RU2769927C2 - METHOD FOR DIAGNOSING MELANOMA USING EXOSOMAL microRNA - Google Patents
METHOD FOR DIAGNOSING MELANOMA USING EXOSOMAL microRNA Download PDFInfo
- Publication number
- RU2769927C2 RU2769927C2 RU2020108781A RU2020108781A RU2769927C2 RU 2769927 C2 RU2769927 C2 RU 2769927C2 RU 2020108781 A RU2020108781 A RU 2020108781A RU 2020108781 A RU2020108781 A RU 2020108781A RU 2769927 C2 RU2769927 C2 RU 2769927C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microrna
- melanoma
- mirna
- development
- stage
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Ecology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к диагностическим методам, позволяющим диагностировать развитие меланомы.The invention relates to the field of biotechnology, namely to diagnostic methods for diagnosing the development of melanoma.
Меланома - опухолевое заболевание, вызванное злокачественной трансформацией меланоцитов, - клеток, ответственных за производство меланина. Меланома является шестым наиболее распространенным злокачественным новообразованием в Соединенных Штатах, причем рост заболеваемости наблюдается во всем мире. Согласно данным американского онкологического сообщества, 91% меланом являются кожные, 5,3% увеальными, 1,3% являются меланомами слизистых оболочек, и 2,2% являются меланомами неизвестного первичного происхождения.Melanoma is a tumor disease caused by the malignant transformation of melanocytes, the cells responsible for the production of melanin. Melanoma is the sixth most common cancer in the United States, with an increase in incidence worldwide. According to the American Cancer Society, 91% of melanomas are cutaneous, 5.3% are uveal, 1.3% are mucosal melanomas, and 2.2% are melanomas of unknown primary origin.
По статистике Всемирной организации здравоохранения в 2000 г было диагностировано более 200 тысяч случаев меланомы, при этом зафиксировано более 65 тысяч летальных исходов, связанных с меланомой. Рост заболевания меланомой отмечается с 1998 г., так к 2008 г. отмечается существенный рост количества случаев меланомы почти что во всех странах мира, в том числе и в Российской Федерации (например, в Санкт-Петербурге: мужчины - 3,5; женщины - 4). Летальность при меланоме тоже высокая, особенно среди белого населения Австралии (мужчины - 5, женщины - 5) и Новой Зеландии (мужчины - 3, женщины - 3), где повышенный уровень ультрафиолетового излучения. При анализе пятилетней выживаемости наблюдается различная картина в разных странах мира - так, высокий процент пятилетней выживаемости наблюдается в Соединенных Штатах Америки, где она составляет 88 процентов. Немного нижи цифры пятилетней выживаемости в Австралии и Новой Зеландии - около 85 процентов. В Европейских странах цифра варьирует, и в среднем составляет 70 - 75 процентов. Что касается развивающихся стран, тут пятилетняя выживаемость около 50 процентов.According to the statistics of the World Health Organization in 2000, more than 200 thousand cases of melanoma were diagnosed, while more than 65 thousand deaths associated with melanoma were recorded. An increase in the incidence of melanoma has been noted since 1998, so by 2008 there was a significant increase in the number of cases of melanoma in almost all countries of the world, including the Russian Federation (for example, in St. Petersburg: men - 3.5; women - 4). Mortality in melanoma is also high, especially among the white population of Australia (men - 5, women - 5) and New Zealand (men - 3, women - 3), where the level of ultraviolet radiation is increased. When analyzing five-year survival, there is a different pattern in different countries of the world - for example, a high percentage of five-year survival is observed in the United States of America, where it is 88 percent. Slightly below the five-year survival rate in Australia and New Zealand - about 85 percent. In European countries, the figure varies, and the average is 70 - 75 percent. In developing countries, the five-year survival rate is about 50 percent.
МикроРНК, в качестве важнейших пост-транскрипционных регуляторов экспрессии генов, являются важными компонентами в биологии меланомы. Нарушение регулирования МикроРНК связывают с развитием злокачественных свойств и метастазирования злокачественной меланомы. Росту рака способствует потере определенных микроРНК, в то время как прогрессии рака способствует избыточная экспрессия других микроРНК.MicroRNAs, as essential post-transcriptional regulators of gene expression, are important components in melanoma biology. Violation of microRNA regulation is associated with the development of malignant properties and metastasis of malignant melanoma. Cancer growth is facilitated by the loss of certain microRNAs, while cancer progression is facilitated by the overexpression of other microRNAs.
МикроРНК можно определять практически во всех биологических жидкостях: в моче, слюне, соскобе со щеки, плазме или сыворотке крови, цереброспинальной жидкости и др. МикроРНК в жидкостях могут присутствовать в различном виде, так, в плазме крови они могут быть свободно циркулирующими молекулами, в комплексах с белками, в циркулирующих клетках и во внеклеточных везикулах, в частности в экзосомах - которые являются небольшими 20-140 нм, структурами, участвующими в межклеточной коммуникации. При проведении исследований выделение отдельных фракций микроРНК, особенно экзосомальных могут представлять наибольший интерес в связи с их ключевым воздействием при межклеточной коммуникации. Во многих исследованиях обнаруживалась способность таргетной доставки микроРНК посредством экзосом, воздействуют таким образом на молекулярно-генетические процессы в реципиентных клетках. Гены-мишени микроРНК при меланоме, как и в случаях с большинством других онкологических заболеваний, связаны с влиянием на клеточный цикл, пролиферацию клеток, адгезию и васкуляризацию. Так, обнаружено, что при меланоме наблюдается гиперрегулация порядка 519 генов в клеточных линиях полученных из метастазов меланомы и клеточных культурах меланомы человека. Существенно (примерно в 5 раз) повышается экспрессия гена ANPEP, а генов CFL1 и МТА2 напротив, слегка снижается (до 0,8 раз). Гены CFL1 и МТА2 определяют морфологию клеток, а также их метастатический потенциал. Ассоциированные с рядом микроРНК В сети взаимодействующих генов, являющихся таргетными для микроРНК, экспрессия которых значительно понижена или повышена при меланоме, отмечают основные гены участвующие во взаимодействии и являющиеся мишенями микроРНК: АРР, AGO2, АКТ1, KRAS, AHR, STAT1, ВАК1 и PARP1. Отмечается что ген АКТ1, а также ген PARP1 и ген KRAS ко-регулируются следующими микроРНК: микро-РНК-34а-5р, -148а-3р, -129-5р, -363-3р и -374b-5р.MicroRNAs can be detected in almost all biological fluids: in urine, saliva, buccal scrapings, blood plasma or serum, cerebrospinal fluid, etc. MicroRNAs in liquids can be present in various forms, for example, in blood plasma they can be freely circulating molecules, complexes with proteins, in circulating cells and in extracellular vesicles, in particular in exosomes - which are small 20-140 nm structures involved in intercellular communication. When conducting research, the isolation of individual microRNA fractions, especially exosomal ones, may be of the greatest interest due to their key effect in intercellular communication. Many studies have revealed the ability of targeted microRNA delivery via exosomes, thus influencing molecular genetic processes in recipient cells. MicroRNA target genes in melanoma, as in most other cancers, are associated with effects on the cell cycle, cell proliferation, adhesion, and vascularization. Thus, it was found that in melanoma hyperregulation of about 519 genes is observed in cell lines derived from melanoma metastases and human melanoma cell cultures. Significantly (about 5 times) the expression of the ANPEP gene increases, while the expression of the CFL1 and MTA2 genes, on the contrary, slightly decreases (up to 0.8 times). The CFL1 and MTA2 genes determine the morphology of cells, as well as their metastatic potential. Associated with a number of miRNAs In the network of interacting genes that are targeted for microRNAs, the expression of which is significantly reduced or increased in melanoma, the main genes involved in the interaction and being targets of microRNAs are noted: APP, AGO2, AKT1, KRAS, AHR, STAT1, BAK1 and PARP1. It is noted that the AKT1 gene, as well as the PARP1 gene and the KRAS gene, are co-regulated by the following miRNAs: miRNA-34a-5p, -148a-3p, -129-5p, -363-3p and -374b-5p.
Уровень экспрессии основных представителей семейства микроРНК34 (-34а, -34b и -34 с) при меланоме понижается. В то же время уровень экспрессии этих микроРНК определяется геном р53. Для микроРНК-34а, характерно участие в апаптозе, инициированным белком р53, она учувствует в подавлении антиапоптотического белка сиртулина 1 (SIRT1). Иной механизм задействует микроРНК34с. Она способствует подавлению опухолевого роста путем влияния на мРНК и изменению экспрессии ряда генов, таких как гены антиапоптотических белков (например BCL-2), циклинзависимая киназа 4 (CDK4) и циклинзависимая киназа 6 CDK6, а также генов, белки которых связаны с метастазированием (MYC, МЕТ, Notch, и AXL). Появляется все больше данных о ассоциации экспрессии микроРНК34а с рецепторами программированной клеточной смерти 1 (PDL1). Повышенный уровень экспрессии рецептора PDL1 на поверхности иммунокомпетентных клеток пациентов со злокачественными новообразованиями рассматривается как негативный прогностический фактор. Здесь мы наблюдаем обратную зависимость: при высоких уровнях микроРНК-34а отмечается низкий уровень экспрессии рецептора PDL1 и наоборот. Уровень микроРНК 10b повышается при также при раке молочной железы и глиоме и также при меланоме. Повышенный уровень данной микроРНК объясняется ее взаимодействием с промоторным участком гена TWIST, который вовлечен в формирование фенотипа клеток, кроме этого МикроРНК 10b учувствует в угнетении экспрессию гена HOXD10, за свет чего увеличивается метастатическая активность клеток. При меланоме понижаются уровни микроРНК-15 и МикроРНК-16, генами-мишенями которых являются: ген CDK1, ген ETS1, ген BCL-2 и ген JUN, активные участники опухолевого прогрессирования. На линии мышей было показано, что делеция участка 13q14.3, который содержит микроРНК-15 и микроРНК-16, вызывает развитие автономных лимфопролиферативных заболеваний. Так же и у человека течение хронической лимфоцитарной лейкемии часто сопровождается частичной делецией данного локуса.The expression level of the main representatives of the miRNA34 family (-34a, -34b and -34c) decreases in melanoma. At the same time, the level of expression of these miRNAs is determined by the p53 gene. MicroRNA-34a is characterized by participation in apoptosis initiated by the p53 protein; it is involved in the suppression of the anti-apoptotic protein sirtulin 1 (SIRT1). Another mechanism involves miRNA34c. It contributes to the suppression of tumor growth by influencing mRNA and changing the expression of a number of genes, such as genes for anti-apoptotic proteins (for example, BCL-2), cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) and cyclin-dependent kinase 6 CDK6, as well as genes whose proteins are associated with metastasis (MYC , MET, Notch, and AXL). More and more data are emerging on the association of miRNA34a expression with programmed cell death 1 (PDL1) receptors. An increased level of expression of the PDL1 receptor on the surface of immunocompetent cells of patients with malignant neoplasms is considered as a negative prognostic factor. Here we observe an inverse relationship: at high levels of microRNA-34a, a low level of expression of the PDL1 receptor is observed and vice versa. The level of microRNA 10b is increased also in breast cancer and glioma and also in melanoma. The increased level of this microRNA is explained by its interaction with the promoter region of the TWIST gene, which is involved in the formation of the cell phenotype, in addition, MicroRNA 10b is involved in the suppression of the expression of the HOXD10 gene, which increases the metastatic activity of cells. In melanoma, the levels of microRNA-15 and MicroRNA-16 decrease, the target genes of which are: the CDK1 gene, the ETS1 gene, the BCL-2 gene and the JUN gene, active participants in tumor progression. It has been shown in mice that deletion of the 13q14.3 region, which contains microRNA-15 and microRNA-16, causes the development of autonomic lymphoproliferative diseases. Similarly, in humans, the course of chronic lymphocytic leukemia is often accompanied by a partial deletion of this locus.
МикроРНК, определяемые в плазме крови пациентов с меланомой на различных стадиях и представляющие собой прогностическую ценность при меланоме.MicroRNAs determined in the blood plasma of patients with melanoma at various stages and representing a prognostic value in melanoma.
В процессе прогрессии опухоли наряду с соматическими мутациями BRAF, V600K, K601E, NRAS, CDKN2A, PTEN и ТР53 и проч. происходят нарушения не только на структурном уровне ДНК, но и на эпигенетическом: наряду с изменением уровня метилирования происходят изменения уровней экспрессии микроРНК. Данные изменения, в свою очередь, приводят к изменению уровней экспрессии различных мРНК, что непосредственно приводит к изменению интенсивности синтеза различных белков и соответственно к изменению функционального состояния клетки, например, к повреждению апоптотических механизмов и проч.In the process of tumor progression, along with somatic mutations of BRAF, V600K, K601E, NRAS, CDKN2A, PTEN and TP53, etc. disturbances occur not only at the structural level of DNA, but also at the epigenetic level: along with changes in the level of methylation, changes occur in the levels of microRNA expression. These changes, in turn, lead to a change in the levels of expression of various mRNAs, which directly leads to a change in the intensity of the synthesis of various proteins and, accordingly, to a change in the functional state of the cell, for example, to damage to apoptotic mechanisms, etc.
Изменение уровня экспрессии микроРНК может быть как в сторону повышения уровня экспрессии, так и в сторону снижению уровня экспрессии микроРНК. Отчасти динамика изменений зависит от таргетных для конкретной микроРНК генов: микроРНК-4731, уровень экспрессии которой снижен, ингибирует белок SSX4, блокирование функции которого привело к уменьшению размеров 2D колоний трех различных клеточных линий меланомы, также функцию этого белка связывают с подавлением клеточного и иммунного ответа организма на опухолевые клетки.Changes in the miRNA expression level can be both in the direction of increasing the expression level, and in the direction of decreasing the miRNA expression level. In part, the dynamics of changes depends on the genes targeted for a particular miRNA: miRNA-4731, the expression level of which is reduced, inhibits the SSX4 protein, blocking the function of which led to a decrease in the size of 2D colonies of three different melanoma cell lines, and the function of this protein is associated with suppression of the cellular and immune response body on tumor cells.
Снижение уровня экспрессии микроРНК-200b наблюдается не только при меланоме, но и, например, при раке легких, при этом отмечается ингибирующий эффект действия данной микроРНК на пролиферацию злокачественных клеток и рост метастазов.A decrease in the expression level of microRNA-200b is observed not only in melanoma, but also, for example, in lung cancer, while an inhibitory effect of this microRNA on the proliferation of malignant cells and the growth of metastases is noted.
Уровень экспрессии микроРНК-211 также имеет тенденцию к снижению при развитии меланомы, что связано с гиперметилированием определенных участков ДНК и ассоциировано со снижением чувствительности клеток к химиотерапии, в том числе цисплатином.The expression level of microRNA-211 also tends to decrease with the development of melanoma, which is associated with hypermethylation of certain DNA regions and is associated with a decrease in cell sensitivity to chemotherapy, including cisplatin.
Повышение уровня экспрессии микроРНК198 при развитии меланомы связано с нарушением механизмов иммунной защиты, в частности, наблюдается при дисфункции CD8 позитивных клеток. Одной из микроРНК, играющих ключевую роль в развитии меланомы, является микроРНК21, повышение уровня экспрессии которой наблюдается на всех этапах развития злокачественного процесса и при меланоме превышает в 8,6 раз уровень экспрессии микроРНК21, характерный для доброкачественных меланоцитов.An increase in the expression level of miRNA198 during the development of melanoma is associated with a violation of the mechanisms of immune defense, in particular, it is observed in the dysfunction of CD8 positive cells. One of the miRNAs that play a key role in the development of melanoma is miRNA21, an increase in the expression level of which is observed at all stages of the development of the malignant process and in melanoma exceeds the expression level of miRNA21 characteristic of benign melanocytes by 8.6 times.
Из уровня техники известен способ определения риска развития меланомы, описанный в патенте «Паттерны микроРНК для диагностики, прогноза и лечения меланомы» [US 8980549 B2, 01.08.2010]. Данный способ включает в себя получение образца опухолевой ткани от пациента с меланомой, выделение и определение уровней экспрессии микроРНК и методику применения микроРНК в качестве прогностического маркера развития меланомы.The prior art method for determining the risk of developing melanoma, described in the patent "MicroRNA patterns for the diagnosis, prognosis and treatment of melanoma" [US 8980549 B2, 01.08.2010]. This method includes obtaining a tumor tissue sample from a patient with melanoma, isolating and determining miRNA expression levels, and using miRNA as a prognostic marker for melanoma development.
Недостатком данного метода является, использование в качестве аналита для исследования только опухолевой ткани, а также отсутствие этапа предварительного выделения экзосом, для получения более специфичных данных по микроРНК.The disadvantage of this method is the use of only tumor tissue as an analyte for the study, as well as the absence of a preliminary exosome isolation step to obtain more specific data on microRNA.
Помимо этого, известен способ диагностики меланомы на основе панели нескольких микроРНК «Способ диагностики, стадии и мониторинга меланомы с использованием экспрессии гена микроРНК» [WO 2019068139 A1, 25.07.2007]. Метод включает в себя забор биологического материала от пациента, выделение микроРНК и определение профиля экспрессии в плазме микроРНК с оценкой по суммарным микроРНК развития меланомы. Основным недостатком метода является применение уровней экспрессии свободных микроРНК, воспроизводимость и специфичность которых ниже воспроизводимости экзосомальных микроРНК.In addition, there is a known method for diagnosing melanoma based on a panel of several miRNAs "Method for diagnosing, staging and monitoring melanoma using miRNA gene expression" [WO 2019068139 A1, 25.07.2007]. The method includes taking biological material from a patient, isolating microRNAs, and determining the expression profile in plasma of microRNAs with an assessment of melanoma development by total microRNAs. The main disadvantage of the method is the use of expression levels of free miRNAs, the reproducibility and specificity of which are lower than those of exosomal miRNAs.
Формула 1 «Расчет коэффициента развития меланомы», описывающей способ расчета коэффициента, в соответствии с которым возможно диагностировать развитие меланомы.Formula 1 "Calculation of the coefficient of development of melanoma", describing the method for calculating the coefficient, according to which it is possible to diagnose the development of melanoma.
Табл. 1 «Значения поправочных коэффициентов микроРНК», содержащая в себе значение поправочных коэффициентов для каждой микроРНК.Tab. 1 “Values of correction factors for miRNA”, which contains the value of correction factors for each microRNA.
Табл. 2 «Уровни экспрессии экзосомальных микроРНК в плазме крови в различных группах пациентов», содержащая в себе значения уровней экспрессии экзосомальных микроРНК в плазме крови здоровых доноров, пациентов с 1-2 стадией меланомы и пациентов с 3-4 стадией меланомы.Tab. 2 "Exosomal microRNA expression levels in blood plasma in various groups of patients", which contains the values of exosomal microRNA expression levels in the blood plasma of healthy donors, patients with stage 1-2 melanoma and patients with stage 3-4 melanoma.
Табл. 3 «Коэффициенты развития меланомы, полученные по значениям уровней экспрессии микроРНК из плазмы крови для пациентов различных групп», содержащая в себе числовые коэффициенты развития меланомы у здоровых доноров, пациентов с 1-2 стадией меланомы и пациентов с 3-4 стадией меланомы.Tab. 3 "Coefficients of development of melanoma obtained from the values of microRNA expression levels from blood plasma for patients of various groups", containing the numerical coefficients of development of melanoma in healthy donors, patients with 1-2 stages of melanoma and patients with 3-4 stages of melanoma.
Техническим результатом заявленного способа является возможность определения стадии меланомы по изменению профиля экспрессии следующих микроРНК в экзосомах, выделенных из плазмы крови: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроРНК-1et7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, микроPHK-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а.The technical result of the claimed method is the ability to determine the stage of melanoma by changing the expression profile of the following miRNAs in exosomes isolated from blood plasma: miRNA-473, miRNA-509-5p, miRNA-1et7b, miRNA-143, miRNA-193b, miRNA-106a, microRNA -21, miRNA-34a, miRNA-224, microRNA-let-7e, miRNA-145, miRNA-203 and miRNA-18a.
Вышеприведенный технический результат достигается благодаря тому, что заявленный способ включает следующие стадии: забор периферической венозной крови (не менее 1 мл) в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА; центрифугировании не позднее чем через 45 минут после взятия крови при 3000 g 15 минут, при комнатной температуре, заморозки при -80°С или использование сразу после центрифугирования; выделение экзосом методом ультрацентрифугирования, выделения экзосомальных микроРНК; постановка реакции ПНР в реальном времени с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием меланомы: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроPHK-let7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, микроРНК-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а.; расчета коэффициента, диагностирующего развитие меланомы по формуле (1) «Расчет коэффициента характеризующего стадию меланомы у пациента в соответствии с полученными числовыми значениями».The above technical result is achieved due to the fact that the claimed method includes the following steps: taking peripheral venous blood (at least 1 ml) into a test tube with EDTA anticoagulant; centrifugation no later than 45 minutes after blood sampling at 3000 g 15 minutes, at room temperature, freezing at -80°C or use immediately after centrifugation; isolation of exosomes by ultracentrifugation, isolation of exosomal microRNAs; staging a real-time NRP reaction with primers for certain types of microRNA associated with the development of melanoma: miRNA-473, miRNA-509-5p, microRNA-let7b, miRNA-143, miRNA-193b, miRNA-106a, miRNA-21, miRNA- 34a, miRNA-224, miRNA-let-7e, miRNA-145, miRNA-203 and miRNA-18a; calculation of the coefficient diagnosing the development of melanoma according to the formula (1) "Calculation of the coefficient characterizing the stage of melanoma in a patient in accordance with the obtained numerical values".
Перерасчет концентраций микроРНК, включаемый в расчет, осуществляется в соответствии с поправочными коэффициентами (см. таблицу 1).The recalculation of microRNA concentrations included in the calculation is carried out in accordance with the correction factors (see Table 1).
Диагностика стадии меланомы осуществляется по цифровому показателю коэффициента R, когда R в диапазоне от 0 до 0,99 - здоровые доноры, если показатель находится в интервале от 1 до 1,99 - 1-2 стадия меланомы, если показатель выше 2-3-4 стадия меданомы.Diagnosis of the stage of melanoma is carried out according to the digital indicator of the coefficient R, when R is in the range from 0 to 0.99 - healthy donors, if the indicator is in the range from 1 to 1.99 - melanoma stage 1-2, if the indicator is higher than 2-3-4 medanoma stage.
Заявляемый способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.The claimed method can be illustrated by the following examples.
Пример 1. Определение уровней экспрессии микроРНК в плазме крови различных групп пациентов и у здоровых доноровExample 1. Determination of microRNA expression levels in blood plasma of various groups of patients and in healthy donors
У 10 здоровых доноров (возраст 38-65 лет, 5 мужчин, 5 женщин) в амбулаторных условиях производят забор 1 мл крови в пробирку ЭДТА К2 (забор возможен в любую пробирку, где в качестве антикоагулянта используется ЭДТА). Кровь в течение 45 часов после забора центрифугирует в течение 15 минут на 3000 g, отбирают в чистую пробирку плазму, готовят несколько аликвот по 250 мкл и замораживают при -80°С. Аналогичным образом производят забор материала у 10 пациентов (6 мужчин, 4 женщин, возраст 38-55 лет) с 1-2 стадией меланомы и у 10 пациентов с 3-4 стадией меланомы (5 мужчин, 5 женщин, возраст 42-59 лет).In 10 healthy donors (age 38-65 years, 5 men, 5 women), 1 ml of blood is taken on an outpatient basis in an EDTA K2 tube (sampling is possible in any tube where EDTA is used as an anticoagulant). Blood is centrifuged for 15 minutes at 3000 g within 45 hours after collection, plasma is taken into a clean tube, several aliquots of 250 μl are prepared and frozen at -80°C. Similarly, material is taken from 10 patients (6 men, 4 women, age 38-55 years) with stage 1-2 melanoma and in 10 patients with stage 3-4 melanoma (5 men, 5 women, age 42-59 years) .
Затем следует этап выделения экзосомальной фракции микроРНК, для чего необходимы следующие действия: 1) проведение центрифугирования в режиме 14000 g в течение 10 минут при комнатной температуре и отбирают супернатант; 3) проведение ультрацентрифугирования на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 1,5 часов при +4С. Супернатант быдрасывают, а полученный на осадок разводят в 200 мкл безнуклеазной воды. К полученному раствору добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, далее проводят выделение миркоРНК на наборах "miRNeasy seram/plasma advanced kit" (Qiagen Q-217004) по стандартному протоколу: наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды и колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, затем проводят центрифугирование при 3000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи набора для обратной транскрипции "miRCURY LNA RT Kit" (Qiagen-339340) по стандартному протоколу.This is followed by the step of isolating the exosomal microRNA fraction, which requires the following steps: 1) centrifugation at 14,000 g for 10 minutes at room temperature and the supernatant is taken; 3) ultracentrifugation in an Avanti 301 centrifuge (rotor JA-30.50) at 100,000 g for 1.5 hours at +4C. The supernatant is drawn, and the precipitate obtained is diluted in 200 µl of nuclease-free water. 5 μl of proteinase K is added to the resulting solution, incubated at 56°C for 1 hour, then miRNAs are isolated using miRNeasy seram/plasma advanced kits (Qiagen Q-217004) according to the standard protocol: applied to an Exiqon column, after which centrifugation is carried out at 2000 g in an eppendorf 5104 centrifuge for 5 minutes at room temperature, then the column is washed 3 times with washing buffer, after each washing, centrifugation is carried out at 2000 g in an eppendorf 5104 centrifuge for 5 minutes at room temperature, then 20 μl of nuclease-free water and the column are left for 10 minutes at room temperature, then centrifugation is carried out at 3000 g in an eppendorf 5104 centrifuge for 10 minutes at room temperature, after which a reverse transcription reaction is carried out using the reverse transcription kit "miRCURY LNA RT Kit" ( Qiagen-339340) using the standard protocol.
Далее с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени с использованием наборов "meRCURY LNA SYBR Green PCR kit" (Qiagen-339347) на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием меланомы: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроPHK-let7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, микроРНК-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а.Further, in order to identify individual types of microRNAs, a polymerase chain reaction with real-time detection is carried out using the "meRCURY LNA SYBR Green PCR kit" (Qiagen-339347) on an Applied Biosystems 7500 instrument with primers for individual types of microRNAs associated with the development of melanoma: miRNA-473, miRNA-509-5p, microRNA-let7b, miRNA-143, miRNA-193b, miRNA-106a, miRNA-21, miRNA-34a, miRNA-224, microRNA-let-7e, miRNA-145, miRNA- 203 and miRNA-18a.
Затем при помощи программного обеспечения, поставляемого производителем оборудования (GenEx 6.1 - qPCR Data Analysis Software, bioMCC, 29.02.2016), вычисляют количество каждой из исследуемых микроРНК, выделенной из каждой фракции, полученные данные приводятся в формате таблицы.Then, using the software supplied by the equipment manufacturer (GenEx 6.1 - qPCR Data Analysis Software, bioMCC, February 29, 2016), the amount of each of the studied microRNAs isolated from each fraction is calculated, the obtained data are presented in a table format.
Затем проводят расчет поправочных коэфициентов для каждой микроРНК. Значения поправочных коэффициентов отображены в табл. №1.Then, correction factors are calculated for each miRNA. The values of the correction factors are displayed in table. No. 1.
Расчет коэффициента, отражающего развитие меланомы происходит по формуле 1, приведенной выше.The calculation of the coefficient reflecting the development of melanoma occurs according to formula 1 above.
Значения уровней экспрессии экзосомальных микроРНК отражены в табл. №2.The expression levels of exosomal miRNAs are shown in Table 1. No. 2.
Полученные коэффициенты отражены в табл. №3The obtained coefficients are reflected in table. No. 3
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020108781A RU2769927C2 (en) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | METHOD FOR DIAGNOSING MELANOMA USING EXOSOMAL microRNA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020108781A RU2769927C2 (en) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | METHOD FOR DIAGNOSING MELANOMA USING EXOSOMAL microRNA |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020108781A RU2020108781A (en) | 2021-08-30 |
| RU2020108781A3 RU2020108781A3 (en) | 2021-08-30 |
| RU2769927C2 true RU2769927C2 (en) | 2022-04-08 |
Family
ID=77662727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020108781A RU2769927C2 (en) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | METHOD FOR DIAGNOSING MELANOMA USING EXOSOMAL microRNA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2769927C2 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2181332B1 (en) * | 2007-07-25 | 2013-04-10 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Exosome-associated microrna as a diagnostic marker |
| RU2571507C1 (en) * | 2014-10-09 | 2015-12-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Diagnostic and monitoring technique for oncology diseases with use of blood exosomes |
| RU2583871C1 (en) * | 2015-03-12 | 2016-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН) | Method for differential diagnosis of gliomas of human brain |
| WO2019068139A1 (en) * | 2017-10-03 | 2019-04-11 | GeneSeq Pty Ltd | A method of diagnosis, staging and monitoring of melanoma using microrna gene expression |
| RU2709651C1 (en) * | 2018-11-29 | 2019-12-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for differential diagnosis of gliomas based on analysis of gene expression and micro-rna |
-
2020
- 2020-02-28 RU RU2020108781A patent/RU2769927C2/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2181332B1 (en) * | 2007-07-25 | 2013-04-10 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Exosome-associated microrna as a diagnostic marker |
| RU2571507C1 (en) * | 2014-10-09 | 2015-12-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Diagnostic and monitoring technique for oncology diseases with use of blood exosomes |
| RU2583871C1 (en) * | 2015-03-12 | 2016-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН) | Method for differential diagnosis of gliomas of human brain |
| WO2019068139A1 (en) * | 2017-10-03 | 2019-04-11 | GeneSeq Pty Ltd | A method of diagnosis, staging and monitoring of melanoma using microrna gene expression |
| RU2709651C1 (en) * | 2018-11-29 | 2019-12-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for differential diagnosis of gliomas based on analysis of gene expression and micro-rna |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2020108781A (en) | 2021-08-30 |
| RU2020108781A3 (en) | 2021-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Elhamamsy et al. | Circulating miR-92a, miR-143 and miR-342 in plasma are novel potential biomarkers for acute myeloid leukemia | |
| US20150126374A1 (en) | Hypermethylated gene markers for head and neck cancer | |
| US20200308655A1 (en) | Plasma Microribonucleic Acids as Biomarkers for Endometriosis and Endometriosis-Associated Ovarian Cancer | |
| CN109837343B (en) | Early lung adenocarcinoma specific exosome miRNA and application thereof | |
| EP3115467B1 (en) | Method for assisting detection of pancreatic cancer | |
| Andreasen et al. | Adenoid cystic carcinomas of the salivary gland, lacrimal gland, and breast are morphologically and genetically similar but have distinct microRNA expression profiles | |
| WO2021243904A1 (en) | Genetic marker combination and application thereof | |
| EP2596136B1 (en) | Marker consisting of plasma microrna and new method for diagnosis of hepatocellular carcinoma | |
| WO2021243906A1 (en) | Genetic marker combination and application thereof | |
| Baumann et al. | Association of high miR-182 levels with low-risk prostate cancer | |
| CN112980947A (en) | Primer and kit for detecting circulating microRNA (microribonucleic acid) related to lung cancer diagnosis and treatment | |
| KR20110015013A (en) | Methods for assessing colorectal cancer and compositions for use therein | |
| WO2017221927A1 (en) | Mmp1 gene transcript for use as marker for diagnosis of ovarian cancer prognosis, and test method | |
| RU2769927C2 (en) | METHOD FOR DIAGNOSING MELANOMA USING EXOSOMAL microRNA | |
| CN109563548B (en) | In vitro method for identifying pancreatic cancer or intraductal papillary myxoma of pancreas | |
| CN116083579A (en) | circRNA-miRNA-mRNA regulation network for non-small cell lung cancer diagnosis and application thereof | |
| RU2547583C2 (en) | Diagnostic technique for breast cancer | |
| JP6616983B2 (en) | How to test for mild cognitive impairment | |
| KR102534200B1 (en) | Biomarkers for diagnosing metastasis of cervical cancer, and uses thereof | |
| EP2083087A1 (en) | Method for determining tongue cancer | |
| CN115125304B (en) | CERNA regulation network for early diagnosis or detection of non-small cell lung cancer and application thereof | |
| US20150080229A1 (en) | Plasma microribonucleic acids as biomarkers for endometriosis and endometriosis-associated ovarian cancer | |
| Bhachu | The role of circulating microRNAs in the pathogenesis of IgA nephropathy | |
| Ismaila et al. | Meta Gene | |
| Huy et al. | STUDY OF rs1059513 STAT6 POLYMORPHISM IN HBsAg (+) HEPATOCELLULAR CARCINOMA PATIENTS |