RU2776889C1 - Method for the quantitative determination of selectively bound disease marker proteins in planar cells of a biochip and a device for its implementation - Google Patents
Method for the quantitative determination of selectively bound disease marker proteins in planar cells of a biochip and a device for its implementation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2776889C1 RU2776889C1 RU2021130432A RU2021130432A RU2776889C1 RU 2776889 C1 RU2776889 C1 RU 2776889C1 RU 2021130432 A RU2021130432 A RU 2021130432A RU 2021130432 A RU2021130432 A RU 2021130432A RU 2776889 C1 RU2776889 C1 RU 2776889C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biochip
- biological
- radiation
- immobilized
- fluorescence
- Prior art date
Links
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 91
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 91
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 91
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 34
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 11
- 230000003287 optical Effects 0.000 claims description 10
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 8
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N Carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004698 Polyethylene (PE) Substances 0.000 claims description 2
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 claims description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 claims description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 2
- 230000003100 immobilizing Effects 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 17
- 229920002395 Aptamer Polymers 0.000 description 12
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 description 10
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 description 8
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 7
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 7
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 7
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 5
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 5
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 4
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 4
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 208000010125 Myocardial Infarction Diseases 0.000 description 3
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229910052950 sphalerite Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052984 zinc sulfide Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 2
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000575 proteomic Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 1
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000036913 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 102000034387 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006031 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002032 lab-on-a-chip Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004377 microelectronic Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002120 photoresistant polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 229910052904 quartz Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 238000004450 types of analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к аналитическому и медицинскому приборостроению, биоинженерии, биофизике, биохимии, молекулярной биологии, клинической биохимии, а именно к области химического анализа биологических материалов, и может быть использовано при исследовании жидких биологических и медицинских проб. Наиболее эффективно использовать при экспресс-диагностике заболеваний в составе миниатюрных аналитических устройств - биочипов или лабораторий-на-чипе (а также биологических микрочипов), в лабораторных и полевых условиях, в приборах для диагностики на месте оказания помощи (Point-of-Care Testing, POCT) и в соответствующих телеметрических системах.The invention relates to analytical and medical instrumentation, bioengineering, biophysics, biochemistry, molecular biology, clinical biochemistry, namely the field of chemical analysis of biological materials, and can be used in the study of liquid biological and medical samples. It is most effective to use in the rapid diagnosis of diseases as part of miniature analytical devices - biochips or laboratories-on-a-chip (as well as biological microchips), in laboratory and field conditions, in devices for diagnostics at the point of care (Point-of-Care Testing, POCT) and related telemetry systems.
Наиболее перспективным направлением развития аналитических средств нового поколения, способных реализовать экспресс-мультипараметрическую биомедицинскую диагностику, и имеющих потенциал развития в экспертные системы, представляется применение принципов протеомики, фотоники, технологии формирования микро- и наноструктур, химии поверхности. Одной из реализаций такого подхода являются диагностические биочипы (также биологические микрочипы, лаборатории-на-чипе), в частности, реализованные на принципах протеомики, т.е. на основе использования явлений специфического молекулярного распознавания и связывания олигопептида и белка-маркера.The most promising direction in the development of new generation analytical tools capable of implementing express multiparametric biomedical diagnostics and having the potential to develop into expert systems is the application of the principles of proteomics, photonics, technologies for the formation of micro- and nanostructures, and surface chemistry. One of the implementations of this approach is diagnostic biochips (also biological microchips, laboratories-on-a-chip), in particular, implemented on the principles of proteomics, i.e. based on the use of the phenomena of specific molecular recognition and binding of the oligopeptide and marker protein.
Анализ биологических жидкостей с целью поиска белков-маркеров с помощью технологии биочипов, включает стадии экспонирования биологических проб на биочипе с целью связывания белков-маркеров из жидкой пробы на поверхности с иммобилизованными пептидными лигандами и затем количественное определение связанных белков-маркеров. Для осуществления последнего, в большинстве случаев, применяют предварительное или в реальном времени присоединение меток к белкам-маркерам, так, чтобы можно было определить их свечение в заданной области спектра. Данная процедура является дорогостоящей, трудоемкой и длительной. Можно даже сказать, что процедура присоединения меток является лимитирующей стадией процесса.The analysis of biological fluids in order to search for marker proteins using biochip technology includes the steps of exposing biological samples on a biochip in order to bind marker proteins from a liquid sample on the surface with immobilized peptide ligands and then quantify the associated marker proteins. To implement the latter, in most cases, preliminary or real-time attachment of labels to marker proteins is used, so that their luminescence in a given region of the spectrum can be determined. This procedure is expensive, time consuming and time consuming. It can even be said that the procedure for attaching labels is the limiting stage of the process.
Известны автоматические и полуавтоматические инструментальные способы обнаружения белков-маркеров в биологических жидкостях, они включают жидкостную хроматографию (Determination of myoglobin in human serum by high-performance liquid chromatography with chemiluminescence detection / V.G. Maltsev, T.M. Zimina [et al.] // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. – 1987. – Vol. 416, - P. 45-52), капиллярный электрофорез (Матричные пептидные биосенсорные системы на основе молекулярного распознавания для экспресс-диагностики заболеваний / А.И. Егоров, Т.М. Зимина [и др.] // Биотехносфера. - 2017. - № 3, с. 48-56) и другие методы, реализуемые с помощью стационарных приборов, однако они являются длительными и централизованными. Automatic and semi-automatic instrumental methods for detecting marker proteins in biological fluids are known, they include liquid chromatography (Determination of myoglobin in human serum by high-performance liquid chromatography with chemiluminescence detection / V.G. Maltsev, T.M. Zimina [et al.] // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. - 1987. - Vol. 416, - P. 45-52), capillary electrophoresis (Matrix peptide biosensor systems based on molecular recognition for express diagnostics of diseases / A.I. Egorov, T.M. Zimina [et al.] // Biotechnosphere - 2017. - No. 3, pp. 48-56) and other methods implemented using stationary devices, however, they are lengthy and centralized.
Достижения технологий микроэлектроники, микросистемной техники и принципы миниатюризации в инструментальном анализе открыли возможности развития нового поколения технических средств - микроаналитических систем, называемых также: μ-TAS, lab-on-a-chip (лаборатории-на-чипе), биочипы, биологические микрочипы, микрофлюидные системы и др. (Manz, A. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing / A. Manz, N. Graber, H.M. Widmer // Sensors and Actuators. B.1. - 1990. Vol. 1, Р. 244-248; Зимина Т.М. Интегральные капиллярные сепарационные микросистемы для химического анализа / Т.М. Зимина // Петербургский журнал электроники. – 2000, № 3-4, с. 79-91). Представляя собой миниатюрные устройства, изготовленные с помощью планарных и гибридных технологий, такие системы предназначены для проведения различного рода химических и биомедицинских анализов. Они позволяют повысить производительность при осуществлении биомедицинского анализа. Разработка микроаналитических систем позволяет также решать задачи снижения стоимости, материало- и энергоемкости изделий. Эти усовершенствования возможны благодаря формированию таких устройств с помощью микро- и нанотехнологий, позволяющих реализовывать прецизионную геометрию, обеспечивающую возможность геометрической комплементарности компонентов на молекулярном уровне, повышение скорости анализа без дополнительных затрат, управление массопереносом и автоматическое регулирование в микромасштабе стадий аналитического процесса в интегрированных функциональных модулях и подсистемах. Перенос биологических объектов в таких системах может осуществляться с помощью проточного анализа, с использованием принципов микрофлюидики. Усовершенствование способов традиционного биохимического анализа, а также биочипов и методов регистрации селективно-связанных белков-маркеров заболеваний в биочипах, может быть осуществлено именно с использованием технологий микро- и наноэлектроники.Achievements in microelectronics technology, microsystem technology and the principles of miniaturization in instrumental analysis have opened up the possibility of developing a new generation of technical means - microanalytical systems, also called: μ-TAS, lab-on-a-chip (laboratories-on-a-chip), biochips, biological microchips, microfluidic systems, etc. (Manz, A. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing / A. Manz, N. Graber, H.M. Widmer // Sensors and Actuators. B.1. - 1990. Vol. 1, P. 244-248; Zimina T.M. Integral capillary separation microsystems for chemical analysis / T.M. Zimina // Petersburg Journal of Electronics. - 2000, No. 3-4, pp. 79-91). Representing miniature devices manufactured using planar and hybrid technologies, such systems are designed for various types of chemical and biomedical analyses. They allow you to increase productivity in the implementation of biomedical analysis. The development of microanalytical systems also makes it possible to solve the problems of reducing the cost, material and energy consumption of products. These improvements are made possible by the formation of such devices using micro- and nanotechnologies that allow the implementation of precision geometry that allows the geometric complementarity of components at the molecular level, increased analysis speed without additional costs, mass transfer control and microscale automatic control of the stages of the analytical process in integrated functional modules and subsystems. The transfer of biological objects in such systems can be carried out using flow analysis, using the principles of microfluidics. Improvement of methods of traditional biochemical analysis, as well as biochips and methods for registration of selectively associated protein markers of diseases in biochips, can be carried out using micro- and nanoelectronics technologies.
Среди первых описаний анализа с помощью биочипа, известен биочип на основе олигонуклеотидных лигандов, ковалентно-присоединенных к твердой подложке в виде топологически кодированных площадок (Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip: МПК C07B 61/00; C12M 1/00; C12N 15/09; C12Q 1/68; G01N 33/53; G01N 33/566; G01N 37/00/ Gold L., Zichi D. PCT/US98/26515 (1998-12-14)). Каждый лиганд на основе нуклеиновой кислоты специфически и активно связывается с конкретной молекулой-мишенью, содержащейся в тестируемой биологической жидкости, включая белки. Контакт тестируемой биологической жидкости с биочипом приводит к связыванию молекулы-мишени (преимущественно, белка-маркера) с родственным ей лигандом на основе олигонуклеотида. При этом молекулы-мишени должны содержать реагент, ковалентно присоединенный к ним и позволяющий распознавать их после присоединения к биочипу. Альтернативно, биочип может вступать в контакт с реагентами (после присоединения к нему молекул-мишеней), ковалентно реагирующими с присоединенными молекулами-мишенями (в частности, белками-маркерами), позволяющими обнаружить каждую из таких молекул-мишеней в тестируемой жидкости по соответствующему адресу на биочипе.Among the first descriptions of biochip analysis, a biochip based on oligonucleotide ligands covalently attached to a solid support in the form of topologically encoded pads is known (Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip: IPC C07B 61/00;
В данном методе впервые использовался принцип пространственного распознавания белков цепью олигонуклеотида (аптамера – термин введен авторами патента), но для детектирования применяют реагенты (метки), ковалентно присоединяемые к белкам, что делает анализ сложным и дорогим. Кроме того, отмечается недостаточно высокая селективность олигонуклеотидных аптамеров, связанная с жесткостью их цепи (Kalra P., A. Simple Methods and Rational Design for Enhancing Aptamer Sensitivity and Specificity / P. Kalra, W. Dhiman [et al.] // Front Mol Biosci. – 2018. Vol. 5, P. 41). Отмечается, что аптамеры – структурированные молекулы нуклеиновых кислот, в принципе, могут связывать молекулярные мишени с высокой афинностью и специфичностью. Однако известные аптамеры, полученные методом SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), могут и не демонстрировать необходимую аффинность и специфичность.This method was the first to use the principle of spatial recognition of proteins by an oligonucleotide chain (aptamer - the term was introduced by the authors of the patent), but reagents (labels) covalently attached to proteins are used for detection, which makes the analysis complicated and expensive. In addition, there is an insufficiently high selectivity of oligonucleotide aptamers associated with the rigidity of their chain (Kalra P., A. Simple Methods and Rational Design for Enhancing Aptamer Sensitivity and Specificity / P. Kalra, W. Dhiman [et al.] // Front Mol Biosci. - 2018. Vol. 5, P. 41). It is noted that aptamers, which are structured nucleic acid molecules, can, in principle, bind molecular targets with high affinity and specificity. However, the known aptamers obtained by the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) method may not demonstrate the required affinity and specificity.
Более высокую аффинность и специфичность при связывании белков-маркеров могут проявлять пептидные аптамеры, или олигопептидные фрагменты. Именно такой механизм молекулярного биораспознавания реализован в живой природе, поскольку олигопептидные цепи обладают более высокой гибкостью, а следовательно, способны сформировать пространственные структуры более высокой сложности и размерности (Parker B.W., Mapping low-affinity/high-specificity peptide–protein interactions using ligand-footprinting mass spectrometry / B.W. Parker, E.J. Goncz [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences – 2019. Vol. 116 (42), P. 21001-21011). Peptide aptamers or oligopeptide fragments can exhibit higher affinity and specificity in binding marker proteins. It is this mechanism of molecular biorecognition that is implemented in nature, since oligopeptide chains are more flexible and, therefore, are able to form spatial structures of higher complexity and dimension (Parker B.W., Mapping low-affinity/high-specificity peptide–protein interactions using ligand-footprinting mass spectrometry / B.W. Parker, E.J. Goncz [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences - 2019. Vol. 116 (42), P. 21001-21011).
Известен способ обнаружения белка-маркера инфаркта миокарда с помощью биочипа применимого в портативной системе (POCT) (Biochip for detecting myocardial infarction marker, and detection method applying same. B01L 3/00; G01N 35/00. CN109061207 (A) ZHANG Y. 2018). Биочип представляет собой подложку и участки с антителами, иммобилизованными на этой подложке, причем антитела могут образовывать иммунный комплекс с антигеном, конъюгированным с магнитными частицами, и маркерным белком, и сложный агрегат магнитных частиц будет образовываться на биосенсоре, покрытом участками с антителами, когда образец крови содержит белок-маркер инфаркта миокарда. Регистрация иммобилизованных белков-маркеров осуществляется путем измерения магнитного поля, генерируемого магнитными микрочастицами. Таким образом, изобретение обеспечивает способ обнаружения белков-маркеров с помощью биочипа, что сокращает объем пробы и время диагностики до 15 - 20 минут. Данный способ, предполагает использование белков - антител, являющихся лабильными веществами, требующими специальных условий хранения, пробоподготовки, заключающейся во внесении конъюгатов с магнитными частицами в биопрепараты, которые вследствие диффузионных ограничений затруднительно использовать в системах более высокой размерности. A known method for detecting myocardial infarction marker protein using a biochip applicable in a portable system (POCT) (Biochip for detecting myocardial infarction marker, and detection method applying same.
Близкий к описанному выше способ описан для микрофлюидного биочипа с магнитными частицами для анализа четырех маркеров воспаления, который также относится к формату POCT диагностики (Magnetic particle microfluidic biochip for four inflammation markers and detection method. B01L 3/00; G01N 33/68, CN108722507 (A), ZHANG Y. 2018). Описанный биочип содержит биосенсор также на основе антител и использует конъюгат на основе антител, связанных с магнитными частицами. Концентрация белка – маркера заболевания, определяется по интенсивности сигнала магнитного сопротивления комплекса в биочипе. Способ разработан для четырех маркеров воспаления: PCT, IL-6, CRP и SAA. Данный способ обладает такими же недостатками, как и предыдущий, но с технической точки зрения ближе к заявляемому способу, так как в нем используется микрофлюидный перенос вещества. A method similar to that described above is described for a magnetic particle microfluidic biochip for four inflammation markers and detection method.
Апатамеры создали альтернативу применению антител в анализе биомаркеров (Nimjee S.M. Aptamers: an emerging class of therapeutics / S.M. Nimjee, C.P. Rusconi, B.A. Sullenger // Rev Med. – 2005. Vol. 56, P. 555–583).Apatamers have created an alternative to the use of antibodies in the analysis of biomarkers (Nimjee S.M. Aptamers: an emerging class of therapeutics / S.M. Nimjee, C.P. Rusconi, B.A. Sullenger // Rev Med. - 2005. Vol. 56, P. 555–583).
Так, известен биочип, содержащий биораспознающие лиганды в виде пептида, комплементарного к холерному токсину и специфически присоединяющий его (The peptide probes high specific and high selective for target biomarker and the biochip for clinical prediction of Vibrio cholera toxin. KR20170009047 (A) PARK J. P., LIM J. M. - 2017). Однако данное изобретение описывает способ, в котором регистрация иммобилизованного в биочипе биомаркера, осуществляется с применением флюорофора, конъюгированного с иммуноглобулином и биотином. Подобные способы, различающиеся химической структурой пептидных аптамеров, описаны в ряде патентов (KR101657881 (B1) 2016-09-19; KR20160111202 (A) 2016-09-26; KR101732787 (B1) 2017-05-08; KR101641825 (B1) 2016-07-2), в которых также не предусмотрена возможность прямой регистрации иммобилизованных белков-маркеров.Thus, a biochip is known that contains biorecognizing ligands in the form of a peptide complementary to cholera toxin and specifically attaching it (The peptide probes high specific and high selective for target biomarker and the biochip for clinical prediction of Vibrio cholera toxin. KR20170009047 (A) PARK J. P., LIM J. M. - 2017). However, this invention describes a method in which registration of a biomarker immobilized in a biochip is carried out using a fluorophore conjugated with immunoglobulin and biotin. Similar methods that differ in the chemical structure of peptide aptamers are described in a number of patents (KR101657881 (B1) 2016-09-19; KR20160111202 (A) 2016-09-26; KR101732787 (B1) 2017-05-08; KR101641825 (B1) 2016-2016- 07-2), which also do not provide for the possibility of direct registration of immobilized marker proteins.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ анализа взаимодействий между молекулами, флуоресцирующими в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне, включая белки, последовательность которых содержит один или несколько аминокислотных остатков триптофана (Trp) и биологическими молекулами, иммобилизованными в ячейках биологического микрочипа (биочипа), в ходе которого регистрируются взаимодействия на основе измерения интенсивности флуоресценции, возбуждаемой в УФ диапазоне спектра. (Способ и устройство для анализа взаимодействий биологических молекул на биологическом микрочипе на основе флуоресценции аминокислотных остатков триптофана. G01N 33/52. RU2588816). Технический результат обеспечивает возможность избежать использования флуоресцентных меток на белках-мишенях для регистрации связывания. Способ осуществляется с использованием биочипа, содержащего лиганды, закрепленные на топологически кодированных площадках твердой подложки. Исследуемая проба биологической жидкости, содержащая белки-маркеры, наносится на подложку и лиганды биочипа взаимодействуют с жидкой пробой, содержащей белки-маркеры, содержащие один или более аминокислотных остатков триптофана (Trp). Интенсивность флуоресценции белков-маркеров на биочипе измеряют в УФ области спектра (300-350 нм) с помощью специализированного настольного анализатора биочипов, приспособленного для работы в УФ диапазоне (возбуждение 250-300 нм, флуоресценция 300-400 нм). Это позволяет исключить использование флуоресцентных меток для регистрации связывания. В качестве анализатора изображения биочипа в данном методе можно использовать флуоресцентный микроскоп с кварцевой оптикой, который оснащен источником ультрафиолетового излучения (например, газоразрядной лампой, излучающей в области 250-300 нм), набором фильтров и фотоприемником, позволяющим регистрировать испускаемое объектом излучение в диапазоне длин волн 300-400 нм, или сканер, позволяющий регистрировать флуоресценцию в области 300-400 нм при возбуждении в области 250-300 нм.Closest to the claimed method is a method for analyzing interactions between molecules that fluoresce in the ultraviolet (UV) range, including proteins, the sequence of which contains one or more amino acid residues of tryptophan (Trp) and biological molecules immobilized in the cells of a biological microchip (biochip), during which registers interactions based on measuring the intensity of fluorescence excited in the UV range of the spectrum. (Method and device for analyzing the interactions of biological molecules on a biological microchip based on the fluorescence of amino acid residues of tryptophan.
Основными недостатками прототипа являются:The main disadvantages of the prototype are:
1. Сложность конструкции, содержащей большое количество дорогостоящих элементов, включая светофильтры, кварцевое стекло, газоразрядную лампу. Все это делает невозможным применение метода в формате мобильного устройства (point-of-care testing, POCT). 1. The complexity of the design, containing a large number of expensive elements, including light filters, quartz glass, gas discharge lamp. All this makes it impossible to use the method in the format of a mobile device (point-of-care testing, POCT).
2. Флюоресценция в диапазоне 300 – 400 нм, требует применения специализированных средств регистрации изображения, что делает способ более дорогостоящим и снижает его доступность в медицинской практике. 2. Fluorescence in the range of 300 - 400 nm requires the use of specialized imaging tools, which makes the method more expensive and reduces its availability in medical practice.
3. Загрузка пробы осуществляется ручным методом путем полива пробы на поверхность чипа, или погружения чипа в жидкий раствор пробы. Это снижает воспроизводимость результатов метода, делает его более трудоемким и повышает объем пробы биологической жидкости.3. Sample loading is carried out manually by pouring the sample onto the surface of the chip, or immersing the chip in a liquid sample solution. This reduces the reproducibility of the results of the method, makes it more laborious and increases the volume of the biological fluid sample.
Задачей заявляемого способа является получение технического результата, заключающегося в упрощении процедуры анализа взаимодействий биологических молекул на биологическом микрочипе (биочипе) для количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний. Кроме того, заявляемый способ решает задачу использования его в приборах класса POCT и в лабораториях-на-чипе, а также возможность автоматизации процедуры ввода пробы.The objective of the proposed method is to obtain a technical result, which consists in simplifying the procedure for analyzing the interactions of biological molecules on a biological microchip (biochip) for the quantitative determination of selectively linked protein markers of diseases. In addition, the proposed method solves the problem of using it in POCT class devices and in laboratories-on-a-chip, as well as the possibility of automating the sample injection procedure.
Данный технический результат достигается тем, что в способе количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа обеспечивают взаимодействие исследуемой биологической жидкости, содержащей белки-маркеры, с биологическими молекулами (лигандами), иммобилизованными в планарных ячейках биочипа, по уровню флуоресценции иммобилизованных белков-маркеров при возбуждении УФ излучением. Причем процесс селективного связывания белков-маркеров проводят в потоке исследуемой биологической жидкости, в микрофлюидной системе биочипа, содержащей планарные ячейки с иммобилизованными биологическими лигандами, а после прохождения всего объема пробы биологической жидкости через микрофлюидную систему биочипа ее промывают биологическим буферным раствором с низкой ионной силой, характеризующимся отсутствием остаточной флюоресценции при возбуждении ультрафиолетовым излучением, затем биочип освещают ультрафиолетовым излучением в диапазоне 260 – 280 нм, при этом вторичное излучение флюоресценции белка в диапазоне 300 – 350 нм направляют через стеклянную подложку, являющуюся одновременно оптическим фильтром, на слой люминофора нанесенный на его внешнюю поверхность, после чего измеряют интегральную интенсивность светового потока, излучаемого люминофором в диапазоне 450 – 550 нм, и в зависимости от ее уровня определяют количество белков-маркеров на основе калибровочной зависимости для конкретного белка-маркера..This technical result is achieved by the fact that in the method for quantitative determination of selectively bound protein markers of diseases in the planar cells of the biochip, interaction of the studied biological fluid containing protein markers with biological molecules (ligands) immobilized in the planar cells of the biochip is provided, according to the level of fluorescence of the immobilized proteins -markers when excited by UV radiation. Moreover, the process of selective binding of marker proteins is carried out in the flow of the studied biological fluid, in the microfluidic system of the biochip containing planar cells with immobilized biological ligands, and after passing the entire volume of the sample of the biological fluid through the microfluidic system of the biochip, it is washed with a biological buffer solution with a low ionic strength, characterized by the absence of residual fluorescence upon excitation with ultraviolet radiation, then the biochip is illuminated with ultraviolet radiation in the range of 260–280 nm, while the secondary protein fluorescence radiation in the range of 300–350 nm is directed through a glass substrate, which is also an optical filter, onto the phosphor layer deposited on its outer surface , after which the integral intensity of the light flux emitted by the phosphor in the range of 450–550 nm is measured, and, depending on its level, the amount of marker proteins is determined based on the calibration dependence for con specific marker protein.
В способе количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа проводят заполнение микрофлюидной системы биочипа исследуемой биологической жидкостью при скорости потока 0,1 – 1,0 мм × с-1, в процессе которого благодаря диффузионной подвижности белки-маркеры приближаются к поверхности ячеек, содержащих иммобилизованные биологические молекулы (олигопептиды), пространственная конфигурация которых обеспечивает накопление белка-маркера в ячейках биочипа, а также полноту связывания белка-маркера с биологическими молекулами, иммобилизованными в ячейках биочипа, за счет снижения диффузионных ограничений при поперечной подвижности белков-маркеров в потоке в микрофлюидном канале, и тем самым повышает чувствительность метода. Объем биологической жидкости составляет от 10 мкл до 1 мл. После прохода всего объема биологической жидкости систему промывают биологическим буфером с низкой ионной силой, и не характеризующимся остаточной флюоресценцией при возбуждении ультрафиолетовым излучением. Например, таким буфером может быть 0,01 мол × л-1 ацетат натрия, pH 7. Непосредственно после этого канал с ячейками освещают ультрафиолетовым излучением, как правило, в диапазоне 260 - 280 нм, через герметизирующую поверхность, прозрачную в ультрафиолетовом диапазоне излучения, а именно при длинах волн 260 – 280 нм, при этом связанный белок-маркер поглощает ультрафиолетовое излучение, а его ароматические компоненты, например аминокислота триптофан, флюоресцируют в диапазоне 300-350 нм, причем флюоресценция распространяется по всем направлениям в пределах 4π стерадиан, а часть ее в пределах апертуры приема порядка π – π/2 стерадиан, определяемой оптическим окном (или системой окон), проходит сквозь стеклянную подложку, герметизирующую микрофлюидный канал со стороны, противоположной источнику излучения, и облучает слой люминофора, нанесенный на нее с противоположной от микрофлюидного канала стороны, который начинает излучать люминесценцию в области длин волн 450–550 нм, при этом первичное излучение УФ источника в значительной степени поглощается стеклянной подложкой и не влияет на уровень выходного излучения. Применение стеклянной подложки биочипа одновременно в качестве светофильтра, поглощающего первичное ультрафиолетовое излучение источника (в диапазоне 260-280 нм) позволяет существенно упростить процедуру позиционирования рабочей области биочипа в апертуре приема оптической системы, а следовательно, упростить процедуру анализа. Использование слоя люминофора, нанесенного на противоположную от микрофлюидного канала сторону стеклянной подложки, обеспечивает смещение полосы вторичного излучения в область спектральной чувствительности типовых видеосенсоров, включая веб-камеры. Интегральная интенсивность светового потока, излучаемого люминофором, сопряженным геометрически с площадкой, содержащей лиганды, прямо пропорциональна количеству белка-маркера, иммобилизованного лигандами вследствие их взаимодействия с белком–маркером. Данную зависимость интенсивности светового потока от количества белка-маркера получают путем калибрования системы растворами белков в заданном диапазоне концентраций. Это позволяет осуществлять калибровку системы для каждого конкретного белка-маркера и определять его количество в пробе.In the method for quantitative determination of selectively bound protein markers of diseases in the planar cells of a biochip, the microfluidic system of the biochip is filled with the studied biological fluid at a flow rate of 0.1–1.0 mm × s -1 , during which, due to diffusion mobility, marker proteins approach the surface cells containing immobilized biological molecules (oligopeptides), the spatial configuration of which ensures the accumulation of the marker protein in the cells of the biochip, as well as the completeness of the binding of the marker protein to the biological molecules immobilized in the cells of the biochip, by reducing diffusion restrictions with the transverse mobility of marker proteins in flow in the microfluidic channel, and thereby increases the sensitivity of the method. The volume of biological fluid is from 10 µl to 1 ml. After the passage of the entire volume of biological fluid, the system is washed with a biological buffer with low ionic strength, and not characterized by residual fluorescence when excited by ultraviolet radiation. For example, such a buffer may be 0.01 mol × l -1 sodium acetate,
Калибровочная зависимость представляет собой соотношение уровня интегральной интенсивности светового потока, регистрируемого фотоприемным устройством, и концентрации калибровочного белка-маркера, при котором минимальной концентрации искомого белка-маркера соответствует минимальному уровню флуоресценции, в пробе, сигнал от которой можно надёжно отличить от фона (см. Пример 3). The calibration dependence is the ratio of the level of the integrated intensity of the light flux recorded by the photodetector and the concentration of the calibration marker protein, at which the minimum concentration of the desired marker protein corresponds to the minimum level of fluorescence in the sample, the signal from which can be reliably distinguished from the background (see Example 3).
Совокупность признаков по п. 2 формулы, характеризующих способ, заключается в использовании в качестве биологических молекул (лигандов), иммобилизованных в планарных ячейках биочипа, пептидов или их производные. Достоинство этого признака заключается в том, что лиганды на основе пептидов или их производных обладают пространственной комплементарностью к конкретным белкам, вследствие чего они способны связываться с белками-маркерами с высокой степенью селективности и специфичности, а также в том, что поиск высокоселективных лигандов может быть проведен путем средств компьютерного моделирования, что позволяет обеспечить не только заданную их пространственную конфигурацию, но и химический состав.The set of features according to
Совокупность признаков по п. 3, характеризующих способ, заключается в использовании пептидов, иммобилизованных в планарных ячейках биочипа, не имеющих в своем составе ароматических аминокислот. Достоинство этого признака заключается в том, что, он позволяет обеспечить снижение фоновой флюоресценции, поскольку ароматические аминокислоты, в частности триптофан, вносят основной вклад в флуоресценцию белков-маркеров, что, в свою очередь, обеспечивает повышение чувствительности способа и расширение его динамического диапазона. The set of features according to
Совокупность признаков по п. 4, характеризующих способ, описывает измерение интегральной интенсивности светового потока, излучаемого люминофором, которое осуществляется с помощью видеосенсора, сопряженного геометрически с биочипом. Достоинство этого признака заключается в том, что он позволяет использовать для регистрации селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа наиболее распространенные и дешевые фотоприемные устройства (например, видеосенсоры на основе КМОП-матриц веб-камер) и реализовать функцию одновременное мультипараметрическое детектирование на всех ячейках биочипа.The set of features according to claim 4, characterizing the method, describes the measurement of the integral intensity of the light flux emitted by the phosphor, which is carried out using a video sensor that is geometrically coupled to the biochip. The advantage of this feature is that it makes it possible to use the most common and cheap photodetector devices (for example, video sensors based on CMOS webcam arrays) to detect selectively bound disease marker proteins in planar cells of a biochip and to implement the function of simultaneous multiparametric detection on all biochip cells.
Наиболее близким к заявляемому устройству является устройство для анализа белков в биологической жидкости c помощью биочипа и флюоресцентного детектирования (Fluorescent biochip diagnosis device. МПК G01N 33/50; G01N 33/533; H01L 27/146; H01L 31/10. CN101868727 (A). B. S. LEE BYOUNG. - 2010). Раскрыто флуоресцентное диагностическое устройство биочипа, включающее в себя: датчик изображения, имеющий множество фотодетекторов; и блок полосового фильтра, имеющий множество полосовых фильтров, сформированных на множестве фотодетекторов, при этом множество полосовых фильтров реализовано путем формирования рисунка наноструктуры в металлическом слое. Поскольку флуоресцентное диагностическое устройство с биочипом имеет небольшие оптические потери из-за короткого интервала между биочипом и фотодетектором, может быть обеспечена превосходная чувствительность. Кроме того, поскольку сигналы могут быть одновременно измерены путем комбинирования световых пучков с короткой длиной волны, используемых в качестве освещения, в зависимости от типа флуоресцентного белкового материала время диагностики могут быть уменьшены.Closest to the claimed device is a device for analyzing proteins in a biological fluid using a biochip and fluorescent detection (Fluorescent biochip diagnosis device.
Основным недостатком прототипного устройства является то, что оно усложняет осуществление анализа, поскольку флюоресценция белков в области 350-400 нм требует применения специальных моделей видеосенсоров. Кроме того, устройство содержит избыточное количество светофильтров. The main disadvantage of the prototype device is that it complicates the analysis, since the fluorescence of proteins in the region of 350-400 nm requires the use of special models of video sensors. In addition, the device contains an excessive number of light filters.
Задачей заявляемого изобретения является разработка устройства для осуществления способа количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа, последовательность которых содержит флюоресцирующие компоненты, например триптофан, позволяющего получить технический результат, заключающийся в повышении скорости анализа, его упрощении, миниатюризации и обеспечении возможности автоматизации, а также повышении надежности и жесткости конструкции и возможности применения в изделиях класса PОCT.The objective of the claimed invention is to develop a device for the implementation of a method for the quantitative determination of selectively bound protein markers of diseases in the planar cells of a biochip, the sequence of which contains fluorescent components, such as tryptophan, which makes it possible to obtain a technical result that consists in increasing the speed of analysis, its simplification, miniaturization and enabling automation. , as well as increasing the reliability and rigidity of the structure and the possibility of using it in products of the POCT class.
Технический результат достигается тем, что устройство для осуществления способа количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний содержит источник УФ излучения в диапазоне 260-280 нм и фотоприемное устройство. Причем оно содержит фотоприемное устройство в виде видеосенсора со светочувствительной матрицей в видимом диапазоне спектра, сопряженный с ним биочип, представляющий собой многослойное устройство, содержащее стеклянную подложку, прозрачную для излучения в видимом диапазоне спектра и предназначенную для поглощения значительной части первичного УФ излучения, расположенную на ней микрофлюидную систему, выполненную в виде слоя с рельефом каналов для жидкости, слой, герметизирующий микрофлюидные каналы, из УФ-прозрачного полимера, и слой люминофора, нанесенный на внешнюю поверхность стеклянной подложки, сопряженный с видеосенсором, а сторона подложки, обращенная в сторону микрофлюидной системы, выполнена с возможностью иммобилизации на ней биологических молекул (лиганд).The technical result is achieved by the fact that the device for carrying out the method for quantitative determination of selectively linked protein markers of diseases contains a source of UV radiation in the range of 260-280 nm and a photodetector. Moreover, it contains a photodetector device in the form of a video sensor with a photosensitive matrix in the visible range of the spectrum, a biochip associated with it, which is a multilayer device containing a glass substrate that is transparent to radiation in the visible range of the spectrum and is designed to absorb a significant part of the primary UV radiation, located on it. a microfluidic system made in the form of a layer with a relief of liquid channels, a layer sealing the microfluidic channels, made of a UV-transparent polymer, and a phosphor layer deposited on the outer surface of the glass substrate, conjugated with the video sensor, and the side of the substrate facing the microfluidic system, configured to immobilize biological molecules (ligand) on it.
Сущность заявляемого устройства заключается в том, что в устройстве для осуществления способа количественной регистрации связанных белков-маркеров содержится планарный биочип, представляющий собой сэндвич-структуру, состоящую из подложки, выполненной из стекла и покрытой слоем люминофора с наружной стороны, причем на внутренней стороне подложка содержит герметично закрепленный полимерный слой с рельефом микрофлюидных каналов. Данный слой герметизируется УФ-прозрачной пленкой, содержащей входное и выходное отверстия для жидкости. В микрофлюидной системе образуется проточная система, использование которой для загрузки и концентрирования жидких биопроб, позволяет повысить точность и чувствительность количественного анализа белков-маркеров, а также обеспечить возможности накопления целевого белка-маркера при контроле объема пробы, что повышает как точность, так и чувствительность анализа. На участках поверхности стеклянной подложки, граничащих с жидкостью, иммобилизованы пептиды, состоящие из 10 – 40 аминокислотных остатков и не имеющие в своем составе ароматических аминокислотных остатков, образующие пространственные конфигурации, обладающие комплементарностью к целевым белкам-маркерам, что обеспечивает снижение фоновой засветки в системе и повышение чувствительности и динамического диапазона регистрации белков-маркеров. Микрофлюидные каналы освещаются через УФ-прозрачный слой светодиодным источником излучения в диапазоне длин волн 260 – 280 нм, возбуждая флюоресценцию белков-маркеров в диапазоне 300 – 350 нм, которая проходит через стеклянную подложку биочипа и возбуждает люминесценцию люминофора в диапазоне 450-550 нм, которая попадает на поверхность фотоприемного устройства в виде видеосенсора со светочувствительной матрицей в видимом диапазоне спектра, при этом первичное УФ-излучение источника поглощается стеклянной подложкой. Применение люминофора в виде тонкого слоя, нанесенного на внешнюю поверхность стеклянной подложки, позволяет использовать наиболее распространенные и дешевые фотоприемные устройства (например, видеосенсоры на основе КМОП-матриц веб-камер), что позволяет упростить конструкцию устройства и дополнительно снизить стоимость устройства. Конфигурация оптической системы приема люминесценции реализована на основе сопряженной системы приема сигнала, т.е. сенсор геометрически сопряжен в пространстве с биочипом, а именно, с его стороной, которая покрыта люминофором, что позволяет повысить компактность устройства, чувствительность вследствие увеличения угла апертуры приема и жесткость конструкции, т.е. надежность и простоту настройки устройства.The essence of the proposed device lies in the fact that the device for carrying out the method for quantitative registration of bound proteins-markers contains a planar biochip, which is a sandwich structure consisting of a substrate made of glass and coated with a phosphor layer on the outside, and on the inside the substrate contains hermetically fixed polymer layer with a relief of microfluidic channels. This layer is sealed with a UV-transparent film containing the inlet and outlet for the liquid. A flow system is formed in the microfluidic system, the use of which for loading and concentrating liquid bioassays makes it possible to increase the accuracy and sensitivity of the quantitative analysis of marker proteins, as well as provide the possibility of accumulating the target marker protein while controlling the sample volume, which increases both the accuracy and sensitivity of the analysis. . Peptides consisting of 10–40 amino acid residues and not containing aromatic amino acid residues are immobilized on the surface areas of the glass substrate adjoining the liquid; increasing the sensitivity and dynamic range of registration of marker proteins. Microfluidic channels are illuminated through a UV-transparent layer with an LED radiation source in the wavelength range of 260–280 nm, exciting fluorescence of marker proteins in the range of 300–350 nm, which passes through the glass substrate of the biochip and excites phosphor luminescence in the range of 450–550 nm, which hits the surface of the photodetector in the form of a video sensor with a photosensitive matrix in the visible range of the spectrum, while the primary UV radiation of the source is absorbed by the glass substrate. The use of a phosphor in the form of a thin layer deposited on the outer surface of a glass substrate makes it possible to use the most common and cheap photodetector devices (for example, video sensors based on CMOS matrices of webcams), which makes it possible to simplify the design of the device and further reduce the cost of the device. The configuration of the optical system for receiving luminescence is implemented on the basis of a coupled signal receiving system, i.e. the sensor is geometrically conjugated in space with the biochip, namely, with its side, which is covered with a phosphor, which makes it possible to increase the compactness of the device, the sensitivity due to the increase in the receiving aperture angle, and the rigidity of the structure, i.e. reliability and ease of configuration of the device.
Совокупность признаков по п. 6 формулы характеризует устройство, в котором стеклянная подложка состоит из натриевого или боросиликатного стекла, стекла Крон-8, в том числе предметного стекла, покровного стекла, задерживающих возбуждающее флюоресценцию белков излучение источника в диапазоне 260-280 нм и одновременно пропускающих флуоресценцию белков в диапазоне 300-350 нм позволяет существенно сократить количество цветных светофильтров и упростить его конструкцию, а также дополнительно снизить стоимость устройства.The set of features according to
Совокупность признаков по п. 7 формулы характеризует устройство, в котором первичное излучение от источника УФ излучения в диапазоне 260-280 нм расположено с противоположной (180 град.) от приемника стороны биочипа, что возможно при использовании стеклянной подложки в качестве оптического окна/светофильтра, поглощающего УФ излучение. Достоинство этого признака устройства заключается в простоте юстировки оптической системы. The set of features according to
Совокупность признаков по п. 8 формулы характеризует устройство, в котором материалом герметизирующего слоя биочипа является УФ-прозрачный полимер, например, полиэтилена, полипропилена или кварцевого стекла. Достоинство данного признака заключается в обеспечении целостности микрофлюидной системы биочипа и пропускании возбуждающего флюоресценцию белков-маркеров УФ излучения в диапазоне 260-280 нм.The set of features according to
Изобретение поясняют следующие фигуры:The invention is illustrated by the following figures:
Фиг. 1 - Схема устройства для реализации способа количественного определения белков-маркеров в биологических жидкостях. Fig. 1 - Scheme of a device for implementing a method for the quantitative determination of marker proteins in biological fluids.
Фиг. 2 - Топология биочипа на примере топологии одноканального (37 ячеек) биочипа для анализа белков-маркеров в крови.Fig. 2 - Topology of the biochip on the example of the topology of a single-channel (37 cells) biochip for the analysis of marker proteins in the blood.
Фиг. 3 - Спектральные характеристики системы флюоресцентного детектирования белков-маркеров в биочипе с возбуждением их флюоресценции УФ-светодиодом на длине волны 2 с 80 нм и переизлучением флюоресценции белка в диапазоне 250 – 400 нм с помощью слоя люминофора с увеличением длины волны излучения, которую могут зарегистрировать фотоприемное устройство в виде видеосенсора со светочувствительной матрицей в видимом диапазоне спектра, например, КМОП-матрицы web-камер. Fig. 3 - Spectral characteristics of the system for fluorescent detection of marker proteins in a biochip with excitation of their fluorescence by a UV LED at a wavelength of 2 s 80 nm and re-emission of protein fluorescence in the range of 250 - 400 nm using a phosphor layer with an increase in the wavelength of radiation, which can be registered by a photodetector a device in the form of a video sensor with a photosensitive matrix in the visible range of the spectrum, for example, a CMOS matrix of web cameras.
Фиг. 4 - Спектральные характеристики элементов оптической схемы приема. Fig. 4 - Spectral characteristics of the elements of the optical reception scheme.
Фиг. 5 - Оценка интенсивности сигнала в фотоприемном устройстве в зависимости от времени накопления при регистрации флюоресценции бычьего сывороточного альбумина (БСА).Fig. 5 - Evaluation of the signal intensity in the photodetector, depending on the accumulation time when registering the fluorescence of bovine serum albumin (BSA).
Фиг. 6 - Изображение фрагмента рабочей зоны биочипа, заполненного Тропонином T при освещении УФ излучением без слоя люминофора (а) и со слоем люминофора толщиной 10 мкм (б).Fig. 6 - Image of a fragment of the working area of the biochip filled with Troponin T under UV illumination without a phosphor layer (a) and with a
Устройство (Фиг. 1) для осуществления способа содержит: 1 – слой люминофора, 2 – стеклянная подложка, 3 – слой микрофлюидной системы биочипа с рельефом каналов для жидкости, 4 – УФ-прозрачная пленка для герметизации слоя микрофлюидной системы, 5 – микрофлюидный канал, 6 – иммобилизованные пептиды - лиганды (аптамеры), 7 – белки-маркеры, 8 – УФ излучение, 9 – вход для жидкости, 10 – светодиодный источник УФ излучения, 11 – выход для жидкости, 12 – флюоресценция белков-маркеров, 13 – люминесценция люминофора, 14 – фотоприемное устройство (видеосенсор).The device (Fig. 1) for implementing the method contains: 1 - a layer of a phosphor, 2 - a glass substrate, 3 - a layer of a microfluidic system of a biochip with a relief of channels for a liquid, 4 - a UV-transparent film for sealing a layer of a microfluidic system, 5 - a microfluidic channel, 6 - immobilized peptides - ligands (aptamers), 7 - marker proteins, 8 - UV radiation, 9 - liquid inlet, 10 - LED source of UV radiation, 11 - liquid outlet, 12 - fluorescence of protein markers, 13 - luminescence phosphor, 14 - photodetector (video sensor).
Биочип (Фиг. 1) для осуществления способа содержит микрофлюидный канал 5, заполняемый жидкостью (например, плазмой крови), который образован стеклянной подложкой 2, слоем микрофлюидной системы биочипа 3, в котором сформирован рельеф каналов для жидкости в соответствии с заданной топологией, и герметизирующей крышкой 4. Наружная сторона стеклянной подложки 2 покрыта слоем люминофора 1 с заданными спектральными характеристиками поглощения и люминесценции. Внутренняя сторона стеклянной подложки, граничащая с жидкой пробой, содержит площадки с иммобилизованными пептидами 6. Жидкая проба поступает в биочип через входное отверстие 9 и элюируется по каналам биочипа с заданной скоростью, которая определяется кинетикой массообмена в диффузионно-ограниченном процессе сорбции в системе: поверхность с иммобилизованными пептидными аптамерами 6 – раствор белков, содержащий белки-маркеры 7. При элюировании жидкой пробы целевые белки–маркеры 7 заболеваний мигрируя около аптамеров присоединяются к ним, образуя комплексы. После прохождения полного объема пробы через каналы микрофлюидной системы 5 биочипа, его проточная система промывается водно-солевым буферным раствором. После промывки, система биочипа освещается УФ светодиодом с длиной волны 280 нм, возбуждая флюоресценцию белков, иммобилизованных на пептидных лигандах (аптамерах). Излучение от флуоресценции 12 белков частично проходя через стеклянную подложку попадает на слой люминофора 1, который люминесцирует 13 в видимой области спектра (450 – 550 нм), формируя изображение биочипа на сенсоре видеокамеры 14. The biochip (Fig. 1) for implementing the method contains a
Устройство (Фиг. 1) состоит из светодиодного источника УФ излучения (10) в диапазоне 260-280 нм, фотоприемного устройства (14) со светочувствительной матрицей в видимом диапазоне спектра (видеосенсора), и сопряженного с ним многослойного биочипа, состоит из подложки 2, выполненной из стекла, и покрытой слоем люминофора 1, слоя 3 микрофлюидной системы биочипа с рельефом каналов для жидкости, который может быть выполнен из пленочного фоторезиста, УФ-прозрачной пленки 4, герметизирующей микрофлюидные каналы 5. На участках поверхности слоя 2, граничащих с жидкостью, иммобилизованы пептиды 6, обладающие пространственной комплементарностью к целевым белкам-маркерам 7 и способностью их селективно связывать. Микрофлюидные каналы 5 освещаются излучением 8, светодиодного источника 10 в диапазоне длин волн 260 – 280 нм. Излучение 8, пропускается слоем 4 и падает на целевые белки, возбуждая флюоресценцию 10 их компонентов (например, ароматических аминокислот) в диапазоне 300 – 350 нм. Флюоресценция 12 пропускается стеклянной подложкой 2 биочипа и возбуждает люминесценцию 13 люминофора 1 в диапазоне 450 – 550 нм. При этом излучение 8 поглощается слоем 2 и не оказывает влияния на сигнал фотоприемного устройства 14. Излучение 13 попадает на поверхность фотоприемного устройства (видеосенсора) 14, например, КМОП-матрицы. The device (Fig. 1) consists of a LED source of UV radiation (10) in the range of 260-280 nm, a photodetector (14) with a photosensitive matrix in the visible range of the spectrum (video sensor), and a multilayer biochip associated with it, consists of a
На фиг. 2 показана топология биочипа с 37 ячейками: 9 – входной резервуар для пробы, 5 – микрофлюидный канал, 21 – ячейка для иммобилизации пептидов, 11 – выходной резервуар. Спектральные характеристики каскада переизлучения в устройстве показаны на Фиг. 3.In FIG. Figure 2 shows the topology of a biochip with 37 cells: 9 is an inlet sample reservoir, 5 is a microfluidic channel, 21 is a cell for peptide immobilization, and 11 is an output reservoir. The spectral characteristics of the re-emission stage in the device are shown in FIG. 3.
Оценка параметров работы устройства приведена в примере 1.The evaluation of the device operation parameters is given in example 1.
На фиг. 4 показаны спектральные характеристики элементов оптической схемы приема: спектры возбуждения (15) и флуоресценции (16) люминофора ZnS:Cu, спектр излучения ультрафиолетового светодиода (17), спектр флюоресценции Тропонина Т (18), спектры поглощения покровного стекла (19) и полипропиленовой пленки (20).In FIG. Figure 4 shows the spectral characteristics of the elements of the optical reception scheme: the excitation (15) and fluorescence (16) spectra of the ZnS:Cu phosphor, the emission spectrum of the ultraviolet LED (17), the fluorescence spectrum of Troponin T (18), the absorption spectra of the cover slip (19) and polypropylene film (twenty).
На фиг. 5 показана оценка интенсивности сигнала в фотоприемном устройстве в зависимости от времени накопления при регистрации флюоресценции бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 0,5 мг/мл в микрофлюидном канале биочипа в присутствии слоя люминофора на внешней поверхности окна (22) и без люминофора (23); (б) – зависимости интенсивности сигнала фотоприемника регистрации флюоресценции растворов БСА различных концентраций от времени накопления сигнала: 24 – 4,25 мг/мл, 25 – 2,125 мг/мл, 26 – 1,063 мг/мл, 27 – 0,531 мг/мл, 28 – 0,266 мг/мл, 29 – 0,133 мг/мл, 30 – 0,066 мг/мл, 31 – 0,033 мг/мл, 32 – 0,017 мг/мл, 33 – фосфатный буфер.In FIG. Figure 5 shows the evaluation of the signal intensity in the photodetector as a function of the accumulation time during the registration of fluorescence of bovine serum albumin (BSA) at a concentration of 0.5 mg/ml in the microfluidic channel of the biochip in the presence of a phosphor layer on the outer surface of the window (22) and without phosphor (23 ); (b) - Dependences of the signal intensity of the photodetector for recording fluorescence of BSA solutions of various concentrations on the time of signal accumulation: 24 - 4.25 mg/ml, 25 - 2.125 mg/ml, 26 - 1.063 mg/ml, 27 - 0.531 mg/ml, 28 - 0.266 mg/ml, 29 - 0.133 mg/ml, 30 - 0.066 mg/ml, 31 - 0.033 mg/ml, 32 - 0.017 mg/ml, 33 - phosphate buffer.
На Фиг. 6 концентрационная зависимость относительной величины сигнала фотоприемного устройства от флюоресценции Тропонина Т для чипа со слоем люминофора (34), где пунктирная линия (35) является линейной аппроксимацией полученной зависимости (в).On FIG. 6 shows the concentration dependence of the relative value of the photodetector signal on Troponin T fluorescence for a chip with a phosphor layer (34), where the dotted line (35) is a linear approximation of the obtained dependence (c).
Пример 1Example 1
Рассмотрим фрагмент биочипа: площадку с иммобилизованными пептидными лигандами (аптамерами) размером 100 мкм х 100 мкм. На площадке иммобилизованы пептиды с плотностью, например, 1 пептид на 1 нм2. Таким образом на площадке расположено 1010 пептидов. Гидродинамический размер белка, например, гемоглобина, составляет 9 нм, тогда максимальное число молекул белка-маркера, иммобилизованных на аптамерах составит 108. Если предположить, что белок содержит, по крайней мере, 1 ароматический аминокислотный остаток, например, триптофан, то площадка будет содержать 108 излучателей с квантовой эффективностью 90%, характерной для триптофана. Светодиод, имеющий мощность 1 мВт, излучает энергию 1 мДж в секунду или в апертуре одной площадки – 0,25 мкДж в секунду. При экспозиции в 60 с энергия падающего излучения составит 18 мкДж. Энергия фотона при длине волны 280 нм составляет 6,6.10-19 Дж. Значит за 60 с на площадку попадет максимально 2,73.1013 фотонов, а минимально 105 фотонов в случае, если будет связан один белок на площадке. Consider a fragment of a biochip: an area with immobilized peptide ligands (aptamers) 100 µm x 100 µm in size. On the site immobilized peptides with a density, for example, 1 peptide per 1 nm 2 . Thus, 1010 peptides are located on the site. The hydrodynamic size of a protein, for example, hemoglobin, is 9 nm, then the maximum number of marker protein molecules immobilized on aptamers will be 108. If we assume that the protein contains at least 1 aromatic amino acid residue, for example, tryptophan, then the site will contain 108 emitters with 90% quantum efficiency characteristic of tryptophan. An LED with a power of 1 mW emits an energy of 1 mJ per second, or in the aperture of one area - 0.25 μJ per second. With an exposure of 60 s, the energy of the incident radiation will be 18 μJ. The photon energy at a wavelength of 280 nm is 6.6.10-19 J. This means that in 60 s a maximum of 2.73.1013 photons will reach the site, and a minimum of 105 photons if one protein is bound on the site.
Если квантовая эффективность люминофора составляет 60%, то поток вторичного излучения флюоресценции белка при использовании микролинз может составить π/2 стерадиан или примерно 10% от полного объема энергии. Учитывая квантовую эффективность люминофора в 60% - энергия составит 6%. Таким образом максимальная энергия, излученная одной площадкой с аптамерами, которая может попасть на фотоприемник составляет порядка 1 мкДж. If the quantum efficiency of the phosphor is 60%, then the flux of secondary protein fluorescence when using microlenses can be π/2 steradians, or about 10% of the total energy. Considering the quantum efficiency of the phosphor at 60%, the energy will be 6%. Thus, the maximum energy emitted by one pad with aptamers, which can reach the photodetector, is about 1 μJ.
На фиг.3 показаны спектры возбуждения (15) и флуоресценции (16) люминофора ZnS:Cu, спектр излучения ультрафиолетового светодиода (17), спектр флюоресценции Тропонина Т (18), спектры поглощения покровного стекла (19) и полипропиленовой пленки (20).Figure 3 shows the excitation (15) and fluorescence (16) spectra of the ZnS:Cu phosphor, the emission spectrum of an ultraviolet LED (17), the fluorescence spectrum of Troponin T (18), the absorption spectra of the coverslip (19) and polypropylene film (20).
Пример 2Example 2
Сравнительное изображение флуоресценции бычьего сывороточного альбумина (БСА) в микрофлюидном канале без люминофора (Фиг. 5(а)) и со слоем люминофора перед КМОП-матрицей (Фиг.5(б)). Как видно из зависимости интенсивности флюоресценции от времени экспозиции (Фиг. 5(в)), применение люминофора ZnS:Cu в качестве переизлучающего слоя значительно повышает интенсивность принимаемого сигнала фотодетектора даже при небольших временах экспозиции. Наиболее ощутимое различие в значениях уровня принимаемого фотоприемником сигнала от флюоресценции белка можно наблюдать, начиная со времени экспозиции, равном 400 мс. Таким образом, накопление сигнала от естественной флуоресценции белка позволяет расширить динамический диапазон детектируемого сигнала. Comparative image of the fluorescence of bovine serum albumin (BSA) in a microfluidic channel without a phosphor (Fig. 5(a)) and with a phosphor layer in front of the CMOS array (Fig. 5(b)). As can be seen from the dependence of the fluorescence intensity on the exposure time (Fig. 5(c)), the use of the ZnS:Cu phosphor as a re-emitting layer significantly increases the intensity of the received photodetector signal even at short exposure times. The most noticeable difference in the level of the protein fluorescence signal received by the photodetector can be observed starting from the exposure time of 400 ms. Thus, the accumulation of a signal from the natural fluorescence of a protein makes it possible to expand the dynamic range of the detected signal.
Для установления времени экспозиции, оптимального для проведения измерений концентрации белка-маркера в пробе, получено семейство кривых для различных концентраций БСА, представленное на Фиг. 6(а). Полученное семейство кривых позволяет в явном виде проследить необходимость накопления входного сигнала с помощью варьирования времени экспозиции КМОП-матрицы. При малых временах экспозиции (<200 мс) наблюдается узкий динамический диапазон детектирования, что существенно понижает достоверность измерений. При времени экспозиции >1000 мс на больших значениях концентрации наблюдаются достаточно малые различия в интенсивности выходного сигнала, что может свидетельствовать о переизбытке накопленного сигнала. Поэтому оптимальным временем экспозиции для измерения концентрационной зависимости выходного сигнала представляется выбрать время 800 мс. Таким образом, подбор оптимального времени экспозиции позволяет расширить динамический диапазон детектирования системы.To establish the optimal exposure time for measuring the concentration of the marker protein in the sample, a family of curves for various concentrations of BSA was obtained, shown in Fig. 6(a). The resulting family of curves makes it possible to explicitly trace the need to accumulate the input signal by varying the exposure time of the CMOS matrix. At short exposure times (<200 ms), a narrow dynamic range of detection is observed, which significantly reduces the reliability of measurements. At an exposure time of >1000 ms, rather small differences in the intensity of the output signal are observed at high concentrations, which may indicate an excess of the accumulated signal. Therefore, the optimal exposure time for measuring the concentration dependence of the output signal seems to be 800 ms. Thus, the selection of the optimal exposure time makes it possible to expand the dynamic range of the system detection.
Пример 3 Example 3
Исследована чувствительность метода с применением КМОП-матрицы видеокамеры ToupCam 5.1MP. Вид рабочего окна биочипа без люминофора и с нанесенным люминофором в присутствии Тропонина Т в концентрации 0,8 мкг/мл, показаны на Фиг. 6(а) и (б), соответственно. Из Фиг. 6 (б) видно, что Тропонин Т при данной концентрации не излучает сигнал, регистрируемый КМОП-матрицей. Концентрационная зависимость относительной флуоресценции Тропонина Т в диапазоне концентраций от 6 до 1000 нг/мл. The sensitivity of the method was studied using the CMOS matrix of the ToupCam 5.1MP video camera. The view of the working window of the biochip without the phosphor and with the applied phosphor in the presence of Troponin T at a concentration of 0.8 μg/ml is shown in Fig. 6(a) and (b), respectively. From FIG. 6(b) shows that Troponin T at this concentration does not emit a signal recorded by the CMOS matrix. Concentration dependence of the relative fluorescence of Troponin T in the concentration range from 6 to 1000 ng/ml.
Относительные значения флуоресценции Fr на графике Фиг. 6 (в) рассчитывали следующим образом: Relative fluorescence values Fr in the graph of FIG. 6(c) was calculated as follows:
Fr = (FS-FB)/(FSmax-FB), (1)Fr = (FS-FB)/(FSmax-FB), (1)
где: FS – значение сигнала флуоресценции образца, FS – значение сигнала флуоресценции образца с максимальной измеренной концентрацией, FB – значение сигнала флуоресценции буферного раствора.where: FS is the fluorescence signal value of the sample, FS is the fluorescence signal value of the sample with the maximum measured concentration, FB is the fluorescence signal value of the buffer solution.
Зависимость на Фиг. 6(в) линейна в диапазоне концентраций Тропонина Т от 6 до 1000 нг/мл и удовлетворяет линейному уравнению; y = -0,3492x + 2,1027, c R2 = 0,9876. Предел обнаружения для Тропонина T составляет 6,0 ± 0,03 нг/мл. Dependency in Fig. 6(c) is linear in the range of Troponin T concentrations from 6 to 1000 ng/ml and satisfies the linear equation; y = -0.3492x + 2.1027, c R2 = 0.9876. The detection limit for Troponin T is 6.0 ± 0.03 ng/mL.
Исходя из данных на Фиг. 6 видно, что относительная флуоресценция возрастает с увеличением концентрации исследуемого белка-маркера. Таким образом, для численного определения концентрации исследуемого белка-маркера, например, Тропонина Т, с помощью разработанного способа, необходимо проводить калибровку устройства с целью установления предела обнаружения для конкретного белка-маркера.Based on the data in Fig. Figure 6 shows that the relative fluorescence increases with increasing concentration of the studied marker protein. Thus, in order to numerically determine the concentration of the studied marker protein, for example, Troponin T, using the developed method, it is necessary to calibrate the device in order to establish the detection limit for a particular marker protein.
Claims (8)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2776889C1 true RU2776889C1 (en) | 2022-07-28 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2588816C2 (en) * | 2014-01-31 | 2016-07-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method and apparatus for analysing interactions of biological molecules on biological microchip based on fluorescence of amino acid residues of tryptophan |
| RU197681U1 (en) * | 2018-04-27 | 2020-05-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Производственное Предприятие "Биочип" | Biochip for multiplex analysis |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2588816C2 (en) * | 2014-01-31 | 2016-07-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method and apparatus for analysing interactions of biological molecules on biological microchip based on fluorescence of amino acid residues of tryptophan |
| RU197681U1 (en) * | 2018-04-27 | 2020-05-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Производственное Предприятие "Биочип" | Biochip for multiplex analysis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЗИМИНА Т.М. ИНТЕГРАЛЬНЫЕ КАПИЛЛЯРНЫЕ СЕПАРАЦИОННЫЕ МИКРОСИСТЕМЫ ДЛЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА // Петербургский журнал электроники. Вып. 3-4, 2000, стр. 79-91. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104081207B (en) | For optics and the verifying attachment of electrochemical gaging | |
| ES2550004T3 (en) | High sensitivity system and troponin analysis methods | |
| CN102933968B (en) | Centrifugal micro-fluidic device and the method for immunoassay | |
| US20110306511A1 (en) | Methods for multiplex analyte detection and quantification | |
| CN104081210A (en) | Optical assay device with pneumatic sample actuation | |
| US20020081617A1 (en) | Fluorescence and FRET based assays for biomolecules on beads | |
| KR20070116615A (en) | Diagnostic test kits employing an internal calibration system | |
| JPH0521185B2 (en) | ||
| US20120316077A1 (en) | System And Method For Detection And Analysis Of A Molecule In A Sample | |
| JP2012127696A (en) | Analyzer and analyzing method | |
| JP4274944B2 (en) | Particle-based ligand assay with extended dynamic range | |
| JP2012523549A (en) | Apparatus and method for the verification and quantitative analysis of analytes, in particular mycotoxins | |
| US20150233907A1 (en) | Microfluidic chip for multi-analyte detection | |
| JP5946275B2 (en) | Test element with combined control and calibration zone | |
| JP4253695B2 (en) | Substance determination method and substance determination device | |
| JP2005510706A5 (en) | ||
| JP6073317B2 (en) | Optical device for assay execution | |
| JP2007501403A (en) | Optical fiber array biochip based on spectral change rule of white light reflection interference | |
| RU2776889C1 (en) | Method for the quantitative determination of selectively bound disease marker proteins in planar cells of a biochip and a device for its implementation | |
| US20160153978A1 (en) | Automated chemical analysis apparatus with integrated microfluidic microchip | |
| WO2007016665A2 (en) | Single use fluorescent assays for determination of analytes | |
| KR20130090174A (en) | A biosensor using quenching system and a method for detecting using thereof | |
| JP2005077396A (en) | Optical waveguide for analysis | |
| Petrou et al. | Silicon optocouplers for biosensing | |
| US20240125698A1 (en) | Gadget for measuring retroreflected signal |