RU2701733C1

RU2701733C1 - Live vaccine based on enterococcus faecium l3 probiotic strain for prevention of infection caused by streptococcus pneumonie

Info

Publication number: RU2701733C1
Application number: RU2018144657A
Authority: RU
Inventors: Александр Николаевич Суворов; Татьяна Виталиевна Гупалова; Евгения Владимировна Кулешевич; Галина Федоровна Леонтьева; Татьяна Анатольевна Крамская; Александра Дмитриевна Золотарева
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2019-10-01

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: present group of inventions refers to medicine, namely to microbiology, molecular genetics and biotechnology, and concerns creation of live vaccine on the basis of strain Enterococcus faecium L3 for preventing and treating pneumonia caused by pneumococcal Streptococcus pneumoniae. For this purpose in structure of saws Eneterococcus faecium L3 include an antigen of a clinically relevant pathogenic microorganism. This is achieved by introducing a gene pspf pathogenic pneumococci into the chromosomal DNA of the probiotic strain Eneterococcus faecium L3.

EFFECT: vaccine created on the basis of a probiotic strain of microorganisms possesses evident immunogenic and protective effects that provides its effectiveness in relation to any serum pneumococcus.

3 cl, 12 dwg, 1 tbl, 6 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин для профилактики и лечения пневмонии, вызываемой пневмококками Streptococcus pneumoniae. The invention relates to medicine, microbiology, molecular genetics and biotechnology and can be used in the medical industry in the production of live vaccines for the prevention and treatment of pneumonia caused by Streptococcus pneumoniae pneumococci .

Проблема вакцинной профилактики инфекций, вызываемых стрептококками, стафилококками и пневмококками, только в последнее время стала рассматриваться в качестве актуальной проблемы в медицинской науке.The problem of vaccine prophylaxis of infections caused by streptococci, staphylococci and pneumococci has only recently begun to be considered as an urgent problem in medical science.

Streptococcus pneumoniae является наиболее частым (в 20-60%) возбудителем опасного заболевания - внебольничной пневмонии, смертность от которой составляет 5%. Кроме того, Streptococcus pneumoniae может вызывать такие заболевания человека, как средний отит, острый негнойный синусит, ринит, ларингит, бронхит, менингит, сепсис, остеомилит, септический артрит, эндокардит, перитонит и другие. Streptococcus pneumoniae является вторым (после HaemophilusHYPERLINK "http://www.gastroscan.ru/handbook/118/7781" HYPERLINK "http://www.gastroscan.ru/handbook/118/7781"influenzae ) по распространённости и важности пневмотропным микроорганизмом в микробном спектре при хронических бронхолегочных заболеваниях у детей в период обострения. Streptococcus pneumoniae is the most common (20-60%) causative agent of a dangerous disease - community-acquired pneumonia, the mortality rate from which is 5%. In addition, Streptococcus pneumoniae can cause human diseases such as otitis media, acute purulent sinusitis, rhinitis, laryngitis, bronchitis, meningitis, sepsis, osteomilitis, septic arthritis, endocarditis, peritonitis and others. Streptococcus pneumoniae is the second (after HaemophilusHYPERLINK "http://www.gastroscan.ru/handbook/118/7781" HYPERLINK http://www.gastroscan.ru/handbook/118/7781"influenzae ) pneumotropic microorganism in terms of its prevalence and importance in the microbial spectrum for chronic bronchopulmonary diseases in children during the exacerbation period.

Для пневмококков характерна мощная полисахаридная капсула, которая выполняет функцию защиты микроорганизма от опсонизации и последующего фагоцитоза. Вследствие того, что капсула пневмококков является основным поверхностным элементом, распознаваемым системой иммунитета, капсульный полисахарид характеризуется наибольшей вариабельностью. К настоящему времени обнаружен 91 различный капсульный тип пневмококков, но большинство (более 90%) инвазивных пневмококковых заболеваний вызывается 23 наиболее распространенными серотипами. Большое количество иммунологических вариантов капсульного полисахарида является фактором, осложняющим создание эффективных полисахаридных вакцинных препаратов.For pneumococci, a powerful polysaccharide capsule is characteristic, which performs the function of protecting the microorganism from opsonization and subsequent phagocytosis. Due to the fact that the pneumococcal capsule is the main surface element recognized by the immune system, the capsular polysaccharide is characterized by the greatest variability. To date, 91 different capsular types of pneumococci have been discovered, but most (more than 90%) of invasive pneumococcal diseases are caused by the 23 most common serotypes. A large number of immunological variants of the capsular polysaccharide is a factor complicating the creation of effective polysaccharide vaccine preparations.

Заболеть пневмококковой инфекцией может любой человек, но существуют группы риска, в большей степени подверженные заболеванию, это лица в возрасте от 65 лет, маленькие дети, лица, имеющие определенные проблемы со здоровьем, лица с ослабленной иммунной системой, курильщики. Пневмококковая инфекция нередко с трудом поддается лечению, поскольку многие циркулирующие эпидемические штаммы пневмококков приобрели множественную лекарственную устойчивость к антибиотикам. Поскольку пневмония считается распространенным заболеванием как у взрослых, так и у детей, она требует ответственного проведения диагностических и лечебных мероприятий.Anyone can get pneumococcal infection, but there are risk groups that are more susceptible to the disease, these are people over the age of 65, small children, people with certain health problems, people with a weakened immune system, smokers. Pneumococcal infection is often difficult to treat, since many circulating epidemic strains of pneumococci have acquired multidrug resistance to antibiotics. Since pneumonia is considered a common disease in both adults and children, it requires responsible diagnostic and therapeutic measures.

Для предупреждения развития заболевания используются вакцины. Согласно позиции ВОЗ (Всемирная Организация Здравоохранения) и Российского респираторного общества, «Вакцинация - единственная возможность предотвратить развитие пневмококковой инфекции».Vaccines are used to prevent the development of the disease. According to the position of WHO (World Health Organization) and the Russian Respiratory Society, “Vaccination is the only way to prevent the development of pneumococcal infection”.

На данный момент FDA (Food and Drug Administration) одобрило 2 типа вакцин: пневмококковую полисахаридную вакцину и пневмококковую конъюгированную вакцину.Currently, the FDA (Food and Drug Administration) has approved 2 types of vaccines: pneumococcal polysaccharide vaccine and pneumococcal conjugate vaccine.

На территории России используется несколько препаратов для защиты от пневмококка. В их составе и установленном графике проведения прививок существуют значительные различия. Но имеющиеся вакцины защищают лишь от наиболее опасных серотипов Streptococcus pneumoniae. Пневмококковая вакцина, выпускаемая под торговым названием «Пневмо 23» (ППСВ), производится во Франции компанией «Санофи Пастер» и зарегистрирована в России. Она предназначена для вакцинирования детей, которым уже исполнилось 2 года, и взрослых, которые попадают в группу риска и болеют вирусными респираторными заболеваниями, пневмониями, отитами, диабетом. In Russia, several drugs are used to protect against pneumococcus. In their composition and the established schedule for vaccinations, there are significant differences. But the available vaccines protect only against the most dangerous serotypes of Streptococcus pneumoniae . Pneumococcal vaccine, marketed under the trade name Pneumo 23 (PPSV), is produced in France by Sanofi Pasteur and registered in Russia. It is intended for vaccination of children who are already 2 years old, and adults who are at risk and suffer from viral respiratory diseases, pneumonia, otitis media, diabetes.

У большинства здоровых взрослых людей, прошедших вакцинацию ППСВ, вырабатывается сопротивляемость большинству типов бактерий (антигены которых имеются в вакцине) в течение 2-3 недель после прививки. У лиц очень пожилого возраста, детей до 2 лет и людей с хроническими заболеваниями вакцинация может не привести к созданию стойкого иммунитета, либо иммунитет к заболеванию не возникает совсем (http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/languages/pneumococcalinfections.html#Russian). Для детей до 2 лет одновременно с вакцинацией показана профилактика с использованием антибиотиков [Bade A, Diot P, Lemarie E. Rev Pneumol Clin. 53(3): 128-37, (1997)].Most healthy adults who have received PPSV vaccination develop resistance to most types of bacteria (the antigens of which are present in the vaccine) within 2-3 weeks after vaccination. In very elderly people, children under 2 years old and people with chronic diseases, vaccination may not lead to the creation of a stable immunity, or the immunity to the disease does not arise at all (http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/languages/pneumococcalinfections. html # Russian). For children under 2 years of age, antibiotic prophylaxis is indicated simultaneously with vaccination [Bade A, Diot P, Lemarie E. Rev Pneumol Clin. 53 (3): 128-37, (1997)].

После вакцинации могут возникнуть осложнения: покраснение, болезненные ощущения в месте инъекции, высокая температура, мышечные боли или более серьезные местные реакции [Donalisio MR, Rodrigues SM, Mendes ET, Krutman M. J Bras Pneumol. 33(1):51-6 (2007)].Complications may occur after vaccination: redness, pain at the injection site, fever, muscle pain, or more serious local reactions [Donalisio MR, Rodrigues SM, Mendes ET, Krutman M. J Bras Pneumol. 33 (1): 51-6 (2007)].

ППСВ оказалась достоверно эффективна лишь для людей с низким риском заболевания пневмококковой инфекцией. Оказалось, что ППСВ не уменьшает частоту пневмонии и связанную с ней смертность и лишь немного уменьшает риск заражения тяжелой пневмококковой инфекцией. Также показано, что данная вакцина не защищает от пневмококков, чувствительных к пенициллину в больших концентрациях [Pneumococcal vaccine: a second look. Solution for SC or IM injection: pneumococcal vaccine. Prescrire Int. 7 (33):16-8, (1998)]. Такие же результаты были показаны и для людей страрше 65 лет (Pneumococcal vaccination for elderly subjects: license extension. Still no proof of clinical efficacy. Prescrire Int. 9 (48):106-9, (2000)].PPSV was reliably effective only for people with a low risk of pneumococcal infection. It turned out that PPSV does not reduce the frequency of pneumonia and the associated mortality and only slightly reduces the risk of contracting a severe pneumococcal infection. It is also shown that this vaccine does not protect against pneumococci sensitive to penicillin in high concentrations [Pneumococcal vaccine: a second look. Solution for SC or IM injection: pneumococcal vaccine. Prescrire Int. 7 (33): 16-8, (1998)]. The same results were shown for people over 65 years of age (Pneumococcal vaccination for elderly subjects: license extension. Still no proof of clinical efficacy. Prescrire Int. 9 (48): 106-9, (2000)].

Действующим веществом ППСВ являются полисахариды 23 серотипов Streptococcus, вызывающих до 90% инвазивных заболеваний пневмококковой этиологии. Полисахарид - это антиген, не связанный с реакцией Т-клеток, потому вызывает лишь краткосрочный иммунитет без иммунной памяти; вакцины, содержащие только данные вещества, неэффективны, что показано у детей до 2 лет (Greenwood В М et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 74:756-760 (1980)]; международная заявка на изобретение WO 2010120921 A1, дата приоритета 16.04.2009). Также тот факт, что существует порядка 90 серотипов пневмококков, поскольку возбудители заболеваний в разных областях земного шара различаются, затрудняет создание универсальной вакцины на основе полисахаридов.The active ingredient in PPSV are polysaccharides of 23 Streptococcus serotypes, causing up to 90% of invasive diseases of pneumococcal etiology. A polysaccharide is an antigen that is not associated with the reaction of T cells, therefore it causes only short-term immunity without immune memory; vaccines containing only these substances are ineffective, as shown in children under 2 years of age (Greenwood BM et al., Trans R Soc Trop Med Hyg 74: 756-760 (1980)]; international patent application WO 2010120921 A1, date priority 04.16.2009). Also, the fact that there are about 90 serotypes of pneumococci, since pathogens differ in different regions of the globe, makes it difficult to create a universal polysaccharide vaccine.

Вакцина «Превенар», которая используется на территории Федерации, изготавливается в США компанией «Вайет». Она считается более иммуногенной. Это означает, что антигены патогенных микроорганизмов дольше удерживаются в организме. Вакцина «Превенар» предназначена для детей от 2 месяцев до 5 лет. Она начала широко использоваться с 2000 года в США. На сегодня она применяется в 88 странах и в 42 странах включена в национальные календари вакцинации. В России вакцина зарегистрирована в конце 2008 г. Это другой тип вакцин для профилактики пневмококковой инфекции - конъюгированная вакцина. Кусочки полисахаридной оболочки семи различных типов пневмококка соединили со специальным белком-носителем, что сделало эту вакцину эффективной у малышей с 2-х мес. жизни. В неё включены 7 так называемых «педиатрических» серотипов бактерии, которые чаще всего вызывают пневмококковую инфекцию в той или иной форме у детей раннего возраста.The Prevenar vaccine, which is used on the territory of the Federation, is manufactured in the United States by Wyeth. It is considered more immunogenic. This means that the antigens of pathogenic microorganisms last longer in the body. The Prevenar vaccine is intended for children from 2 months to 5 years. It began to be widely used since 2000 in the USA. Today it is used in 88 countries and in 42 countries is included in national vaccination calendars. In Russia, the vaccine was registered at the end of 2008. This is another type of vaccine for the prevention of pneumococcal infection - the conjugate vaccine. Pieces of the polysaccharide membrane of seven different types of pneumococcus were combined with a special carrier protein, which made this vaccine effective in babies from 2 months. of life. It includes 7 so-called “pediatric” bacterial serotypes, which most often cause pneumococcal infection in one form or another in young children.

В конъюгированной вакцине, показанной детям, наряду с полисахаридами 7 серотипов пневмококков, которые наиболее часто вызывают заболевания среди детей, также содержится белок-носитель CRM 197 (мутант дифтерийного токсина), в качестве адъюванта. Благодаря наличию адъюванта в препарате вакцины данный антигенный комплекс хорошо распознается Т-клетками, обеспечивая устойчивый иммунитет [Schneerson R, Barrera O, Sutton A, Robbins JB. J Exp Med. 152(2):361-76, (1980)]. CRM 197 связывается с гепарин-связывающим эпидермальным фактором роста и может его ингибировать. Несмотря на то, что токсичность CRM197 примерно в 106 раз меньше, чем дифтерийного токсина, все же его использование должно быть осторожным, особенно в высоких дозировках [Takuya Kageyama, Minako Ohishil, Shingo Miyamoto, Hiroto Mizushima, Ryo Iwamoto and Eisuke Mekada. Diphtheria Toxin Mutant CRM197 Possesses Weak EF2-ADP-ribosyl Activity that Potentiates its Anti-tumorigenic Activity. Received April 16, 2007. Accepted May 2, 2007]. Кроме того, после вакцинации могут возникнуть осложнения: покраснение, чувствительность или припухлость в месте введения препарата, температура выше 38-39С, а также беспокойность, сонливость, потеря аппетита. Более того, вакцинацию рекомендуют проводить детям до 2 лет четыре раза, от 2 до 5 лет - в зависимости от возраста ребенка, В общей сложности для вакцинации ребенка требуется введение как минимум 4 доз, что дорого и небезопасно.The conjugate vaccine shown to children, along with the polysaccharides of 7 serotypes of pneumococci, which most often cause diseases among children, also contains the carrier protein CRM 197 (diphtheria toxin mutant) as an adjuvant. Due to the presence of an adjuvant in the vaccine preparation, this antigenic complex is well recognized by T cells, providing stable immunity [Schneerson R, Barrera O, Sutton A, Robbins JB. J Exp Med. 152 (2): 361-76, (1980)]. CRM 197 binds to and can inhibit heparin-binding epidermal growth factor. Although CRM197 is about 106 times less toxic than diphtheria toxin, its use should be careful, especially at high dosages [Takuya Kageyama, Minako Ohishil, Shingo Miyamoto, Hiroto Mizushima, Ryo Iwamoto and Eisuke Mekada. Diphtheria Toxin Mutant CRM197 Possesses Weak EF2-ADP-ribosyl Activity that Potentiates its Anti-tumorigenic Activity. Received April 16, 2007. Accepted May 2, 2007]. In addition, complications can occur after vaccination: redness, sensitivity, or swelling at the injection site, temperatures above 38-39 ° C, as well as anxiety, drowsiness, and loss of appetite. Moreover, vaccination is recommended for children under 2 years of age four times, from 2 to 5 years - depending on the age of the child. In total, at least 4 doses are required to vaccinate a child, which is expensive and unsafe.

Известна вакцина, двумя главными компонентами которой являются полисахарид оболочки N. meningitidi и белок PsaA S.pneumoniae (может также использоваться белок PspA) (международная заявка на изобретение WO2010120921 A1, дата приоритета 16.04.2009). Ввиду невозможности выработки иммунной памяти на полисахариды, использование полисахарида оболочки N. meningitidi в качестве компонента вакцины является неоправданным. A vaccine is known whose two main components are the polysaccharide membrane of N. meningitidi and the PsaA protein of S. pneumoniae (the PspA protein may also be used) (international patent application WO2010120921 A1, priority date 04.16.2009). Due to the impossibility of developing immune memory for polysaccharides, the use of the polysaccharide shell N. meningitidi as a component of the vaccine is unjustified.

В качестве вакцинных препаратов целесообразнее использовать поверхностные антигены пневмококков, которые способны вызывать и иммунный ответ, и формирование иммунологической памяти. Центральное место в такой разработке занимают белки пневмококков, полученные с использованием методов молекулярной биологии и рекомбинантной ДНК. По литературным данным, в качестве вакцинных кандидатов белковой природы наиболее перспективными антигенами являются три поверхностных белка пневмококков: PsaA, PspA, Spr1895 [Suvorov A., Dukhovlinov I., Leontieva G., Kramskaya T., Koroleva I., Grabovskaya K., Fedorova E., Chernyseva E., Klimov N., Orlov A., Uversky V. J Vaccines Vaccin, 6, 6: 1-8, (2015)].As vaccine preparations, it is more expedient to use surface antigens of pneumococci, which are capable of inducing both an immune response and the formation of immunological memory. The central place in this development is occupied by proteins of pneumococci obtained using the methods of molecular biology and recombinant DNA. According to the literature, the most promising antigens of protein nature are the three surface proteins of pneumococci: PsaA, PspA, Spr1895 [Suvorov A., Dukhovlinov I., Leontieva G., Kramskaya T., Koroleva I., Grabovskaya K., Fedorova E., Chernyseva E., Klimov N., Orlov A., Uversky V. J Vaccines Vaccin, 6, 6: 1-8, (2015)].

Белок PsaA высоко консервативен среди различных серотипов пневмококков и обусловливает адгезию бактерии и ее вирулентность [Berry AM, and Paton JC. Infect Immun. 64:5255-5262, (1996)]. Показано, что антитела к PsaA обладают перекрестной активностью относительно всех серотипов S. pneumonia.Protein PsaA is highly conserved among various serotypes of pneumococci and causes the adhesion of the bacterium and its virulence [Berry AM, and Paton JC. Infect Immun. 64: 5255-5262, (1996)]. Antibodies to PsaA have been shown to have cross-activity with respect to all serotypes of S. pneumonia.

PspA - это холин-связывающий поверхностный антиген, который ингибирует комплемент-опосредованный фагоцитоз, связывается с лактоферрином и предотвращает лактоферрин-опосредованную элиминацию бактериальных клеток [Hammerschmidt S., Bethe G., Remane P.H., Chhatwal G.S. Infect Immun 67:1683-1687, (1999)]. В данной статье также указывается белок PsaA, как перспективный для создания вакцины.PspA is a choline-binding surface antigen that inhibits complement-mediated phagocytosis, binds to lactoferrin and prevents lactoferrin-mediated elimination of bacterial cells [Hammerschmidt S., Bethe G., Remane P.H., Chhatwal G.S. Infect Immun 67: 1683-1687, (1999)]. This article also indicates the PsaA protein as a promising vaccine.

Белок PsaA считают перспективным иммуногеном и авторы международной заявки на изобретение WO 2004102199 A2, дата приоритета 16.05.2003. Авторы приводят данный белок и еще несколько белков (SlrA - ротамаза липопротеинов, IgA1 - протеаза, PpmA - белок созревания стрептококков) или их компонентов в качестве основы для создания вакцины. Описан гибридный белок, включающий PsaA и В-субъединицу холерный токсин в качестве адъюванта [Areas АР, Oliveira ML, Miyaji EN, Leite LC, Aires KA, Dias WO, Ho PL. Biochem Biophys Res Commun. 13; 321(1):192-6 (2006)]. Однако, использование холерного токсина, либо его компонентов в качестве компонента вакцины не безопасно, ввиду того, что люди высокочувствительны к холерному токсину, и даже 8 мкг токсина может вызвать сильную диарею.The PsaA protein is considered a promising immunogen and the authors of the international application for the invention WO 2004102199 A2, priority date 05.16.2003. The authors cite this protein and several more proteins (SlrA - rotamase of lipoproteins, IgA1 - protease, PpmA - maturation protein of streptococci) or their components as the basis for creating the vaccine. A hybrid protein has been described comprising PsaA and the B subunit of the cholera toxin as an adjuvant [Areas AP, Oliveira ML, Miyaji EN, Leite LC, Aires KA, Dias WO, Ho PL. Biochem Biophys Res Commun. 13; 321 (1): 192-6 (2006)]. However, using cholera toxin or its components as a component of the vaccine is not safe, because people are highly sensitive to cholera toxin, and even 8 micrograms of toxin can cause severe diarrhea.

Существуют и другие подходы при создании пневмококковых вакцин. Для доставки пневмококкового антигена используют пузырьки грамотрицательных микроорганизмов. Создан гибрид гена PspA и -лактамазы сальмонеллы. Иммунизация мышей пузырьками внешней мембраны, содержащие PspA, обеспечивает полную защиту против летальной дозы S. pneumonia. There are other approaches to creating pneumococcal vaccines. Vials of gram-negative microorganisms are used to deliver pneumococcal antigen. A hybrid of the PspA gene and Salmonella β-lactamase has been created. Immunization of mice with external membrane vesicles containing PspA provides complete protection against a lethal dose of S. pneumonia .

Одним из способов доставки антигена являются молочнокислые бактерии. Назальная иммунизация мышей Lactobacillus casei, экспрессирующих N-терминальный участок PspA приводит к образованию анти-PspA IgG в сыворотке, которые защищали мышей от последующей пневмококковой инфекции [Tarahomjoo, J Mol Microbiol Biotechnol. 24:215-2272014, (2014)].One of the methods for antigen delivery is lactic acid bacteria. Nasal immunization of Lactobacillus casei mice expressing the N-terminal portion of PspA results in the formation of anti-PspA IgG in serum, which protected the mice from subsequent pneumococcal infection [Tarahomjoo, J Mol Microbiol Biotechnol. 24: 215-2272014, (2014)].

Описана вакцина, в которой в качестве главных компонентов используются белки PsaA, PspA и белок Spr 1895, закодированный в гене фосфат-связывающего белка фосфатного ABC транспортера. Данный белок является жизненно важным для бактерий, константным, что обуславливает его выбор для создания вакцины от пневмонии, вызываемой S. pneumonia. В этой вакцине авторы используют белок флагеллин (FliC) в качестве адъюванта. В результате создана вакцина на основе гибридного белка PSPF, включающего фрагменты белков Streptococcus pneumoniae PsaA и PspA и Spr 1895, а также компоненты флагеллина, соединенные гибкими мостиками. Вакцина обеспечивает эффективную профилактику и терапию пневмонии за счет того, что гибридный белок вакцины составлен из различных иммуногенных эпитопов, на которые вырабатывается специфический иммунный ответ с формированием иммунологической памяти [Суворов А.Н., Духовлинов И. В., Орлов А. И. Байгузин Е. Я. патент RU 2510281 С2, (2014)]. A vaccine is described in which PsaA, PspA and Spr 1895 protein encoded in the gene of the phosphate-binding protein of the phosphate ABC transporter are used as the main components. This protein is vital for bacteria, constant, which determines its choice for creating a vaccine against pneumonia caused by S. pneumonia . In this vaccine, the authors use flagellin protein (FliC) as an adjuvant. As a result, a vaccine was created on the basis of the PSPF hybrid protein, which includes protein fragments of Streptococcus pneumoniae PsaA and PspA and Spr 1895, as well as flagellin components connected by flexible bridges. The vaccine provides effective prevention and treatment of pneumonia due to the fact that the hybrid protein of the vaccine is composed of various immunogenic epitopes to which a specific immune response is generated with the formation of immunological memory [Suvorov AN, Dukhovlinov IV, Orlov AI I. Baiguzin E. Ya. Patent RU 2510281 C2, (2014)].

Эта вакцина принята в качестве первого прототипа заявляемого изобретения. В настоящем изобретении использовали плазмиду, кодирующую гибридный вакцинный белок для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumoniae.This vaccine is accepted as the first prototype of the claimed invention. The present invention used a plasmid encoding a hybrid vaccine protein for the prevention of infection caused by Streptococcus pneumoniae .

Эффективное применение и белковых и полисахаридных вакцинных препаратов предусматривает двух- или трехкратную иммунизацию путем подкожных или внутримышечных инъекций с адъювантом, что может быть сопряжено с осложнениями и требует серьезных организационных и финансовых затрат.The effective use of both protein and polysaccharide vaccine preparations involves two or three times immunization by subcutaneous or intramuscular injections with adjuvant, which can be fraught with complications and requires serious organizational and financial costs.

Альтернативой использованию химических адъювантов для вакцинации является применение так называемых живых бактериальных вакцин на основе пробиотиков. Живые вакцины применяют, как правило, однократно, вводят подкожно, накожно или внутримышечно, а некоторые вакцины перорально и ингаляционно. Главным преимуществом живых вакцин является то, что они активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный прочный иммунный ответ. An alternative to using chemical adjuvants for vaccination is the use of so-called probiotic-based live bacterial vaccines. Live vaccines are usually administered once, administered subcutaneously, cutaneously or intramuscularly, and some vaccines are administered orally and inhaled. The main advantage of live vaccines is that they activate all components of the immune system, causing a balanced, strong immune response.

Пробиотики - препараты, оказывающие общее благотворное влияние на организм человека (чаще всего молочнокислые бактерии). Установлено, что некоторые пробиотики являются эффективными неспецифическими стимуляторами выработки специфических иммуноглобулинов против различных инфекций [Vintini E.O., Medina M.S., BMC Immunol., 12: 46 (2011), Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact., 10: 17-24 (2011)]. Пробиотики стали использоваться в качестве векторов, в часть из которых успешно внесены плазмидные конструкции, обеспечивающие зкспрессию антигенов патогенных бактерий [ME Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011)]. Probiotics are drugs that have a general beneficial effect on the human body (most often lactic acid bacteria). It has been established that some probiotics are effective nonspecific stimulators of the production of specific immunoglobulins against various infections [Vintini E.O., Medina M.S., BMC Immunol., 12: 46 (2011), Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact., 10: 17-24 (2011)]. Probiotics began to be used as vectors, in some of which plasmid constructs were successfully introduced to ensure expression of antigens of pathogenic bacteria [ME Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012 ), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011)].

Разработана вакцина против Enterohemorrhagic Escherihia coli (EHEC), вызывающей уремический синдром [Ahmed, M. Loos, D. Vanrompay, E. Cox. Vaccine, 32: 3909-3916 (2014). Он является причиной острой почечной недостаточности у детей и пожилых людей. В своей вакцине авторы используют пробиотический штамм Lactococcus lactis, который является безопасной бактерией и может служить платформой для пероральной вакцинации. В работе создан рекомбинантный штамм, в котором Lactococcus lactis экспрессирует антиген EHEC, EspB, в цитоплазме. Эта вакцина может быть особенно полезна для детей и пожилых людей, находящихся в группе высокого риска заболеваемости. A vaccine has been developed against Enterohemorrhagic Escherihia coli (EHEC) that causes uremic syndrome [Ahmed, M. Loos, D. Vanrompay, E. Cox. Vaccine 32: 3909-3916 (2014). It is the cause of acute renal failure in children and the elderly. In their vaccine, the authors use a probiotic strain of Lactococcus lactis , which is a safe bacterium and can serve as a platform for oral vaccination. A recombinant strain was created in which Lactococcus lactis expresses the EHEC antigen, EspB, in the cytoplasm. This vaccine can be especially useful for children and the elderly at high risk for morbidity.

Персистенция подобных вариантов пробиотиков в организме способна не только стимулировать выработку протективных иммуноглобулинов, специфичных в отношении целевых антигенов возбудителя, но и обеспечить благоприятный фон для борьбы с инфекцией за счет усиления защитных реакций врожденного иммунитета.The persistence of such probiotic variants in the body can not only stimulate the production of protective immunoglobulins specific for the target antigens of the pathogen, but also provide a favorable background for the fight against infection by enhancing the protective reactions of innate immunity.

Пробиотические микроорганизмы рассматриваются в настоящее время как хорошая основа для получения рекомбинантных живых вакцин, экспрессирующих вакцинные антигены возбудителей актуальных инфекций [Vintini E.O., Medina M.S., BMC Immunol., 12: 46 (2011); Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact., 10: 17-24 (2011); ME Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011)].Probiotic microorganisms are currently considered as a good basis for producing recombinant live vaccines expressing vaccine antigens for causative agents of current infections [Vintini E.O., Medina M.S., BMC Immunol., 12: 46 (2011); Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact., 10: 17-24 (2011); ME Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011)].

Описано создание живой вакцины на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной Streptococcus agalactiae (СГБ). На основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 сконструирована первая генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена белка патогенного СГБ. [Гупалова Т.В., Леонтьева Г.Ф., Ермоленко Е.И. и др. Медицинский академический журнал, 13: 64-70, (2013)].Describes the creation of a live vaccine based on a strain of the probiotic Enterococcus faecium L3 for the prevention of vaginal infection caused by Streptococcus agalactiae (GBS). Based on the probiotic strain Enterococcus faecium L3, the first genetically engineered live vaccine was constructed with a pathogenic GBS protein gene integrated into the chromosome. [Gupalova T.V., Leontiev G.F., Ermolenko E.I. and other Medical academic journal, 13: 64-70, (2013)].

Также описано создание живой вакцины против СГВ, в которой использовался подход, основанный на введении bac гена патогенных СГВ в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 при экспрессии в пилях. Пили из энтерококков являются идеальными кандидатами для вакцин из-за их экспозиции на клеточной поверхности. Они выступают за пределы бактериальных клеток и способны проникать сквозь капсулу, которая экранирует большинство белков-антигенов. Пили состоят из мономеров, способных к агрегации за счет чего увеличивается доза антигена, что способствует увеличению титров антител, специфичных к встраиваемому в структуру поверхностного белка энтерококка полипептидного фрагмента штамма патогенного СГВ. Поэтому способ введения гена патогенных стрептококков в пили пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 выгодно отличается тем, что рекомбинантный белок экспрессируется не на поверхности, а в цитоплазме бактерии [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Леонтьева Г.Ф. и др., патент № RU 2640250].The creation of a live HBV vaccine is also described, which used an approach based on the introduction of a bac gene of pathogenic HBV into the chromosomal DNA of the probiotic Enterococcus faecium L3 strain when expressed in peels. Enterococcal drinks are ideal candidates for vaccines because of their exposure on the cell surface. They extend beyond the boundaries of bacterial cells and are able to penetrate the capsule, which shields the majority of antigen proteins. Drinks consist of monomers capable of aggregation, thereby increasing the dose of antigen, which contributes to an increase in antibody titers specific to the polypeptide fragment of the pathogenic HBV strain inserted into the structure of the surface protein of the enterococcus. Therefore, the method of introducing a gene of pathogenic streptococci into a drink of the probiotic strain Enterococcus faecium L3 compares favorably with the fact that the recombinant protein is expressed not on the surface, but in the bacterial cytoplasm [Suvorov AN, Gupalova TV, Leontyeva G.F. et al., patent No. RU 2640250].

Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях, описанный в этом патенте, использовался в качестве второго прототипа настоящего изобретения.The method of introducing genes of pathogenic streptococci into the chromosomal DNA of the probiotic strain Enterococcus faecium L3 for expression in saws, described in this patent, was used as a second prototype of the present invention.

Отличие данного исследования от других экспериментальных работ с живыми вакцинами на основе пробиотиков заключается в том, что обычно пробиотики используют в качестве природных адъювантов иммунного ответа, а антиген вводится отдельно.The difference between this study and other experimental studies with probiotic-based live vaccines is that probiotics are usually used as natural adjuvants of the immune response, and the antigen is administered separately.

Настоящее исследование представляет собой интеграцию участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент белка патогенного микроорганизма, в структуру хромосомной ДНК энтерококка. При этом задача генетической части работы состояла в осуществлении интеграции гетерологичного участка ДНК в структуру гена поверхностного белка пробиотика без нарушения открытой рамки считывания и повреждения участков кодирования компонентов, участвующих в процессинге поверхностного белка PilF. В данном исследовании в качестве бактерии-реципиента использовался хорошо изученный пробиотический штамм Enterococcus faecium L3, обладающий целым рядом уникальных биологических свойств.The present study is the integration of a portion of DNA encoding an antigenic fragment of a protein of a pathogenic microorganism into the structure of the chromosomal DNA of enterococcus. The task of the genetic part of the work was to integrate the heterologous DNA region into the structure of the probiotic surface protein gene without violating the open reading frame and damaging the coding regions of the components involved in the processing of the PilF surface protein. In this study, the well-studied probiotic strain Enterococcus faecium L3, which has a number of unique biological properties, was used as the recipient bacterium.

Штамм Enterococcus faecium L3 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, способностью восстанавливать микробиоценоз кишечника на фоне дисбиотических состояний [Yermolenko E., Suvorov A., Chernush A., et al. International Congress Series, 1289: 363-366 (2006)], а также оказывать иммуномодулирующее действие на организм хозяина [Tarasova E., Yermolenko E., Donets V. et al. Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010)]. Осуществлено физическое картирование штамма Enterococcus faecium L3 [Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotics and probiotics potencial for human health, 104-112, (2011)]. В экспериментах на здоровых самках мышей показано, что интравагинальное введение высоких доз штамма Enterococcus faecium L3 не только не оказывает токсического действия на организм, но и не влияет на состояние слизистой оболочки влагалища [Суворов А.Н., Алехина Г.Г., Пигаревский П.В. и др. Гастробюллетень, 4: 29-31, (2001)], способствует экспрессии IL-10 клетками слизистой оболочки влагалища крыс с экспериментальным вагинитом, вызванном S.agalactiae и Staphylococcus aureus [Tarasova E., Yermolenko E., Donets V. et al. Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010)].The strain Enterococcus faecium L3 has a pronounced antagonistic activity against gram-positive and gram-negative bacteria, the ability to restore intestinal microbiocenosis against a background of dysbiotic conditions [Yermolenko E., Suvorov A., Chernush A., et al. International Congress Series, 1289: 363-366 (2006)], and also have an immunomodulatory effect on the host [Tarasova E., Yermolenko E., Donets V. et al. Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010)]. Physical mapping of the strain Enterococcus faecium L3 was carried out [Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotics and probiotics potencial for human health, 104-112, (2011)]. In experiments on healthy female mice, it was shown that intravaginal administration of high doses of Enterococcus faecium L3 strain not only does not have a toxic effect on the body, but also does not affect the condition of the vaginal mucosa [Suvorov AN, Alekhina GG, Pigarevsky P .AT. and others Gastrobulletin, 4: 29-31, (2001)], promotes the expression of IL-10 cells of the rat vaginal mucosa with experimental vaginitis caused by S. agalactiae and Staphylococcus aureus [Tarasova E., Yermolenko E., Donets V. et al. Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010)].

В штамме Enterococcus faecium L3, как и у других грамположительных бактерий, были найдены пили, которые представляют собой фимбрии длиной 0,3-3 m и диаметром 2-10nm [Telford JL, Barocchi MA, Margarit I et al. Nature Reviews Microbiology 4: 509-519, (2006)]. Это длинные белок подобные полимеры, тянущиеся на поверхности бактерий, представляют собой субъединицы белка пилина, соединенные ковалентной связью. Они играют большую роль в адгезии колонизации хозяина. Пили являются высокоиммуногенными структурами, которые находятся под селективным давлением иммунных реакций хозяина [Camille Danne, Shaynoor Dramsi. Research in Microbiology, 163: 645-658, (2012)]. Принцип модификации пилей энтерококков вакцинными антигенами является идеальным подходом при создании эффективных живых вакцин благодаря экспозиции целевого антигена на поверхности энтерококка.In the Enterococcus faecium L3 strain, as in other gram-positive bacteria, dranks were found which are fimbriae 0.3-3 m long and 2-10 nm in diameter [Telford JL, Barocchi MA, Margarit I et al. Nature Reviews Microbiology 4: 509-519, (2006)]. These are long protein-like polymers stretching on the surface of bacteria, are subunits of the pilin protein connected by a covalent bond. They play a large role in the adhesion of colonization of the host. Pili are highly immunogenic structures that are under the selective pressure of host immune responses [Camille Danne, Shaynoor Dramsi. Research in Microbiology, 163: 645-658, (2012)]. The principle of modification of Enterococcal pili with vaccine antigens is an ideal approach for creating effective live vaccines due to exposure of the target antigen on the surface of Enterococcus.

В качестве вакцинного антигена Streptococcus pneumoniae в настоящем изобретении использовался гибридный белок, включающий иммуногенные фрагменты белков PspA, PsaA и Spr1895. В отличие от гибридного белка, используемого в описанной вакцине для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumoniae [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Леонтьева Г.Ф. и др., патент № RU2640250], он не содержал фрагментов флагеллина.As the vaccine antigen of Streptococcus pneumoniae in the present invention, a hybrid protein was used comprising immunogenic fragments of the proteins PspA, PsaA and Spr1895. In contrast to the hybrid protein used in the described vaccine for the prevention of infection caused by Streptococcus pneumoniae [Suvorov AN, Gupalova TV, Leontyeva G.F. et al., patent No. RU2640250], it did not contain fragments of flagellin.

В гибридном белке представлены антигенные детерминанты консервативных белков пневмококка, которые присутствуют у всех серотипов данного микроорганизма, поэтому иммунный ответ, который вырабатывается после вакцинации, будет эффективен в отношении любого серологического варианта пневмококка. Использование эпитопов нескольких белков позволит увеличить эффективность вакцины. Наличие в сыворотке крови человека протективных антител к S. pneumoniae приведет к тому, что человек не заболеет или легко перенесет болезнь. Ранее была показана защита от пневмококков за счет того, что белок вакцины составлен из иммуногенных эпитопов нескольких консервативных белков пневмококков, на которые вырабатывается специфический иммунный ответ с формированием иммунологической памяти [Suvorov A., Dukhovlinov I., Leontieva G., Kramskaya T., Koroleva I., Grabovskaya K., Fedorova E., Chernyseva E., Klimov N., Orlov A., Uversky V. J Vaccines Vaccin, 6, 6: 1-8, (2015)].The hybrid protein contains antigenic determinants of the conserved proteins of pneumococcus, which are present in all serotypes of this microorganism, therefore, the immune response that is generated after vaccination will be effective against any serological variant of pneumococcus. The use of epitopes of several proteins will increase the effectiveness of the vaccine. The presence of protective antibodies to S. pneumoniae in human blood serum will lead to the fact that a person will not get sick or easily suffer the disease. Previously, protection against pneumococci was shown due to the fact that the vaccine protein is composed of immunogenic epitopes of several conserved proteins of pneumococci, to which a specific immune response is generated with the formation of immunological memory [Suvorov A., Dukhovlinov I., Leontieva G., Kramskaya T., Koroleva I., Grabovskaya K., Fedorova E., Chernyseva E., Klimov N., Orlov A., Uversky V. J Vaccines Vaccin, 6, 6: 1-8, (2015)].

Задачей данного изобретения явилась создание живой вакцины на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium L3 за счет включения в структуру его пилей гибридного поливалентного антигена клинически патогенного микроорганизма Streptococcus pneumoniae. Создание такой вакцины против инфекции, вызываемой пневмококками, основано на введении участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент иммуногенных эпитопов нескольких консервативных белков пневмококков, в структуру пилей пробиотика. The objective of the invention was the creation of a live vaccine based on a biologically active strain of Enterococcus faecium L3 due to the inclusion of the clinically pathogenic microorganism Streptococcus pneumoniae in the structure of its pili hybrid polyvalent antigen. The creation of such a vaccine against pneumococcal infection is based on the introduction of a DNA fragment encoding the antigenic fragment of the immunogenic epitopes of several conserved pneumococcal proteins into the structure of probiotic pili.

Задача решалась конкретно на примере введения гена pspf патогенных пневмококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях:The problem was solved specifically by the example of the introduction of the pspf gene of pathogenic pneumococci into the chromosomal DNA of the probiotic strain Enterococcus faecium L3 for expression in peels:

а) получение слитого гена entF-pspf и его клонированиеa) obtaining a fused gene entF-pspf and its cloning

б) выявление бактериальных клонов, экспрессирующих ген слитого белка PSPF белок в пиляхb) identification of bacterial clones expressing the gene fused protein PSPF protein in peels

в) интраназальная вакцинация мышей живой пробиотической вакцинойc) intranasal vaccination of mice with a live probiotic vaccine

г) определение PSPF-специфических антител в крови и вагинальных смывах. d) determination of PSPF-specific antibodies in the blood and vaginal swabs.

д) исследование протективной эффективности и вакцинации живой пробиотической вакцинойe) study of protective efficacy and vaccination with a live probiotic vaccine

Сущностью предлагаемого изобретения является создание живой вакцины против пневмококков, обладающей выраженным иммуногенным и протективным эффектами.The essence of the invention is the creation of a live vaccine against pneumococci with pronounced immunogenic and protective effects.

Авторами заявляемого изобретения на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3, содержащего пили на своей поверхности, сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена pspf патогенного Streptococcus pneumoniae. Интраназальное введение вакцины Enterococcus faecium L3-PSPF+ стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интравазальной летальной пневмококковой инфекции у мышей СВА было показано, что трехкратная интравазальная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной пневмококковой инфекции.The authors of the claimed invention based on a strain of the probiotic Enterococcus faecium L3 containing drank on its surface, constructed a genetically engineered live vaccine with a pathogenic Streptococcus pneumoniae pathogen Streptococcus pneumoniae embedded in the chromosome of the pspf gene. Intranasal administration of the Enterococcus faecium L3-PSPF + vaccine stimulated the development of a specific systemic and local immune response. In a model of intravasal lethal pneumococcal infection in CBA mice, it was shown that triple intravasal vaccination with the created live probiotic vaccine increased protection against lethal pneumococcal infection.

Конструирование живой вакцины на основе биологически активного пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 за счет включения в его пили антигенов Streptococcus pneumoniae позволило объединить в одном препарате эффективность полезных свойств пробиотика и специфического антигенного стимула. The construction of a live vaccine based on the biologically active probiotic strain Enterococcus faecium L3 due to the inclusion of Streptococcus pneumoniae antigens in its drink made it possible to combine the effectiveness of the useful properties of a probiotic and a specific antigenic stimulus in one drug.

Поставленная задача решалась получением слитого гена entF-pspf и его клонированием. Для этого были сконструированы уникальные праймеры, представленные в таблице. The problem was solved by obtaining the entF-pspf fusion gene and its cloning. For this, unique primers were designed, which are presented in the table.

Таблица 1. Олигонуклеотидные праймерыTable 1. Oligonucleotide Primers

НазваниеTitle ОриентацияOrientation Нуклеотидная последовательность от 5' к 3'The nucleotide sequence from 5 'to 3' А1A1 прямойstraight GCTCTAGAGCCGATGAGAGCAGCTGGTATTGGC TCTAGA GCCGATGAGAGCAGCTGGTATTG B1B1 обратныйback AGGTCAGCCGGTACCATATGCAATGCGCCATCATAGTTT AGGTCAGCCGGTAC CATATG CAATGCGCCATCATAGTTT C1C1 прямойstraight CGACAAGCTGGATAAACTCGAGAAAGGTTCTGCGCGAGTGATAGAT CGACAAGCTGGATAAA CTCGAG AAAGGTTCTGCGCGAGTGATAGAT D1D1 обратныйback CAACAAGCTTCAAAGCATCGTTGGCAAC AAGCTT CAAAGCATCGTTGG E1E1 прямойstraight CATATGGTACCGGCTGACCT CATATG GTACCGGCTGACCT F1F1 обратныйback TTTCTCGAGTTTATCCAGCTTGTCGTTT CTCGAG TTTATCCAGCTTGTCG B2B2 прямойstraight TGAGTGAACCACAGCCAGAATGAGTGAACCACAGCCAGAA Seq FSeq f прямойstraight GGACACCACAACCATCGAAGGGACACCACAACCATCGAAG Seq RSeq r обратныйback TAGTCCTCTTCTGCCTGCTGTAGTCCTCTTCTGCCTGCTG

Подчеркнутые звенья нуклеотидной последовательности указывают на сайты рестрикции.The underlined units of the nucleotide sequence indicate restriction sites.

Фрагменты ДНК, соответствующие фрагментам гена пилей Enterococcus faecium L3 и плазмидной ДНК, кодирующей три пневмококковых белка PspA, PsaA и Spr1895 без компонентов флагеллина, были амплифицированы в ПЦР с помощью Taq полимеразы («Ampli Taq», Perkin-Elmer, Cetus, USA) и амплификатора (BIO-RAD, USA). Проведена амплификация отдельных двух фрагментов гена пилей Enterococcus faecium L3 с праймерами А1 и В1 и с праймерами С1 и D1 и фрагмента гена pspf с праймерами E1 и F1. Синтез слитого фрагмента осуществляли с праймерами A1 и D1. Одна пара праймеров представлена одновременно участком ДНК энтерококков, а другая участком гена pspf. Дизайн праймеров предполагал образование слитого гена без стоп-кодонов в местах сшивок. В результате постановки двух последовательных этапов ПЦР сначала получены отдельные части конструкции, а затем и целый слитый фрагмент ДНК (фиг. 1 и фиг. 2). Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК осуществляли с использованием плазмиды pJET1.2, используя Clone JET PCR Cloning Kit (Fermentas). В результате клонирования была создана уникальная гибридная ДНК entF-pspf с использованием плазмиды pJET1.2. Наличие в ней нужной вставки было подтверждено реакцией гидролиза ферментами BamHI и XbaI (фиг. 3). Гибридная ДНК entF-pspf из плазмиды pJET1.2 была переклонирована в суицидную плазмиду pT7ERMB с геном устойчивости к эритромицину. Для этого была проведена амплификация гибридной плазмиды с праймерами A1 и D1. В результате клонирования были получена плазмида pentF-pspf с ожидаемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами BamHI и XbaI (фиг. 4 и фиг. 5). Наличие фрагментов гена пилей Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf подтвердила ПЦР с праймерами A1 и B1, C1 и D1, A1 и F1, E1 и D1 (фиг. 6).DNA fragments corresponding to fragments of the piloca gene Enterococcus faecium L3 and plasmid DNA encoding three pneumococcal proteins PspA, PsaA and Spr1895 without flagellin components were amplified by PCR using Taq polymerase (Ampli Taq, Perkin-Elmer, Cetus, USA) and Amplifier (BIO-RAD, USA). The amplification of two separate fragments of the Enterococcus faecium L3 peel gene with primers A1 and B1 and with primers C1 and D1 and the pspf gene fragment with primers E1 and F1 was amplified. The fusion fragment was synthesized with primers A1 and D1. One pair of primers is represented simultaneously by the DNA site of enterococci, and the other by the site of the pspf gene. The design of the primers involved the formation of a fusion gene without stop codons at the crosslinking sites. As a result of the formulation of two consecutive PCR stages, first, individual parts of the construct were obtained, and then the whole fused DNA fragment (Fig. 1 and Fig. 2). The amplified DNA fragment was cloned using plasmid pJET1.2 using the Clone JET PCR Cloning Kit (Fermentas). As a result of cloning, a unique hybrid entF-pspf DNA was created using the plasmid pJET1.2. The presence of the desired insert in it was confirmed by the hydrolysis by the BamHI and XbaI enzymes (Fig. 3). EntF-pspf hybrid DNA from plasmid pJET1.2 was cloned into the suicide plasmid pT7ERMB with the erythromycin resistance gene. To do this, the hybrid plasmid was amplified with primers A1 and D1. Cloning resulted in the plasmid p ent F- pspf with the expected insert and erythromycin resistance gene. The presence of the insert was confirmed by hydrolysis of the plasmid with BamHI and XbaI enzymes (Fig. 4 and Fig. 5). The presence of Enterococcus faecium L3 pili gene fragments and the pspf gene fragment was confirmed by PCR with primers A1 and B1, C1 and D1, A1 and F1, E1 and D1 (Fig. 6).

В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой были получены 2 трансформанта. Они были проверены в реакции ПЦР со специально сконструированными праймерами SeqF и SeqR. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дал только один трансформант, обозначенный как PSPF+ клон (фиг. 7). Было проведено секвенирование ДНК, выделенной из PSPF+ клона с праймерами, соответствующими последовательности гена pspf (праймер seqR) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер В2) для подтверждения интеграции плазмидной ДНК pentF-pspf в хромосомную ДНК энтерококка. As a result of enterococcal electroporation by the created integrative plasmid, 2 transformants were obtained. They were tested in PCR reactions with specially designed SeqF and SeqR primers. For this, DNA was isolated from transformants using a DNA express kit (Litech, Russia). Only one transformant, designated as PSPF + clone, gave a positive answer (Fig. 7). Sequencing of DNA isolated from the PSPF + clone with primers corresponding to the pspf gene sequence ( seqR primer) and enterococcal chromosomal DNA sequence (B2 primer) was performed to confirm the integration of pentF-pspf plasmid DNA into enterococcus chromosomal DNA.

Этот клон энтерококков PSPF+, экспрессирующий ген слитого белка PSPF белок, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования. This PSPF + enterococcal clone expressing the PSPF protein fusion gene is selected as a vaccine preparation for further research.

Вакцинацию живой пробиотической вакциной проводили на мышах CBA, самках 16-18 г. Мыши экспериментальной группы (n=16) были вакцинированы интраназально введением в обе ноздри взвеси Enterococcus faecium L3-PSPF в дозе 5 х 108 КОЕ. Бактерии вводили два дня подряд, процедуру вакцинации проводили три раза с интервалом в три недели. Контрольные группы мышей получали по той же схеме пробиотический штамм Enterococcus faecium L3 (n=16) или ЗФР (n=16). Через 18 дней после второй и третьей вакцинации у мышей определяли содержание PSPF-специфических IgA в носовых смывах и PSPF-специфических IgG в сыворотке крови.Live probiotic vaccine was vaccinated in CBA mice, females 16-18 g. Mice of the experimental group (n = 16) were vaccinated intranasally by suspension in both nostrils Enterococcus faecium L3-PSPF at a dose of 5 x 108 CFU. Bacteria were administered two days in a row, the vaccination procedure was carried out three times with an interval of three weeks. Control groups of mice received the probiotic strain according to the same scheme.Enterococcus faecium L3 (n = 16) or SFR (n = 16). 18 days after the second and third vaccinations in mice, the content of PSPF-specific IgA in nasal swabs and PSPF-specific IgG in blood serum was determined.

Уровень специфических антител определяли в реакции ИФА. The level of specific antibodies was determined in the ELISA.

Было показано, что в сыворотке крови уже после второй вакцинации присутствовали специфические IgG (фиг. 8). Через 18 дней после третьей вакцинации специфические антитела в сыворотке крови продолжали циркулировать (фиг. 9).It was shown that in the blood serum after the second vaccination specific IgG were present (Fig. 8). 18 days after the third vaccination, specific antibodies in the blood serum continued to circulate (Fig. 9).

Анализ секреторных IgA показал, что накануне заражения в носовых секретах мышей, вакцинированных живой вакциной присутствовали PSPF-специфические антитела в титре 1:5-1:10, в контролях специфические антитела не обнаруживались (фиг. 10).Analysis of secretory IgA showed that on the eve of infection, PSPF-specific antibodies in the titer 1: 5-1: 10 were present in the nasal secretions of mice vaccinated with a live vaccine; no specific antibodies were detected in the controls (Fig. 10).

В результате показано, что после проведения курса вакцинации живой вакциной происходит стимуляция местного и системного PSPF-специфического иммунного ответа, что выражается в накоплении в носовых секретах и сыворотке специфических антител класса А и G.As a result, it was shown that after a live vaccination course, a local and systemic PSPF-specific immune response is stimulated, which is expressed in the accumulation of specific class A and G antibodies in nasal secretions and serum.

Для оценки протективной эффективности живой вакцины Enterococcus faecium L3-PSPF мышей заражали S.pneumoniae штамм 73 (серотип 3). С этой целью 20 мкл суспензии бактерий вводили иммунным и контрольным животным интраназально, каждая доза содержала 6 x 104 КОЕ. Через 4 часа после заражения у части мышей получали легкие для последующего подсчета бактерий в легочной ткани, остальных мышей оставляли для оценки уровня падежа от пневмококковой инфекции.To evaluate the protective efficacy of the live vaccine Enterococcus faecium L3-PSPF, mice were infected with S. pneumoniae strain 73 (serotype 3). To this end, 20 μl of a suspension of bacteria was administered intranasally to the immune and control animals, each dose containing 6 x 10 4 CFU. 4 hours after infection, some of the mice received lungs for subsequent counting of bacteria in the lung tissue, the remaining mice were left to assess the mortality rate from pneumococcal infection.

Через 4 часа после заражения в легких мышей, вакцинированных живой вакциной наблюдалось снижение количества бактерий по сравнению с обеими контрольными группами (фиг. 11). Через 10 дней после заражения в группе вакцинированных живой вакциной мышей падеж составил 40 %, тогда как смертность в контрольных группах составила 75 и 80 % (фиг. 12).4 hours after infection in the lungs of mice vaccinated with a live vaccine, a decrease in the number of bacteria was observed compared with both control groups (Fig. 11). 10 days after infection in the group of mice vaccinated with a live vaccine, the mortality rate was 40%, while mortality in the control groups was 75 and 80% (Fig. 12).

На основании проведенных иммунологических исследований можно заключить, что живая вакцина на основании штамма L3 пробиотика Enterococcus faecium, содержащая химерную последовательность иммунодоминантных участков ряда поверхностных белков пневмококка (PSPF), стимулировала развитие иммунного ответа, достаточного для снижения смертности от летальной пневмококковой инфекции на 40%.Based on the immunological studies, it can be concluded that a live vaccine based on the L3 strain of the probiotic Enterococcus faecium , containing the chimeric sequence of immunodominant regions of a number of surface proteins of pneumococcus (PSPF), stimulated the development of an immune response sufficient to reduce mortality from lethal pneumococcal infection by 40%.

Таким образом, на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена белка PSPF патогенного Streptococcus pneumoniae. Белок PSPF был встроен в структуру пилей. Интраназальное введение вакцины Enterococcus faecium L3-PSPF+ стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной пневмококковой инфекции у мышей СВА было показано, что трехкратная интраназальная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной пневмококковой инфекции.Thus, based on the probiotic strain Enterococcus faecium L3, a genetically engineered live vaccine was constructed with a pathogenic Streptococcus pneumoniae pathogenic Streptococcus pneumoniae protein gene integrated into the chromosome of the PSPF protein gene . The PSPF protein has been integrated into the pili structure. Intranasal administration of the Enterococcus faecium L3-PSPF + vaccine stimulated the development of a specific systemic and local immune response. Using a model of intranasal lethal pneumococcal infection in CBA mice, it was shown that triple intranasal vaccination with the created live probiotic vaccine increased protection against lethal pneumococcal infection.

Описано создание живой вакцины на основе введении слитого гена, состоящего из двух участков гена пилей энтерококка и фрагмента гена, кодирующего PSPF белок патогенных пневмококков в структуру пробиотиков.The creation of a live vaccine based on the introduction of a fused gene consisting of two sections of the enterococcus pili gene and a fragment of the gene encoding the PSPF protein of pathogenic pneumococci into the structure of probiotics is described.

Пример 1. Получение фрагментов гена Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf Example 1. Obtaining fragments of the Enterococcus faecium L3 gene and the pspf gene fragment

Для работы были выбран пробиотический штамм Enterococcus faecium L3, хромосомную ДНК которого использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выделения хромосомной ДНК клетки микроба лизировали 50 мМ ЭДТА (Serva, Германия) и лизоцимом в концентрации 1мг/мл. ДНК депротеинезировали фенолом и хлороформом, а затем экстрагировали спиртом. Для амплификации фрагмента гена pspf использовали гибридную плазмидную ДНК pspf.For work, a probiotic strain of Enterococcus faecium L3 was chosen, the chromosomal DNA of which was used as a matrix in the polymerase chain reaction (PCR). To isolate chromosomal DNA, microbial cells were lysed with 50 mM EDTA (Serva, Germany) and lysozyme at a concentration of 1 mg / ml. DNA was deproteinized with phenol and chloroform, and then extracted with alcohol. For amplification of the gene fragment used pspf hybrid plasmid DNA pspf.

Фрагменты ДНК, соответствующие фрагментам гена Enterococcus faecium L3 и фрагменту гена pspf, были амплифицированы в ПЦР с помощью Taq полимеразы («Ampli Taq», Perkin-Elmer, Cetus, USA) и амплификатора (BIO-RAD, USA). Олигонуклеотидные праймеры представлены в таблице 1. Проведена амплификация отдельных двух фрагментов гена Enterococcus faecium L3 с праймерами А1 и В1 и с праймерами С1 и D1 и фрагмента гена pspf с праймерами E1 и F1. В пробирки с 0,25 мкг геномной ДНК добавляли по 10 М каждого из специфических праймеров, фланкирующих исследуемую последовательность, буфер с магнием для полимеразы, по 0,2 мМ четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, объем доводили водой до 25 мкл и добавляли 0,5 мкл термостабильной Taq полимеразы. Пробирки помещали в амплификатор и инкубировали при 94С 2 мин. Программа ПЦР состояла из: денатурации при 94С - 30 сек, отжига праймеров - 55С - 1 мин и синтеза - 72С - 1 мин. Этот цикл повторяли 30 раз, после чего смесь инкубировали при 72С 10 мин. ПЦР продукты разделяли в 1% агарозном геле в горизонтальном электрофорезе. Выделение амплифицированных участков ДНК проводили с использованием набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США). Анализ размера полученных фрагментов ДНК проводили, исходя из сравнения их электрофоретических подвижностей с элетрофоретической подвижностью маркера молекулярных весов (100 п.н. ДНК-маркер, Хеликон).DNA fragments corresponding to fragments of the Enterococcus faecium L3 gene and the pspf gene fragment were amplified by PCR using Taq polymerase (Ampli Taq, Perkin-Elmer, Cetus, USA) and an amplifier (BIO-RAD, USA). Oligonucleotide primers are presented in table 1. The amplification of two separate fragments of the Enterococcus faecium L3 gene with primers A1 and B1 and with primers C1 and D1 and the pspf gene fragment with primers E1 and F1 was carried out. In test tubes with 0.25 μg of genomic DNA, 10 M of each of the specific primers flanking the test sequence were added, a buffer with magnesium for polymerase, 0.2 mm of four deoxyribonucleotide triphosphates, the volume was adjusted with water to 25 μl, and 0.5 μl of thermostable Taq was added polymerase. The tubes were placed in an amplifier and incubated at 94C for 2 minutes. The PCR program consisted of: denaturation at 94C for 30 sec, annealing of the primers 55C for 1 min and synthesis 72C for 1 min. This cycle was repeated 30 times, after which the mixture was incubated at 72C for 10 minutes. PCR products were separated on a 1% agarose gel in horizontal electrophoresis. Amplified DNA regions were isolated using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA). The size analysis of the obtained DNA fragments was carried out based on a comparison of their electrophoretic mobilities with the electrophoretic mobility of the molecular weight marker (100 bp DNA marker, Helikon).

На фиг. 1 представлена электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов, где цифрами обозначено:In FIG. 1 shows an electrophoregram of amplified DNA fragments, where the numbers indicate:

1 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).1 - 100 bp DNA is a marker (from top to bottom: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 and 100 nucleotide pairs).

2 - продукт ПЦР с праймерами А1 и В12 - PCR product with primers A1 and B1

3 - продукт ПЦР с праймерами С1 и D13 - PCR product with primers C1 and D1

4 - продукт ПЦР с праймерами E1 и F14 - PCR product with primers E1 and F1

Пример 2. Получение слитого гена Example 2. Obtaining a fused gene entF-pspfentF-pspf и его клонирование. and its cloning.

Синтез слитого фрагмента осуществляли с праймерами A1 и D1. Программа ПЦР состояла из: денатурации при 94С - 30 сек, отжига праймеров - 55 С - 1 мин и синтеза - 72С - 2 мин. Этот цикл повторялся 30 раз, после чего смесь инкубировалась при 72С 10 мин. ПЦР продукты разделяли в 1% агарозном геле в горизонтальном электрофорезе. Выделение амплифицированного участка ДНК проводили с использованием набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США). Анализ размера полученного фрагмента ДНК проводили, исходя из сравнения их электрофоретических подвижностей с элетрофоретической подвижностью маркера молекулярных весов (100 п.н. ДНК-маркер, Хеликон).The fusion fragment was synthesized with primers A1 and D1. The PCR program consisted of: denaturation at 94 ° C for 30 sec, annealing of the primers 55 ° C for 1 min, and synthesis 72 ° C for 2 min. This cycle was repeated 30 times, after which the mixture was incubated at 72C for 10 minutes. PCR products were separated on a 1% agarose gel in horizontal electrophoresis. Amplified DNA was isolated using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA). The analysis of the size of the obtained DNA fragment was carried out based on a comparison of their electrophoretic mobilities with the electrophoretic mobility of the molecular weight marker (100 bp DNA marker, Helikon).

Электрофореграмма амплифицированного слитого фрагмента ДНК представлена на фиг. 2, где цифрами обозначено:An electrophoregram of the amplified DNA fusion is shown in FIG. 2, where the numbers indicate:

2 - Продукт ПЦР (слитый фрагмент).2 - PCR product (fused fragment).

Пример 3. Клонирование слитого фрагмента ДНКExample 3. Cloning of a fused DNA fragment

Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК осуществляли с использованием плазмиды pJET1.2, используя Clone JET PCR Cloning Kit (Fermentas). Реакционная смесь состояла из 1мкл PCR- продукта, 1 мкл ДНК-вектора pJET1.2 (50 ng/l), 10 мкл лигазного буфера, 1 мкл T4 ДНК-лигазы и 7 мкл бидистиллированной воды. Лигазную смесь инкубировали при 220 С 5 мин. Лигазную смесь использовали для трансформации в гетерологичную систему E.coli DH5. Среда для отбора трансформантов содержала 100 мкг/мл ампициллина. Получили трансформанты, из которых были выделены плазмидные ДНК, с которыми поставлена реакция ПЦР с праймерами А1 и D2. Вставку содержали 2 плазмиды. Эти плазмиды были рестрицированы ферментами BamHI и XbaI (фиг. 3). The amplified DNA fragment was cloned using plasmid pJET1.2 using the Clone JET PCR Cloning Kit (Fermentas). The reaction mixture consisted of 1 μl PCR product, 1 μl pJET1.2 DNA vector (50 ng / l), 10 μl ligase buffer, 1 μl T4 DNA ligase and 7 μl bidistilled water. The ligase mixture was incubated at 220 C for 5 minutes. The ligase mixture was used to transform into a heterologous E. coli DH5 system. The transformant selection medium contained 100 μg / ml ampicillin. Transformants were obtained from which plasmid DNAs were isolated, with which a PCR reaction with primers A1 and D2 was performed. The insert contained 2 plasmids. These plasmids were restricted by the BamHI and XbaI enzymes (FIG. 3).

На фиг.3. представлена электрофореграмма рестрицированных плазмид BamHI и XbaI, где цифрами обозначено:In figure 3. The electrophoregram of the restricted BamHI and XbaI plasmids is shown, where the numbers indicate:

1 - плазмида 1,1 - plasmid 1,

3 - плазмида 2, 3 - plasmid 2,

2 - 1 kb маркер (сверху вниз: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 и 250 нуклеотидных пар).2 - 1 kb marker (from top to bottom: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 and 250 nucleotide pairs).

Как следует из рисунка, нужный фрагмент содержали обе плазмиды. Была выбрана плазмида 1 и обозначена, как pentF-pspf As follows from the figure, the desired fragment contained both plasmids. Plasmid 1 was selected and designated as p entF-pspf

Гибридная ДНК (entF-pspf) была переклонирована в суицидную плазмиду pT7ERMB с геном устойчивости к эритромицину. Для этого была проведена амплификация плазмиды 1 с праймерами A1 и D1. ПЦР-продукт и плазмида pT7ERMB были рестрицированы ферментами BamHI и Xba. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК рестрикты выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина. Из полученных клонов после трансформации были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами A1 и D1. 8 трансформантов дали положительный ответ. Из них были выделены плазмиды, 5 из которых содержали ожидаемую вставку. На фиг. 4 показана электрофореграмма плазмид, выделенных из 8 трансформантов, где цифрами 1-8 обозначены плазмиды с 1 по 8, а цифрой 9 обозначена эритромициновая плазмида pT7ERMB. Как следует из рисунка, вставка есть в 1, 2, 3, 7 и 8 плазмидах.Hybrid DNA ( entF-pspf ) was cloned into the suicide plasmid pT7ERMB with the erythromycin resistance gene. For this, plasmid 1 was amplified with primers A1 and D1. The PCR product and plasmid pT7ERMB were restricted with BamHI and Xba enzymes. Restriction products were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel. Restriction DNA was isolated from agarose using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA), ligated, and transformed into an E. coli DH5 heterologous system. The selection medium contained 500 μg / ml erythromycin. From the obtained clones, DNAs were isolated after transformation, which were verified by PCR with primers A1 and D1. 8 transformants gave a positive answer. Plasmids were isolated from them, 5 of which contained the expected insert. In FIG. 4 shows the electrophoregram of plasmids isolated from 8 transformants, where the numbers 1-8 indicate plasmids 1 through 8, and the number 9 indicates the erythromycin plasmid pT7ERMB. As follows from the figure, the insert is in 1, 2, 3, 7, and 8 plasmids.

Рестрикция этих плазмид BamHI и XbaI подтвердила наличие нужной вставки. На фиг. 5 представлена электрофореграмма рестрицированных плазмид BamHI и XbaI, где цифрами обозначено:Restriction of these plasmids BamHI and XbaI confirmed the presence of the desired insert. In FIG. 5 shows the electrophoregram of the restricted BamHI and XbaI plasmids, where the numbers indicate:

1 - плазмида 7, 2 - плазмида 8, 3 - плазмида 1 pJET, 1 - plasmid 7, 2 - plasmid 8, 3 - plasmid 1 pJET,

4 - 1kb маркер (сверху вниз: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 и 250 нуклеотидных пар). Для дальнейшей работы выбрали плазмиду, выделенную из клона 7 и обозначенную как pentF-pspf.4 - 1kb marker (from top to bottom: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 and 250 nucleotide pairs). For further work, a plasmid isolated from clone 7 and designated as pentF-pspf was selected.

Наличие фрагментов гена пилей Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf ПЦР было подтверждено ПЦР плазмиды pentF-pspf с праймерами A1 и B1, C1 и D1, A1 и F1, E1 и D1.The presence of Enterococcus faecium L3 pili gene fragments and the PCR pspf gene fragment was confirmed by PCR of the p entF-pspf plasmid with primers A1 and B1, C1 and D1, A1 and F1, E1 and D1.

Электрофореграмма амплифицированной плазмиды pentF-pspf) приведена на фиг. 6, где цифрами обозначено:The electrophoregram of the amplified plasmid pentF-pspf) is shown in FIG. 6, where the numbers indicate:

1 - ПЦР продукт с праймерами A1 и B11 - PCR product with primers A1 and B1

2 - ПЦР продукт с праймерами C1 и D12 - PCR product with primers C1 and D1

3 - ПЦР продукт с праймерами A1 и F13 - PCR product with primers A1 and F1

4 - ПЦР продукт с праймерами E1 и D14 - PCR product with primers E1 and D1

5 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).5 - 100 bp DNA is a marker (from top to bottom: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 and 100 nucleotide pairs).

Пример 4. Электропорация энтерококков.Example 4. Electroporation of enterococci.

Для электропорации энтерококков культуру Enterococcus faecium L3 сеяли в 3 мл бульона Tood-Hewitt (THB) («HiMedia», Индия) и выращивали в течение ночи при 37С, затем пересевали в 50 мл бульона THB 1 мл ночной культуры и выращивали ее до оптической плотности при длине волны 650 нм 0.3. После этого культуру помещали в лед и затем отмывали трижды в 20 мл 10% глицерола при температуре 4С, полученный осадок суспендировали в 0.5 мл стерильного раствора глицерола, переосаждали и конечный осадок ресуспендировали в 0.3 мл того же раствора, разлили по 50 мкл в пробирки и проводили электропорацию в кювете с расстоянием между электродами 1 мм при напряжении 2100 В. Во льду к клеткам добавили ДНК (полученную интегративную плазмиду pentF-pspf плазмиду, 300 нг). Оптимальная продолжительность импульса составила 4-5 миллисекунд. После проведения разряда тока в кювету добавляли 1 мл THB, инкубировали 1 час и высевали на чашки с селективной средой, которая содержала 2.5 мкг/мл эритромицина. Затем ожидали появления трансформантов через 24 часа. For electroporation of enterococci, Enterococcus faecium L3 culture was seeded in 3 ml of Tood-Hewitt broth (THB) (HiMedia, India) and grown overnight at 37 ° C, then transferred to 50 ml of THB broth 1 ml of overnight culture and grown to optical density at a wavelength of 650 nm 0.3. After that, the culture was placed on ice and then washed three times in 20 ml of 10% glycerol at 4 ° C, the obtained precipitate was suspended in 0.5 ml of a sterile glycerol solution, reprecipitated and the final precipitate was resuspended in 0.3 ml of the same solution, poured into 50 μl into tubes and carried out electroporation in a cuvette with an electrode spacing of 1 mm at a voltage of 2100 V. DNA was added to the cells in ice (obtained integrative plasmid p entF-pspf plasmid, 300 ng). The optimal pulse duration was 4-5 milliseconds. After current discharge, 1 ml THB was added to the cuvette, incubated for 1 hour, and plated on plates with selective medium containing 2.5 μg / ml erythromycin. Then transformants were expected to appear after 24 hours.

В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой были получены 2 трансформанта. Они были проверены в реакции ПЦР со специально сконструированными праймерами SeqF и SeqR. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дал только один трансформант, обозначенный как PSPF+ клон. Электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов показана на фиг. 7, где цифрами обозначено:As a result of enterococcal electroporation by the created integrative plasmid, 2 transformants were obtained. They were tested in PCR reactions with specially designed SeqF and SeqR primers. For this, DNA was isolated from transformants using a DNA express kit (Litech, Russia). Only one transformant, designated as PSPF + clone, gave a positive answer. An electrophoregram of amplified DNA fragments is shown in FIG. 7, where the numbers indicate:

2 - продукт ПЦР клона 1 с праймерами SeqF и SeqR2 - PCR product of clone 1 with primers SeqF and SeqR

3 - продукт ПЦР клона 2 с праймерами SeqF и SeqR3 - PCR product of clone 2 with primers SeqF and SeqR

4 - продукт ПЦР плазмидной ДНК pentF-pspf с праймерами SeqF и SeqR4 - PCR product of plasmid DNA p entF-pspf with primers SeqF and SeqR

Было проведено секвенирование ДНК, выделенной из PSPF+ клона с праймерами, соответствующими последовательности гена pspf (праймер seqR) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер В2), чтобы подтвердить интеграцию плазмидной ДНК pentF-pspf в хромосомную ДНК энтерококка. Sequencing of DNA isolated from the PSPF + clone with primers corresponding to the pspf gene sequence ( seqR primer) and enterococcal chromosomal DNA sequence (B2 primer) was performed to confirm the integration of pentF-pspf plasmid DNA into the enterococcus chromosomal DNA.

Нуклеотидная последовательность ПЦР продукта, состоящая из 1713 п.н. и соответствующая последовательности двух фрагментов гена энтерококка и встроенному между ними фрагменту pspf гена, приведена в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 1.The nucleotide sequence of the PCR product, consisting of 1713 bp and the corresponding sequence of two fragments of the enterococcus gene and the inserted pspf gene fragment between them, is shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing .

Аминокислотная последовательность слитого белка, состоящая из 571 аминокислотного остатка, приведена в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 2.The amino acid sequence of the fusion protein, consisting of 571 amino acid residues, is shown in the List of sequences as SEQ ID NO: 2.

Клон энтерококков PSPF+, экспрессирующий ген слитого PSPF белка, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования. The PSPF + enterococcal clone expressing the gene for the fused PSPF protein is selected as a vaccine preparation for further research.

Пример 5. Вакцинация мышей живой пробиотической вакциной.Example 5. Vaccination of mice with a live probiotic vaccine.

Исследование выполнялось на мышах CBA, самках 16-18 г. Мыши экспериментальной группы (n=16) были вакцинированы интраназально введением в обе ноздри взвеси Enterococcus faecium L3-PSPF в дозе 5 х 108 КОЕ. Бактерии вводили два дня подряд, процедуру вакцинации проводили три раза с интервалом в три недели. Контрольные группы мышей получали по той же схеме пробиотический штамм Enterococcus faecium L3 (n=16) или ЗФР (n=16). Через 18 дней после второй и третьей вакцинации у мышей определяли содержание PSPF-специфических IgA в носовых смывах и PSPF-специфических IgG в сыворотке крови.The study was performed on CBA mice, females 16-18 g. Mice of the experimental group (n = 16) were vaccinated intranasally by suspension in both nostrils Enterococcus faecium L3-PSPF at a dose of 5 x 108 CFU. Bacteria were administered two days in a row, the vaccination procedure was carried out three times with an interval of three weeks. Control groups of mice received the probiotic strain according to the same scheme.Enterococcus faecium L3 (n = 16) or SFR (n = 16). 18 days after the second and third vaccinations in mice, the content of PSPF-specific IgA in nasal swabs and PSPF-specific IgG in blood serum was determined.

Было показано, что в сыворотке крови уже после второй вакцинации присутствовали специфические IgG. На фиг. 8 показано сравнение уровня PSPF-специфических IgG антител в сыворотке крови мышей после двух циклов интраназального введения, где It was shown that specific IgG was present in the blood serum after the second vaccination. In FIG. 8 shows a comparison of the level of PSPF-specific IgG antibodies in the blood serum of mice after two cycles of intranasal administration, where

■- E. faecium L3-PSPF■ - E. faecium L3-PSPF

● - E.. Faecium L3 ● - E .. Faecium L3

▲- ФСБ▲ - FSB

* - различия средних значений достоверны (р0,05)* - differences in mean values are significant (p0.05)

Через 18 дней после третьей вакцинации специфические антитела в сыворотке крови продолжали циркулировать. Сравнение уровня PSPF-специфических IgG антител в сыворотке крови мышей после трех циклов интраназального введения показано на фиг. 9, где18 days after the third vaccination, specific antibodies in the blood serum continued to circulate. A comparison of the level of PSPF-specific IgG antibodies in the blood serum of mice after three cycles of intranasal administration is shown in FIG. 9 where

■ - E.. faecium L3-PSPF■ - E .. faecium L3-PSPF

●- E.. faecium L3● - E .. faecium L3

▲- ФСБ▲ - FSB

* - различия средних значений достоверны (р0,05).* - differences in mean values are significant (p0.05).

Каждая точка представляет собой среднее значение из четырех или пяти мышей на группу . Сравнение независимых выборок проводили методом ANOVA. Статистически достоверные отличия значений ОД450 при анализе сывороток в соответствующих разведениях указаны звездочками, уровень статистической значимости p0,05.Each point represents the average of four or five mice per group. Independent samples were compared using ANOVA. Statistically significant differences in the OD450 values in the analysis of sera in the appropriate dilutions are indicated by asterisks, the level of statistical significance is p0.05.

Анализ секреторных IgA показал, что накануне заражения в носовых секретах мышей, вакцинированных живой вакциной присутствовали PSPF-специфические антитела в титре 1:5-1:10, в контролях специфические антитела не обнаруживались. На фиг. 10 показано сравнение уровня PSPF-специфических IgA антител в индивидуальных сыворотках крови мышей после трех циклов интраназального введения, где Analysis of secretory IgA showed that on the eve of infection, PSPF-specific antibodies in the titer of 1: 5-1: 10 were present in the nasal secretions of mice vaccinated with a live vaccine; no specific antibodies were found in the controls. In FIG. 10 shows a comparison of the level of PSPF-specific IgA antibodies in individual blood sera of mice after three cycles of intranasal administration, where

•- E. faecium L3-PSPF• - E. faecium L3-PSPF

● - E. faecium L3● - E. faecium L3

▲ - ФСБ▲ - FSB

— - среднее значение - - average value

Таким образом, после проведения курса вакцинации живой вакциной происходит стимуляция местного и системного PSPF-специфического иммунного ответа, что выражается в накоплении в носовых секретах и сыворотке специфических антител класса А и G.Thus, after a live vaccination course, a local and systemic PSPF-specific immune response is stimulated, which is reflected in the accumulation of specific antibodies of class A and G in nasal secretions and serum.

Пример 6. Изучение протективной эффективности живой вакцины.Example 6. The study of the protective efficacy of a live vaccine.

Для оценки протективной эффективности живой вакцины Enterococcus faecium L3-PSPF мышей заражали S.pneumoniae штамм 73 (серотип 3). С этой целью 20 мкл суспензии бактерий вводили иммунным и контрольным животным интраназально, каждая доза содержала 6 х 104 КОЕ. Через 4 часа после заражения у части мышей получали легкие для последующего подсчета бактерий в легочной ткани, остальных мышей оставляли для оценки уровня падежа от пневмококковой инфекции. To evaluate the protective efficacy of the live vaccine Enterococcus faecium L3-PSPF, mice were infected with S. pneumoniae strain 73 (serotype 3). To this end, 20 μl of a suspension of bacteria was administered intranasally to the immune and control animals, each dose containing 6 x 10 4 CFU. 4 hours after infection, some of the mice received lungs for subsequent counting of bacteria in the lung tissue, the remaining mice were left to assess the mortality rate from pneumococcal infection.

Через 4 часа после заражения в легких мышей, вакцинированных живой вакциной наблюдалось снижение количества бактерий по сравнению с обеими контрольными группами. На фиг. 11 приведено сравнение показателей выделения S.pneumoniae из легких мышей, вакцинированных интраназально различными препаратами, через 4 часа после заражения. 4 hours after infection, a decrease in the number of bacteria was observed in the lungs of mice vaccinated with a live vaccine compared with both control groups. In FIG. Figure 11 shows a comparison of S. pneumoniae excretion rates from the lungs of mice vaccinated with intranasally different drugs 4 hours after infection.

• - E. faecium L3-PSPF• - E. faecium L3-PSPF

● - E. faecium L3● - E. faecium L3

▲ - ФСБ▲ - FSB

— - среднее значение - - average value

Через 10 дней после заражения в группе вакцинированных живой вакциной мышей падеж составил 40 %, тогда как смертность в контрольных группах составила 75 и 80 %. На фиг. 12 показано изменение доли выживших животных после интраназальной инфекции S.pneumoniae.10 days after infection in the group of mice vaccinated with a live vaccine, the mortality rate was 40%, while mortality in the control groups was 75 and 80%. In FIG. 12 shows the change in the proportion of surviving animals after intranasal infection of S. pneumoniae .

• - E. faecium L3-PSPF• - E. faecium L3-PSPF

●- E. faecium L3● - E. faecium L3

▲- ФСБ▲ - FSB

Таким образом на основании проведенных иммунологических исследований можно заключить, что живая вакцина на основании штамма L3 пробиотика Enterococcus faecium, содержащая химерную последовательность иммунодоминантных участков ряда поверхностных белков пневмококка (PSPF), стимулировала развитие иммунного ответа, достаточного для снижения смертности от летальной пневмококковой инфекции на 40%.Thus, on the basis of immunological studies, it can be concluded that a live vaccine based on the L3 strain of the probiotic Enterococcus faecium , containing the chimeric sequence of immunodominant regions of a number of surface proteins of pneumococcus (PSPF), stimulated the development of an immune response sufficient to reduce mortality from lethal pneumococcal infection by 40% .

Claims

1. A method of creating a live vaccine based on a biologically active strain of E. faecium L3 by incorporating a clinically relevant pathogenic microorganism into its pili structure, which consists in obtaining the enta-pspf fusion gene and its cloning, identifying bacterial clones expressing the desired protein in peels, immunization of mice with a live probiotic vaccine and determination of protein-specific antibodies in blood and nasal swabs.

2. Recombinant plasmid DNA p enta-pspf , which is a plasmid DNA obtained by inserting a total DNA fragment consisting of two separate fragments of the probiotic Enterococcus faecium L3 gene and pspf gene fragment and having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, in a suicide plasmid PT7ERMB at the BamHI and XbaI sites, used to create a live vaccine according to claim 1.

3. The vaccine preparation Enterococcus faecium L3-PSPF +, obtained after electroporation of plasmid DNA p entF-pspf according to claim 2, in which Enterococcus faecium L3 expresses the PSPF fusion gene having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, capable of causing the synthesis of anti-PSPF moreover, the resulting specific antibodies have protective properties against Streptococcus pneumonie.