RU2697412C2 - Express test on basis of pcr, which enables to predict sensitivity of brain tumor of specific patient to oncolytic viruses - Google Patents

Express test on basis of pcr, which enables to predict sensitivity of brain tumor of specific patient to oncolytic viruses Download PDF

Info

Publication number
RU2697412C2
RU2697412C2 RU2016150452A RU2016150452A RU2697412C2 RU 2697412 C2 RU2697412 C2 RU 2697412C2 RU 2016150452 A RU2016150452 A RU 2016150452A RU 2016150452 A RU2016150452 A RU 2016150452A RU 2697412 C2 RU2697412 C2 RU 2697412C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
pcr
sensitivity
viruses
oncolytic
oncolytic viruses
Prior art date
Application number
RU2016150452A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2016150452A3 (en
RU2016150452A (en
Inventor
Анастасия Валерьевна Липатова
Анна Викторовна Кудрявцева
Дмитрий Владимирович Кочетков
Андрей Олегович Желтухин
Анастасия Олеговна Сосновцева
Пётр Михайлович Чумаков
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Priority to RU2016150452A priority Critical patent/RU2697412C2/en
Publication of RU2016150452A publication Critical patent/RU2016150452A/en
Publication of RU2016150452A3 publication Critical patent/RU2016150452A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2697412C2 publication Critical patent/RU2697412C2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention refers to medicine and molecular biology. Disclosed is a PCR-based rapid test for prediction of sensitivity of a brain tumour sample of a specific patient to oncolytic viruses. Express test is based on analysis of interrelation of gene expression levels PVR, CD55, CXADR, ICAM1, ITGAV, ITGB1, ITGA2, ITGB3, SELPLG, TMPRSS2, TMPRSS4, TMPRSS9, TMPRSS11D, EIF2AK2, IFIH1, MAVS, IRF-3, IRF-9, STAT1, STAT2, NLRX1, SCARB2, RARRES3 and susceptibility of malignant cells to oncolytic action of viruses and includes a mixture for amplification, 96-well plate with a lyophilised mixture of amplification-specific sections of gene markers of primers and corresponding oligonucleotide probes and a scheme for interpreting test results.
EFFECT: invention provides effective selection of personified therapy of cerebral malignancies.
1 cl, 4 dwg, 3 tbl, 2 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к области молекулярной биологии, медицине и касается экспресс-теста, позволяющего методом ПЦР-анализа определять экспрессии в образце опухолевой ткани головного мозга пациента ряда маркерных генов, анализ экспрессии которых можно использовать для предсказания чувствительности опухоли конкретного пациента к онколитическим вирусам. Предлагаемое изобретение может найти применение в медицине и клинической лабораторной диагностике для подбора персонифицированной терапии злокачественных новообразований головного мозга.The invention relates to the field of molecular biology, medicine, and relates to an express test that allows the method of PCR analysis to determine the expression in a sample of tumor tissue of a patient’s brain tissue of a number of marker genes, the expression analysis of which can be used to predict the sensitivity of a particular patient’s tumor to oncolytic viruses. The present invention may find application in medicine and clinical laboratory diagnostics for the selection of personalized therapy for malignant neoplasms of the brain.

Уровень техникиState of the art

Несмотря на достижения современной медицины, излечение пациентов со злокачественными опухолями глиального происхождения остается нерешенной задачей. Инвазивный характер и расположение в жизненно важных областях головного мозга ограничивают возможности хирургического лечения, применение химиолучевой терапии осложняется высокой устойчивостью опухолевых стволовых клеток, обуславливающей появление рецидивов заболевания, а адъювантная терапия пока также не приносит ожидаемых результатов [1, 2].Despite the achievements of modern medicine, the cure of patients with malignant tumors of glial origin remains an unresolved problem. The invasive nature and location in vital areas of the brain limit the possibilities of surgical treatment, the use of chemoradiotherapy is complicated by the high stability of tumor stem cells, which causes the onset of relapses, and adjuvant therapy also does not bring the expected results [1, 2].

Совершенствование технологий биоселекции, а также конструирования рекомбинантных вирусов позволили создать штаммы, обладающие онколитическими свойствами в отношении глиальных опухолей. Многие штаммы прошли первую стадию клинических испытаний и продемонстрировали практическое отсутствие токсичности и высокую безопасность их использования. Несмотря на очевидную перспективность данного подхода и демонстрацию впечатляющих результатов у отдельных пациентов, терапевтическое действие существующих штаммов мало предсказуемо, что указывает на необходимость их дальнейшего совершенствования.Improving the technology of bioselection, as well as the construction of recombinant viruses, allowed the creation of strains with oncolytic properties against glial tumors. Many strains passed the first stage of clinical trials and demonstrated the practical absence of toxicity and high safety of their use. Despite the obvious promise of this approach and the demonstration of impressive results in individual patients, the therapeutic effect of existing strains is little predictable, which indicates the need for their further improvement.

Злокачественные заболевания крайне индивидуальны, что обуславливает различия в чувствительности опухолей отдельных пациентов к онколитическим вирусам. Поэтому для повышения эффективности терапии требуется учитывать индивидуальные особенности опухоли, что позволит подбирать для каждого пациента наиболее эффективный для его случая набор онколитических штаммов.Malignant diseases are extremely individual, which leads to differences in the sensitivity of individual patients' tumors to oncolytic viruses. Therefore, to increase the effectiveness of therapy, it is required to take into account the individual characteristics of the tumor, which will allow selecting for each patient the most effective set of oncolytic strains for his case.

Эффективность проникновения вируса в клетку, успешность его репликации и распространение зависят от ряда факторов, присутствующих в клетке-хозяине. Первым этапом взаимодействия вируса и клетки является связывание вируса с поверхностными рецепторами - молекулами, имеющими сродство к вирусу. За проникновения непатогенных энтеровирусов в клетки человека отвечают различные рецепторы. Для полиовируса - это полиовирусный рецептор (PVR, также CD155 или NECL5) [3], является трансмембранным гликопротеидом, относящимся к суперсемейству иммуноглобулинов, его внешний домен отвечает за прикрепление клетки к внеклеточному матриксу путем связывания с витронектином, а внутриклеточный домен взаимодействует с легкой цепью динеина Tctex-1/DYNLTl [4]. Для вируса Коксаки группы В - это рецептор некоторых вирусов Коксаки группы В и аденовирусов (CXADR или CAR) [5], является представителем рецепторов адгезии семейства JAM, расположен в плотных и адгезионных контактах на стыке эпителиальных клеток, контролирует в межклеточных контактах стабильность Е-кадгерина путем участия в его Src-зависимом эндоцитозе [6]. А для некоторых вирусов Коксаки группы А и ряда Эховирусов - это CD55 или DAF [7-10] поверхностный трансмембранный гликопротеин участвующий в регуляции каскада комплемента, связывание с CD55 белков комплемента ускоряет их разрушение, чем прерывает каскад и защищает клетки организма от повреждения [11-13].The effectiveness of the penetration of the virus into the cell, the success of its replication and spread depends on a number of factors present in the host cell. The first step in the interaction of the virus and the cell is the binding of the virus to surface receptors - molecules that have an affinity for the virus. Various receptors are responsible for the penetration of non-pathogenic enteroviruses into human cells. For poliovirus, this is a poliovirus receptor (PVR, also CD155 or NECL5) [3], is a transmembrane glycoprotein belonging to the immunoglobulin superfamily, its external domain is responsible for the attachment of cells to the extracellular matrix by binding to vitronectin, and the intracellular domain interacts with the light chain Tctex-1 / DYNLTl [4]. For Coxsackie virus, group B is a receptor of some Coxsackie viruses of group B and adenoviruses (CXADR or CAR) [5], it is a representative of the adhesion receptors of the JAM family, it is located in tight and adhesive contacts at the junction of epithelial cells, it controls the stability of E-cadherin in intercellular contacts by participating in its Src-dependent endocytosis [6]. And for some Coxsackie viruses of group A and a number of Echoviruses, it is CD55 or DAF [7-10] the surface transmembrane glycoprotein involved in the regulation of the complement cascade, binding of complement proteins to CD55 accelerates their destruction, which interrupts the cascade and protects the body’s cells from damage [11- 13].

Но не для всех энтеровирусов достаточно присутствие только вышеупомянутых рецепторов, но также необходимо присутствие других рецепторов или дополнительных молекул, выступающих в роли ко-рецептора. Например, установлено что ЕСН01 взаимодействует с интегрином α2β1 (ITGA2) [14-26]; Coxsackie А21 - с молекулой межклеточной адгезии ICAM-1 [27]; проникновение в клетки энтеровируса 71 и Coxsackie А24 зависит от присутствия молекулы клеточной адгезии Р-селектина SELPLG [28-31]; фагоцитарный рецептор SCARB2 способствует проникновению Coxsackie А7, А14, А16 и энтеровируса 71 [32,33].But the presence of only the aforementioned receptors is not sufficient for all enteroviruses, but the presence of other receptors or additional molecules acting as a co-receptor is also necessary. For example, it was found that ESN01 interacts with the integrin α 2 β 1 (ITGA2) [14-26]; Coxsackie A21 - with an intercellular adhesion molecule ICAM-1 [27]; penetration of Enterovirus 71 and Coxsackie A24 into the cells depends on the presence of the SELPLG P-selectin cell adhesion molecule [28-31]; the SCARB2 phagocytic receptor facilitates the penetration of Coxsackie A7, A14, A16 and enterovirus 71 [32,33].

Но проникновение вируса в клетку не может в полной мере обеспечить репликацию вируса из-за присутствия в клетках определенных механизмов противовирусной защиты, в том числе механизмов интерферонового ответа. Клетки опухоли в ходе злокачественной прогрессии утрачивают многие механизмы противовирусной защиты и поэтому становятся привлекательными мишенями для вирусного онколиза [34, 35]. В системе индукции интерферона существует множество сигнальных путей, подавление которых может способствовать репликации и распространению определенных онколитических вирусов. К таким молекулам мишеням можно отнести регуляторные факторы интерферонов (IRF); митохондриальный антивирусный сигнальный белок (MAVS); переносчик сигналов и фактор транскрипции (STAT); Nod-подобный рецептор XI (NLRX1) и другие [36].But the penetration of the virus into the cell cannot fully ensure the replication of the virus due to the presence of certain antiviral defense mechanisms in the cells, including the interferon response mechanisms. Tumor cells during malignant progression lose many of their antiviral defense mechanisms and therefore become attractive targets for viral oncolysis [34, 35]. There are many signaling pathways in the interferon induction system, the suppression of which can facilitate the replication and spread of certain oncolytic viruses. Such target molecules include regulatory factors of interferons (IRF); mitochondrial antiviral signaling protein (MAVS); signal carrier and transcription factor (STAT); Nod-like receptor XI (NLRX1) and others [36].

Наиболее подходящим методом для быстрого определения уровня экспрессии небольшого числа генов - биомаркеров, является ПЦР в реальном времени (рвПЦР). В ходе проведения рвПЦР количество амплифицированной ДНК определяется после каждого цикла амплификации («в реальном времени») за счет прямой детекции флуоресценции в пробирке, уровень которой прямо пропорционален количеству ПЦР-продукта. Такой анализ является весьма быстрым и не требует проведения дополнительных процедур детекции продуктов амплификации (электрофорез и визуализация), что в значительной мере уменьшает риск контаминации и число ложноположительных результатов [37-40].The most suitable method for quickly determining the expression level of a small number of biomarker genes is real-time PCR (rVPCR). During rvPCR, the amount of amplified DNA is determined after each amplification cycle (“in real time”) due to direct detection of fluorescence in a test tube, the level of which is directly proportional to the amount of PCR product. Such an analysis is very quick and does not require additional procedures for the detection of amplification products (electrophoresis and visualization), which significantly reduces the risk of contamination and the number of false positive results [37–40].

Для определения динамики наработки ампликонов могут быть использованы интеркалирующие красители или флуоресцентно меченные олигонуклеотидные пробы. При использовании флуоресцентномеченых олигонуклеотидных проб, олигонуклеотид (зонд), комплементарный амплифицируемому фрагменту, связывают с флуорофором и гасителем (тушителем) флуоресценции. Когда флуорофор и тушитель связаны с зондом, кванты света флуорофора эффективно поглощаются тушителем и наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5-3' экзонуклеазной активности Taq-полимеразы олигонуклеотидный зонд гидролизуется, флуоресцентная метка освобождается и переходит в раствор, создавая флуоресцентный сигнал [39-42].Intercalating dyes or fluorescently labeled oligonucleotide probes can be used to determine the dynamics of amplicon production. When using fluorescently labeled oligonucleotide samples, the oligonucleotide (probe) complementary to the amplified fragment is associated with a fluorophore and a fluorescence quencher (quencher). When the fluorophore and the quencher are associated with the probe, the light quanta of the fluorophore are effectively absorbed by the quencher and only a slight fluorescence emission is observed. During the amplification process, due to the 5-3 'exonuclease activity of Taq polymerase, the oligonucleotide probe is hydrolyzed, the fluorescent label is released and passes into the solution, creating a fluorescent signal [39-42].

Метод позволяет достоверно регистрировать накопление фрагмента ДНК строго определенной последовательности. В связи со значительным разнообразием флуорофоров (со значительно отличающимся спектром флуоресценции), возможно параллельное использование сразу нескольких зондов, комплементарных нескольким последовательностям - мультиплексная ПЦР (МПЦР) в реальном времени. Мультиплексная полимеразная реакция - вариант проведения ПЦР, при котором в реакционном объеме одновременно присутствует смесь нескольких пар праймеров, специфичных в отношении разных мРНК, что позволяет проводить одновременную амплификацию соответствующих участков. Этот подход активно внедряется в разных областях ПЦР диагностики [43-47]. Переход от моноплексного формата к мультиплексному повышает минимально выявляемое количество мРНК примерно в 3-4 раза (с 6 копий/реакции до 20 копий/реакции). Тем не менее, значительно повышается воспроизводимость результатов анализа и намного сокращает время проведения процедуры [48, 49].The method allows to reliably register the accumulation of a DNA fragment of a strictly defined sequence. Due to the significant variety of fluorophores (with a significantly different fluorescence spectrum), it is possible to use several probes at once that are complementary to several sequences - real-time multiplex PCR (MPR). Multiplex polymerase reaction is a variant of PCR, in which a mixture of several pairs of primers specific for different mRNAs is simultaneously present in the reaction volume, which allows simultaneous amplification of the corresponding regions. This approach is being actively implemented in various areas of PCR diagnostics [43–47]. The transition from a monoplex to a multiplex format increases the minimum detectable amount of mRNA by about 3-4 times (from 6 copies / reaction to 20 copies / reaction). Nevertheless, the reproducibility of the analysis results is significantly increased and the procedure time is greatly reduced [48, 49].

Таким образом, исходя из уровня техники, существует потребность в создании экспресс-теста на основе ПЦР, позволяющего предсказывать чувствительность опухоли головного мозга конкретного пациента к онколитическим вирусам и подбирать персонифицированную терапию.Thus, based on the prior art, there is a need to create an express test based on PCR to predict the sensitivity of a brain tumor of a particular patient to oncolytic viruses and select personalized therapy.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention

Задачами настоящего изобретения являются: 1) определение перечня генных маркеров чувствительности к онколитическим вирусам 2) разработка схемы мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для детекции генных маркеров чувствительности к онколитическим вирусам.The objectives of the present invention are: 1) to determine the list of gene markers of sensitivity to oncolytic viruses 2) to develop a multiplex PCR scheme in real time for the detection of gene markers of sensitivity to oncolytic viruses.

Первая техническая задача решается за счет того, что путем анализа и сопоставления данных литературы, данных транскриптомного секвенирования опухолевых клеток головного мозга, данных по определению чувствительности опухолевых клеток к онколитическим вирусам был сформирован перечень генных маркеров, связанных с чувствительностью клеток к онколитическим вирусам. Формирования окончательного перечня генных маркеров чувствительности опухолевых клеток головного мозга к онколитическим вирусам производится с помощью верификации связи генных маркеров путем выключения экспрессии этих маркеров с помощью специфической РНК интерференции, либо гиперэкспрессии этих маркеров с использованием метода лентивирусной трансдукции.The first technical problem is solved due to the fact that by analyzing and comparing literature data, transcriptome sequencing of brain tumor cells, and data on determining the sensitivity of tumor cells to oncolytic viruses, a list of gene markers related to the sensitivity of cells to oncolytic viruses has been formed. The final list of gene markers of the sensitivity of brain tumor cells to oncolytic viruses is generated by verifying the linkage of gene markers by turning off the expression of these markers using specific RNA interference, or by overexpressing these markers using the lentiviral transduction method.

Существенные признаки, характеризующие перечень генных маркеров чувствительности к онколитическим вирусам согласно настоящему изобретению:The essential features characterizing the list of gene markers of sensitivity to oncolytic viruses according to the present invention:

1) Перечень генных маркеров чувствительности с указанием направленности связи для каждого онколитического вируса. Перечень представлен в Табл. 1.1) A list of gene markers of sensitivity indicating the direction of communication for each oncolytic virus. The list is presented in Tab. one.

2) Коэффициент ранговой корреляции Спирмена между уровнем экспрессии маркерных генов, вошедших в определяемый перечень генных маркеров, и чувствительности к онколитическим вирусам в отношении органных культур злокачественных опухолей головного мозга равен, либо больше

Figure 00000001
. Коэффициенты корреляции Спирмена уровней экспрессии маркерных генов и чувствительности к онколитическим вирусам в отношении органных культур злокачественных опухолей головного мозга представлены на Фиг. 1.2) Spearman's rank correlation coefficient between the expression level of marker genes included in the determined list of gene markers and sensitivity to oncolytic viruses in relation to organ cultures of malignant brain tumors is equal to or greater
Figure 00000001
. Spearman's correlation coefficients of marker gene expression levels and sensitivity to oncolytic viruses in relation to organ cultures of malignant brain tumors are presented in FIG. one.

3) В перечень вошли генные маркеры со степенью несоответствия результатов вычисления коэффициентов ранговой корреляции Спирмена, выявленной в результате верификации связи генных маркеров путем выключения экспрессии этих маркеров с помощью специфической РНК интерференции, либо гиперэкспрессии этих маркеров с использованием метода лентивирусной трансдукции, равной менее 0,5. Степень несоответствия, выявленная в ходе верификации связи генных маркеров в определении чувствительности к конкретным онколитическим вирусам представлена на Фиг. 2.3) The list includes gene markers with a degree of inconsistency between the results of the calculation of Spearman's rank correlation coefficients, revealed as a result of verification of the linkage of gene markers by turning off the expression of these markers using specific RNA interference, or hyperexpression of these markers using the lentiviral transduction method equal to less than 0.5 . The degree of inconsistency revealed during verification of the linkage of gene markers in determining sensitivity to specific oncolytic viruses is presented in FIG. 2.

Способ определения списка генных маркеров представлен в Примере 1. Перечень генных маркеров представлен в Табл. 1. На Фиг. 1. представлены коэффициенты ранговой корреляции Спирмена между уровнями экспрессии маркерных генов в злокачественных опухолях головного мозга и их чувствительностью к онколитическим вирусам, а на Фиг. 2 степень несоответствия, выявленная в ходе верификации связи генных маркеров, в определении чувствительности к конкретным онколитическим вирусам.A method for determining the list of gene markers is presented in Example 1. The list of gene markers is presented in Table. 1. In FIG. 1. the Spearman rank correlation coefficients between the levels of expression of marker genes in malignant brain tumors and their sensitivity to oncolytic viruses are presented, and FIG. 2 degree of inconsistency revealed during verification of the linkage of gene markers in determining the sensitivity to specific oncolytic viruses.

Вторая техническая задача решается за счет того, что был проведен дизайн специфических последовательностей праймеров и зондов для амплификации участков определяемых маркерных генов и генов «домашнего хозяйства», подходящих для проведения мультиплексного ПЦР в режиме реального времени, а также разработана схема проведения ПЦР.The second technical problem is solved due to the fact that specific sequences of primers and probes were designed to amplify sections of the determined marker genes and “housekeeping” genes suitable for real-time multiplex PCR, and a PCR scheme was developed.

Существенные признаки, характеризующие разработку схемы мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для детекции генных маркеров чувствительности к онколитическим вирусам согласно настоящему изобретению:Salient features characterizing the development of a real-time multiplex PCR scheme for the detection of gene markers of sensitivity to oncolytic viruses according to the present invention:

1) Специфические праймеры для амплификации участков генов маркеров и генов «домашнего хозяйства», подходящие для проведения мультиплексной ПЦР. Последовательность праймеров представлена в Табл. 2.1) Specific primers for amplification of marker gene regions and “housekeeping” genes, suitable for multiplex PCR. The sequence of primers is presented in Table. 2.

2) Специфические зонды для детекции амплификации участков маркерных генов и генов «домашнего хозяйства», подходящие для проведения мультиплексной ПЦР. Последовательность праймеров представлена в Табл. 3.2) Specific probes for detecting amplification of marker gene and “housekeeping” genes, suitable for multiplex PCR. The sequence of primers is presented in Table. 3.

3) Комбинирование генных маркеров и генов «домашнего хозяйства» для определения в одном анализе Схема представлена на Фиг. 3.3) Combination of gene markers and “housekeeping” genes for determination in one analysis. The scheme is presented in FIG. 3.

Схема мультеплексной ПЦР в режиме реального времени для детекции генных маркеров чувствительности к онколитическим представлена в Примере 2. Комбинации генов для детекции в одной реакции представлены на Фиг. 3.The real-time multiplex PCR scheme for the detection of gene markers of sensitivity to oncolytic is presented in Example 2. The combinations of genes for detection in one reaction are presented in FIG. 3.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.Further, the invention will be disclosed in more detail with reference to the figures and examples, which are given solely to illustrate and explain the essence of the claimed invention, but which are not intended to limit the scope of claims.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

Фиг. 1 демонстрирует коэффициенты ранговой корреляции Спирмена между уровнями экспрессии маркерных генов в злокачественных опухолях головного мозга и их чувствительностью к онколитическим вирусам.FIG. 1 shows Spearman's rank correlation coefficients between marker gene expression levels in malignant brain tumors and their sensitivity to oncolytic viruses.

Фиг. 2 демонстрирует степень несоответствия, выявленную в ходе верификации связи генных маркеров в определении чувствительности к конкретным онколитическим вирусам.FIG. Figure 2 demonstrates the degree of mismatch identified during verification of the linkage of gene markers in determining sensitivity to specific oncolytic viruses.

Фиг. 3 демонстрирует группы генных маркеров, которые определяются совместно в одной реакции.FIG. 3 shows groups of gene markers that are defined together in a single reaction.

Фиг. 4 демонстрирует изменения генного профиля злокачественных опухолей головного мозга человека под воздействием онколитических вирусов.FIG. 4 shows changes in the gene profile of malignant tumors of the human brain under the influence of oncolytic viruses.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Настоящее изобретение обеспечивает экспресс-тест, позволяющий методом ПЦР-анализа определять экспрессии в образце опухолевой ткани головного мозга пациента ряда маркерных генов, анализ экспрессии которых можно использовать для предсказания чувствительности опухоли конкретного пациента к онколитическим вирусам. Экспресс-тест представляет собой тест-систему для определения уровня экспрессии генных маркеров чувствительности в злокачественных опухолях головного мозга к онколитической виротерапии методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.The present invention provides a rapid test that allows PCR analysis to determine the expression in a sample of tumor tissue of the patient’s brain tissue of a number of marker genes, the expression analysis of which can be used to predict the sensitivity of a particular patient’s tumor to oncolytic viruses. The rapid test is a test system for determining the level of expression of gene markers of sensitivity in malignant brain tumors to oncolytic virotherapy using real-time multiplex PCR.

Список определяемых генных маркеров, позволяющих предсказывать чувствительность опухолевых клеток к действию онколитического вируса, должен включать в себя генные маркеры со значением коэффициента ранговой корреляции Спирмена между уровнем экспрессии маркерных генов и чувствительностью к онколитическим вирусам равным, либо большим

Figure 00000001
(Фиг. 1). Кроме этого проводилась верификация связи генных маркеров с чувствительностью с помощью получения и тестирования клеточных линий с измененным уровнем экспрессии (нокдаун или гиперэксспресия гена). На основе этих данных определяли степень несоответствия результатов вычисления коэффициентов ранговой корреляции Спирмена. Перечень определяемых генных маркеров должен включать в себя, только те генные маркеры, у которых степень несоответствия ниже или равна 0,5 (Фиг. 2). Окончательный список генных маркеров, определение уровня экспрессии которых позволяет предсказывать чувствительность злокачественных опухолей головного мозга пациента к терапевтическому действию онколитических вирусов, представлен в Табл. 1.The list of determined gene markers that allow predicting the sensitivity of tumor cells to the action of the oncolytic virus should include gene markers with the Spearman rank correlation coefficient between the level of expression of marker genes and sensitivity to oncolytic viruses equal to or greater
Figure 00000001
(Fig. 1). In addition, the relationship of gene markers with sensitivity was verified by obtaining and testing cell lines with a changed expression level (knockdown or hyperexpression of the gene). Based on these data, the degree of inconsistency between the results of calculating the Spearman rank correlation coefficients was determined. The list of determined gene markers should include only those gene markers in which the degree of mismatch is lower than or equal to 0.5 (Fig. 2). The final list of gene markers, the determination of the expression level of which allows to predict the sensitivity of malignant brain tumors of the patient to the therapeutic effect of oncolytic viruses, is presented in Table. one.

Для обеспечения оптимальных условий мультиплексной ПЦР в режиме реального времени необходимо использовать специфические праймеры и олигонуклеотидные зонды, меченные флуорофором. Выбор последовательности праймеров, используемых для проведения ПЦР, является важнейшим этапом разработки тест-системы. К праймерам для рвПЦР выдвигаются следующие основные требования:In order to ensure optimal conditions for real-time multiplex PCR, it is necessary to use specific primers and oligonucleotide probes labeled with a fluorophore. The choice of the sequence of primers used for PCR is the most important step in the development of a test system. The following basic requirements are put forward for primers for rvPCR:

- длина - 18-30 п.н- length - 18-30 bp

- GC-состав - 40-60%- GC composition - 40-60%

- температура отжига (Тт) - 50-65°С- annealing temperature (T t ) - 50-65 ° С

- длина ампликона - 90-150 п.н.- amplicon length - 90-150 bp

Желательно, чтобы Тт праймеров была близка между собой (Espy et al., 2006), в то же время температура плавления зондов должна быть на 5-10°С выше (при этом примерно одинакова для всех зондов). Это условие диктуется необходимостью взаимодействия зонда с ампликоном до того, как полимераза начнет синтезировать комплементарную цепь ДНК. Только в этом случае будет обеспечено эффективное разрушение зонда за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы (пик 5'-экзонуклеазной активности - около 60°С). Для исключения возможности формирования димеров праймеров, как минимум четыре 3'-концевых нуклеотида не должны быть комплементарны самому праймеру, праймеру в паре или зонду. Желательно, чтобы последовательность не содержала повторов и протяженных участков из одного типа нуклеотидов (более 4-5 азотистых оснований одного типа подряд).It is desirable that T t of primers be close to each other (Espy et al., 2006), at the same time, the melting temperature of the probes should be 5-10 ° C higher (approximately the same for all probes). This condition is dictated by the need for the probe to interact with the amplicon before the polymerase begins to synthesize a complementary DNA strand. Only in this case, the effective destruction of the probe due to the 5'-exonuclease activity of Taq polymerase will be ensured (the peak of the 5'-exonuclease activity is about 60 ° C). To exclude the possibility of the formation of primer dimers, at least four 3'-terminal nucleotides should not be complementary to the primer itself, the primer in pair or probe. It is desirable that the sequence does not contain repeats and extended sections of one type of nucleotides (more than 4-5 nitrogenous bases of the same type in a row).

Для проведение детекции продуктов амплификации в мультиплексной схеме ПЦР были выбраны 4 пары флуорофор-тушитель флуоресценции. А все генные маркеры и гены «домашнего хозяйства» были разделены на группы по 3-4 гена (Фиг. 3). Было проведено компьютерное моделирование взаимодействия всех праймеров и зондов с последовательностями кДНК и между собой для исключения возможности неспецифической гибридизации и соответственно получения ложноположительных результатов. Последовательности специфичных праймеров и зондов представлены в Табл. 2 и 3.To carry out the detection of amplification products in a multiplex PCR scheme, 4 pairs of fluorophore-quencher of fluorescence were selected. And all the gene markers and genes of the “household” were divided into groups of 3-4 genes (Fig. 3). Computer simulation of the interaction of all primers and probes with cDNA sequences and between each other was performed to exclude the possibility of nonspecific hybridization and, accordingly, to obtain false positive results. The sequences of specific primers and probes are presented in Table. 2 and 3.

Примеры осуществления настоящего изобретения.Embodiments of the present invention.

Пример 1. Способ определения списка генных маркеровExample 1. The method of determining the list of gene markers

Проанализировав данные литературы, были выбраны 23 гена (PVR, CD55, CXADR, ICAM1, ITGAV, ITGB1, ITGA2, ITGB3, SELPLG, TMPRSS2, TMPRSS4, TMPRSS9, TMPRSS11D, EIF2AK2, IFIH1, MAVS, IRF-3, IRF-9, STAT1, STAT2, NLRX1, SCARB2, RARRES3), необходимые для эффективного проникновения в клетки, онколиза и продукции вирусного потомства панели исследуемых онколитических вирусов. С помощью количественного ПЦР в реальном времени был получен экспрессионный профиль этих 23 генов в 238 органных культурах злокачественных опухолей головного мозга.After analyzing the literature data, 23 genes were selected (PVR, CD55, CXADR, ICAM1, ITGAV, ITGB1, ITGA2, ITGB3, SELPLG, TMPRSS2, TMPRSS4, TMPRSS9, TMPRSS11D, EIF2AK2, IFIH1, MAVS, IRF-3, IRF-9, STAT1 , STAT2, NLRX1, SCARB2, RARRES3) necessary for effective penetration into cells, oncolysis and production of viral offspring of the panel of the studied oncolytic viruses. Using quantitative real-time PCR, an expression profile of these 23 genes was obtained in 238 organ cultures of malignant brain tumors.

Каждая органная культура тестировалась на чувствительность к онколитическим вирусам. Из органных культур, для изучения изменения уровня относительной экспрессии панели генов под воздействием вирусов, были выбраны по 60 образцов на каждый вирус (с разной чувствительностью к вирусу). Отобранные органные культуры инфицировались соответствующим вирусом и через 5 часов проводили выделение тотальной РНК и количественную ртПЦР. Изменения генного профиля злокачественных опухолей головного мозга человека под воздействием онколитических вирусов представлена на Фиг. 4.Each organ culture was tested for sensitivity to oncolytic viruses. From organ cultures, to study changes in the level of relative expression of the gene panel under the influence of viruses, 60 samples were selected for each virus (with different sensitivity to the virus). Selected organ cultures were infected with the corresponding virus and after 5 hours total RNA was isolated and quantitative rtPCR was performed. Changes in the gene profile of malignant tumors of the human brain under the influence of oncolytic viruses are presented in FIG. four.

Затем были вычислены коэффициенты ранговой корреляции с целью выявления наиболее значимых предсказательных маркеров. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена - это непараметрический метод, используемый для статистического изучения связи между явлениями, отражающий фактическую степень параллелизма между двумя количественными рядами изучаемых признаков. Именно такой метод дает наиболее точную оценку тесноты установленной связи с помощью количественно выраженного коэффициента.Then, the rank correlation coefficients were calculated in order to identify the most significant predictive markers. Spearman's rank correlation coefficient is a nonparametric method used to statistically study the relationship between phenomena, reflecting the actual degree of parallelism between two quantitative series of the studied attributes. It is this method that gives the most accurate assessment of the tightness of the established relationship using a quantitative coefficient.

Коэффициент корреляции Спирмена вычисляется по формуле 1:Spearman's correlation coefficient is calculated by the formula 1:

Figure 00000002
Figure 00000002

Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена между уровнями экспрессии маркерных генов в злокачественных опухолях головного мозга и их чувствительностью к онколитическим вирусам представлены на Фиг. 1.Spearman's rank correlation coefficients between marker gene expression levels in malignant brain tumors and their sensitivity to oncolytic viruses are shown in FIG. one.

Далее проводили работу по созданию сублиний клеток с подавлением экспрессии генных маркеров с помощью специфической РНК интерференции, либо гиперэкспрессии этих маркеров с использованием метода лентивирусной трансдукции. Изменение экспрессии подтверждали с помощью ПЦР в режиме реального времени. Полученные линии тестировали на чувствительность к онколитическим вирусам и сравнивали с исходной чувствительностью. Затем проводили верификацию генных маркеров и вычисляли степени несоответствия, которые представлены на Фиг. 2. В перечень вошли генные маркеры со степенью несоответствия результатов вычисления коэффициентов ранговой корреляции Спирмена, выявленной в результате верификации связи генных маркеров, равной 0,5 или меньше. Итоговый список генных маркеров представлен в Табл. 1.Further, work was done to create subline cells with suppression of gene marker expression using specific RNA interference, or hyperexpression of these markers using the lentiviral transduction method. The change in expression was confirmed by real-time PCR. The obtained lines were tested for sensitivity to oncolytic viruses and compared with the initial sensitivity. Then, gene markers were verified and the degrees of mismatch, which are presented in FIG. 2. The list includes gene markers with the degree of inconsistency of the results of the calculation of Spearman's rank correlation coefficients, revealed as a result of verification of the linkage of gene markers equal to 0.5 or less. The final list of gene markers is presented in Table. one.

Пример 2. Схема мультеплексной ПЦР в режиме реального времени для детекции генных маркеров чувствительности к онколитическим вирусамExample 2. The scheme of multiplex PCR in real time for the detection of gene markers of sensitivity to oncolytic viruses

Для оптимизации времени проведения анализа, а также повышения его информативности, 23 анализируемых маркерных гена должны были быть разбиты на группы для совместного анализа путем проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени. Некоторые из исследуемых генов обладали существенной гомологией, что, очевидно, могло сказаться на специфичности разработанного ПЦР-теста. Кроме этого, на эффективность протекания реакции могли повлиять такие явления, как образование димеров праймеров.To optimize the time of the analysis, as well as increase its information content, 23 analyzed marker genes had to be divided into groups for joint analysis by conducting real-time multiplex PCR. Some of the studied genes possessed significant homology, which, obviously, could affect the specificity of the developed PCR test. In addition, phenomena such as the formation of primer dimers could affect the efficiency of the reaction.

После проведения компьютерного моделирования мультиплексной ПЦР в реальном времени со всеми возможными комбинациями анализируемых маркеров по группам, а также экспериментальной проверки результатов моделирования с использованием 24 образцов кДНК, полученных из биоптатов злокачественных опухолей головного мозга, в качестве наилучшей схемы была выбрана схема, изображенная на Фиг. 3.After computer simulation of real-time multiplex PCR with all possible combinations of the analyzed markers in groups, as well as experimental verification of the simulation results using 24 cDNA samples obtained from biopsy samples of malignant brain tumors, the scheme depicted in FIG. 3.

Были сформированы 8 групп генов:8 gene groups were formed:

1 группа: ITGAV, SCARB2, RARRES3Group 1: ITGAV, SCARB2, RARRES3

2 группа: PVR, CD55,1С AMIGroup 2: PVR, CD55.1C AMI

3 группа: STAT1, TMPRSS1 ID, NLRX13 group: STAT1, TMPRSS1 ID, NLRX1

4 группа: IRF9, ITGB3, CXADRGroup 4: IRF9, ITGB3, CXADR

5 группа: ITGA2, TMPRSS2, EIF2AK25th group: ITGA2, TMPRSS2, EIF2AK2

6 группа: IFIH1, TMPRSS4, MAVS6 group: IFIH1, TMPRSS4, MAVS

7 группа: ITGB1, IRF3, STAT27th group: ITGB1, IRF3, STAT2

8 группа: TMPRSS9, SELPLG8 group: TMPRSS9, SELPLG

Каждая из указанных групп может быть дополнена одним «хаускиперным» геном. Олигонуклеотидные зонды в каждой анализируемой группе должны быть связаны различными парами флуорофоров-тушителей (например: FAM-BHQ1; TAMRA- BHQ2; JOE- BHQ1; Су5- BHQ2 и др.).Each of these groups can be supplemented with one “housekeeping” gene. The oligonucleotide probes in each analyzed group should be connected by different pairs of quencher fluorophores (for example: FAM-BHQ1; TAMRA-BHQ2; JOE-BHQ1; Cy5-BHQ2 and others).

Из анализируемых образцов кДНК готовятся 3 10-кратных разведения, после чего в 3х повторностях наносят на лунки с лиофилизованными праймерами и зондами на соответствующие анализируемые маркерные гены. Также для каждой анализируемой группы предусмотрено по 3 лунки, внесение образца кДНК в которые не предполагается: две для отрицательного контроля (обозначенные «-») и одна, содержащая контрольные образцы кДНК, для положительного контроля (обозначена «+»).3 10-fold dilutions are prepared from the analyzed cDNA samples, after which they are applied in 3 replicates to wells with lyophilized primers and probes on the corresponding analyzed marker genes. Also, for each analyzed group, 3 wells are provided, the introduction of a cDNA sample into which is not expected: two for negative control (marked with “-”) and one containing control cDNA samples for positive control (marked with “+”).

Figure 00000003
Figure 00000003

Figure 00000004
Figure 00000004

Figure 00000005
Figure 00000005

Figure 00000006
Figure 00000006

Figure 00000007
Figure 00000007

Список литературыBibliography

1. Mirimanoff R.O., Gorlia Т., Mason W., Van den Bent M.J., Kortmann R.D., Fisher В., Reni M., Brandes A.A., Curschmann J., Villa S., Cairncross G., Allgeier A., Lacombe D., Stupp R. Radiotherapy and temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: recursive partitioning analysis of the EORTC 26981/22981-NCIC CE3 phase III randomized trial. // J Clin Oncol. - 2006. - V. 24. - P. 2563-2569.1. Mirimanoff RO, Gorlia T., Mason W., Van den Bent MJ, Kortmann RD, Fisher B., Reni M., Brandes AA, Curschmann J., Villa S., Cairncross G., Allgeier A., Lacombe D ., Stupp R. Radiotherapy and temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: recursive partitioning analysis of the EORTC 26981/22981-NCIC CE3 phase III randomized trial. // J Clin Oncol. - 2006. - V. 24. - P. 2563-2569.

2. van den Bent M.J., Hegi M.E., Stupp R. Recent developments in the use of chemotherapy in brain tumours. // European journal of cancer (Oxford, England: 1990). - 2006. - V. 42. - P. 582-588.2. van den Bent M.J., Hegi M.E., Stupp R. Recent developments in the use of chemotherapy in brain tumors. // European journal of cancer (Oxford, England: 1990). - 2006. - V. 42. - P. 582-588.

3. Mendelsohn C, Johnson В., Lionetti K.A., Nobis P., Wimmer E., Racaniello V.R. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1986. - V. 83. - P. 7845-7849.3. Mendelsohn C, Johnson B., Lionetti K.A., Nobis P., Wimmer E., Racaniello V.R. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1986. - V. 83. - P. 7845-7849.

4. Strauss M., Filman D.J., Belnap D.M., Cheng N., Noel R.T., Hogle J.M. Nectin-like interactions between poliovirus and its receptor trigger conformational changes associated with cell entry. // J Virol. - 2015. - V. 89. - P. 4143-4157.4. Strauss M., Filman D.J., Belnap D.M., Cheng N., Noel R.T., Hogle J.M. Nectin-like interactions between poliovirus and its receptor trigger conformational changes associated with cell entry. // J Virol. - 2015. - V. 89. - P. 4143-4157.

5. Bergelson J.M., Cunningham J.A., Droguett G., Kurt-Jones E.A., Krithivas A., Hong J.S., Horwitz M.S., Crowell R.L., Finberg R.W. Isolation of a common receptor for Coxsackie В viruses and adenoviruses 2 and 5.11 Science. - 1997. - V. 275. - P. 1320-1323.5. Bergelson J.M., Cunningham J.A., Droguett G., Kurt-Jones E.A., Krithivas A., Hong J.S., Horwitz M.S., Crowell R.L., Finberg R.W. Isolation of a common receptor for Coxsackie In viruses and adenoviruses 2 and 5.11 Science. - 1997. - V. 275. - P. 1320-1323.

6. Morton P.E., Hicks A., Nastos Т., Santis G., Parsons M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. // Scientific reports. - 2013. - V. 3. - P. 2889.6. Morton P.E., Hicks A., Nastos T., Santis G., Parsons M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. // Scientific reports. - 2013. - V. 3. - P. 2889.

7. Ward Т., Pipkin P.A., Clarkson N.A., Stone D.M., Minor P.D., Almond J.W. Decay-accelerating factor CD55 is identified as the receptor for echovirus 7 using CELICS, a rapid immuno-focal cloning method. // EMBO J. - 1994. - V. 13. - P. 5070-5074.7. Ward T., Pipkin P.A., Clarkson N.A., Stone D.M., Minor P.D., Almond J.W. Decay-accelerating factor CD55 is identified as the receptor for echovirus 7 using CELICS, a rapid immuno-focal cloning method. // EMBO J. - 1994. - V. 13. - P. 5070-5074.

8. Bergelson J.M., Mohanty J.G., Crowell R.L., St John N.F., Lublin D.M., Finberg R.W. Coxsackievirus B3 adapted to growth in RD cells binds to decay-accelerating factor (CD55). // J Virol. - 1995. - V. 69. - P. 1903-1906.8. Bergelson J.M., Mohanty J.G., Crowell R.L., St John N.F., Lublin D.M., Finberg R.W. Coxsackievirus B3 adapted to growth in RD cells binds to decay-accelerating factor (CD55). // J Virol. - 1995. - V. 69. - P. 1903-1906.

9. Clarkson N.A., Kaufman R., Lublin D.M., Ward Т., Pipkin P.A., Minor P.D., Evans D.J., Almond J.W. Characterization of the echovirus 7 receptor: domains of CD55 critical for virus binding. // J Virol. - 1995. - V. 69. - P. 5497-5501.9. Clarkson N.A., Kaufman R., Lublin D.M., Ward T., Pipkin P.A., Minor P.D., Evans D.J., Almond J.W. Characterization of the echovirus 7 receptor: domains of CD55 critical for virus binding. // J Virol. - 1995. - V. 69. - P. 5497-5501.

10. Shafren D.R., Bates R.C., Agrez M.V., Herd R.L., Burns G.F., Barry R.D. Coxsackieviruses Bl, B3, and B5 use decay accelerating factor as a receptor for cell attachment. // J Virol. - 1995. - V. 69. - P. 3873-3877.10. Shafren D.R., Bates R.C., Agrez M.V., Herd R.L., Burns G.F., Barry R.D. Coxsackieviruses Bl, B3, and B5 use decay accelerating factor as a receptor for cell attachment. // J Virol. - 1995. - V. 69. - P. 3873-3877.

11. Mikesch J.H., Buerger H., Simon R., Brandt B. Decay-accelerating factor (CD55): a versatile acting molecule in human malignancies. // Biochim Biophys Acta. - 2006. - V. 1766. - P. 42-52.11. Mikesch J.H., Buerger H., Simon R., Brandt B. Decay-accelerating factor (CD55): a versatile acting molecule in human malignancies. // Biochim Biophys Acta. - 2006. - V. 1766. - P. 42-52.

12. Mikesch J.H., Schier K., Roetger A., Simon R., Buerger H., Brandt B. The expression and action of decay-accelerating factor (CD55) in human malignancies and cancer therapy. // Cell Oncol. - 2006. - V. 28. - P. 223-232.12. Mikesch J.H., Schier K., Roetger A., Simon R., Buerger H., Brandt B. The expression and action of decay-accelerating factor (CD55) in human malignancies and cancer therapy. // Cell Oncol. - 2006. - V. 28. - P. 223-232.

13. Spendlove I., Ramage J.M., Bradley R., Harris C., Durrant L.G. Complement decay accelerating factor (DAF)/CD55 in cancer. // Cancer immunology, immunotherapy: CII. - 2006. - V. 55. - P. 987-995.13. Spendlove I., Ramage J.M., Bradley R., Harris C., Durrant L.G. Complement decay accelerating factor (DAF) / CD55 in cancer. // Cancer immunology, immunotherapy: CII. - 2006. - V. 55. - P. 987-995.

14. Vuorinen Т., Vainionpaa R., Heino J., Hyypia T. Enterovirus receptors and virus replication in human leukocytes. // J Gen Virol. - 1999. - V. 80 (Pt 4). - P. 921-927.14. Vuorinen T., Vainionpaa R., Heino J., Hyypia T. Enterovirus receptors and virus replication in human leukocytes. // J Gen Virol. - 1999. - V. 80 (Pt 4). - P. 921-927.

15. Triantafilou K., Triantafilou M. A biochemical approach reveals cell-surface molecules utilised by Picornaviridae: Human Parechovirus 1 and Echovirus 1. // Journal of cellular biochemistry. - 2001. - V. 80. - P. 373-381.15. Triantafilou K., Triantafilou M. A biochemical approach reveals cell-surface molecules utilized by Picornaviridae: Human Parechovirus 1 and Echovirus 1. // Journal of cellular biochemistry. - 2001. - V. 80. - P. 373-381.

16. Triantafilou M., Wilson K.M., Triantafilou K. Identification of Echovirus 1 and coxsackievirus A9 receptor molecules via a novel flow cytometric quantification method. // Cytometry. - 2001. - V. 43. - P. 279-289.16. Triantafilou M., Wilson K.M., Triantafilou K. Identification of Echovirus 1 and coxsackievirus A9 receptor molecules via a novel flow cytometric quantification method. // Cytometry. - 2001. - V. 43. - P. 279-289.

17. Marjomaki V., Pietiainen V., Matilainen H., Upla P., Ivaska J., Nissinen L., Reunanen H., Huttunen P., Hyypia Т., Heino J. Internalization of echovirus 1 in caveolae. // J Virol. - 2002. - V. 76. - P. 1856-1865.17. Marjomaki V., Pietiainen V., Matilainen H., Upla P., Ivaska J., Nissinen L., Reunanen H., Huttunen P., Hyypia T., Heino J. Internalization of echovirus 1 in caveolae. // J Virol. - 2002. - V. 76. - P. 1856-1865.

18. Pietiainen V., Marjomaki V., Upla P., Pelkmans L., Helenius A., Hyypia T. Echovirus 1 endocytosis into caveosomes requires lipid rafts, dynamin II, and signaling events. // Mol Biol Cell. - 2004. - V. 15. - P. 4911-4925.18. Pietiainen V., Marjomaki V., Upla P., Pelkmans L., Helenius A., Hyypia T. Echovirus 1 endocytosis into caveosomes requires lipid rafts, dynamin II, and signaling events. // Mol Biol Cell. - 2004. - V. 15. - P. 4911-4925.

19. Xing L., Huhtala M., Pietiainen V., Kapyla J., Vuorinen K., Marjomaki V., Heino J., Johnson M.S., Hyypia Т., Cheng R.H. Structural and functional analysis of integrin alpha2I domain interaction with echovirus 1. // J Biol Chem. - 2004. - V. 279. - P. 11632-11638.19. Xing L., Huhtala M., Pietiainen V., Kapyla J., Vuorinen K., Marjomaki V., Heino J., Johnson M.S., Hyypia T., Cheng R.H. Structural and functional analysis of integrin alpha2I domain interaction with echovirus 1. // J Biol Chem. - 2004. - V. 279. - P. 11632-11638.

20. Heikkila O., Susi P., Stanway G., Hyypia T. Integrin alphaVbeta6 is a high-affinity receptor for coxsackievirus A9. // J Gen Virol. - 2009. - V. 90. - P. 197-204.20. Heikkila O., Susi P., Stanway G., Hyypia T. Integrin alphaVbeta6 is a high-affinity receptor for coxsackievirus A9. // J Gen Virol. - 2009. - V. 90. - P. 197-204.

21. Jokinen J., White D.J., Salmela M., Huhtala M., Kapyla J., Sipila K., Puranen J.S., Nissinen L., Kankaanpaa P., Marjomaki V., Hyypia Т., Johnson M.S., Heino J. Molecular mechanism of alpha2betal integrin interaction with human echovirus 1. // EMBO J. - 2010. - V. 29. - P. 196-208.21. Jokinen J., White DJ, Salmela M., Huhtala M., Kapyla J., Sipila K., Puranen JS, Nissinen L., Kankaanpaa P., Marjomaki V., Hyypia T., Johnson MS, Heino J. Molecular mechanism of alpha2betal integrin interaction with human echovirus 1. // EMBO J. - 2010 .-- V. 29. - P. 196-208.

22. Merilahti P., Koskinen S., Heikkila O., Karelehto E., Susi P. Endocytosis of integrin-binding human picornaviruses. // Adv Virol. - 2012. - V. 2012. - P. 547530.22. Merilahti P., Koskinen S., Heikkila O., Karelehto E., Susi P. Endocytosis of integrin-binding human picornaviruses. // Adv Virol. - 2012. - V. 2012. - P. 547530.

23. Rintanen N., Karjalainen M., Alanko J., Paavolainen L., Maki A., Nissinen L., Lehkonen M., Kallio K., Cheng R.H., Upla P., Ivaska J., Marjomaki V. Calpains promote alpha2betal integrin turnover in nonrecycling integrin pathway. // Mol Biol Cell. - 2012. - V. 23. - P. 448-463.23. Rintanen N., Karjalainen M., Alanko J., Paavolainen L., Maki A., Nissinen L., Lehkonen M., Kallio K., Cheng RH, Upla P., Ivaska J., Marjomaki V. Calpains promote alpha2betal integrin turnover in nonrecycling integrin pathway. // Mol Biol Cell. - 2012. - V. 23. - P. 448-463.

24. Shakeel S., Seitsonen J.J., Kajander Т., Laurinmaki P., Hyypia Т., Susi P., Butcher S.J. Structural and functional analysis of coxsackievirus A9 integrin alphavbeta6 binding and uncoating. // J Virol. - 2013. - V. 87. - P. 3943-3951.24. Shakeel S., Seitsonen J.J., Kajander T., Laurinmaki P., Hyypia T., Susi P., Butcher S.J. Structural and functional analysis of coxsackievirus A9 integrin alphavbeta6 binding and uncoating. // J Virol. - 2013. - V. 87. - P. 3943-3951.

25. Siljamaki E., Rintanen N., Kirsi M., Upla P., Wang W., Karjalainen M., Ikonen E., Marjomaki V. Cholesterol dependence of collagen and echovirus 1 trafficking along the novel alpha2betal integrin internalization pathway. // PLoS One. - 2013. - V. 8. - P. e55465.25. Siljamaki E., Rintanen N., Kirsi M., Upla P., Wang W., Karjalainen M., Ikonen E., Marjomaki V. Cholesterol dependence of collagen and echovirus 1 trafficking along the novel alpha2betal integrin internalization pathway. // PLoS One. - 2013. - V. 8. - P. e55465.

26. Huttunen M., Waris M., Kajander R., Hyypia Т., Marjomaki V. Coxsackievirus A9 infects cells via nonacidic multivesicular bodies. // J Virol. - 2014. - V. 88. - P. 5138-5151.26. Huttunen M., Waris M., Kajander R., Hyypia T., Marjomaki V. Coxsackievirus A9 infects cells via nonacidic multivesicular bodies. // J Virol. - 2014. - V. 88. - P. 5138-5151.

27. Shafren D.R., Dorahy D.J., Ingham R.A., Burns G.F., Barry R.D. Coxsackievirus A21 binds to decay-accelerating factor but requires intercellular adhesion molecule 1 for cell entry. // Journal of Virology. - 1997. - V. 71. - P. 4736-4743.27. Shafren D.R., Dorahy D.J., Ingham R.A., Burns G.F., Barry R.D. Coxsackievirus A21 binds to decay-accelerating factor but requires intercellular adhesion molecule 1 for cell entry. // Journal of Virology. - 1997. - V. 71. - P. 4736-4743.

28. Lin H.Y., Yang Y.T., Yu S.L., Hsiao K.N., Liu C.C., Sia C., Chow Y.H. Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus 71 infection. // J Virol. - 2013. - V. 87. - P. 9064-9076.28. Lin H.Y., Yang Y.T., Yu S.L., Hsiao K.N., Liu C.C., Sia C., Chow Y.H. Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus 71 infection. // J Virol. - 2013. - V. 87. - P. 9064-9076.

29. Nishimura Y., Shimojima M., Tano Y., Miyamura Т., Wakita Т., Shimizu H. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. // Nat Med. - 2009. - V. 15. - P. 794-797.29. Nishimura Y., Shimojima M., Tano Y., Miyamura T., Wakita T., Shimizu H. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. // Nat Med. - 2009. - V. 15. - P. 794-797.

30. Mistry N., Inoue H., Jamshidi F., Storm R.J., Oberste M.S., Arnberg N. Coxsackievirus A24 variant uses sialic acid-containing O-linked glycoconjugates as cellular receptors on human ocular cells. // J Virol. - 2011. - V. 85. - P. 11283-11290.30. Mistry N., Inoue H., Jamshidi F., Storm R.J., Oberste M.S., Arnberg N. Coxsackievirus A24 variant uses sialic acid-containing O-linked glycoconjugates as cellular receptors on human ocular cells. // J Virol. - 2011. - V. 85. - P. 11283-11290.

31. Nilsson E.C., Jamshidi F., Johansson S.M., Oberste M.S., Arnberg N. Sialic acid is a cellular receptor for coxsackievirus A24 variant, an emerging virus with pandemic potential. // J Virol. - 2008. - V. 82. - P. 3061-3068.31. Nilsson E.C., Jamshidi F., Johansson S.M., Oberste M.S., Arnberg N. Sialic acid is a cellular receptor for coxsackievirus A24 variant, an emerging virus with pandemic potential. // J Virol. - 2008. - V. 82. - P. 3061-3068.

32. Dang M., Wang X., Wang Q., Wang Y., Lin J., Sun Y., Li X., Zhang L., Lou Z., Wang J., Rao Z. Molecular mechanism of SCARB2-mediated attachment and uncoating of EV71. // Protein Cell. - 2014. - V. 5. - P. 692-703.32. Dang M., Wang X., Wang Q., Wang Y., Lin J., Sun Y., Li X., Zhang L., Lou Z., Wang J., Rao Z. Molecular mechanism of SCARB2- mediated attachment and uncoating of EV71. // Protein Cell. - 2014. - V. 5. - P. 692-703.

33. Yamayoshi S., Iizuka S., Yamashita Т., Minagawa H., Mizuta K., Okamoto M., Nishimura H., Sanjoh K., Katsushima N., Itagaki Т., Nagai Y., Fujii K., Koike S. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. // J Virol. - 2012. - V. 86. - P. 5686-5696.33. Yamayoshi S., Iizuka S., Yamashita T., Minagawa H., Mizuta K., Okamoto M., Nishimura H., Sanjoh K., Katsushima N., Itagaki T., Nagai Y., Fujii K., Koike S. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. // J Virol. - 2012. - V. 86. - P. 5686-5696.

34. Heiber J.F., Barber G.N. Evaluation of innate immune signaling pathways in transformed cells. // Methods Mol Biol. - 2012. - V. 797. - P. 217-238.34. Heiber J.F., Barber G.N. Evaluation of innate immune signaling pathways in transformed cells. // Methods Mol Biol. - 2012. - V. 797. - P. 217-238.

35. Stojdl D.F., Lichty В., Knowles S., Marius R., Atkins H., Sonenberg N., Bell J.C. Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolytic virus. // Nat Med. - 2000. - V. 6. - P. 821-825.35. Stojdl D.F., Lichty B., Knowles S., Marius R., Atkins H., Sonenberg N., Bell J.C. Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolytic virus. // Nat Med. - 2000. - V. 6. - P. 821-825.

36. Singh, K., Poteryakhina, A., Zheltukhin, A., Bhatelia, K., Prajapati, P., Sripada, L., Tomar, D., Singh, R., Singh, A.K., Chumakov, P.M. and Singh, R., 2015. NLRX1 acts as tumor suppressor by regulating TNF-a induced apoptosis and metabolism in cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 1853(5), pp. 1073-1086.36. Singh, K., Poteryakhina, A., Zheltukhin, A., Bhatelia, K., Prajapati, P., Sripada, L., Tomar, D., Singh, R., Singh, A.K., Chumakov, P.M. and Singh, R., 2015. NLRX1 acts as tumor suppressor by regulating TNF-a induced apoptosis and metabolism in cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Molecular Cell Research, 1853 (5), pp. 1073-1086.

37. Ребриков Д.В. и др. ПЦР в реальном времени // М.: Бином. Лаборатория знаний. - 2009. - Т. 115.37. Rebrikov D.V. and other real-time PCR // M .: Binom. Knowledge laboratory. - 2009 .-- T. 115.

38. Oliveira D.C., Lencastre Н. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. // Antimicrob. Agents. Chemother. - 2002. - V. 46. P. 2155-2161.38. Oliveira D.C., Lencastre N. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. // Antimicrob. Agents. Chemother. - 2002. - V. 46. P. 2155-2161.

39. Sung R.Y., Chan P.K., Tsen Т., Li A.M., Lam W.Y., Yeung A.C., Nelson E.A. Identification of viral and atypical bacterial pathogens in children hospitalized with acute respiratory infections in Hong Kong by multiplex PCR assays. // J. Med. Virol. - 2009. - V. 81.- P. 153-159.39. Sung R.Y., Chan P.K., Tsen T., Li A.M., Lam W.Y., Yeung A.C., Nelson E.A. Identification of viral and atypical bacterial pathogens in children hospitalized with acute respiratory infections in Hong Kong by multiplex PCR assays. // J. Med. Virol. - 2009. - V. 81.- P. 153-159.

40. Suntoke T.R., Hardick A., Tobian A.A., Mpoza В., Laeyendecker O., Serwadda D., Opendi P., Gaydos C.A., Gray R.H., Wawer M.J., Quinn T.C., Reynolds S.J. Evaluation of multiplex real-time PCR for detection of Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum,herpes simplex virus type 1 and 2 in the diagnosis of genital ulcer disease in the Rakai District, Uganda. // Sex. Transm. Infect. - 2009. - V. 85. - P. 97-101.40. Suntoke T.R., Hardick A., Tobian A.A., Mpoza B., Laeyendecker O., Serwadda D., Opendi P., Gaydos C.A., Gray R.H., Wawer M.J., Quinn T.C., Reynolds S.J. Evaluation of multiplex real-time PCR for detection of Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, herpes simplex virus type 1 and 2 in the diagnosis of genital ulcer disease in the Rakai District, Uganda. // Sex. Transm. Infect. - 2009. - V. 85. - P. 97-101.

41. Tomaso H., Reisinger E.C., Al Dahouk S., Frangoulidis D., Rakin A., Landt O., Neubauer H. Rapid detection of Yersinia pestis with multiplex real-time PCR assays using fluorescent hybridisation probes. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2003. - V. 38. - P. 117-126.41. Tomaso H., Reisinger E.C., Al Dahouk S., Frangoulidis D., Rakin A., Landt O., Neubauer H. Rapid detection of Yersinia pestis with multiplex real-time PCR assays using fluorescent hybridization probes. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2003. - V. 38. - P. 117-126.

42. Chao D.Y., Davis B.S., Chang G.J. Development of multiplex real-time reverse transcriptase PCR assays for detecting eight medically important flaviviruses in mosquitoes. // J. Clin. Microbiol. - 2007. - V. 45. - P. 584-589.42. Chao D.Y., Davis B.S., Chang G.J. Development of multiplex real-time reverse transcriptase PCR assays for detecting eight medically important flaviviruses in mosquitoes. // J. Clin. Microbiol. - 2007. - V. 45. - P. 584-589.

43. Chong S., Luinstra K., Petrich A., Smieja M. Multiplex PCR tests sentinel the appearance of pandemic influenza viruses including H1N1 swine influenza. // J. Clin. Virol. - 2009. - V. 45.- P. 200-202.43. Chong S., Luinstra K., Petrich A., Smieja M. Multiplex PCR tests sentinel the appearance of pandemic influenza viruses including H1N1 swine influenza. // J. Clin. Virol. - 2009. - V. 45.- P. 200-202.

44. Wagner A., Blackstone N., Cartwright P., Dick M., Misof В., Snow P., Wagner G.P., Bartels J., Murtha M., Pendleton J. Surveys of gene families using polymerase chain reaction: PCR selection and PCR drift. // Syst. Biol. - 1994. - V. 43. - P. 250-261.44. Wagner A., Blackstone N., Cartwright P., Dick M., Misof B., Snow P., Wagner GP, Bartels J., Murtha M., Pendleton J. Surveys of gene families using polymerase chain reaction: PCR selection and PCR drift. // Syst. Biol. - 1994. - V. 43. - P. 250-261.

45. Dieffenbach C.W., Lowe T.M.J., Dveksler G.S. General conception for PCR primer design. // PCR Methods Appl. - 1993. - V. 3. - P. S30-S37.45. Dieffenbach C.W., Lowe T.M.J., Dveksler G.S. General conception for PCR primer design. // PCR Methods Appl. - 1993. - V. 3. - P. S30-S37.

46. Mutter G.L., Boynton K.A. PCR bias in amplification of androgen receptor alleles, a trinucleotide repeat marker used in clonality studies. // Nucleic. Acids. Res. - 1995. - V. 23. - P. 1411-141846. Mutter G.L., Boynton K.A. PCR bias in amplification of androgen receptor alleles, a trinucleotide repeat marker used in clonality studies. // Nucleic. Acids Res. - 1995. - V. 23. - P. 1411-1418

47. Suzuki M.T., Giovannoni S.J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR. // Appl. Environ. Microbiol. - 1996. - V. 62. - P. 625-630.47. Suzuki M.T., Giovannoni S.J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR. // Appl. Environ. Microbiol. - 1996. - V. 62. - P. 625-630.

48. Elnifro E.M., Ashshi A.M., Cooper R.J., Klapper P.E. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. //Clin. Microbiol. Rev. - 2000. - V. 13. - №4. - P. 559-570.48. Elnifro E.M., Ashshi A.M., Cooper R.J., Klapper P.E. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. // Clin. Microbiol. Rev. - 2000. - V. 13. - No. 4. - P. 559-570.

49. Markoulatos P., Siafakas N., Moncany M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. // J. Clin. Lab. Anal. - 2002. - V. 16. - P. 47-51.49. Markoulatos P., Siafakas N., Moncany M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. // J. Clin. Lab. Anal. - 2002. - V. 16. - P. 47-51.

Claims (4)

Экспресс-тест на основе ПЦР для прогнозирования чувствительности образца опухоли головного мозга конкретного пациента к онколитическим вирусам на основе анализа взаимосвязи уровней экспрессии генов PVR, CD55, CXADR, ICAM1, ITGAV, ITGB1, ITGA2, ITGB3, SELPLG, TMPRSS2, TMPRSS4, TMPRSS9, TMPRSS11D, EIF2AK2, IFIH1, MAVS, IRF-3, IRF-9, STAT1, STAT2, NLRX1, SCARB2, RARRES3 и восприимчивости злокачественных клеток к онколитическому действию вирусов, включающий в себя следующие элементы:Rapid PCR test to predict the sensitivity of a brain tumor of a particular patient to oncolytic viruses based on an analysis of the relationship between the expression levels of PVR, CD55, CXADR, ICAM1, ITGAV, ITGB1, ITGA2, ITGB3, SELPLG, TMPRSS2, TMPRSS4, TMPRSS9, TMPRSS11DD , EIF2AK2, IFIH1, MAVS, IRF-3, IRF-9, STAT1, STAT2, NLRX1, SCARB2, RARRES3 and the susceptibility of malignant cells to the oncolytic effect of viruses, which includes the following elements: а) смесь для амплификации, включающую в себя Taq-полимеразу, буфер для полимеразы, содержащий Mg2+ и смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов;a) an amplification mixture comprising Taq polymerase, a polymerase buffer containing Mg 2+ and a mixture of deoxyribonucleoside triphosphates; б) 96-луночный планшет с лиофилизированной смесью специфических для амплификации участков генных маркеров праймеров SEQ ID NO 1-46 и соответствующих олигонуклеотидных зондов SEQ ID NO 47-69;b) a 96-well plate with a lyophilized mixture of amplification-specific regions of gene markers of primers SEQ ID NOS 1-46 and corresponding oligonucleotide probes SEQ ID NOS 47-69; в) схему интерпретации результатов теста, построенную на основе таблицы 1.c) a scheme for interpreting test results based on table 1.
RU2016150452A 2016-12-21 2016-12-21 Express test on basis of pcr, which enables to predict sensitivity of brain tumor of specific patient to oncolytic viruses RU2697412C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016150452A RU2697412C2 (en) 2016-12-21 2016-12-21 Express test on basis of pcr, which enables to predict sensitivity of brain tumor of specific patient to oncolytic viruses

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016150452A RU2697412C2 (en) 2016-12-21 2016-12-21 Express test on basis of pcr, which enables to predict sensitivity of brain tumor of specific patient to oncolytic viruses

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2016150452A RU2016150452A (en) 2018-06-22
RU2016150452A3 RU2016150452A3 (en) 2018-12-11
RU2697412C2 true RU2697412C2 (en) 2019-08-14

Family

ID=62713247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016150452A RU2697412C2 (en) 2016-12-21 2016-12-21 Express test on basis of pcr, which enables to predict sensitivity of brain tumor of specific patient to oncolytic viruses

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2697412C2 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA001861B1 (en) * 1996-07-12 2001-10-22 Фёрст Опинион Корпорейшн Computerized medical diagnostic and treatment advice system including network access

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA001861B1 (en) * 1996-07-12 2001-10-22 Фёрст Опинион Корпорейшн Computerized medical diagnostic and treatment advice system including network access

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OTTOLINO-PERRY K. et al. Intelligent design: combination therapy with oncolytic viruses. Mol Ther. 2010 Feb; 18(2): 251-63. *
OTTOLINO-PERRY K. et al. Intelligent design: combination therapy with oncolytic viruses. Mol Ther. 2010 Feb; 18(2): 251-63. STOJDL D.F. et al. Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolyticvirus. Nat Med. 2000 Jul; 6(7): 821-5. *
STOJDL D.F. et al. Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolyticvirus. Nat Med. 2000 Jul; 6(7): 821-5. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016150452A3 (en) 2018-12-11
RU2016150452A (en) 2018-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Development of a real-time loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay and visual LAMP assay for detection of African swine fever virus (ASFV)
Leung et al. Longitudinal study of surrogate aging measures during human immunodeficiency virus seroconversion
WO2018035860A1 (en) Multiplex taqman probe qpcr assay kit and method for simultaneous assay and quantitative analysis of four blood-borne viruses
Lewandowska et al. Unbiased metagenomic sequencing complements specific routine diagnostic methods and increases chances to detect rare viral strains
KR102018201B1 (en) Method and kit for detecting batcoronavirus using real-time PCR
RU2731390C1 (en) Test system and method for detecting rna of coronavirus sars-cov-2, virus-agent of coronavirus disease 2019 covid-19, by polymerase chain reaction in real time (embodiments)
Dedkov et al. Retrospective diagnosis of two rabies cases in humans by high throughput sequencing
Viedma et al. Optimization of qRT-PCR assay for zika virus detection in human serum and urine
Yang et al. Development of a quadruple qRT-PCR assay for simultaneous identification of highly and low pathogenic H7N9 avian influenza viruses and characterization against oseltamivir resistance
Zheney et al. Real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification assay for direct detection of egg drop syndrome virus
Pripuzova et al. Development of real-time PCR array for simultaneous detection of eight human blood-borne viral pathogens
Khan et al. Use of whole blood and dried blood spot for detection of HIV-1 nucleic acids using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification
Galipienso et al. Cucumber vein yellowing virus isolate-specific expression of symptoms and viral RNA accumulation in susceptible and resistant cucumber cultivars
Elkhodiry et al. miR-155 and functional proteins of CD8+ T cells as potential prognostic biomarkers for relapsing-remitting multiple sclerosis
RU2697412C2 (en) Express test on basis of pcr, which enables to predict sensitivity of brain tumor of specific patient to oncolytic viruses
Haegeman et al. Characterisation of the discrepancy between PCR and virus isolation in relation to classical swine fever virus detection
Jasim et al. Correlation between both genetic polymorphism and serum level of toll-like receptor 4 with viral load and genotype of hepatitis C virus in Iraqi patients
Jia et al. Detection of a novel highly pathogenic H7 influenza virus by duplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction
RU2515911C1 (en) Set of oligodesoxyribonucleic primers and fluorescence-labelled probes for identification of rna and differentiation of human parainfluenza virus of 1, 2, 3 and 4 types
Park et al. One-step reverse transcription-polymerase chain reaction for Ebola and Marburg viruses
Azimi et al. Molecular detection and clinical characteristics of bacterial and viral main etiological agents causing respiratory tract infections in Tehran, Iran
Lee et al. M‐specific reverse transcription loop‐mediated isothermal amplification for detection of pandemic (H1N1) 2009 virus
CN104278106B (en) Duplex fluorescence quantitative RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) detection kit for duck tembusu virus and egg drop syndrome virus
Abed et al. Transmembrane Serine Protease-2 Gene Polymorphism and Expression in Iraqi COVID-19 Patients
Wu et al. Development of Taqman RT-nested PCR system for clinical SARS-CoV detection

Legal Events

Date Code Title Description
HC9A Changing information about inventors
QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200226

Effective date: 20200226