RU2670001C1

RU2670001C1 - Method for producing cell surface proteins

Info

Publication number: RU2670001C1
Application number: RU2017145454A
Authority: RU
Inventors: Николай Юрьевич Селиванов; Ольга Геннадьевна Селиванова; Анна Алексеевна Галицкая; Олег Игоревич Соколов
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2018-10-17

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method for producing surface proteins of gram-negative bacteria and plant cell culture. Method includes preliminary washing of TBS or PBS cells with buffer, treatment with 0.1–0.2 % solution of sodium deoxycholate for 5–10 minutes, filtering, precipitating the extracted surface proteins with a solution of trichloroacetic acid followed by precipitation, washing the precipitate with acetone, incubating 60–300 minutes at -18 °C, precipitation of surface proteins.

EFFECT: invention provides increased yield of the desired product.

5 cl, 4 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к биохимии растений и микроорганизмов и может быть использовано в технологии выделения (получения) и исследования белков, расположенных на поверхности клеток.The invention relates to the biochemistry of plants and microorganisms and can be used in the technology of isolation (production) and study of proteins located on the surface of cells.

Макромолекулы, локализованные частично или полностью на внешней стороне клеточной стенки, контактирующей с окружающей средой, выполняют разнообразные функции. В частности, они обеспечивают межклеточные взаимодействия между микроорганизмами, а также между бактериями и тканями высших организмов. От присутствия бактериальных поверхностно-ассоциированных белков, в частности, зависят гидрофобность клеточной поверхности, ее заряд и первичная адгезия бактерий. Когда бактерии прикрепляются к так называемой «кондиционной пленке», которая представляет собой слой адсорбированных на поверхности молекул, этот процесс определяется специфическими взаимодействиями компонентов микробной поверхности (адгезинов) с комплементарными им адгезивными молекулами матрикса. Белковые структуры на поверхности клеток обеспечивают транспорт веществ в клетку, выполняют рецепторную функцию, включая рецепторы для фагов и колицинов. У архебактерий и большинства эубактерий на поверхности клеток формируются так называемые S-слои (от surface -поверхность), представляющие собой регулярное псевдокристаллическое окружение клетки. Часто они представлены определенным образом ориентированными белками и гликопротеинами, причем специализация этих белков до конца не исследована. Предполагают, что они обеспечивают регуляцию процесса адгезии клеток к поверхностям, обеспечивают устойчивость клеток к протеолитическим ферментам, несут сайты адгезии для собственных ферментов, служат протективными антигенами, защищают клетки от фагоцитоза, а отдельные домены служат рецепторами или посредниками в связывании с лейкоцитами, что подтверждает их роль в патогенезе заболеваний.Macromolecules localized partially or completely on the outer side of the cell wall in contact with the environment perform various functions. In particular, they provide intercellular interactions between microorganisms, as well as between bacteria and tissues of higher organisms. The hydrophobicity of the cell surface, its charge and the primary adhesion of bacteria depend on the presence of bacterial surface-associated proteins, in particular. When bacteria attach to the so-called “conditional film”, which is a layer of molecules adsorbed on the surface, this process is determined by the specific interactions of the components of the microbial surface (adhesins) with the adhesive matrix molecules complementary to them. Protein structures on the surface of cells provide the transport of substances into the cell and perform a receptor function, including receptors for phages and colicins. In archaebacteria and most eubacteria, so-called S-layers (from the surface-surface) are formed on the cell surface, which are a regular pseudocrystalline environment of the cell. Often they are represented in a certain way by oriented proteins and glycoproteins, and the specialization of these proteins is not fully understood. They suggest that they regulate the process of cell adhesion to surfaces, ensure cell resistance to proteolytic enzymes, carry adhesion sites for their own enzymes, serve as protective antigens, protect cells from phagocytosis, and individual domains serve as receptors or mediators in binding to leukocytes, which confirms them role in the pathogenesis of diseases.

В связи с этим исследование белков поверхности клеток представляет актуальную на сегодняшний день проблему протеомики и биохимии в целом. Следует отметить, что при исследовании протеома особые требования предъявляются к такому этапу пробоподготовки, как количественная экстракция белков. В идеальном варианте должно быть обеспечено максимальное извлечение всех белков, расположенных на поверхности клетки, поскольку оптимальная пробоподготовка позволит не только получить наиболее полное представление о качественном составе протеома поверхности, но и оценить количественные изменения содержания белков.In this regard, the study of surface proteins of the cells is a current problem of proteomics and biochemistry in general. It should be noted that in the study of the proteome, special requirements are imposed on such a stage of sample preparation as quantitative extraction of proteins. Ideally, the maximum extraction of all proteins located on the cell surface should be ensured, since optimal sample preparation will not only provide the most complete picture of the qualitative composition of the surface proteome, but also evaluate the quantitative changes in the protein content.

Белки клеточной стенки (БКС) растений в значительной степени отличаются по степени взаимодействия с поверхностью клетки. Лежащие на поверхности и практически несвязанные (слабосвязанные) белки легко переходят в экстраклеточный раствор, они выявляются в жидких питательных средах при культивировании клеточных суспензий или растительных проростков. Для их обозначения часто используют термин «лабильные белки». Большинство из них являются кислыми белками с pi от 2 до 6. Их легко экстрагировать буферами с низкой ионной силой или такими недеструктивными методами, как вакуумная фильтрация (Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics / G. Boudart [et al.] // Proteomics. 2005. V.5. P. 212-221.). Другая часть БКС может быть прикреплена к матриксу слабыми взаимодействиями, например Ван-дер-Ваальсовыми, водородными, гидрофобными или ионными силами. Такие белки, как правило, имеют основные величины pI от 8 до 11, они экстрагируются солевыми растворами или хелатирующими агентами. Наконец, часть БКС прочно связана с компонентами клеточной стенки, например, ковалентными связями, как экстенсины или гидроксипролин-богатые белки. На данный момент не разработано единого подхода к экстракции таких белков. Например, сравнение нескольких методов экстракции поверхностных белков из корней проростков ячменя показало, что использование таких экстрагентов, как 2%-ный раствор SDS в сочетании с Nonidet Р40, мочевина и Nonidet Р40, а также 4%-ный раствор SDS с последующей преципитацией ацетоном не позволяют получить максимального извлечения всех фракций и их качественного разделения при проведении двумерного электрофореза. Наилучший результат (70 - 80%) был получен после проведения фенольной экстракции с последующей преципитацией белков 5 объемами 0,1М раствора ацетата аммония в метаноле (Hurkman W.J., Tanaka С.К. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis / W.J. Hurkman, C.K. Tanaka // Plant Physiol. 1986. V. 81. P. 802-806.).Proteins of the cell wall (BCS) of plants significantly differ in the degree of interaction with the cell surface. Lying on the surface and practically unbound (weakly bound) proteins easily pass into the extracellular solution; they are detected in liquid nutrient media during the cultivation of cell suspensions or plant seedlings. The term “labile proteins” is often used to denote them. Most of them are acidic proteins with pi from 2 to 6. They are easy to extract with low ionic strength buffers or non-destructive methods such as vacuum filtration (Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics / G. Boudart [et al.] // Proteomics. 2005. V. 5. P. 212-221.). The other part of the BCS can be attached to the matrix by weak interactions, for example, van der Waals, hydrogen, hydrophobic, or ionic forces. Such proteins, as a rule, have basic pI values from 8 to 11; they are extracted with saline solutions or chelating agents. Finally, part of BCS is firmly bound to the components of the cell wall, for example, covalent bonds, such as extensins or hydroxyproline-rich proteins. At present, a unified approach to the extraction of such proteins has not been developed. For example, a comparison of several methods for extracting surface proteins from the roots of barley seedlings showed that the use of extractants such as 2% SDS solution in combination with Nonidet P40, urea and Nonidet P40, as well as 4% SDS solution followed by precipitation with acetone did not allow to obtain maximum extraction of all fractions and their qualitative separation during two-dimensional electrophoresis. The best result (70 - 80%) was obtained after phenol extraction followed by precipitation of proteins with 5 volumes of 0.1 M solution of ammonium acetate in methanol (Hurkman WJ, Tanaka S.K. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis / WJ Hurkman, CK Tanaka // Plant Physiol. 1986. V. 81. P. 802-806.).

Исследование белков, экспонированных на поверхности клетки, имеет большое практическое значение, поскольку они зачастую являются мишенью для лекарственных средств. Кроме того, показано, что они обладают высоким вакцинным потенциалом и могут быть использованы в диагностических целях.The study of proteins exposed on the surface of the cell is of great practical importance, since they are often a target for drugs. In addition, it was shown that they have a high vaccine potential and can be used for diagnostic purposes.

Поскольку вакцинация является одним из самых эффективных и действенных способов борьбы с заболеваниями, актуальным остается вопрос получения и/или разработки новых вакцин. Как правило, это напрямую связано с выделением, очисткой и идентификацией поверхностных антигенов возбудителей болезней.Since vaccination is one of the most effective and efficient ways to combat diseases, the issue of obtaining and / or developing new vaccines remains relevant. As a rule, this is directly related to the isolation, purification and identification of surface antigens of pathogens.

Известен способ получения поверхностного оболочечного белка вируса гепатита С (Выделенный оболочечный белок HCV, способ его получения и лекарство, вакцина, фармацевтическая композиция (варианты), его содержащие / Депла Э. [и др.]. / Патент RU 2274643 С2 от 24.04.2002.). По описанному способу выделенный оболочечный белок HCV или его часть является продуктом экспрессии в эукариотических (дрожжевых) клетках. Для этого в многостадийной процедуре конструировали челночный вектор, содержащий открытую рамку считывания, которая кодирует оболочечный белок HCV или его часть.A known method for producing a surface envelope protein of hepatitis C virus (Isolated HCV envelope protein, a method for its preparation and a medicine, a vaccine, a pharmaceutical composition (options) containing it / Depla E. [et al.]. / Patent RU 2274643 C2 of 04.24.2002 .). According to the described method, the isolated HCV envelope protein or part thereof is an expression product in eukaryotic (yeast) cells. For this, in a multi-step procedure, a shuttle vector was constructed containing an open reading frame that encodes an HCV envelope protein or part thereof.

Экспрессию специфических белков анализировали с помощью комбинации электрофореза в Na-ДДС ПААГ и вестерн-блоттинга. Выделение белков включает в себя лизис дрожжевых клеток агентом, вызывающим диссоциацию комплексов, химическую модификацию цистеиновых тиольных групп (обратимую и необратимую) и последующую аффинную хроматографию с использованием гепарина. Примерами «агентов, вызывающих диссоциацию комплексов» являются гуанидин хлорид и мочевина. Клеточные осадки ресуспензировали в 30 мМ фосфата, 6 М GuHCl, рН 7,2 (9 мл буфера/г клеток). Белок сульфонировали в течение ночи при комнатной температуре (КТ) в присутствии 320 мМ (4% масс/об.) сульфита натрия и 65 мМ (2% масс/об.) тетратионата натрия. Осветляли лизат после цикла замораживания-оттаивания центрифугированием (10000 g, 30 мин, 4°С). Добавляли Empigen ВВ (Albright & Wilson) и имидазол до конечной концентрации 1% (масс/об.) и 20 мМ, соответственно. Поскольку HCV E2s (аминокислоты 383-673) экспрессировался как белок с гистидиновой меткой, его быструю и эффективную очистку осуществляли аффинной хроматографией на установке Akta FPLC (быстрая жидкостная хроматография белков) (Pharmacia). Образец фильтровали через мембрану (ацетат целлюлозы) с порами размером 0,22 мкм и наносили на Ni-IDA-колонку (хелатирующая Sepharose FF, нагруженная Ni²⁺, Pharmacia), которую уравновешивали 50 мМ фосфата, 6М GuHCl, 1% Empigen ВВ, рН 7,2 (буфер А), обогащенным 20 мМ имидазола. Колонку промывали последовательно буфером А, содержащим 20 мМ и 50 мМ имидазола, соответственно, до тех пор, пока поглощение при 280 нм не достигало базового уровня. Элюировали продукты с гистидиновой меткой нанесением буфера D, 50 мМ фосфата, 6 М GuHCl, 0,2% Empigen ВВ (рН 7,2), 200 мМ имидазола. Очищенный материал анализировали Na-ДДС-ПААГ-электрофорезоми и вестерн-блоттингом с использованием специфического моноклонального антитела против Е2 (IGH212).The expression of specific proteins was analyzed using a combination of electrophoresis in Na-DDS-PAAG and Western blotting. Protein isolation involves lysis of yeast cells with an agent that causes dissociation of the complexes, chemical modification of cysteine thiol groups (reversible and irreversible), and subsequent affinity chromatography using heparin. Examples of “agents causing dissociation of complexes” are guanidine chloride and urea. Cell pellets were resuspended in 30 mM phosphate, 6 M GuHCl, pH 7.2 (9 ml buffer / g cells). The protein was sulfonated overnight at room temperature (CT) in the presence of 320 mM (4% w / v) sodium sulfite and 65 mM (2% w / v) sodium tetrathionate. The lysate was clarified after a freeze-thaw cycle by centrifugation (10,000 g, 30 min, 4 ° C). Empigen BB (Albright & Wilson) and imidazole were added to a final concentration of 1% (w / v) and 20 mM, respectively. Since HCV E2s (amino acids 383-673) was expressed as a histidine tagged protein, its rapid and efficient purification was performed by affinity chromatography on an Akta FPLC (fast liquid protein chromatography) (Pharmacia). The sample was filtered through a 0.22 μm membrane (cellulose acetate) and loaded onto a Ni-IDA column (Chephating Sepharose FF, loaded with Ni ²⁺ , Pharmacia), which was equilibrated with 50 mM phosphate, 6M GuHCl, 1% Empigen BB, pH 7.2 (buffer A) enriched with 20 mM imidazole. The column was washed sequentially with buffer A containing 20 mM and 50 mM imidazole, respectively, until absorbance at 280 nm reached a baseline. Histidine-labeled products were eluted by applying buffer D, 50 mM phosphate, 6 M GuHCl, 0.2% Empigen BB (pH 7.2), 200 mM imidazole. The purified material was analyzed by Na-DDS-PAGE-electrophoresis and Western blotting using specific anti-E2 monoclonal antibody (IGH212).

Описанный выше способ позволяет получить очищенный препарат белка, однако он осложняется необходимостью использования специализированного оборудования. Следует также отметить, что агенты, используемые для диссоциации комплексов, представляют собой хаотропы, которые в концентрированных растворах могут денатурировать белки. Кроме того, предполагаемая на этом этапе химическая модификация тиольных групп цистеина также может быть необратимой, что приведет к потере нативных свойств белка.The method described above allows to obtain a purified protein preparation, however, it is complicated by the need to use specialized equipment. It should also be noted that the agents used to dissociate the complexes are chaotropes that can denature proteins in concentrated solutions. In addition, the chemical modification of cysteine thiol groups proposed at this stage may also be irreversible, which will lead to the loss of the native properties of the protein.

Описан способ получения вакцины на основе поверхностного антигена вируса гриппа (Influenza vaccine / G.J.M. Van Scharrenburg, R. Brands / U.S. patent 5,948,410; Date of Patent: Sep. 7, 1999.). Согласно предложенному методу для культивирования вируса гриппа используют культуру клеток животных (фибробласты эмбрионов цыпленка (CEF), клетки Мадин - Дарби почек собаки (MDCK), клетки яичников китайского хомячка (СНО) и клетки Веро). Непосредственно в ферментере проводят обработку ферментам, расщепляющими ДНК (ДНКазами и нуклеазами). Затем проводят обработку катионными детергентами из группы солей цетилтриметиламмония, такими как цетилтриметиламмония бромид (С.Т.А.В., ЦТАБ), солей миристилтриметиламмония. Кроме того могут быть использования липофектин, липофектамин и DOTMA. Кроме того может быть использован неионный детергент Tween. Выделение поверхностных катионных белков после стадии обработки детергентами может включать в себя две стадии: во-первых, отделение РНП-частицы (тела вируса) от поверхностных антигенных белков, например, центрифугированием или ультрафильтрацией, и, во-вторых, удаление детергента из поверхностных антигенных белков, например, с использованием смол (таких как Amberlite XAD-4) и/или ультра(диа)фильтрацией. При выделении вируса жидкость фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,5 мкм для удаления дебриса, затем проводят концентрирование и очищают ультрафильтрацией с применением мембраны, отсекающей молекулярные массы 300000. Затем к концентрату добавляют сахарозу до конечной концентрации 30% (м/об), формальдегид до конечной концентрации 0,015% (м/об) и перемешивают при 2-8°С в течение 72 ч. Затем вирусный концентрат разбавляют в 5 раз забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) и наносят на аффинную колонку, содержащую Amicon Cellufine Sulphate. Колонку промывают ЗФР, вирус элюируют раствором 1,5 М хлорида натрия в ЗФР. Элюат концентрируют и обессоливают ультрафильтрацией с использованием мембраны с отсечением молекулярной массы 300000. Для выделения поверхностных белковых антигенов добавляют неионный детергент Твин-80 до конечной концентрации 300 мкг/мл и бромид цетилметиламмония до конечной концентрации 750 мкг/мл. Эту смесь перемешивают при 4°С в течение 3 ч, после чего РНП-частицы отделяют от поверхностных антигенных белков центрифугированием. Супернатант перемешивают с Amberlite XAD-4 в течение ночи при 2-8°С для удаления детергентов. Амберлит удаляют фильтрованием и затем фильтрат подвергают стерильному фильтрованию через фильтр 0,22 мкм.A method for producing a vaccine based on the surface antigen of an influenza virus is described (Influenza vaccine / G.J. M. Van Scharrenburg, R. Brands / U.S. patent 5,948,410; Date of Patent: Sep. 7, 1999.). According to the proposed method, an animal cell culture (chicken embryo fibroblasts (CEF), Madin-Darby dog kidney cells (MDCK), Chinese hamster ovary cells (CHO), and Vero cells) is used to cultivate the influenza virus. Directly in the fermenter, processing is carried out for enzymes that cleave DNA (DNases and nucleases). Then, cationic detergents from the group of cetyltrimethylammonium salts, such as cetyltrimethylammonium bromide (C.T.A.V., CTAB), and myristyltrimethylammonium salts are treated. In addition, lipofectin, lipofectamine, and DOTMA may be used. In addition, Tween non-ionic detergent can be used. The isolation of surface cationic proteins after the detergent treatment step may include two stages: firstly, separation of the RNP particle (virus body) from surface antigenic proteins, for example, by centrifugation or ultrafiltration, and secondly, removal of detergent from surface antigenic proteins for example using resins (such as Amberlite XAD-4) and / or ultra (dia) filtration. When virus is isolated, the liquid is filtered through a filter with a pore diameter of 0.5 μm to remove debris, then concentration is carried out and purified by ultrafiltration using a membrane that cuts off the molecular weights of 300,000. Then, sucrose is added to the concentrate to a final concentration of 30% (m / v), formaldehyde to a final concentration of 0.015% (m / v) and stirred at 2-8 ° C for 72 hours. Then the viral concentrate is diluted 5 times with phosphate buffered saline (PBS) and applied to an affinity column containing Amicon Cellufine Sulphate. The column is washed with PBS, the virus is eluted with a solution of 1.5 M sodium chloride in PBS. The eluate is concentrated and desalted by ultrafiltration using a 300,000 molecular weight cut-off membrane. To isolate surface protein antigens, Tween-80 non-ionic detergent is added to a final concentration of 300 μg / ml and cetyl methyl ammonium bromide to a final concentration of 750 μg / ml. This mixture was stirred at 4 ° C for 3 hours, after which the RNP particles were separated from surface antigenic proteins by centrifugation. The supernatant is mixed with Amberlite XAD-4 overnight at 2-8 ° C to remove detergents. Amberlite is removed by filtration and then the filtrate is sterile filtered through a 0.22 μm filter.

Особенностью данного способа является использование для получения поверхностных белковых антигенов вирусных частиц, которые характеризуются своеобразным строением, не схожим со строением бактериальных клеток. В этом случае задача сводится к диссоциации комплекса РНП и белкового капсида. В то же время клетки бактерий отличаются более сложной организацией и белки в них соединены с компонентами клеточной стенки с помощью взаимодействий различного типа.A feature of this method is the use of viral particles to obtain surface protein antigens, which are characterized by a peculiar structure that is not similar to the structure of bacterial cells. In this case, the task is reduced to the dissociation of the complex of RNP and protein capsid. At the same time, bacterial cells have a more complex organization and the proteins in them are connected to the components of the cell wall using various types of interactions.

Описан способ получения поверхностного антигена вируса гепатита В (Лебедин Ю.С., Тимофеева Т.В., Сучков А.В. Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита в из рекомбинантных клеток дрожжей Hansenula polymorpha и вакцина для иммунизации против гепатита В / Патент RU 2205023 от 01.10.2010.). Источником получения в данном случае служат рекомбинантные клетки дрожжей Hansenula polymorpha (штамм DL-U/pH-HBs), которые способны экспрессировать поверхностный антиген вируса гепатита В (HBs-антиген). Способ включает этап разрушения дрожжевых клеток. Для этого 20 г полученной в стадии 1 дрожжевой клеточной массы смешивают с 250 мл буфера для разрушения (0,1 М натрия фосфат, рН 7,4; 4 М мочевина; 0,2 М хлорид натрия; 20 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота). Смесь охлаждают до температуры +2°С на ледяной бане и подают при постоянном перемешивании со скоростью 10-15 мл/мин в гомогенизатор APV Gaulin. Камеру гомогенизатора постоянно охлаждают подачей водно-метанольной смеси с температурой - 10°С. Затем осуществляется экстракция и солюбилизация HBs антигена. На этом этапе клеточный гомогенат промывают дистиллированной водой с помощью двукратного центрифугирования. К полученному промытому осадку добавляют 0,2% (вес/объем) дезоксихолата натрия; смесь перемешивают на льду в течение 1 часа. Затем смесь центрифугируют 45 минут при 10000 g и температуре 4°С для удаления клеточных остатков. Затем для очистки целевого продукта проводят гидрофобную хроматографию в буфере, содержащем 8-14% этанола, отмывку проводят тем же буфером при температуре 30°С, элюцию проводят тем же буфером при температуре 40-42°С. Элюат подвергают ультрацентрифугированию в градиенте плотности бромида калия, после чего проводят гель-фильтрацию на кополимерном носителе. Следует отметить, что в данном способе при проведении этапа разрушения дрожжевых клеток авторы получают смесь белков, в состав которой входят не только поверхностные белки, но также и цитоплазматические и мембранные белки.A method for producing hepatitis B virus surface antigen is described (Lebedin Yu.S., Timofeeva T.V., Suchkov A.V. Method for producing hepatitis B virus surface antigen from recombinant Hansenula polymorpha yeast cells and a vaccine for immunization against hepatitis B / Patent RU 2205023 from 10/01/2010.). The source of production in this case is recombinant Hansenula polymorpha yeast cells (strain DL-U / pH-HBs), which are capable of expressing hepatitis B virus surface antigen (HBs antigen). The method includes the step of destroying the yeast cells. For this, 20 g of the yeast cell mass obtained in stage 1 is mixed with 250 ml of destruction buffer (0.1 M sodium phosphate, pH 7.4; 4 M urea; 0.2 M sodium chloride; 20 mm ethylenediaminetetraacetic acid). The mixture is cooled to a temperature of + 2 ° C in an ice bath and fed with constant stirring at a speed of 10-15 ml / min to the APV Gaulin homogenizer. The homogenizer chamber is constantly cooled by feeding a water-methanol mixture with a temperature of -10 ° C. Then, the extraction and solubilization of HBs antigen is carried out. At this stage, the cell homogenate is washed with distilled water by double centrifugation. 0.2% (w / v) sodium deoxycholate is added to the washed precipitate obtained; the mixture was stirred on ice for 1 hour. The mixture is then centrifuged for 45 minutes at 10,000 g and a temperature of 4 ° C to remove cell debris. Then, to purify the target product, hydrophobic chromatography is carried out in a buffer containing 8-14% ethanol, washing is carried out with the same buffer at a temperature of 30 ° C, elution is carried out with the same buffer at a temperature of 40-42 ° C. The eluate is subjected to ultracentrifugation in a density gradient of potassium bromide, followed by gel filtration on a copolymer carrier. It should be noted that in this method, during the stage of destruction of yeast cells, the authors obtain a mixture of proteins, which includes not only surface proteins, but also cytoplasmic and membrane proteins.

Известен способ получения белков клеточной поверхности золотистого стафилококка, обладающих способностью связывать фибронектин и фибриноген (Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability / M. Hook, K.M. Lindberg, T.M. Wadstriim / U.S. patent 5,980,908; Date of Patent: Nov. 9, 1999.). Штамм Staphylococcus aureus, обладающий необходимыми свойствами, культивировали на жидкой питательной среде TS-broth в присутствии триптиказо-соевого экстракта (Oxoid, Ltd., England). После окончания роста бактерии выделяли центрифугированием и отмывали физиологическим раствором (0,9% NaCl). Затем бактерии разрушали добавлением бактериолитического фермента LysostaphinR (Sigma) в количестве 5 мг/л культуральной среды. Из полученной смеси выделяли белки, обладающие способностью связывать, к примеру, фибронектин, при помощи аффинной хроматографии на декстрановых гелях (бромцианактивированной сефарозе CL-4B) с иммобилизованным лигандом. Элюцию осуществляли с использованием хаотропных агентов, таких как NaSCN, KSCN и/или используя кислые растворы, например, раствор уксусной кислоты с рН<3.A known method for producing staphylococcus aureus cell surface proteins with the ability to bind fibronectin and fibrinogen (Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability / M. Hook, KM Lindberg, TM Wadstriim / US patent 5,980,908; Date of Patent: Nov. 9, 1999.). The Staphylococcus aureus strain, possessing the necessary properties, was cultured on TS-broth liquid nutrient medium in the presence of trypticase-soy extract (Oxoid, Ltd., England). After growth, the bacteria were isolated by centrifugation and washed with physiological saline (0.9% NaCl). Then the bacteria were destroyed by the addition of the bacteriolytic enzyme LysostaphinR (Sigma) in an amount of 5 mg / l of culture medium. Proteins possessing the ability to bind, for example, fibronectin, were isolated using affinity chromatography on dextran gels (CL-4B bromine-activated sepharose) with an immobilized ligand. Elution was carried out using chaotropic agents such as NaSCN, KSCN and / or using acidic solutions, for example, an acetic acid solution with pH <3.

Недостатком данного способа является использование фермента лизостафина, который является глицил-глициновой эндопептидазой. Поскольку именно для стафилококков характерно высокое содержание пентаглициновых мостиков, данный фермент проявляет специфичность по отношению к представителям этого семейства. В связи с этим его применение для воздействия на клеточную стенку других микроорганизмов будет менее эффективным. Кроме того следует отметить, что по данным производителя, этот фермент обладает также гексозаминидазной активностью. Это может приводить к более глубокому и непредсказуемому разрушению клеточной стенки, сопровождающемуся выходом не только поверхностных белков.The disadvantage of this method is the use of the enzyme lysostaphin, which is glycyl-glycine endopeptidase. Since staphylococci are characterized by a high content of pentaglycine bridges, this enzyme is specific for members of this family. In this regard, its use to affect the cell wall of other microorganisms will be less effective. In addition, it should be noted that according to the manufacturer, this enzyme also has hexosaminidase activity. This can lead to deeper and more unpredictable destruction of the cell wall, accompanied by the release of not only surface proteins.

V.J. Benedi и L. Martinez-Martinez предложен способ выделения белков поверхностной мембраны штаммов Klebsiella pneumoniae (Benedi V.J., Martinez-Martinez L. Outer Membrane Profiles of Clonally Related Klebsiella pneumoniae I V.J. Benedi, L. Martinez-Martinez//Methods in Molecular Medicine, vol. 48: Antibiotic Resistance Methods and Protocols. Edited by: S. H. Gillespie Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2001. P. 189-197.). Ночную культуру бактерий, выращенных на питательной среде, стимулирующей сверхэкспрессию некоторых белков поверхностной мембраны, подвергали центрифугированию при 10000g в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в 20 мл холодного Трис - Mg-буфера и повторно центрифугировали при тех же условиях. Эту манипуляцию повторяли, после чего клеточный осадок вновь ресуспендировали в 20 мл охлажденного Трис - Mg-буфера. Разрушение клеток проводили с помощью пресса Френча при 4°С. В качестве альтернативы можно использовать обработку ультразвуком (15 циклов по 30 с каждый; каждый цикл включал шестикратную обработку ультразвуком с амплитудой 18-20 мкм по 5 с с перерывом в 1 с; перерывы между циклами составляли 30 с). Для удаления неразрушенных клеток проводили центрифугирование при 3000g в течение 10 мин. Супернатант аккуратно переносили в чистые центрифужные пробирки и отделяли ультрацентрифугированием при 100 000g в течение 1 ч с охлаждением до 4°С. Полученные осадки ресуспендировали в 10 мл 2%-ного раствора лаурилсаркозината натрия (sodium lauryl sarcosinate) в Трис - Mg-буфере и инкубировали при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Затем наружные мембраны осаждали в течение 1 ч при 70000g. Супернатант, содержащий цитоплазматические мембраны, отбрасывали, а осадок перерастворяли в буфере того же состава и повторно центрифугировали. После завершения надосадочную жидкость окончательно удаляли и осадок ресуспендировали в 0,1-0,2 мл дистиллированной воды.V.J. Benedi and L. Martinez-Martinez proposed a method for isolating surface membrane proteins of Klebsiella pneumoniae strains (Benedi VJ, Martinez-Martinez L. Outer Membrane Profiles of Clonally Related Klebsiella pneumoniae I VJ Benedi, L. Martinez-Martinez // Methods in Molecular Medicine, vol 48: Antibiotic Resistance Methods and Protocols Edited by: SH Gillespie Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2001. P. 189-197.). An overnight culture of bacteria grown on a growth medium that stimulates overexpression of certain surface membrane proteins was centrifuged at 10,000 g for 20 minutes. The pellet was resuspended in 20 ml of cold Tris - Mg buffer and re-centrifuged under the same conditions. This manipulation was repeated, after which the cell pellet was resuspended in 20 ml of chilled Tris - Mg buffer. Cell destruction was carried out using a French press at 4 ° C. Alternatively, you can use ultrasound treatment (15 cycles of 30 s each; each cycle included six-time sonication with an amplitude of 18-20 μm for 5 s with an interval of 1 s; breaks between cycles were 30 s). Centrifugation was carried out at 3000 g for 10 min to remove undamaged cells. The supernatant was carefully transferred to clean centrifuge tubes and separated by ultracentrifugation at 100,000g for 1 h with cooling to 4 ° C. The precipitates obtained were resuspended in 10 ml of a 2% solution of sodium lauryl sarcosinate (sodium lauryl sarcosinate) in Tris-Mg buffer and incubated at room temperature for 20-30 minutes. Then the outer membranes were besieged for 1 h at 70,000 g. The supernatant containing cytoplasmic membranes was discarded, and the pellet was redissolved in a buffer of the same composition and centrifuged again. After completion, the supernatant was finally removed and the precipitate was resuspended in 0.1-0.2 ml of distilled water.

Однако, как отмечают сами авторы, согласно этому способу происходит выделение не только белков наружной мембраны, но также и поринов, которые, строго говоря, являются уже белками, интегрированными в цитоплазматическую мембрану. При этом отделить порины удается, только используя модификации электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS.However, as the authors themselves note, according to this method, not only proteins of the outer membrane are released, but also porins, which, strictly speaking, are already proteins integrated into the cytoplasmic membrane. In this case, it is possible to separate porins only using modifications of polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS.

Следует отметить, что использование всех описанных способов разработано для осаждения белков из растворов, а не с поверхности клеток. Кроме того они не позволяют количественно преципитировать белки и имеют значительные ограничения по применению в разбавленных растворах.It should be noted that the use of all the methods described is designed to precipitate proteins from solutions, and not from the cell surface. In addition, they do not allow quantitative precipitation of proteins and have significant limitations on the use in dilute solutions.

Задачей данного изобретения является получение способа, позволяющего обеспечить наиболее полное и количественное выделения белков поверхности целых клеток путем их смыва, минуя этап получения отдельных мембранных фракций и/или солюбилизации мембран.The objective of this invention is to provide a method that allows for the most complete and quantitative selection of surface proteins of whole cells by washing them off, bypassing the step of obtaining individual membrane fractions and / or solubilizing the membranes.

Технический результат заключается в повышении процента выхода белков клеточной поверхности, сохраняющих свою структуру, при упрощении технологии их получения.The technical result consists in increasing the percentage of yield of cell surface proteins that retain their structure, while simplifying the technology for their preparation.

Поставленная задача решается тем, что способ получения поверхностных белков клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений, включает в себя:The problem is solved in that the method of obtaining surface proteins of cells of gram-negative bacteria and plant cell culture, includes:

- предварительную промывку клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений TBS или PBS буфером,- pre-washing cells of gram-negative bacteria and plant cell culture with TBS or PBS buffer,

- обработку грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений 0,1-0,2%-ным раствором дезоксихолата натрия в течение 5-10 минут,- processing gram-negative bacteria and plant cell culture with 0.1-0.2% sodium deoxycholate solution for 5-10 minutes,

- фильтрацию экстрагированных поверхностных белков,- filtering the extracted surface proteins,

- преципитацию экстрагированных поверхностных белков раствором трихлоруксусной кислоты,- precipitation of the extracted surface proteins with a solution of trichloroacetic acid,

- осаждение преципитата центрифугированием,precipitation of precipitate by centrifugation,

- промывку преципитата ацетоном, инкубирование 60-300 мин при -18°С- washing the precipitate with acetone, incubation for 60-300 min at -18 ° C

- осаждение поверхностных белков.- deposition of surface proteins.

Предварительная промывка клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений может быть осуществлена TBS Tris-HCL 10-20 mM рН 7,2, либо PBS 10-20 mМ рН 7,2.Pre-washing of gram-negative bacteria cells and plant cell culture can be carried out with TBS Tris-HCL 10-20 mM pH 7.2, or PBS 10-20 mM pH 7.2.

Осаждение поверхностных белков может быть осуществлено фильтрованием или центрифугированием.Precipitation of surface proteins can be carried out by filtration or centrifugation.

Заявляемое изобретение иллюстрируется чертежами:The invention is illustrated by drawings:

Фиг. 1 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов A brasilense Sp245 и Sp7, экстрагированных различными агентами, где цифрами обозначены белковые спектры в присутствии: 1 - 15 мМ ТРИС-фосфатного буфера; 2 - 1М NaCl; 3 - 1М LiCL; 4 - 2М мочевины; 5-0,1% дезоксихолат натрия; 6 - маркеры молекулярных масс.FIG. 1 - DDS-PAG analysis of surface polypeptides A brasilense Sp245 and Sp7, extracted with various agents, where the numbers indicate protein spectra in the presence of: 1 - 15 mm TRIS-phosphate buffer; 2-1 M NaCl; 3-1M LiCL; 4 - 2M urea; 5-0.1% sodium deoxycholate; 6 - molecular weight markers.

Фиг. 2 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов A. brasilense Sp245, экстрагированных различными концентрациями ДОХ, где цифрами обозначены: 1 - 0,03% ДОХ; 2 - 0,05% ДОХ; 3 - 0,075% ДОХ; 4 - 0,1% ДОХ; 5 - 0,15% ДОХ; 6 - 0,2% ДОХ; 7 - белковые маркеры.FIG. 2 - DDS-PAG analysis of surface polypeptides of A. brasilense Sp245, extracted with various concentrations of DOC, where the numbers denote: 1 - 0.03% DOC; 2 - 0.05% DOC; 3 - 0.075% DOC; 4 - 0.1% DOH; 5 - 0.15% DOH; 6 - 0.2% DOH; 7 - protein markers.

Фиг. 3 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов A. brasilense Sp7 (А) и А. brasilense Sp245, экстрагированных ДОХ в течение различного времени: 1 -экстракция в течение 6 секунд; 2 - экстракция в течение 30 секунд; 3 - экстракция в течение 60 секунд; 4 - экстракция в течение 600 секунд (Юминут); 5 - экстракция в течение 3600 секунд (1 часа); 6 - белковые маркеры.FIG. 3 - DDS-PAG analysis of surface polypeptides A. brasilense Sp7 (A) and A. brasilense Sp245, extracted with DOC for various times: 1 -extraction for 6 seconds; 2 - extraction for 30 seconds; 3 - extraction for 60 seconds; 4 - extraction for 600 seconds (Yuminut); 5 - extraction for 3600 seconds (1 hour); 6 - protein markers.

Фиг. 4 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов суспензионной культуры клеток Arabidopsis thaliana, при различном времени культивирования: треки 1,8 - белковые маркеры; трек 2 - культивирование 2 суток; 3 - культивирование 4 суток; 4 -культивирование 6 суток; 5 - культивирование 8 суток; 6 - культивирование 8 суток; 7 -культивирование 10 суток, 9 - актин Arabidopsis thaliana, 10 - актин Sp245, 11 - актин кролика.FIG. 4 - DDS-PAG analysis of surface polypeptides of a suspension culture of Arabidopsis thaliana cells, with different cultivation times: tracks 1.8 - protein markers; Track 2 - cultivation for 2 days; 3 - cultivation for 4 days; 4 -cultivation of 6 days; 5 - cultivation of 8 days; 6 - cultivation of 8 days; 7 - cultivation for 10 days, 9 - actin of Arabidopsis thaliana, 10 - actin Sp245, 11 - actin of rabbit.

Согласно заявляемому способу белки смывают (экстрагируют) с поверхности клеток поверхностно активным веществом (детергентом), при этом, согласно изобретению, детергентом является соль желчной кислоты дезоксихолат натрия (ДОХ). Обработку проводят 0,1-0,2% раствором ДОХ в течение 5-10 минут, а полученные белки количественно осаждают трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и промывают ацетоном для удаления ДОХ.According to the claimed method, the proteins are washed (extracted) from the surface of the cells with a surface-active substance (detergent), and according to the invention, the detergent is a sodium bile salt salt of sodium deoxycholate (DOC). The treatment is carried out with 0.1-0.2% DOC solution for 5-10 minutes, and the obtained proteins are quantitatively precipitated with trichloroacetic acid (TCA) and washed with acetone to remove DOC.

Использование ДОХ в концентрациях 0,1-0,2% позволяет экстрагировать поверхностные белки бактериальных и растительных клеток без их разрушения и избежать контаминации загрязнения препарата внутриклеточными цитоплазматическими белками.The use of DOC in concentrations of 0.1-0.2% allows you to extract surface proteins of bacterial and plant cells without destroying them and to avoid contamination of the drug with intracellular cytoplasmic proteins.

Преципитация ТХУ в присутствии ДОХ обеспечивает количественное (полное) осаждение экстрагированных белков с различной молекулярной массой, в том числе минорных и низкомолекулярных.Precipitation of TCA in the presence of DOC provides a quantitative (complete) precipitation of extracted proteins with different molecular weights, including minor and low molecular weight ones.

В заявляемом решении технический результат достигается за счет использования в качестве экстрагента соли желчной кислоты - дезоксихолата натрия в концентрации ниже (или равной) критической концентрации мицеллообразования (ККМ).In the claimed solution, the technical result is achieved through the use of bile salt as an extractant - sodium deoxycholate at a concentration below (or equal to) the critical micelle concentration (CMC).

Выбор экстрагента основан на результатах предварительных экспериментов, в которых использовались растворы различного состава, обычно применяемые в биохимии для выделения поверхностных белков (см. Фиг. 1, которая демонстрирует эффективность экстракции белков клеточной поверхности на примере двух штаммов грамотрицательных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и Sp7).The choice of extractant is based on the results of preliminary experiments in which solutions of various compositions were used, usually used in biochemistry to isolate surface proteins (see Fig. 1, which demonstrates the efficiency of extraction of cell surface proteins using two strains of gram-negative bacteria Azospirillum brasilense Sp245 and Sp7 as an example).

Было показано, что наиболее эффективно экстрагировали полипептиды с поверхности бактериальных клеток мочевина и дезоксихолат натрия. В соответствующих белковых спектрах присутствует значительное количество низкомолекулярных полипептидов, которые отсутствуют в спектрах, полученных с использованием солей и ТРИС-фосфатного буфера, либо полностью или содержание этих белков незначительно. Однако следует отметить, что экстракция белков, проведенная с использованием ДОХ, оказалась более универсальной: с поверхности бактерий штамма Sp245 наибольшее количество белков экстрагируется именно дезоксихолатом натрия.It was shown that polypeptides were most efficiently extracted from the surface of bacterial cells urea and sodium deoxycholate. In the corresponding protein spectra there is a significant amount of low molecular weight polypeptides that are absent in the spectra obtained using salts and TRIS-phosphate buffer, or completely or the content of these proteins is negligible. However, it should be noted that protein extraction using DOC turned out to be more universal: from the surface of bacteria of strain Sp245, the largest amount of proteins is extracted with sodium deoxycholate.

Раствор ДОХ в заявляемом способе демонстрирует выраженную способность к количественной экстракции белков с поверхности бактерий в зависимости от использованной концентрации (см. Фиг 2).A solution of DOC in the present method demonstrates a pronounced ability to quantitatively extract proteins from the surface of bacteria depending on the concentration used (see Fig. 2).

Сущность заявляемого изобретения подробно рассматривают на примере бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и Sp7, и суспензионной культуре клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. дикого типа (экотип Columbia, Col-0).The essence of the claimed invention is considered in detail on the example of bacteria Azospirillum brasilense Sp245 and Sp7, and a suspension cell culture of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. wild type (ecotype Columbia, Col-0).

Пример 1.Example 1

Способ заключается в том, что суспензию (V=2 мл) бактериальных клеток А. brasilense осаждали центрифугированием при 7000-9000 g в течение 3-5 минут. Для удаления компонентов культуральной среды, осадок промывали 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS 10-20 мМ рН 7,2+150 mM NaCl или TBS Tris-HCl 10-20 мМ рН 7.2+150 mМ NaCl) и повторно центрифугировали при тех же условиях. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл PBS или TBS, добавляли ДОХ до конечной концентрации 0,1%, встряхивали на Vortex, инкубировали 5-10 мин и осаждали клетки центрифугированием при 7000-9000 g в течение 3-5 мин. Полученный супернатант количественно переносили в пробирки 1,5 мл, белки из надосадочной жидкости преципитировали добавлением ТХУ до конечной концентрации 10-12%, осаждали центрифугированием 7000-9000 g., 3-5 мин. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок для удаления ДОХ промывали ацетоном инкубировали 60-300 мин при -18°С центрифугировали 7000-9000 g., 3-5 мин., осадок хранили до проведения анализа. Время экспозиции было определено в предварительных экспериментах. Результат ДДС-ПААГ анализа поверхностных полипептидов A. brasilense Sp7 (А) и A. brasilense Sp245, экстрагированных ДОХ в течение различного времени, приведен на Фиг. 3.The method consists in the fact that a suspension (V = 2 ml) of bacterial cells of A. brasilense was precipitated by centrifugation at 7000-9000 g for 3-5 minutes. To remove the components of the culture medium, the precipitate was washed with 1 ml of phosphate-buffered saline (PBS 10-20 mm pH 7.2 + 150 mm NaCl or TBS Tris-HCl 10-20 mm pH 7.2 + 150 mm NaCl) and re-centrifuged at the same conditions. The resulting pellet was resuspended in 1 ml of PBS or TBS, DOC was added to a final concentration of 0.1%, shaken on a Vortex, incubated for 5-10 minutes and cells were pelleted by centrifugation at 7000-9000 g for 3-5 minutes. The obtained supernatant was quantitatively transferred into 1.5 ml tubes, proteins from the supernatant were precipitated by adding TCA to a final concentration of 10-12%, precipitated by centrifugation of 7000-9000 g., 3-5 min. The supernatant was removed. The precipitate for removing DOC was washed with acetone, incubated for 60-300 min at -18 ° C, centrifuged at 7000-9000 g., 3-5 min., The precipitate was stored until analysis. Exposure time was determined in preliminary experiments. The result of the DDS-PAGE analysis of A. brasilense Sp7 (A) surface polypeptides and A. brasilense Sp245 polypeptides extracted with DOC for various times is shown in FIG. 3.

Пример 2.Example 2

Суспензионная культура клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. дикого типа (экотип Columbia, Col-0).Suspension cell culture of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. wild type (ecotype Columbia, Col-0).

Клетки перед экстракцией отделяли от культуральной среды на крупнопористом стекловолоконном фильтре, например Whatman GF-D, дополнительно отмывали на том же фильтре, изотоническим натриевым фосфатным буфером с 44-88 мМ (15-30 г/л) сахарозы. Навеску отфильтрованных клеток 500 мг помещали в пластиковую пробирку на 5 мл.Before extraction, the cells were separated from the culture medium on a large-pore glass fiber filter, for example, Whatman GF-D, and were further washed on the same filter with isotonic sodium phosphate buffer with 44-88 mM (15-30 g / l) sucrose. A sample of 500 mg filtered cells was placed in a 5 ml plastic tube.

Поверхностные белки экстрагировали 0,1% ДОХом в фосфатном буфере с 43-88 мМ сахарозой, аккуратно перемешивая в течение 10 минут при соотношении 1:5-1:10 (в/об). Затем клетки отделяли фильтрованием на крупнопористом стекловолоконном фильтре, например Whatman GF-D, отбирали аликвоту фильтрата 1,0 мл, белки из надосадочной жидкости преципитировали добавлением ТХУ до конечной концентрации 10-12%, осаждали центрифугированием 7000-9000 g., 3-5 мин. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок для удаления ДОХ промывали ацетоном инкубировали 60-300 мин при -18°С центрифугировали 7000-9000 g., 3-5 мин., осадок хранили до проведения анализа. Результаты ДДС-ПААГ анализа поверхностных полипептидов суспензионной культуры клеток Arabidopsis thaliana при различном времени культивирования показан на Фиг. 4.Surface proteins were extracted with 0.1% DOCh in phosphate buffer with 43-88 mM sucrose, gently mixing for 10 minutes at a ratio of 1: 5-1: 10 (w / v). Then the cells were separated by filtration on a large-pore fiberglass filter, for example, Whatman GF-D, a 1.0 ml aliquot of the filtrate was taken, proteins from the supernatant were precipitated by adding TCA to a final concentration of 10-12%, precipitated by centrifugation 7000-9000 g., 3-5 min . The supernatant was removed. The precipitate for removing DOC was washed with acetone, incubated for 60-300 min at -18 ° C, centrifuged at 7000-9000 g., 3-5 min., The precipitate was stored until analysis. The results of DDS-PAGE analysis of surface polypeptides of a suspension culture of Arabidopsis thaliana cells at different cultivation times are shown in FIG. four.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает количественное выделение белков с поверхности клеток без разрушения поверхностной мембраны и минуя этап получения фракции сферопластов. Подобный подход позволяет значительно снизить трудоемкость процесса, упростив и сократив процедуру получения белков поверхности. Способ применим как для микробных, так и для растительных клеток.Thus, the inventive method provides a quantitative release of proteins from the surface of cells without destroying the surface membrane and bypassing the stage of obtaining a fraction of spheroplasts. This approach can significantly reduce the complexity of the process, simplifying and shortening the procedure for obtaining surface proteins. The method is applicable for both microbial and plant cells.

Воспроизводимость процедуры выделения позволяет проводить количественное и качественное сравнение (сопоставление) состава белков поверхности исследуемых объектов.The reproducibility of the isolation procedure allows quantitative and qualitative comparison (comparison) of the composition of the surface proteins of the studied objects.

Claims

1. The method of obtaining surface proteins of cells of gram-negative bacteria and plant cell culture, including:

- pre-washing cells of gram-negative bacteria and plant cell culture with TBS or PBS buffer,

- processing gram-negative bacteria and plant cell culture with 0.1-0.2% sodium deoxycholate solution for 5-10 minutes,

- filtering the extracted surface proteins,

- precipitation of the extracted surface proteins with a solution of trichloroacetic acid,

precipitation of precipitate by centrifugation,

- washing the precipitate with acetone, incubation for 60-300 min at -18 ° C,

- deposition of surface proteins.

2. The method according to p. 1, characterized in that the preliminary washing of the cells of gram-negative bacteria and the culture of plant cells is carried out by TBS Tris-HCL 10-20 mM pH 7.2.

3. The method according to p. 1, characterized in that the preliminary washing of the cells of gram-negative bacteria and the culture of plant cells is carried out with PBS 10-20 mm pH 7.2.

4. The method according to p. 1, characterized in that the deposition of surface proteins is carried out by filtration.

5. The method according to p. 1, characterized in that the deposition of surface proteins is carried out by centrifugation.