710 Isla Vista hantavirus Species 0.000 description 4
- 210000004153 Islets of Langerhans Anatomy 0.000 description 4
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 4
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 4
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 4
- 229960000553 Somatostatin Drugs 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 4
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 4
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 210000002459 Blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N Cyclopamine Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC2=C3C)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@@]13O[C@@H]2C[C@H](C)CN[C@H]2[C@H]1C QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N 0.000 description 3
- 210000003958 Hematopoietic Stem Cells Anatomy 0.000 description 3
- 102100008240 INHBE Human genes 0.000 description 3
- 102100016985 KIT Human genes 0.000 description 3
- 101710009391 KIT Proteins 0.000 description 3
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 101700034724 PAX4 Proteins 0.000 description 3
- 102100019163 POU5F1 Human genes 0.000 description 3
- 101710026246 POU5F1 Proteins 0.000 description 3
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 3
- 108010052776 Pancreatic Polypeptide Proteins 0.000 description 3
- 210000001811 Primitive Streak Anatomy 0.000 description 3
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N Tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 210000002469 Basement Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 2
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 2
- 210000003981 Ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 description 2
- 101700018827 FOXD3 Proteins 0.000 description 2
- 102100014040 FOXD3 Human genes 0.000 description 2
- 210000003754 Fetus Anatomy 0.000 description 2
- 102100011278 GJC1 Human genes 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 101700025531 MIXL1 Proteins 0.000 description 2
- 102100014645 MIXL1 Human genes 0.000 description 2
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 2
- 210000003716 Mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- SKVWSNOLUIYQFD-YQUYJWMZSA-N N-[(2S,3R,4R,5R,6R)-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3R,4R,5R,6S)-6-[(2R,3S,4R,5R,6R)-6-[(E,2S,3R)-2-formamido-3-hydroxyoctadec-4-enoxy]-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxa Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@@H]([C@H](O)/C=C/CCCCCCCCCCCCC)NC=O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)NC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 SKVWSNOLUIYQFD-YQUYJWMZSA-N 0.000 description 2
- 102100018288 NKX2-2 Human genes 0.000 description 2
- 101710012898 NKX2-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100015786 NKX6-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710012744 NKX6-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100018850 PAX4 Human genes 0.000 description 2
- 102100018847 PAX6 Human genes 0.000 description 2
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 102100018829 SOX2 Human genes 0.000 description 2
- 101700006931 SOX2 Proteins 0.000 description 2
- 208000002491 Severe Combined Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 102100005491 TDGF1 Human genes 0.000 description 2
- 101700073629 TDGF1 Proteins 0.000 description 2
- 101700026107 UTF1 Proteins 0.000 description 2
- 102100011197 UTF1 Human genes 0.000 description 2
- 102100018570 ZFP42 Human genes 0.000 description 2
- 101700068938 ZFP42 Proteins 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 108010015426 connexin 45 Proteins 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000032686 female pregnancy Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- WOLVEMPZUIFSII-IHHOKICGSA-N (2E,4E)-N-[(2S,5S)-5-(hydroxymethyl)-1-methyl-3-oxo-2-propan-2-yl-2,4,5,6-tetrahydro-1,4-benzodiazocin-8-yl]-5-[4-(trifluoromethyl)phenyl]penta-2,4-dienamide Chemical compound CN([C@H](C(N[C@H](CO)CC1=C2)=O)C(C)C)C1=CC=C2NC(=O)\C=C\C=C\C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 WOLVEMPZUIFSII-IHHOKICGSA-N 0.000 description 1
- WKPUACLQLIIVJJ-RHKLHVFKSA-M (2S,3R,4R,5S,6R)-4-hydroxy-3-methoxy-6-[(2S,3R,4S,5S,6R)-6-methoxy-4-oxido-5-(sulfooxyamino)-2-(sulfooxymethyl)oxan-3-yl]oxy-5-sulfooxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [O-][C@H]1[C@H](NOS(O)(=O)=O)[C@H](OC)O[C@@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C([O-])=O)O1 WKPUACLQLIIVJJ-RHKLHVFKSA-M 0.000 description 1
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2S,4S,5R,6R)-5-acetamido-2-{[(2S,3R,4S,5S,6R)-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2S,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1R,2R)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCSKNASZPVZHEG-UHFFFAOYSA-N 3,6-dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione;1,4-dioxane-2,5-dione Chemical group O=C1COC(=O)CO1.CC1OC(=O)C(C)OC1=O LCSKNASZPVZHEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102100001432 BTC Human genes 0.000 description 1
- 101700038892 BTC Proteins 0.000 description 1
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 description 1
- 229940087828 Buprenex Drugs 0.000 description 1
- RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N Buprenorphine Chemical compound C([C@]12[C@H]3OC=4C(O)=CC=C(C2=4)C[C@@H]2[C@]11CC[C@]3([C@H](C1)[C@](C)(O)C(C)(C)C)OC)CN2CC1CC1 RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N 0.000 description 1
- 102100016531 CD9 Human genes 0.000 description 1
- 101700017162 CD9 Proteins 0.000 description 1
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 description 1
- 210000003917 Chromosomes, Human Anatomy 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 102000019622 EC 2.7.1.2 Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 EC 2.7.1.2 Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 210000002242 Embryoid Bodies Anatomy 0.000 description 1
- 102100008658 FN1 Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 101700010630 GHRL Proteins 0.000 description 1
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 1
- 102000012004 Ghrelin Human genes 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 1
- 102000000010 Goosecoid Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010080267 Goosecoid Protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- ZRVUJXDFFKFLMG-UHFFFAOYSA-N Ilacox Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=NC=C(C)S1 ZRVUJXDFFKFLMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 102100003431 MAFA Human genes 0.000 description 1
- 108060004538 MAFA Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229940001676 Metacam Drugs 0.000 description 1
- 210000004253 Multipotent Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinylpyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100000987 NID1 Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 229940032957 PANCREATIC HORMONES Drugs 0.000 description 1
- 101700083667 PAX6 Proteins 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100002862 PTF1A Human genes 0.000 description 1
- 102400001170 Pancreatic hormone Human genes 0.000 description 1
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-Kinases Proteins 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229940069328 Povidone Drugs 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108060003459 SRP54 Proteins 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M Sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960001052 Streptozocin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N Streptozotocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 102100014320 TGFB1 Human genes 0.000 description 1
- 101700041213 TGFB1 Proteins 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001541 Thymus Gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 Thyroid Gland Anatomy 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 210000002438 Upper Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 1
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 1
- 108009000607 Wnt Signaling Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000000646 extraembryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037320 fibronectin Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- BGHSOEHUOOAYMY-JTZMCQEISA-N ghrelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C1=CC=CC=C1 BGHSOEHUOOAYMY-JTZMCQEISA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotection Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-M iodide Chemical compound [I-] XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H iron(3+);methyl-dioxido-oxo-$l^{5}-arsane Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 229960001929 meloxicam Drugs 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000003867 nerve cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 101700008186 pdxS Proteins 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 1
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS REFERENCES TO RELATED APPLICATIONS
Настоящая заявка истребует приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным номером 61/333831, поданной 12 мая 2010 г., которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки для любых целей.This application claims priority from U.S. Provisional Application Serial No. 61/333831, filed May 12, 2010, which is hereby incorporated by reference in its entirety for all purposes.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES
Настоящее изобретение представляет способы стимулирования дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки. В частности, настоящее изобретение представляет способ получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.The present invention provides methods for promoting differentiation of pluripotent stem cells into insulin-producing cells. In particular, the present invention provides a method for obtaining a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 50% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка доступных для трансплантации островков Лангерганса стимулировали интерес к разработке источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.Recent advances in cell replacement therapy for
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, содержащих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и энтодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из энтодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией в данном процессе является образование дефинитивной энтодермы. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF3 бета, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX 17.In vertebrate embryonic development, pluripotent cells give rise to a group of cells containing three germ layers (ectoderm, mesoderm, and endoderm) in a process called gastrulation. Tissues such as the thyroid, thymus, pancreas, intestines, and liver, for example, will develop from the endoderm through an intermediate stage. An intermediate stage in this process is the formation of the definitive endoderm. Definitive endoderm cells express a number of markers such as HNF3 beta, GATA4, MIXL1, CXCR4, and SOX 17.
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании дефинитивной энтодермы в панкреатическую энтодерму. Клетки панкреатической энтодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, PDX1. При отсутствии PDX1 развитие поджелудочной железы не происходит дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической энтодермы.The formation of the pancreas occurs when the definitive endoderm differentiates into the pancreatic endoderm. Pancreatic endoderm cells express the pancreatic-duodenal homeobox gene, PDX1. In the absence of PDX1, pancreatic development does not proceed beyond the formation of the ventral and dorsal buds. Thus, PDX1 expression characterizes a critical stage in pancreatic organogenesis. The mature pancreas contains, among other cell types, exocrine tissue and endocrine tissue. Exocrine and endocrine tissues are formed during the differentiation of the pancreatic endoderm.
По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, в работе Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) сообщается о дифференцировании мышиных эмбриональных стволовых клеток в инсулин-секретирующие структуры, аналогичные островкам поджелудочной железы. В работе Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) сообщается, что полученные из мышиных эмбриональных стволовых клеток инсулин-секретирующие клетки нормализуют гликемию у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином.Cells with islet cell properties have reportedly been derived from mouse embryonic cells. For example, Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) murine embryonic stem cells are reported to differentiate into insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Soria in progress et al. (Diabetes 49:157, 2000) mouse embryonic stem cell-derived insulin-secreting cells are reported to normalize glycemia in mice with streptozotocin-induced diabetes.
В одном примере в работе Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) раскрывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.In one example, Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) discloses that treatment of mouse embryonic stem cells with inhibitors of phosphoinositide 3-kinase (LY294002) resulted in β-cell-like cells.
В другом примере в работе Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) сообщается о получении инсулин-продуцирующих клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток с конститутивной экспрессией Pax4.In another example in Blyszczuk's work et al. (PNAS 100:998, 2003) reported on the production of insulin-producing cells from mouse embryonic stem cells with constitutive expression of Pax4.
В работе Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать PDX1-положительную панкреатическую энтодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуры на 4 день дифференцирования эмбриональной стволовой клетки в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).In Micallef's work et al. reported that retinoic acid can regulate the ability of embryonic stem cells to form PDX1-positive pancreatic endoderm. Retinoic acid most effectively induces Pdx1 expression when added to cultures on day 4 of embryonic stem cell differentiation during the period corresponding to the end of embryonic gastrulation (Diabetes 54:301, 2005).
В работе Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией PDX1. Результаты авторов показывают, что экспрессия экзогенного PDX1 явно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).In Miyazaki's work et al. a mouse embryonic stem cell line overexpressing PDX1 has been reported. The authors' results show that exogenous PDX1 expression clearly upregulates the gene expression of insulin, somatostatin, glucokinase, neurogenin 3, p48, Pax6, and HNF6 in resulting differentiated cells (Diabetes 53: 1030, 2004).
В работе Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (PDX1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдали при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Авторы также отмечали, что уровень экспрессии инсулина и PDX1 mRNA не зависел от наличия ретиноевой кислоты. Однако обработка с использованием 3 нМ FGF7 привела к повышению уровня транскрипта для PDX1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).Skoudy in progress et al. activin A (a member of the TGF-β superfamily) has been reported to increase the expression of exocrine pancreatic genes (p48 and amylase) and endocrine genes (PDX1, insulin and glucagon) in mouse embryonic stem cells. The maximum effect was observed when using activin A at a concentration of 1 nM. The authors also noted that the level of insulin and PDX1 mRNA expression did not depend on the presence of retinoic acid. However, treatment with 3 nM FGF7 resulted in an increase in the transcript level for PDX1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучены эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцирование эмбриональных стволовых клеток в PDX1-положительные клетки. Авторы отмечали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли PDX1-положительных клеток (Genes Cells, июнь 2005 г.; 10(6): 503-16).In Shiraki's work et al. the effects of growth factors specifically accelerating the differentiation of embryonic stem cells into PDX1-positive cells were studied. The authors noted that TGF-β2 resulted in a reproducible increase in the proportion of PDX1 positive cells (Genes Cells, June 2005; 10(6): 503-16).
В работе Gordon et al. продемонстрирована индукция образования брахиурических [положительных]/HNF3 бета [положительных] энтодермальных клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина в сочетании с ингибитором сигнального каскада Wnt (патент США № 2006/0003446A1).In Gordon's work et al. demonstrated the induction of the formation of brachiuric [positive]/HNF3 beta [positive] endodermal cells from mouse embryonic stem cells in the absence of serum and in the presence of activin in combination with an inhibitor of the Wnt signaling cascade (US patent No. 2006/0003446A1).
В работе Gordon et al. (PNAS, т. 103, стр. 16806, 2006) говорится: «Для образования передней первичной полоски требовались одновременно сигнальные каскады Wnt и TGF-бета/Nodal/активин».In Gordon's work et al. (PNAS, vol. 103, p. 16806, 2006) states: "For formation of the anterior primary streak, both Wnt and TGF-beta/Nodal/activin signaling cascades were required."
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах не может в точности имитировать программу развития у высших млекопитающих, например у человека.However, the mouse model of embryonic stem cell development cannot accurately mimic the developmental program in higher mammals, such as humans.
В работе Thomson et al. выделяли эмбриональные стволовые клетки из бластоцист человека (Science 282:114, 1998). Параллельно, Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцированию которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемии (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека необходимо культивировать в крайне специфических условиях (патент США № 6200806; международные заявки на патент №№ 99/20741, 01/51616).In Thomson's work et al. isolated embryonic stem cells from human blastocysts (Science 282:114, 1998). In parallel, Gearhart et al. have generated human embryonic germ cell (hEG) cell lines from embryonic gonadal tissue (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). Unlike mouse embryonic stem cells, which can be prevented from differentiating by simply culturing with leukemia inhibitory factor (LIF), human embryonic stem cells must be cultured under very specific conditions (US Patent No. 6200806; International Patent Applications Nos. 99/20741, 01 /51616).
В работе D’Amour et al. описывается производство обогащенных культур дефинитивной энтодермы, производной от эмбриональных стволовых клеток человека, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцированию в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых энтодермальных органов. Клетки дефинитивной энтодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, можно далее дифференцировать в PDX1-положительные клетки после добавления FGF-10 (патент США № 2005/0266554A1).D'Amour et al. describes the production of enriched cultures of human embryonic stem cell-derived definitive endoderm in the presence of high activin and low serum (Nature Biotechnology 2005). Transplantation of these cells under the renal capsule of mice led to their differentiation into more mature cells with characteristic features of some endodermal organs. Definitive endoderm cells derived from human embryonic stem cells can be further differentiated into PDX1 positive cells after the addition of FGF-10 (US Pat. No. 2005/0266554A1).
В работе D’Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) говорится: «Мы разработали способ дифференцирования, преобразующий эмбриональные стволовые клетки человека (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы: инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный способ имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через стадии, напоминающие образование дефинитивной энтодермы, энтодермы кишечной трубки, панкреатической энтодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны».D'Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) states: "We have developed a differentiation method that converts human embryonic stem cells (hES) into endocrine cells capable of synthesizing pancreatic hormones: insulin, glucagon, somatostatin, pancreatic polypeptide and ghrelin. This method mimics pancreatic organogenesis in vivo by taking cells through stages resembling the formation of definitive endoderm, intestinal tube endoderm, pancreatic endoderm, and the conversion of endocrine progenitors into endocrine hormone-expressing cells."
В другом примере в работе Fisk et al. сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (патент США № 2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Сначала эмбриональные стволовые клетки человека были дифференцированы до энтодермы с помощью комбинации бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировали с антагонистами TGF-β, такими как Ноггин, в комбинации с EGF или бетацеллюлином с получением PDX1-положительных клеток. Окончательное дифференцирование индуцировали никотинамидом.In another example, Fisk et al. reported on a system for the production of pancreatic islet cells from human embryonic stem cells (US patent No. 2006/0040387A1). In this case, the differentiation process was divided into three stages. First, human embryonic stem cells were differentiated to the endoderm using a combination of sodium butyrate and activin A. The cells were then cultured with TGF-β antagonists such as Noggin in combination with EGF or betacellulin to obtain PDX1-positive cells. Final differentiation was induced with nicotinamide.
В одном примере в работе Benvenistry et al. сообщается: «Мы делаем вывод, что сверхэкспрессия PDX1 повышала экспрессию панкреатических обогащенных генов, а для индукции экспрессии инсулина могут требоваться дополнительные сигналы, присутствующие только in vivo» (Benvenistry et al., Stem Cells 2006; 24:1923-1930).In one example, Benvenistry et al. reported: "We conclude that overexpression of PDX1 increased the expression of pancreatic enriched genes, and additional signals that are only present in vivo may be required to induce insulin expression" (Benvenistry et al., Stem Cells 2006; 24:1923-1930).
В другом примере в работе Grapin-Botton et al. сообщается: «Ранняя активация Ngn3 почти во всех случаях индуцировала глюкагон-положительные клетки, уменьшая при этом количество клеток-предшественников поджелудочной железы. Как и в случае E11.5, предшественники PDX-1 могут дифференцироваться в инсулин-[положительные] и PP-[положительные] клетки» (Johansson KA et al., Developmental Cell 12, 457-465, март 2007 г.).In another example, Grapin-Botton et al. reported: “Early activation of Ngn3 induced glucagon-positive cells in almost all cases, while reducing the number of pancreatic progenitor cells. As with E11.5, PDX-1 precursors can differentiate into insulin-[positive] and PP-[positive] cells" (Johansson KA et al., Developmental Cell 12, 457-465, March 2007).
Например, в работе Diez et al. сообщается: «После 9 и 10 недель большинство глюкагон-положительных клеток одновременно экспрессировали инсулин, хотя на этих стадиях явно обнаруживались и отдельные клетки, экспрессирующие только инсулин. Клетки, одновременно экспрессирующие инсулин и глюкагон, наблюдали в течение всего периода исследования (от 9 до 21 недели), но они представляли лишь небольшую часть от общего количества экспрессирующих инсулин и глюкагон клеток» (J Histochem Cytochem., сентябрь 2009 г.; 57(9):811-24, 13 апреля 2009 г.).For example, Diez et al. reported: “After 9 and 10 weeks, most of the glucagon-positive cells co-expressed insulin, although some cells expressing only insulin were clearly found at these stages. Cells co-expressing insulin and glucagon were observed throughout the study period (from 9 to 21 weeks), but they represented only a small fraction of the total number of cells expressing insulin and glucagon” (J Histochem Cytochem., September 2009; 57( 9):811-24, April 13, 2009).
В одном примере в работе Chen et al. сообщается: «(-)-индолактам V [(ILV)] активирует сигнальный каскад протеинкиназы С и задает поджелудочную спецификацию эмбриональных стволовых клеток человека, которые уже были определены для дифференцирования в линии энтодермы...ILV и ретиноевая кислота воздействуют через связанный механизм...ILV демонстрирует более сильную индукцию экспрессирующих PDX-1 клеток (большую процентную долю экспрессирующих PDX-1 клеток), чем ретиноевая кислота» (Nature Chemical Biology 5, 195-196 (апрель 2009 г.) doi:10.1038/nchembio0409-195).In one example, Chen et al. reported: "(-)-Indolactam V [(ILV)] activates the protein kinase C signaling cascade and sets the pancreatic specification of human embryonic stem cells, which have already been identified for endoderm lineage differentiation...ILV and retinoic acid act through a coupled mechanism.. .ILV shows a stronger induction of PDX-1 expressing cells (higher percentage of PDX-1 expressing cells) than retinoic acid" (Nature Chemical Biology 5, 195-196 (April 2009) doi:10.1038/nchembio0409-195).
В работе Lyttle et al. сообщается: «NKX6-1 со-локализованы только с инсулиновыми клетками, что указывает на то, что NKX6-1 участвует только в развитии бета-клеток человека» (Diabetologia, июль 2008 г.: 51(7):1169-80, 2008).Lyttle et al. reported: "NKX6-1 is co-localized only with insulin cells, indicating that NKX6-1 is only involved in the development of human beta cells" (Diabetologia, July 2008: 51(7):1169-80, 2008 ).
Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке лабораторных способов создания функциональной экспрессирующей инсулин клетки, более близкой к β-клетке. Настоящее изобретение представляет альтернативный подход к повышению эффективности дифференцирования эмбриональных стволовых клеток человека в экспрессирующие инсулин клетки путем генерирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.Thus, there remains a significant need to develop laboratory methods for creating a functional insulin-expressing cell closer to a β-cell. The present invention provides an alternative approach to improve the differentiation efficiency of human embryonic stem cells into insulin-expressing cells by generating a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 50% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕSHORT DESCRIPTION
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.In one embodiment, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 50% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ дифференцирования популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, содержащий следующие стадии:In one embodiment, the present invention provides a method for differentiating a population of pluripotent stem cells into a population of cells expressing markers characteristic of a pancreatic endoderm lineage, comprising the steps of:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;a. culturing a population of pluripotent stem cells;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы; иb. differentiation of a population of pluripotent stem cells into a population of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage; and
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, посредством обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, средой, в которую добавлен активатор протеинкиназы С.c. differentiation of a population of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage by treating the population of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage with a medium to which a protein kinase C activator has been added.
В одном варианте осуществления более 50% клеток в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые получены способами, составляющими предмет настоящего изобретения, одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.In one embodiment, more than 50% of the cells in the population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, which are obtained by the methods that are the subject of the present invention, simultaneously express PDX-1 and NKX6.1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
На фигурах 1A и 1B приведены данные по экспрессии PDX1, NKX6.1 и ISL-1 на стадии 4, день 4, протокола дифференцирования, приведенного в примере 1. На фиг. 1A приведены данные по экспрессии PDX1 и NKX6.1. На фиг. 1B приведены данные по экспрессии NKX6.1 и ISL-1.Figures 1A and 1B show expression data for PDX1, NKX6.1 and ISL-1 at stage 4, day 4, of the differentiation protocol of Example 1. FIG. 1A shows PDX1 and NKX6.1 expression data. In FIG. 1B shows NKX6.1 and ISL-1 expression data.
На фигурах 2A и 2B показан эффект обработки активатором протеинкиназы С (PKC) на долю клеток, экспрессирующих PDX1, NKX6.1 и CDX2, анализируемый с помощью анализатора IN Cell Analyzer 1000 (фиг. 2A), а также сравнение различных активаторов PKC и эффектов их воздействия на долю клеток, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, по данным, полученным на анализаторе IN Cell Analyzer (фиг. 2B).Figures 2A and 2B show the effect of protein kinase C (PKC) activator treatment on the proportion of cells expressing PDX1, NKX6.1 and CDX2 as analyzed by the IN Cell Analyzer 1000 (Figure 2A) and a comparison of various PKC activators and their effects. affecting the proportion of cells expressing PDX1 and NKX6.1 as measured by the IN Cell Analyzer (FIG. 2B).
На фигурах 3A, 3B и 3C приведены уровни циркулирующего C-пептида у мышей линии SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров, которым вводили клетки, составляющие предмет настоящего изобретения, под почечную капсулу (фиг. 3A) и через имплантированное под кожу устройство Theracyte (фиг. 3B). Уровни C-пептида регистрировали в указанные моменты времени. На фиг. 3C показано сравнение уровней С-пептида, наблюдаемых в группе, получавшей клетки под почечную капсулу, и группе, получавшей клетки через подкожное устройство Theracyte, через 12 недель после трансплантации.Figures 3A, 3B and 3C show the levels of circulating C-peptide in SCID mice with congenital absence of killer cells, which were injected with cells of the present invention, under the renal capsule (Fig. 3A) and through the Theracyte device implanted under the skin (Fig. .3B). C-peptide levels were recorded at the indicated time points. In FIG. 3C shows a comparison of C-peptide levels observed in the sub-renal capsule cell group and the Theracyte subcutaneous device group at 12 weeks post-transplantation.
На фигурах 4A, 4B, 4C и 4D показан эффект обработки активатором PKC на экспрессию PDX1, NKX6.1, NGN3 и PTF1 альфа в клетках, обработанных в соответствии со способами, описанными в примере 3.Figures 4A, 4B, 4C and 4D show the effect of PKC activator treatment on PDX1, NKX6.1, NGN3 and PTF1 alpha expression in cells treated according to the methods described in Example 3.
На фигурах 5A, 5B, 5C и 5D показан эффект FGF7 на экспрессию NKX6.1, PDX1, PTF1 альфа и CDX2 в клетках, обработанных в соответствии со способами, описанными в примере 4.Figures 5A, 5B, 5C and 5D show the effect of FGF7 on the expression of NKX6.1, PDX1, PTF1 alpha and CDX2 in cells treated according to the methods described in Example 4.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание настоящего изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.For clarity of description, and not to limit the invention, the detailed description of the present invention is divided into the following subsections, describing or illustrating certain features, embodiments, or applications of the present invention.
ОпределенияDefinitions
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцировать с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от множества зародышевых листков, и по существу способствовать формированию большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.Stem cells are undifferentiated cells, defined by their ability, at the single cell level, to both self-renew and differentiate into progeny cells such as self-renewing progenitor cells, non-renewable progenitor cells, and terminally differentiated cells. Stem cells are also characterized by the ability to differentiate in vitro into functional cells of various cell lines of differentiation from multiple germ layers (endoderm, mesoderm, and ectoderm) and, after transplantation, to give rise to tissues derived from multiple germ layers, and essentially contribute to the formation of most, if not all tissues after injection into blastocysts.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития следующим образом: (1) тотипотентные, способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементы (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).Stem cells are classified according to developmental potential as follows: (1) totipotent, capable of transforming into any of the embryonic and extraembryonic cell types; (2) pluripotent, capable of transforming into all types of embryonic cells; (3) multipotent, capable of transforming into many cell lines, but within the same tissue, organ, or physiological system (for example, hematopoietic stem cells (HSCs) can generate HSCs (self-renewal), oligopotent limited blood progenitor cells and all types of cells and elements (eg, platelets), which are standard constituents of the blood); (4) oligopotent, capable of transforming into a more limited subset of cell lines than multipotent stem cells; and (5) unipotent, capable of transforming into a single cell line (eg, spermatogenic stem cells).
Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или множества типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которую можно использовать для оценки дифференцирования некоммитированной клетки данную линию дифференцирования.Differentiation is the process by which an unspecialized ("uncommitted") or less specialized cell acquires the properties of a specialized cell, such as a nerve or muscle cell. A differentiated or differentiation-induced cell is a cell that has taken a more specialized ("committed") position in the cell's lineage. The term "committed" in relation to the process of differentiation means a cell that, during the differentiation process, has reached a stage from which, under normal conditions, it will continue to differentiate to a particular cell type or set of cell types and will not be able under normal conditions to differentiate into another type of cell or return back to less differentiated type. Dedifferentiation is the process by which a cell returns to a less specialized (or committed) position in the lineage of differentiation. Used in this application, the term "cell lineage" defines the heredity of the cell, that is, determines from which cell a given cell originated and which cells it can give rise to. In the line of differentiation, the cell is placed in the hereditary pattern of development and differentiation. A lineage-specific marker is a feature specifically associated with the cell phenotype of a particular lineage that can be used to assess the differentiation of an uncommitted cell of that lineage.
Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы», «клетки стадии 1» или «стадия 1», относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксный белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, включают в себя клетки-предшественники клеток первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезоэнтодермы и клетки дефинитивной энтодермы.As used herein, "cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage", "
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HNF4 альфа, SOX9, HB9 или PROX1. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, включают в себя клетки панкреатической энтодермы, клетки первичной кишечной трубки и поздние клетки передней кишки.The term "cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage" as used herein refers to cells expressing at least one of the following markers: PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, HB9, or PROX1 . Cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage include pancreatic endoderm cells, primary intestinal tube cells, and late foregut cells.
Используемый в настоящей заявке термин «дефинитивная энтодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 бета, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.As used herein, the term "definitive endoderm" refers to cells having the characteristic features of cells derived from the epiblast during gastrulation and forming the gastrointestinal tract and its derivatives. Definitive endoderm cells express the following markers: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99, and MIXL1.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет выявлять интересующую клетку и отличать ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.Used in this application, the term "markers" means molecules of nucleic acids or polypeptides with differential expression in the cells of interest. In this context, differential expression refers to an increase in the level of expression for a positive marker and a decrease in the level of expression for a negative marker. The detectable level of the marker nucleic acid or polypeptide in cells of interest is significantly higher or lower than other cells, allowing the cell of interest to be identified and distinguished from other cells using any of a variety of techniques known in the art.
Используемые в настоящей заявке термины «панкреатическая эндокринная клетка», или «клетка, экспрессирующая гормон поджелудочной железы», или «клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток», относятся к клетке, способной экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.As used herein, the terms "pancreatic endocrine cell" or "cell expressing pancreatic hormone" or "cell expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cell line" refers to a cell capable of expressing at least one of the following hormones: insulin, glucagon, somatostatin and pancreatic polypeptide.
Выделение, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клетокIsolation, expansion and cultivation of pluripotent stem cells
Характеристика плюрипотентных стволовых клетокCharacterization of pluripotent stem cells
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадиеспецифических эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначаемыми как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998 г.). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при наличии) и к повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которую можно обнаружить путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, г. Берлингейм, штат Калифорния). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ОТ-ПЦР.Pluripotent stem cells can express one or more stage-specific embryonic antigens (SSEA) 3 and 4, as well as markers determined by antibodies referred to as Tra-1-60 and Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998 G.). Differentiation of pluripotent stem cells in vitro results in loss of expression of SSEA-4, Tra 1-60 and Tra 1-81 (if present) and increased expression of SSEA-1. In undifferentiated pluripotent stem cells, alkaline phosphatase is generally active, which can be detected by fixing the cells with 4% paraformaldehyde, followed by detection with Vector Red used as a substrate, according to the manufacturer's instructions (Vector Laboratories, Burlingame). , California State). Undifferentiated pluripotent stem cells also typically express OCT4 and TERT as determined by RT-PCR.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в энтодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентность можно определить по образованию эмбриоидных тел и их анализа на предмет присутствия маркеров, которые ассоциируются с тремя зародышевыми листками.Another desirable phenotypic property of grown pluripotent stem cells is the potential to differentiate into cells of all three germ layers: endodermal, mesodermal and ectodermal tissues. The pluripotency of pluripotent stem cells can be confirmed, for example, by injecting the cells into severe combined immunodeficiency (SCID) mice, fixing the resulting teratomas with 4% paraformaldehyde, and examining them histologically for evidence of cell types derived from the three germ layers. In an alternative embodiment, pluripotency can be determined by the formation of embryoid bodies and their analysis for the presence of markers that are associated with the three germ layers.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», то есть эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.Grown pluripotent stem cell lines can be karyotyped using the standard Giemsa staining method and compared with published karyotypes of the corresponding primate species. It is desirable to obtain cells having a "normal karyotype", that is, euploid cells in which all human chromosomes are present and have no visible changes.
Источники плюрипотентных стволовых клетокSources of pluripotent stem cells
К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из ткани, формируемой после вынашивания плода, в том числе из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в период вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Неограничивающими примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека или эмбриональных зародышевых клеток человека, например, линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке композиций во время первоначального установления или стабилизации таких клеток. В этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Целям настоящего изобретения также соответствуют клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Целям настоящего изобретения также соответствуют линии мутантных эмбриональных стволовых клеток человека, такие как BG01v (BresaGen, г. Афины, штат Джорджия).Types of pluripotent stem cells that can be used include resistant pluripotent cell lines derived from tissue formed after gestation, including pre-embryonic tissue (such as a blastocyst), fetal tissue, or fetal tissue taken at any time during gestation. usually, but not necessarily, before about 10-12 weeks of gestation. Non-limiting examples are stable human embryonic stem cell lines or human embryonic germ cells, such as human embryonic stem cell lines H1, H7 and H9 (WiCell). It is also possible to use the compositions described in this application during the initial establishment or stabilization of such cells. In this case, the source cells are primary pluripotent cells taken directly from source tissues. Also suitable for the purposes of the present invention are cells taken from a population of pluripotent stem cells already cultured in the absence of nurse cells. Mutant human embryonic stem cell lines such as BG01v (BresaGen, Athens, Georgia) are also suitable for the purposes of the present invention.
В одном варианте осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовят, как описано в работе Thomson et al. (патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).In one embodiment, human embryonic stem cells are prepared as described by Thomson et al. (US patent No. 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Культивирование плюрипотентных стволовых клетокCultivation of pluripotent stem cells
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные стволовые клетки в различных отношениях. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и не допускающей существенного дифференцирования. Рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной предварительным культивированием клеток иного типа. В альтернативном варианте осуществления рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.In one embodiment, the pluripotent stem cells are cultured on a layer of nurse cells that support the pluripotent stem cells in various ways. In an alternative embodiment, the pluripotent stem cells are cultured in a culture system that is substantially free of nurse cells, but nevertheless supports proliferation of the pluripotent stem cells and does not allow significant differentiation. Growth of pluripotent stem cells in a non-feeder cell culture system without differentiation is maintained by using a medium conditioned by pre-cultivation of cells of a different type. In an alternative embodiment, the growth of pluripotent stem cells in a non-feeder cell culture system without differentiation is supported by using a chemically defined medium.
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток фибробластов эмбриона мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток фибробластов эмбриона мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Thompson et al (Science 6, ноябрь 1998 г.: т. 282, № 5391, стр. 1145-1147). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на любом из слоев питающих клеток, раскрытых в работе Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003).In one embodiment, pluripotent stem cells can be cultured on a layer of mouse embryonic fibroblast nurse cells according to the methods set forth in Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)). In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured on a layer of mouse embryonic fibroblast nurse cells according to the methods set forth in Thompson et al (Science 6, Nov. 1998: vol. 282, no. 5391, pp. 1145-1147). In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured on any of the nurse cell layers disclosed by Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека в соответствии со способами, изложенными в работе Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Inzunza et al (Stem Cells 23: 544-549, 2005).In one embodiment, pluripotent stem cells can be cultured on a layer of human nurse cells according to the methods set forth in Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005). In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured on a layer of human nurse cells disclosed by Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005). In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured on a layer of human nurse cells disclosed by Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004). In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured on a layer of human nurse cells disclosed by Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003). In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured on a layer of human nurse cells disclosed by Inzunza et al (Stem Cells 23: 544-549, 2005).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20020072117. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6642048. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в международном патенте WO2005014799. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в работе Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20070010011. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050233446. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6800480. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в международном патенте WO2005065354.In one embodiment, pluripotent stem cells can be cultured in a culture medium prepared according to the methods of US Pat. No. 20020072117. In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured in a culture medium prepared according to the methods of US Pat. 6,642,048. In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured in a culture medium prepared in accordance with the methods presented in international patent WO2005014799. In an alternative embodiment, the pluripotent stem cells can be cultured in a culture medium prepared according to the methods presented by Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004). In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured in a culture medium prepared according to the methods of US Pat. No. 20070010011. In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured in a culture medium prepared according to the methods of US Pat. 20050233446. In an alternative embodiment, the pluripotent stem cells can be cultured in a culture medium prepared in accordance with the methods presented in US Pat. No. 6,800,480. patent WO2005065354.
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в работе Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod. 105.046870, 19 октября 2005 г.). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в работе Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050148070. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050244962. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в международной заявке на патент № WO2005086845.In one embodiment, pluripotent stem cells can be cultured according to the methods presented in Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod. 105.046870, October 19, 2005). In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured according to the methods presented in Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006). In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured according to the methods of US Pat. No. 20050148070. In an alternative embodiment, pluripotent stem cells can be cultured according to the methods of US Pat. No. 20050244962. cultivate in accordance with the methods presented in international patent application No. WO2005086845.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном варианте осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном варианте осуществления соответствующим культуральным субстратом является MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.Pluripotent stem cells can be seeded on an appropriate culture substrate. In one embodiment, the appropriate culture substrate is an extracellular matrix component such as, for example, derived from a basement membrane or one that can participate in a ligand-receptor interaction involving an adhesive layer molecule. In one embodiment, the appropriate culture substrate is MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® is a soluble Engelbreth-Holm-Swarm tumor cell preparation that gels at room temperature and forms a reconstituted basement membrane.
В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, последние могут включать в себя ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных комбинациях.Alternatively, other extracellular matrix components and mixtures of components can be used. Depending on the type of proliferating cells, the latter may include laminin, fibronectin, proteoglycan, entactin, heparan sulfate, and the like, alone or in various combinations.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживаемость, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.Pluripotent stem cells can be seeded on a substrate with an appropriate distribution over the surface and in the presence of a medium that supports the survival, reproduction and maintenance of the desired characteristics of the cells. All of these characteristics are improved by a careful approach to the distribution of cells during seeding and can be determined by a person skilled in the art.
Соответствующая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco № 10829-018, основная среда Хэма F12/50% DMEM, 200 мМ L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор неосновных аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; рекомбинантный основной фактор роста фибробластов человека (bFGF), Gibco № 13256-029.A suitable culture medium can be prepared, for example, from the following components: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Gibco no. 11965-092, Knockout Dulbecco's Modified Eagle's Medium (KO DMEM), Gibco no. F12/50% DMEM, 200 mM L-glutamine, Gibco #15039-027; non-essential amino acid solution, Gibco 11140-050; β-mercaptoethanol, Sigma No. M7522; recombinant basic human fibroblast growth factor (bFGF), Gibco No. 13256-029.
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, из плюрипотентных стволовых клетокFormation of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage from pluripotent stem cells
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы из плюрипотентных стволовых клеток, содержащий следующие стадии:In one embodiment, the present invention provides a method for obtaining a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage from pluripotent stem cells, comprising the following steps:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;a. culturing a population of pluripotent stem cells;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы; иb. differentiation of a population of pluripotent stem cells into a population of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage; and
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, посредством обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, средой, в которую добавлен активатор протеинкиназы С.c. differentiation of a population of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage by treating the population of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage with a medium to which a protein kinase C activator has been added.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 60% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 70% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 80% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 90% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.In one aspect, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 50% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1. In an alternative embodiment, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 60% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1. In an alternative embodiment, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 70% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1. In an alternative embodiment, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 80% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1. In an alternative embodiment, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 90% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1.
В одном аспекте настоящего изобретения популяция клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, можно дополнительно обрабатывать для получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.In one aspect of the present invention, a population of cells expressing markers characteristic of a pancreatic endoderm lineage can be further processed to obtain a population of cells expressing markers characteristic of a pancreatic endocrine cell line.
Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для желательного вида клеток. Differentiation efficiency can be determined by treating a population of cells with an agent (eg, antibody) that specifically recognizes a protein marker expressed by cells expressing markers characteristic of the desired cell species.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (под ред. Ausubel et al., 2001, доп.)), а также способы иммунологического анализа, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).Methods for assessing the expression of protein and nucleic acid markers in cultured or isolated cells are standard in the art. Such methods include quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), Northern blotting, in situ hybridization (see, for example, Current Protocols in Molecular Biology (ed. Ausubel et al., 2001, add.)) , as well as immunoassay methods such as sectional immunohistochemistry, Western blot, and for markers available in intact cells, flow cytometry (FACS) (see, e.g., Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или более из следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.The characteristics of pluripotent stem cells are well known to those skilled in the art, and further characteristics of pluripotent stem cells are being identified. Pluripotent stem cell markers include, for example, the expression of one or more of the following markers: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1- 60, Tra 1-81.
После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть очищены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например, CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы.Following treatment of pluripotent stem cells using the methods of the present invention, differentiated cells can be purified by exposing the cell population to an agent (e.g., antibody) that specifically recognizes a protein marker, e.g., CXCR4, expressed by cells expressing markers characteristic of the definitive lineage. endoderm.
К плюрипотентным стволовым клеткам, допустимым для использования в целях настоящего изобретения, относятся, например, эмбриональные стволовые клетки человека линии H9 (код NIH: WA09), эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 (код NIH: WA01), эмбриональные стволовые клетки человека линии H7 (код NIH: WA07) и эмбриональные стволовые клетки человека линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также целям настоящего изобретения соответствуют клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, CRIPTO, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81. Pluripotent stem cells suitable for use in the present invention include, for example, H9 human embryonic stem cells (NIH code: WA09), H1 human embryonic stem cells (NIH code: WA01), H7 human embryonic stem cells ( NIH code: WA07) and SA002 human embryonic stem cells (Cellartis, Sweden). Also suitable for the purposes of the present invention are cells expressing at least one of the following markers characteristic of pluripotent cells: ABCG2, CRIPTO, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA -4, Tra 1-60 and Tra 1-81.
Маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, выбраны из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобного гомеобоксного белка, FGF4, CD48, эомезодермина (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Целям настоящего изобретения соответствует клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии дефинитивной энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой мезэнтодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку дефинитивной энтодермы.Markers characteristic of the definitive endoderm lineage are selected from the group consisting of SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-like homeobox protein, FGF4, CD48, eomesoderm (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 and OTX2. For the purposes of the present invention, a cell expresses at least one of the markers characteristic of the definitive endoderm lineage. In one aspect of the present invention, a cell expressing markers characteristic of a definitive endoderm lineage is a primitive streak progenitor cell. In another aspect of the present invention, a cell expressing markers characteristic of a definitive endoderm lineage is a mesendodermal cell. In another aspect of the present invention, a cell expressing markers characteristic of a definitive endoderm lineage is a definitive endoderm cell.
Маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, выбраны из группы, состоящей из PDX1, NKX6.1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HNF4 альфа, SOX9, HB9 и PROX1. Целям настоящего изобретения соответствует клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатической энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, представляет собой клетку панкреатической энтодермы.Markers specific to the pancreatic endoderm lineage are selected from the group consisting of PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, HB9 and PROX1. For the purposes of the present invention, a cell expresses at least one of the markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage. In one aspect of the present invention, the cell expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage is a pancreatic endoderm cell.
Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбраны из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, NKX2.2, PDX1, NKX6.1, PAX4 и PAX6. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулина, глюкагона, соматостатина и панкреатического полипептида. Целям настоящего изобретения соответствует клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.Markers specific to the pancreatic endocrine cell line are selected from the group consisting of NGN3, NEUROD, NKX2.2, PDX1, NKX6.1, PAX4 and PAX6. In one embodiment, the pancreatic endocrine cell is capable of expressing at least one of the following hormones: insulin, glucagon, somatostatin, and a pancreatic polypeptide. For the purposes of the present invention, a cell expresses at least one of the markers characteristic of a pancreatic endocrine cell line. In one aspect of the present invention, a cell expressing markers characteristic of a pancreatic endocrine cell line is a pancreatic endocrine cell. The pancreatic endocrine cell may be a hormone-expressing pancreatic cell. In an alternative embodiment, the pancreatic endocrine cell may be a hormone-secreting pancreatic cell.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для линии дифференцирования β-клеток. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования β-клеток, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования β-клеток, представляет собой β-клетку.In one aspect of the present invention, the pancreatic endocrine cell is a cell expressing markers characteristic of the β-cell lineage. A cell expressing markers characteristic of the β-cell lineage expresses PDX1 and at least one of the following transcription factors: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 beta, MAFA, PAX4, and PAX6. In one aspect of the present invention, a cell expressing markers characteristic of a β-cell lineage is a β-cell.
Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы.Differentiation of pluripotent stem cells into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцирование плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.The formation of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage can be detected by checking for the presence of markers before and after performing a specific protocol. Pluripotent stem cells generally do not express such markers. Thus, the differentiation of pluripotent cells is determined by the onset of expression of such markers.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.Pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage using any method known to those skilled in the art, or using any method provided by the present invention.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе D’Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by the methods described in D'Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004).For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by the methods described in Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе McLean et al., Stem Cells 25, 29-38 (2007).For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by the methods described in McLean et al.,
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе D’Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by the methods described in D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 11/736908.For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by treating the pluripotent stem cells according to the methods set forth in US Patent Application No. 11/736,908.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 11/779311.For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by treating the pluripotent stem cells according to the methods set forth in US Patent Application No. 11/779311.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 60/990529.For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by treating the pluripotent stem cells according to the methods set forth in US Patent Application No. 60/990529.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076889.For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by treating the pluripotent stem cells according to the methods set forth in US Patent Application No. 61/076889.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076900.For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by treating the pluripotent stem cells according to the methods set forth in US Patent Application No. 61/076900.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076908.For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by treating the pluripotent stem cells according to the methods set forth in US Patent Application No. 61/076908.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076915.For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage by treating the pluripotent stem cells according to the methods set forth in US Patent Application No. 61/076915.
Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермыDifferentiation of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы из плюрипотентных стволовых клеток, содержащий следующие стадии:In one embodiment, the present invention provides a method for obtaining a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage from pluripotent stem cells, comprising the following steps:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;a. culturing a population of pluripotent stem cells;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы; иb. differentiation of a population of pluripotent stem cells into a population of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage; and
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, посредством обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, средой, в которую добавлен активатор протеинкиназы С.c. differentiation of a population of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage by treating the population of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage with a medium to which a protein kinase C activator has been added.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 60% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 70% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 80% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 90% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.In one aspect, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 50% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1. In an alternative embodiment, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 60% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1. In an alternative embodiment, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 70% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1. In an alternative embodiment, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 80% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1. In an alternative embodiment, the present invention provides a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 90% of the cells in the population simultaneously expressing PDX-1 and NKX6.1.
В одном варианте осуществления активатор протеинкиназы С выбран из группы, состоящей из (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактама, индолактама V (ILV), форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA) и форбол-12,13-дибутирата (PDBu). В одном варианте осуществления активатор протеинкиназы С представляет собой (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам можно использовать в концентрации от приблизительно 20 нМ до приблизительно 500 нМ. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам в настоящем документе называется «TPB».In one embodiment, the protein kinase C activator is selected from the group consisting of (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadiemoylamino)benzolactam, indolactam V ( ILV), phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) and phorbol-12,13-dibutyrate (PDBu). In one embodiment, the protein kinase C activator is (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadiemoylamino)benzolactam. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadiemoylamino)benzolactam can be used at a concentration of from about 20 nM to about 500 nM. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadiemoylamino)benzolactam is referred to herein as "TPB".
В одном варианте осуществления в среду, в которую добавлен активатор протеинкиназы С, дополнительно добавлен по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из фактора, способного ингибировать BMP, ингибитора сигнального каскада рецепторов TGFβ, а также фактора роста фибробластов.In one embodiment, the medium to which the protein kinase C activator is added is additionally supplemented with at least one factor selected from the group consisting of a factor capable of inhibiting BMP, an inhibitor of the TGFβ receptor signaling cascade, and fibroblast growth factor.
В одном варианте осуществления фактор, способный ингибировать BMP, представляет собой Ноггин. Ноггин можно использовать в концентрации от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 500 нг/мл. В одном варианте осуществления Ноггин используют в концентрации 100 нг/мл.In one embodiment, the factor capable of inhibiting BMP is Noggin. Noggin can be used at a concentration of from about 50 ng/ml to about 500 ng/ml. In one embodiment, Noggin is used at a concentration of 100 ng/ml.
В одном варианте осуществления ингибитор сигнального каскада рецептора TGFβ представляет собой ингибитор ALK5. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II. Ингибитор ALK5 II можно использовать в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 10 мкМ. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 II используют в концентрации 1 мкM.In one embodiment, the TGFβ receptor signaling cascade inhibitor is an ALK5 inhibitor. In one embodiment, the ALK5 inhibitor is an ALK5 II inhibitor. The ALK5 II inhibitor can be used at a concentration of from about 0.1 μM to about 10 μM. In one embodiment, the ALK5 II inhibitor is used at a concentration of 1 μM.
В одном варианте осуществления фактор роста фибробластов представляет собой FGF7. В альтернативном варианте осуществления фактор роста фибробласта представляет собой FGF10.In one embodiment, the fibroblast growth factor is FGF7. In an alternative embodiment, the fibroblast growth factor is FGF10.
В одном варианте осуществления фактор роста фибробластов можно использовать в концентрации от приблизительно 50 пг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. В одном варианте осуществления фактор роста фибробластов используют в концентрации 50 нг/мл.In one embodiment, fibroblast growth factor can be used at a concentration of from about 50 pg/ml to about 50 μg/ml. In one embodiment, fibroblast growth factor is used at a concentration of 50 ng/ml.
Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клетокDifferentiation of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cell line
В одном варианте осуществления популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, дополнительно дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, с использования любого способа, известного специалистам в данной области.In one embodiment, cell populations expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage are further differentiated into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cell line using any method known to those skilled in the art.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’ Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.For example, populations of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage can be further differentiated into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cell line by treating the population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage according to the methods presented in D' Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’ Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.For example, populations of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage can be further differentiated into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cell line by treating the population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage according to the methods presented in D' Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 11/736908.For example, populations of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage can be further differentiated into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cell line by treating the population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage according to the methods presented in US Patent Application No. 11/736908.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 11/779311.For example, populations of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage can be further differentiated into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cell line by treating the population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage according to the methods presented in US Patent Application No. 11/779311.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 60/953178.For example, populations of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage can be further differentiated into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cell line by treating the population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage according to the methods presented in US Patent Application No. 60/953178.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 60/990529.For example, populations of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage can be further differentiated into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cell line by treating the population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage according to the methods presented in US Patent Application No. 60/990529.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 61/289671.For example, populations of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage can be further differentiated into a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cell line by treating the population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage according to the methods presented in US patent application No. 61/289671.
Настоящее изобретение далее без ограничений иллюстрируется следующими примерами.The present invention is further illustrated without limitation by the following examples.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1Example 1
Формирование популяции клеток, составляющих предмет настоящего изобретенияFormation of a population of cells that are the subject of the present invention
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; № по кат. 356231) чашках со средой RPMI (Invitrogen, № по кат. 22400) + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A (PeproTech; № по кат. 120-14) + 20 нг/мл WNT-3a (R&D Systems; № по кат. 1324-WN/CF) в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI, дополненной 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затемHuman embryonic stem cell line H1 cells were cultured in MATRIGEL® coated (1:30 dilution) (BD Biosciences; cat. no. 356231) plates with RPMI medium (Invitrogen, cat. no. 22400) + 0.2% FBS + 100 ng /ml activin A (PeproTech; cat. no. 120-14) + 20 ng/ml WNT-3a (R&D Systems; cat. no. 1324-WN/CF) for one day, followed by treatment with 0-supplemented RPMI medium .5% FBS + 100 ng/ml activin A for two more days (stage 1), then
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затемa. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 ng/ml FGF7 for three days (stage 2), then
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем либоb. High glucose DMEM + 1% B27 + 0.25 µM cyclopamine-KAAD + 2 µM retinoic acid (RA) + 100 ng/ml Noggin for four days (stage 3), then either
c. обработка 1: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 в течение четырех дней (стадия 4 - основная среда - BM), либоc. treatment 1: high glucose DMEM + 1% B27 for four days (stage 4 - basic medium - BM), or
d. обработка 2: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II в течение четырех дней (стадия 4), либоd. treatment 2: high glucose DMEM + 1% B27 + 100 ng/ml Noggin + 1 μM ALK5 II inhibitor for four days (step 4), or
e. обработка 3: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нм форбол-12,13-дибутирата (PDBu) (Calbiochem, № по кат. 524390) в течение четырех дней (стадия 4).e. treatment 3: high glucose DMEM + 1% B27 + 100 ng/mL Noggin + 1 µM ALK5 II inhibitor + 20
Образцы культур отбирали в дублях на стадии 4, день 4, и получали их изображения с помощью анализатора IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания для каждой лунки снимали по 100 проекций. Для каждой лунки с использованием программного обеспечения IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare) измеряли общее количество клеток, общее количество клеток, экспрессирующих PDX1, общее количество клеток, экспрессирующих NKX6.1, и общее количество клеток, экспрессирующих CDX-2. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общие количества клеток, экспрессирующих PDX 1, NKX6.1 и CDX-2, приведены в процентах от общей популяции клеток.Cultures were sampled in duplicate at step 4, day 4 and imaged using the IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). To compensate for possible cell loss during the analysis and subsequent staining procedures, 100 projections were taken for each well. Total cells, total PDX1 expressing cells, total NKX6.1 expressing cells, and total CDX-2 expressing cells were measured for each well using IN Cell Developer Toolbox 1.7 software (GE Healthcare). For each repeated set of data, mean values and standard deviations were calculated. The total number of
Как показано на фиг. 2A, во всех экспериментальных популяциях в конце стадии 4, день 4, приблизительно 92%±4% клеток в популяции экспрессировали PDX 1. При этом обработка PDBu (активатор протеинкиназы C) вызвала значительное увеличение доли клеток, экспрессирующих NKX6.1, в популяции, экспрессирующей PDX1 (фиг. 2A), по сравнению с популяциями клеток, обработанных либо основной средой (обработка 1), либо ингибитором ALK5 II в присутствии Ноггина (обработка 2). В группе, обработанной PDBu, 88%±4,2% от всей популяции экспрессировали NKX6.1, тогда как при обработке 2 NKX6.1 экспрессировали 62%±8% клеток, а при обработке 1 NKX6.1 экспрессировали 46,7%±0,2% клеток. Большинство экспрессирующих NKX6.1 клеток на стадии 4 также экспрессировали PDX1. Эти наблюдения подтверждаются наложением изображений экспрессии PDX1 и NKX6.1, полученных для конкретной популяции клеток (фиг. 1A). Приведенные данные показывают, что обработка клеток средой с добавлением активатора протеинкиназы С увеличила процент клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, в популяции клеток, которые экспрессируют маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы.As shown in FIG. 2A, in all experimental populations at the end of stage 4, day 4, approximately 92% ± 4% of the cells in the population expressed
В популяции клеток, прошедших обработку 1, 10% клеток экспрессировали CDX2 (маркер ткани кишечника) (фиг. 2A). В популяциях клеток, прошедших обработку 2 или 3, CDX2 экспрессировали менее 5% клеток. Во всех случаях большинство клеток, экспрессировавших CDX2, не экспрессировали одновременно PDX1 и NKX6.1.In the cell population treated with 1, 10% of the cells expressed CDX2 (an intestinal tissue marker) (FIG. 2A). In cell populations treated 2 or 3, CDX2 was expressed in less than 5% of the cells. In all cases, the majority of cells expressing CDX2 did not simultaneously express PDX1 and NKX6.1.
Параллельные популяции клеток стадии 3 также обрабатывали следующими активаторами протеинкиназы С: форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) с концентрацией 20 нМ (Calbiochem № 524400) или [(2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламино)бензолактам] (TPB) с концентрацией 50 нМ (Calbiochem № 565740), которые были использованы вместо PDBu при указанной выше обработке 3. В конце стадии 4, день 4, 91% клеток в популяции, обрабатываемой PMA, и 90% клеток в популяции, обрабатываемой TPB, экспрессировали NKX6.1. Для общего количества клеток, экспрессировавших PDX1, при всех вариантах обработки значительных различий не наблюдали. См. фиг. 2B.Parallel populations of stage 3 cells were also treated with the following protein kinase C activators: 20 nM phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) (Calbiochem #524400) or [(2S, 5S)-(E, E)-8-( 5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadienoylamino)benzolactam] (TPB) at 50 nM (Calbiochem No. 565740) which were used instead of PDBu in the above treatment 3. At the end of step 4, day 4 , 91% of the cells in the PMA-treated population and 90% of the cells in the TPB-treated population expressed NKX6.1. For the total number of cells expressing PDX1, no significant differences were observed for all treatments. See fig. 2b.
Приведенный пример показывает, что активаторы протеинкиназы C можно использовать при сравнительно низких концентрациях, чтобы стимулировать повышение экспрессии NKX6.1 и увеличить процент клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы.This example shows that protein kinase C activators can be used at relatively low concentrations to stimulate upregulation of NKX6.1 and increase the percentage of cells co-expressing PDX1 and NKX6.1 in a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage.
Пример 2 Example 2
Имплантация клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, мышам с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID-Bg)Implantation of the cells of the present invention in mice congenitally lacking natural killer cells with severe combined immunodeficiency (SCID-Bg)
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) чашках со средой RPMI + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A + 20 нг/мл WNT-3a в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI + 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затемHuman embryonic stem cell line H1 was cultured in MATRIGEL® coated (1:30 dilution) plates with RPMI medium + 0.2% FBS + 100 ng/ml Activin A + 20 ng/ml WNT-3a for one day followed by treatment RPMI medium + 0.5% FBS + 100 ng/ml activin A for two more days (stage 1), then
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затемa. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 ng/ml FGF7 for three days (stage 2), then
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем b. High glucose DMEM + 1% B27 + 0.25 µM cyclopamine-KAAD + 2 µM retinoic acid (RA) + 100 ng/mL Noggin for four days (stage 3), then
c. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 50 нМ TPB в течение четырех дней (стадия 4).c. High glucose DMEM + 1% B27 + 100 ng/ml Noggin + 1 μM ALK5 inhibitor II + 50 nM TPB for four days (step 4).
Мышей линии SCID-Bg (С.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg N7) возрастом от пяти до шести недель приобрели в компании Taconic Farms. Мышей содержали в клетках-микроизоляторах со свободным доступом к стерилизованной пище и воде. В ходе подготовки к хирургической операции мыши были помечены нанесенной на ухо идентификационной меткой, у них была измерена масса тела, а также содержание глюкозы в крови с помощью ручного глюкометра (LifeScan, One Touch).Five to six week old SCID-Bg mice (C.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdc scid -Lyst bg N7) were purchased from Taconic Farms. Mice were kept in microisolator cages with free access to sterilized food and water. In preparation for surgery, the mice were tagged with an ID tag applied to the ear, their body weight was measured, and their blood glucose levels were measured using a hand-held glucometer (LifeScan, One Touch).
Мышей анестезировали смесью изофлурана и кислорода и на операционном поле выстригли шерсть малыми ножницами для животных. Перед операцией мышам подкожно ввели 0,1 мг/кг Buprenex. Операционное поле подготовили последовательным промыванием 70% раствором изопропилового спирта и 10% повидон-йодидом.The mice were anesthetized with a mixture of isoflurane and oxygen, and their hair was trimmed on the operating field with small animal scissors. Before surgery, mice were injected subcutaneously with 0.1 mg/kg Buprenex. The operating field was prepared by sequential washing with 70% isopropyl alcohol and 10% povidone iodide.
Находящиеся в конце четвертой стадии клетки механически собирали стеклянной пипеткой на 1 мл и далее переносили на не допускающие прикрепления планшеты и культивировали в течение ночи. В ходе предоперационной подготовки мышей клетки отцентрифугировали в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке, большую часть супернатанта удалили, оставив количество среды, достаточное лишь для отбора осажденных клеток. Клетки отобрали с помощью пипетки с объемным вытеснением Rainin Pos-D, после чего пипетку перевернули, чтобы клетки могли осесть под собственным весом. Излишки среды вытеснили, оставив компактный препарат клеток для трансплантации.Cells at the end of the fourth stage were mechanically harvested with a 1 ml glass pipette and then transferred to non-attached plates and cultured overnight. During preoperative preparation of mice, the cells were centrifuged in a 1.5 ml microcentrifuge tube, most of the supernatant was removed, leaving only enough medium to collect the precipitated cells. Cells were collected using a Rainin Pos-D volumetric displacement pipette, after which the pipette was inverted to allow the cells to settle under their own weight. Excess media was expelled, leaving a compact cell preparation for transplantation.
При трансплантации для проникновения в почечную капсулу использовали катетер для внутривенных введений 24G × 1,9 см (3/4 дюйма), после чего иглу извлекли. Затем катетер продвинули под почечной капсулой к дистальному краю почки. Наконечник пипетки Pos-D плотно вставили во втулку катетера и ввели 5 миллионов клеток через катетер под почечную капсулу, к дистальному краю почки. Почечную капсулу загерметизировали, используя низкотемпературное прижигание, после чего почку вернули в первоначальное анатомическое положение. Одновременно агрегаты по 5 миллионов клеток загрузили в устройство для имплантации на 50 мкл при помощи наконечника пипетки Post-D. Устройства на 50 мкл приобрели в компании TheraCyte, Inc (г. Ирвайн, штат Калифорния). Устройство после загрузки клеток герметизировали медицинским клейким силиконом типа А (Dow Corning, № по каталогу 129109) и имплантировали под кожу мышам линии SICD-Bg (животные №№ 3 и 4). Мышцы сшили непрерывным швом с помощью викриловой нити 5-0, а кожу стянули скобами для ран. После операции мышам подкожно ввели 1,0 мг/кг Metacam. Мышей вывели из наркоза и дали им возможность полностью восстановиться.In transplantation, a 24G x 1.9 cm (3/4 inch) IV catheter was used to penetrate the renal capsule, after which the needle was withdrawn. The catheter was then advanced under the renal capsule to the distal edge of the kidney. The Pos-D pipette tip was firmly inserted into the catheter hub and 5 million cells were injected through the catheter under the renal capsule, to the distal edge of the kidney. The renal capsule was sealed using low-temperature cauterization, after which the kidney was returned to its original anatomical position. Simultaneously, aggregates of 5 million cells were loaded into a 50 µl implanter using a Post-D pipette tip. The 50 µl devices were purchased from TheraCyte, Inc (Irvine, CA). The device, after cell loading, was sealed with type A medical adhesive silicone (Dow Corning, catalog # 129109) and implanted under the skin of SICD-Bg mice (animal nos. 3 and 4). The muscles were closed with a continuous suture using 5-0 Vicryl suture, and the skin was tightened with wound staples. After surgery, mice were injected subcutaneously with 1.0 mg/kg Metacam. The mice were taken out of anesthesia and allowed to fully recover.
После трансплантации мышей взвешивали раз в неделю и дважды в неделю брали анализ крови для определения уровня глюкозы. На разных сроках после трансплантации мышам интраперитонеально ввели 3 г/кг глюкозы. Через 60 минут после введения глюкозы через ретроорбитальный синус отобрали кровь, поместив ее в микроцентрифужные пробирки, содержащие небольшое количество гепарина. Кровь центрифугировали, плазму собирали во вторую микроцентрифужную пробирку, замораживали на сухом льду и хранили при -80°C до проведения анализа на С-пептид человека. Уровни человеческого С-пептида измеряли с помощью комплекта Mercodia/ALPCO Diagnotics Ultrasensitive C-peptide ELISA (№ по каталогу 80-CPTHU-E01, Alpco Diagnostics, г. Нью-Гемпшир) в соответствии с инструкциями производителя.After transplantation, mice were weighed once a week and blood samples were taken twice a week to determine the level of glucose. At various times after transplantation, mice were intraperitoneally injected with 3 g/kg of glucose. 60 minutes after administration of glucose, blood was taken through the retroorbital sinus, placing it in microcentrifuge tubes containing a small amount of heparin. Blood was centrifuged, plasma was collected in a second microcentrifuge tube, frozen on dry ice and stored at -80° C. until analysis for human C-peptide. Human C-peptide levels were measured using the Mercodia/ALPCO Diagnotics Ultrasensitive C-peptide ELISA kit (catalog # 80-CPTHU-E01, Alpco Diagnostics, New Hampshire) according to the manufacturer's instructions.
С-пептид человека обнаруживали в сыворотке крови животных и в группе почечной капсулы, и в группе с имплантированным устройством Theracyte, уже через 4-6 недель после трансплантации, и его концентрация нарастала во времени (фиг. 3A и 3B). По истечении трех месяцев в ответ на введение глюкозы регистрировались значительное количество циркулирующего С-пептида человека как у 100% животных с почечной капсулой, так и в группе с имплантированным устройством Theracyte. Через три месяца уровень стимулированного глюкозой С-пептида человека в сыворотке в группе почечной капсулы составил 1,7±0,5 нг/мл (n=4), а концентрация человеческого С-пептида у мышей с имплантированным устройством Theracyte составила 1±0,5 нг/мл (n=2) (фиг. 3C).Human C-peptide was detected in the serum of animals in both the renal capsule group and the Theracyte implanted group as early as 4-6 weeks after transplantation, and its concentration increased over time (FIGS. 3A and 3B). After three months, a significant amount of circulating human C-peptide was recorded in response to glucose administration in both 100% of the animals with the renal capsule and in the Theracyte implanted group. After three months, the serum glucose-stimulated human C-peptide level in the renal capsule group was 1.7±0.5 ng/mL (n=4), and the human C-peptide concentration in Theracyte implanted mice was 1±0. 5 ng/ml (n=2) (Fig. 3C).
Данный пример показывает, что популяция клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, которую получили под действием активаторов протеинкиназы С, способна к дальнейшему дифференцированию в инсулин-секретирующие клетки in vivo. Способность к дальнейшему дифференцированию в инсулин-секретирующие клетки не зависит от локального окружения. Авторы показали, что клетки, одновременно экспрессирующие PDX1 и NKX6.1, способны к дальнейшему дифференцированию в инсулин-секретирующие клетки как в почечной капсуле, так и в иммуннопротекторном устройстве при его подкожной имплантации.This example shows that a population of cells co-expressing PDX1 and NKX6.1, which was generated by the action of protein kinase C activators, is capable of further differentiation into insulin-secreting cells in vivo . The ability to further differentiate into insulin-secreting cells is independent of the local environment. The authors showed that cells that simultaneously express PDX1 and NKX6.1 are capable of further differentiation into insulin-secreting cells both in the renal capsule and in the immunoprotective device when it is implanted subcutaneously.
Пример 3 Example 3
Альтернативный способ формирования популяции клеток, составляющих предмет настоящего изобретенияAlternative method for generating a population of cells that are the subject of the present invention
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; № по кат. 356231) чашках со средой RPMI (Invitrogen, № по кат. 22400) + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A (PeproTech; № по кат. 120-14) + 20 нг/мл WNT-3a (R&D Systems; № по кат. 1324-WN/CF) в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI, дополненной 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затемHuman embryonic stem cell line H1 cells were cultured in MATRIGEL® coated (1:30 dilution) (BD Biosciences; cat. no. 356231) plates with RPMI medium (Invitrogen, cat. no. 22400) + 0.2% FBS + 100 ng /ml activin A (PeproTech; cat. no. 120-14) + 20 ng/ml WNT-3a (R&D Systems; cat. no. 1324-WN/CF) for one day, followed by treatment with RPMI supplemented with 0, 5% FBS + 100 ng/mL activin A for two more days (stage 1), then
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затемa. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 ng/ml FGF7 for three days (stage 2), then
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем либоb. High glucose DMEM + 1% B27 + 0.25 µM cyclopamine-KAAD + 2 µM retinoic acid (RA) + 100 ng/ml Noggin for four days (stage 3), then either
c. обработка 4: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 20 нМ PDBu + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 4), илиc. treatment 4: high glucose DMEM + 1% B27 + 20 nM PDBu + 100 ng/ml Noggin for four days (step 4), or
d. обработка 5: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4), илиd. treatment 5: high glucose DMEM + 1% B27 + 100 ng/ml Noggin + 1 μM ALK5 II inhibitor + 20 nM PDBu for four days (step 4), or
e. обработка 6: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF10 + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4).e. treatment 6: high glucose DMEM + 1% B27 + 50 ng/ml FGF10 + 20 nM PDBu for four days (step 4).
Исследовали воздействие дополнительных факторов на опосредованное активатором протеинкиназы С увеличение процента клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1. Образцы культур отбирали в дублях на стадии 4, день 4, и анализ изображений проводили, как описано в примере 1 выше. Также регистрировали экспрессию ISL1 и NEUROD1.The effect of additional factors on the protein kinase C activator-mediated increase in the percentage of cells simultaneously expressing PDX1 and NKX6.1 was investigated. Cultures were sampled in duplicate at step 4, day 4, and image analysis was performed as described in Example 1 above. ISL1 and NEUROD1 expression was also recorded.
В данном исследовании большинство клеток из популяции, экспрессирующей маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, демонстрировали положительную экспрессию PDX 1. Большинство клеток, экспрессирующих PDX1, также одновременно демонстрировали положительную экспрессию NKX6.1. Как показано в таблице 1, добавление одного только активатора PKC способствовало появлению клеток, экспрессирующих NKX6.1, в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы (обработка 4). На день 4 стадии 4 93% всей популяции были положительны по NKX6.1, и почти все клетки, экспрессирующие NKX6.1, демонстрировали положительную экспрессию PDX1.In this study, the majority of cells from the population expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage showed positive expression of
Добавление ингибитора ALK5 II к среде, содержащей активатор протеинкиназы C (обработка 5), не оказывало никакого воздействия на наблюдаемое увеличение экспрессии NKX6.1. 57,1% клеток популяции экспрессировали NEUROD1, и 52,4% клеток популяции экспрессировали ISL1, что указывает на увеличение доли эндокринных клеток-предшественников в популяции после такой обработки. См. таблицу 1.The addition of an ALK5 II inhibitor to medium containing protein kinase C activator (treatment 5) had no effect on the observed increase in NKX6.1 expression. 57.1% of the cells in the population expressed NEUROD1 and 52.4% of the cells in the population expressed ISL1, indicating an increase in the proportion of endocrine progenitors in the population after this treatment. See table 1.
ПЦР-анализ взятых в этом примере образцов показал, что экспрессия PDX 1, NKX6.1 и PTF1 альфа возрастала в популяции клеток, прошедших обработку 4, по сравнению с клетками, прошедшими обработку 5. См. фиг. 4A-4D. С другой стороны, в клетках, получавших ингибитор ALK5 II и PDBu (обработка 5), наблюдали значительное увеличение экспрессии NGN3. См. фиг. 4A-4D.PCR analysis of the samples taken in this example showed that the expression of
Также исследовали эффект добавления FGF10 к среде, содержащей активатор протеинкиназы С (обработка 6). Добавление FGF10 в концентрации 50 нг/мл в сочетании с PDBu (обработка 6) привело к формированию популяции клеток, экспрессирующих маркер, характерный для линии панкреатической энтодермы, где 90% клеток в популяции экспрессируют NKX6.1, однако многие из экспрессирующих NKX6.1 клеток также демонстрировали положительную экспрессию CDX2. См. таблицу 1. Уровень мРНК для PDX1, NKX6.1 и PTF1 альфа не возрастал по сравнению с уровнем, наблюдаемым для клеток, обработанных PDBu и Ноггином. См. фиг. 4A-4D.The effect of adding FGF10 to medium containing protein kinase C activator was also investigated (treatment 6). The addition of FGF10 at 50 ng/ml in combination with PDBu (treatment 6) resulted in a population of cells expressing a marker characteristic of the pancreatic endoderm lineage, where 90% of the cells in the population express NKX6.1, but many of the cells expressing NKX6.1 also showed positive expression of CDX2. See Table 1. The level of mRNA for PDX1, NKX6.1 and PTF1 alpha did not increase compared to the level observed for cells treated with PDBu and Noggin. See fig. 4A-4D.
Данный пример показывает, что активатор протеинкиназы С в относительно низкой концентрации (примерно 20 нМ) в сочетании с ингибитором BMP можно использовать для формирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, при этом более 90% клеток одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.This example shows that a protein kinase C activator at a relatively low concentration (about 20 nM) in combination with a BMP inhibitor can be used to generate a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, with more than 90% of the cells simultaneously expressing PDX1 and NKX6. one.
Пример 4Example 4
Альтернативный способ формирования популяции клеток, составляющих предмет настоящего изобретенияAlternative method for generating a population of cells that are the subject of the present invention
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; № по кат. 356231) чашках со средой RPMI (Invitrogen, № по кат. 22400) + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A (PeproTech; № по кат. 120-14) + 20 нг/мл WNT-3a (R&D Systems; № по кат. 1324-WN/CF) в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI, дополненной 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затемHuman embryonic stem cell line H1 cells were cultured in MATRIGEL® coated (1:30 dilution) (BD Biosciences; cat. no. 356231) plates with RPMI medium (Invitrogen, cat. no. 22400) + 0.2% FBS + 100 ng /ml activin A (PeproTech; cat. no. 120-14) + 20 ng/ml WNT-3a (R&D Systems; cat. no. 1324-WN/CF) for one day, followed by treatment with RPMI supplemented with 0, 5% FBS + 100 ng/mL activin A for two more days (stage 1), then
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем либоa. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 ng/ml FGF7 for three days (stage 2), then either
b. обработка 7 (T7): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), либо b. treatment 7 (T7): DMEM high glucose + 1% B27 + 0.25 µM cyclopamine-KAAD + 2 µM retinoic acid (RA) + 100 ng/ml Noggin for four days (step 3), or
c. обработка 8 (T8): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина + 50 нг/мл FGF7 в течение четырех дней (стадия 3), затем либоc. treatment 8 (T8): DMEM high glucose + 1% B27 + 0.25 μM cyclopamine-KAAD + 2 μM retinoic acid (RA) + 100 ng/ml Noggin + 50 ng/ml FGF7 for four days (stage 3 ), then either
d. обработка 9 (T9): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4), илиd. treatment 9 (T9): high glucose DMEM + 1% B27 + 100 ng/ml Noggin + 1 μM ALK5 II inhibitor + 20 nM PDBu for four days (step 4), or
e. обработка 10 (T10): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF10 + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4), илиe. treatment 10 (T10): high glucose DMEM + 1% B27 + 50 ng/ml FGF10 + 20 nM PDBu for four days (step 4), or
f. обработка 11 (T11): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 20 нМ PDBu + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 4).f. treatment 11 (T11): high glucose DMEM + 1% B27 + 20 nM PDBu + 100 ng/ml Noggin for four days (step 4).
Образцы культур отбирали в дублях на стадии 4, день 4, и получали их изображения с помощью анализатора IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания для каждой лунки снимали по 100 проекций. Для каждой лунки с использованием программного обеспечения IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare) измеряли общее количество клеток, общее количество клеток, экспрессирующих PDX1, общее количество клеток, экспрессирующих NKX6.1, и общее количество клеток, экспрессирующих CDX2. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общие количества клеток, экспрессирующих PDX 1, NKX6.1 и CDX-2, приведены в процентах от общей популяции клеток.Cultures were sampled in duplicate at step 4, day 4 and imaged using the IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). To compensate for possible cell loss during the analysis and subsequent staining procedures, 100 projections were taken for each well. Total cells, total PDX1 expressing cells, total NKX6.1 expressing cells, and total CDX2 expressing cells were measured for each well using IN Cell Developer Toolbox 1.7 software (GE Healthcare). For each repeated set of data, mean values and standard deviations were calculated. The total number of
В популяциях клеток, обработанных T7 с последующим добавлением среды T9, приблизительно 80% клеток в популяции экспрессировали NKX6.1. См. таблицу 2. В популяциях клеток, обработанных T7 с последующим добавлением среды T10, приблизительно 90% клеток экспрессировали NKX6.1, при этом в данном варианте обработки отмечали больше клеток, экспрессирующих CDX2. См. таблицу 2. Обработка популяций клеток T7 с последующей обработкой средой T11 приводила к популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 93% клеток в популяции экспрессировали NKX6.1. Большинство клеток популяций, экспрессирующих NKX6.1, также экспрессировали PDX1.In cell populations treated with T7 followed by the addition of T9 medium, approximately 80% of the cells in the population expressed NKX6.1. See Table 2. In cell populations treated with T7 followed by the addition of T10 medium, approximately 90% of the cells expressed NKX6.1, with more cells expressing CDX2 in this treatment. See Table 2. Treatment of populations of T7 cells followed by treatment with T11 medium resulted in a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, where 93% of the cells in the population expressed NKX6.1. Most of the cells in populations expressing NKX6.1 also expressed PDX1.
Культуры, обработанные T8 с последующей обработкой средой T9, формировали популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 56,7% клеток популяции экспрессировали NKX6.1. См. таблицу 2. Культуры, обработанные T8 с последующей обработкой средой T10, формировали популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 63,5% клеток популяции экспрессировали NKX6.1, после обработки отмечалось возрастание числа клеток, экспрессирующих CDX2. См. таблицу 2. Культуры, обработанные T8 с последующей обработкой средой Т11, формировали популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 74% клеток популяции экспрессировали NKX6.1. См. таблицу 2. Большинство экспрессирующих NKX6.1 клеток также экспрессировали PDX 1.Cultures treated with T8 followed by treatment with T9 medium formed a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, where 56.7% of the cells of the population expressed NKX6.1. See Table 2. Cultures treated with T8 followed by treatment with T10 medium formed a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, where 63.5% of the cells of the population expressed NKX6.1, after treatment, an increase in the number of cells expressing CDX2 was noted. See Table 2. Cultures treated with T8 followed by treatment with T11 medium formed a population of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage, where 74% of the cells of the population expressed NKX6.1. See Table 2. Most of the cells expressing NKX6.1 also expressed
ПЦР-анализ также подтвердил результаты, полученные на анализаторе IN Cell, в том что обработка ретиноевой кислотой, циклопамином и Ноггином на стадии 3 с последующим добавлением активатора PKC на стадии 4 на день 4 стадии 4 приводила к повышению уровней мРНК для NKX6.1 и PTF1 альфа (фиг. 5A-5D).PCR analysis also confirmed the results obtained on the IN Cell analyzer in that treatment with retinoic acid, cyclopamine and Noggin at step 3 followed by the addition of PKC activator at step 4 on day 4 of step 4 led to an increase in mRNA levels for NKX6.1 and PTF1 alpha (FIGS. 5A-5D).
Все цитируемые в настоящем документе публикации полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Хотя различные аспекты настоящего изобретения проиллюстрированы выше путем ссылки на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что сущность настоящего изобретения ограничивается не указанным выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.All publications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety. While various aspects of the present invention have been illustrated above by reference to examples and preferred embodiments, it is intended that the subject matter of the present invention be limited not by the above description, but by the following claims, drafted in accordance with the principles of patent law.
Claims (45)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33383110P | 2010-05-12 | 2010-05-12 | |
| US61/333,831 | 2010-05-12 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016118225A Division RU2663339C1 (en) | 2010-05-12 | 2011-05-11 | Differentiation of human embryo stem cells |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2022127146A Division RU2805433C1 (en) | 2010-05-12 | 2022-10-19 | Differentiation of human embryonic stem cells |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018120334A RU2018120334A (en) | 2019-12-02 |
| RU2018120334A3 RU2018120334A3 (en) | 2022-04-07 |
| RU2782271C2 true RU2782271C2 (en) | 2022-10-25 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002002750A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Amcyte, Inc. | Culturing pancreatic stem cells having a specified, intermediate stage of development |
| RU2006142742A (en) * | 2004-05-05 | 2008-06-10 | Новартис Форшунгсстифтунг, Цвайгнидерлассунг Фридрих Мишер Институте Фор Биомедикал Рисеч (Ch) | METHOD FOR DIFFERENTIATION OF NEURAL CELLS FROM EMBRYONAL STEM (ES) CELLS |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002002750A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Amcyte, Inc. | Culturing pancreatic stem cells having a specified, intermediate stage of development |
| RU2006142742A (en) * | 2004-05-05 | 2008-06-10 | Новартис Форшунгсстифтунг, Цвайгнидерлассунг Фридрих Мишер Институте Фор Биомедикал Рисеч (Ch) | METHOD FOR DIFFERENTIATION OF NEURAL CELLS FROM EMBRYONAL STEM (ES) CELLS |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHEN et al., A small molecule that differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage, Nat Chem Biol, 2009, 5(4), pp. 258-65, doi:10.1038/nchembio.154. CAI et al., Generation of homogeneous PDX1+ pancreatic progenitors from human ES cell-derived endoderm cells, Journal of Molecular Cell Biology, Vol. 2, Is. 1, 2010, pp. 50-60, doi:10.1093/jmcb/mjp037. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7149190B2 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
| US20200291360A1 (en) | Use of noggin, an alk5 inhibitor and a protein kinase c activator, to produce endocrine cells | |
| EP2456858B1 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
| KR102058901B1 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
| RU2805433C1 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
| RU2782271C2 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
| AU2018202016B2 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
| US20230151332A1 (en) | Methods for making insulin in vivo |