RU2610689C2

RU2610689C2 - Oligonucleotide kit for diagnosis of frequent mutations in capn3 gene, responsible for waist and limb muscular dystrophy of 2a type

Info

Publication number: RU2610689C2
Application number: RU2015126217A
Authority: RU
Inventors: Александр Владимирович Поляков; Оксана Петровна Рыжкова; Ольга Анатольевна Щагина
Original assignee: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр"
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2017-02-14
Also published as: RU2015126217A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: set of oligonucleotides for detection of CAPN3 gene c.598_612del and c.550delA mutations is proposed. Both or one of these mutations occurs at least one chromosome in 81% of cases among all Russian patients with waist and limb muscular dystrophy of type 2A (PKMD 2A).

EFFECT: efficient diagnosis of the two most common mutations.

1 dwg

Description

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, конкретно к молекулярной биологии и генетике.The invention relates to the field of medicine and biotechnology, specifically to molecular biology and genetics.

Поясно-конечностные прогрессирующие мышечные дистрофии (ПКМД) - группа клинически полиморфных и генетически гетерогенных заболеваний, характеризующихся преимущественным поражением мышц тазового и плечевого поясов. Частота всех ПКМД колеблется в различных популяциях от 5 до 70 больных на 1 млн населения. Вследствие того, что белковые продукты генов, мутации в которых приводят к развитию аутосомно-рецессивных ПКМД, участвуют в одном патогенетическом процессе, клинические проявления всех генетических вариантов этой группы заболеваний характеризуются значительным сходством, что затрудняет их дифференциальную диагностику и снижает эффективность медико-генетического консультирования. Показано, что в большинстве европейских популяций наиболее распространенным генетическим вариантом ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования является 2А тип (OMIM: 253600), обусловленный мутациями в гене кальпаина 3 (CAPN3), на долю которого приходится от 30% до 40% всех случаев этой группы заболеваний (Canki-Klain N. et al (2004). Prevalence of the 550delA mutation in calpainopathy (LGMD 2A) in Croatia // Am J Med Genet - 2004 - 125A: 152-6; Duno M. et al cDNA analyses of CAPN3 enhance mutation detection and reveal a low prevalence of LGMD2A patients in Denmark // Eur J Hum Genet - 2008 - 16: 935-40).Lap-limb progressive muscular dystrophy (PCMD) is a group of clinically polymorphic and genetically heterogeneous diseases characterized by primary damage to the muscles of the pelvic and shoulder girdles. The frequency of all PCMD varies in different populations from 5 to 70 patients per 1 million of the population. Due to the fact that protein products of genes, mutations in which lead to the development of autosomal recessive PCMD, are involved in one pathogenetic process, the clinical manifestations of all genetic variants of this group of diseases are characterized by significant similarities, which complicates their differential diagnosis and reduces the effectiveness of genetic counseling. It was shown that in most European populations, the most common genetic variant of PCMD with an autosomal recessive type of inheritance is the 2A type (OMIM: 253600), caused by mutations in the calpain 3 gene (CAPN3), which account for 30% to 40% of all cases of this disease groups (Canki-Klain N. et al (2004). Prevalence of the 550delA mutation in calpainopathy (LGMD 2A) in Croatia // Am J Med Genet - 2004 - 125A: 152-6; Duno M. et al cDNA analyses of CAPN3 enhance mutation detection and reveal a low prevalence of LGMD2A patients in Denmark // Eur J Hum Genet - 2008 - 16: 935-40).

Показано, что у жителей РФ с ПКМД 2А наиболее часто встречаются мутации c.598_612del и c.550delA - обе или одна из которых встречается хотя бы на одной из хромосом в 81% случаев среди всех больных ПКМД2А (56% хромосом с мутациями) (Рыжкова О.П. и др. Клинико-генетические характеристики поясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии 2А типа // Медицинская генетика. - 2011. - Т. 10, №1: 15-21).It was shown that among residents of the Russian Federation with PCMD 2A, mutations c.598_612del and c.550delA are most common - both or one of which occurs on at least one of the chromosomes in 81% of cases among all patients with PCMD2A (56% of chromosomes with mutations) (Ryzhkova O.P. et al. Clinical and genetic characteristics of type 2A progressive muscular dystrophy type 2A // Medical Genetics. - 2011. - T. 10, No. 1: 15-21).

На сегодняшний день для детекции мутаций гена CAPN3 у больных ПКМД 2А применяются следующие методики.To date, the following methods are used to detect CAPN3 gene mutations in patients with PCMD 2A.

Метод анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP) (Fanin М. et al How to tackle the diagnosis of limb-girdle muscular dystrophy 2A. // Eur J Hum Genet. - 2009 - 17(5):598-603). Недостатки: низкая точность, высокая трудоемкость исследования, необходимость подтверждения выявленных изменений прямым автоматическим секвенированием по Сенгеру.Method for the analysis of conformational polymorphism of single-stranded DNA fragments (SSCP) (Fanin M. et al How to tackle the diagnosis of limb-girdle muscular dystrophy 2A. // Eur J Hum Genet. - 2009 - 17 (5): 598-603). Disadvantages: low accuracy, high complexity of the study, the need to confirm the detected changes by direct automatic sequencing according to Senger.

Секвенирование по Сенгеру (Saenz A. et al. LGMD2A: genotype-phenotype correlations based on a large mutation al survey on the calpain 3 gene. // Brain. - 2005 - 128(Pt 4):732-742.;

K. et al Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies in the Czech Republic. // BMC Neurol. - 2014 - Aug 19; 14:154). Недостатки: высокая стоимость исследования, трудоемкость проведения анализа, необходимость специальной высокотехнологичной аппаратуры.Sanger sequencing (Saenz A. et al. LGMD2A: genotype-phenotype correlations based on a large mutation al survey on the calpain 3 gene. // Brain. - 2005 - 128 (Pt 4): 732-742 .;

K. et al Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies in the Czech Republic. // BMC Neurol. - 2014 - Aug 19; 14: 154). Disadvantages: the high cost of the study, the complexity of the analysis, the need for special high-tech equipment.

Полногеномное/экзомное секвенирование нового поколения (NGS) (Nigro V, Savarese М. Genetic basis of limb-girdle muscular dystrophies: the 2014 update. // Acta Myol. - 2014 - May; 33(1):1-12). Недостатки: высокая стоимость исследования, трудоемкость проведения анализа, необходимость специальной высокотехнологичной аппаратуры, необходимость биоинформационной платформы для обработки результатов, необходимость проверки выявленных изменений прямым автоматическим секвенированием по Сенгеру.Full-genomic / exomic sequencing of the new generation (NGS) (Nigro V, Savarese M. Genetic basis of limb-girdle muscular dystrophies: the 2014 update. // Acta Myol. - 2014 - May; 33 (1): 1-12). Disadvantages: the high cost of the study, the complexity of the analysis, the need for special high-tech equipment, the need for a bioinformation platform for processing the results, the need to verify the detected changes by direct automatic sequencing according to Senger.

Задачей заявляемого изобретения является создание оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для анализа мутаций гена CAPN3, ответственного за ПКМД 2А исходя из частот мутаций среди пациентов в Российской Федерации.The objective of the invention is the creation of an optimal set of oligonucleotide sequences for analysis of mutations of the CAPN3 gene, responsible for PCMD 2A based on mutation frequencies among patients in the Russian Federation.

Задача решается путем создания оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для детекции мутаций c.598_612del и c.550delA гена CAPN3.The problem is solved by creating the optimal set of oligonucleotide sequences for the detection of mutations c.598_612del and c.550delA of the CAPN3 gene.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для детекции мутаций c.598_612del и c.550delA гена CAPN3 с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с визуализацией результата методом электрофореза в полиакриамидном геле.The technical result of the claimed invention is the creation of an optimal set of oligonucleotide sequences for the detection of mutations c.598_612del and c.550delA of the CAPN3 gene using multiplex polymerase chain reaction (PCR) with visualization of the result by polyacryamide gel electrophoresis.

Технический результат достигается подбором оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для мультиплексной ПЦР мутаций c.598_612del и c.550delA гена CAPN3, имеющих следующий нуклеотидный состав:The technical result is achieved by selecting the optimal set of oligonucleotide sequences for multiplex PCR mutations c.598_612del and c.550delA of the CAPN3 gene, having the following nucleotide composition:

SEQ ID NO 1 5'-GGTGAAAACCAGTTGATTGTTGTAC-3'SEQ ID NO 1 5'-GGTGAAAACCAGTTGATTGTTGTAC-3 '

SEQ ID NO 2 5'-GAACTCATTGCGGTGGTTGGAC-3'SEQ ID NO 2 5'-GAACTCATTGCGGTGGTTGGAC-3 '

SEQ ID NO 3 5'-CGTGGTTATAGATGACTGCCTGC-3'.SEQ ID NO 3 5'-CGTGGTTATAGATGACTGCCTGC-3 '.

На первом этапе на основе нуклеотидной последовательности гена CAPN3 (NCBI Reference Sequence: NM_000070.2) были подобраны три праймера SEQ ID NO 1-3. Так как мутации c.598_612del и c.550delA находятся друг от друга на расстоянии 48 н.п. для их детекции в одной реакции была подобрана одна последовательность прямого и две последовательности обратных праймеров, фланкирующих области интересующих мутаций, таким образом, чтобы продукты амплификации с нормальных и мутантных аллелей имели разницу длин, достаточную для детекции в ПААГ.In the first step, three primers of SEQ ID NO 1-3 were selected based on the nucleotide sequence of the CAPN3 gene (NCBI Reference Sequence: NM_000070.2). Since the mutations c.598_612del and c.550delA are located at a distance of 48 n.p. for their detection in one reaction, one forward sequence and two reverse primer sequences flanking regions of mutations of interest were selected, so that amplification products from normal and mutant alleles had a length difference sufficient for detection in PAAG.

Изобретение поясняется фигурой. На фигуре представлены результаты электрофоретического разделения продуктов мультиплексной ПЦР. При отсутствии в образце ДНК мутаций c.598_612del и c.550delA в ПААГ визуализируются два фрагмента с длинами 51 и 179 пар нуклеотидов (п.н.), в случае присутствия в образце мутации c.598_612del в гетерозиготном состоянии и отсутствия мутации c.550delA - три фрагмента длиной 51, 164 и 179 п.н., при наличии мутации c.598_612del в гомозиготном состоянии и отсутствии мутации c.550delA - два фрагмента 51 и 164 п.н., при мутации c. 550delA в гетерозиготном состоянии и отсутствии c.598_612del - три фрагмента длиной 50, 51 и 179 н.п., при мутации c.550delA в гомозиготном состоянии и отсутствии c.598_612del - два фрагмента длиной 50 и 179 н.п, при наличии в образце мутаций c.598_612del и c.550delA в компаунд-гетерозиготном состоянии визуализируются 4 фрамента длинами 50, 51, 164 и 179 н.п.The invention is illustrated by a figure. The figure shows the results of electrophoretic separation of multiplex PCR products. In the absence of c.598_612del and c.550delA mutations in the DNA sample, two fragments with 51 and 179 nucleotide pairs (bp) are visualized in the SDS page, in the presence of the c.598_612del mutation in the heterozygous state in the sample and the absence of the c.550delA mutation - three fragments 51, 164 and 179 bp long, in the presence of the c.598_612del mutation in the homozygous state and in the absence of the c.550delA mutation - two fragments 51 and 164 bp, in the c mutation. 550delA in the heterozygous state and the absence of c.598_612del — three fragments 50, 51 and 179 bp in length, with c.550delA mutation in the homozygous state and c.598_612del absence — two fragments 50 and 179 bp in length the mutations c.598_612del and c.550delA in the compound heterozygous state are visualized 4 fragments with lengths of 50, 51, 164 and 179 n.p.

Для проведения молекулярно-генетического исследования ДНК выделяется из лимфоцитов периферической крови человека с использованием набора реактивов выделения DNA Prep 100 (DIAtom™) по протоколу производителя. Для приготовления растворов, необходимых для проведения ПЦР, использовались импортные реагенты высокой степени очистки. Последовательности олигонуклеотидных праймеров были синтезированы ЗАО «Евроген», г. Москва. Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) в объеме 25 μl реакционной смеси следующего состава: 20-100 нг геномной ДНК; по 0.25 μМ каждого оригинального олигопраймера (SEQ ID NO: 1-3); по 200 μМ каждого нуклеозидтрифосфата; 1,0 единица активности ДНК-полимеразы Biotaq («БиоМастер»); буфер для ПЦР (67 mM Tris-HCl; 16.6 mM (NH₄)₂SO₄; 0.01% Twin-20; рН 8.8); 6,0 mM MgCl₂; 20-30 μl минерального масла.For molecular genetic studies, DNA is isolated from human peripheral blood lymphocytes using the DNA Prep 100 (DIAtom ™) isolation reagent kit according to the manufacturer's protocol. To prepare the solutions necessary for PCR, imported highly purified reagents were used. The sequences of oligonucleotide primers were synthesized by CJSC Evrogen, Moscow. Amplification of all the studied DNA fragments was carried out by PCR on a programmable thermal cycler MS2 of the DNA Technology company (Russia) in a volume of 25 μl of a reaction mixture of the following composition: 20-100 ng of genomic DNA; 0.25 μM of each original oligoprimer (SEQ ID NO: 1-3); 200 μM of each nucleoside triphosphate; 1.0 unit of Biotaq DNA polymerase activity (“BioMaster”); PCR buffer (67 mM Tris-HCl; 16.6 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ; 0.01% Twin-20; pH 8.8); 6.0 mM MgCl ₂ ; 20-30 μl of mineral oil.

Параметры ПЦР были следующие: денатурация двухцепочечной ДНК при t=94°C в течение 5 минут, далее 30 циклов полимеразной цепной реакции t=94°C - 30 секунд, t=65°C - 30 секунд, t=72°C - 30 секунд, окончательная элонгация при t=72°C в течение 5 минут.PCR parameters were as follows: denaturation of double-stranded DNA at t = 94 ° C for 5 minutes, then 30 cycles of polymerase chain reaction t = 94 ° C for 30 seconds, t = 65 ° C for 30 seconds, t = 72 ° C for 30 seconds, final elongation at t = 72 ° C for 5 minutes.

Визуализацию результатов ПЦР производили в 10% геле с соотношением акриламида (АА) и бисакриламида (БА) 19:1. Для заливки 10% ПААГ готовили раствор следующего состава: 16,7 мл 30%-ного раствора АА и БА; 5 мл 10xTBE; 28,3 мл дистиллированной воды. Непосредственно перед заливкой геля в раствор добавляли 400 мкл 10%-ного персульфата амония и 48 мкл ТЕМЕД. В качестве электрофорезного буфера использовали 1xTBE. Проводили префорез в течение 20 мин. Пробы для нанесения на гель готовились следующим образом: 10 мкл смеси после ПЦР-реакции смешивали с 2 мкл буфера для нанесения. Состав буфера для нанесения проб: 25% бромфенолового синего; 25% ксилолцианола; 30% глицерина; 20% дистиллированной воды. Проводили электрофорез при 15-18 В/см в течение 3 часов. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага λ, рестрицированную PstI.Visualization of the PCR results was carried out in a 10% gel with a ratio of acrylamide (AA) and bisacrylamide (BA) 19: 1. For pouring 10% PAG, a solution of the following composition was prepared: 16.7 ml of a 30% solution of AA and BA; 5 ml 10xTBE; 28.3 ml of distilled water. Immediately before pouring the gel, 400 μl of 10% ammonium persulfate and 48 μl of TEMED were added to the solution. As electrophoresis buffer used 1xTBE. Conducted prephoresis for 20 minutes Samples for gel application were prepared as follows: 10 μl of the mixture after PCR reaction was mixed with 2 μl of application buffer. Sample buffer composition: 25% bromophenol blue; 25% xylene cyanol; 30% glycerol; 20% distilled water. Electrophoresis was carried out at 15-18 V / cm for 3 hours. PstI-restricted phage DNA was used as a molecular weight marker.

После разделения фрагментов гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,1 мкг/мл в 1xTBE) в течение 20 минут, промывали водой. Результаты исследования регистрировались на гель-документирующей системе GelDoc® 2000.After fragment separation, the gel was stained in a solution of ethidium bromide (0.1 μg / ml in 1xTBE) for 20 minutes, washed with water. The results of the study were recorded on a gel-documenting system GelDoc® 2000.

Таким образом, представленный материал показывает, что предлагаемый способ позволяет эффективно детектировать две наиболее частые мутации c.598_612del и c.550delA гена CAPN3, обе или одна из которых встречается хотя бы на одной из хромосом в 81% случаев среди всех больных ПКМД2А. Применение данного изобретения позволяет оптимизировать молекулярно-генетическую диагностику поясно-конечностных мышечных дистрофий. Низкая себестоимость и простота исследования позволяют применять данный способ детекции практически в любой ПЦР-лаборатории с минимальным набором оборудования и реактивов.Thus, the presented material shows that the proposed method can effectively detect the two most frequent mutations c.598_612del and c.550delA of the CAPN3 gene, both or one of which occurs on at least one of the chromosomes in 81% of cases among all patients with PCMD2A. The use of this invention allows to optimize the molecular genetic diagnosis of waist-limb muscle dystrophy. The low cost and simplicity of the study allow the use of this detection method in almost any PCR laboratory with a minimum set of equipment and reagents.

ПЕРЕЧЕНЬ НУКЛЕОТИДОВLIST OF NUCLEOTIDES

Claims

A set of oligonucleotides for the detection of mutations c.598_612del and c.550delA of the CAPN3 gene, both or one of which occurs on at least one of the chromosomes in 81% of cases among all Russian patients with PCMD2A, where the oligonucleotide sequences have the following nucleotide composition:

SEQ ID NO 1 5'-GGTGAAAACCAGTTGATTGTTGTAC-3 '

SEQ ID NO 2 5'-GAACTCATTGCGGTGGTTGGAC-3 '

SEQ ID NO 3 5'-CGTGGTTATAGATGACTGCCTGC-3 '.