RU2563989C1

RU2563989C1 - Composition for interleukine-4 cytokine gene silencing

Info

Publication number: RU2563989C1
Application number: RU2014146661/15A
Authority: RU
Inventors: Муса Рахимович Хаитов; Валерий Валерьевич Смирнов; Сергей Михайлович Андреев; Илья Викторович Сергеев; Артем Владимирович Маерле; Софья Борисовна Лобанова; Елена Владимировна Калинина; Игорь Петрович Шиловский
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2015-09-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention concerns a composition for the interleukin-4 cytokine gene silencing by means of an RNA interference mechanism, consisting of a cationic LTP peptide dendrimer described by formula (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2 used as a carrier, and two siRNA molecules described by formulas 5-UUGAUGAUCUCCUGUAAGGtt-3 and 5-AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt-3.

EFFECT: creating the low-toxic composition used for interleukin-4 gene silencing.

3 cl, 18 dwg, 14 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области медицины и генной терапии, и может быть использовано для лечения аллергической бронхиальной астмы и аллергического ринита путем регуляции генной экспрессии про-воспалительного цитокина интерлейкина-4 (IL-4).The invention relates to the field of medicine and gene therapy, and can be used to treat allergic bronchial asthma and allergic rhinitis by regulating the gene expression of the pro-inflammatory cytokine interleukin-4 (IL-4).

Предпосылками изобретения явилось следующее. Бронхиальная астма (БА) - это хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, характеризующееся приступами удушья, экспираторной одышки, кашля, свистящих хрипов и эмфиземой легких (Global Inititative for Asthma). В основе этих симптомов лежат специфические (иммунные) и неспецифические механизмы, к которым относятся нарушения равновесия между отделами вегетативной нервной системы, повышенная способность клеток отвечать высвобождением медиаторов на неспецифические стимулы создавая при этом состояние гиперреактивности различных систем организма.The background of the invention was the following. Bronchial asthma (BA) is a chronic inflammatory disease of the respiratory tract characterized by attacks of suffocation, expiratory dyspnea, coughing, wheezing, and pulmonary emphysema (Global Inititative for Asthma). These symptoms are based on specific (immune) and nonspecific mechanisms, which include imbalance between the parts of the autonomic nervous system, and the increased ability of cells to respond by the release of mediators to nonspecific stimuli, creating a state of hyperreactivity of various body systems.

Многие пациенты с астмой имеют атопию, т.е. они генетически предрасположены к синтезу антител IgE после контакта с аллергенами, такими как аллерген клещей домашней пыли, пыльца растений и перхоть животных и др. Известно, что около 60-70% случаев заболевания БА связано с атопической предрасположенностью (Humbert М., Menz G., Ying S. et al. The immunopathology of extrinsic (atopic) and intrinsic (non-atopic) asthma: more similarities than differences. Immunol. Today, 1999; 20: 528-533). Повторяющиеся контакты с такими аллергенами могут индуцировать IgE-опосредованную реакцию гиперчувствительности, которая характеризуется проницаемостью кровеносных сосудов, расширением сосудов, сокращением гладкой мускулатуры, бронхоконстрикцией и воспалением дыхательных путей. При этом, дыхательные пути астматиков подвергаются структурным изменениям (ремоделированию), с изменением в эпителии, увеличением гладкой мускулатуры, отложением белков внеклеточного матрикса и гиперплазией дыхательных путей.Many patients with asthma have atopy, i.e. they are genetically predisposed to the synthesis of IgE antibodies after contact with allergens, such as house dust mite allergen, plant pollen and animal dander, etc. It is known that about 60-70% of AD cases are associated with atopic predisposition (Humbert M., Menz G. , Ying S. et al. The immunopathology of extrinsic (atopic) and intrinsic (non-atopic) asthma: more similarities than differences. Immunol. Today, 1999; 20: 528-533). Repeated exposure to such allergens can induce an IgE-mediated hypersensitivity reaction, which is characterized by permeability of blood vessels, vasodilation, smooth muscle contraction, bronchoconstriction, and airway inflammation. At the same time, the airways of asthmatics undergo structural changes (remodeling), with a change in the epithelium, an increase in smooth muscle, deposition of extracellular matrix proteins, and airway hyperplasia.

В настоящее время астма представляет глобальную проблему здравоохранения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) на 2008 год, в мире около 300 миллионов человек, страдающих этим заболеванием, из которых примерно 5-6 млн. - в субрегионе ВОЗ Euro-C (к нему отнесена и Россия) (www.ginasthma.org). По оценкам ВОЗ, ежегодно астма обусловливает потерю 15 миллионов так называемых DALY (Disability Adjusted Life Year - дословно «год жизни, измененный или потерянный в связи с нетрудоспособностью»), что составляет 1% от общего всемирного ущерба от болезней.Asthma is currently a global health problem. According to the World Health Organization (WHO) for 2008, there are about 300 million people suffering from this disease in the world, of which about 5-6 million are in the WHO Euro-C subregion (Russia also belongs to it) (www.ginasthma. org). According to WHO estimates, asthma annually causes the loss of 15 million so-called DALYs (Disability Adjusted Life Year - literally "the year of life, changed or lost due to disability"), which is 1% of the total worldwide damage from diseases.

По данным отчета GINA (Global Initiative for Asthma) (www.ginasthma.org), страны с наибольшей распространенностью бронхиальной астмы - это Великобритания (частота бронхиальной астмы в популяции - от 18,4% до 15,3% в зависимости от региона), Новая Зеландия - 15,1%, Австралия - 14,7%, Ирландия - 14,6%, Канада - 14,1%, Перу - 13%, Тринидад и Тобаго - 12,6%, Коста-Рика - 11,9%, Бразилия - 11,4%, США - 10,9%, Фиджи - 10,5%, Парагвай - 9,7%, Уругвай - 9,5%, Израиль - 9%, Барбадос - 8,9%, Панама - 8,8%, Кувейт - 8,5%, Украина - 8,3%, Эквадор - 8,2%, ЮАР - 8,1%, Чехия - 8%, Финляндия - 8%, Мальта - 8%, Республика Берег Слоновой Кости - 7,8%, Колумбия - 7,4%, Турция - 7,4%, Кения - 7%, Германия - 6,9%, Франция - 6,8%, Норвегия - 6,8%, Япония - 6,7%, Швеция - 6,5%, Таиланд - 6,5%, Филиппины - 6,2%, ОАЭ - 6,2%, Бельгия - 6%, Австрия - 5,8%, Испания - 5,7%, Саудовская Аравия - 5,6%, Аргентина - 5,5%, Иран - 5,5%, Эстония - 5,4%, Нигерия - 5,4%, Чили - 5,1%. Распространенность астмы в России - 5-7% (Revised Global Burden of Disease (GBD) 2008).According to the GINA (Global Initiative for Asthma) report (www.ginasthma.org), the countries with the highest prevalence of bronchial asthma are the UK (the frequency of bronchial asthma in a population is from 18.4% to 15.3% depending on the region), New Zealand - 15.1%, Australia - 14.7%, Ireland - 14.6%, Canada - 14.1%, Peru - 13%, Trinidad and Tobago - 12.6%, Costa Rica - 11.9 %, Brazil - 11.4%, USA - 10.9%, Fiji - 10.5%, Paraguay - 9.7%, Uruguay - 9.5%, Israel - 9%, Barbados - 8.9%, Panama - 8.8%, Kuwait - 8.5%, Ukraine - 8.3%, Ecuador - 8.2%, South Africa - 8.1%, Czech Republic - 8%, Finland - 8%, Malta - 8%, Republic Ivory Coast - 7.8%, Colombia - 7.4%, T Russia - 7.4%, Kenya - 7%, Germany - 6.9%, France - 6.8%, Norway - 6.8%, Japan - 6.7%, Sweden - 6.5%, Thailand - 6 , 5%, Philippines - 6.2%, UAE - 6.2%, Belgium - 6%, Austria - 5.8%, Spain - 5.7%, Saudi Arabia - 5.6%, Argentina - 5.5 %, Iran - 5.5%, Estonia - 5.4%, Nigeria - 5.4%, Chile - 5.1%. The prevalence of asthma in Russia is 5-7% (Revised Global Burden of Disease (GBD) 2008).

Смертность от БА значительно варьирует в разных странах, по-видимому, не коррелируя с распространенностью этой нозологии. Так, например, в США в 2002 г. от бронхиальной астмы умерло более 4000 чел. (14 чел. на 1 млн. населения) (National Surveillance for Asthma), а в субрегионе ВОЗ SEARO-D за тот же период смертность составила почти 77000 чел. (более 59 чел. на 1 млн). По данным специалистов, в мире от астмы умирают 250 тысяч человек в год (Revised Global Burden of Disease (GBD)).Mortality from asthma varies significantly in different countries, apparently not correlating with the prevalence of this nosology. So, for example, in the USA in 2002, more than 4,000 people died from bronchial asthma. (14 people per 1 million people) (National Surveillance for Asthma), and in the WHO subregion SEARO-D over the same period, the death rate was almost 77,000 people. (more than 59 people per 1 million). According to experts, 250 thousand people a year die from asthma in the world (Revised Global Burden of Disease (GBD)).

Таким образом, БА оказывает выраженные отрицательные эффекты на общественное здоровье и экономику всего мира. В настоящее время ведутся многочисленные клинические и фундаментальные исследования, конечной целью которых является уменьшение бремени этого заболевания.Thus, BA has pronounced negative effects on public health and the economy of the whole world. Numerous clinical and fundamental studies are underway, the ultimate goal of which is to reduce the burden of this disease.

На сегодняшний день поддерживающая терапия астмы включает применение противовоспалительных лекарств, включая ингаляцию кортикостероидов, применение ингибиторов лейкотриенов (5-липоксигеназные ингибиторы и антагонисты лейкотриеновых рецепторов), и бронходилататоров. Эти препараты снижают проявления симптомов астмы и являются достаточными для лечения значительной доли пациентов, но они не воздействуют на первопричины патогенетических звеньев заболевания. Для лечения атопической БА успешно применяют аллерген-специфическую иммунотерапию (АСИТ), которая является единственным патогенетическим видом лечения атопических аллергических болезней, влияющим на саму природу заболевания. Однако АСИТ имеет ряд недостатков, основным из которых является опасность возникновения местных и системных реакций на проводимое лечение за счет сохранения B-клеточных эпитопов в препаратах нативного аллергена. B-клеточные эпитопы аллергена обусловливают IgE-опосредованное высвобождение медиаторов (гистамина, лейкотриенов и др.) из клеток-мишеней аллергии (в основном тучных клеток, базофилов крови) в основном на начальных этапах лечения, что приводит к серьезным осложнениям лечения (в ряде случаев с угрозой для жизни) примерно у 3,7% пациентов (156. Williams А.Р., Krishna М.Т., Frew A.J. The safety of immunotherapy // Clin Exp Allergy. - 2004. -34. - P. 513-514).Today, supportive asthma therapy includes the use of anti-inflammatory drugs, including inhalation of corticosteroids, the use of leukotriene inhibitors (5-lipoxygenase inhibitors and antagonists of leukotriene receptors), and bronchodilators. These drugs reduce the symptoms of asthma and are sufficient to treat a significant proportion of patients, but they do not affect the root causes of the pathogenetic links of the disease. Allergen-specific immunotherapy (ASIT), which is the only pathogenetic type of treatment for atopic allergic diseases that affect the very nature of the disease, is successfully used to treat atopic asthma. However, ASIT has a number of drawbacks, the main of which is the risk of local and systemic reactions to the treatment due to the preservation of B-cell epitopes in the native allergen preparations. Allergen B-cell epitopes cause IgE-mediated release of mediators (histamine, leukotrienes, etc.) from allergy target cells (mainly mast cells, blood basophils) mainly at the initial stages of treatment, which leads to serious treatment complications (in some cases life-threatening) in approximately 3.7% of patients (156. Williams A.R., Krishna M.T., Frew AJ The safety of immunotherapy // Clin Exp Allergy. - 2004. -34. - P. 513- 514).

Распространенность аллергического ринита в популяции человека в 3-5 раз выше, чем аллергической бронхиальной астмы, однако выявляемость данного заболевания низкая по причине редких обращений пациентов с соответствующими симптомами к врачам-специалистам. Стоит отметить, что развитие аллергической бронхиальной астмы в подавляющем большинстве случаев начинается с развития аллергического ринита, поскольку данные патологии имеют сходный молекулярный механизм. Это подтверждается и тем фактом, что 75-90% пациентов с аллергической бронхиальной астмой, страдают также и от аллергического ринита.The prevalence of allergic rhinitis in a human population is 3-5 times higher than that of allergic bronchial asthma, however, the detection of this disease is low due to rare visits by patients with relevant symptoms to specialist doctors. It is worth noting that the development of allergic bronchial asthma in the vast majority of cases begins with the development of allergic rhinitis, since these pathologies have a similar molecular mechanism. This is confirmed by the fact that 75-90% of patients with allergic bronchial asthma also suffer from allergic rhinitis.

Таким образом, разработка новых подходов к лечению и профилактике аллергической бронхиальной астмы и ринита остается актуальной задачей.Thus, the development of new approaches to the treatment and prevention of allergic bronchial asthma and rhinitis remains an urgent task.

Один из базовых подходов к лечению аллергической бронхиальной астмы и ринита это анти-IL-4 терапия, где применяются различные ингибиторы как самого IL-4, так и компонентов его сигнального пути. Еще два десятилетия назад было предположено, что IL-4 играет ключевую роль в патогенезе астмы (Steinke J.W. and Borish L. Th2 cytokines and asthma. Interleukin-4: its role in the pathogenesis of asthma, and targeting it for asthma treatment with interleukin-4 receptor antagonists // Respir. Res. 2001. V. 2. P. 66-70). Было показано, что астматики имеют повышенный уровень белка IL-4 как в сыворотке крови, так и в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) (Daher S., Santos L.М., Sole D., De Lima M.G., Naspitz С.K., Musatti C.C. Interleukin-4 and soluble CD23 serum levels in asthmatic atopic children // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 1995. V. 5. P. 251-254), а также увеличенный уровень mRNA IL-4 и самого белка в бронхиальной биопсии пациентов (Humbert М., Durham S.R., Ying S., Kimmitt P., Barkans J., Assoufi В., Pfister R., Menz G., Robinson D.S., Kay A.B., Corrigan C. J. IL-4 and IL-5 mRNA and protein in bronchial biopsies from patients with atopic and nonatopic asthma: evidence against "intrinsic" asthma being a distinct immunopathologic entity // Am. J. Respir. Crit Care Med. 1996. V. 154. P. 1497-1504). Также важным доказательством участия IL-4 в патогенезе бронхиальной астмы являлся тот факто, что аэрозольное введение IL-4 индивидуумам с легкой астмой индуцировало у них гиперреактивность бронхов (ГРБ) и эозинофилию (Shi H.Z., Deng J.M., Xu Н., Nong Z.X., Xiao C.Q., Liu Z.M., Qin S.M., Jiang H.X., Liu G.N., Chen Y.Q. Effect of inhaled interleukin-4 on airway hyperreactivity in asthmatics // Am. J. Respir. Crit Care Med. V. 157. 1998. P. 1818-1821).One of the basic approaches to the treatment of allergic bronchial asthma and rhinitis is anti-IL-4 therapy, where various inhibitors of both IL-4 itself and components of its signaling pathway are used. Two decades ago, it was suggested that IL-4 plays a key role in the pathogenesis of asthma (Steinke JW and Borish L. Th2 cytokines and asthma. Interleukin-4: its role in the pathogenesis of asthma, and targeting it for asthma treatment with interleukin- 4 receptor antagonists // Respir. Res. 2001. V. 2. P. 66-70). Asthmatics have been shown to have elevated levels of IL-4 protein both in blood serum and in bronchoalveolar lavage (BAL) (Daher S., Santos L.M., Sole D., De Lima MG, Naspitz C.K., Musatti CC Interleukin-4 and soluble CD23 serum levels in asthmatic atopic children // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 1995. V. 5. P. 251-254), as well as an increased level of IL-4 mRNA and the protein itself in bronchial biopsy of patients (Humbert M., Durham SR, Ying S., Kimmitt P., Barkans J., Assoufi B., Pfister R., Menz G., Robinson DS, Kay AB, Corrigan CJ IL-4 and IL- 5 mRNA and protein in bronchial biopsies from patients with atopic and nonatopic asthma: evidence against "intrinsic" asthma being a distinct immunopathologic entity // Am. J. Respir. Crit Care Med. 1996. V. 154. P. 1497-1504) . Another important evidence of the involvement of IL-4 in the pathogenesis of bronchial asthma was the fact that aerosol administration of IL-4 to individuals with mild asthma induced bronchial hyperreactivity (HHB) and eosinophilia (Shi HZ, Deng JM, Xu N., Nong ZX, Xiao CQ, Liu ZM, Qin SM, Jiang HX, Liu GN, Chen YQ Effect of inhaled interleukin-4 on airway hyperreactivity in asthmatics // Am. J. Respir. Crit Care Med. V. 157. 1998. P. 1818-1821 )

Для выяснения точной роли IL-4 в патогенезе астмы были использованы экспериментальные модели на животных, таких как мыши, крысы, морские свинки и приматы. Особый вклад в понимание биологической роли IL-4 внесли эксперименты с трансгенными мышами, у которых был полностью инактивирован ген il-4. Стандартное моделирование признаков бронхиальной астмы на таких IL-4-дефектных мышах показало, что происходит редукция аллергического воспаления, что выражалось в снижении количества эозинофилов в ткани легких и перибронхиального воспаления в сравнении с мышами, имеющих функциональный ген il-4. Кроме того, IL-4-дефектные мыши не продуцировали аллерген-специфические IgE антитела (Ат) и не развивали ГРБ (Brusselle G.G., Kips J.C., Tavernier J.H., van der Heyden J.G., Cuvelier C.A., Pauwels R.A., Bluethmann H. Attenuation of allergic airway inflammation in IL-4 deficient mice // Clin. Exp. Allergy. 1994. V. 24. P. 73-80).To elucidate the exact role of IL-4 in asthma pathogenesis, experimental models in animals such as mice, rats, guinea pigs and primates were used. A special contribution to understanding the biological role of IL-4 was made by experiments with transgenic mice in which the il-4 gene was completely inactivated. Standard modeling of signs of bronchial asthma in such IL-4-defective mice showed that there is a reduction in allergic inflammation, which is manifested in a decrease in the number of eosinophils in lung tissue and peribronchial inflammation compared with mice with the il-4 functional gene. In addition, IL-4-defective mice did not produce allergen-specific IgE antibodies (At) and did not develop HrB (Brusselle GG, Kips JC, Tavernier JH, van der Heyden JG, Cuvelier CA, Pauwels RA, Bluethmann H. Attenuation of allergic airway inflammation in IL-4 deficient mice // Clin. Exp. Allergy. 1994. V. 24. P. 73-80).

Экспериментально установлено, что в патогенезе бронхиальной астмы IL-4 обеспечивает дифференциацию про-аллергические Th2-клеток из нативных Th0-клеток, индуцирует переключение синтеза B-клетками антител с IgM на про-аллергические IgE. В последствии синтезированные IgE антитела способствуют высвобождению тучными клетками и базофилами крови про-воспалительных медиаторов гистамина, лейкотриенов, простагландинов. В нескольких независимых исследованиях было установлено, что IL-4, вместе с IL-13, увеличивают экспрессию в эндотелии адгезионной молекулы VCAM-1, которая способствует миграции про-воспалительных клеток эозинофилов, T-лимфоцитов, моноцитов и базофилов, привлекаемых хемокинами тучных клеток, тем самым IL-4 вносит вклад в локальное воспаление в дыхательных путях (Schleimer R.P., Sterbinsky S.A., Kaiser J., Bickel C.A., Klunk D.A., Tomioka K., Newman W., Luscinskas F.W., Gimbrone M.A., Jr., McIntyre B.W.. IL-4 induces adherence of human eosinophils and basophils but not neutrophils to endothelium. Association with expression of VCAM-1 // J. Immunol. 1992. V. 148. P. 1086-1092).It was experimentally established that in the pathogenesis of bronchial asthma, IL-4 provides differentiation of pro-allergic Th2 cells from native Th0 cells, induces a switch of B-cell synthesis of antibodies from IgM to pro-allergic IgE. Subsequently, the synthesized IgE antibodies contribute to the release by mast cells and blood basophils of the pro-inflammatory mediators of histamine, leukotrienes, prostaglandins. In several independent studies, it was found that IL-4, together with IL-13, increase the expression in the endothelium of the adhesion molecule VCAM-1, which promotes the migration of pro-inflammatory cells of eosinophils, T-lymphocytes, monocytes and basophils attracted by mast cell chemokines, thus, IL-4 contributes to local inflammation in the airways (Schleimer RP, Sterbinsky SA, Kaiser J., Bickel CA, Klunk DA, Tomioka K., Newman W., Luscinskas FW, Gimbrone MA, Jr., McIntyre BW. IL-4 induces adherence of human eosinophils and basophils but not neutrophils to endothelium. Association with expression of VCAM-1 // J. Immunol. 1992. V. 148. P. 1086-1092).

Что касается источников IL-4 в организме, то этот цитокин продуцируется Th2 клетками, но может высвобождаться также и тучными, базофилами, эозинофилами и альвеолярными макрофагами (Gessner А., Mohrs K., Mohrs M. Mast cells, basophils, and eosinophils acquire constitutive IL-4 and IL-13 transcripts during lineage differentiation that are sufficient for rapid cytokine production // J. Immunol. 2005. V. 174. P. 1063-1072). IL-4 специфически связывается с IL-4Rα цепью, которая экспрессируется на T-лимфоцитах, B-лимфоцитах, эозинофилах, фагоцитах, эндотелиальных клетках, легочных фибробластах, эпителиальных клетках бронхов, и клетках гладкой мускулатуры (Kotsimbos Т.С., Ghaffar О., Minshall Е.М., Humbert М., Durham S.R., Pfister R., Menz G., Kay A.B., Hamid Q.A. Expression of the IL-4 receptor alpha-subunit is increased in bronchial biopsy specimens from atopic and nonatopic asthmatic subjects // J. Allergy Clin. Immunol. 1998. V. 102. P. 859-866).As for the sources of IL-4 in the body, this cytokine is produced by Th2 cells, but can also be released by mast, basophils, eosinophils and alveolar macrophages (Gessner A., Mohrs K., Mohrs M. Mast cells, basophils, and eosinophils acquire constitutive IL-4 and IL-13 transcripts during lineage differentiation that are sufficient for rapid cytokine production // J. Immunol. 2005. V. 174. P. 1063-1072). IL-4 specifically binds to the IL-4Rα chain, which is expressed on T-lymphocytes, B-lymphocytes, eosinophils, phagocytes, endothelial cells, pulmonary fibroblasts, bronchial epithelial cells, and smooth muscle cells (Kotsimbos T.C., Ghaffar O. , Minshall E.M., Humbert M., Durham SR, Pfister R., Menz G., Kay AB, Hamid QA Expression of the IL-4 receptor alpha-subunit is increased in bronchial biopsy specimens from atopic and nonatopic asthmatic subjects / / J. Allergy Clin. Immunol. 1998. V. 102. P. 859-866).

IL-4Rα вовлечен в образование трех рецепторных комплексов: IL-4Rα/(γc)/IL-4 (Рецептор I типа), IL-4Rα/IL-13Rα1/IL-4 и IL-4Rα/IL-13Rα1/IL-13 комплекс (рецепторы II типа). Рецептор I типа связывается исключительно с IL-4, комплекс II типа связывается как с IL-4, так и с IL-13. Это объясняет перекрывание некоторых биологических функций IL-4 и IL-13. Рецептор I типа типично встречается у гематопоэтических клетках и вовлечен в развитие Th2-ответа, тогда как рецептор II типа обнаруживается как у гематопоэтических так и у негематопоэтических клеток. Передача сигнала IL-4, и IL-13, посредством рецептора II типа на негематопоэтических клетках дыхательных путей, таких как клетки гладкой мускулатуры и эпителиальные клетки, может напрямую индуцировать ГРБ и секрецию слизи (Kuperman D.A., Schleimer R.P. Interleukin-4, interleukin-13, signal transducer and activator of transcription factor 6, and allergic asthma // Curr. Mol. Med. 2008. V. 8. P. 384-392).IL-4Rα is involved in the formation of three receptor complexes: IL-4Rα / (γc) / IL-4 (Type I receptor), IL-4Rα / IL-13Rα1 / IL-4, and IL-4Rα / IL-13Rα1 / IL-13 complex (type II receptors). The type I receptor binds exclusively to IL-4, the complex of type II binds to both IL-4 and IL-13. This explains the overlap of some biological functions of IL-4 and IL-13. A type I receptor is typically found in hematopoietic cells and is involved in the development of the Th2 response, while a type II receptor is found in both hematopoietic and non-hematopoietic cells. Signal transmission of IL-4, and IL-13, through a type II receptor on non-hematopoietic cells of the respiratory tract, such as smooth muscle cells and epithelial cells, can directly induce HGH and mucus secretion (Kuperman DA, Schleimer RP Interleukin-4, interleukin-13 , signal transducer and activator of transcription factor 6, and allergic asthma // Curr. Mol. Med. 2008. V. 8. P. 384-392).

Связывание лиганда (IL-4 или IL-13) с I или II типом рецептора инициирует активацию протеинкиназ семейства Janus (Jak). В частности, IL-4Rα, ус и IL-13Rα1 активируют Jak1, Jak3 и Tyk2 соответственно. Это, в свою очередь, приводит к активации нескольких внутриклеточных сигналов посредством фосфорилирования специфических тирозиновых остатков в цитоплазматическом домене IL-4Rα, и к фосфорилированию фактора транскрипции - белка Stat6. Фосфорилированный Stat6 димеризуется и транслоцируется в ядро, где связывается со специфическими участками ДНК и индуцирует так называемые IL-4/IL-13-стимулируемые гены, вовлеченные в Th2 ответ, переключение синтеза с IgM на IgE, ГРБ и продукцию слизи. Более того субъединица IL-13Rα1 в комплексе II типа может также инициировать другие сигнальные пути, привлекая другие белки Stat (например, Stat3, Stat1). При этом происходит развитие Stat6-независимой, но IL-13-зависимой ГРБ, что было показано на мышиных моделях хронической бронхиальной астмы.Binding of a ligand (IL-4 or IL-13) to type I or type II receptor initiates the activation of protein kinases of the Janus family (Jak). In particular, IL-4Rα, mustache, and IL-13Rα1 activate Jak1, Jak3, and Tyk2, respectively. This, in turn, leads to the activation of several intracellular signals by phosphorylation of specific tyrosine residues in the cytoplasmic domain of IL-4Rα, and to phosphorylation of the transcription factor Stat6 protein. Phosphorylated Stat6 dimers and translocates to the nucleus, where it binds to specific DNA sites and induces the so-called IL-4 / IL-13-stimulated genes involved in the Th2 response, switching synthesis from IgM to IgE, HGP and mucus production. Moreover, the IL-13Rα1 subunit in the type II complex can also initiate other signaling pathways by attracting other Stat proteins (e.g., Stat3, Stat1). In this case, the development of Stat6-independent, but IL-13-dependent HHB occurs, which was shown in mouse models of chronic bronchial asthma.

Таким образом, экспериментально доказана роль гена IL-4 в формировании бронхиальной астмы, что делает данный ген привлекательной мишенью при разработке новых лекарственный препаратов.Thus, the role of the IL-4 gene in the formation of bronchial asthma has been experimentally proved, which makes this gene an attractive target in the development of new drugs.

К настоящему времени создан ряд лекарственных средств и терапевтических подходов для подавления данного гена, которые апробированы в доклинических и клинических исследованиях. Так, например, растворимый белок-рецептор - sIL-4R является естественным белком - секретируемой формой рецептора IL-4R, который содержит внеклеточную часть цепи IL-4Rα, но утративший трансмембранный и цитоплазматический домены, благодаря этому sIL-4R способен связываться с IL-4, но при этом не активирует сигнальный путь, т.е. функционирует как «ловушка», связывающаяся с IL-4 и нейтрализующая его (табл. 1, табл. 2). В экспериментах на мышиной модели астмы, sIL-4R значительно ингибировал ГРБ и продукцию IgE при введении в период сенсибилизации. Более того, когда sIL-4R вводился во время стадии провокации он предотвращал позднюю фазу воспаления в легких, что выражалось в репрессии VCAM-1, инфильтрации эозинофилов в дыхательные пути и снижении гиперсекреции слизи, но при этом не происходило улучшения ГРБ, которая оставалась высокой). Это исследование показало, что блокирование IL-4 может иметь клинический эффект, даже после сенсибилизации организма к аллергену (Renz Н., Bradley K., Enssle K., Loader J.Е., Larsen G.L., Gelfand E.W. Prevention of the development of immediate hypersensitivity and airway hyperresponsiveness following in vivo treatment with soluble IL-4 receptor. Int. Arch. Allergy Immunol. 1996. V. 109. P. 167-176).To date, a number of drugs and therapeutic approaches have been created to suppress this gene, which have been tested in preclinical and clinical studies. For example, the soluble protein receptor sIL-4R is a natural protein, a secreted form of the IL-4R receptor, which contains the extracellular part of the IL-4Rα chain but has lost the transmembrane and cytoplasmic domains, due to which sIL-4R is able to bind to IL-4 but does not activate the signaling path, i.e. functions as a “trap" that binds to and neutralizes IL-4 (Table 1, Table 2). In experiments on a mouse model of asthma, sIL-4R significantly inhibited HGH and IgE production when introduced into the sensitization period. Moreover, when sIL-4R was administered during the provocation stage, it prevented the late phase of pneumonia, which was expressed in the repression of VCAM-1, infiltration of eosinophils into the respiratory tract and a decrease in mucus hypersecretion, but there was no improvement in HHB, which remained high) . This study showed that blocking IL-4 can have a clinical effect, even after sensitizing the body to an allergen (Renz N., Bradley K., Enssle K., Loader J.E., Larsen GL, Gelfand EW Prevention of the development of immediate hypersensitivity and airway hyperresponsiveness following in vivo treatment with soluble IL-4 receptor. Int. Arch. Allergy Immunol. 1996. V. 109. P. 167-176).

Терапевтический потенциал ингаляции рекомбинантного человеческого sIL-4R (Nuvance) был многообещающим на начальной фазе клинических испытаний (Borish L.C., Nelson Н.S., Corren J., Bensch G., Busse W.W., Whitmore J.В., Agosti J.M. Efficacy of soluble IL-4 receptor for the treatment of adults with asthma // J. Allergy Clin. Immunol // 2001. V. 107. P. 963-970). С пролонгированным периодом полу-жизни sIL-4R (примерно 5 дней), применялся для ингаляционной терапии курсом один раз в неделю. Фазы I/II испытаний с прерыванием приема кортикостероидов пациентами, показало, что одиночное ингаляционное введение sIL-4R было безопасным и эффективным при астме средней тяжести, не наблюдалось токсического эффекта, происходило значительное улучшение показателя объема форсированного выдоха в 1 секунду (forced expiratory volume in 1 second (FEV1)), пациентам требовалось принимать меньше β2-агонистов, и снижался уровень воспаления в легких, измеренный по количеству выдыхаемого оксида азота (NO).The therapeutic potential for inhalation of recombinant human sIL-4R (Nuvance) was promising in the initial phase of clinical trials (Borish LC, Nelson H.S., Corren J., Bensch G., Busse WW, Whitmore J. B., Agosti JM Efficacy of soluble IL-4 receptor for the treatment of adults with asthma // J. Allergy Clin. Immunol // 2001. V. 107. P. 963-970). With a prolonged half-life of sIL-4R (approximately 5 days), it was used for inhalation therapy once a week. Phases I / II of trials with interruption of corticosteroid administration by patients showed that single inhaled sIL-4R was safe and effective for moderate asthma, no toxic effect was observed, and there was a significant improvement in forced expiratory volume in 1 second (forced expiratory volume in 1 second (FEV1)), patients were required to take fewer β2-agonists, and the level of inflammation in the lungs, measured by the amount of expired nitric oxide (NO), was reduced.

Последующие исследования с многократным введением sIL-4R в течение 12 недель по оценке длительной безопасности и эффективности также показали многообещающие результаты при лечении астмы средней тяжести (Immunex Phase II Efficacy Study, 2005). Однако дальнейшие клинические испытания, на астматиках, которые принимали только β2-агонисты, не показали клинического эффекта на FEV1 или симптомы астмы. Отсутствие клинических эффектов наблюдалось и в другом исследовании, когда пациенты принимали sIL-4R при уменьшении приема кортикостероидов. В последующем было показано, что sIL-4Rα стабилизирует взаимодействие IL-13 со своим рецептором, тем самым активируя сигнальный путь IL-13. Это может быть объяснением почему клинические испытания sIL-4R потерпели неудачу (Andrews A.L., Holloway J.W, Holgate S.Т., Davies D.E. IL-4 receptor alpha is an important modulator of IL-4 and IL-13 receptor binding: implications for the development of therapeutic targets // J. Immunol. 2006. V. 176. P. 7456-7461).Subsequent studies with repeated administration of sIL-4R over 12 weeks to assess long-term safety and efficacy also showed promising results in the treatment of moderate asthma (Immunex Phase II Efficacy Study, 2005). However, further clinical trials in asthmatics who only took β2 agonists did not show a clinical effect on FEV1 or asthma symptoms. The lack of clinical effects was also observed in another study when patients took sIL-4R with a decrease in corticosteroid intake. It was subsequently shown that sIL-4Rα stabilizes the interaction of IL-13 with its receptor, thereby activating the IL-13 signaling pathway. This may be the reason why sIL-4R clinical trials failed (Andrews AL, Holloway JW, Holgate S.T., Davies DE IL-4 receptor alpha is an important modulator of IL-4 and IL-13 receptor binding: implications for the development of therapeutic targets // J. Immunol. 2006. V. 176. P. 7456-7461).

Другой подход для блокирования IL-4 это использование гуманизированных моноклональных антител (мАт), например, препарат Pascolizumab, (табл. 1, табл. 2). Препарат Pascolizumab представляет собой мышиные мАт (3B9) со специфичностью к человеческому IL-4, которые были гуманизированы с целью снижения иммуногенности. На мышиных моделях астмы было показано снижение уровня IgE и ГРБ после введения анти-IL-4-мАт. (Zhou C.Y., Crocker I.С, Koenig G., Romero F.A., Townley R.G. Anti-interleukin-4 inhibits immunoglobulin E production in a murine model of atopic asthma // J. Asthma. 1997. V. 34. P. 195-201). Исследования in vitro показали, что Pascolizumab нейтрализовал активность IL-4 в клеточных линиях человека и ингибировал Th2-процесс, например, синтез IL-5, и продукцию IgE. Изучение фармакокинетики и хронической безопасности Pascolizumab in vivo на обезьянах показало хорошую переносимость без побочных эффектов (Hart Т.K., Blackburn М.N., Brigham-Burke М., Dede K., Al-Mahdi N., Zia-Amirhosseini P., Cook R.M. Preclinical efficacy and safety of pascolizumab (SB 240683): a humanized antiinterleukin-4 antibody with therapeutic potential in asthma // Clin. Exp. Immunol. 2002. V. 130. P. 93-100).Another approach for blocking IL-4 is the use of humanized monoclonal antibodies (mAbs), for example, Pascolizumab, (Table 1, Table 2). Pascolizumab is a mouse mAb (3B9) with specificity for human IL-4 that has been humanized to reduce immunogenicity. In mouse models of asthma, a decrease in the level of IgE and HGP after administration of anti-IL-4 mAb was shown. (Zhou CY, Crocker I.C., Koenig G., Romero FA, Townley RG Anti-interleukin-4 inhibits immunoglobulin E production in a murine model of atopic asthma // J. Asthma. 1997. V. 34. P. 195- 201). In vitro studies have shown that Pascolizumab neutralized the activity of IL-4 in human cell lines and inhibited the Th2 process, for example, the synthesis of IL-5, and the production of IgE. A study of the pharmacokinetics and chronic safety of Pascolizumab in vivo in monkeys showed good tolerance without side effects (Hart T.K., Blackburn M.N., Brigham-Burke M., Dede K., Al-Mahdi N., Zia-Amirhosseini P. Cook RM Preclinical efficacy and safety of pascolizumab (SB 240683): a humanized antiinterleukin-4 antibody with therapeutic potential in asthma // Clin. Exp. Immunol. 2002. V. 130. P. 93-100).

Фаза I клинических испытаний при однократном внутривенном введении пациентам с астмой средней тяжести также показала хорошую переносимость препарата, который имел период полу-жизни более чем 2 недели (Shames R.S., Vexler V., Lane N., McClellan M., Shi J., Keller S., The safety and pharmacokinetics of SB240683 (anti-IL-4 humanized monoclonal antibody) in patients with mild to moderate asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2001. V. 163.). Однако последующая II фаза клинических испытаний была прекращена, т.к. Pascolizumab не обеспечивал клинического эффекта даже при многократном введении астматикам, не принимающим кортикостероиды (PDL BioPharma, Inc. Pilot Study, 2008).Phase I clinical trials for a single intravenous administration to patients with moderate asthma also showed good tolerance to the drug, which had a half-life of more than 2 weeks (Shames RS, Vexler V., Lane N., McClellan M., Shi J., Keller S., The safety and pharmacokinetics of SB240683 (anti-IL-4 humanized monoclonal antibody) in patients with mild to moderate asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2001. V. 163.). However, the subsequent phase II clinical trial was discontinued, as Pascolizumab did not provide a clinical effect even with repeated administration to asthmatics not taking corticosteroids (PDL BioPharma, Inc. Pilot Study, 2008).

Альтернативой использованию моноклональных антител (мАт) служит стратегия применения антисмысловых олигонуклеотидов (АСО). АСО осуществляют деградацию молекул мРНК гена с комплементарной последовательностью. Поэтому в отличие от мАт, которые нейтрализуют IL-4 на белковом уровне, АСО осуществляют сайленсинг на уровне мРНК. Этот подход может быть интересной альтернативой, т.к. несколько копий белка может считываться с одной молекулы мРНК. На крысиной модели астмы с помощью рекомбинантного адено-ассоциированного вируса осуществлялось системное введение АСО, подавляющих IL-4. В результате наблюдали значительное снижение уровня IL-4 в БАЛ, аллергического воспаления и ремоделирования (Cao Y., Zeng D., Song Q., Сао С, Xie M., Liu X., Xiong S., Xu Y., Xiong W. The effects of antisense interleukin-4 gene transferred by recombinant adeno-associated virus vector on the airway remodeling in allergic rats // J. Asthma. 2010. V. 47. P. 951-958). К настоящему моменту данный подход еще не опробован в клинических испытаниях.An alternative to the use of monoclonal antibodies (mAbs) is the use of antisense oligonucleotides (ASOs). ASOs degrade mRNA molecules of a gene with a complementary sequence. Therefore, unlike mAbs that neutralize IL-4 at the protein level, ASOs silence at the mRNA level. This approach can be an interesting alternative, as multiple copies of a protein can be read from a single mRNA molecule. In a rat model of asthma, a recombinant adeno-associated virus was used to systemically administer ASOs that suppress IL-4. As a result, a significant decrease in IL-4 levels in BAL, allergic inflammation and remodeling (Cao Y., Zeng D., Song Q., Cao C, Xie M., Liu X., Xiong S., Xu Y., Xiong W The effects of antisense interleukin-4 gene transferred by recombinant adeno-associated virus vector on the airway remodeling in allergic rats // J. Asthma. 2010. V. 47. P. 951-958). To date, this approach has not yet been tested in clinical trials.

Перекрывающиеся биологические функции IL-13, объясняющееся способностью данного цитокина связываться с рецепторными цепями IL-4, свидетельствуют о перспективности стратегии по его блокированию с помощью мАт. Такие мАт против IL-13 использовались как при профилактическом, так при терапевтическом режиме введения на мышиной модели бронхиальной астмы. Анти-IL-13-мАт ингибировали аллергическое воспаление, гиперплазию бокаловидных клеток и ремоделирование у мышей. Однако, тогда как при профилактическом протоколе введения мАт снижалась ГРБ, при терапевтическом введении препарат не ингибировал этот важный клинический признак бронхиальной астмы (Tomlinson K.L., Davies G.С, Sutton D.J., Palframan R.Т. Neutralisation of interleukin-13 in mice prevents airway pathology caused by chronic exposure to house dust mite // PLoS. One. 2010. V. 5).The overlapping biological functions of IL-13, due to the ability of this cytokine to bind to IL-4 receptor chains, indicate the promise of a strategy for blocking it with mAbs. Such anti-IL-13 mAbs were used both in the prophylactic and therapeutic regimen of administration of a bronchial asthma in a mouse model. Anti-IL-13 mAb inhibited allergic inflammation, goblet cell hyperplasia, and remodeling in mice. However, while the prophylactic protocol for the administration of mAbs reduced MHB, the therapeutic administration did not inhibit this important clinical sign of bronchial asthma (Tomlinson KL, Davies G.C., Sutton DJ, Palframan R.T. Neutralization of interleukin-13 in mice prevents airway pathology caused by chronic exposure to house dust mite // PLoS. One. 2010. V. 5).

Некоторые успешные исследования на обезьянах и овцах позволили начать клинические испытания анти-IL-13 Ат субкласса IgG1 (IMA-638 и IMA-026) (Bree A., Schlerman F.J., Wadanoli М., Tchistiakova L., Marquette K., Tan X.Y., Jacobson B.A., Widom A., Cook T.A., Wood N., Vunnum S., Krykbaev R., Xu X., Donaldson D.D., Goldman S.J., Sypek J., Kasaian M.T. IL-13 blockade reduces lung inflammation after Ascaris suum challenge in cynomolgus monkeys // J. Allergy Clin. Immunol. 2007. V. 119. P. 1251-1257). IMA-638 и IMA-026, связываются с разными эпитопами IL-13 и ингибируют аллерген-индуцированный ответ. Антитело IMA-638 блокирует связывание IL-13 с цепью IL-4Rα, а IMA-026 с цепями IL-13Rα1 и IL-13Rα2. Они были тестированы на пациентах с мягкой астмой (табл. 2). Показано, что подкожное введение IMA-638 и IMA-026 на день 1 и 8 не влияло на ГРБ и эозинофилию в слюне, но IMA-638 кратковременно снижал раннюю и позднюю фазы аллергического ответа (Gauvreau G.М., Boulet L.Р., Cockcroft D.W., Fitzgerald J.М., Carlsten С., Davis В.Е., Deschesnes F., Duong M., Durn В.L., Howie K.J., Hui L., Kasaian M.Т., Killian K.J., Strinich Т.X., Watson R.M., Zhou Y N. S., Raible D., O′Byrne P.M. Effects of interleukin-13 blockade on allergen-induced airway responses in mild atopic asthma // Am. J. Respir. Crit Care Med. 2011. V. 183. P. 1007-1014). Однако, при более длительном введении мАт пациентам с неконтролируемой астмой, (12 недель) которые получали кортикостеройды, не было эффекта IMA-638 на симптомы БА в сравнении с плацебо (Study Evaluating the Effect of IMA-638, 2009).Some successful studies in monkeys and sheep have allowed the start of clinical trials of the anti-IL-13 At subclass of IgG1 (IMA-638 and IMA-026) (Bree A., Schlerman FJ, Wadanoli M., Tchistiakova L., Marquette K., Tan XY , Jacobson BA, Widom A., Cook TA, Wood N., Vunnum S., Krykbaev R., Xu X., Donaldson DD, Goldman SJ, Sypek J., Kasaian MT IL-13 blockade reduces lung inflammation after Ascaris suum challenge in cynomolgus monkeys // J. Allergy Clin. Immunol. 2007. V. 119. P. 1251-1257). IMA-638 and IMA-026 bind to different epitopes of IL-13 and inhibit the allergen-induced response. The IMA-638 antibody blocks the binding of IL-13 to the IL-4Rα chain, and IMA-026 to the IL-13Rα1 and IL-13Rα2 chains. They were tested in patients with mild asthma (Table 2). It was shown that subcutaneous administration of IMA-638 and IMA-026 on days 1 and 8 did not affect HGH and eosinophilia in saliva, but IMA-638 briefly reduced the early and late phases of the allergic response (Gauvreau G.M., Boulet L.P. , Cockcroft DW, Fitzgerald J.M., Carlsten S., Davis V.E., Deschesnes F., Duong M., Durn B.L., Howie KJ, Hui L., Kasaian M.T., Killian KJ, Strinich T.X., Watson RM, Zhou Y NS, Raible D., O'Byrne PM Effects of interleukin-13 blockade on allergen-induced airway responses in mild atopic asthma // Am. J. Respir. Crit Care Med. 2011 V. 183. P. 1007-1014). However, with longer administration of mAbs to patients with uncontrolled asthma (12 weeks) who received corticosteroids, there was no effect of IMA-638 on AD symptoms compared with placebo (Study Evaluating the Effect of IMA-638, 2009).

Другой препарат - Lebrikizumab - представляет собой гуманизированные мАт субкласса IgG4, также направленные против IL-13. Lebrikizumab тестировался на пациентах как с мягкой астмой, так и с неконтролируемой астмой посредством подкожного введения в течение нескольких месяцев (вплоть до 6 месяцев) (Genentech, A Study to Evaluate MILR1444A, 2010; Genentech, A Study of Lebrikizumab, 2011; Genentech, A Study to Evaluate Lebrikizumab (MILR1444A) in Adult Patient, 2011). Согласно рабочей гипотезе анти-IL-13 терапия могла бы быть полезной для пациентов с повышенной активностью IL-13. Подгруппа пациентов у которых был доказан Th2 статус (повышенный уровень IgE и эозинофилов в крови, увеличенный уровень периостина - белка, секретируемого в ответ на IL-13) (Corren et al., 2011; Genentech, A Study of Lebrikizumab (MILR1444A) in Adult Patients 2011) хорошо отвечала на препарат. У таких пациентов Lebrikizumab значительно улучшал форсированный объем выдоха (FEV1) на 5.5% к 12-ой неделе. В связи с этим измерение уровня периостина у астматиков могло бы использоваться как биомаркер для поиска пациентов, отвечающих на Lebrikizumab. Несмотря на успех препарата на ограниченной группе пациентов Lebrikizumab не приводил к значительному улучшению большинства симптомов БА (Corren J., Lemanske R.F., Hanania N.A., Korenblat P.E., Parsey M.V., Arron J.R., Harris J.M., Scheerens H., Wu L.C, Su Z., Mosesova S., Eisner M.D., Bohen S.P., Matthews J.G. Lebrikizumab treatment in adults with asthma // N. Engl. J. Med. 2011. V. 365. P. 1088-1098).Another drug, Lebrikizumab, is a humanized mAb of the IgG4 subclass, also directed against IL-13. Lebrikizumab was tested in patients with both mild asthma and uncontrolled asthma through subcutaneous administration for several months (up to 6 months) (Genentech, A Study to Evaluate MILR1444A, 2010; Genentech, A Study of Lebrikizumab, 2011; Genentech, A Study to Evaluate Lebrikizumab (MILR1444A) in Adult Patient, 2011). According to the working hypothesis, anti-IL-13 therapy could be beneficial for patients with increased IL-13 activity. A subgroup of patients who have proven Th2 status (elevated levels of IgE and eosinophils in the blood, increased levels of periostin, a protein secreted in response to IL-13) (Corren et al., 2011; Genentech, A Study of Lebrikizumab (MILR1444A) in Adult Patients 2011) responded well to the drug. In such patients, Lebrikizumab significantly improved forced expiratory volume (FEV1) by 5.5% by week 12. In this regard, measurement of the level of periostin in asthmatics could be used as a biomarker to search for patients responding to Lebrikizumab. Despite the success of the drug in a limited group of patients, Lebrikizumab did not significantly improve the majority of AD symptoms (Corren J., Lemanske RF, Hanania NA, Korenblat PE, Parsey MV, Arron JR, Harris JM, Scheerens H., Wu LC, Su Z. , Mosesova S., Eisner MD, Bohen SP, Matthews JG Lebrikizumab treatment in adults with asthma // N. Engl. J. Med. 2011. V. 365. P. 1088-1098).

Еще один препарат, основанный на гуманизированных мАт субкласса IgG4 - Tralikinumab (САТ-354) - показал эффективность в доклинических моделях, а в клинических испытаниях был безопасен и хорошо переносим как для здоровых индивидуумов, так и для астматиков. Препарат Tralikinumab в настоящий момент находиться на II фазе клинических испытаний (Medimmune, A Phase 2b, Randomized, Double-blind Study 2012; Medimmune, Study to Evaluate the Safety and Efficacy 2011).Another drug based on the humanized mAbs of the IgG4 subclass - Tralikinumab (CAT-354) - has shown efficacy in preclinical models, and in clinical trials has been safe and well tolerated for both healthy individuals and asthmatics. Tralikinumab is currently in Phase II clinical trials (Medimmune, A Phase 2b, Randomized, Double-blind Study 2012; Medimmune, Study to Evaluate the Safety and Efficacy 2011).

Одна из причин неудач анти-IL-4 терапии - это взаимозаменяемость IL-4 и интерлейкина-13 (IL-13), когда при подавлении только IL-4 его функцию может выполнять IL-13. Потому некоторые исследования были сфокусированы на блокировании цепи IL-4Rα, которая входит в состав рецепторов как для IL-4, так и IL-13 и инициирует Stat6-опосредованный сигнальный путь. Для инактивации IL-4Rα разработано несколько подходов: использование IL-4-мутеина (Pitrakinra), использование мАт против IL-4Rα (AMG317) и не так давно стали применять АСО (AIR-645).One of the reasons for the failure of anti-IL-4 therapy is the interchangeability of IL-4 and interleukin-13 (IL-13), when IL-13 can perform its function when suppressing only IL-4. Therefore, some studies have focused on blocking the IL-4Rα chain, which is part of the receptors for both IL-4 and IL-13 and initiates the Stat6-mediated signaling pathway. Several approaches have been developed for the inactivation of IL-4Rα: the use of IL-4-mutein (Pitrakinra), the use of mAbs against IL-4Rα (AMG317), and recently, ASO (AIR-645) began to be used.

Pitrakinra - это рекомбинантная форма человеческого IL-4 с двумя функциональными мутациями в позиции 121 (замена аргинина на аспарагиновую кислоту) и 124 (замена тирозина на аспарагиновую кислоту). Была продемонстрирована высокая афинность связывания Pitrakinra с IL-4Rα цепью, в результате чего препарат действует как конкурентный антагонист и блокирует связывание обоих цитокинов (IL-4 IL-13) с IL-4Rα. Эффективность такого подхода изначально оценена на мышиной модели астмы, где показано ингибирование продукции Th2 цитокинов, эозинофильного воспаления, гиперплазии бокаловидных клеток, ГРБ и специфического IgE. У обезьян, двойной антагонизм IL-4/IL-13 посредством Pitrakinra снижал ГРБ и имел тенденцию к снижению эозинофильного воспаления (Tomlinson K.L., Davies G.С., Sutton D.J., Palframan R.Т. Neutralisation of interleukin-13 in mice prevents airway pathology caused by chronic exposure to house dust mite // PLoS. One. 2010. V. 5).Pitrakinra is a recombinant form of human IL-4 with two functional mutations at position 121 (replacement of arginine with aspartic acid) and 124 (replacement of tyrosine with aspartic acid). The high affinity of binding of Pitrakinra to the IL-4Rα chain has been demonstrated, as a result of which the drug acts as a competitive antagonist and blocks the binding of both cytokines (IL-4 IL-13) to IL-4Rα. The effectiveness of this approach was initially evaluated in a mouse model of asthma, which shows the inhibition of the production of Th2 cytokines, eosinophilic inflammation, goblet cell hyperplasia, HGH and specific IgE. In monkeys, the double antagonism of IL-4 / IL-13 by Pitrakinra reduced HGH and tended to decrease eosinophilic inflammation (Tomlinson KL, Davies G.C., Sutton DJ, Palframan R.T. Neutralisation of interleukin-13 in mice prevents airway pathology caused by chronic exposure to house dust mite // PLoS. One. 2010. V. 5).

Многообещающие результаты в доклинических испытаниях были основаниями для проведения клинических исследований Pitrakinra. Два независимых клинических исследования фазы IIa изучили эффект препарата (при подкожном и аэрозольном введении) на позднюю фазу аллергического ответа у атопических астматиков. Независимо от пути введения, препарат Pitrakinra улучшал FEV1, в то же время ингаляционное введение имело большую эффективность в сравнении с подкожным (Wenzel S., Wilbraham D., Fuller R., Getz E.В., Longphre M. Effect of an interleukin-4 variant on late phase asthmatic response to allergen challenge in asthmatic patients: results of two phase 2a studies // Lancet. 2007. V. 370. P. 1422-1431). На текущий момент описана фармакодинамика, фармакокинетика, клиническая эффективность и безопасность препарата (Antoniu S.A., Cojocaru I. Pitrakinra for asthma // Expert. Opin. Biol. Ther. 2010. V. 10. P. 1609-1615). В фазе IIb клинических исследований на астматиках со средней и тяжелой формой астмы изучалась способность Pitrakinra снижать осложнения при постепенном уменьшении приема β-агонистов и кортикостеройдов. Как оказалось, Pitrakinra не имел значительного эффекта в общей популяции астматиков со средней и тяжелой формой, но у подгруппы пациентов с эозинофильной астмой снижались осложнения на 37% (Aerovance Inc. Press release. Phase 2b Clinical Trial, 2010; Aerovance, Inc. A Study of the Treatment-Sparing Effects, 2011). Подобные результаты были получены и при испытании препарата Mepolizumab (мАт против IL-5), который был неэффективен в смешанной (гетерогенной) популяции астматиков, но показал свою эффективность в подгруппе пациентов с тяжелой эозинофильной астмой.Promising results in preclinical trials were the basis for conducting clinical trials of Pitrakinra. Two independent clinical trials of phase IIa studied the effect of the drug (with subcutaneous and aerosol administration) on the late phase of the allergic response in atopic asthmatics. Regardless of the route of administration, Pitrakinra improved FEV1, while inhalation was more effective than subcutaneous (Wenzel S., Wilbraham D., Fuller R., Getz E.V., Longphre M. Effect of an interleukin- 4 variant on late phase asthmatic response to allergen challenge in asthmatic patients: results of two phase 2a studies // Lancet. 2007. V. 370. P. 1422-1431). Currently described pharmacodynamics, pharmacokinetics, clinical efficacy and safety of the drug (Antoniu S.A., Cojocaru I. Pitrakinra for asthma // Expert. Opin. Biol. Ther. 2010. V. 10. P. 1609-1615). In phase IIb of clinical studies on asthmatics with moderate and severe asthma, the ability of Pitrakinra to reduce complications was studied with a gradual decrease in the intake of β-agonists and corticosteroids. Pitrakinra did not appear to have a significant effect in the general population of moderate to severe asthmatics, but complications in eosinophilic asthma patients decreased by 37% (Aerovance Inc. Press release. Phase 2b Clinical Trial, 2010; Aerovance, Inc. A Study of the Treatment-Sparing Effects, 2011). Similar results were obtained when testing the drug Mepolizumab (mAb against IL-5), which was ineffective in a mixed (heterogeneous) population of asthmatics, but showed its effectiveness in a subgroup of patients with severe eosinophilic asthma.

AMG317 - это гуманизированные мАт против IL-4Rα человека, предотвращают связывание как IL-4 так и IL-13 с IL-4Rα (фиг. 1). Доклинические исследования на мышах показали, что AMG317 снижает воспаление дыхательных путей, ГРБ и гиперплазию бокаловидных клеток. В фазах I и II клинических испытаний изучена фармакокинетика и фармакодинамика AMG317 при однократном и многократном введениях посредством внутривенного и подкожного путей. Длительное подкожное введение AMG317 в течение нескольких месяцев показало хорошую переносимость препарата. Фаза II исследований на пациентах со средней и тяжелой астмой выявила отсутствие клинической эффективности во всех группах пациентов (Amgen Inc. Phase II Study, 2009).AMG317 is a humanized mAb against human IL-4Rα that prevents the binding of both IL-4 and IL-13 to IL-4Rα (Fig. 1). Preclinical studies in mice have shown that AMG317 reduces airway inflammation, HBG, and goblet cell hyperplasia. In phases I and II of clinical trials, the pharmacokinetics and pharmacodynamics of AMG317 were studied with single and multiple administrations via the intravenous and subcutaneous routes. Prolonged subcutaneous administration of AMG317 for several months showed good tolerance to the drug. Phase II studies in patients with moderate to severe asthma revealed a lack of clinical efficacy in all patient groups (Amgen Inc. Phase II Study, 2009).

Снижение экспрессии IL-4Rα посредством антисмысловых олигонуклеотидов (АСО) приводило к подавлению признаков БА на мышиных моделях. В фазе I клинических исследований была показана хорошая переносимость препарата здоровыми индивидуумами и пациентами с мягкой астмой, что дает возможность его использования для ежедневной терапии (Altair Therapeutics, Inc. A Phase 1 Study 2011; Seguin and Ferrari 2009). Однако в фазе II клинических испытаний препарат не проявил достаточного клинического эффекта, в частности на показатель FEV1, чтобы оправдать дальнейшее развитие (Altair Therapeutics, Inc. Study Evaluating the Effects of AIR645, 2010).Decreased expression of IL-4Rα by antisense oligonucleotides (ASOs) led to the suppression of AD in mouse models. Phase I clinical trials have shown that the drug is well tolerated by healthy individuals and patients with mild asthma, which makes it possible to use it for daily therapy (Altair Therapeutics, Inc. A Phase 1 Study 2011; Seguin and Ferrari 2009). However, in phase II clinical trials, the drug did not show sufficient clinical effect, in particular on the FEV1 score, to justify further development (Altair Therapeutics, Inc. Study Evaluating the Effects of AIR645, 2010).

Другим подходом блокирования биологической активности обоих цитокинов IL-4 и IL-13, является подавление фактора Stat6, который необходим для транскрипции генов, отвечающих на IL-4 и IL-13. В доклинических исследованиях использовались несколько разных подходов для подавления Stat6, а именно: использование ингибирующего пептида (AS1517499), и молекул малых интерферирующих РНК (миРНК). Применение обоих подходов в доклинических исследованиях было успешным, т.к. на мышиных моделях продемонстрировано снижение аллергического воспаления дыхательных путей, снижение гиперплазии бокаловидных клеток, продукции слизи и ГРБ (Tian X.R., Tian X.L., Во J.P., Li S.G., Liu Z.L., Niu B. Inhibition of allergic airway inflammation by antisense-induced blockade of STAT6 expression // Chin Med. J. (Engl.) 2011. V. 124. P. 26-31) (табл. 1). Хотя данные исследования подтверждают перспективность мишени Stat6 для лечения астмы, к настоящему моменту нет клинических данных.Another approach to blocking the biological activity of both the cytokines IL-4 and IL-13 is to suppress the Stat6 factor, which is necessary for the transcription of genes that respond to IL-4 and IL-13. In preclinical studies, several different approaches were used to suppress Stat6, namely, the use of an inhibitory peptide (AS1517499), and small interfering RNA molecules (siRNAs). The application of both approaches in preclinical studies was successful, because in mouse models, a decrease in allergic inflammation of the airways, a decrease in goblet cell hyperplasia, mucus production and HGP (Tian XR, Tian XL, JP, Li SG, Liu ZL, Niu B. Inhibition of allergic airway inflammation by antisense-induced blockade of STAT6 expression // Chin Med. J. (Engl.) 2011. V. 124. P. 26-31) (Table 1). Although these studies confirm the promise of the Stat6 target for asthma, there are currently no clinical data.

Несмотря на существование разных способов антиастматической терапии, все еще существует большое количество пациентов с низким качеством жизни по причине неконтролируемой астмы. Поэтому разработка новых дополнительных способов лечения заболевания остается актуальной. За последние 15 лет получены новые данные о молекулярных механизмах БА, усовершенствована технология получения мАт и открыто явление РНК интерференции. Все это привело к созданию концепции анти-IL-4 терапии для лечения БА. Хотя блокирование IL-4 в доклинических исследованиях показало многообещающие результаты, однако не были оправданы ожидания от клинических испытаний. Этим неудачам есть несколько объяснений. Во-первых, информация о роли IL-4 в астме и в Th2-дифференциации постоянно дополняется. Изначально сигнальный путь IL-4/IL-4Rα/Stat6 считался ключевым в развитии CD4+ T-клеток, a IL-4 единственным инициатором Th2-дифференциации. Сейчас установлено, что Th2-дифференциация представляет собой более сложный процесс, а сигнальный путь IL-4/IL-4Rα/Stat6 может быть необязательным, т.к. открыты иные пути Th2-дифференциации (например, пути опосредуемые IL-25, IL-33). Поэтому стратегия подавление исключительно IL-4 оказалась не оправданной. Во-вторых, блокирование IL-4 для предотвращения Th2-дифференциации может быть успешным в краткосрочных мышиных моделях при терапевтическом введении анти-IL4 препаратов, но в клинической практике пациенты с астмой уже имеют сформированный Th2-ответ, поэтому не удается экстраполировать результаты доклинических исследований на человека.Despite the existence of different methods of anti-asthma therapy, there are still a large number of patients with poor quality of life due to uncontrolled asthma. Therefore, the development of new additional methods of treating the disease remains relevant. Over the past 15 years, new data on the molecular mechanisms of AD have been obtained, the technology for producing mAbs has been improved, and the phenomenon of RNA interference has been discovered. All this led to the creation of the concept of anti-IL-4 therapy for the treatment of AD. Although blocking IL-4 in preclinical studies has shown promising results, expectations from clinical trials have not been met. There are several explanations for these failures. First, information on the role of IL-4 in asthma and in Th2 differentiation is constantly updated. Initially, the IL-4 / IL-4Rα / Stat6 signaling pathway was considered key in the development of CD4 + T cells, and IL-4 was the only initiator of Th2 differentiation. It has now been established that Th2 differentiation is a more complex process, and the IL-4 / IL-4Rα / Stat6 signaling pathway may be optional, because other Th2 differentiation pathways have been discovered (e.g., IL-25, IL-33 mediated pathways). Therefore, the strategy of suppressing exclusively IL-4 was not justified. Secondly, IL-4 blocking to prevent Th2 differentiation can be successful in short-term mouse models with therapeutic administration of anti-IL4 drugs, but in clinical practice, patients with asthma already have a Th2 response, therefore, it is not possible to extrapolate the results of preclinical studies to person.

Обе причины неудачных клинических испытаний в той или иной степени преодолимы. Во-первых, в настоящее время астма у человека больше не рассматривается как исключительно аллергическое Th2-опосредованное, эозинофильное заболевание, но подразделяется на отдельные клинические и молекулярные фенотипы. Такое фенотипическое деление астмы позволит оптимально подбирать группу пациентов, для которых анти-IL-4 терапия будет эффективной. Во-вторых, для корректного проведения доклинических испытаний необходимы более адекватные модели на животных. Учитывая многообразие фенотипов астмы, сложилась необходимость в создании разнообразных мышиных моделей, например, не только с эозинофильным, но и с нейтрофильным воспалением, а также необходимость использования причинно-значимых аллергенов при моделировании. Более того исследуемые препараты в доклинических испытаниях необходимо вводить не в профилактическом, а в терапевтическом режиме, т.е. после того как у животных разовьются признаки БА. Для этих целей разрабатываются хронические модели астмы.Both causes of unsuccessful clinical trials are overcome to one degree or another. Firstly, at present, asthma in humans is no longer regarded as an exclusively allergic Th2-mediated, eosinophilic disease, but is divided into separate clinical and molecular phenotypes. This phenotypic division of asthma will optimally select a group of patients for whom anti-IL-4 therapy will be effective. Secondly, for the correct conduct of preclinical trials, more adequate animal models are needed. Given the variety of phenotypes of asthma, there is a need to create a variety of mouse models, for example, not only with eosinophilic, but also with neutrophilic inflammation, as well as the need to use causally significant allergens in modeling. Moreover, the studied drugs in preclinical trials must be administered not in a prophylactic, but in a therapeutic regimen, i.e. after the animals develop signs of AD. For these purposes, chronic asthma models are being developed.

Таким образом, будущее развитие анти-IL-4 терапии будет связано с использованием адекватных моделей для доклинических исследованиях, а также с тщательным отбором респондентов из гетерогенной популяции астматиков для клинических исследований.Thus, the future development of anti-IL-4 therapy will be associated with the use of adequate models for preclinical studies, as well as with the careful selection of respondents from a heterogeneous population of asthmatics for clinical studies.

Недавнее открытие явления интерференции РНК (РНКи) - одного из основных механизмов посттранскрипционной регуляции генов, дало возможность использовать данный феномен для создания новых лекарственных средств, способных эффективно и безопасно подавлять экспрессию генов-мишеней. РНКи позволяет специфически «выключать» экспрессию генов-мишеней с помощью молекул siRNA (small interfering RNA - малых интерферирующих РНК). Для эффективной доставки siRNA в клетки-мишени применяют специальные молекулы-носители, формирующие комплексы с siRNA. Комплексование приводит к компактизации молекул РНК, их защите от деградации клеточными РНКазами, что в сочетании с позитивным суммарным зарядом, позволяет им эффективно проникать внутрь клетки и достигать нужной мишени.The recent discovery of the phenomenon of RNA interference (RNAi), one of the main mechanisms of post-transcriptional regulation of genes, made it possible to use this phenomenon to create new drugs that can effectively and safely suppress the expression of target genes. RNAi allows you to specifically "turn off" the expression of target genes using siRNA molecules (small interfering RNA - small interfering RNA). For effective delivery of siRNA to target cells, special carrier molecules are used that form complexes with siRNA. The combination leads to the compaction of RNA molecules, their protection against degradation by cellular RNases, which, combined with a positive total charge, allows them to efficiently penetrate into the cell and reach the desired target.

Главными преимуществами использования препаратов на основе РНКи являются высокая специфичность подавления экспрессии генов, вовлеченных в патогенез, а также высокая эффективность их подавления (до 90%), т.к. вводимые siRNA способны действовать в крайне низких концентрациях. Кроме того, привлекательной является сравнительная дешевизна методики. Синтез олигонуклеотидов в настоящее время вполне доступен и прост в масштабировании. Этот факт дает препаратам, созданным на базе, siRNA, важное конкурентное преимущество, например, по сравнению с моноклональными антителами.The main advantages of using RNAi-based drugs are the high specificity of suppressing the expression of genes involved in pathogenesis, as well as the high efficiency of their suppression (up to 90%), because administered siRNAs are capable of acting at extremely low concentrations. In addition, the comparatively low cost of the technique is attractive. The synthesis of oligonucleotides is currently quite affordable and easy to scale. This fact gives siRNA-based drugs an important competitive advantage, for example, compared to monoclonal antibodies.

Известны изобретения для лечения аллергических заболеваний, включая аллергическую бронхиальную астму и ринит путем блокирования экспрессии гена про-воспалительного цитокина IL-4.Inventions are known for the treatment of allergic diseases, including allergic bronchial asthma and rhinitis by blocking the expression of the pro-inflammatory cytokine IL-4 gene.

Известно применение моноклональных и биспецифических антител, которые специфически связываются с IL-4 и/или IL-13 (патент ЕР 2574630). Однако эффективность такого применения не высока, поскольку моноклональные антитела действуют на белковом (т.е. посттрансляционном уровне), в то же время препараты на основе интерференции РНК, к таковым относится и заявляемое изобретение, действуют на уровне мРНК (т.е. на посттранскрипционном уровне), что позволяет более эффективно блокировать ген-мишень за счет того, что с одной копии мРНК может синтезироваться более 1000 копий белка.The use of monoclonal and bispecific antibodies is known which specifically bind to IL-4 and / or IL-13 (patent EP 2574630). However, the effectiveness of this application is not high, since monoclonal antibodies act on the protein (i.e., post-translational level), at the same time, preparations based on RNA interference, such as the claimed invention, act at the mRNA level (i.e., on the post-transcriptional level), which allows more efficient blocking of the target gene due to the fact that more than 1000 copies of the protein can be synthesized from one copy of mRNA.

Помимо ингибирования путем непосредственного связывания цитокина, можно снижать его активность посредством блокирования соответствующего рецептора. Известно, что сигнальный путь IL-4 опосредован гетеродимерным комплексом двух белков рецептора: IL-4Rα и γ-цепи IL-2-рецептора. Создание моноклонального антитела (imAb) Х2/45, направленного против внеклеточного домена IL-4Rα позволило предположить его для ингибирования IL-4-опосредованных реакций, в том числе и для создания нового способа терапии бронхиальной астмы. Этот подход реализован в одном из изобретений (патент WO 2009121847), который относится к области применения антител или антигенсвязывающих фрагментов, специфичных для человеческого рецептора к IL-4. В данном изобретении также используются моноклональные антитела со всеми присущими им недостатками и ограничениями, описанными выше.In addition to inhibition by direct binding of the cytokine, its activity can be reduced by blocking the corresponding receptor. It is known that the IL-4 signaling pathway is mediated by a heterodimeric complex of two receptor proteins: IL-4Rα and the γ-chain of IL-2 receptor. The creation of a monoclonal antibody (imAb) X2 / 45 directed against the extracellular domain of IL-4Rα suggested it to inhibit IL-4-mediated reactions, including the creation of a new method for the treatment of bronchial asthma. This approach is implemented in one of the inventions (patent WO 2009121847), which relates to the field of application of antibodies or antigen-binding fragments specific for the human receptor for IL-4. Monoclonal antibodies are also used in this invention with all their inherent disadvantages and limitations described above.

Известно, что связывание IgE с FcεRI-рецепторами эффекторных клеток (тучные клетки, базофилы) индуцирует высвобождение медиаторов воспаления (гистамин, лейкотриены) и вызывает острые симптомы аллергического воспаления. Таким образом, взаимодействие IgE-FcεRI является одним из ключевых в патогенезе бронхиальной астмы. Этот факт был использован при создании изобретения для терапии аллергических воспалений в том числе бронхиальной астмы. Изобретение заключается в использовании Fab фрагмента антитела, который ингибирует IgE-FcεRI взаимодействия (патент WO 2002079257).It is known that the binding of IgE to FcεRI receptors of effector cells (mast cells, basophils) induces the release of inflammatory mediators (histamine, leukotrienes) and causes acute symptoms of allergic inflammation. Thus, the interaction of IgE-FcεRI is one of the key in the pathogenesis of bronchial asthma. This fact was used when creating the invention for the treatment of allergic inflammations, including bronchial asthma. The invention consists in the use of a Fab fragment of an antibody that inhibits IgE-FcεRI interaction (patent WO 2002079257).

Открытие РНК интерференции дало новые возможности для регуляции экспрессии патогенетически-значимых генов, в том числе и генов, вовлеченных в инициацию и развитие БА. РНКи активируется молекулами siRNA, которые имеют нуклеотидную последовательность комплементарную гену-мишени. Несмотря на сравнительно недавнее открытие РНКи уже имеются изобретения по применению данного подхода к терапии бронхиальной астмы. Известно, что CD23 участвует в активации T-лимфоцитов, которые в свою очередь вовлечены в патогенез бронхиальной астмы. Этот факт был использован при создании изобретения (патент US 8461125) для лечения бронхиальной астмы, заключающееся в использовании молекул siRNA для блокирования гена CD23.The discovery of RNA interference provided new opportunities for regulating the expression of pathogenetically significant genes, including genes involved in the initiation and development of AD. RNAi is activated by siRNA molecules that have a nucleotide sequence complementary to the target gene. Despite the relatively recent discovery of RNAi, there are already inventions on the application of this approach to the treatment of bronchial asthma. It is known that CD23 is involved in the activation of T-lymphocytes, which in turn are involved in the pathogenesis of bronchial asthma. This fact was used when creating the invention (patent US 8461125) for the treatment of bronchial asthma, which consists in the use of siRNA molecules to block the CD23 gene.

Еще одно изобретение заключается в использовании молекул siRNA для снижения синтеза антител класса IgE, как основных про-аллергических медиаторов (патент US 20110112169).Another invention is the use of siRNA molecules to reduce the synthesis of antibodies of the IgE class, as the main pro-allergic mediators (patent US 20110112169).

Однако эти изобретения (US 8461125, US 20110112169) направленны на подавление синтеза антител IgE, или препятствие связывания IgE антител с клетками мишенами, в то время как заявляемое изобретение направлено на подавление IL-4, с активации которого запускаются данные процесс, а такде патогенез бронхиальной астмы. В связи с этим ожидается, что заявляемое изобретение будет более эффективно подавлять признаки бронхиальной астмы.However, these inventions (US 8461125, US 20110112169) are aimed at suppressing the synthesis of IgE antibodies, or preventing the binding of IgE antibodies to target cells, while the claimed invention is aimed at suppressing IL-4, from the activation of which these processes are launched, as well as the pathogenesis of bronchial asthma In this regard, it is expected that the claimed invention will more effectively suppress signs of bronchial asthma.

Таким образом, прямых аналогов заявляемого изобретения, представляющего собой композицию, состоящую из катионного дендримерного пептида - LTP и двух молекул siRNA против гена IL-4 для подавления аллергического воспаления путем блокировки экспрессии гена про-воспалительного цитокина IL-4 не выявлено.Thus, direct analogues of the claimed invention, which is a composition consisting of a cationic dendrimer peptide - LTP and two siRNA molecules against the IL-4 gene to suppress allergic inflammation by blocking the expression of the pro-inflammatory cytokine IL-4 gene, were not detected.

Задачей предлагаемого изобретения является создание малотоксичного средства для лечения бронхиальной астмы.The task of the invention is to provide a low toxicity agent for the treatment of bronchial asthma.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание малотоксичной композиции, подавляющая экспрессию про-воспалительного гена IL-4.The technical result of the invention is the creation of a low-toxic composition that suppresses the expression of the pro-inflammatory gene IL-4.

Указанная задача решается, а технический результат достигается, за счет того, что композиция для подавления экспрессия гена цитокина интерлейкина-4 (IL-4) посредством механизма интерференции РНК состоит из катионного дендримерного пептида LTP с формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2, выступающего в качестве носителя, и двух молекул siRNA с формулами 5-UUGAUGAUCUCCUGUAAGGtt-3 (SEQ ID NO 57) и 5-AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt-3 (SEQ ID NO 59).This problem is solved, and the technical result is achieved due to the fact that the composition for suppressing the expression of the cytokine gene of interleukin-4 (IL-4) through the RNA interference mechanism consists of a cationic dendrimer peptide LTP with the formula (Arg) 8 (Lys) 4 (Lys ) 2Lys-Ala-Cys-NH2 acting as a carrier and two siRNA molecules with the formulas 5-UUGAUGAUCUCCUGUAAGGtt-3 (SEQ ID NO 57) and 5-AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt-3 (SEQ ID NO 59).

При отношении количества положительных зарядов пептида к количеству отрицательных зарядов нуклеиновых кислот от 24 до 96 композиция для подавления экспрессия гена цитокина интерлейкина-4 (IL-4) способна эффективно трансфецировать различные типы клеток.When the ratio of the number of positive charges of the peptide to the number of negative charges of nucleic acids is from 24 to 96, the composition for suppressing the expression of the cytokine gene of interleukin-4 (IL-4) is able to efficiently transfect various types of cells.

При LD50 равным 325 мг/кг композиция для подавления экспрессия гена цитокина интерлейкина-4 (IL-4) является малотоксичной.At an LD50 of 325 mg / kg, the composition for suppressing the expression of the cytokine gene of interleukin-4 (IL-4) is low toxic.

Изобретение поясняется рисунками, где на фиг. 1 представлена диаграмма эффективности трансфекции клеток HEK293T с использованием LTP, при этом условные обозначения приняты следующие: R - соотношение количества положительных зарядов LTP к количеству отрицательных зарядов плазмиды pGL3; pLuc - плазмида pGL3, кодирующая ген люциферазы luc; LU - световые единицы (light units); # - достоверно отличает от Lf2000 (Lipofectamine2000 (Invitrogen, США), использованный в качестве положительного контроля); × - достоверно отличается от pLuc (плазмида pGL3 без каких-либо трансфекционных реагентов); на фиг. 2 представлена диаграмма изменения концентрации IL-4 в супернатантах клеток HEK293T при котрансфекции молекул siRNA и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP, где приняты следующие условные обозначения: × - достоверно отличается от siP4; на фиг. 3 представлена эффективность трасфекции клеток HelaHI с использованием LTP; на фиг. 4 представлена эффективность трасфекции клеток A549 с использованием LTP; на фиг. 5 изображены защитные группировки 2′-гидроксильной группы мономера РНК; на фиг. 6 изображены мономеры с защитными группировками ТОМ фирмы Glen Research Corporation; на фиг. 7 изображены мономеры с защитными группировками TBDMS фирмы Glen Research; на фиг. 8 приведена хроматограмма образцов РНК-олигонуклеотидов - миРНК siIL4-89s; на фиг. 9 - хроматограмма образцов РНК-олигонуклеотидов - миРНК siIL4-89as; на фиг. 10 - хроматограмма образцов РНК-олигонуклеотидов - миРНК siIL4-153s; на фиг. 11 - хроматограмма образцов РНК-олигонуклеотидов - миРНК siIL4-153as; на фиг. 12 приведены масс-спектры, подтверждающие чистоту и структуру РНК-олигонуклеотидов siIL4-89s; на фиг. 13 приведены масс-спектры, подтверждающие чистоту и структуру РНК-олигонуклеотидов siIL4-89as; на фиг. 14 приведены масс-спектры, подтверждающие чистоту и структуру РНК-олигонуклеотидов siIL4-153s; на фиг. 15 приведены масс-спектры, подтверждающие чистоту и структуру РНК-олигонуклеотидов siIL4-153as; на фиг. 16 приведена аналитическая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) очищенного пептида LTP; на фиг. 17 приведен масс-спектр очищенного пептида LTP (MALDI-TOF, на приборе BRUKER Microflex LT); на фиг. 18 показана диаграмма подавления экспрессии гена про-воспалительного цитокина IL-4 посредством композиции siIL4-89-153/LTP.The invention is illustrated by drawings, where in FIG. 1 is a diagram of the efficiency of transfection of HEK293T cells using LTP, with the following conventions: R — ratio of the number of positive charges of LTP to the number of negative charges of plasmid pGL3; pLuc — plasmid pGL3 encoding the luc luciferase gene; LU - light units; # - significantly distinguishes from Lf2000 (Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA), used as a positive control); × - significantly different from pLuc (plasmid pGL3 without any transfection reagents); in FIG. Figure 2 shows a diagram of changes in IL-4 concentration in HEK293T cell supernatants upon cotransfection of siRNA molecules and recombinant plasmid pUCHR IL4 IRES GFP, where the following conventions are used: × - significantly different from siP4; in FIG. 3 shows the efficacy of HelaHI cell transfection using LTP; in FIG. 4 shows the efficacy of A549 cell transfection using LTP; in FIG. 5 shows the protective groups of the 2′-hydroxyl group of the RNA monomer; in FIG. 6 depicts monomers with TOM protecting groups from Glen Research Corporation; in FIG. 7 depicts monomers with TBDMS protecting groups from Glen Research; in FIG. 8 shows a chromatogram of samples of RNA oligonucleotides - siIL4-89s siRNA; in FIG. 9 is a chromatogram of samples of RNA oligonucleotides - siIL4-89as miRNA; in FIG. 10 is a chromatogram of samples of RNA oligonucleotides - siIL4-153s miRNAs; in FIG. 11 is a chromatogram of samples of RNA oligonucleotides siIL4-153as miRNA; in FIG. 12 shows mass spectra confirming the purity and structure of siIL4-89s RNA oligonucleotides; in FIG. 13 shows mass spectra confirming the purity and structure of siIL4-89as RNA oligonucleotides; in FIG. 14 shows mass spectra confirming the purity and structure of siIL4-153s RNA oligonucleotides; in FIG. 15 shows mass spectra confirming the purity and structure of siIL4-153as RNA oligonucleotides; in FIG. 16 shows analytical high performance liquid chromatography (HPLC) of the purified LTP peptide; in FIG. 17 shows the mass spectrum of the purified LTP peptide (MALDI-TOF, on a BRUKER Microflex LT instrument); in FIG. 18 is a graph of suppressing the expression of the pro-inflammatory cytokine IL-4 gene by the siIL4-89-153 / LTP composition.

Выбор оптимальных молекул siRNA для композиции siIL4-89-153/LTP осуществлялся следующим образом. Для выбора оптимальных последовательностей молекул siRNA было использовано специализированное программное обеспечение OligoWalk, которое рассчитывает термодинамические параметры гибридизации РНК-олигонуклеотидов, предсказывает их свободную энергию связывания с мРНК-мишеньюThe selection of optimal siRNA molecules for the composition siIL4-89-153 / LTP was carried out as follows. To select the optimal sequences of siRNA molecules, the specialized OligoWalk software was used, which calculates the thermodynamic parameters of hybridization of RNA oligonucleotides, predicts their free binding energy to the target mRNA

(http://rna.urmc.rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_form.cgi). Метод селекции эффективных вариантов миРНК описан в статье (Lu Z.J. and Mathews D.H., 2008).(http://rna.urmc.rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_form.cgi). The method of selection of effective siRNA variants is described in the article (Lu Z.J. and Mathews D.H., 2008).

Для предсказания оптимальных вариантов siRNA, способных подавлять ген il-4 человека, была использована кодирующая часть нуклеотидной последовательности данного гена, опубликованная в базе данных GeneBank (Номер: M13982.1), ее последовательность представлена далее (SEQ ID NO 1):To predict the optimal siRNA variants that can suppress the human il-4 gene, the coding part of the nucleotide sequence of this gene, published in the GeneBank database (Number: M13982.1), was used, its sequence is presented below (SEQ ID NO 1):

С использованием программы OligoWalk было спрогнозировано 55 различных вариантов молекул siRNA, последовательности смысловых цепей и их возможная эффективность представлены в таблице (таб. 3). Серым цветом в таблице выделены выбранные варианты.Using the OligoWalk program, 55 different variants of siRNA molecules were predicted, the sequences of sense strands and their possible effectiveness are presented in the table (Table 3). The selected options are highlighted in gray in the table.

Из представленных в таблице 3 вариантов siRNA были выбраны варианты №5 и №16, они получили названия siIL4-89 и siIL4-153, соответственно. Выбор именно этих вариантов миРНК основан на рекомендациях, описанных в публикациях (Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 V. 411(6836). P. 494-8.). Согласно этим рекомендациям положение участка отжига на мРНК гена-мишени (il-4 человека) не должен находиться ближе 50 пн относительно Start-кодона гена, т.к. в данном участке мРНК-мишени инициируется трансляция, которая сопряжена с привлечением различных инициирующих белковых факторов, что снижает пространственную доступность данного участка для молекул миРНК, и как следствие понижает их активность. Рекомендуется избегать повторяющихся более 4 раз нуклеотидов таких как «АААА» и «GGGG». Рекомендуется изучить нуклеотидную последовательность миРНК на предмет сходства с другими генами в геноме человека, чтобы избежать подавления экспрессии иных генов, что может вызвать побочные эффекты лекарственного средства, в составе которого будет данная композиция. Также рекомендовано для 19-нуклеотидной последовательности спрогнозированной программой OligoWalk на 3′-конец РНК-олгонуклеотидов добавить динуклеотид «TT». С учетом этих рекомендаций были спроектированы последовательности четырех РНК-олигонуклеотидов, составляющих две молекулы siRNA для дальнейшей наработки. Их последовательности представлены в таблице 4.From the siRNA variants presented in Table 3, variants No. 5 and No. 16 were selected; they were named siIL4-89 and siIL4-153, respectively. The selection of these siRNA variants is based on the recommendations described in publications (Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 V. 411 (6836). P. 494-8.). According to these recommendations, the position of the annealing site on the mRNA of the target gene (human il-4) should not be closer than 50 bp relative to the Start codon of the gene, because in this region of the target mRNA, translation is initiated, which is associated with the involvement of various initiating protein factors, which reduces the spatial availability of this region for siRNA molecules, and as a result reduces their activity. It is recommended that nucleotides such as “AAAA” and “GGGG” be repeated more than 4 times. It is recommended to study the nucleotide sequence of siRNA for similarity with other genes in the human genome in order to avoid inhibition of the expression of other genes, which can cause side effects of the drug, which will include this composition. It is also recommended that for the 19-nucleotide sequence predicted by the OligoWalk program, the TT dinucleotide be added to the 3′-end of the RNA olgonucleotides. Based on these recommendations, sequences of four RNA oligonucleotides comprising two siRNA molecules were designed for further development. Their sequences are presented in table 4.

Таким образом, выбрано 2 молекулы siRNA, каждая из которых состоит из двух РНК-олигонуклеотидов смысловой и антисмысловой полярности. Каждая из двух молекул siRNA способна независимо связываться с различными участками молекулы мРНК гена il-4, что повысит эффективность подавления гена-мишени.Thus, 2 siRNA molecules were selected, each of which consists of two RNA oligonucleotides of sense and antisense polarity. Each of the two siRNA molecules is able to independently bind to different parts of the il-4 gene mRNA molecule, which will increase the efficiency of suppressing the target gene.

Более того, известно, что для гена il-4 человека характерен полиморфизм нуклеотидной последовательности, т.е. в человеческой популяции присутствуют индивидуумы, у которых нуклеотидная последовательность в различных участках гена незначительно отличается. Все это может значительно снизить эффективность лекарственных средств, созданных на основе данной композиции. Иными словами, индивидуумы-носители полифонных мутаций в гене il-4 могут оказаться нечувствительными к такому препарату (хотя и с незначительной вероятностью), которое будет содержать в своем составе лишь одну молекулу siRNA. Поэтому в заявляемом изобретении применяется два варианта молекул siRNA, способных независимо связываться с разными участками мРНК гена il-4, что повысит универсальность лекарственных средств на основе данной композиции.Moreover, it is known that the human il-4 gene is characterized by polymorphism of the nucleotide sequence, i.e. in the human population there are individuals in which the nucleotide sequence in different parts of the gene is slightly different. All this can significantly reduce the effectiveness of drugs created on the basis of this composition. In other words, individuals carrying polyphonic mutations in the il-4 gene may be insensitive to such a drug (albeit with a low probability), which will contain only one siRNA molecule. Therefore, in the claimed invention, two variants of siRNA molecules are used that are able to independently bind to different mRNA regions of the il-4 gene, which will increase the universality of drugs based on this composition.

Пример 1. Для экспериментального подтверждения способности спроектированных молекул siRNA подавлять экспрессию про-воспалительного гена IL-4 человека был проведен соответствующий эксперимент in vitro с использованием культуры клеток HEK293T (эмбриональная почка человека) и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP, способной экспрессировать в этих клетках IL-4 человека.Example 1. To experimentally confirm the ability of the designed siRNA molecules to suppress the expression of the pro-inflammatory human IL-4 gene, a corresponding in vitro experiment was performed using a HEK293T cell culture (human embryonic kidney) and a recombinant plasmid pUCHR IL4 IRES GFP capable of expressing IL in these cells -4 people.

Для оценки эффективности подавления IL-4 молекулами siRNA (siIL4-89 и siIL4-153) 0,75×10⁵ клеток HEK293T трансфецировали смесью, состоящей из 0,25 мкг плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP, 0,5 мкг молекул siRNA и 1,5 мкл Lipofectamine2000 (Invitrogen, США) в 80 мкл optiMEM (Gibco, США). В качестве положительного контроля использовали siRNA, направленную против мРНК-gfp, которая (siGFP) подавляет экспрессию гена GFP, находящегося в составе трансфецируемой плазмиды. Так как клонированный ген IL-4 мыши и ген GFP находятся под общим промотором и транскрибируются в виде единого мРНК-транскрипта, то siGFP, подавляет и экспрессию IL-4. В качестве отрицательного контроля в эксперименте использовали siRNA против мРНК гена p респираторно-синцитиального вируса (RSV) (siP), которая не имеет сходства с последовательностями генов IL-4 и GFP. Последовательности siRNA использованные в экспериментах представлены в таблице 5.To assess the effectiveness of IL-4 suppression by siRNA molecules (siIL4-89 and siIL4-153), 0.75 × 10 ⁵ HEK293T cells were transfected with a mixture of 0.25 μg of the pUCHR IL4 IRES GFP plasmid, 0.5 μg of siRNA molecules and 1, 5 μl of Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA) in 80 μl of optiMEM (Gibco, USA). As a positive control, siRNA directed against gfp mRNA was used, which (siGFP) inhibits the expression of the GFP gene contained in the transfected plasmid. Since the cloned mouse IL-4 gene and the GFP gene are under a common promoter and are transcribed as a single mRNA transcript, siGFP also inhibits IL-4 expression. As a negative control, siRNA was used against the mRNA of the p gene of the respiratory syncytial virus (RSV) (siP), which is not similar to the sequences of the IL-4 and GFP genes. The siRNA sequences used in the experiments are presented in table 5.

Сутки после котрансфекции образцы клеточных супернатантов были собраны, и концентрация IL-4 была определена в них методом ИФА. Согласно полученным данным siGFP снижала экспрессию IL-4 на 70% в сравнении с неспецифической siP4, в то же время смесь siIL4-89 и siIL4-153 также снижала экспрессию IL-4, но 73% (фиг. 2).The day after cotransfection, cell supernatant samples were collected, and the concentration of IL-4 was determined in them by ELISA. According to the data obtained, siGFP reduced the expression of IL-4 by 70% compared to non-specific siP4, while a mixture of siIL4-89 and siIL4-153 also reduced the expression of IL-4, but 73% (Fig. 2).

Таким образом, экспериментально была подтверждена способность спроектированных молекул siRNA (siIL4-89 и siIL4-153) эффективно подавлять экспрессию про-воспалительного гена IL-4.Thus, the ability of the engineered siRNA molecules (siIL4-89 and siIL4-153) to effectively inhibit the expression of the pro-inflammatory gene IL-4 was experimentally confirmed.

Затем проводили выбор оптимальной структуры катионного дендримерного пептида - LTP.Then, the optimal structure of the cationic dendrimer peptide, LTP, was selected.

Помимо двух типов молекул siRNA (siIL4-89 и siIL4-153) в состав заявляемого изобретения входит катионный дендримерный пептид LTP, который выполняет роль носителя для молекул siRNA. Оптимальная структура пептида была выбрана в результате теоретического анализа известных литературных данных, анализе функционирования природных транспортных белков и экспериментальной проверке различных структурных особенностей пептидов. Проведенный нами предварительный анализ обусловил выбор 22 катионных пептидных последовательностей в качестве предполагаемых эффективных носителей молекул siRNA (таблица 6). Выбранные структуры можно подразделить на три основные группы: линейные пептиды, липопептиды, содержащие привязанный к N-концу остаток пальмитиновой кислоты, и - дендримерные пептиды, имеющие ветвления по аминогруппам лизина. Дальнейший выбор оптимальной структуры носителя базировался на результатах экспериментов по трансфекции клеточных культур.In addition to two types of siRNA molecules (siIL4-89 and siIL4-153), the claimed invention includes a cationic dendrimer peptide LTP, which acts as a carrier for siRNA molecules. The optimal structure of the peptide was chosen as a result of a theoretical analysis of known literature data, analysis of the functioning of natural transport proteins, and experimental verification of various structural features of the peptides. Our preliminary analysis determined the choice of 22 cationic peptide sequences as the proposed effective carriers of siRNA molecules (table 6). The selected structures can be divided into three main groups: linear peptides, lipopeptides containing the palmitic acid residue attached to the N-terminus, and dendrimer peptides having branching at the amino groups of lysine. Further selection of the optimal carrier structure was based on the results of experiments on transfection of cell cultures.

Для этого все соединения с различной структурой, представленные в таблице 6 были синтезированы твердофазным методом, очищены и использованы в экспериментах по изучению эффективности трансфекции. Трансфекционная активность синтезированных структур оценивалась в эксперименте in vitro с использованием клеточной линии HEK293T (эмбриональная почка человека). Различные концентрации ситезированных пептидов индивидуально смешивались с одинаковым количеством (0,25 мкг) плазмидной ДНК, несущей репортерный ген GFP (зеленый флуоресцирующий белок); плазмида pUCHR IRES GFP. Конечный объем смеси = 80 мкл питательной среды optiMEM (Gibco, США), не содержащей антибиотики и эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС). Смесь пептида и ДНК инкубировалась при комнатной температуре в течение 30 минут, при этом происходило образование электростатического комплекса пепетид/ДНК. После этого весь объем смеси (80 мкл) был внесен в предварительно подготовленную культуру клеток HEK293T. Культура клеток готовилась заранее в 48-луночном плейте (Costar, США): количество клеток 75000 в объеме 300 мкл полной питательно среды ДМЕМ (Gibco, США), содержащая 10% ЭТС (Hyclone, США) и 80 мг/л антибиотика Гентамицина (Gibco, США). Далее после внесения смеси в лунки с клетками их инкубировали 48 часов при 37 C в 5% атмосфере CO₂. После инкубации осуществляли оценку эффективности проникновения плазмиды pUCHR IRES GFP методом флуоресцентной микроскопии. Эффективность проникновение ДНК в клетки была прямо пропорциональная интенсивности флуоресценции клеток, т.е. чем эффективнее пептид способствует внутриклеточному проникновению ДНК, тем выше интенсивность флуоресценции.For this, all compounds with different structures shown in Table 6 were synthesized by the solid-phase method, purified and used in experiments to study the efficiency of transfection. The transfection activity of the synthesized structures was evaluated in an in vitro experiment using the HEK293T cell line (human embryonic kidney). Different concentrations of synthesized peptides were individually mixed with the same amount (0.25 μg) of plasmid DNA carrying the GFP reporter gene (green fluorescent protein); plasmid pUCHR IRES GFP. The final volume of the mixture = 80 μl of optiMEM nutrient medium (Gibco, USA) that does not contain antibiotics and fetal calf serum (ETS). The mixture of peptide and DNA was incubated at room temperature for 30 minutes, while the formation of the electrostatic complex peptid / DNA. After that, the entire volume of the mixture (80 μl) was added to the previously prepared HEK293T cell culture. The cell culture was prepared in advance in a 48-well plate (Costar, USA): the number of cells 75000 in a volume of 300 μl of complete nutrient medium DMEM (Gibco, USA) containing 10% ETS (Hyclone, USA) and 80 mg / l of the antibiotic Gentamicin (Gibco , USA). Then, after the mixture was added to the wells with cells, they were incubated for 48 hours at 37 ° C in 5% CO ₂ atmosphere. After incubation, the penetration efficiency of the pUCHR IRES GFP plasmid was evaluated by fluorescence microscopy. The efficiency of DNA penetration into cells was directly proportional to the fluorescence intensity of cells, i.e. the more effective the peptide promotes the intracellular penetration of DNA, the higher the fluorescence intensity.

По результатам данного исследования (таблица 6) можно заключить, что наибольшую трансфекционную активность из изученных пептидов проявлял дендримерный катионный пептид с формулой (R)₈(K)₄(K)₂KAC-NH₂, обозначенный нами как LTP, входящий в состав композиции siIL4-89-153/LTP, которая является предметом данного изобретения.According to the results of this study (table 6), we can conclude that the greatest transfection activity of the studied peptides was shown by the dendrimer cationic peptide with the formula (R) ₈ (K) ₄ (K) ₂ KAC-NH ₂ , which we designated as LTP, which is part of the composition siIL4-89-153 / LTP, which is the subject of this invention.

Выбор оптимального массового соотношения компонентов в композиции проводили следующим образом.The choice of the optimal mass ratio of the components in the composition was carried out as follows.

Поскольку катионный носитель LTP и молекулы IL-4 (siIL4-89-153/LTP) являются уникальным соединениями, синтезированным впервые, то для подбора оптимального соотношения LTP/siRNA целесообразно использовать плазмидную ДНК, несущую репортерный ген luc, кодирующий фермент - люциферазу светлячков. Такая система удобна тем, что эффективность трансфекции будет напрямую связана с уровнем люминесценции клетки, и он легко измеряется специальным люминометром. Так как химические структуры ДНК и РНК очень близки, а количество отрицательных зарядов на 1 моль в ДНК и РНК идентичны, то эффективность комплексов носитель/ДНК коррелирует с эффективностью комплексов носитель/siRNA (Faizuloev et al., 2012). Поэтому оптимизация соотношения LTP/siRNA была проведена с использованием плазмидной ДНК (pGL3), кодирующей репортерный ген люциферазы светлячка (luc).Since the cationic LTP carrier and IL-4 molecules (siIL4-89-153 / LTP) are unique compounds synthesized for the first time, it is advisable to use plasmid DNA carrying the luc reporter gene encoding the firefly luciferase enzyme to select the optimal LTP / siRNA ratio. Such a system is convenient in that the transfection efficiency will be directly related to the luminescence level of the cell, and it is easily measured with a special luminometer. Since the chemical structures of DNA and RNA are very close, and the number of negative charges per mole of DNA and RNA is identical, the efficiency of the carrier / DNA complexes correlates with the efficiency of the carrier / siRNA complexes (Faizuloev et al., 2012). Therefore, optimization of the LTP / siRNA ratio was performed using plasmid DNA (pGL3) encoding the firefly luciferase reporter gene (luc).

Для этого культуру клеток HEK293T засевают в 48-луночный плейт в полной среде ДМЕМ, которая содержит 10% эмбриональной телячий сыворотки (ЭТС), 300 мг/л Глутамина-L и 60 мг/мл Гентамицина в количестве 75 тыс. клеток на лунку в объеме 300 мкл полной среды ДМЕМ и культивируют при 37 C в 5% атмосфере CO₂ до образования монослоя 75% конфлуентности (1 сутки).For this, a HEK293T cell culture is seeded in a 48-well plate in complete DMEM medium, which contains 10% fetal calf serum (ETS), 300 mg / L Glutamine-L and 60 mg / ml Gentamicin in an amount of 75 thousand cells per well in volume 300 μl of complete DMEM medium and cultured at 37 C in 5% CO ₂ atmosphere until a monolayer of 75% confluence was formed (1 day).

Комплекс pGL3 и LTP готовился среде optiMEM (Gibco) не содержащей ЭТС и антибиотиков. Для этого необходимое количество LTP смешивали с 40 мкл optiMEM в отдельной пробирке, а 0,25 мкг pGL3 также смешивали с 40 мкл optiMEM в отдельной пробирке. Затем содержимое пробирки с pGL3 смешивали с содержимым пробирки с LTP, таким образом суммарный объем комплекса составил 80 мкл. Для достижения равновесного состояния комплекса LTP/ДНК смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 25-30 минут избегая попадания прямых солнечных лучей или других источников ультрафиолетового излучения.The pGL3 and LTP complex was prepared with optiMEM (Gibco) medium containing no ETS and antibiotics. For this, the required amount of LTP was mixed with 40 μl of optiMEM in a separate tube, and 0.25 μg of pGL3 was also mixed with 40 μl of optiMEM in a separate tube. Then the contents of the tube with pGL3 were mixed with the contents of the tube with LTP, so the total volume of the complex was 80 μl. To achieve the equilibrium state of the LTP / DNA complex, the mixture was incubated at room temperature for 25-30 minutes avoiding direct sunlight or other sources of ultraviolet radiation.

Готовили несколько вариантов комплекса с различным соотношением количества положительных зарядов LTP к количеству отрицательных зарядов pGL3 (R).Several variants of the complex were prepared with a different ratio of the number of positive charges of LTP to the number of negative charges of pGL3 (R).

R=N(+)/N(-),R = N (+) / N (-),

где R - соотношение количества положительных зарядов LTP к количеству отрицательных зарядов pGL3, N(+) - количество положительных зарядов LTP, N(-) - количество отрицательных зарядов pGL3.where R is the ratio of the number of positive LTP charges to the number of negative pGL3 charges, N (+) is the number of positive LTP charges, N (-) is the number of negative pGL3 charges.

Известно, что количество отрицательных зарядов на 1 мкг pGL3 (N(-))=17,3×10¹⁴, а что количество положительных зарядов на 1 мкг LTP (N(-))=39,3×10¹⁴.It is known that the number of negative charges per 1 μg pGL3 (N (-)) = 17.3 × 10 ¹⁴ , and that the number of positive charges per 1 μg LTP (N (-)) = 39.3 × 10 ¹⁴ .

Подготовленный и сформированный комплекс LTP/pGL3 в объеме 80 мкл optiMEM вносили к клеткам в лунки 48-луночного плейта по каплям и инкубировали при 37 C в 5% атмосфере CO₂ в течение 2 суток.The prepared and formed LTP / pGL3 complex in a volume of 80 μl optiMEM was added dropwise to the cells in the wells of a 48-well plate and incubated at 37 ° C in 5% CO ₂ atmosphere for 2 days.

После инкубации клеток с комплексом надосадочную среду удаляли из лунок плейта, а монослой клеток лизировали в 60 мкл специального буфера Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega). Лизат клеток переносили в отдельные пробирки на 1,5 мл и центрифугировали и осуществляли цикл замораживания оттаивания для лучшего лизиса клеток; замораживание проводили в течение ночи при -70 C, а оттаивание в течение 10-15 мин при 37 C в твердотельном термостате Далее лизаты клеток вортексировали и центрифугировали при 10000 об/мин при 4 C в течение 2 минут для удаления клеточного дебриза. Надосадок переносили в отдельные пробирки на 1,5 мл и проводили измерение люциферазной активности каждого образца путем смешивания 50 мкл лизата с 50 мкл люциферина - субстрата для люфиферазы. При наличие в образце фермента люциферазы происходит излучение света, интенсивность которого детектировалось люминометром (Promega).After incubation of the cells with the complex, the supernatant was removed from the plate wells, and the cell monolayer was lysed in 60 μl of a special Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega) buffer. The cell lysate was transferred to separate 1.5 ml tubes and centrifuged and a thaw freezing cycle was carried out to better cell lysis; freezing was performed overnight at -70 ° C, and thawing for 10-15 minutes at 37 ° C in a solid state thermostat. Next, cell lysates were vortexed and centrifuged at 10,000 rpm at 4 ° C for 2 minutes to remove cell debris. The supernatant was transferred to separate 1.5 ml tubes and the luciferase activity of each sample was measured by mixing 50 μl of lysate with 50 μl of luciferin, a substrate for luffiferase. When a luciferase enzyme is present in the sample, light is emitted, the intensity of which was detected by a luminometer (Promega).

Эффективность трансфекции культуры клеток HEK293T с использованием LTP была сравнима с коммерческим реагентом Lipofectamine2000. Оптимальное соотношение R при трансфекции клеток HEK293T находилось в пределах от 96 до 254 (фиг. 1). При трансфекции клеток HelaHI (эпителиоидная карцинома шейки матки) оптимальные соотношения (R) находились в пределах от 48 до 254 (рис. 3). При изучении эффективности трансфекции клеток A549 (карцинома легкого) показано, что оптимальная соотношение (R) находится в пределах от 32 до 254 (фиг. 4).The efficacy of transfection of HEK293T cell culture using LTP was comparable to the commercial Lipofectamine2000 reagent. The optimal ratio of R during transfection of HEK293T cells was in the range from 96 to 254 (Fig. 1). During transfection of HelaHI cells (cervical epithelioid carcinoma), the optimal ratios (R) were in the range from 48 to 254 (Fig. 3). When studying the efficiency of transfection of A549 cells (lung carcinoma), it was shown that the optimal ratio (R) is in the range from 32 to 254 (Fig. 4).

На фиг. 4 использованы следующие условные обозначения:In FIG. 4, the following conventions are used:

R - соотношение количества положительных зарядов LTP к количеству отрицательных зарядов плазмиды pGL3;R is the ratio of the number of positive charges of LTP to the number of negative charges of plasmid pGL3;

pLuc - плазмида pGL3, кодирующая ген люциферазы luc;pLuc — plasmid pGL3 encoding the luc luciferase gene;

LU - световые единицы (light units);LU - light units;

# - достоверно отличает от Lf2000 (Lipofectamine2000 (Invitrogen, США), использованный в качестве положительного контроля);# - significantly distinguishes from Lf2000 (Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA), used as a positive control);

× - достоверно отличается от pLuc (плазмида pGL3 без каких-либо трансфекционных реагентов).× - significantly different from pLuc (plasmid pGL3 without any transfection reagents).

Также определена эффективность трасфекции клеток HelaHI с использованием LTP, результаты которой преведены на фиг. 3, гдеThe efficacy of HelaHI cell transfection using LTP was also determined, the results of which are shown in FIG. 3 where

LU - световые единицы (light units);LU - light units;

Lf2000 - Lipofectamine2000 (Invitrogen, США), используется в качестве положительного контроля;Lf2000 - Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA), used as a positive control;

Также была определена эффективность трасфекции клеток A549 с использованием LTP, результаты которой приведены на фиг. 4, гдеThe efficacy of A549 cell transfection using LTP was also determined, the results of which are shown in FIG. 4 where

LU - световые единицы (light units);LU - light units;

* - достоверно отличается от pLuc (плазмида pGL3 без каких-либо трансфекционных реагентов).* - significantly different from pLuc (plasmid pGL3 without any transfection reagents).

Таким образом, суммировав результаты трасфекции трех различных клеточных линий можно заключить, что наиболее оптимальное соотношение LTP/siRNA будет находиться в пределах от 48 до 128. С точки зрения экономической целесообразности соотношение зарядов R=48, что соответствует соотношению LTP/siRNA 25/1 по массе является наиболее оптимальным, т.к. выбор такого состава композиции позволит эффективно трасфецировать различные типы клеток с минимальными затратами LTP.Thus, summing up the results of transfection of three different cell lines, we can conclude that the most optimal LTP / siRNA ratio will be in the range from 48 to 128. From the point of view of economic feasibility, the charge ratio is R = 48, which corresponds to the LTP / siRNA ratio 25/1 in mass is the most optimal, because the choice of such a composition composition will allow efficiently trasfecting various types of cells with minimal LTP.

Получение композиции siIL4-89-153/LTP осуществлялось следующим способом.Obtaining the composition siIL4-89-153 / LTP was carried out in the following way.

Синтез молекул siRNA (siIL4-89 и siIL4-153), входящих в состав композиции siIL4-89-153/LTP, осуществляют амидофосфатным методом твердофазного синтеза. Суть метода заключается в добавлении одного нуклеотидного звена к иммобилизованному защищенному нуклеозиду или олигонуклеотиду. Нуклеозидный компонент связан ковалентно с нерастворимым полимером, а нуклеотидный компонент и необходимые реагенты находятся в растворе. В качестве полимерной подложки использовали стекло Glen 20-2030-10 dT-CPG-500 °А. 3′-Концевой нуклеозидный остаток связывается с такими матрицами через сукцинильное спейсерное звено. Никаких стадий очистки не проводится до тех пор, пока полностью синтезированная олигомерная последовательность не будет удалена с твердой фазы.The synthesis of siRNA molecules (siIL4-89 and siIL4-153), which are part of the composition siIL4-89-153 / LTP, is carried out by the amidophosphate method of solid-phase synthesis. The essence of the method is to add one nucleotide unit to an immobilized protected nucleoside or oligonucleotide. The nucleoside component is covalently bound to an insoluble polymer, and the nucleotide component and the necessary reagents are in solution. As the polymer substrate used glass Glen 20-2030-10 dT-CPG-500 ° A. The 3′-terminal nucleoside residue binds to such matrices via a succinyl spacer unit. No purification steps are carried out until the fully synthesized oligomeric sequence is removed from the solid phase.

Синтез проводится на ДНК-синтезаторе Poligen 2000 с 12 колонками. Управление и программирование осуществляют с помощью вынесенного компьютера. Приготовление рабочих растворов для синтеза проводится по протоколу, указанному в таблице 7.The synthesis is carried out on a Poligen 2000 DNA synthesizer with 12 columns. Management and programming is carried out using a remote computer. Preparation of working solutions for the synthesis is carried out according to the protocol specified in table 7.

Для синтеза РНК-олигонуклеотидов, составляющих молекул siRNA проводился подбор мономеров. В синтезе РНК используются строительные блоки с «дополнительной» 2′-гидроксильной группой, не участвующей в синтезе. Ее защищают трет-бутилдиметилсилильной (TBDMS) или триизопропилсилилоксиметильной (ТОМ) группой (фиг. 5, 6).For the synthesis of RNA oligonucleotides that make up siRNA molecules, monomers were selected. RNA synthesis uses building blocks with an “additional” 2′-hydroxyl group that is not involved in the synthesis. It is protected by tert-butyldimethylsilyl (TBDMS) or triisopropylsilyloxymethyl (TOM) group (Fig. 5, 6).

ТОМ-защита обладает более низким стерическим фактором, чем TBMDS, что обеспечивает высокую эффективность сцепления мономеров. Еще одной особенностью ТОМ является то, что во время основных стадий синтеза практически исключена ее миграция из 2′ в 3′ положение, что сводит к минимуму получение небиологических активных связей.TOM protection has a lower steric factor than TBMDS, which provides high coupling efficiency of monomers. Another feature of TOM is that during the main stages of synthesis its migration from the 2 ′ to 3 ′ position is practically excluded, which minimizes the production of non-biological active bonds.

Были проведены параллельно синтезы, с использованием мономеров с ТОМ- и TBMDS-защитами.Syntheses were carried out in parallel using monomers with TOM and TBMDS protections.

В обоих случаях синтез прошел с высокой эффективностью, но, исходя из экономической целесообразности, для дальнейшей работы были выбраны мономеры с TBMDS-защитой. Спектры полученных РНК-олигонуклеотидов для обоих случаев идентичны, что свидетельствует об идентичности продуктов.In both cases, the synthesis was highly efficient, but, based on economic feasibility, monomers with TBMDS protection were chosen for further work. The spectra of the obtained RNA oligonucleotides for both cases are identical, which indicates the identity of the products.

После синтеза РНК-олигонуклеотидов у них были удалены все защитные группы:After the synthesis of RNA oligonucleotides, all protective groups were removed from them:

1. 5′-концевая DMT-группа (удаляется после очистки олигонуклеотида методом ВЭЖХ);1. 5′-terminal DMT group (removed after purification of the oligonucleotide by HPLC);

2. Ацильные и бензильные защитные группы;2. Acyl and benzyl protective groups;

3. 3′-цианэтильные группы, защищающие межнуклеозидные фосфатные группы;3. 3′-cyanoethyl groups protecting internucleoside phosphate groups;

4. 2′-O-Si-связь4. 2′-O-Si bond

Отщепление олигонуклеотида от носителя, удаление защитных групп оснований и цианэтильных защитных групп проводили одновременно под действием водного раствора аммиак/метиламин.Cleavage of the oligonucleotide from the carrier, removal of the protective groups of the bases and cyanethyl protective groups was carried out simultaneously under the action of an aqueous solution of ammonia / methylamine.

Для удаления защиты с 2′-конца (с сохранением 5′-DMT-группы) использовали следующую методику (количества реактивов указаны на 250 мг олигонуклеотида).To remove protection from the 2′-end (while maintaining the 5′-DMT group), the following procedure was used (the number of reagents is indicated per 250 mg of oligonucleotide).

Сначала полностью растворяли РНК-олигонуклеотид в 115 мкл диметилсульфоксида DMSO (для лучшей растворимости нагревать в течение 5 мин при температуре 65°C).First, the RNA oligonucleotide was completely dissolved in 115 μl of DMSO dimethyl sulfoxide (for better solubility, heat for 5 minutes at 65 ° C).

Затем добавляли 60 мкл триэтиламина TEA к раствору DMSO/олигонуклеотид и аккуратно перемешивали. После этого добавляли 75 мкл TEA*3HF и нагревали раствор при 65°C в течение 2,5 часов. После чего раствор немедленно охлаждали.Then, 60 μl of TEA triethylamine was added to the DMSO / oligonucleotide solution and gently mixed. After that, 75 μl of TEA * 3HF was added and the solution was heated at 65 ° C for 2.5 hours. After which the solution was immediately cooled.

При подготовке олигонуклеотидов к очистке их предварительно обессоливали осаждением растворов по следующей методике:When preparing oligonucleotides for purification, they were previously desalted by precipitation of solutions according to the following procedure:

1. Добавить 5 мкл перхлората лития LiClO4 на 1 мкл раствора олигонуклеотида.1. Add 5 μl of lithium perchlorate LiClO4 per 1 μl of oligonucleotide solution.

2. Центрифугировать 10 мин при 12,5000 rpm2. Centrifuge for 10 min at 12.5000 rpm

3. Отобрать надосадочную жидкость (перхлорат лития), используя стерильный наконечник.3. Select supernatant (lithium perchlorate) using a sterile tip.

4. Промыть осадок ацетоном 2-3 раза, пока раствор не станет прозрачным.4. Rinse the precipitate with acetone 2-3 times until the solution becomes clear.

5. Отобрать надосадочную жидкость (ацетон), используя стерильный наконечник.5. Select supernatant (acetone) using a sterile tip.

6. Высушить под высоким вакуумом для удаления следов ацетона.6. Dry under high vacuum to remove traces of acetone.

Очистка РНК-олигонуклеотидов проводилась методом обращено-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии). Такой метод очистки был выбран исходя из того, что только целевой компонент (синтетический РНК-олигонуклеотид) содержит на 5-конце гидрофобную диметокситритильную группу. Все побочные продукты с более низкой молекулярной массой, которые могли появиться в результате твердофазного синтеза, не несут на 5′-конце диметокситритильной группы. Оптимальным методом выделения для такого компонента является градиентная хроматография на обращено-фазовой колонке C18 с полярным растворителем (50% ацетонитрил) в качестве элюента, где целевой компонент будет обладать наибольшим временем удерживания и соответственно может легко быть отделен от нецелевых продуктов. Подбор градиента состава подвижной фазы в зависимости от времени подбирался экспериментально. Критерием отбора было оптимальное разделение целевого компонента от остальных при наименьшем времени очистки.Purification of RNA oligonucleotides was carried out by reverse phase HPLC (high performance liquid chromatography). This purification method was chosen on the assumption that only the target component (synthetic RNA oligonucleotide) contains a hydrophobic dimethoxytrityl group at the 5th end. All lower molecular weight by-products that could result from solid-phase synthesis are not carried at the 5′-end of the dimethoxytrityl group. The optimal isolation method for such a component is C18 reverse phase gradient chromatography with a polar solvent (50% acetonitrile) as the eluent, where the target component will have the longest retention time and, accordingly, can be easily separated from non-target products. The selection of the gradient of the composition of the mobile phase as a function of time was selected experimentally. The selection criterion was the optimal separation of the target component from the rest with the shortest cleaning time.

Очистка синтетических РНК-олигонуклеотидов проводилась с использованием препаративной хроматографической системы, оснащенной препаративной колонкой (250×10 мм), содержащей 5 мкм-сорбент с обращенной C18 фазой, градиентным насосом, детектором с переменной длиной волны (установлена длина волны 260 нм), коллектором фракций, самописцем, компьютером для управления насосом, расчета времени удерживания и площади пиков.The purification of synthetic RNA oligonucleotides was carried out using a preparative chromatographic system equipped with a preparative column (250 × 10 mm) containing a 5 μm sorbent with reverse C18 phase, a gradient pump, a variable wavelength detector (a wavelength of 260 nm was established), and a fraction collector , recorder, computer for pump control, calculation of retention time and peak area.

Хроматограммы образцов РНК-олигонуклеотидов (фиг. 8-11) содержат 3 основных пика, первые два из которых обладают низким временем удерживания, характерным для компонентов, не содержащих диметокситритильной группы, и не являются целевыми, что дополнительно было подтверждено методом масс-спектрометрии. Пик №3, содержащий требуемый РНК-олигонуклеотид (что подтверждено данными масс-спектрометрии) и обладающий наибольшим временем удерживания и площадью, собирали в автоклавированные пробирки на 1,5 мл так, чтобы побочные пики и «плечи» не попали в пробирку. Пробирки с собранными целевыми фракциями высушивали на роторной сушке в течение 12-15 часов (как изложено ниже). Аликвоту целевого компонента объемом 20 мкл повторно хроматографировали в тех же условиях на аналитической колонке (Jupiter 5u C18 300 4,6×250 мм). Аналитические хроматограммы содержали один пик целевого компонента. Результаты хроматографической очистки РНК-олигонуклеотидов и аналитические хроматограммы целевого пика представлены на фиг. 17.Chromatograms of RNA oligonucleotide samples (Fig. 8-11) contain 3 main peaks, the first two of which have a low retention time, characteristic for components that do not contain dimethoxytrityl group, and are not targeted, which was additionally confirmed by mass spectrometry. Peak No. 3, containing the desired RNA oligonucleotide (as confirmed by mass spectrometry) and having the highest retention time and area, was collected in 1.5 ml autoclaved tubes so that side peaks and shoulders did not enter the tube. Tubes with the collected target fractions were dried on a rotary dryer for 12-15 hours (as described below). An aliquot of the target component with a volume of 20 μl was rechromatographed under the same conditions on an analytical column (Jupiter 5u C18 300 4.6 × 250 mm). Analytical chromatograms contained one peak of the target component. The results of chromatographic purification of RNA oligonucleotides and analytical chromatograms of the target peak are presented in FIG. 17.

Для высушивания растворов РНК-олигонуклеотидов использовали систему роторной сушки, время высушивания 12-15 часов.To dry the solutions of RNA oligonucleotides, a rotary drying system was used, the drying time was 12-15 hours.

Для анализа структуры синтезированных РНК-олгонуклеотидов использовался МАЛДИ-масс-спектрометр BRTJKER microflex LT. Детекция велась в режиме положительных ионов. Оптимальная энергия импульсов азотного лазера составляла 70 мкрДж. Детекция ионов велась в диапазоне 3-12 кДа (г/моль). Для сополимеризации образца использовался раствор матрицы 3-НРА (3-гидроксипиколиновая кислота) в деионизованной воде в концентрации 30 мг/мл с двузамещенным цитратом аммония в концентрации 0,5 мг/мл.To analyze the structure of the synthesized RNA olgonucleotides, a BRTJKER microflex LT MALDI mass spectrometer was used. Detection was carried out in the mode of positive ions. The optimal pulse energy of the nitrogen laser was 70 μJ. The ion detection was carried out in the range of 3-12 kDa (g / mol). To copolymerize the sample, we used a solution of a 3-HPA matrix (3-hydroxypicolinic acid) in deionized water at a concentration of 30 mg / ml with disubstituted ammonium citrate at a concentration of 0.5 mg / ml.

Полученные масс-спектры приведены на фиг. 12-15. Наблюдаемая масса однозарядного иона для каждого образца соответствует расчетной с погрешностью, не превышающей 0.1%. Наблюдаемые пики с массой в два раза меньшей массе пика с максимальной интенсивностью соответствуют двузарядным ионам целевого пика, являются особенностью метода и в анализе не учитываются.The obtained mass spectra are shown in FIG. 12-15. The observed mass of a singly charged ion for each sample corresponds to the calculated one with an error not exceeding 0.1%. The observed peaks with a mass half that of the peak with maximum intensity correspond to doubly charged ions of the target peak, are a feature of the method, and are not taken into account in the analysis.

Пики с массой ниже массы основного пика на 329,21 Да, 305,18 Да, 345,21 Да, 306,20 Да, 304,20 Да, 109,09 Да, 124,1 Да, 133,11 Да, 149,11 Да, как и пики с массой выше искомой на 114,2 Да, 42,04 Да не обнаружены. Соответственно был сделан вывод о низком содержании или отсутствии недостроенных цепей, последовательностей, несущих депуринизованные основания, либо несущие защитные группы.Peaks with a mass below the mass of the main peak are 329.21 Yes, 305.18 Yes, 345.21 Yes, 306.20 Yes, 304.20 Yes, 109.09 Yes, 124.1 Yes, 133.11 Yes, 149, 11 Yes, as well as peaks with a mass higher than the desired by 114.2 Yes, 42.04 Yes were not detected. Accordingly, it was concluded that there is a low content or absence of unfinished chains, sequences bearing depurinated bases, or bearing protective groups.

Сводные данные по анализу полученных масс-спектров представлены в таблице 8, представленной далее. Чистота анализируемых РНК-олигонуклеотидов не ниже 90%.Summary data on the analysis of the obtained mass spectra are presented in table 8 below. The purity of the analyzed RNA oligonucleotides is not less than 90%.

Синтез LTP проводили твердофазным методом, используя стандартный протокол Fmoc-химии и N-гидроксибензотриазол/диизопропилкарбодиимидный (ГБТ/ДИП) метод активации Fmoc-аминокислот. В качестве полимера-носителя использовали коммерческие реактивы: смолу Rink Amide МВНА, или Wang. В качестве исходных производных аминокислот применяли: Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH. Стандартный цикл включет промывку (ДМФА), удаление Fmoc-защиты (20% пиперидин в ДМФА), предварительное активирование Fmoc-аминокислоты (ДИП/ГБТ) и кондесацию в среде ДМФА/N-метилпирролидон при 2-кратном избытке карбоксильного компонента (~0,5 часа). Контроль над полнотой реакции осуществляли нингидриновым методом, и при необходимости реакцию конденсации повторяли. Конечные пептиды отщепляют от полимера трифторуксусной кислотой в присутствии скавенджеров (тиоанизол, этандитиол, фенол, диметилсульфид).LTP synthesis was performed by the solid-state method using the standard protocol of Fmoc chemistry and the N-hydroxybenzotriazole / diisopropylcarbodiimide (GBT / DIP) method for the activation of Fmoc amino acids. As the carrier polymer, commercial reagents were used: Rink Amide MVNA resin, or Wang. The starting amino acid derivatives used were: Fmoc-Cys (Trt) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH. The standard cycle includes washing (DMF), removal of Fmoc protection (20% piperidine in DMF), preliminary activation of Fmoc amino acids (DIP / GBT) and condensation in DMF / N-methylpyrrolidone with a 2-fold excess of carboxyl component (~ 0, 5 hours). The completeness of the reaction was monitored by the ninhydrin method, and if necessary, the condensation reaction was repeated. The final peptides are cleaved from the polymer with trifluoroacetic acid in the presence of scavengers (thioanisole, ethanedithiol, phenol, dimethyl sulfide).

Сырой продукт высаждали сухим серным эфиром, экстрагировали водной уксусной кислотой и экстракт лиофилизируют. Очистку пептида проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (фиг. 16), например, на колонке Grace Vydac 218 ТР54, а структуру очищенного пептида подтверждали масс-спектрометрией (фиг. 17).The crude product was precipitated with dry sulfuric ether, extracted with aqueous acetic acid and the extract was lyophilized. The peptide was purified by high performance liquid chromatography (HPLC) (Fig. 16), for example, on a Grace Vydac 218 TP54 column, and the structure of the purified peptide was confirmed by mass spectrometry (Fig. 17).

Пример 2. Полученные параметры стандартного образца LTP: время удерживания на аналитической колонке: 10,1±0,2 мин., масс-спектр (MALDI-TOF): m/z=2337,471±1 при расчетной массе: 2337,98 (для амида). Аналитическая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) очищенного пептида LTP была проведена следующим образом. Для аналитических целей была использована аналитическая колонка Grace Vydac 218ТР54 (150×4.6 мм), содержащая 5 мкм сорбент C18. Подвижная фаза: 0,1% водный раствор трифторуксусной кислоты (А) и ацетонитрил (Б) - смесь, 1 мл/мин. Градиент, % состав: 0-2 мин (А - 100%); 2-25 мин (Б -линейно от 0 до 70%); 25-27 мин (Б - 70%); 27-29 мин (Б - линейно от 70 до 0%); 29-35 мин (А - 100%).Example 2. The obtained parameters of the standard sample LTP: retention time on the analytical column: 10.1 ± 0.2 min., Mass spectrum (MALDI-TOF): m / z = 2337.471 ± 1 with an estimated mass: 2337.98 (for amide). Analytical high performance liquid chromatography (HPLC) of the purified LTP peptide was carried out as follows. For analytical purposes, we used a Grace Vydac 218TP54 analytical column (150 × 4.6 mm) containing 5 μm sorbent C18. Mobile phase: 0.1% aqueous solution of trifluoroacetic acid (A) and acetonitrile (B) - mixture, 1 ml / min. Gradient,% composition: 0-2 min (A - 100%); 2-25 min (B-linearly from 0 to 70%); 25-27 min (B - 70%); 27-29 min (B - linearly from 70 to 0%); 29-35 min (A - 100%).

После синтеза четырех РНК-олигонуклеотидов проводили их попарный отжиг, чтобы получить два типа молекул siRNA (siIL4-89-153/LTP). Под отжигом олигонуклеотида понимается смешивание водных растворов эквимолярных количеств сенс- и антисенс-олигонуклеотидов, при этом между ними образуются водородные связи и два олигонуклеотида образуют прочный дуплекс. Для этого водные растворы с известной концентрацией сенс- и антисенс-РНК-олигонуклеотидов смешивают в эквимолярных количествах, и прогревают при 80 C в течение 10 мин после чего раствору дают остывать до комнатной температуры в течении 1 часа. Затем водный р-ор образовавшихся после отжига молекул siRNA лиофильно высушивали для получения порошкообразной формы.After the synthesis of four RNA oligonucleotides, they were annealed in pairs to obtain two types of siRNA molecules (siIL4-89-153 / LTP). By annealing an oligonucleotide is meant mixing aqueous solutions of equimolar amounts of sensory and antisense oligonucleotides, hydrogen bonds being formed between them and two oligonucleotides form a strong duplex. For this, aqueous solutions with a known concentration of sensor and antisense RNA oligonucleotides are mixed in equimolar amounts and heated at 80 C for 10 minutes, after which the solution is allowed to cool to room temperature for 1 hour. Then, the aqueous solution of siRNA molecules formed after annealing was lyophilized to obtain a powder form.

Получение композиции siIL4-89-153/LTP из компонентов LTP и двух видов молекул siRNA (siIL4-89 и siIL4-153) заключается в следующем:Obtaining the composition siIL4-89-153 / LTP from the components of LTP and two types of siRNA molecules (siIL4-89 and siIL4-153) is as follows:

1. готовят раствор LTP в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), pH=7,4+0,4 М NaCl концентрацией 25 мг/мл и раствор смеси молекул siIL4-89 и siIL4-153 концентрацией 1 мг/мл в ФСБ pH=7,4+0,4 М NaCl.1. prepare a solution of LTP in phosphate-buffered saline (PBS), pH = 7.4 + 0.4 M NaCl at a concentration of 25 mg / ml and a solution of a mixture of molecules siIL4-89 and siIL4-153 at a concentration of 1 mg / ml in PBS pH = 7.4 + 0.4 M NaCl.

2. водные растворы LTP (25 мг/мл) и siRNA (1 мг/мл) смешиваются в объемных соотношениях 1:1 соответственно. Смешивание осуществляют в стеклянной колбе.2. aqueous solutions of LTP (25 mg / ml) and siRNA (1 mg / ml) are mixed in volume ratios of 1: 1, respectively. Mixing is carried out in a glass flask.

3. Смесь растворов инкубируется в течении 30 минут при комнатной температуре (+21 C). При этом происходит образование комплекса LTP/siRNA в массовых соотношениях 25/1 концентрацией 13 мг/мл.3. The mixture of solutions is incubated for 30 minutes at room temperature (+21 C). In this case, the LTP / siRNA complex is formed in mass ratios of 25/1 with a concentration of 13 mg / ml.

Таким образом, в результате синтеза компоненты композиции siIL4-89-153/LTP, пептид siRNA и молекулы siRNA (siIL4-89 и siIL4-153) изначально получают независимо, после чего проводят процедуру комплексообразования LTP/siRNA.Thus, as a result of the synthesis, the components of the siIL4-89-153 / LTP composition, the siRNA peptide, and the siRNA molecules (siIL4-89 and siIL4-153) are independently obtained initially, after which the LTP / siRNA complexation procedure is carried out.

Было показано, что композиция siIL4-89-153/LTP эффективно подавляет экспрессию про-воспалительного цитокина IL-4.The siIL4-89-153 / LTP composition has been shown to effectively inhibit the expression of the pro-inflammatory cytokine IL-4.

Пример 3. В предварительных исследованиях было показано, что созданные молекулы siIL4-89 и siIL4-153 эффективно подавляли экспрессию гена IL-4. Чтобы подтвердить, что непосредственно композиция также siIL4-89-153/LTP подавляет экспрессию IL-4, были проведены дополнительные эксперименты. Для этого культуру клеток HEK293T засевали в 4 8-луночный плейт в полной среде DMEM, которая содержала 10% эмбриональной телячий сыворотки (ЭТС), 300 мг/л Глутамина-L и 60 мг/мл Гентамицина в количестве 75 тыс.клеток на лунку в объеме 300 мкл полной среды DMEM и культивируют при 37°C в 5% атмосфере CO₂ до образования монослоя 75% конфлуентности (примерно 1 сутки). Готовили смесь, состоящую из 25 мкг LTP с 1,0 мкг плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP (соотношение 25:1 по массе) в 40 мкл среды optiMEM, не содержащей ЭТС и антибиотиков в отдельной пробирке. Отдельно готовили несколько образцов композиции siIL4-89-153/LTP (130 мкг, 65 мкг, 33 мкг) растворяя их в 40 мкл optiMEM в отдельных пробирках. Затем содержимое пробирки со смесью пептида с плазмидой (LTP/pUCHR IL4 IRES GFP) смешивали с содержимым пробир с композицией siIL4-89-153/LTP, таким образом, суммарный объем составлял 80 мкл. Для достижения равновесного состояния смеси ее инкубировали при комнатной температуре в течение 25-30 минут, избегая попадания прямых солнечных лучей или других источников ультрафиолетового излучения. В качестве контроля сравнения использовали образец без добавления композиции. В качестве отрицательного контроля использовали среду optiMEM без добавления плазмиды или трансфекционных агентов.Example 3. In preliminary studies, it was shown that the created molecules siIL4-89 and siIL4-153 effectively suppressed the expression of the IL-4 gene. To confirm that directly the composition also siIL4-89-153 / LTP inhibits the expression of IL-4, additional experiments were conducted. For this, a HEK293T cell culture was seeded in 4 8-well plates in complete DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS), 300 mg / L Glutamine-L and 60 mg / ml Gentamicin in the amount of 75 thousand cells per well per 300 μl of complete DMEM medium and cultured at 37 ° C in 5% CO ₂ atmosphere until a monolayer of 75% confluence was formed (approximately 1 day). A mixture was prepared consisting of 25 μg LTP with 1.0 μg plasmid pUCHR IL4 IRES GFP (ratio 25: 1 by weight) in 40 μl of optiMEM medium not containing ETS and antibiotics in a separate tube. Several samples of the siIL4-89-153 / LTP composition (130 μg, 65 μg, 33 μg) were separately prepared by dissolving them in 40 μl optiMEM in separate tubes. Then the contents of the tube with the mixture of peptide with plasmid (LTP / pUCHR IL4 IRES GFP) were mixed with the contents of the test tube with the composition siIL4-89-153 / LTP, thus, the total volume was 80 μl. To achieve the equilibrium state of the mixture, it was incubated at room temperature for 25-30 minutes, avoiding direct sunlight or other sources of ultraviolet radiation. As a control of comparison, a sample was used without adding a composition. OptiMEM medium without plasmid or transfection agents was used as a negative control.

Далее, подготовленные трансфекционные смеси и контроли в объеме 80 мкл optiMEM вносили к клеткам в лунки 48-луночного плейта по каплям и инкубировали при 37°C в 5% атмосфере CO₂ в течение 2 суток.Next, prepared transfection mixtures and controls in a volume of 80 μl optiMEM were added dropwise to the cells in the wells of a 48-well plate and incubated at 37 ° C in 5% CO ₂ atmosphere for 2 days.

После инкубации клеток с среду удаляли из лунок плейта и хранили при -70 C до анализа из методом иммуноферментного анализа (ИФА) на содержание IL-4. Уровень экспрессии IL-4 определяли с использованием коммерческого набора Human IL-4 ELISA Set (BD). Для этого на подложку (96-луночный плейт) сорбировали связывающие антитела (Anti-human IL-4) в разведении 1/250 от начальной концентрации по 100 мкл раствора на лунку. Инкубировали в течение ночи при +4°C. Плейт отмывали отмывочным буфером (1 л PBS/ 0,5 мл Tween 20) 3 раза и вносили обезжиренное молоко по 200 мкл на лунку, инкубировали 2 часа при комнатной температуре. Плейт отмывали 2 раза и вносили супернатанты (без разведения, 1/10, 1/100, 1/1000). Инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Далее плейт отмывали 3 раза, после чего вносили рабочий раствор (детектирующие антитела против IL-4 в разведении 1/1000 + стрептавидиновый коньюгат в разведении 1/250) по 100 мкл на лунку и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Затем плейт отмывали 6 раз отмывочным буфером и вносили субстрат (тетра-метил-бензидин) по 100 мкл на лунку, после чего инкубировали 25-30 минут в темноте. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл 2 н H₂SO₄ и фиксировали результат с помощью спектрофотометра Reader MPR1 при длинах волн 450 и 630 нм.After the cells were incubated, the medium was removed from the plate wells and stored at -70 C until enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the content of IL-4. The expression level of IL-4 was determined using a commercial set of Human IL-4 ELISA Set (BD). For this, binding antibodies (Anti-human IL-4) were adsorbed onto a substrate (96-well plate) at a dilution of 1/250 of the initial concentration of 100 μl of solution per well. Incubated overnight at + 4 ° C. The plate was washed with washing buffer (1 L PBS / 0.5 ml Tween 20) 3 times and skim milk was added at 200 μl per well, incubated for 2 hours at room temperature. The plate was washed 2 times and supernatants were added (without dilution, 1/10, 1/100, 1/1000). Incubated for one hour at room temperature. Next, the plate was washed 3 times, after which a working solution was introduced (detecting antibodies against IL-4 at a dilution of 1/1000 + streptavidin conjugate at a dilution of 1/250) at 100 μl per well and incubated for 1 hour at room temperature. Then the plate was washed 6 times with washing buffer and a substrate (tetra-methyl-benzidine) was added at 100 μl per well, after which it was incubated for 25-30 minutes in the dark. The reaction was stopped by adding 50 μl of 2 n H ₂ SO ₄ and the result was recorded using a Reader MPR1 spectrophotometer at wavelengths of 450 and 630 nm.

Интенсивность экспрессии IL-4 определяли по показателю оптической плотности раствора. Отрицательный контроль, определяющий фоновый уровень реакции, не превышает 0,07. В образце положительного контроля (клетки инкубировались без добавления композиции siIL4-89-153/LTP) наблюдался высокий уровень экспрессии IL-4 в сравнении с контролем (фиг. 18). Однако, добавление в трансфекционную смесь композиции siIL4-89-153/LTP, значительно ослабило экспрессию IL-4 клетками. При этом эффект подавления IL-4 был дозозависимым, т.е. при уменьшении концентрации композиции siIL4-89-153/LTP происходило восстановление экспрессии IL-4. Таким образом, установлено, что композиция дозозависимо подавляет экспрессию гена про-воспалительного цитокина IL-4.The expression intensity of IL-4 was determined by the optical density of the solution. The negative control, which determines the background level of the reaction, does not exceed 0.07. In the positive control sample (cells were incubated without adding the siIL4-89-153 / LTP composition), a high level of IL-4 expression was observed in comparison with the control (Fig. 18). However, the addition of siIL4-89-153 / LTP composition to the transfection mixture significantly impaired IL-4 cell expression. Moreover, the effect of suppressing IL-4 was dose-dependent, i.e. with a decrease in the concentration of the composition siIL4-89-153 / LTP, the expression of IL-4 was restored. Thus, it was found that the composition dose-dependently inhibits the expression of the pro-inflammatory cytokine IL-4 gene.

На фиг. 18 показано подавление экспрессии гена про-воспалительного цитокина IL-4 посредством композиции siIL4-89-153/LTP,In FIG. 18 shows the suppression of gene expression of the pro-inflammatory cytokine IL-4 through the composition siIL4-89-153 / LTP,

гдеWhere

1 - экспрессия гена IL-4 клетками HEK293T,1 - IL-4 gene expression by HEK293T cells,

2 - экспрессия гена IL-4 клетками HEK293T, после добавление 130 мкг композиции siIL4-89-153/LTP,2 - expression of the IL-4 gene by HEK293T cells, after adding 130 μg of the composition siIL4-89-153 / LTP,

3 - экспрессия гена IL-4 клетками HEK293T, после добавление 65 мкг композиции siIL4-89-153/LTP,3 - expression of the IL-4 gene by HEK293T cells, after adding 65 μg of the composition siIL4-89-153 / LTP,

4 - экспрессия гена IL-4 клетками HEK293T, после добавление 33 мкг композиции siIL4-89-153/LTP.4 - expression of the IL-4 gene by HEK293T cells, after adding 33 μg of the composition siIL4-89-153 / LTP.

5 - экспрессия гена IL-4 клетками HEK293T без добавления каких-либо трансфекционных агентов и нуклеиновых кислот.5 - IL-4 gene expression by HEK293T cells without the addition of any transfection agents and nucleic acids.

Было показано и доказано, что композиция siIL4-89-153/LTP мало токсична.It was shown and proved that the composition siIL4-89-153 / LTP is slightly toxic.

Пример 4. Была изучена острая токсичность композиции siIL4-89-153/LTP при внутрибрюшинном введении мышам в высоких дозах. Исследование выполнено на половозрелых мышах (самки) при однократном внутрибрюшинном введении в максимально возможной для введения дозе. Предполагаемая терапевтическая доза композиции siIL4-89-153/LTP находится в пределах 3,25 мг для взрослого, т.е. максимум 0,05 мг/кг. Чтобы оценить летальные дозы композиция siIL4-89-153/LTP была введен мышам в значительной передозировке в 13000 раз (650 мкг/кг). Препарат вводился внутрибрюшинно, поскольку данный способ обеспечивает высокий уровень всасывания. Для данного исследования выбраны мыши (CBA×C57BL/6)F₁ как вид, общепринятый для токсикологических исследований.Example 4. The acute toxicity of the siIL4-89-153 / LTP composition was studied with intraperitoneal administration to mice in high doses. The study was performed on mature mice (females) with a single intraperitoneal administration at the maximum possible dose. The estimated therapeutic dose of the siIL4-89-153 / LTP composition is in the range of 3.25 mg for an adult, i.e. maximum 0.05 mg / kg. To assess lethal doses, the siIL4-89-153 / LTP composition was administered to mice in a significant overdose of 13,000 times (650 mcg / kg). The drug was administered intraperitoneally, since this method provides a high level of absorption. For this study, mice (CBA × C57BL / 6) F _{1 were} selected as a species generally accepted for toxicological studies.

Дизайн исследования острой токсичности на половозрелых мышах (CBA×C57BL/6)F₁ представлен в таблице 9.The design of the study of acute toxicity in adult mice (CBA × C57BL / 6) F _{1 are} presented in table 9.

.

.

Токсичность регистрировали по появлению признаков нарушения здоровья животных при клиническом осмотре в клетке, в руках и на открытой площадке (поза, поведение, тремор, аномальные движения, внешний вид, состояние шерсти, диарея, пилоэрекция, исследовательская активность, общая подвижность), а также по приросту массы тела. Исследуемые показатели у мышей:Toxicity was recorded by the appearance of signs of impaired animal health during clinical examination in the cage, in the hands and in an open area (posture, behavior, tremor, abnormal movements, appearance, condition of the coat, diarrhea, piloerection, research activity, general mobility), as well as weight gain. The studied parameters in mice:

1. Масса тела каждые на 0, 1, 7 и 14 сутки.1. Body weight every 0, 1, 7 and 14 days.

2. Клинический осмотр - ежедневно. Параметры оценки интоксикации (двигательная активность, координация движений, ориентировочные реакции, тонус скелетных мышц, реакция на тактильные и болевые раздражители, частота дыхания, окраска слизистых оболочек, состояние волосяного покрова, консистенция фекальных масс).2. Clinical examination - daily. Parameters for assessing intoxication (motor activity, coordination of movements, indicative reactions, skeletal muscle tone, response to tactile and pain stimuli, respiratory rate, coloration of the mucous membranes, condition of the skin, consistency of fecal masses).

Клинический осмотр заключался в наблюдении за животными для выявления отклонений в состоянии здоровья. Его проводили дважды в первые сутки после введения тестируемого препарата, затем регулярно один раз в день вплоть до некропсии. Клинический осмотр каждого животного проводили в течение первых трех часов после введения и далее один раз в сутки. Осмотр животного проводили в клетке содержания, в руках и на стандартной открытой площадке. Ниже указаны признаки, которые описываются при оценке токсичности тестируемых веществ.The clinical examination consisted in monitoring the animals to detect abnormalities in health status. It was performed twice in the first day after the administration of the test drug, then regularly once a day until necropsy. A clinical examination of each animal was carried out during the first three hours after administration and then once a day. Inspection of the animal was carried out in the cage, in the hands and in a standard open area. The following are signs that are described in assessing the toxicity of test substances.

При изучении острой токсичности массу тела определяли перед введением, далее на 1,3, 7, 10 и 14 сутки.In the study of acute toxicity, body weight was determined before administration, then on days 1,3, 7, 10 and 14.

Результаты наблюдений показали, что на протяжении всего исследования гибели животных в контрольной группе, получавшей физиологический раствор, не наблюдалось.The observation results showed that throughout the study, the death of animals in the control group receiving saline was not observed.

Выживаемость и масса тела подопытных животных представлены в таблицах ниже (табл. 10-14).Survival and body weight of experimental animals are presented in the tables below (tab. 10-14).

Из таблиц 10-14 видно, что однократное внутрибрюшинное введение мышам-самкам композиции siIL-89-153/LTP в дозе 162,5 мг/кг, не вызвало гибели животных, то есть препарат переносим. Интоксикация проявлялась в снижении массы тела, сильной диуретическом эффекте, взъерошенности шерстного покрова и судорогах задних конечностей. Признаки выраженной интоксикации наблюдались в течение первых суток после введения и сохранялись в течение трех дней. На 14 сутки масса тела подопытных животных была ниже, чем контрольных.From tables 10-14 it can be seen that a single intraperitoneal injection of siIL-89-153 / LTP at a dose of 162.5 mg / kg to female mice did not cause death of the animals, i.e., the drug was tolerated. Intoxication was manifested in a decrease in body weight, a strong diuretic effect, ruffling of the coat and convulsions of the hind limbs. Signs of severe intoxication were observed during the first days after administration and persisted for three days. On day 14, the body weight of the experimental animals was lower than the control.

При однократном внутрибрюшинном введении мышам самкам препарата siIL-89-153/LTP LD₈₄ составляет 650 мг/кг, a LD₅₀=325 мг/кг, что позволяет отнести данную композицию к малотоксичным соединениям по классификации токсичности (IV класс токсичности, К.К. Сидоров, 1973).With a single intraperitoneal administration to mice in female siIL-89-153 / LTP, LD ₈₄ is 650 mg / kg, and LD ₅₀ = 325 mg / kg, which allows this composition to be classified as low-toxic compounds according to toxicity classification (toxicity class IV, K.K. Sidorov, 1973).

Таким образом была установлена доза близкая к летальной для композиции siIL-89-153/LTP при внутрибрюшинном введении: LD₈₄=650 мг/кг, гибель животных наступает в первые часы. Выявлено, что LD₅₀ при внутрибрюшинном введении мышам составляет 325 мг/кг, что в 6 500 раз превышает разовую предполагаемую дозу для человека (0,05 мг/кг). По классификации токсичности веществ (по К.К. Сидорову) композиция siIL-89-153/LTP относится к IV классу малотоксичных соединений. Также установлено, что максимальная переносимая мышами доза композиции siIL-89-153/LTP при внутрибрюшинном введении - 162,5 мг/кг.Thus, a dose close to lethal for the siIL-89-153 / LTP composition was established with intraperitoneal administration: LD ₈₄ = 650 mg / kg, the death of animals occurs in the first hours. It was found that LD ₅₀ with intraperitoneal administration to mice is 325 mg / kg, which is 6,500 times higher than the single estimated dose for humans (0.05 mg / kg). According to the classification of toxicity of substances (according to K.K.Sidorov), the composition siIL-89-153 / LTP belongs to class IV of low toxic compounds. It was also found that the maximum mouse-tolerated dose of the siIL-89-153 / LTP composition with intraperitoneal administration was 162.5 mg / kg.

Таким образом, было доказано, что заявляемое изобретение - малотоксичная композиция siIL4-89-153/LTP, подавляющая экспрессию про-воспалительного гена IL-4, может применяться в составе лекарственных препаратов для лечения IL-4-опосредованных патологий таких как аллергическая бронхиальная астма и аллергический ринит.Thus, it was proved that the claimed invention is a low-toxic composition siIL4-89-153 / LTP, which suppresses the expression of the pro-inflammatory gene IL-4, can be used as part of drugs for the treatment of IL-4-mediated pathologies such as allergic bronchial asthma and allergic rhinitis.

Состав композиции siIL4-89-153/LTP был установлен в результате теоретического анализа структурных особенностей гена IL-4 человека и известных пептидных конструкций, а также в результате экспериментальных исследований. Проведенные эксперименты показали, что выбранные и синтезированные молекулы siRNA (siIL4-89 и siIL4-153) значительно снижали экспрессию гена-мишени (IL-4), а выбранный и синтезированный катионный пептид LTP эффективно доставлял нуклеиновые кислоты в различные типы клеток млекопитающих при соотношении LTP/нуклеиновая кислота 25/1 по массе. Также экспериментально подтверждено, что композиция siIL4-89-153/LTP эффективно подавляла экспрессию IL-4 человека. В исследования токсичности созданной композиции siIL4-89-153/LTP установлена полу-летальная доза LD₅₀=325 мг/кг, что позволяет отнести ее к малотоксичным соединениям по классификации токсичности (IV класс токсичности, К.К. Сидоров, 1973).The composition of the composition siIL4-89-153 / LTP was established as a result of a theoretical analysis of the structural features of the human IL-4 gene and known peptide structures, as well as as a result of experimental studies. The experiments showed that the selected and synthesized siRNA molecules (siIL4-89 and siIL4-153) significantly reduced the expression of the target gene (IL-4), and the selected and synthesized cationic peptide LTP efficiently delivered nucleic acids to various types of mammalian cells at an LTP ratio / nucleic acid 25/1 by weight. It was also experimentally confirmed that the siIL4-89-153 / LTP composition effectively inhibited the expression of human IL-4. In a toxicity study of the created composition siIL4-89-153 / LTP, a semi-lethal dose of LD ₅₀ = 325 mg / kg was established, which allows it to be classified as low-toxic compounds according to the toxicity classification (IV toxicity class, K.K. Sidorov, 1973).

Claims

1. Composition for suppressing the expression of the cytokine gene of interleukin-4 through the RNA interference mechanism, consisting of a cationic dendrimer peptide LTP with the formula (Arg) 8 (Lys) 4 (Lys) 2Lys-Ala-Cys-NH2, acting as a carrier, and two siRNA molecules with the formulas 5-UUGAUGAUCUCCUGUAAGGtt-3 (SEQ ID NO 57) and 5-AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt-3 (SEQ ID NO 59).

2. The composition for suppressing the expression of the cytokine gene of interleukin-4 according to claim 1, characterized in that when the ratio of the number of positive charges of the peptide to the number of negative charges of nucleic acids from 24 to 96, it is able to efficiently transfect various types of cells.

3. The composition for suppressing the expression of the cytokine gene of interleukin-4 according to claim 1, characterized in that at an LD50 of 325 mg / kg, it is low toxic.