RU2664184C2 - RECOMBINANT PLASMID DNA pBiIPr-ABIgA1FI6-INTHT FOR OBTAINING RECOMBINANT IGA1 ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN - Google Patents
RECOMBINANT PLASMID DNA pBiIPr-ABIgA1FI6-INTHT FOR OBTAINING RECOMBINANT IGA1 ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN Download PDFInfo
- Publication number
- RU2664184C2 RU2664184C2 RU2016152550A RU2016152550A RU2664184C2 RU 2664184 C2 RU2664184 C2 RU 2664184C2 RU 2016152550 A RU2016152550 A RU 2016152550A RU 2016152550 A RU2016152550 A RU 2016152550A RU 2664184 C2 RU2664184 C2 RU 2664184C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plasmid dna
- recombinant plasmid
- antibody
- human
- virus
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 161
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title description 4
- 101100396606 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) iga gene Proteins 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 69
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 32
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 16
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 80
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 64
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 48
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 32
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 25
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 25
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 25
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 claims description 17
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 claims description 13
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 13
- 101900159346 Influenza A virus Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 12
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 9
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 7
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 7
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 30
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 14
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 14
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 12
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 102100027377 HBS1-like protein Human genes 0.000 description 5
- 101001009070 Homo sapiens HBS1-like protein Proteins 0.000 description 5
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 5
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 5
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 5
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 5
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 5
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102100037116 Transcription elongation factor 1 homolog Human genes 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 4
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 239000012743 FreeStyle Max reagent Substances 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102400001107 Secretory component Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710109570 Thymidine kinase a Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 230000000422 nocturnal effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности предложена рекомбинантная плазмидная ДНК, позволяющая осуществлять транскрипцию и трансляцию кодирующей последовательности генов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина А для последующего получения линий клеток, экспрессирующих антитела изотипа IgA1, которые могут быть использованы при производстве терапевтических средств (препаратов и вакцин), в том числе против вируса гриппа А.The invention relates to the field of biotechnology, in particular, a recombinant plasmid DNA is proposed that allows transcription and translation of the coding sequence of the immunoglobulin A heavy and light chain genes for subsequent production of cell lines expressing IgA1 isotype antibodies that can be used in the manufacture of therapeutic agents (drugs and vaccines) ), including against influenza A.
Уровень техникиState of the art
В литературе описано несколько способов получения рекомбинантных иммуноглобулинов А в животных клетках и создания культур - продуцентов антител на основе клеток грызунов и приматов, например на основе линии клеток СНО (клетки яичника китайского хомячка).The literature describes several methods for producing recombinant immunoglobulins A in animal cells and creating cultures producing antibodies based on rodent and primate cells, for example, based on the CHO cell line (Chinese hamster ovary cells).
Известна плазмида, созданная на основе рЕЕ14.4 [R.C. Kallmeier, T.J. Macartney and R.D. Gay. IMPROVEMENTS TO THE GS SYSTEM. FOR EASIER RE-EXPRESSION OF HUMAN ANTIBODIES. METHODS. http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_Posters_Easier_Expression_of_Antibodies_using_GS.pdf], содержащая промотор и энхансер гена hCMV-MIE, включая 5'-нетранслируемую последовательность и первый интрон, лидерный пептид HAVT20, вариабельный домен легкой цепи антитела 225 против рецептора эпидермального фактора роста человека EGF-R, константный домен легкой каппа-цепи человека, сайт полиаденилирования и в качестве селективного маркера на безглутаминовой среде ген глутамин-синтетазы под контролем слабого позднего промотора вируса SV40 [Beyer Т., Lohse S., Berger S., Peipp M., Valerius Т., Dechant M. Serum-free production and purification of chimeric IgA antibodies. // Journal of Immunological Methods 346 (2009) 26-37].A known plasmid created on the basis of pEE14.4 [R.C. Kallmeier, T.J. Macartney and R.D. Gay IMPROVEMENTS TO THE GS SYSTEM. FOR EASIER RE-EXPRESSION OF HUMAN ANTIBODIES. METHODS. http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_Posters_Easier_Expression_of_Antibodies_using_GS.pdf], containing the promoter and enhancer of the hCMV-MIE gene, including the 5'-untranslated sequence and the first intron, the leader of the HABT20 receptor antibody chain domain of 225 variable human epidermal growth factor EGF-R, a constant domain of the human kappa light chain, a polyadenylation site and, as a selective marker on a glutamine-free medium, the glutamine synthetase gene under the control of a weak late promoter of the SV40 virus [Beyer T., Lohse S., Berger S., Peipp M., Valerius T., Dechant M. Serum-free produc tion and purification of chimeric IgA antibodies. // Journal of Immunological Methods 346 (2009) 26-37].
Известна плазмида, созданная на основе рЕЕ14.4, содержащая промотор и энхансер гена hCMV-MIE, включая 5'-нетранслируемую последовательность и первый интрон, лидерный пептид HAVT20, вариабельный домен тяжелой цепи антитела 225 против EGF-R, ген констанных доменов тяжелой α1-цепи человека (или α2-цепи в варианте для IgA2(m1)), сайт полиаденилирования и ген глутамин-синтетазы под контролем слабого позднего промотора вируса SV40 в качестве селективного маркера на безглутаминовой среде. Полученные с помощью ко-трансфекции в клетках СНО-К1 стабильные клеточные линии обеспечивали продукцию мономерных IgA1 и IgA2 в суспензионной культуре в бессывороточной среде с выходом 2,2 пикограмм/клетку/день [Beyer Т., Lohse S., Berger S., Peipp M., Valerius Т., Dechant M. Serum-free production and purification of chimeric IgA antibodies. // Journal of Immunological Methods 346 (2009) 26-37].A known plasmid created on the basis of pEE14.4 containing the promoter and enhancer of the hCMV-MIE gene, including the 5'-untranslated sequence and the first intron, the HAVT20 leader peptide, the anti-EGF-R antibody heavy chain variable domain 225, the heavy α1- constant gene domain human chains (or the α2 chains in the variant for IgA2 (m1)), the polyadenylation site and the glutamine synthetase gene under the control of the weak late promoter of the SV40 virus as a selective marker on glutamine-free medium. The stable cell lines obtained by co-transfection in CHO-K1 cells ensured the production of monomeric IgA1 and IgA2 in suspension culture in serum-free medium with a yield of 2.2 picograms / cell / day [T. Beyer, S. Lohse, Berger S., Peipp M., Valerius T., Dechant M. Serum-free production and purification of chimeric IgA antibodies. // Journal of Immunological Methods 346 (2009) 26-37].
Известна плазмида, полученная на основе вектора pIR-ESpuro3 (Clontech, Mountain View, CA), содержащая ранний промотор и энхансер цитомегаловируса человека PCMV IE, ген J-цепи человека с гексагистидиновой последовательностью на N-конце (кодирующая последовательность 6 гистидинов взята из вектора pcDNA6His (Invitrogen)), синтетический интрон IVS, внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиокардита IRES, ген пуромицин-N-ацетил-трансферазы Puror и ранний сигнал полиаденилирования вируса SV40. Котрансфекция этой плазмидой клонов, хорошо продуцирующих антитела 225-IgA против EGF-R, обеспечивает продукцию димеров 225-IgA, связанных с J-цепью, в суспензионной культуре в бессывороточной среде в клетках (CHO)-K1 с выходом 200.8 (673.3) и 295.2 (6139.5) мг/мл для мономерной и димерной форм 225-IgA1 [Lohse S., Derer S., Beyer Т., Klausz K., Peipp M., Leusen J.H.W., van de Winkel J.G.J., Dechant M., Valerius T. Recombinant Dimeric IgA Antibodies against the Epidermal Growth Factor Receptor Mediate Effective Tumor Cell Killing. // The Journal of Immunology, 2011, 186: 3770-3778].A known plasmid derived from the pIR-ESpuro3 vector (Clontech, Mountain View, CA) containing the early promoter and enhancer of human cytomegalovirus P CMV IE , a human J-chain gene with a hexahistidine sequence at the N-terminus (the coding sequence of 6 histidines is taken from the vector pcDNA6His (Invitrogen)), synthetic IVS intron, internal IRES site for ribosome embryos, Puromycin N-acetyl transferase gene Puro r and early SV40 polyadenylation signal. Cotransfection of this plasmid with clones that well produce 225-IgA antibodies against EGF-R ensures the production of 225-IgA dimers linked to the J-chain in suspension culture in serum-free medium in (CHO) -K1 cells with a yield of 200.8 (673.3) and 295.2 (6139.5) mg / ml for the monomeric and dimeric forms of 225-IgA1 [Lohse S., Derer S., Beyer T., Klausz K., Peipp M., Leusen JHW, van de Winkel JGJ, Dechant M., Valerius T. Recombinant Dimeric IgA Antibodies against the Epidermal Growth Factor Receptor Mediate Effective Tumor Cell Killing. // The Journal of Immunology, 2011, 186: 3770-3778].
Известна плазмида pEF-dhfr2a-NEO-IGA-chi-H, содержащая кодирующую последовательность вариабельного домена тяжелой цепи мышиного антитела НА-9 против вируса птичьего гриппа H5N1, кодирующую последовательность константных доменов IgA2 антител человека из pGEM-T-Easy-IGHA с нитронами, ген устойчивости к неомицину NeoR и ген дигидрофолатредуктазы dhfr, промоторы CMV и фактора элонгации 1 человека (EF1)-α, искусственный интрон перед и поздний сайт полиаденилирования SV40 poly (А) после гена цепи антитела [Cun Li, Xiaoping An, Azeem Mehmood Butt, Baozhong Zhang, Zhiyi Zhang, Xiaona Wang, Yong Huang, Wenhui Zhang, Bo Zhang, Zhiqiang Mi, Yigang Tong. Construction of a Chimeric Secretory IgA and Its Neutralization. Activity against Avian Influenza Virus H5N1. // J Immunol Res. 2014: 394127. Published online 2014 February 13. doi: 10.1155/2014/394127, PMCID: РМС3987799].Known plasmid pEF-dhfr2a-NEO-IGA-chi-H, containing the coding sequence of the variable domain of the heavy chain of the mouse antibody HA-9 against avian influenza virus H5N1, coding for the sequence of the constant domains of human IgA2 antibodies from pGEM-T-Easy-IGHA with nitrons, neomycin resistance gene Neo R and dhfr dihydrofolate reductase gene, CMV and human elongation factor 1 (EF1) -α promoters, artificial intron before and late poly (a) polyadenylation site SV40 poly (A) after antibody chain gene [Cun Li, Xiaoping An, Azeem Mehmood Butt , Baozhong Zhang, Zhiyi Zhang, Xiaona Wang, Yong Huang, Wenhui Zhang, Bo Zhang, Zhiqiang Mi, Yigang Tong. Construction of a Chimeric Secretory IgA and Its Neutralization. Activity against Avian Influenza Virus H5N1. // J Immunol Res. 2014: 394127. Published online 2014 February 13. doi: 10.1155 / 2014/394127, PMCID: PMC3987799].
Известна плазмида pEF-dhfr2a-NEO-IGA-Kappa, содержащая кодирующую последовательность вариабельного домена легкой цепи мышиного антитела НА-9 против вируса птичьего гриппа H5N1, кодирующую последовательность константного домена каппа легкой цепи антител человека из pGEM-T-Easy-CK, устойчивости к неомицину NeoR и ген дигидрофолатредуктазы dhfr, промоторы CMV и фактора элонгации 1 человека (EF1)-α, искусственный интрон перед и поздний сайт полиаденилирования SV40 poly (А) после гена цепи антитела [Cun Li, Xiaoping An, Azeem Mehmood Butt, Baozhong Zhang, Zhiyi Zhang, Xiaona Wang, Yong Huang, Wenhui Zhang, Bo Zhang, Zhiqiang Mi, Yigang Tong. Construction of a Chimeric Secretory IgA and Its Neutralization. Activity against Avian Influenza Virus H5N1. // J Immunol Res. 2014: 394127. Published online 2014 February 13. doi: 10.1155/2014/394127, PMCID: РМС3987799].Known plasmid pEF-dhfr2a-NEO-IGA-Kappa, containing the coding sequence of the variable domain of the light chain of the mouse antibody HA-9 against avian influenza virus H5N1, coding for the sequence of the constant domain of the kappa light chain of human antibodies from pGEM-T-Easy-CK, resistance to Neomycin Neo R and the dhfr dihydrofolate reductase gene, CMV and human elongation factor 1 (EF1) -α promoters, artificial intron before and late SV40 poly (A) polyadenylation site after antibody chain gene [Cun Li, Xiaoping An, Azeem Mehmood Butt, Baozhong Zhang , Zhiyi Zhang, Xiaona Wang, Yong Huang, Wenhui Zhang, Bo Zhang, Zhiqiang Mi, Yiga ng Tong. Construction of a Chimeric Secretory IgA and Its Neutralization. Activity against Avian Influenza Virus H5N1. // J Immunol Res. 2014: 394127. Published online 2014 February 13. doi: 10.1155 / 2014/394127, PMCID: PMC3987799].
Обе плазмиды обеспечивают продукцию химерного антитела IgA2 НА-9 против вируса птичьего гриппа H5N1 при котрансфекции в клетки CHO/dhfr- в суспензионной культуре в бессывороточной среде. Известна плазмида pcDNA4/His A-IgJ, содержащая ген J-цепи антител IgJ. Известна плазмида pcDNA4/HisA-SC, содержащая ген секреторного компонента (состоит из первых 585 аминокислот полимерного рецептора иммуноглобулинов plgR человека). Обе плазмиды обеспечивают продукцию секреторного варианта химерного антитела IgA2 НА-9 против вируса птичьего гриппа H5N1 при котрансфекции в клетки CHO/dhfr-, продуцироющие мономерный вариант в суспензионной культуре в бессывороточной среде с выходом 25 мг/л супернатанта. [Сип Li, Xiaoping An, Azeem Mehmood Butt, Baozhong Zhang, Zhiyi Zhang, Xiaona Wang, Yong Huang, Wenhui Zhang, Bo Zhang, Zhiqiang Mi, Yigang Tong. Construction of a Chimeric Secretory IgA and Its Neutralization. Activity against Avian Influenza Virus H5N1. // J Immunol Res. 2014: 394127. Published online 2014 February 13. doi: 10.1155/2014/394127, PMCID: РМС3987799].Both plasmids provide the production of the chimeric antibody IgA2 HA-9 against the H5N1 avian influenza virus by cotransfection into CHO / dhfr-cells in suspension culture in serum-free medium. Known plasmid pcDNA4 / His A-IgJ containing the gene for the J-chain of antibodies IgJ. The known plasmid pcDNA4 / HisA-SC containing the gene for the secretory component (consists of the first 585 amino acids of the human immunoglobulin polymer receptor plgR). Both plasmids produce the secretory variant of the chimeric IgA2 HA-9 antibody against the H5N1 avian influenza virus by cotransfection into CHO / dhfr- cells, producing the monomeric variant in suspension culture in serum-free medium with a yield of 25 mg / L supernatant. [Sip Li, Xiaoping An, Azeem Mehmood Butt, Baozhong Zhang, Zhiyi Zhang, Xiaona Wang, Yong Huang, Wenhui Zhang, Bo Zhang, Zhiqiang Mi, Yigang Tong. Construction of a Chimeric Secretory IgA and Its Neutralization. Activity against Avian Influenza Virus H5N1. // J Immunol Res. 2014: 394127. Published online 2014 February 13. doi: 10.1155 / 2014/394127, PMCID: PMC3987799].
Известна плазмида, полученная на основе pFUSE2ss-CLIg-hK (InvivoGen), содержащая гибридный промотор hEF1-HTLV, сигнальную последовательность интерлейкина-2 человека, кодирующую последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела 9F4 против вирусов гриппа H5N1, ген константного каппа-домена легкой цепи антитела человека, сигнал полиаденилирования SV40 pAn, ген устойчивости к бластицидину под контролем гибридного промотора CMV enh / hFerL и сайта полиаденилирования бета-глобина человека βGlo pAn в качестве селективного маркера [Tze-Minn Мак, Brendon J. Hanson, Yee-Joo Tan. Chimerization and characterization of a monoclonal antibody with potent neutralizing activity across multiple influenza A H5N1 clades. // Antiviral Res. 2014 Jul; 107:76-83. doi: 10.1016/j.antiviral.2014.04.011].Known plasmid obtained on the basis of pFUSE2ss-CLIg-hK (InvivoGen) containing the hybrid promoter hEF1-HTLV, the signal sequence of human interleukin-2, the coding sequence of the variable domain of the light chain of the antibody 9F4 against influenza viruses H5N1, the constant light chain constant kappa domain of the antibody human, SV40 pAn polyadenylation signal, blastidin resistance gene under the control of the hybrid promoter CMV enh / hFerL and human beta-globin polyadenylation site βGlo pAn as a selective marker [Tze-Minn Mac, Brendon J. Hanson, Yee-Joo Tan. Chimerization and characterization of a monoclonal antibody with potent neutralizing activity across multiple influenza A H5N1 clades. // Antiviral Res. 2014 Jul; 107: 76-83. doi: 10.1016 / j.antiviral.2014.04.01.011].
Известна плазмида, полученная на основе pFUSEss-CHIg-hA1 (InvivoGen), содержащая гибридный промотор hEF1-HTLV, сигнальную последовательность интерлейкина-2 человека, кодирующую последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 9F4 против вирусов гриппа H5N1, кодирующую последовательность константных доменов тяжелой цепи антитела человека IgA1, сигнал полиаденилирования SV40 pAn, ген устойчивости к зеоцину под контролем гибридного промотора CMV enh / hFerL и сайта полиаденилирования бета-глобина человека βGlo pAn в качестве селективного маркера. При транзиентной котрансфекции клеток 293FT обе плазмиды обеспечивали продукцию химерного антитела против вирусов гриппа H5N1 xi-IgA1-9F4 [Tze-Minn Мак, Brendon J. Hanson, Yee-Joo Tan. Chimerization and characterization of a monoclonal antibody with potent neutralizing activity across multiple influenza A H5N1 clades. // Antiviral Res. 2014 Jul; 107:76-83. doi: 10.1016/j.antiviral.2014.04.011].Known plasmid derived on the basis of pFUSEss-CHIg-hA1 (InvivoGen) containing the hybrid promoter hEF1-HTLV, the signal sequence of human interleukin-2, encoding the sequence of the variable domain of the heavy chain of the antibody 9F4 against influenza viruses H5N1, encoding the sequence of constant domains of the heavy chain of human antibodies IgA1, SV40 pAn polyadenylation signal, zeocin resistance gene under the control of the hybrid promoter CMV enh / hFerL and human beta-globin polyadenylation site βGlo pAn as a selective marker. During transient cotransfection of 293FT cells, both plasmids produced chimeric antibodies against H5N1 xi-IgA1-9F4 influenza viruses [Tze-Minn Mac, Brendon J. Hanson, Yee-Joo Tan. Chimerization and characterization of a monoclonal antibody with potent neutralizing activity across multiple influenza A H5N1 clades. // Antiviral Res. 2014 Jul; 107: 76-83. doi: 10.1016 / j.antiviral.2014.04.01.011].
Известна плазмида pYR-GCEVH, содержащая тяжелую цепь антитела HCAb к раку кишечника человека, и плазмида pYR-GCEVL, содержащая легкую цепь антитела к раку кишечника человека [Xiong Н., Ran Y., Xing J., Yang X., Li Y. and Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies// Journal of Biochemistry and Molecular Biology. - 2005. - V. 38 (4). - P. 414-419]. Плазмида pYR-GCEVL включает в себя ген устойчивости к неомицину/генетицину под управлением раннего промотора вируса SV40 с удаленным энхансером. Транскрипция гена легкой цепи находится под контролем CMV на 5' конце и терминатора бычьего гормона роста (BGHT), на 3' конце находится сайт полиаденилирования. Плазмида pYR-GCEVH включает в себя ген dhfr под управлением раннего промотора вируса SV40. Транскрипция гена легкой цепи находится под контролем CMV на 5' конце и терминатора бычьего гормона роста (BGHT), на 3' конце находится сайт полиаденилирования.The known plasmid pYR-GCEVH containing the heavy chain of an HCAb antibody to human intestinal cancer and the plasmid pYR-GCEVL containing the light chain of an antibody to human intestinal cancer [Xiong N., Ran Y., Xing J., Yang X., Li Y. and Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies // Journal of Biochemistry and Molecular Biology. - 2005 .-- V. 38 (4). - P. 414-419]. Plasmid pYR-GCEVL includes a neomycin / geneticin resistance gene driven by an early promoter of the SV40 virus with a deleted enhancer. Transcription of the light chain gene is controlled by CMV at the 5 'end and bovine growth hormone terminator (BGHT), at the 3' end there is a polyadenylation site. Plasmid pYR-GCEVH includes the dhfr gene under the control of the early promoter of the SV40 virus. Transcription of the light chain gene is controlled by CMV at the 5 'end and bovine growth hormone terminator (BGHT), at the 3' end there is a polyadenylation site.
Культура клеток dhfr (-) СНО (АТСС, США), дефицитных по дигидрофолатредуктазе (ДГФР), была ко-трансфецирована с использованием равных количеств плазмид pYR-GCEVH, pYR-GCEVL. После проведения нескольких раундов селекции была получена культура, клоны которой имели продукцию химерных антител против рака кишечника человека от 30 до 100 и более мкг/мл кондиционированной среды [Xiong и др., 2005].A culture of dhfr (-) CHO cells (ATCC, USA) deficient in dihydrofolate reductase (DHFR) was co-transfected using equal amounts of pYR-GCEVH, pYR-GCEVL plasmids. After several rounds of selection, a culture was obtained whose clones had the production of chimeric antibodies against human intestinal cancer from 30 to 100 μg / ml or more of conditioned medium [Xiong et al., 2005].
Известны плазмиды pOptiVEC-L и pcDNA3.3-L, содержащие в своем составе ген легкой цепи антитела против ФНО-альфа человека [Radko B.V., Boitchenko V.E., Nedospasov S.A., Korobko V.G. Characterization of the genes encoding variable light and heavy chains of the high-affinity monoclonal antibody against human tumor necrosis factor // Russ J Immunol. - 2002. - V. 7(4). P. 371-4] под контролем промотора CMV, а также OptiVEC-H, pcDNA3.3-H, содержащие в своем составе ген легкой цепи антитела против ФНО-альфа человека под контролем промотора CMV. Плазмиды pcDNA3.3-L и pcDNA3.3-H содержат в своем составе также ген устойчивости к селективному антибиотику G418, а плазмиды pOptiVEC-L и pOptiVEC-H содержат в своем составе также миниген ДГФР мыши. После трансфекции экспрессирующими векторами pOptiVEC-L и pcDNA3.3-H клеток линии СНО DG44 и селекции в среде без нуклеотидов получен клон клеток, секретирующий химерные антитела против ФНО-альфа человека в среду культивирования с выходом 2 мкг на 1 мл кондиционированной среды. Путем проведения нескольких раундов амплификации в присутствии возрастающих концентраций метотрексата и селективного антибиотика G418 была получена линия-продуцент, стабильно секретирующая химерные антитела против ФНО-альфа человека с выходом до 24,5 мкг/мл. [Балабашин Д.С., Зайцева-Зотова Д.С., Топорова В.А., Панина А.А., Марквичева Е.А., Свирщевская Е.В., Алиев Т.К. Способы увеличения продукции рекомбинантных антител в клеточных линиях СНО DG44 // Современные проблемы науки и образования. - 2011. - №5.].Plasmids pOptiVEC-L and pcDNA3.3-L are known which contain the light chain gene of the anti-human TNF alpha antibody [Radko B.V., Boitchenko V.E., Nedospasov S.A., Korobko V.G. Characterization of the genes encoding variable light and heavy chains of the high-affinity monoclonal antibody against human tumor necrosis factor // Russ J Immunol. - 2002. - V. 7 (4). P. 371-4] under the control of the CMV promoter, as well as OptiVEC-H, pcDNA3.3-H, containing the light chain gene antibodies against human TNF-alpha under the control of the CMV promoter. The plasmids pcDNA3.3-L and pcDNA3.3-H also contain the selective antibiotic resistance gene G418, and plasmids pOptiVEC-L and pOptiVEC-H also contain the mouse DHFG minigen. After transfection with expressing vectors pOptiVEC-L and pcDNA3.3-H of CHO DG44 cell line and selection in a nucleotide-free medium, a clone of cells secreting chimeric antibodies against human TNF-alpha into the culture medium was released in 2 μg yield per ml of conditioned medium. By conducting several rounds of amplification in the presence of increasing concentrations of methotrexate and the selective antibiotic G418, a producer line was obtained that stably secreted chimeric antibodies against human TNF-alpha with a yield of up to 24.5 μg / ml. [Balabashin D.S., Zaitseva-Zotova D.S., Toporova V.A., Panina A.A., Markvicheva E.A., Svirshchevskaya E.V., Aliev T.K. Ways to increase the production of recombinant antibodies in cell lines CHO DG44 // Modern problems of science and education. - 2011. - No. 5.].
Недостатком данного продуцента, в котором используются 2 различные плазмиды, имеющие в своем составе гены тяжелой и легкой цепей антитела, является то, что интегрированные в них гены цепей антител против ФНО-альфа человека находятся в клетке под контролем одинаковых промоторов и терминаторов. Также различные генетические маркеры, позволяющие за счет селективного давления увеличивать продукцию cis-ориентированных генов в клетках-продуцентах, имеют различную активность, что может влиять на количество экспрессируемого белкового продукта каждой из плазмид. Данное обстоятельство может изменять соотношение легкой и тяжелой цепей и приводить к токсичности белкового продукта для клеток-продуцентов. При использовании метода селекции клеточной линии-продуцента с помощью метотрексата увеличение уровня экспрессии будет происходить только для той цепи антитела, которая находится в непосредственной близости от селективного маркера, гена ДГФР.The disadvantage of this producer, which uses 2 different plasmids containing the genes of the heavy and light chains of the antibody, is that the integrated genes of the chains of antibodies against human TNF-alpha are in the cell under the control of the same promoters and terminators. Also, various genetic markers that allow selective production of cis-oriented genes in producer cells due to selective pressure have different activities, which can affect the amount of expressed protein product of each plasmid. This circumstance can change the ratio of light and heavy chains and lead to toxicity of the protein product for producer cells. When using the method of breeding a cell line producer using methotrexate, an increase in the expression level will occur only for that chain of the antibody, which is located in the immediate vicinity of the selectable marker, the gene for DHFR.
Известно нейтрализующее моноклональное антитело FI6 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА), полученное из культуры единичных клеток плазмы периферической крови человека и демонстрирующее широкую специфичность к гемагглютининам обеих гетерологичных групп и нейтрализующую активность к вирусам разных серотипов [Corti D., Voss J., Gamblin S.J., Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., Silacci C, Fernandez-Rodriguez B.M., Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire L.F., Temperton N., Langedijk J.P., Skehel J.J. and Lanzavecchia A. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. // Science 333 (6044), 850-856 (2011). PUBMED 21798894]. кДНК вариабельных доменов этого антитела были получены с помощью метода RT-PCR, клонированы в экспрессионные векторы IgG1 и Igk и экспрессированы путем транзиентной трансфекции суспензионной культуры клеток 293Т. Эти антитела и их фрагменты потенциально могут быть использованы для диагностики и терапии гриппа [Antonio Lanzavecchia. Neutralizing anti-influenza A virus antibodies and uses thereof. Патент US 9340603 B2 https://www.google.ch/patents/US 93406031.Known is a neutralizing monoclonal antibody FI6 to hemagglutinin of influenza A virus (HAV), obtained from a culture of a single plasma cell of human peripheral blood and demonstrating broad specificity for hemagglutinins of both heterologous groups and neutralizing activity to viruses of different serotypes [Corti D., Voss J., GamblinJ , Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri SG, Pinna D., Minola A., Vanzetta F., Silacci C, Fernandez-Rodriguez BM, Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire LF, Temperton N., Langedijk JP, Skehel JJ and Lanzavecchia A. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to
Известна плазмида pBiPr-ABTNF [Алиев Т.К., Балабашин Д.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Панина А.А., Топорова В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая химерное антитело против фактора некроза опухоли-альфа человека, линия экуариотических клеток - продуцент химерного антитела и способ получения химерного антитела. Патент №2555533, прототип по конструированию], кодирующая химерное антитело против фактора некроза опухолей-альфа человека (ФНО-альфа) изотипа IgG1, созданная на основе плазмиды pOptiVEC™-TOPO®. Трансфецированная этой плазмидой линия эукариотических клеток осуществляет продукцию антитела против ФНО-альфа на уровне 90 мг/л. Наличие в плазмиде pBiPr-ABTNF активного гена ДГФР, находящегося под контролем IRES, позволяет проводить селекцию и амплификацию чужеродных последовательностей, интегрированных в геном клетки СНО DG44 (dhfr-/- вариант линии клеток СНО-К1), в среде, содержащей метотрексат. Сочетание процессов трансфекции, селекции и амплификации позволяет получить линию клеток продуцентов CHO-S11, содержащую в своем геноме интегрированные копии генов химерного антитела против ФНО-альфа человека и стабильно секретирующую рекомбинантные антитела в культуральную жидкость. Наличие генов тяжелой и легкой цепей антитела в составе одной плазмиды позволяет осуществлять одновременную амплификацию генов легкой и тяжелой цепей рекомбинантного антитела, встроенных в геном клеток СНО, при воздействии метотрексатом.The known plasmid pBiPr-ABTNF [Aliev T.K., Balabashin D.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Panina A.A., Toporova V.A. Recombinant plasmid DNA encoding a chimeric antibody against human tumor-necrosis factor-alpha, a line of ecuariotic cells producing a chimeric antibody and a method for producing a chimeric antibody. Patent No. 2555533, prototype for designing], encoding a chimeric antibody against tumor necrosis factor-human alpha (TNF-alpha) of the IgG1 isotype, based on the plasmid pOptiVEC ™ -TOPO®. The line of eukaryotic cells transfected with this plasmid produces antibodies against TNF-alpha at a level of 90 mg / L. The presence in the pBiPr-ABTNF plasmid of the active DHFR gene, which is controlled by IRES, allows the selection and amplification of foreign sequences integrated into the genome of CHO DG44 cells (dhfr - / - variant of the CHO-K1 cell line) in a medium containing methotrexate. The combination of transfection, selection and amplification processes allows to obtain a cell line of CHO-S11 producers containing in its genome integrated copies of the genes of the chimeric antibody against human TNF-alpha and stably secreting recombinant antibodies into the culture fluid. The presence of the antibody heavy and light chain genes in a single plasmid allows the simultaneous amplification of recombinant antibody light and heavy chain genes integrated into the genome of CHO cells when exposed to methotrexate.
Недостатком плазмиды является то, что эта плазмида позволяет получать антитела только изотипа G1 и только против фактора некроза опухолей-альфа человека. Возникшая необходимость получения антител изотипа IgA1 приводит к созданию сходной бипромоторной рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей получение антител изотипа IgA1. В качестве вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей используются вариабельные домены атитела FI6 как имеющие потенциальное терапевтическое значение. Кроме того, в ходе создания плазмиды получаются варианты как с однонаправленной, так и с разнонаправленной транскрипцией генов тяжелой и легкой цепей антитела. В литературе данные по влиянию взаимной ориентации транскрипции генов не найдены, что приводит к необходимости как разработки способов дифференцирования клонов по взаимному направлению транскрипции генов, так и изучения влияния однонаправленной и разнонаправленной транскрипции генов на уровень продукции антител изотипа IgA1. Также не найдены в литературе данные по изучению влияния наличия или отсутствия интронов в гене константных доменов тяжелой цепи антитела изотипа IgA1 на уровень экспрессии целевого антитела, что приводит к созданию бипромоторной рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей получение антител изотипа IgA1 и содержащей интронированный вариант гена IgA1. В дальнейшем эти данные могут позволить оптимизировать работу по получению рекомбинантных плазмид и клеточных культур, экспрессирующих другие антитела изотипа IgA1.The disadvantage of the plasmid is that this plasmid allows you to get antibodies only isotype G1 and only against tumor necrosis factor-alpha person. The need to obtain antibodies of the IgA1 isotype leads to the creation of a similar bipromotor recombinant plasmid, which provides the production of antibodies of the IgA1 isotype. As the variable domains of the heavy and light chains, the variable domains of the FI6 antibody are used as having potential therapeutic value. In addition, during the creation of the plasmid, variants with both unidirectional and multidirectional transcription of the antibody heavy and light chains are obtained. No data were found in the literature on the influence of the mutual orientation of gene transcription, which necessitates the development of methods for differentiating clones in the mutual direction of gene transcription and the study of the effect of unidirectional and multidirectional gene transcription on the level of production of antibodies of the IgA1 isotype. Also, no data were found in the literature on the effect of the presence or absence of introns in the constant domain gene of the heavy chain of an IgA1 isotype antibody on the expression level of a target antibody, which leads to the creation of a bipromotor recombinant plasmid that produces antibodies of the IgA1 isotype and contains an intron version of the IgA1 gene. In the future, these data can optimize the work on obtaining recombinant plasmids and cell cultures expressing other antibodies of the IgA1 isotype.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей настоящего изобретения является создание рекомбинантной плазмиды для получения рекомбинантных человеческих антител изотипа IgA1 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА).The present invention is the creation of a recombinant plasmid for the production of recombinant human antibodies of the IgA1 isotype to hemagglutinin of influenza A virus (HAV).
Сконструированная рекомбинантная плазмидная ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-Intht (структура плазмиды pBiPr-ABIgA1FI6-Intht показана в Фиг. 1) содержит:The constructed recombinant plasmid DNA pBiPr-ABIgA1FI6-Intht (the structure of the plasmid pBiPr-ABIgA1FI6-Intht is shown in Fig. 1) contains:
- фрагмент плазмиды pOptiVEC™-TOPO®, включающий промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV), ген ДГФР, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса ТК рА, сайт начала репликации в Е. coli из плазмиды pUC, ген β-лактамазы, а также следующие модификации - единичный сайт узнавания рестриктазы MluI вместо сайта узнавания рестриктазы SaiI в положении 23, единичные сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI после промотора CMV для клонирования ДНК легкой цепи антитела;- a fragment of the plasmid pOptiVEC ™ -TOPO®, including the promoter / enhancer of the early human cytomegalovirus (CMV) genes, the internal ribosome binding site (IRES) of the encephalomyocarditis virus (EMCV), the DHFR gene, the herpes thymidine kinase A polyadenylation signal at the beginning of the herpes T replication site, and the start of herpes T coli from the pUC plasmid, β-lactamase gene, as well as the following modifications — single MluI restriction enzyme recognition site instead of the SaiI restriction enzyme recognition site at position 23, single NheI and XhoI restriction enzyme recognition sites after the CMV promoter for cloning antibody light chain DNA;
- фрагмент ДНК, включающий фланкированную сайтами рестрикции NheI и XhoI кДНК легкой цепи типа каппа человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа A [Corti D., Voss J., Gamblin S.J., Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., Silacci C, Fernandez-Rodriguez B.M., Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire L.F., Temperton N., Langedijk J.P., Skehel J.J. and Lanzavecchia A. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. // Science 333 (6044), 850-856 (2011). PUBMED 21798894] человека под контролем промотора/энхансера ранних генов цитомегаловируса человека (CMV);- a DNA fragment including flanked by restriction sites NheI and XhoI cDNA of a light chain such as the kappa of a human anti-influenza A hemagglutinin antibody [Corti D., Voss J., Gamblin SJ, Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri SG, Pinna D., Minola A., Vanzetta F., Silacci C, Fernandez-Rodriguez BM, Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire LF, Temperton N., Langedijk JP, Skehel JJ and Lanzavecchia A. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to
- MluI/MluI - фрагмент ДНК, содержащий ДНК тяжелой цепи человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А человека [Corti D., Voss J., Gamblin S.J., Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., Silacci C, Fernandez-Rodriguez B.M., Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire L.F., Temperton N., Langedijk J.P., Skehel J.J. and Lanzavecchia A. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. // Science 333 (6044), 850-856 (2011). PUBMED 217988941 изотипа IgA1 в интронированном варианте под контролем гибридного промотора hEF1-HTLV и сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста BGH polyA. Фрагмент ориентирован так, что транскрипция с промоторов hEF1-HTLV и CMV идет однонаправленно.- MluI / MluI is a DNA fragment containing the heavy chain DNA of a human anti-human influenza A virus hemagglutinin antibody [Corti D., Voss J., Gamblin SJ, Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri SG, Pinna D. , Minola A., Vanzetta F., Silacci C, Fernandez-Rodriguez BM, Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire LF, Temperton N., Langedijk JP, Skehel JJ and Lanzavecchia A. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to
Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, характеризующуюся тем, что в ней содержится фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь человеческого антитела изотипа IgA1 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.The present invention also provides the aforementioned recombinant plasmid DNA pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, characterized in that it contains a DNA fragment encoding the heavy chain of a human antibody of the IgA1 isotype to hemagglutinin of influenza A virus (HAV) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, характеризующуюся тем, что фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь человеческого антитела изотипа IgA1 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) в интронированном варианте, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.The present invention also provides the aforementioned recombinant plasmid DNA pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, characterized in that the DNA fragment encoding the heavy chain of the human antibody of the IgA1 isotype IgA1 hemagglutinin (HAV) in the intron version has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что в ней содержится фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.The present invention also provides the aforementioned recombinant plasmid DNA, characterized in that it contains a DNA fragment encoding the light chain of a human antibody to influenza A virus hemagglutinin (HAV) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА), имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4.The present invention also provides the aforementioned recombinant plasmid DNA, characterized in that the DNA fragment encoding the light chain of the human anti-influenza A virus hemagglutinin (HAV) antibody has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что указанный промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV) имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5.The present invention also provides the aforementioned recombinant plasmid DNA, characterized in that said promoter / enhancer of early human cytomegalovirus (CMV) genes has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что указанный гибридный промотор hEF1-HTLV имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6.The present invention also provides the aforementioned recombinant plasmid DNA, characterized in that said hEF1-HTLV hybrid promoter has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что указанный сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста BGH polyA имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7.Also, the present invention provides the aforementioned recombinant plasmid DNA, characterized in that said bovine growth hormone polyadenylation signal BGH polyA has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
Поставленная задача также решается способом получения культуры клеток яичника китайского хомячка СНО - продуцента иммуноглобулина А изотипа IgA1 человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) путем трансфекции клеток упомянутой выше рекомбинантной плазмидной ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-Intht.The problem is also solved by the method of obtaining a culture of the ovary of the Chinese hamster CHO, a producer of the immunoglobulin A of the IgA1 isotype of the human antibody to influenza A virus hemagglutinin (HAV) by transfecting the cells of the above recombinant plasmid DNA pBiPr-ABIgA1FI6-Intht.
Также поставленная задача решается линией клеток яичника китайского хомячка СНО - продуцента человеческого антитела изотипа IgA1 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА), полученной путем трансфекции линии клеток СНО DG44 упомянутой выше рекомбинантной плазмидной ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-Intht.Also, the problem is solved by the line of ovary cells of the Chinese hamster CHO, a producer of the human antibody of the IgA1 isotype to hemagglutinin of influenza A virus (HAV), obtained by transfection of the CHO DG44 cell line with the aforementioned recombinant plasmid DNA pBiPr-ABIgA1FI6-Intht.
Поставленная задача также решается способом получения человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) изотипа IgA1, включающим:The problem is also solved by the method of obtaining human antibodies to hemagglutinin of influenza A virus (HAV) of IgA1 isotype, including:
- культивирование в питательной среде упомянутых выше линий клеток,- culturing in a nutrient medium of the above cell lines,
- выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости.- isolation of the obtained target protein from the culture fluid.
Технический результат заключается в стабильной коэкспрессии генов тяжелой и легкой цепей антитела под давлением одного селективного маркера и достигается за счет однонаправленной транскрипции генов тяжелой (в интронированном варианте) и легкой цепей антитела изотипа IgA1 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) клетками-продуцентами СНО при использовании полученной рекомбинантной плазмидной ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-Intht с выходом до 16,7 мг/л культуральной среды.The technical result consists in stable coexpression of the genes of the heavy and light chains of the antibody under the pressure of one selective marker and is achieved by unidirectional transcription of the genes of the heavy (intron version) and light chains of the IgA1 isotype antibody to hemagglutinin of influenza A virus (HAV) by producing cells of CHO when using the obtained recombinant plasmid DNA pBiPr-ABIgA1FI6-Intht with the release of up to 16.7 mg / l of culture medium.
Наличие в плазмиде pBiPr-ABIgA1FI6-Intht активного гена ДГФР, находящегося под контролем IRES, позволяет проводить селекцию и амплификацию чужеродных последовательностей, интегрированных в геном клетки СНО DG44 (dhfr-/- вариант линии клеток СНО-К1), в среде, содержащей метотрексат.Сочетание процессов трансфекции, селекции и амплификации позволяет получить линию клеток продуцентов СНО DG44/pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, содержащую в своем геноме интегрированные копии генов человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) и стабильно секретирующие рекомбинантные антитела изотипа IgA1 в культуральную жидкость. Наличие генов тяжелой и легкой цепей антитела в составе одной плазмиды позволяет осуществлять одновременную амплификацию генов легкой и тяжелой цепей рекомбинантного антитела, встроенных в геном клеток СНО, при воздействии метотрексатом.The presence in the plasmid pBiPr-ABIgA1FI6-Intht of the active DHFR gene under IRES control allows the selection and amplification of foreign sequences integrated into the genome of the CHO DG44 cell (dhfr - / - variant of the CHO-K1 cell line) in a medium containing methotrexate. The combination of transfection, selection and amplification processes allows to obtain a cell line of producers of CHO DG44 / pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, containing integrated copies of the genes of the human antibody to influenza A virus hemagglutinin (HAV) in its genome and stably secreting recombinant e IgA1 isotype antibody in the culture fluid. The presence of the antibody heavy and light chain genes in a single plasmid allows the simultaneous amplification of recombinant antibody light and heavy chain genes integrated into the genome of CHO cells when exposed to methotrexate.
Преимущество предлагаемого изобретения заключается в том, что культуры, трансфецированные плазмидой pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, значительно быстрее проходят процедуру селекции с использованием метотрексата в концентрации до 200 нМ в сравнении с культурой, трансфецированной двумя отдельными плазмидами, которой необходимы ко-трансфекция и дополнительный этап селекции с помощью добавления 500 мкг на 1 мл питательной среды селективного антибиотика генетицина (G418). Линия-продуцент СНО DG44/pBiPr-ABIgA1FI6-Intht отличается от линии клеток СНО DG44 по признакам, передаваемым последовательностями ДНК, использованными для трансфекции, т.е. является устойчивой к высоким дозам метотрексата (200 нМ), и синтезирует рекомбинантные человеческие антитела изотипа IgA1 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) с выходом до 16,7 мг/л культуральной среды. Наличие интронов позволяет достигнуть выхода 16.7 мг/л за трое суток культивирования вместо 14 в с лучае неинтронированного варианта гена тяжелой цепи.An advantage of the present invention is that cultures transfected with plasmid pBiPr-ABIgA1FI6-Intht are much faster in breeding using methotrexate at a concentration of up to 200 nM compared with a culture transfected with two separate plasmids, which require co-transfection and an additional selection step by adding 500 μg per 1 ml of the culture medium of the selective antibiotic geneticin (G418). The producing line of CHO DG44 / pBiPr-ABIgA1FI6-Intht differs from the CHO cell line DG44 in terms of the characters transmitted by the DNA sequences used for transfection, i.e. is resistant to high doses of methotrexate (200 nM), and synthesizes recombinant human antibodies of the IgA1 isotype to hemagglutinin of influenza A virus (HAV) with a yield of up to 16.7 mg / l of culture medium. The presence of introns makes it possible to achieve a yield of 16.7 mg / L in three days of cultivation instead of 14 in the beam of an unintronated version of the heavy chain gene.
Продукция антител может быть осуществлена в эукариотических клетках. Примером эукариотической клетки, пригодной для продукции полноразмерного антитела, согласно настоящему изобретению являются, но не ограничиваются ими, клетки яичников Cricetulus griseus (СНО). Фраза "клетки яичников Cricetulus griseus" означает, что указанные эукариотические клетки классифицируют как клетки яичников С.griseus (СНО) в соответствии с классификацией, известной специалисту в данной области биотехнологии. Примерами клеток яичников Cricetulus griseus (СНО), применимых в рамках настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, клетки яичников Cricetulus griseus (СНО) клетки СНО DG44 (Invitrogen).Antibody production can be carried out in eukaryotic cells. An example of a eukaryotic cell suitable for the production of a full-sized antibody according to the present invention are, but are not limited to, ovarian cells Cricetulus griseus (CHO). The phrase “Cricetulus griseus ovarian cells” means that said eukaryotic cells are classified as C. griseus ovary cells (CHO) according to a classification known to one skilled in the art of biotechnology. Examples of Cricetulus griseus ovary cells (CHO) useful in the framework of the present invention include, but are not limited to, Cricetulus griseus ovary cells (CHO) CHO DG44 cells (Invitrogen).
Предложенная рекомбинантная плазмида pBiPr-ABIgA1FI6-Intht и способ получения линии культивируемых клеток СНО, основанный на использовании рекомбинантной плазмиды pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, впервые получены авторами данного изобретения, в научной и патентной литературе не описаны. Кроме того, нуклеотидная последовательность вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела FI6 получена отличным от прототипа способом и отличается от опубликованной в прототипе, так как адаптирована для прокариотической и эукариотической экспрессии по частотам встречаемости ко донов, а также сайтам узнавания рестриктаз. Также большая часть использованных праймеров впервые разработана для получения данной плазмиды и ранее не встречались в литературе. Наличие интронов вкодирующей последовательности гена тяжелой цепи антитела позволяет повысить уровень продукции антител и сократить время культивирования.The proposed recombinant plasmid pBiPr-ABIgA1FI6-Intht and a method for producing a cultured CHO cell line based on the use of the recombinant plasmid pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, were first obtained by the authors of this invention, are not described in the scientific and patent literature. In addition, the nucleotide sequence of the variable domains of the heavy and light chains of the FI6 antibody was obtained in a different way from the prototype and differs from that published in the prototype, as it is adapted for prokaryotic and eukaryotic expression in terms of the frequency of occurrence of codons and restriction enzyme recognition sites. Also, most of the primers used were first developed to obtain this plasmid and have not previously been encountered in the literature. The presence of introns in the coding sequence of the antibody heavy chain gene allows an increase in antibody production and a reduction in cultivation time.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На Фиг. 1 показана структура плазмиды pBiPr-ABIgA1FI6-Intht. hEF1-HTLV - гибридный промотор из плазмиды pMG, состоящий из промотора фактора элонгации EF-1а и 5'-нетранслируемой области вируса Т-клеточной лейкемии человека HTLV (позиции 29-560), lidF10H - секреторный пептид тяжелой цепи антитела F10 (позиции 605-661), FI6Hv - кодирующая последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела FI6 (позиции 662-1047), IgA1-Int - содержащий интроны ген константных доменов тяжелой цепи антитела человека изотипа IgA1 (позиции 1048-2681), BGH рА - сайт полиаденилирования BGH из плазмиды pBudCE4.1 (позиции 2688-2911), CMV promoter -промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (позиции 2939-3618), HdF10L - секреторный пептид легкой цепи антитела F10 (позиции 3657-3716), FI6Lv -кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела FI6 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) (позиции 3221-3556), Lc-kappa - ген константного домена типа каппа легкой цепи антитела человека (позиции 4053-4373), EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (позиции 4462-5049), DHFR - ген дигидрофолатредуктазы (позиции 5062-5625), ТК рА -сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса (позиции 5665-5937), pUC ori - последовательность начала репликации (позиции 6299-6972), bla (AmpR) - ген резистентности к ампициллину (позиции 7114-7974), Ыа рг - промотор гена ампициллиновой резистентности bla (позиции 7969-8073), MM, NheI, XhoI, PstI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции (ММ - позиции 23, 2914, NheI - 571, 3636, XhoI - 2683, 4415, PstI - 903, 1088, 2338, 3961).In FIG. 1 shows the structure of plasmid pBiPr-ABIgA1FI6-Intht. hEF1-HTLV is a hybrid promoter from the plasmid pMG, consisting of the promoter of the elongation factor EF-1a and the 5'-untranslated region of the human T-cell leukemia virus HTLV (positions 29-560), lidF10H is the secretory peptide of the heavy chain of antibody F10 (positions 605- 661), FI6Hv is the coding sequence of the variable domain of the heavy chain of the FI6 antibody (positions 662-1047), IgA1-Int is the intron-containing constant domain gene of the heavy chain constant domain of a human antibody of the IgA1 isotype (positions 1048-2681), BGH pA is the BGH polyadenylation site from plasmid pBudCE4.1 (positions 2688-2911), CMV promoter promoter / enhancer of early qi genes human tomegalovirus (positions 2939-3618), HdF10L - secretory peptide of the light chain of the antibody F10 (positions 3657-3716), FI6Lv - coding sequence of the variable domain of the light chain of the antibody FI6 to influenza A virus hemagglutinin (HAV) (positions 3221-3556), Lc -kappa is the constant domain gene of the kappa type of the human antibody light chain (positions 4053-4373), EMCV IRES is the internal ribosome binding site (IRES) of the encephalomyocarditis virus (positions 4462-5049), DHFR is the dihydrofolate reductase gene (positions 5062-5625), TK pA signal of the herpes virus thymidine kinase polyadenylation signal (positions 5665-5937), pUC ori - p sequence of replication initiation (positions 6299-6972), bla (AmpR) - ampicillin resistance gene (positions 7114-7974), Ya pg - bla ampicillin resistance gene promoter (positions 7969-8073), MM, NheI, XhoI, PstI - sites recognition of the corresponding restriction endonucleases (MM - positions 23, 2914, NheI - 571, 3636, XhoI - 2683, 4415, PstI - 903, 1088, 2338, 3961).
На Фиг. 2 показана кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела FI6 с секреторным пептидом (двойное подчеркивание) и местами расположения праймеров (выделены курсивом). Подчеркнут сайт узнавания рестриктазы NheI. Приведена аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела FI6.In FIG. Figure 2 shows the coding sequence of the variable domain of the light chain of a FI6 antibody with a secretory peptide (double underline) and primer locations (in italics). The NheI restriction enzyme recognition site is underlined. The amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody FI6.
На Фиг. 3 показана схематическая структура промежуточной плазмиды pOpti-FI6L-MluI. CMV promoter - промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека, L -ген легкой цепи антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА), EMCV IRES -внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита, DHFR - ген дигидрофолатредуктазы, ТК рА - сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса, MluI, NheI, XhoI - сайты узнавания соответствующих рестриктаз.In FIG. 3 shows the schematic structure of the intermediate plasmid pOpti-FI6L-MluI. CMV promoter - promoter / enhancer of early human cytomegalovirus genes, L-gene of the light chain antibody for influenza A hemagglutinin virus (HAV), EMCV IRES -internal ribosome binding site (IRES) of encephalomyocarditis virus, DHFR-gene for polyhydrodynamic tyne reductase, herpes virus, MluI, NheI, XhoI - recognition sites of the corresponding restriction enzymes.
На Фиг. 4 показана кодирующая последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела FI6 с секреторным пептидом (двойное подчеркивание) и местами расположения праймеров (выделены курсивом). Подчеркнуты сайт узнавания рестриктаз NheI, PstI, Bsp120I и SacI. Приведена аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела FI6.In FIG. Figure 4 shows the coding sequence of the variable domain of the heavy chain of the FI6 antibody with a secretory peptide (double underlining) and primer locations (in italics). The restriction enzyme recognition site NheI, PstI, Bsp120I, and SacI are underlined. The amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of the antibody FI6.
На Фиг. 5 показана структура промежуточной плазмиды pcDNA3.3-FI6HG1. CMV promoter - промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека, ТК рА - сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса, FI6HG1 - ген тяжелой цепи антитела FI6 изотипа IgG1, Psv40 - промотор ранних генов вируса SV40, SV40 рА - сигнал полиаденилирования ранних генов вируса SV40, Neomycin - ген устойчивости к антибиотику генетицину, NheI, XhoI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции.In FIG. 5 shows the structure of the intermediate plasmid pcDNA3.3-FI6HG1. CMV promoter - promoter / enhancer of early human cytomegalovirus genes, TK pA - herpes virus thymidine kinase polyadenylation signal, FI6HG1 - IgG1 isotype FI6 heavy chain gene, Psv40 - SV40 early gene promoter, SV40 pA - Ne40 early viral polyadenylation signal - antibiotic resistance gene geneticin, NheI, XhoI - recognition sites of the corresponding restriction endonucleases.
На Фиг. 6 показана структура полученной промежуточной плазмиды pSK-EF1-FI6HG1-BGH. hEF1-HTLV promoter - гибридный промотор из плазмиды pMG, состоящий из промотора фактора элонгации EF-1a и 5'-нетранслируемой области вируса Т-клеточной лейкемии человека HTLV, BGH - сигнал полиаденилирования BGH из плазмиды pBudCE4.1, FI6HG1 - ген тяжелой цепи антитела FI6 изотипа IgG1, MluI, NheI, XhoI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции.In FIG. 6 shows the structure of the obtained intermediate plasmid pSK-EF1-FI6HG1-BGH. hEF1-HTLV promoter is a hybrid promoter from the plasmid pMG, consisting of the promoter of the EF-1a elongation factor promoter and the 5'-untranslated region of the human T-cell leukemia virus HTLV, BGH is the BGH polyadenylation signal from plasmid pBudCE4.1, FI6HG1 is the antibody heavy chain gene FI6 isotype IgG1, MluI, NheI, XhoI - recognition sites of the corresponding restriction endonucleases.
На Фиг. 7 показана структура полученной промежуточной плазмиды pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGH. hEF1-HTLV promoter - гибридный промотор из плазмиды pMG, состоящий из промотора фактора элонгации EF-1a и 5'-нетранслируемой области вируса Т-клеточной лейкемии человека HTLV, BGH - сигнал полиаденилирования BGH из плазмиды pBudCE4.1, FI6HA1-Int - интронированный вариант гена тяжелой цепи антитела FI6 изотипа IgA1, MluI, NheI, XhoI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции.In FIG. 7 shows the structure of the obtained intermediate plasmid pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGH. hEF1-HTLV promoter - a hybrid promoter from pMG plasmid, consisting of the promoter of the EF-1a elongation factor promoter and the 5'-untranslated region of the human T-cell leukemia virus HTLV, BGH - BGH polyadenylation signal from plasmid pBudCE4.1, FI6HA1-Int - intron variant antibody heavy chain FI6 isotype IgA1, MluI, NheI, XhoI - recognition sites of the corresponding restriction endonucleases.
На Фиг. 8 показана структура полученных плазмид pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh и pBiPr-ABIgA1FI6-Intht. hEF1-HTLV promoter - гибридный промотор из плазмиды pMG, состоящий из промотора фактора элонгации EF-1a и 5'-нетранслируемой области вируса Т-клеточной лейкемии человека HTLV, FI6HA1-Int - интронированный вариант гена тяжелой цепи антитела FI6 изотипа IgA1, BGH - сайт полиаденилирования BGH из плазмиды pBudCE4.1, CMV promoter - промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека, L - ген легкой цепи антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА), EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита, DHFR -ген дигидрофолатредуктазы, ТК рА - сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса, MluI, NheI, XhoI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции.In FIG. 8 shows the structure of the obtained plasmids pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh and pBiPr-ABIgA1FI6-Intht. hEF1-HTLV promoter - a hybrid promoter from plasmid pMG, consisting of the promoter of the elongation factor EF-1a and the 5'-untranslated region of the human T-cell leukemia virus HTLV, FI6HA1-Int - intron version of the heavy chain gene of the FI6 antibody IgA1 isotype, BGH - site BGH polyadenylation from plasmid pBudCE4.1, CMV promoter - promoter / enhancer of early human cytomegalovirus genes, L - light chain antibody gene for influenza A hemagglutinin (HAV), EMCV IRES - internal ribosome binding site (IRES) of encephalomyocarditis virus, DH dihydrofolate reductase, TC pA - polyadenyl signal herpes virus thymidine kinase, MluI, NheI, XhoI - recognition sites of the corresponding restriction endonucleases.
На Фиг. 9 показано влияние различной ориентации генов тяжелой и легкой цепей («голова-голова» и «голова-хвост») в экспрессионных плазмидах для продукции рекомбинантных антител к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) изотипа IgA1 в клеточной линии СНО DG44. IgA1 hh - pBiPr-ABIgA1FI6-hh, IgA1 ht - pBiPr-ABIgA 1FI6-ht, IgA1 Ihh - pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh, IgA1 Iht - pBiPr-ABIgA1FI6-Intht.In FIG. Figure 9 shows the effect of different orientation of the heavy and light chain genes (head-to-head and head-to-tail) in expression plasmids for the production of recombinant antibodies to influenza A virus hemagglutinin (HAV) of the IgA1 isotype in the CHO DG44 cell line. IgA1 hh - pBiPr-ABIgA1FI6-hh, IgA1 ht - pBiPr-ABIgA 1FI6-ht, IgA1 Ihh - pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh, IgA1 Iht - pBiPr-ABIgA1FI6-Intht.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
В частном варианте воплощения настоящего изобретения указанная плазмида pBiPr-ABIgA1FI6-Intht может представлять собой плазмиду, кодирующую полипептиды со свойствами тяжелой и легкой цепей человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) изотипа IgA1c молекулярной массой 2,9 Md (8,092 т.п.о.), и, например, состоять из:In a particular embodiment of the present invention, said pBiPr-ABIgA1FI6-Intht plasmid can be a plasmid encoding polypeptides with the properties of the heavy and light chains of the human anti-influenza virus hemagglutinin (HAV) IgA1c isotype with a molecular weight of 2.9 Md (8.092, etc. o.), and, for example, consist of:
фрагмента плазмиды pOptiVEC™-TOPO® длиной 4,402 т.п.о., включающего промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), обеспечивающий высокий уровень экспрессии целевых белков в клетках млекопитающих, внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV) для кэп-независимой трансляции гена ДГФР, ген ДГФР для ауксотрофной селекции трансфецированных клеток СНО DG44 и геномной амплификации стабильных клеточных линий с использованием метатрексата, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса ТК рА для правильной терминации и процессинга рекомбинантных транскриптов, сайт начала репликации в Е. coli из плазмиды pUC, ген β-лактамазы, а также следующие модификации - единичный сайт узнавания рестриктазы MluI вместо сайта узнавания рестриктазы SalI в положении 23, единичные сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI после промотора CMV для клонирования кДНК легкой цепи антитела;a fragment of the pOptiVEC ™ -TOPO® plasmid with a length of 4.402 kb, including a promoter / enhancer of early human cytomegalovirus (CMV) genes, providing a high level of expression of target proteins in mammalian cells, an internal ribosome binding site (IRES) of the encephalomyocarditis virus (EMCV) for cap-independent translation of the DHFR gene, the DHFR gene for auxotrophic selection of transfected CHO DG44 cells and the genomic amplification of stable cell lines using metatrexate, the herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation TA pA signal for correct termination and processing of recombinant transcripts, the site of initiation of replication in E. coli from the pUC plasmid, β-lactamase gene, as well as the following modifications - a single MluI restriction enzyme recognition site instead of the SalI restriction enzyme recognition site at position 23, single NheI and XhoI restriction enzyme recognition sites after CMV promoter for cloning antibody light chain cDNA;
NheI/XhoI - фрагмента ДНК длиной 0,779 т.п.о., включающего фланкированную сайтами рестрикции NheI и XhoI кДНК легкой каппа цепи человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА);NheI / XhoI - 0.779 kbp DNA fragment, flanked by the restriction sites NheI and XhoI cDNA of the kappa light chain of the human anti-influenza A virus hemagglutinin (HAV) antibody;
MluI/MluI - фрагмента ДНК длиной 2,891 т.п.о., включающего гибридный промотор hEF1-HTLV из плазмиды pMG, интронированный вариант гена тяжелой цепи человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) изотипа IgA1 и сигнал полиаденилирования гена фактора роста быка BGH polyA из плазмиды pBudCE4.1. Фрагмент ориентирован так, что транскрипция с промоторов hEF1-HTLV и CMV идет однонаправленно.MluI / MluI - 2.891 kbp DNA fragment, comprising the hEF1-HTLV hybrid promoter from pMG plasmid, an intron version of the human influenza A virus hemagglutinin (HAV) IgA1 isotype IgG1 gene polyadenylation signal, and a BGH bullion growth factor gene polyadenylation signal polyA from plasmid pBudCE4.1. The fragment is oriented so that transcription from the hEF1-HTLV and CMV promoters is unidirectional.
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения полноразмерного человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) изотипа IgA1, включающий выращивание трансформированных клеток эукариот в питательной среде и выделение полученных антител из культуральной жидкости. В настоящем изобретении выращивание, накопление и очистка антител из культуральной жидкости может быть осуществлена методом, сходным с традиционными методами ферментации, когда некий белок производится с использованием трансформированных клеток.The method according to the present invention is a method for producing a full-sized human antibody to influenza A virus hemagglutinin (HAV) of IgA1 isotype, comprising growing transformed eukaryotic cells in a nutrient medium and isolating the resulting antibodies from the culture fluid. In the present invention, the growth, accumulation and purification of antibodies from the culture fluid can be carried out by a method similar to traditional fermentation methods, when a certain protein is produced using transformed cells.
Выращивание клеток эукариот осуществляют в атмосфере 8% СО2 в СО2-инкубаторе при 37°С и 96% влажности в режиме культивирования с перемешиванием в синтетических средах, таких как среда OptiCHO или среда CD DG44 (Invitrogen, USA), в течение 3-6 суток.The cultivation of eukaryotic cells is carried out in an atmosphere of 8% CO 2 in a CO 2 incubator at 37 ° C and 96% humidity in a culture mode with stirring in synthetic media, such as OptiCHO medium or CD DG44 medium (Invitrogen, USA), for 3- 6 days
После выращивания твердые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрации с использованием мембраны, а затем антитела могут быть выделены и очищены методом осаждения с солями, с использованием сульфата натрия или сульфата аммония, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и т.п.After cultivation, solid components, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration using a membrane, and then the antibodies can be isolated and purified by precipitation with salts using sodium sulfate or ammonium sulfate, affinity chromatography, ion exchange chromatography and etc.
Предложенная рекомбинантная плазмида pBiPr-ABIgA1FI6-Intht и способ получения линии культивируемых клеток СНО, основанный на использовании рекомбинантной плазмиды pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, впервые получены авторами данного изобретения, в научной и патентной литературе не описаны. Кроме того, нуклеотидная последовательность вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела FI6 получена отличным от прототипа способом и отличается от опубликованной в прототипе, так как адаптирована для прокариотической и эукариотической экспрессии по частотам встречаемости ко донов, а также сайтам узнавания рестриктаз. Также большая часть использованных праймеров впервые разработана для получения данной плазмиды и ранее не встречались в литературе.The proposed recombinant plasmid pBiPr-ABIgA1FI6-Intht and a method for producing a cultured CHO cell line based on the use of the recombinant plasmid pBiPr-ABIgA1FI6-Intht, were first obtained by the authors of this invention, are not described in the scientific and patent literature. In addition, the nucleotide sequence of the variable domains of the heavy and light chains of the FI6 antibody was obtained in a different way from the prototype and differs from that published in the prototype, as it is adapted for prokaryotic and eukaryotic expression in terms of the frequency of occurrence of codons and restriction enzyme recognition sites. Also, most of the primers used were first developed to obtain this plasmid and have not previously been encountered in the literature.
Ниже следуют примеры осуществления предлагаемого изобретения.The following are examples of the implementation of the invention.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-htExample 1. Construction of recombinant plasmid DNA pBiPr-ABIgA1FI6-ht
Пример 1a. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pOpti-FI6L-MluIExample 1a Construction of intermediate recombinant plasmid DNA pOpti-FI6L-MluI
Кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела FI6 [Corti D., Voss J., Gamblin S.J., Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., Silacci C, Fernandez-Rodriguez B.M., Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire L.F., Temperton N., Langedijk J.P., Skehel J.J. and Lanzavecchia A. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. // Science 333 (6044), 850-856 (2011). PUBMED 21798894] была составлена исходя из аминокислотной последовательности легкой цепи антитела FI6, частот встречаемости кодонов в прокариотах и эукариотах и наличия сайтов узнавания рестриктаз. Для получения кодирующей последовательности используются частично перекрывающиеся олигонуклеотидные праймеры (структура праймеров приведена в Таблице 1). Расположение праймеров на нуклеотидной последовательности вариабельного домена легкой цепи антитела FI6 приведено на Фиг. 2). Данные олигонуклеотидные праймеры (кроме CMV forward и EMCV IRES reverse М) разработаны для получения составленной последовательности и ранее в литературе не встречались. Олигонуклеотиды (FI6LF1 и FI6LR1, FI6LF2 и FI6LR2, FI6LF3 и FI6LR3, FI6LF4 и FI6LR4, FI6LF5 и FI6LR5) попарно смешивают в эквимолярных количествах и проводят ПЦР с полимеразой Pfu с циклом (94°С - 2 min, потом 25 циклов: 94°С - 30 сек, 40°С - 40 сек, 72°С - 40 сек). В первом раунде достраивают комплементарные концы дуплексов. Во втором раунде достроенные олигонуклеотиды смешивают и используют в качестве матрицы для ПЦР с концевыми праймерами FI6LF7 и FI6LR5 (с полимеразой Pfu, цикл амплификации тот же), получая фрагмент LvT (354 пары оснований).The coding sequence of the variable domain of the light chain of the antibody FI6 [Corti D., Voss J., Gamblin SJ, Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri SG, Pinna D., Minola A., Vanzetta F., Silacci C, Fernandez-Rodriguez BM, Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire LF, Temperton N., Langedijk JP, Skehel JJ and Lanzavecchia A. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to
Праймеры CMV forward и EMCV IRES reverse M (№№14 и 15) являются коммерческими, остальные синтезированы для этой работы и ранее в литературе не встречались.The primers CMV forward and EMCV IRES reverse M (Nos. 14 and 15) are commercial, the rest are synthesized for this work and have not been previously encountered in the literature.
На матрице плазмиды pOpti-F10L-MluI [Балабашин Д.С., Зайцева-Зотова Д.С., Топорова В.А., Панина А.А., Марквичева Е.А., Свирщевская Е.В., Алиев Т.К. Способы увеличения продукции рекомбинантных антител в клеточных линиях СНО DG44 // Современные проблемы науки и образования. - 2011. - №5.] [Алиев Т.К., Балабашин Д.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Панина А.А., Топорова В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая химерное антитело против фактора некроза опухоли-альфа человека, линия экуариотических клеток - продуцент химерного антитела и способ получения химерного антитела. Патент №2555533 http://www.findpatent.ru/patent/255/2555533.html 
Кодирующую последовательность легкой цепи получают методом SOE-ПЦР на матрице фрагментов LlidT1, LvT и LcT1 с перекрывающимися концами с полимеразой Pfu со специфическими олигонуклеотидными праймерами CMV forward и EMCV IRES reverse М, при этом на 5'-конец гена вводят сайт узнавания рестриктазы NheI, а на 3'-конец - сайт XhoI. После обработки ПЦР-фрагмента соответствующими рестриктазами кодирующую последовательность легкой цепи человеческого антитела FI6 клонируют в вектор pOpti-F10L-MluI по сайтам узнавания рестриктаз NheI и XhoI.The coding sequence of the light chain is obtained by SOE-PCR on the matrix of fragments LlidT1, LvT and LcT1 with overlapping ends with Pfu polymerase with specific oligonucleotide primers CMV forward and EMCV IRES reverse M, with the NheI restriction enzyme recognition site being introduced at the 5'-end of the gene, and at the 3'-end is the XhoI site. After processing the PCR fragment with the appropriate restriction enzymes, the coding sequence of the light chain of the human antibody FI6 is cloned into the pOpti-F10L-MluI vector at the restriction enzyme recognition sites NheI and XhoI.
Отбирают плазмидные ДНК, содержащие нужный набор рестрикционных фрагментов. Определяют нуклеотидную последовательность отобранных клонов промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pOpti-FI6L-MluI секвенированием по двум цепям по методу Сэнгера. Структура полученной промежуточной плазмиды pOpti-FI6L-MI11I приведена в Фиг. 3.Plasmid DNAs containing the desired set of restriction fragments are selected. The nucleotide sequence of the selected clones of the intermediate recombinant plasmid DNA pOpti-FI6L-MluI was determined by sequencing on two chains according to the Sanger method. The structure of the obtained intermediate plasmid pOpti-FI6L-MI11I is shown in FIG. 3.
Пример 16. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмиды pAL-2T-IgA1-Int.Example 16. Construction of an intermediate recombinant plasmid pAL-2T-IgA1-Int.
Ген константного домена тяжелой цепи изотипа IgA1 находится в кластере генов иммуноглобулинов в области 14q32.33 хромосомы 14 человека и содержит три экзона и два интрона. Анализ последовательностей на наличие сайтов узнавания рестриктаз показывает, что последовательность IgA1 не содержит сайт узнавания рестриктазы SacI, что можно использовать для подстыковки гена к кодирующей последовательности вариабельного домена тяжелой цепи антитела FI6 (в конце гена FI6VHv3 А находится сайт узнавания рестриктазы SacI). Сайт SacI и последовательность CG для восстановления рамки считывания вносятся на 5'-конец кодирующей последовательности IgA1 с помощью ПЦР. Структура олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации интронированного варианта гена, приведена в Таблице 2. Все приведенные на рисунке праймеры разработаны для получения данной последовательности и ранее не встречались в литературе.The IgA1 isotype heavy chain constant domain gene is located in the cluster of immunoglobulin genes in the region 14q32.33 of
Фрагменты, содержащие интронированный вариант гена IgA1, получают одновременно с удалением сайта XhoI во втором экзоне с помощью ПЦР с полимеразой Taq на матрице хромосомной ДНК человека из двух образцов с праймерами IgAF1SacI и IgAXhoR (первая половина гена) и IgAXhoF и IgA-XhoI (вторая половина гена). Реакцию проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 95°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 2 мин; 30 циклов.Fragments containing an intron version of the IgA1 gene are obtained simultaneously with the removal of the XhoI site in the second exon using PCR with Taq polymerase on a human chromosomal DNA matrix from two samples with primers IgAF1SacI and IgAXhoR (first half of the gene) and IgAXhoF and IgA-XhoI (second half gene). The reaction is carried out in the following temperature conditions: denaturation - 95 ° C, 30 sec; annealing - 50 ° С, 40 sec; elongation - 72 ° C, 2 min; 30 cycles.
Результатом всех проведенных ПЦР-амплификаций является получение ДНК-фрагментов требуемой длины. Фрагменты выделяют из геля и клонируют в вектор pAL2-Т (Евроген, Россия). Вектор лигируют с фрагментами с помощью ДНК-лигазы фага Т4 при 12°С в течение ночи. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli штамма XL-1 Blue. Для первичного анализа используют бело-голубую селекцию. Плазмидную ДНК клонов, отобранных по наличию в продуктах ПЦР фрагментов соответствующих длин, выделяют из ночных культур и дополнительно анализируют с помощью ПЦР с теми же парами праймеров. Отобранные по наличию фрагментов соответствующих длин клоны секвенируют по методу Сэнгера. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивают с литературными данными с помощью выравнивания. Плазмидные ДНК клонов, чья нуклеотидная последовательность соответствует гену IgA1 и не содержит мутации, вызванные протеканием ПЦР, отбирают для последующей работы.The result of all PCR amplifications is the production of DNA fragments of the required length. Fragments were isolated from the gel and cloned into the pAL2-T vector (Eurogen, Russia). The vector is ligated with fragments using T4 phage DNA ligase at 12 ° C. overnight. Ligase mixture transform competent cells of E. coli strain XL-1 Blue. For the initial analysis, blue-white selection is used. Plasmid DNA of clones selected by the presence of fragments of corresponding lengths in PCR products was isolated from nocturnal cultures and further analyzed by PCR with the same primer pairs. The clones selected by the presence of fragments of the corresponding lengths are sequenced using the Sanger method. The obtained nucleotide sequences are compared with published data using alignment. Plasmid DNA of clones whose nucleotide sequence corresponds to the IgA1 gene and does not contain mutations caused by PCR are selected for subsequent work.
Объединение полученных фрагментов проводят с помощью метода SOE-PCR одновременно с удалением сайта XhoI во втором экзоне. Наличие данного сайта препятствует клонированию ДНК константных доменов в экспрессионный вектор.Combining the obtained fragments is carried out using the SOE-PCR method simultaneously with the removal of the XhoI site in the second exon. The presence of this site prevents the cloning of constant domain DNA into an expression vector.
На первом этапе проводят амплификацию половин гена по отдельности, используя в качестве матриц ДНК клонов, не содержащих артефактных нуклеотидных замен по отношению к последовательности константных доменов из баз данных. ПЦР с полимеразой Рш проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 94°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 2 мин; 30 циклов. ДНК-фрагменты требуемой длины выделяют из геля.At the first stage, half of the gene is amplified separately, using DNA clones as matrices that do not contain artifact nucleotide substitutions with respect to the sequence of constant domains from the databases. PCR with polymerase Rsh is carried out in the following temperature conditions: denaturation - 94 ° C, 30 sec; annealing - 50 ° С, 40 sec; elongation - 72 ° C, 2 min; 30 cycles. DNA fragments of the desired length are isolated from the gel.
На втором этапе выделенные ПЦР-фрагменты, полученные на первом этапе, смешивают и амплифицируют с использованием концевых олигонуклеотидных праймеров IgAF1SacI и IgA-XhoI, фланкирующих интронированный вариант гена изотипа IgA1. Реакцию с помощью полимеразы Taq проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 95°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 2 мин; 30 циклов. В итоге получают ДНК-фрагмент длиной 1,653 т.п.о., кодирующий полноразмерный константный домен IgA1.In the second stage, the isolated PCR fragments obtained in the first stage are mixed and amplified using the terminal oligonucleotide primers IgAF1SacI and IgA-XhoI flanking the intron version of the IgA1 isotype gene. The reaction using Taq polymerase is carried out in the following temperature conditions: denaturation - 95 ° C, 30 sec; annealing - 50 ° С, 40 sec; elongation - 72 ° C, 2 min; 30 cycles. As a result, a DNA fragment of 1.653 kbp was obtained, encoding the full-size constant domain of IgA1.
Фрагмент выделяют из геля и клонируют в вектор pAL2-T. Вектор лигируют с фрагментом с помощью ДНК-лигазы фага Т4 при 12°С в течение ночи. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli штамма XL-1 Blue. Для первичного анализа используют бело-голубую селекцию. Колонии анализируют с помощью ПЦР с праймерами M13/pUC-46F и M13/pUC-46R, внешними к вставке. Структура олигонуклеотидных праймеров приведена в Таблице 3. Плазмидную ДНК отобранных по наличию фрагмента длиной 1,922 т.п.о. клонов выделяют из ночных культур и анализируют с помощью ПЦР с праймерами IgAF1SacI и IgA-XhoI. Кроме того, плазмидную ДНК клонов дополнительно анализируют с помощью рестрикции с рестриктазами SacI и XhoI.The fragment is isolated from the gel and cloned into the pAL2-T vector. The vector is ligated to the fragment using T4 phage DNA ligase at 12 ° C. overnight. Ligase mixture transform competent cells of E. coli strain XL-1 Blue. For the initial analysis, blue-white selection is used. Colonies were analyzed by PCR with primers M13 / pUC-46F and M13 / pUC-46R, external to the insert. The structure of the oligonucleotide primers is shown in Table 3. Plasmid DNA selected by the presence of a fragment length of 1.922 kb clones were isolated from overnight cultures and analyzed by PCR with primers IgAF1SacI and IgA-XhoI. In addition, the plasmid DNA of the clones is further analyzed by restriction with restriction enzymes SacI and XhoI.
Отобранные положительные клоны секвенируют по Сэнгеру в области вставки по двум цепям. Проведенный гомологичный анализ нуклеотидных последовательностей с целью обнаружения в последовательностях отдельных клонов артефактных мутаций, вызванных протеканием ПЦР, позволяет идентифицировать плазмидные ДНК, в которых последовательность константного домена полностью соответствует завленной в базе данных Genbank.The selected positive clones are sequenced according to Sanger in the insertion region on two chains. A homologous analysis of nucleotide sequences in order to detect artifact mutations in the sequences of individual clones caused by PCR allows the identification of plasmid DNAs in which the sequence of the constant domain is fully consistent with that entered in the Genbank database.
Таким образом, из хромосомной ДНК человека получают и клонируют содержащий интроны вариант гена константного домена иммуноглобулина изотипа IgA1.Thus, from the human chromosomal DNA, an intron variant of the immunoglobulin constant domain gene of the IgA1 isotype is obtained and cloned.
Все приведенные праймеры разработаны для получения данной последовательности и ранее не встречались в литературе.All of these primers are designed to obtain this sequence and have not previously been encountered in the literature.
Пример 1в. Конструирование промежуточных плазмид pcDNA3.3-FI6HG1, pSK-EF1-FI6HG1 -BGH и pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGHExample 1c. Construction of intermediate plasmids pcDNA3.3-FI6HG1, pSK-EF1-FI6HG1 -BGH and pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGH
Кодирующую последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела FI6 [Corti D., Voss J., Gamblin S J., Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., Silacci C, Fernandez-Rodriguez B.M., Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire L.F., Temperton N., Langedijk J.P., Skehel J.J. and Lanzavecchia A. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. // Science 333 (6044), 850-856 (2011). PUBMED 21798894] составляют исходя из аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела FI6, частот встречаемости кодонов в прокариотах и эукариотах и наличия сайтов узнавания рестриктаз. Для получения кодирующей последовательности используют частично перекрывающиеся олигонуклеотидные праймеры (структура праймеров приведена в Таблице 4, расположение праймеров на нуклеотидной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи антитела FI6 приведено на Фиг. 4). Все приведенные праймеры разработаны для получения данной последовательности и ранее не встречались в литературе. Олигонуклеотиды попарно (FI6HF1 и FI6HR1, FI6HF2 и FI6HR2, FI6HF3 и FI6HR3, FI6HF4 и FI6HR4, FI6HF5 и FI6HR5, FI6HF6 и FI6HR6) смешивают в эквимолярных количествах и проводят ПЦР с полимеразой Рш с циклом (94°С - 2 min, потом 25 циклов: 94°С - 30 сек, 40°С - 40 сек, 72°С - 40 сек). В первом раунде достраивают комплементарные концы дуплексов. Во втором раунде достроенные олигонуклеотиды смешивают и используют в качестве матрицы для ПЦР с концевыми праймерами FI6HF7 и FI6HR6 (реакцию проводят с полимеразой Pfu, цикл тот же), получая фрагмент HvT (474 пары оснований), содержащий кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи FI6 и сайт узнавания рестриктазы Bsp120I на 3'-конце.FI6 antibody heavy chain variable domain coding sequence [Corti D., Voss J., Gamblin S J., Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri SG, Pinna D., Minola A., Vanzetta F., Silacci C, Fernandez-Rodriguez BM, Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire LF, Temperton N., Langedijk JP, Skehel JJ and Lanzavecchia A. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to
Все приведенные праймеры разработаны для получения данной последовательности и ранее не встречались в литературе.All of these primers are designed to obtain this sequence and have not previously been encountered in the literature.
На матрице плазмиды pcDNA3.3-H [Балабашин Д.С., Зайцева-Зотова Д.С., Топорова В.А., Панина А.А., Марквичева Е.А., Свирщевская Е.В., Алиев Т.К. Способы увеличения продукции рекомбинантных антител в клеточных линиях СНО DG44 // Современные проблемы науки и образования. - 2011. - №5.] [Алиев Т.К., Балабашин Д.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Панина А.А., Топорова В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая химерное антитело против фактора некроза опухоли-альфа человека, линия экуариотических клеток - продуцент химерного антитела и способ получения химерного антитела. Патент №2555533 http://vvww.findpatent.ru/patent/255/2555533.html
Далее из полученной промежуточной плазмиды pcDNA3.3-FI6HG1 вырезают фрагмент NheI-XhoI, содержащий секреторный пептид тяжелой цепи антитела F10, кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи FI6 и полноразмерную константную область IgG1, и клонируют в пред обработанную теми же рестриктазами плазмиду pSK+/hEF1-HTLV-BGH [Алиев Т.К., Балабашин Д.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Панина А.А., Топорова В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая химерное антитело против фактора некроза опухоли-альфа человека, линия экуариотических клеток - продуцент химерного антитела и способ получения химерного антитела. Патент №2555533 http://vvww.findpatent.ru/patent/255/2555533.html
Отбирают плазмидные ДНК, содержащие нужный набор рестрикционных фрагментов. Определяют нуклеотидную последовательность отобранных клонов промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pSK-EF1-FI6HG1-BGH секвенированием по двум цепям по методу Сэнгера. Структура полученной промежуточной плазмиды pSK-EF1-FI6HG1-BGH приведена в Фиг. 6.Plasmid DNAs containing the desired set of restriction fragments are selected. The nucleotide sequence of the selected clones of the intermediate recombinant plasmid DNA pSK-EF1-FI6HG1-BGH is determined by sequencing on two chains using the Sanger method. The structure of the obtained intermediate plasmid pSK-EF1-FI6HG1-BGH is shown in FIG. 6.
Для получения кодирующей области вариабельного домена тяжелой цепи FI6 из полученной промежуточной плазмиды pcDNA3.3-FI6HGl вырезают фрагмент NheI-SacI, содержащий секреторный пептид тяжелой цепи антитела F10 и кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи FI6.To obtain the coding region of the variable domain of the heavy chain of FI6 from the obtained intermediate plasmid pcDNA3.3-FI6HGl cut out the NheI-SacI fragment containing the secretion peptide of the heavy chain of the antibody F10 and the coding sequence of the variable region of the heavy chain of FI6.
Также полученную промежуточную плазмиду pAL-2T-IgA1-Int обрабатывают рестриктазами SacI и XhoI. Продукты реакции разделяют в 1% агарозном геле. Фрагмент IgA1-Int / SacI-Sfr274I длиной 1,636 т.п.о., содержащий интронированный вариант кодирующей последовательности константной области изотипа IgA1, вырезают и выделяют из геля для последующих лигирований.Also, the resulting intermediate plasmid pAL-2T-IgA1-Int was digested with restriction enzymes SacI and XhoI. The reaction products are separated on a 1% agarose gel. A 1.636 kb IgA1-Int / SacI-Sfr274I fragment containing an intron version of the coding sequence of the constant region of the IgA1 isotype is excised and isolated from the gel for subsequent ligation.
Для подстыковки кодирующих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи антитела FI6 и константной области IgA1 фрагменты NheI-SacI из плазмиды pcDNA3.3-FI6HGl и SacI-XhoI из плазмиды pAL-2T-IgA1-Int клонируют в предобработанную рестриктазами NheI и XhoI плазмиду pSK+/hEF1-HTLV-BGH. Вектор лигируют с фрагментами с помощью ДНК-лигазы фага Т4 при 12°С в течение ночи. Лигазными смесями трансформируют компетентные клетки E.coli штамма XL-1 Blue. Колонии анализируют с помощью ПЦР с праймерами EF-1F и FI6HR4. Плазмидную ДНК отобранных по наличию и длине фрагмента клонов выделяют из ночных культур и анализируют с помощью ПЦР с праймерами IgAF1SacI и IgA-XhoI. Кроме того, плазмидную ДНК клонов дополнительно анализируют с помощью рестрикции с рестриктазой SacI. Отбирают плазмидные ДНК, содержащие нужный набор рестрикционных фрагментов. Определяют нуклеотидную последовательность отобранных клонов промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGH секвенированием по двум цепям по методу Сэнгера. Структура полученной промежуточной плазмиды pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGH приведена в Фиг. 7.To dock the coding sequences of the variable region of the heavy chain of the FI6 antibody and the IgA1 constant region, NheI-SacI fragments from the plasmid pcDNA3.3-FI6HGl and SacI-XhoI from the plasmid pAL-2T-IgA1-Int are cloned into the NheI and pS1-h1EF restriction enzyme HTLV-BGH. The vector is ligated with fragments using T4 phage DNA ligase at 12 ° C. overnight. Ligase mixtures transform competent cells of E. coli strain XL-1 Blue. Colonies were analyzed by PCR with primers EF-1F and FI6HR4. Plasmid DNA selected by the presence and length of a fragment of clones was isolated from overnight cultures and analyzed by PCR with primers IgAF1SacI and IgA-XhoI. In addition, the plasmid DNA of the clones is further analyzed by restriction with SacI restriction enzyme. Plasmid DNAs containing the desired set of restriction fragments are selected. The nucleotide sequence of the selected clones of the intermediate recombinant plasmid DNA pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGH is determined by sequencing on two chains using the Sanger method. The structure of the obtained intermediate plasmid pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGH is shown in FIG. 7.
Пример 1 г. Конструирование рекомбинантной плазмиды pBiPr-ABIgA1FI6-InthtExample 1 g. Construction of the recombinant plasmid pBiPr-ABIgA1FI6-Intht
Рекомбинантную плазмидную ДНК pOpti-FI6L-MluI обрабатывают рестриктазой MluI и дефосфорилируют с помощью фосфатазы CIAP, из полученного гидролизата выделяют линеаризованную плазмидную ДНК длиной 5,201 т.п.о. после электрофоретического разделения в 0,8%-ном агарозном геле.The recombinant plasmid DNA pOpti-FI6L-MluI was digested with restriction enzyme MluI and dephosphorylated with CIAP phosphatase, a linearized plasmid DNA of 5.201 kb was isolated from the resulting hydrolyzate. after electrophoretic separation in a 0.8% agarose gel.
Промежуточную рекомбинантную плазмидную ДНК pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGH обрабатывают рестриктазой MluI, из полученного гидролизата выделяют фрагмент ДНК длиной 2,891 т.п.о. после электрофоретического разделения в 1%-ном агарозном геле.The intermediate recombinant plasmid DNA pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGH is treated with restriction enzyme MluI, a DNA fragment of 2.891 kb in length is isolated from the obtained hydrolyzate. after electrophoretic separation in 1% agarose gel.
Векторную часть плазмидной ДНК pOpti-FI6L-MluI/MluI длиной 5,201 т.п.о. и MluI/MluI - фрагмент ДНК длиной 2,891 т.п.о., включающий в себя гибридный промотор hEF1-HTLV из плазмиды pMG, интронированный вариант гена тяжелой цепи человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) изотипа IgA1 с лидерным пептидом антитела F10 и сигнал полиаденилирования гена фактора роста быка BGH из плазмиды pBudCE4.1, сшивают при помощи лигазной реакции и клонируют.The vector part of plasmid DNA pOpti-FI6L-MluI / MluI with a length of 5.201 kb and MluI / MluI, a 2.891 kbp DNA fragment comprising the hEF1-HTLV hybrid promoter from pMG plasmid, an intron version of the human influenza A virus hemagglutinin (HAV) IgA1 isotype antibody gene leader antibody F10 peptide and the polyadenylation signal of the BGH bovine growth factor gene from plasmid pBudCE4.1, crosslinked by ligase reaction and cloned.
Вектор лигируют с фрагментами с помощью ДНК-лигазы фага Т4 при 12°С в течение ночи. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli штамма XL-1 Blue. Колонии анализируют с помощью ПЦР с полимеразой Taq с праймерами EF-1F и FI6HR4. Реакцию проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 95 С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 1 мин; 30 циклов. Продукты реакции разделяют в 1% агарозном геле. Плазмидную ДНК отобранных по наличию и длине фрагмента клонов выделяют из ночных культур и анализируют с помощью рестрикции по наличию двух сайтов узнавания рестриктазы MluI (наличие в продуктах реакции фрагмента ДНК длиной 2,891 т.п.о.).The vector is ligated with fragments using T4 phage DNA ligase at 12 ° C. overnight. Ligase mixture transform competent cells of E. coli strain XL-1 Blue. Colonies were analyzed by Taq polymerase PCR with primers EF-1F and FI6HR4. The reaction is carried out in the following temperature conditions: denaturation - 95 C, 30 sec; annealing - 50 ° С, 40 sec; elongation - 72 ° C, 1 min; 30 cycles. The reaction products are separated on a 1% agarose gel. Plasmid DNA of clones selected by the presence and length of the fragment is isolated from overnight cultures and analyzed by restriction by the presence of two MluI restriction enzyme recognition sites (the presence of a 2.891 kb DNA fragment in the reaction products).
Кроме того, плазмидную ДНК клонов дополнительно анализируют с помощью рестрикции с рестриктазами NheI и XhoI (появление второго сайта узнавания рестриктаз свидетельствует о наличии вставки).In addition, the plasmid DNA of the clones is further analyzed by restriction with restriction enzymes NheI and XhoI (the appearance of a second restriction enzyme recognition site indicates the presence of an insert).
Пример 1д. Определение взаимной ориентации генов тяжелой и легкой цепей в полученной рекомбинантной плазмиде pBiPr-ABIgA1FI6-InthtExample 1d Determination of the mutual orientation of the heavy and light chain genes in the obtained recombinant plasmid pBiPr-ABIgA1FI6-Intht
Встраивание фрагментов MluI-MluI в плазмиду pOpti-FI6L-MluI возможно в двух ориентациях: «голова-хвост» (ht), когда транскрипция генов тяжелой и легкой цепей антитела осуществляется в одном направлении, и «голова-голова» (hh), когда транскрипция разнонаправленная. Ориентацию встроенных MluI-MluI-фрагментов, включающих в себя гибридный промотор hEF1-HTLV из плазмиды pMG, интронированный вариант гена тяжелой цепи человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) изотипа IgA1 с лидерным пептидом антитела F10 и сигнал полиаденилирования гена фактора роста быка BGH рА из плазмиды pBudCE4.1, определяют с помощью метода ПЦР с полимеразой Taq с олигонуклеотидными праймерами CMVrev1, BGHF и HTLV-R (праймеры в смесь добавляют в эквимолярном соотношении, состав праймеров приведен в Таблице 5). Реакцию проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 95°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 1 мин; 30 циклов. Продукты реакции разделяют в 1% агарозном геле. Кроме того, проводят аналогичный ПЦР с праймерами Opti4319, BGHF и HTLV-R. Условия реакции те же.The insertion of MluI-MluI fragments into the pOpti-FI6L-MluI plasmid is possible in two orientations: head-tail (ht) when the antibody heavy and light chain genes are transcribed in one direction, and head-head (hh) when transcription is multidirectional. Orientation of the inserted MluI-MluI fragments, including the hEF1-HTLV hybrid promoter from the pMG plasmid, the intron version of the human influenza A hemagglutinin antibody (HAV) IgA1 isotype antibody with the F10 antibody leader peptide and the BGH polyadenylation signal pA from plasmid pBudCE4.1, determined by PCR method with Taq polymerase with oligonucleotide primers CMVrev1, BGHF and HTLV-R (primers are added to the mixture in an equimolar ratio, the composition of the primers is shown in Table 5). The reaction is carried out in the following temperature conditions: denaturation - 95 ° C, 30 sec; annealing - 50 ° С, 40 sec; elongation - 72 ° C, 1 min; 30 cycles. The reaction products are separated on a 1% agarose gel. In addition, carry out a similar PCR with primers Opti4319, BGHF and HTLV-R. The reaction conditions are the same.
Дополнительно плазмидную ДНК клонов анализируют с помощью обработки рестриктазами NheI и XhoI (появление второго сайта узнавания рестриктаз свидетельствует о наличии вставки), а также PstI. Продукты реакции разделяют в 1% агарозном геле. Длины получаемых фрагментов приведены в Таблице 6.Additionally, the plasmid DNA of the clones is analyzed by treatment with restriction enzymes NheI and XhoI (the appearance of a second restriction enzyme recognition site indicates the presence of an insert), as well as PstI. The reaction products are separated on a 1% agarose gel. The lengths of the resulting fragments are shown in Table 6.
Окончательно структуру рекомбинантных плазмидных ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-Intht и pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh подтверждают определением нуклеотидной последовательности секвенированием по методу Сэнгера с олигонуклеотидными праймерами pOpti-4319-4343 и CMVrev1 (состав праймеров приведен в Таблице 5). Структура полученных плазмид pBiPr-ABIgA1FI6-Intht и pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh приведена в Фиг. 8.Finally, the structure of the recombinant plasmid DNA pBiPr-ABIgA1FI6-Intht and pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh is confirmed by the determination of the nucleotide sequence by sequencing using the Sanger method with oligonucleotide primers pOpti-4319-4343 and CMVrev1 (Table 5). The structure of the obtained plasmids pBiPr-ABIgA1FI6-Intht and pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh is shown in FIG. 8.
Все приведенные праймеры разработаны для получения данной последовательности и ранее не встречались в литературе.All of these primers are designed to obtain this sequence and have not previously been encountered in the literature.
Пример 2. Получение линий СНО - продуцентов мономеров IgA1 антител к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) с применением плазмид pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh и pBiPr-ABIg A1FI6-Intht.Для получения стабильного продуцента рекомбинантных антител человека проводят трансфекцию клеток яичника китайского хомячка CHODG44 dhfr - плазмидами pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh и pBiPr-ABIgA1FI6-Intht с разными направлениями транскрипции генов тяжелой (интронированный вариант) и легкой цепей (hh или ht) антител к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) изотипа IgA1. Клетки культивируют в CO2-инкубаторе при 37°С, 96% влажности и 8% CO2 в стандартной бессывороточной среде CD DG44 (Invitrogen) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 (Invitrogen). Во флаконы Эрленмейера объемом 125 мл засевают 30 мл клеточной суспензии (4,5 млн клеток) при постоянном пемешивании на орбитальном шейкере с частотой 130 об/мин и через 20-24 ч проводят трансфекцию с использованием реагента трансфецирующего реагента Lipofectamine-3000Transfection Kit (Invitrogen) согласно стандартному протоколу производителя [Lipofectamine-3000 Reagent Protocol, https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/lipofectamine3000_protocol.pdf].Example 2. Obtaining lines of CHO - producers of IgA1 monomers of antibodies to influenza A virus hemagglutinin (HAV) using plasmids pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh and pBiPr-ABIg A1FI6-Intht. To obtain a stable producer of recombinant human antibodies, transfection of Chinese ovary CHD 44 cells is performed. - plasmids pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh and pBiPr-ABIgA1FI6-Intht with different directions of transcription of the heavy (intron version) and light chain (hh or ht) genes of antibodies to the hemagglutinin of the influenza A virus (HAV) of IgA1 isotype. Cells were cultured in a CO2 incubator at 37 ° C, 96% humidity and 8% CO2 in standard serum-free CD DG44 medium (Invitrogen) supplemented with 200 mM L-Glutamine solution to a final concentration of 8 mM and containing 0.18% (v / v ) Pluronic F-68 (Invitrogen). 30 ml cell suspension (4.5 mln cells) are inoculated into 125 ml Erlenmeyer bottles with constant stirring on an orbital shaker at a frequency of 130 rpm and transfection is carried out using Lipofectamine-3000 Transfection Kit (Invitrogen) reagent after 20-24 hours according to the manufacturer’s standard protocol [Lipofectamine-3000 Reagent Protocol, https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/lipofectamine3000_protocol.pdf].
Плазмидную ДНК добавляют к клеткам в виде ДНК-липосомного преципитата. Преципитат готовят следующим образом: при комнатной температуре во флакон А вносят 18 мкг ДНК плазмиды в 1200 мкл среды OptiMEM (Invitrogen), перемешивают, добавляют 15 мкл реагента Freestyle MAX (Invitrogen), инкубируют от 10 до 20 минут при комнатной температуре. После инкубации перемешивают пипетированием и по каплям вносят в культуральный флакон. Культуральный флакон инкубируют при температуре 37°С, 98% влажности, в атмосфере 8% СО2 и непрерывном перемешивании 130 об/мин.Plasmid DNA is added to the cells as a DNA liposome precipitate. The precipitate is prepared as follows: at room temperature, 18 μg of plasmid DNA is added to vial A in 1200 μl of OptiMEM medium (Invitrogen), mixed, 15 μl of Freestyle MAX reagent (Invitrogen) is added, and incubated for 10 to 20 minutes at room temperature. After incubation, mix by pipetting and dropwise into the culture bottle. The culture bottle is incubated at a temperature of 37 ° C, 98% humidity, in an atmosphere of 8% CO 2 and continuous stirring 130 rpm
Через 48 ч после трансфекции клетки отмывают и помещают в ростовую среду CD OptiCHO (Invitrogen) (без тимидина и гипоксантина) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 (или среду CD OptiCHO (Invitrogen, USA) с добавлением 8 мМ L-глютамина (Gibco, USA),0.1% Pluronic F68 (Gibco, USA) с добавлением гентамицина (G418 "Gibco") в зависимости от селективного маркера) на 48 ч. Клетки инкубируют в селективной среде в течение двух недель, смену среды и поддержание концентрации клеток в среде проводят каждые трое суток.48 hours after transfection, the cells are washed and placed on OptiCHO growth medium (Invitrogen) CD (without thymidine and hypoxanthine) supplemented with 200 mM L-Glutamine solution to a final concentration of 8 mM and containing 0.18% (v / v) Pluronic F- 68 (or OptiCHO CD media (Invitrogen, USA) supplemented with 8 mM L-glutamine (Gibco, USA), 0.1% Pluronic F68 (Gibco, USA) supplemented with gentamicin (G418 Gibco) depending on the selectable marker) at 48 h. Cells are incubated in selective medium for two weeks, changing the medium and maintaining the concentration of cells in the medium is carried out every three days.
Измерение концентрации клеток и их жизнеспособности проводят с использованием 0.04% раствора трипанового синего в камере Горяева.The concentration of cells and their viability are measured using a 0.04% trypan blue solution in the Goryaev chamber.
Отбор трансфектантов с наилучшей экпрессией антител проводят с помощью клональной селекции на полутвердой среде (Semi-Solid media "Invitrogen") по предложенной методике с использованием приборов ClonePix и CloneSelect Imager фирмы "Genetix". Далее, для увеличения копийности плазмиды и повышения продукции антител применяют поэтапное увеличение концентрации метатрексата (МТХ).The selection of transfectants with the best expression of antibodies is carried out using clonal selection on a semi-solid medium (Semi-Solid media "Invitrogen") according to the proposed method using ClonePix and CloneSelect Imager devices of the company "Genetix". Further, to increase the copy number of the plasmid and increase the production of antibodies, a phased increase in the concentration of metatrexate (MTX) is used.
Кроме того, определение продуктивности измеряют с помощью иммуноферментного анализа. После трансфекции клетки инкубируют в течение 48-72 часов. В эти временные интервалы берут пробы для иммуноферментного анализа (ELISA) для определения оптимального результата трансфекции. По результатам ELISA оптимальные варианты подвергают селекции по соответствующим маркерам.In addition, the determination of productivity is measured using enzyme-linked immunosorbent assay. After transfection, cells are incubated for 48-72 hours. Samples for enzyme immunoassay (ELISA) are taken at these time intervals to determine the optimal transfection result. According to the ELISA results, the best options are subjected to selection by appropriate markers.
Через 14 дней после помещения в селективные условия в культуре остаются клетки, способные существовать без добавления в среду тимидина и гипоксантина. При достижении культурой времени удвоения популяции 24 часа производят полную замену среды на среду CD DG44, содержащей 8 мМ L-Глутамина, 0,18% Pluronic F-68, 50 нМ метотрексата.14 days after being placed in selective conditions, cells remain in the culture that can exist without the addition of thymidine and hypoxanthine to the medium. When the culture reaches a population doubling time of 24 hours, the medium is completely replaced with CD DG44 medium containing 8 mM L-Glutamine, 0.18% Pluronic F-68, 50 nM methotrexate.
Через 14 дней после помещения в среду, содержащую метотрексат, остаются только клетки, способные существовать в присутствии 50 нМ метотрексата. При достижении культурой времени удвоения популяции 24 часа производят полную замену среды на среду CD DG44, содержащую 8 мМ L-Глутамина, 0,18% (v/v) Pluronic F-68, 100 нМ метотрексата.14 days after being placed in a medium containing methotrexate, only cells that can exist in the presence of 50 nM methotrexate remain. When the culture reaches a population doubling time of 24 hours, the medium is completely replaced with CD DG44 medium containing 8 mM L-Glutamine, 0.18% (v / v) Pluronic F-68, 100 nM methotrexate.
Данную процедуру увеличения концентрации метотрексата проводят до тех пор, пока не будет достигнута устойчивость клеток к концентрации метотрексата равной 200 нМ.This procedure for increasing the concentration of methotrexate is carried out until a cell resistance to a concentration of methotrexate of 200 nM is reached.
Продуктивность измеряют с помощью иммуноферментного анализа по стандартной методике. В Фиг. 9 представлено влияние наличия и отсутствия интронов в гене тяжелой цепи, а также различного направления транскрипции генов тяжелой и легкой цепей (hh или ht) антител к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) изотипа IgA1. Результаты анализа показывают, что продукция антител изотипа IgA1 в случае интронированного варианта гена тяжелой цепи (pBiPr-ABIgA1FI6-Intht) более чем в 6 раз выше при использовании экспрессионной плазмиды с однонаправленной транскрипцей генов тяжелой и легкой цепей антител к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) («голова-хвост»), чем неинтронированного (pBiPr-ABIgA1FI6-ht), а в случае однонаправленной транскрипции (pBiPr-ABIgA1FI6-Intht) почти в 3 раза выше, чем разнонаправленной (pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh).Productivity is measured using enzyme-linked immunosorbent assay according to standard methods. In FIG. Figure 9 shows the effect of the presence and absence of introns in the heavy chain gene, as well as the different directions of transcription of the heavy and light chain genes (hh or ht) of antibodies to the hemagglutinin of influenza A virus (HAV) of the IgA1 isotype. The results of the analysis show that the production of antibodies of the IgA1 isotype in the case of the intron version of the heavy chain gene (pBiPr-ABIgA1FI6-Intht) is more than 6 times higher when using an expression plasmid with a unidirectional transcript of the heavy and light chain genes of influenza A virus hemagglutinin (HAV) antibodies (“Head-tail”) than unintended (pBiPr-ABIgA1FI6-ht), and in the case of unidirectional transcription (pBiPr-ABIgA1FI6-Intht) is almost 3 times higher than multidirectional (pBiPr-ABIgA1FI6-Inthh).
Интронированный вариант достигает уровня 16.7 мг/мл за 3 суток, в то время как неинтронированному по другим экспериментам необходимо 14 суток культивирования, чтобы достичь такого же уровня продукции.The intron version reaches the level of 16.7 mg / ml in 3 days, while the uninterested variant according to other experiments needs 14 days of cultivation to achieve the same level of production.
Пример 3. Получение, выделение и очистка белкового продукта с помощью линий клеток СНО, продуцирующих человеческие антитела изотипа IgA1 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА)Example 3. Obtaining, isolation and purification of the protein product using cell lines SNO, producing human antibodies of the IgA1 isotype to hemagglutinin of influenza A virus (HAV)
Получение белкового продукта производят в колбах Эрленмейера различного объема без рассекателей в ростовой среде CD OptiCHO (без тимидина и гипоксантина) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и 0,18% (v/v) Pluronic F-68 без добавления дополнительных количеств питательных веществ при постоянном перемешивании с частотой 135 об/мин при температуре 37°С, 96% влажности в атмосфере 8% СО2. Культивирование для получения белкового продукта производят не менее 14 дней.The protein product is produced in Erlenmeyer flasks of various volumes without dividers in OptiCHO CD growth medium (without thymidine and hypoxanthine) with the addition of 200 mM L-Glutamine solution to a final concentration of 8 mM and 0.18% (v / v) Pluronic F-68 without adding additional amounts of nutrients with constant stirring with a frequency of 135 rpm at a temperature of 37 ° C, 96% humidity in the atmosphere of 8% CO 2 . Cultivation to obtain a protein product is done for at least 14 days.
После окончания культивирования для получения продукта человеческих антител изотипа IgA1 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) полученную кондиционированную среду от культур трансфецированных клеток центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант смешивают в соотношении 4:1 с Буфером для нанесения (50 мМ Трис-HCl, рН 7.0) и наносят на подготовленную Белок А - агарозную колонку (Gibco BRL, США). При элюции используют Буфер для элюции (100 мМ глицина, рН 3,0) и Нейтрализующий буфер (1 М Трис-HCl, рН 8,0). Колонку с 2 мл Белок А-агарозы промывают 3 раза по 4 мл Буфером для нанесения. Далее наносят смесь супернатанта кондиционированной среды и Буфера для нанесения. Образец наносят при комнатной температуре с помощью перистальтического насоса. После нанесения образца колонку промывают 3 раза по 20 мл Буфером для нанесения. Смывание антител с колонки производят с помощью 6 фракций по 2 мл Буфера для элюции. К образцу добавляют Нейтрализующий буфер в соотношении 1 часть буфера на 9 частей прошедшего через колонку Буфера для элюции.After cultivation, to obtain the product of human antibodies of the IgA1 isotype to hemagglutinin of influenza A virus (HAV), the resulting conditioned medium from the cultures of transfected cells is centrifuged at 4000 rpm for 30 minutes. The supernatant is mixed in a 4: 1 ratio with Application Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.0) and applied to the prepared Protein A - agarose column (Gibco BRL, USA). For elution, an Elution Buffer (100 mM glycine, pH 3.0) and a Neutralizing Buffer (1 M Tris-HCl, pH 8.0) are used. A 2 ml column A-agarose protein is washed 3 times with 4 ml of Application buffer. Next, a mixture of conditioned medium supernatant and application buffer is applied. The sample is applied at room temperature using a peristaltic pump. After applying the sample, the column is washed 3 times with 20 ml of Application buffer. The antibody washes off the column using 6 fractions of 2 ml of Elution Buffer. A neutralizing buffer is added to the sample at a ratio of 1 part of buffer to 9 parts of elution buffer passed through the column.
Полученные образцы выделенных антител диализуют против ФСБ (фосфатно-солевой буфер, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,76 мМ KH2PO4, рН 7,4) и хранят при температуре +4°С.The obtained samples of the isolated antibodies are dialyzed against FSB (phosphate buffered saline, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 , 1.76 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4) and stored at +4 ° C.
Оценку гомогенности и степени очистки препарата проводят с использованием электрофоретического метода. Электрофорез проводят в 10%-ном полиакриламидном геле. В качестве контроля используют неокрашенный белковый маркер молекулярных весов (Fermentas, Великобритания). Перед внесением к 15 мкл образца антител добавляют 5 мкл Буфера для нанесения с 2-меркаптоэтанолом (2-МЭ) (200 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 400 мМ 2-МЭ, 4% натрия додецилсульфат, 0,01% бромофеноловый синий, 40%-ный глицерин). Образцы для внесения на гель инкубируют при температуре 95°С в течение 5 мин. Антитела наносят в Буфере для нанесения как содержащем 2-МЭ, так и в отсутствии него.Evaluation of the homogeneity and degree of purification of the drug is carried out using the electrophoretic method. Electrophoresis is carried out in a 10% polyacrylamide gel. An unpainted protein molecular weight marker (Fermentas, UK) is used as a control. Before adding to 15 μl of an antibody sample, add 5 μl of Application Buffer with 2-mercaptoethanol (2-ME) (200 mm Tris-HCl, pH 6.8, 400 mm 2-ME, 4% sodium dodecyl sulfate, 0.01% bromophenol blue, 40% glycerin). Samples for application to the gel are incubated at a temperature of 95 ° C for 5 minutes. Antibodies are applied in the buffer for applying as containing 2-ME, and in the absence of it.
Полученные образцы продукта человеческих антител изотипа IgA1 к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА)характеризуются следующими показателями:The obtained samples of the product of human antibodies of the IgA1 isotype to hemagglutinin of influenza A virus (HAV) are characterized by the following indicators:
- гомогенность препарата не менее 98% (по данным гель-электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле с денситометрией);- the homogeneity of the drug is not less than 98% (according to gel electrophoresis in a 10% polyacrylamide gel with densitometry);
- молекулярная масса - 148000 Да (по данным гель-электрофореза с белковыми маркерами молекулярных весов);- molecular weight - 148,000 Yes (according to gel electrophoresis with protein markers of molecular weights);
- молекулярная масса легкой цепи антитела 24000 Да, молекулярная масса тяжелой цепи антитела - 50000 Да (по данным гель-электрофореза с белковыми маркерами молекулярных весов).- the molecular weight of the antibody light chain is 24,000 Da, the molecular weight of the antibody heavy chain is 50,000 Da (according to gel electrophoresis with protein markers of molecular weights).
Claims (19)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152550A RU2664184C2 (en) | 2016-12-30 | 2016-12-30 | RECOMBINANT PLASMID DNA pBiIPr-ABIgA1FI6-INTHT FOR OBTAINING RECOMBINANT IGA1 ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152550A RU2664184C2 (en) | 2016-12-30 | 2016-12-30 | RECOMBINANT PLASMID DNA pBiIPr-ABIgA1FI6-INTHT FOR OBTAINING RECOMBINANT IGA1 ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016152550A3 RU2016152550A3 (en) | 2018-07-02 |
| RU2016152550A RU2016152550A (en) | 2018-07-02 |
| RU2664184C2 true RU2664184C2 (en) | 2018-08-15 |
Family
ID=62813948
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016152550A RU2664184C2 (en) | 2016-12-30 | 2016-12-30 | RECOMBINANT PLASMID DNA pBiIPr-ABIgA1FI6-INTHT FOR OBTAINING RECOMBINANT IGA1 ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2664184C2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100080813A1 (en) * | 2008-07-25 | 2010-04-01 | Institute For Research In Biomedicine | Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof |
| RU2555533C2 (en) * | 2013-05-23 | 2015-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Recombined plasmid dna coding chimeric antibody against human tumour necrosis factor-alpha, eukaryotic cell line producing chimeric antibody, and method of chimeric antibody obtainment |
-
2016
- 2016-12-30 RU RU2016152550A patent/RU2664184C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100080813A1 (en) * | 2008-07-25 | 2010-04-01 | Institute For Research In Biomedicine | Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof |
| RU2555533C2 (en) * | 2013-05-23 | 2015-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Recombined plasmid dna coding chimeric antibody against human tumour necrosis factor-alpha, eukaryotic cell line producing chimeric antibody, and method of chimeric antibody obtainment |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DAVIDE CORTI et al., A Neutralizing Antibody Selected from Plasma Cells That Binds to Group 1and Group 2 Influenza A Hemagglutinins, Science, 12 August 2011, Vol.333, pp.850-856. * |
| БАЛАБАШИН Д.С. и др., Способы увеличения продукции рекомбинантных антител в клеточных линиях CHO DG44, Современные проблемы науки и образования, 2011, No.5, стр.1-9. * |
| БАЛАБАШИН Д.С. и др., Способы увеличения продукции рекомбинантных антител в клеточных линиях CHO DG44, Современные проблемы науки и образования, 2011, No.5, стр.1-9. DAVIDE CORTI et al., A Neutralizing Antibody Selected from Plasma Cells That Binds to Group 1and Group 2 Influenza A Hemagglutinins, Science, 12 August 2011, Vol.333, pp.850-856. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016152550A3 (en) | 2018-07-02 |
| RU2016152550A (en) | 2018-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5432117B2 (en) | Recombinant expression vector element (rEVE) for enhancing expression of recombinant protein in a host cell | |
| EP1694850B1 (en) | Plasmid system for multigene expression | |
| US11046975B2 (en) | Bicistronic expression vector for antibody expression and method for producing antibody using same | |
| KR100233781B1 (en) | Production of proteins using homologous recombination | |
| EP2848687B1 (en) | Novel expression vector | |
| JP6392245B2 (en) | Production of therapeutic proteins in genetically modified mammalian cells | |
| JP2010529833A5 (en) | ||
| US20220127637A1 (en) | Transcriptional regulatory element and its use in enhancing the expression of heterologous protein | |
| US9260721B2 (en) | Expression vector and methods of producing high levels of proteins | |
| RU2555533C2 (en) | Recombined plasmid dna coding chimeric antibody against human tumour necrosis factor-alpha, eukaryotic cell line producing chimeric antibody, and method of chimeric antibody obtainment | |
| RU2656142C1 (en) | Recombinant plasmid dna pbipr-abiga1fi6-ht for obtaining recombinant immunoglobulin a igoth iga1 | |
| JP2021525548A6 (en) | Applications in enhancing transcriptional regulatory elements and their foreign protein expression | |
| RU2664184C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pBiIPr-ABIgA1FI6-INTHT FOR OBTAINING RECOMBINANT IGA1 ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN | |
| RU2671477C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA OF pBiPr-ABIgA2m1F16-ht TO OBTAIN RECOMBINANT IMMUNOGLOBULIN A OF ISOTYPE IgA2m1 | |
| EP2938726B1 (en) | Heterologous intron within a signal peptide | |
| CN113564145B (en) | Fusion protein for cytosine base editing and application thereof | |
| RU2801178C1 (en) | METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT IGA2m1 ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN IN MAMMALIAN CELLS | |
| RU2679055C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA POPTIVEC-MBP84-106-Fc ENCODING CONSTANT FRAGMENT OF HUMAN IMMUNOGLOBULIN FUSED WITH FRAGMENT OF MYELIN BASIC PROTEIN, EUKARYOTIC CELL LINES - PRODUCERS OF SPECIFIED PROTEIN AND METHOD FOR OBTAINING MBP84-106-Fc PROTEIN FOR MULTIPLE SCLEROSIS THERAPY | |
| CN111936625A (en) | Modulating lactogenic activity in mammalian cells |