RU2770818C1 - Method for isolating spermatozoa from the ejaculate of patients with impaired spermatogenesis for use in in vitro fertilization and/or cryopreservation programs - Google Patents
Method for isolating spermatozoa from the ejaculate of patients with impaired spermatogenesis for use in in vitro fertilization and/or cryopreservation programs Download PDFInfo
- Publication number
- RU2770818C1 RU2770818C1 RU2021127573A RU2021127573A RU2770818C1 RU 2770818 C1 RU2770818 C1 RU 2770818C1 RU 2021127573 A RU2021127573 A RU 2021127573A RU 2021127573 A RU2021127573 A RU 2021127573A RU 2770818 C1 RU2770818 C1 RU 2770818C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- centrifugation
- spermatozoa
- ejaculate
- minutes
- isolating
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
- A61B17/42—Gynaecological or obstetrical instruments or methods
- A61B17/425—Gynaecological or obstetrical instruments or methods for reproduction or fertilisation
- A61B17/435—Gynaecological or obstetrical instruments or methods for reproduction or fertilisation for embryo or ova transplantation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктологии, андрологии и клинической эмбриологии.The invention relates to medicine, namely to reproduction, andrology and clinical embryology.
В структуре причин бесплодия в парах примерно половина случаев приходится на нарушение фертильности у мужчин. Одним из проявлений нарушения репродуктивной функции у мужчин является нарушение сперматогенеза, при котором может отмечаться резкое снижение концентрации сперматозоидов в эякуляте (сперме) - олигозооспермия и криптозооспермия (единичные сперматозоиды в осадке эякулята после центрифугирования). In the structure of the causes of infertility in couples, about half of the cases are due to impaired fertility in men. One of the manifestations of reproductive dysfunction in men is a violation of spermatogenesis, in which there may be a sharp decrease in the concentration of spermatozoa in the ejaculate (sperm) - oligozoospermia and cryptozoospermia (single spermatozoa in the ejaculate sediment after centrifugation).
Выделение единичных сперматозоидов из эякулята в тяжелых случаях олигозооспермии или при криптозооспермии в целях вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) может быть крайне затруднено и представляет существенную проблему. Существующие методы обработки эякулята в данных случаях могут быть неэффективны из-за крайне малого количества сперматозоидов, часто неподвижных. При невозможности выделения сперматозоидов из эякулята пациентам может быть рекомендовано использование спермы донора или хирургическое получение сперматозоидов из придатка и/или яичка [Вспомогательные репродуктивные технологии и искусственная инсеминация. Клинические рекомендации (протокол лечения) МЗ РФ 05.03.2019 №15-4/и/2-1908].The isolation of single spermatozoa from the ejaculate in severe cases of oligozoospermia or cryptozoospermia for the purpose of assisted reproductive technologies (ART) can be extremely difficult and represents a significant problem. Existing ejaculate processing methods in these cases may be ineffective due to the extremely small number of spermatozoa, often immobile. If it is impossible to isolate sperm from the ejaculate, patients may be recommended to use donor sperm or surgically obtain sperm from the epididymis and / or testicle [Assisted reproductive technologies and artificial insemination. Clinical recommendations (treatment protocol) of the Ministry of Health of the Russian Federation 05.03.2019 No. 15-4 / and / 2-1908].
Существуют следующие способы обработки эякулята в целях выделения из него сперматозоидов для ВРТ [Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пятое издание. Всемирная организация здравоохранения. «Медико-генетический научный центр» РАН. Издательство «Капитал Принт», Москва, 2012].There are the following methods for processing ejaculate in order to isolate spermatozoa from it for ART [WHO guidelines for the examination and processing of human ejaculate. Fifth edition. World Health Organization. "Medical Genetic Research Center" RAS. Publishing house "Capital Print", Moscow, 2012].
1. Простое отмывание. Метод основан на центрифугировании эякулята в отмывочной среде. В результате осаждения эякулят отмывают от семенной плазмы, которую удаляют в виде супернатанта после центрифугирования, а все клеточные элементы (клетки эпителия и округлые клетки), неклеточные элементы (дебрис, желатиновые гранулы и т.п.), а также сперматозоиды, концентрируются в осадке (Фиг. 2). При достаточной концентрации сперматозоидов в сперме их выделение методом простого отмывания не представляет сложности и является рутинным методом. Однако в случаях тяжелой олигозооспермии или криптозооспермии единичные сперматозоиды могут залипать и теряться в объеме полученного осадка, а их последующий отбор для ВРТ может быть крайне затруднен или невозможен. 1. Simple laundering. The method is based on ejaculate centrifugation in a washing medium. As a result of sedimentation, the ejaculate is washed from seminal plasma, which is removed in the form of supernatant after centrifugation, and all cellular elements (epithelial cells and rounded cells), non-cellular elements (debris, gelatin granules, etc.), as well as spermatozoa, are concentrated in the sediment (Fig. 2). With a sufficient concentration of spermatozoa in the semen, their isolation by simple washing is not difficult and is a routine method. However, in cases of severe oligozoospermia or cryptozoospermia, single spermatozoa can stick and be lost in the volume of the resulting sediment, and their subsequent selection for ART can be extremely difficult or impossible.
2. Прямой метод swim-up. Метод основан на способности сперматозоидов выплывать из семенной жидкости в отмывочную среду. Прямой метод swim-up может быть выполнен либо наслаиванием культуральной (отмывочной) среды на разжиженный эякулят, либо подслаиванием спермы под культуральную среду. Затем подвижные сперматозоиды перемещаются в культуральную среду. Эта процедура дает более низкое количество сперматозоидов, чем отмывание, но помогает отобрать их по подвижности. Метод применим к сперме с относительно нормальными характеристиками концентрации и подвижности сперматозоидов. В случаях выраженной олигозооспермии и криптозооспермии прямой метод swim-up неэффективен. 2. Direct swim-up method. The method is based on the ability of spermatozoa to swim out of the seminal fluid into the washing medium. The direct swim-up method can be performed either by layering the culture (wash) medium on the liquefied ejaculate, or by layering the semen under the culture medium. The motile spermatozoa are then transferred to the culture medium. This procedure gives a lower sperm count than washing, but helps to select them for motility. The method is applicable to semen with relatively normal sperm concentration and motility characteristics. In cases of severe oligozoospermia and cryptozoospermia, the direct swim-up method is ineffective.
3. Отмывание в градиенте плотностей. При выполнении этого метода используют центрифугирование спермы в градиенте плотностей, содержащем коллоидные шарики, покрытые силаном, которые разделяют клетки по их плотности. Кроме того, подвижные сперматозоиды активно проникают через градиент и формируют небольшой осадок на дне пробирки. Полученный в результате центрифугирования в градиенте плотностей супернатант (надосадочную жидкость) удаляют, а из образовавшегося под коллоидным слоем осадка отбирают сперматозоиды, которые могут быть использованы при оплодотворении ооцитов или криоконсервированы. Метод не применим к выделению из спермы единичных сперматозоидов в случаях тяжелой олигозооспермии или криптозооспермии. 3. Washing in a density gradient. This method uses centrifugation of sperm in a density gradient containing colloidal beads coated with silane, which separate cells by their density. In addition, motile spermatozoa actively penetrate the gradient and form a small sediment at the bottom of the tube. The supernatant (supernatant) obtained as a result of centrifugation in a density gradient is removed, and spermatozoa are selected from the sediment formed under the colloidal layer, which can be used in the fertilization of oocytes or cryopreserved. The method is not applicable to the isolation of single spermatozoa from semen in cases of severe oligozoospermia or cryptozoospermia.
Таким образом, выбор способа выделения сперматозоидов из эякулята и его эффективность напрямую зависят от исходных параметров эякулята (Фиг. 1). Thus, the choice of method for separating spermatozoa from the ejaculate and its effectiveness directly depend on the initial parameters of the ejaculate (Fig. 1).
Известен способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины по патенту РФ 2526494 [МПК С12N 7/00, опубл. 20.08.2014 г.]. Способ предусматривает отделение подвижных сперматозоидов от спермоплазмы и сопутствующих клеток путем центрифугирования и последующей инкубации в специальных средах. Согласно изобретению сперму центрифигируют в градиенте плотности (Sil-Select Plus) при 300 g в растворах в течение 20 минут, затем удаляют супернатант. Осадок, содержащий сперматозоиды, аспирируют пипеткой, добавляют среду для промывки спермы FertiCult Flushing medium и центрифугируют при 300 g 10 минут, после чего удаляют супернатант до осадка. Далее осадок, содержащий сперматозоиды покрывают 2 мл среды FertiCult Flushing medium, пробирку помещают в инкубатор на 80-90 минут, наиболее подвижные сперматозоиды передвигаются в среду, их аспирируют в объеме 0,7 мл. Данный способ применим к обработке спермы и выделению из нее сперматозоидов отмытых от вируса и включает в себя комбинацию общепринятых методов обработки спермы: центрифугирование в градиенте плотности и простую отмывку с последующим самостоятельным всплытием подвижных сперматозоидов из осадка. Способ используется при обработке спермы с относительно нормальными характеристиками: в которой содержатся подвижные сперматозоиды, способные к самостоятельному всплытию в достаточном для их выделения количестве. Способ не применим к сперме со сниженными показателями концентрации и подвижности. A known method of removing the human immunodeficiency virus from the sperm of a man according to the patent of the Russian Federation 2526494 [IPC C12N 7/00, publ. 20.08.2014]. The method involves separating motile spermatozoa from spermatozoa and accompanying cells by centrifugation and subsequent incubation in special media. According to the invention, semen is centrifuged in a density gradient (Sil-Select Plus) at 300 g in solutions for 20 minutes, then the supernatant is removed. Sediment containing spermatozoa is aspirated with a pipette, FertiCult Flushing medium is added and centrifuged at 300 g for 10 minutes, after which the supernatant is removed to sediment. Next, the sediment containing spermatozoa is covered with 2 ml of FertiCult Flushing medium, the tube is placed in an incubator for 80-90 minutes, the most mobile spermatozoa move into the medium, they are aspirated in a volume of 0.7 ml. This method is applicable to the processing of semen and the isolation of spermatozoa washed from the virus and includes a combination of conventional methods of semen processing: centrifugation in a density gradient and simple washing followed by self-emergence of motile spermatozoa from the sediment. The method is used in the processing of sperm with relatively normal characteristics: which contains motile spermatozoa capable of self-surfacing in sufficient quantity to isolate them. The method is not applicable to sperm with reduced levels of concentration and mobility.
Известен способ подготовки спермы для внутриматочной инсеменации [патент РФ 2317072 МПК А61К 31/02, А61Р 15/08, опубл. 20.02.2008 г.] путем забора спермы, добавления физиологического раствора и двухкратного центрифугирования по 10 минут при 1500 оборотах в минуту. После центрифугирования в полученную массу сперматозоидов вводят перфторан в соотношение 1:3, выдерживают в течение 3-5 минут, проводят процедуру инсеминации. В указанном способе использован метод простой отмывки спермы с последующим самостоятельным всплытием подвижных сперматозоидов из осадка. Способ применим к обработке спермы с относительно нормальными характеристиками: в которой содержатся подвижные сперматозоиды, способные к самостоятельному всплытию в достаточном для их выделения количестве. Способ не применим к сперме со сниженными показателями концентрации и подвижности. A known method of preparing sperm for intrauterine insemination [RF patent 2317072 IPC A61K 31/02, A61R 15/08, publ. February 20, 2008] by collecting sperm, adding saline and centrifuging twice for 10 minutes at 1500 rpm. After centrifugation, perftoran is introduced into the resulting mass of spermatozoa in a ratio of 1:3, kept for 3-5 minutes, and the insemination procedure is carried out. In this method, the method of simple washing of sperm is used, followed by independent emergence of motile spermatozoa from the sediment. The method is applicable to the processing of semen with relatively normal characteristics: which contains motile spermatozoa capable of self-surfacing in sufficient quantity to isolate them. The method is not applicable to sperm with reduced levels of concentration and mobility.
Технической проблемой, решаемой предлагаемым изобретением, является выделение сперматозоидов, в том числе неподвижных и при их критически малом (единичном) количестве в случаях выраженной олигозооспермии или криптозооспермии из объема эякулята, когда другие методы обработки неэффективны, с возможностью их последующего использования для оплодотворения ооцитов и/или криоконсервации. The technical problem solved by the invention is the isolation of spermatozoa, including immobile and with their critically small (single) number in cases of severe oligozoospermia or cryptozoospermia from the volume of the ejaculate, when other processing methods are ineffective, with the possibility of their subsequent use for fertilization of oocytes and / or cryopreservation.
Технический результат состоит в получении (выделении) чистой фракции сперматозоидов (в том числе единичных) из спермы пациентов с выраженным нарушением сперматогенеза, которые можно использовать для оплодотворения ооцитов методом внутрицитоплазматической инъекции в ооцит и/или криоконсервации. The technical result consists in obtaining (isolation) of a pure fraction of spermatozoa (including single ones) from the sperm of patients with severe impairment of spermatogenesis, which can be used for fertilization of oocytes by intracytoplasmic injection into the oocyte and/or cryopreservation.
Для достижения вышеуказанного технического результата в способе выделения сперматозоидов из эякулята пациентов с нарушением сперматогенеза отделение единичных сперматозоидов от других клеточных и неклеточных элементов эякулята осуществляют путем, по меньшей мере, двух циклов центрифугирования, с отбором для каждого последующего цикла центрифугирования полученного в результате предыдущего цикла центрифугирования супернатанта, центрифугирование проводят при 200-350 g в течение 1-2 минут, при этом циклы центрифугирования супернатанта проводят до отсутствия видимого осадка. To achieve the above technical result in the method of isolating spermatozoa from the ejaculate of patients with impaired spermatogenesis, the separation of single spermatozoa from other cellular and non-cellular elements of the ejaculate is carried out by at least two centrifugation cycles, with the selection for each subsequent centrifugation cycle of the supernatant obtained as a result of the previous centrifugation cycle , centrifugation is carried out at 200-350 g for 1-2 minutes, while centrifugation cycles of the supernatant are carried out until there is no visible precipitate.
В большинстве случаев циклы центрифугирования проводят после предварительной обработки эякулята методом простого отмывания от семенной плазмы в течение 1-3 последовательных циклов центрифугирования при 300-600 g в течение 5-10 минут. В случаях выраженной олигоспермии (снижение объема эякулята) предварительная отмывка эякулята от семенной плазмы не требуется. In most cases, centrifugation cycles are carried out after pre-treatment of the ejaculate by simple washing from seminal plasma for 1-3 consecutive centrifugation cycles at 300-600 g for 5-10 minutes. In cases of severe oligospermia (decrease in ejaculate volume), preliminary washing of the ejaculate from seminal plasma is not required.
Среднее количество последовательных циклов центрифугирования составляет от 3 до 8. При каждом последующем цикле параметры центрифугирования (центробежная сила и время) могут быть сохранены, а могут быть увеличены относительно первого цикла и/или предыдущего цикла, при этом центробежная сила находится в пределах 200-350 g, а время в пределах 1-2 минут. В частном случае выполнения изобретения центрифугирование проводят при 300 g в течение 1 минуты при объеме материала 8-12 мл.The average number of successive centrifugation cycles is from 3 to 8. With each subsequent cycle, the centrifugation parameters (centrifugal force and time) can be maintained or increased relative to the first cycle and / or the previous cycle, while the centrifugal force is in the range of 200-350 g, and the time is within 1-2 minutes. In a particular case of the invention, centrifugation is carried out at 300 g for 1 minute with a material volume of 8-12 ml.
Для концентрирования выделенной фракции сперматозоидов в минимальном объеме, полученный в последнем цикле супернатант центрифугируют при 250-600 g в течение 5-15 минут.To concentrate the isolated fraction of spermatozoa in the minimum volume, the supernatant obtained in the last cycle is centrifuged at 250-600 g for 5-15 minutes.
Предложенный способ позволяет выделить из эякулята пациентов с нарушением сперматогенеза даже единичные мужские половые клетки и использовать их для оплодотворения, особенно при их критически малом количестве, когда общепринятые методы выделения могут быть неэффективными. The proposed method makes it possible to isolate even single male germ cells from the ejaculate of patients with impaired spermatogenesis and use them for fertilization, especially when their number is critically small, when conventional methods of isolation may be ineffective.
Предложенный способ основан на методе дифференциального центрифугирования, который ранее никогда не использовался при работе со спермой. The proposed method is based on the differential centrifugation method, which has never been used before when working with sperm.
Дифференциальное центрифугирование - это метод выделения и очистки различных биологических объектов, таких как вирусы, клетки, субклеточные органеллы, белки и нуклеиновые кислоты, которые растворены или диспергированы в биологически релевантных растворителях [De Duve, C. Exploring cells with a centrifuge. Nobel Lecture. 1974, http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/ laureates/1974/duve-lecture.html].Differential centrifugation is a method for isolating and purifying various biological entities such as viruses, cells, subcellular organelles, proteins, and nucleic acids that are dissolved or dispersed in biologically relevant solvents [De Duve, C. Exploring cells with a centrifuge. Nobel lecture. 1974, http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1974/duve-lecture.html].
Центрифугирование вызывает осаждение частиц, которые тяжелее растворителя. Исходный раствор обычно содержит многокомпонентную смесь частиц, которые различаются по размеру и плотности, а, следовательно, и по скорости их осаждения. Метод дифференциального центрифугирования позволяет выборочно осаждать интересующие компоненты в результате повторяющихся циклов центрифугирования - в центробежном поле все частицы (в данном случае - клетки) оседают по-разному: крупные быстрее мелких. На дне пробирки в результате центрифугирования образуется осадок или седимент частиц. Жидкость над осадком называется супернатантом, из него можно собрать достаточно чистую фракцию самых маленьких частиц. Таким образом клетки, у которых имеется достаточная разница в размере и скорости седиментации, можно отделить друг от друга, при этом необходима определенная комбинация относительного центробежного ускорения и времени центрифугирования, эффективная для выделения компонентов данной клеточной смеси [Ohlendieck, Kay; Harding, Stephen E. (19 April 2018). «Centrifugation and Ultracentrifugation». Wilson and Walker's Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology: 424–453. doi:10.1017/9781316677056.014. ISBN 9781107162273]. Centrifugation causes sedimentation of particles that are heavier than the solvent. The initial solution usually contains a multi-component mixture of particles that differ in size and density, and, consequently, in the rate of their deposition. The method of differential centrifugation makes it possible to selectively precipitate the components of interest as a result of repeated centrifugation cycles - in a centrifugal field, all particles (in this case, cells) settle in different ways: large particles are faster than small ones. At the bottom of the tube as a result of centrifugation, a precipitate or sediment of particles is formed. The liquid above the precipitate is called the supernatant, and a sufficiently pure fraction of the smallest particles can be collected from it. Thus, cells that have a sufficient difference in size and sedimentation rate can be separated from each other, which requires a certain combination of relative centrifugal acceleration and centrifugation time, effective to isolate the components of a given cell mixture [Ohlendieck, Kay; Harding, Stephen E. (April 19, 2018). Centrifugation and Ultracentrifugation. Wilson and Walker's Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology: 424–453. doi:10.1017/9781316677056.014. ISBN 9781107162273].
Принцип дифференциального центрифугирования в изобретении впервые применяют к выделению сперматозоидов из эякулята. Сперматозоиды по массе меньше других элементов, присутствующих в эякуляте, поэтому их можно эффективно отделить от них. В результате дифференциального центрифугирования при подобранном для данной клеточной суспензии экспериментальным путем режиме центрифугирования, возможно получение верхней фракции (супернатанта), свободной от эпителиальных клеток, гранулоцитов, клеток сперматогенного эпителия и клеточного дебриса и неклеточных элементов, но содержащей сперматозоиды. The principle of differential centrifugation in the invention is applied for the first time to the isolation of spermatozoa from the ejaculate. Spermatozoa are smaller in mass than other elements present in the ejaculate, so they can be effectively separated from them. As a result of differential centrifugation, with the centrifugation mode selected for this cell suspension experimentally, it is possible to obtain an upper fraction (supernatant) free of epithelial cells, granulocytes, spermatogenic epithelial cells and cell debris and non-cellular elements, but containing spermatozoa.
Предложенный дифференциальный подход в выделении мужских половых клеток значительно более эффективен (Фиг. 3) по сравнению с традиционным методом центрифугирования (простой отмывки) (Фиг. 2), так как позволяет избежать осадка, в котором теряются или залипают сперматозоиды, что делает их последующее выделение в ряде случаев невозможным ввиду их критически малого количества. The proposed differential approach in the isolation of male germ cells is much more efficient (Fig. 3) compared to the traditional method of centrifugation (simple washing) (Fig. 2), as it avoids the sediment in which spermatozoa are lost or stuck, which makes their subsequent isolation in some cases impossible due to their critically small number.
Изобретение поясняется следующими материалами.The invention is illustrated by the following materials.
Фиг. 1. Методы обработки эякулята и их эффективность при различных состояниях эякулята: А) при нормальной концентрации сперматозоидов > 15 млн/мл; Б) при выраженной олигозооспермии; В) при криптозооспермии. Fig. 1. Methods of ejaculate processing and their effectiveness in various conditions of ejaculate: A) at a normal spermatozoa concentration > 15 million/ml; B) with severe oligozoospermia; C) with cryptozoospermia.
Фиг. 2. Осадок эякулята при криптозооспермии, полученный в результате обработки методом простого отмывания. Сперматозоиды отмечены стрелкой. Отбор сперматозоидов из осадка для оплодотворения затруднен или невозможен. Fig. 2. Sediment of ejaculate with cryptozoospermia, obtained as a result of processing by the method of simple washing. Spermatozoa are marked with an arrow. The selection of spermatozoa from the sediment for fertilization is difficult or impossible.
Фиг. 3. Сперматозоиды (отмечены стрелкой), выделенные из эякулята при криптозооспермии в результате дифференциального центрифугирования. Отбор сперматозоидов для оплодотворения возможен. Fig. 3. Spermatozoa (marked with an arrow) isolated from the ejaculate during cryptozoospermia as a result of differential centrifugation. Sperm selection for fertilization is possible.
Способ получения единичных сперматозоидов из эякулята при нарушении сперматогенеза для использования в программах экстракорпорального оплодотворения и/или криоконсервации, осуществляют следующим образом. Полученный эякулят в полном объеме помещают в пробирку для центрифугирования и доводят объем до 8-12 мл отмывочной средой для гамет человека на основе ХЕПЕС-буфера. При необходимости предварительно осуществляют простое отмывание от семенной плазмы в течение 1-3 последовательных циклов центрифугирования при 300-600 g в течение 5-10 минут. Полученный в результате простого отмывания осадок ресуспендируют в отмывочной среде в объеме 8-12 мл центрифугируют при заданных параметрах центробежной силы и времени при 200-350 g в течение 1-2 минут. Центробежная сила и время центрифугирования зависят от исходного объема образца, степени его контаминации. При выборе режима дифференциального центрифугирования для каждого случая учитывают, что сильно контаминированные образцы следует доводить отмывочной средой до большего объема (10-12 мл). Применение центробежной силы ниже 200 g и/или времени центрифугирования менее 1 минуты при объеме является малоэффективным, так как отличные от сперматозоидов клеточные и неклеточные элементы не оседают в полной мере на дно пробирки; применение центробежной силы выше 350 g и/или времени более 2 минут приводит к одновременному осаждению как всех клеточных и неклеточных элементов, так и сперматозоидов, что не позволяет эффективно выделить чистую фракцию последних. The method for obtaining single spermatozoa from the ejaculate in violation of spermatogenesis for use in in vitro fertilization and/or cryopreservation programs is carried out as follows. The resulting ejaculate is placed in full in a centrifugation tube and the volume is adjusted to 8-12 ml with a wash medium for human gametes based on HEPES buffer. If necessary, a simple washing from seminal plasma is carried out beforehand for 1-3 successive centrifugation cycles at 300-600 g for 5-10 minutes. The precipitate obtained as a result of simple washing is resuspended in a washing medium in a volume of 8-12 ml and centrifuged at the given parameters of centrifugal force and time at 200-350 g for 1-2 minutes. Centrifugal force and centrifugation time depend on the initial volume of the sample, the degree of its contamination. When choosing the mode of differential centrifugation for each case, it is taken into account that heavily contaminated samples should be brought to a larger volume (10-12 ml) with washing medium. The use of a centrifugal force below 200 g and/or a centrifugation time of less than 1 minute at a volume is ineffective, since cellular and non-cellular elements other than spermatozoa do not fully settle to the bottom of the tube; the use of centrifugal force above 350 g and/or time more than 2 minutes leads to the simultaneous sedimentation of all cellular and non-cellular elements, as well as spermatozoa, which does not allow one to effectively isolate the pure fraction of the latter.
После каждого центрифугирования супернатант переносят в новую пробирку и повторно центрифугируют при исходных параметрах или при увеличенной центробежной силе и/или увеличенном времени в зависимости от кондиции образца, не выходя из установленных пределов для центробежной силы 200-350 g, времени 1-2 минуты. Повторяющиеся раунды центрифугирования супернатанта осуществляют до момента отсутствия видимого осадка; количество раундов центрифугирования в среднем варьирует от 3 до 8 и зависит от исходной степени контаминации образца клеточными и неклеточными элементами, отличными от сперматозоидов. Полученный в результате последнего раунда центрифугирования супернатант представляет собой суспензию со сперматозоидами, которая может быть использована для оплодотворения ооцитов методом внутрицитоплазматической инъекции и/или криоконсервирована для отложенного использования в программе ЭКО. After each centrifugation, the supernatant is transferred to a new tube and re-centrifuged at the initial parameters or with increased centrifugal force and/or increased time, depending on the condition of the sample, without going beyond the established limits for centrifugal force of 200-350 g, time of 1-2 minutes. Repeated rounds of centrifugation of the supernatant are carried out until there is no visible sediment; the number of centrifugation rounds varies on average from 3 to 8 and depends on the initial degree of contamination of the sample with cellular and non-cellular elements other than spermatozoa. The supernatant obtained as a result of the last round of centrifugation is a suspension with spermatozoa, which can be used for fertilization of oocytes by intracytoplasmic injection and/or cryopreserved for delayed use in the IVF program.
С целью концентрирования в минимальном объеме, полученный в результате дифференциального центрифугирования супернатант, в котором содержатся сперматозоиды, но из которого удалена основная масса других элементов, центрифугируют при 250-600 g в течение 5-15 минут. Полученный в результате концентрирования осадок представляет собой суспензию со сперматозоидами, которая может быть использована для оплодотворения ооцитов методом внутрицитоплазматической инъекции и/или криоконсервирована для отложенного использования в программе ЭКО. In order to concentrate in the minimum volume, the supernatant obtained as a result of differential centrifugation, which contains spermatozoa, but from which the bulk of other elements have been removed, is centrifuged at 250-600 g for 5-15 minutes. The precipitate obtained as a result of concentration is a suspension with spermatozoa, which can be used for fertilization of oocytes by intracytoplasmic injection and/or cryopreserved for delayed use in the IVF program.
Реализация предложенного способа подтверждена клиническими данными. The implementation of the proposed method is confirmed by clinical data.
КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫCLINICAL EXAMPLES
Пример 1. Пациент С., 34 г. Криптозооспермия (единичные сперматозоиды в осадке эякулята после центрифугирования). При обработке эякулята методом простого отмывания ранее выделить сперматозоиды для ВРТ не удавалось. Вместе с супругой, пациенткой С., вступили в протокол лечения бесплодием методом ЭКО с предварительным согласием на использование спермы донора. В день пункции фолликулов у Пациентки С. получен эякулят Пациента С. В нативном эякуляте сперматозоиды не обнаружены. После простого отмывания в осадке эякулята присутствуют единичные сперматозоиды (криптозооспермия). В результате дифференциального центрифугирования (6 раундов центрифугирования при 300 g в течение 1 минуты) с последующим концентрированием при 300 g в течение 10 минут выделены единичные сперматозоиды, проведено оплодотворение ооцитов Пациентки С. сперматозоидами супруга, Пациента С. методом внутрицитоплазматической инъекции. Example 1. Patient S., 34 years old. Cryptozoospermia (single spermatozoa in the ejaculate sediment after centrifugation). When processing the ejaculate by simple washing, it was not possible to isolate spermatozoa for ART earlier. Together with his wife, patient S., we entered into a protocol for infertility treatment by IVF with prior consent to the use of donor sperm. On the day of follicle puncture, Patient S. received the ejaculate of Patient S. No spermatozoa were found in the native ejaculate. After simple washing, single spermatozoa are present in the ejaculate sediment (cryptozoospermia). As a result of differential centrifugation (6 rounds of centrifugation at 300 g for 1 minute) followed by concentration at 300 g for 10 minutes, single spermatozoa were isolated, the oocytes of Patient S. were fertilized with the spermatozoa of the spouse, Patient S. by intracytoplasmic injection.
Пример 2. Пациент У., 28 лет. Азооспермия, секреторная форма. В ходе подготовки к процедуре хирургического получения сперматозоидов из яичка назначена гормональная терапия. Через 10 недель терапии, на фоне назначенного лечения в эякуляте присутствуют сперматозоиды (1 на 10 полей зрения, х200, выраженная олигозооспермия). В результате дифференциального центрифугирования (2 раунда центрифугирования при 200 g в течение 1 минуты, 3 раунда при 300 g в течение 1 минуты, 1 раунд при 300 g в течение 2 минут в объеме 12 мл) с последующим концентрированием выделены сперматозоиды в достаточном для криоконсервации количестве, выполнена криоконсервация. Пациент У. вместе с супругой вступили в протокол лечения бесплодием методом ЭКО. При отсутствии сперматозоидов в эякуляте в день пункции фолликулов у супруги предполагалось использование криоконсервированных ранее сперматозоидов. В день пункции фолликулов у Пациентки У. получен эякулят Пациента У. В нативном эякуляте присутствуют сперматозоиды (1 на 10 полей зрения, х200, выраженная олигозооспермия). В результате дифференциального центрифугирования выделены единичные сперматозоиды, проведено оплодотворение ооцитов Пациентки У. методом внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидами супруга, Пациента У. Осуществляется хранение криоконсервированных ранее сперматозоидов. Example 2. Patient W., aged 28. Azoospermia, secretory form. Hormone therapy was prescribed in preparation for the procedure of surgical extraction of spermatozoa from the testis. After 10 weeks of therapy, against the background of the prescribed treatment, spermatozoa are present in the ejaculate (1 per 10 fields of view, x200, pronounced oligozoospermia). As a result of differential centrifugation (2 rounds of centrifugation at 200 g for 1 minute, 3 rounds at 300 g for 1 minute, 1 round at 300 g for 2 minutes in a volume of 12 ml), followed by concentration, spermatozoa were isolated in sufficient quantity for cryopreservation performed cryopreservation. Patient U., together with his wife, entered into a protocol for infertility treatment using the IVF method. In the absence of spermatozoa in the ejaculate on the day of follicle puncture, the wife was supposed to use previously cryopreserved spermatozoa. On the day of follicle puncture, Patient U. received the ejaculate of Patient U. The native ejaculate contains spermatozoa (1 per 10 fields of view, x200, pronounced oligozoospermia). As a result of differential centrifugation, single spermatozoa were isolated, the oocytes of Patient U. were fertilized by intracytoplasmic injection with spermatozoa of the spouse, Patient U. The previously cryopreserved spermatozoa are stored.
Пример 3. Пациент Е., 32 г. Олигозооспермия (1 млн/мл). В связи с выраженным мужским фактором пациентам рекомендовано достижение беременности методом ЭКО. В день пункции фолликулов супруги получен эякулят Пациента Е. Отмечено резкое ухудшение характеристики эякулята - в нативном эякуляте сперматозоиды не обнаружены. После простого отмывания в осадке эякулята присутствуют единичные сперматозоиды (криптозооспермия) (Фиг. 2). В результате дифференциального центрифугирования (4 раунда центрифугирования при 250 g в течение 1 минуты, 2 раунда при 300 g в течение 1 минуты) с последующим концентрированием выделены единичные сперматозоиды (Фиг. 3), проведено оплодотворение ооцитов супруги сперматозоидами супруга, Пациента Е. Example 3 Patient E., aged 32. Oligozoospermia (1 million/ml). Due to the pronounced male factor, patients are recommended to achieve pregnancy by IVF. On the day of the wife's follicle puncture, the ejaculate of Patient E was obtained. A sharp deterioration in the characteristics of the ejaculate was noted - no spermatozoa were found in the native ejaculate. After simple washing, single spermatozoa are present in the ejaculate sediment (cryptozoospermia) (Fig. 2). As a result of differential centrifugation (4 rounds of centrifugation at 250 g for 1 minute, 2 rounds at 300 g for 1 minute) followed by concentration, single spermatozoa were isolated (Fig. 3), the wife's oocytes were fertilized with the spermatozoa of the spouse, Patient E.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021127573A RU2770818C1 (en) | 2021-09-21 | 2021-09-21 | Method for isolating spermatozoa from the ejaculate of patients with impaired spermatogenesis for use in in vitro fertilization and/or cryopreservation programs |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021127573A RU2770818C1 (en) | 2021-09-21 | 2021-09-21 | Method for isolating spermatozoa from the ejaculate of patients with impaired spermatogenesis for use in in vitro fertilization and/or cryopreservation programs |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2770818C1 true RU2770818C1 (en) | 2022-04-22 |
Family
ID=81306277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021127573A RU2770818C1 (en) | 2021-09-21 | 2021-09-21 | Method for isolating spermatozoa from the ejaculate of patients with impaired spermatogenesis for use in in vitro fertilization and/or cryopreservation programs |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2770818C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2317072C1 (en) * | 2006-07-12 | 2008-02-20 | Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Method for preparing sperm for carrying out intrauterine insemination |
| RU2526494C1 (en) * | 2013-03-19 | 2014-08-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации" (ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздрава России) | Method of removing human immunodeficiency virus from male's sperm |
-
2021
- 2021-09-21 RU RU2021127573A patent/RU2770818C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2317072C1 (en) * | 2006-07-12 | 2008-02-20 | Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Method for preparing sperm for carrying out intrauterine insemination |
| RU2526494C1 (en) * | 2013-03-19 | 2014-08-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации" (ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздрава России) | Method of removing human immunodeficiency virus from male's sperm |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| KATKOV I.I. et al., Influence of Centrifugation Regimes on Motility, Yield, and Cell Associations of Mouse Spermatozoa / Journal of Androtogy, 1998, vol. 19, N 2, pages 232-241. * |
| SHEKARRIZ M. et al., A Method of Human Semen Centrifugation to Minimize the Iatrogenic Sperm Injuries Caused by Reactive Oxygen Species / Eur Urol, 1995; 28, pages 31-35. * |
| ПЛОСКОНОС М.В. Сравнительная характеристика методов выделения сперматозоидов из нативного эякулята мужчин / КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, 2016; 61 (6), стр. 342-347. * |
| ПЛОСКОНОС М.В. Сравнительная характеристика методов выделения сперматозоидов из нативного эякулята мужчин / КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, 2016; 61 (6), стр. 342-347. KATKOV I.I. et al., Influence of Centrifugation Regimes on Motility, Yield, and Cell Associations of Mouse Spermatozoa / Journal of Androtogy, 1998, vol. 19, N 2, pages 232-241. SHEKARRIZ M. et al., A Method of Human Semen Centrifugation to Minimize the Iatrogenic Sperm Injuries Caused by Reactive Oxygen Species / Eur Urol, 1995; 28, pages 31-35. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pertoft | Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll | |
| Beydola et al. | Sperm preparation and selection techniques | |
| Mortimer | Sperm recovery techniques to maximize fertilizing capacity | |
| EP1181524B1 (en) | Method for enriching or depleting tumour cells obtained from a body fluid and kit suitable for this purpose | |
| Forster et al. | Selection of human spermatozoa according to their relative motility and their interaction with zona-free hamster eggs | |
| Child et al. | A method for the isolation of the parts of ciliates | |
| RU2762489C1 (en) | Method for isolating spermatozoa from aspiration and/or biopsy material from an appendage and/or testicle for use in in vitro fertilization and/or cryopreservation programs | |
| RU2770818C1 (en) | Method for isolating spermatozoa from the ejaculate of patients with impaired spermatogenesis for use in in vitro fertilization and/or cryopreservation programs | |
| AU3616193A (en) | Method for testing blood units for viral contamination | |
| Kaneko et al. | Continuous-step density gradient centrifugation for the selective concentration of progressively motile sperm for insemination with husband's semen | |
| Kinsey | Purification and properties of the egg plasma membrane | |
| Behki et al. | Intracellular distribution of deoxyribosidic compounds in normal and regenerating liver and in Novikoff hepatoma | |
| Morrell et al. | Effect of osmolarity and density of colloid formulations on the outcome of SLC-selection of stallion spermatozoa | |
| Fukushima et al. | A rapid method for starting a culture for the establishment of Epstein-Barr virus-transformed human lymphoblastoid cell lines | |
| Toplin | Purification of the Moloney and Rauscher murine leukemia viruses by use of zonal ultracentrifuge systems | |
| Nordhoff et al. | Sperm preparation for therapeutic IVF | |
| RU2526494C1 (en) | Method of removing human immunodeficiency virus from male's sperm | |
| Astarto et al. | Comparison between two-layer density gradient and three-layer density gradient technique for sperm preparation at aster fertility clinic, Dr. Hasan Sadikin General Hospital | |
| Sharma et al. | Sperm Processing and Selection | |
| Shepherd et al. | Enrichment of primary pachytene spermatocytes from the human testis | |
| EP1812562B1 (en) | Method for preparation of an autologous endometrial culture for an endometrium/embryo coculture | |
| Hadi et al. | Gender selection by Percoll® gradients by using intraperitoneal insemination in mice: as a model of human | |
| JP2000288082A (en) | Tube for washing and thickening sperm and method for washing and thickening sperm | |
| ZAVOS et al. | Improvements in Qualitative Characteristics of Cryopreserved Human Spermatozoa Following Recovery via the SpermPrepTMII Filtration Method | |
| JP2006068012A (en) | Nurr1-positive neuron stem cell, its medicine composition and method for separating, culturing and storing the same |