RU2535871C1 - PLASMID FOR EXPRESSION IN CELL OF CHINESE HAMSTER, CELL OF CHINESE HAMSTER - PROTEIN PRODUCER WITH Gla-DOMAIN, AND METHOD FOR OBTAINING PROTEIN WITH Gla-DOMAIN - Google Patents
PLASMID FOR EXPRESSION IN CELL OF CHINESE HAMSTER, CELL OF CHINESE HAMSTER - PROTEIN PRODUCER WITH Gla-DOMAIN, AND METHOD FOR OBTAINING PROTEIN WITH Gla-DOMAIN Download PDFInfo
- Publication number
- RU2535871C1 RU2535871C1 RU2013131441/10A RU2013131441A RU2535871C1 RU 2535871 C1 RU2535871 C1 RU 2535871C1 RU 2013131441/10 A RU2013131441/10 A RU 2013131441/10A RU 2013131441 A RU2013131441 A RU 2013131441A RU 2535871 C1 RU2535871 C1 RU 2535871C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- protein
- vkorc1
- chinese hamster
- plasmid
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения рекомбинантных белков в культивируемых клетках млекопитающих.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to a technology for the production of biologically active substances (BAS) by genetic engineering methods, more specifically, to methods for producing recombinant proteins in cultured mammalian cells.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Некоторые секретируемые белки позвоночных животных содержат кластеры близкорасположенных гамма-карбоксилированных остатков глутаминовой кислоты, обычно обозначаемые как Gla-домен. Большинство известных белков, содержащих Gla-домен, являются зимогенами сериновых протеаз и участвуют в каскаде свертывания крови. Функции самого Gla-домена могут быть описаны как координирование ионов кальция и Са-зависимое связывание с фосфолипидной мембраной (Nelsestuen et al. (1976) Role of gamma-carboxyglutamic acid. Cation specificity ofprothrombin and factor X-phospholipid binding. J. Biol. Chem., 251, 6886-6893).Some secreted vertebrate proteins contain clusters of closely spaced gamma-carboxylated glutamic acid residues, commonly referred to as the Gla domain. Most of the known proteins containing the Gla domain are zymogens of serine proteases and are involved in the blood coagulation cascade. The functions of the Gla domain itself can be described as the coordination of calcium ions and Ca-dependent binding to a phospholipid membrane (Nelsestuen et al. (1976) Role of gamma-carboxyglutamic acid. Cation specificity ofprothrombin and factor X-phospholipid binding. J. Biol. Chem ., 251, 6886-6893).
В настоящее время известно более 10 белков человека, содержащих Gla-домен, - факторы свертывания крови, такие как протромбин или фактор II, факторы VII, IX, X; антикоагулянты, такие как белок С, белок S, белок Z; остеокальцин или Gla-белок кости, матриксный Gla-белок кости (MGP); белок регулятор клеточного цикла Gas6 (growth arrest specific gene 6 protein) и трансмембранные Gla-белки (TMGPs). Для всех указанных белков гамма-карбоксилирование необходимо для проявления их функциональной активности (Furie et al. (1999) Vitamin K-dependent biosynthesis of gamma-carboxyglutamic acid. Blood, 93, 1798-1808).Currently, more than 10 human proteins containing the Gla domain are known - coagulation factors such as prothrombin or factor II, factors VII, IX, X; anticoagulants such as protein C, protein S, protein Z; osteocalcin or Gla bone protein, matrix Gla bone protein (MGP); Gas6 cell growth regulator protein (growth arrest
Гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты (Glu→Gla) происходит пост-трансляционно, локализовано в эндоплазматическом ретикулуме клеток и производится ферментом витамин-К зависимой гамма-глутамин карбоксилазой (GGCX, ЕС 4.1.1.90) (Berkner, K.L. (2000) The vitamin K-dependent carboxylase. J. Nutr., 130, 1877-1880). Источником присоединяемой карбоксильной группы в данной реакции является растворенный углекислый газ, а кофактором GGCX выступает восстановленная дигидрохиноновая форма витамина K, превращающаяся при прохождении реакции в окисленную форму 2,3-эпоксида хинона. Таким образом, реакция гамма-карбоксилирования требует постоянного поддержания существенной концентрации дигидрохиноновой формы витамина К в люмене эндоплазматического ретикулума.Gamma-carboxylation of glutamic acid residues (Glu → Gla) occurs post-translationally, is localized in the endoplasmic reticulum of cells and is performed by the vitamin K-dependent gamma-glutamine carboxylase enzyme (GGCX, EC 4.1.1.90) (Berkner, KL (2000) The vitamin K -dependent carboxylase. J. Nutr., 130, 1877-1880). The source of the attached carboxyl group in this reaction is dissolved carbon dioxide, and the reduced dihydroquinone form of vitamin K acts as the cofactor GGCX, which is converted to the oxidized form of
Восстановление эпокси-формы витамина К до дигидрохинона в клетке производится ферментным комплексом VKOR или VKORC (vitamin К oxireductase complex), основным компонентом которого является интегральный белок "субъединица 1 комплекса 2,3-эпоксиредуктазы витамина K" (VKORC1, ЕС 1.1.4.1). Ген VKORC1 и основные свойства рекомбинантного белка VKORC1 человека описаны в патентах США 7482141 и 7524665. Известно, что некоторые мутации в этом гене вызывают устойчивость к ингибитору гамма-карбоксилирования белков варфарину, а также редкое наследственное заболевание "множественный дефицит факторов свертываемости крови тип 2" [Rost, Fregin, Ivaskevicius, Conzelmann, Hortnagel, Pelz, Lappegard, Seifried, Scharrer, Tuddenham, Muller, Strom and Oldenburg, Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type 2 // Nature, v.427, p.537-41 (2004)].The restoration of the epoxy form of vitamin K to dihydroquinone in the cell is performed by the VKOR or VKORC (vitamin K oxireductase complex) enzyme complex, the main component of which is the integral protein "
Поскольку белки системы гемостаза должны иметь полностью (или почти полностью) гамма-карбоксилированный Gla-домен для проявления функциональной активности, гетерологичная экспрессия их генов в культивируемых клетках млекопитающих может приводить к секреции неактивных форм белков. Этот нежелательный эффект наиболее выражен для систем экспрессии рекомбинантного фактора VII свертываемости крови и проявляется как невозможность получения существенных количеств функционально активного рекомбинантного фактора VII в клетках линии СНО, при этом клетки линий HepG2 или ВНК позволяют получать функционально активный белок при сходном уровне секреции. В ряде работ было установлено, что увеличение количества GGCX не приводит к улучшению гамма-карбоксилирования молекул фактора VII, в то время как оверэкспрессия гена VKORC1 человека в клетках линии СНО позволяет получить функционально активный продукт и существенно повысить скорость секреции клетками фактора VII (Bolt, G., Т.D. Steenstrup, et al. (2007). "All post-translational modifications except propeptide cleavage are required for optimal secretion of coagulation factor VII." Thromb Haemost 98(5): 988-997). Сходные данные были получены для рекомбинантного фактора свертываемости крови IX, секретируемого клетками линии ВНК [Wajih, Hutson, Owen and Wallin, Increased production of functional recombinant human clotting factor IX by baby hamster kidney cells engineered to overexpress VKORC1, the vitamin К 2,3-epoxide-reducing enzyme of the vitamin К cycle // J Biol Chem, v.280, p.31603-7 (2005)]. Для известных систем экспрессии фактора IX в клетках СНО, лимитированных уровнем процессинга пропептида целевого белка, уровень гамма-карбоксилирования, обеспечиваемый эндогенным ферментом VKORC1, по-видимому, достаточен для получения фактора IX с полной функциональной активностью [McGrath, Factor IX (protease zymogen) // Directory of therapeutic enzymes, p.209-238 (2005)]. В то же время уровень секреции фактора IX при оверэкспрессии гена VKORC1 человека увеличивается в 1,2-1,4 раза (патент США 7375084). Таким образом, оверэкспрессия гена VKORC1 в клетках-продуцентах позволяет увеличить как уровень секреции BK3-белков, так и долю их функционально активных форм.Since the proteins of the hemostatic system must have a fully (or almost completely) gamma-carboxylated Gla domain for the manifestation of functional activity, heterologous expression of their genes in cultured mammalian cells can lead to the secretion of inactive forms of proteins. This undesirable effect is most pronounced for the expression systems of recombinant blood coagulation factor VII and is manifested as the impossibility of obtaining significant amounts of functionally active recombinant factor VII in CHO cell lines, while HepG2 or BHK cell lines allow one to obtain a functionally active protein at a similar level of secretion. In a number of studies, it was found that an increase in the amount of GGCX does not lead to an improvement in gamma-carboxylation of factor VII molecules, while overexpression of the human VKORC1 gene in CHO cells allows one to obtain a functionally active product and significantly increase the rate of secretion by factor VII cells (Bolt, G ., T. D. Steenstrup, et al. (2007). "All post-translational modifications except propeptide cleavage are required for optimal secretion of coagulation factor VII." Thromb Haemost 98 (5): 988-997). Similar data were obtained for the recombinant coagulation factor IX secreted by BHK cells [Wajih, Hutson, Owen and Wallin, Increased production of functional recombinant human clotting factor IX by baby hamster kidney cells engineered to overexpress VKORC1, the
Вследствие того, что исходно были охарактеризованы ген и кДНК VKORC1 человека, в большинстве работ для оверэкспрессии VKORC1 в культивируемых клетках были использованы плазмиды, содержащие кДНК VKORC1 человека. Известно, что изолированная каталитическая эффективность VKORC1 для различных видов млекопитающих отличается примерно в 4 раза [Wilson, Sauer, Carlson, Wallin, Ward and Hooser, Species comparison of vitamin K1 2,3-epoxide reductase activity in vitro: kinetics and warfarin inhibition // Toxicology, v.189, p.191-8 (2003)]. Поскольку удельная активность фермента VKORC1 может быть точно и непосредственно измерена только при разобщении витамин К оксиредуктазного комплекса и использовании дитиотрейтола в качестве донора электронов, собственная удельная активность VKORC1 не может охарактеризовать его фактическую каталитическую эффективность в живой клетке. Такая каталитическая эффективность, то есть способность поддерживать достаточную концентрацию восстановленной дигидрохиноновой формы витамина K в эндоплазматическом ретикулуме клеток, в которых происходит оверэкспрессия Gla-белка, может быть оценена только косвенным образом, а именно по уровню секреции гамма-карбоксилированной формы оверэкспрессируемого белка. Поскольку белки, переносящие электроны на мембранно-связанный фермент VKORC1, в настоящий момент неизвестны [Wilson, Sauer, Carlson, Wallin, Ward and Hooser, Species comparison of vitamin K1 2,3-epoxide reductase activity in vitro: kinetics and warfarin inhibition // Toxicology, v.189, p.191-8 (2003)], можно предположить, что их сродство к различным ортологам VKORC1 может существенно различаться. Тогда наилучшим вариантом VKORC1 для оверэкспрессии в клетках-продуцентах мог бы быть их собственный VKORC1, поскольку его достаточное сродство к белкам-донорам электронов клетки-хозяина не может вызывать сомнения. В случае клеток линии СНО такой аутологичный вариант VKORC1 не был описан, и его ферментативная активность не была охарактеризована ни прямыми, ни косвенными методами.Due to the fact that the human VKORC1 gene and cDNA were originally characterized, in most studies, plasmids containing human VKORC1 cDNA were used to over-express VKORC1 in cultured cells. The isolated catalytic efficiency of VKORC1 for various mammalian species is known to differ by about 4 times [Wilson, Sauer, Carlson, Wallin, Ward and Hooser, Species comparison of
По-видимому, естественный уровень экспрессии гена VKORC1 в клетках СНО относительно низок, поскольку данный ген преимущественно экспрессируется в гепатоцитах, а линия клеток СНО получена из яичника. В частности, в работе [de Castilho Femandes, Fontes, Gonsales, Swiech, Picanco-Castro, Faca and Covas, Stable and high-level production of recombinant Factor IX in human hepatic cell line // Biotechnol Appi Biochem, v.58, p.243-9 (2011)] было установлено, что уровень экспрессии функционально активного фактора IX человека выше в линии клеток, полученных из печени (HepG2), чем в линиях клеток, полученных из других тканей; при этом во всех случаях использовался одинаковый экспрессионный вектор. В то же время, уровень экспрессии неустановленных белков, являющихся донорами электронов для VKORC1, в различных тканях неизвестен, также неизвестной остается и необходимость поддержания повышенного уровня экспрессии генов этих белков.Apparently, the natural level of expression of the VKORC1 gene in CHO cells is relatively low, since this gene is mainly expressed in hepatocytes, and the CHO cell line is obtained from the ovary. In particular, in [de Castilho Femandes, Fontes, Gonsales, Swiech, Picanco-Castro, Faca and Covas, Stable and high-level production of recombinant Factor IX in human hepatic cell line // Biotechnol Appi Biochem, v. 58, p .243-9 (2011)] it was found that the expression level of functionally active human factor IX is higher in the cell line derived from the liver (HepG2) than in cell lines derived from other tissues; in all cases, the same expression vector was used. At the same time, the level of expression of unidentified proteins that are electron donors for VKORC1 in various tissues is unknown, and the need to maintain an increased level of gene expression of these proteins remains unknown.
Краткое описание изобретения.A brief description of the invention.
Целью настоящего изобретения является получение клеток китайского хомячка - продуцентов белков с Gla-доменом и предоставление способа получения белков с Gla-доменом с использованием полученных клеток.The aim of the present invention is to obtain Chinese hamster cells - producers of proteins with a Gla domain and the provision of a method for producing proteins with a Gla domain using the obtained cells.
Эта цель была достигнута путем того, что авторами настоящего изобретения впервые была клонирована и секвенирована область открытой рамки (ОРС) считывания кДНК VKORC1, полученной из клеток линии СНО DG-44. При оверэкспрессии ОРС аутологичного VKORC1 китайского хомячка, находящегося под контролем промотора CHEF1, в линии клеток СНО DG-44 было обнаружено резкое увеличение ферментативной активности VKORC1. Оверэкспрессия ОРС VKORC1 человека в таком же экспрессионном векторе приводила к значительно меньшему увеличению ферментативной активности VKORC1. Таким образом, ко-экспрессия аутологичного гена VKORC1 китайского хомячка под контролем сильного промотора может увеличить уровень секреции рекомбинантных Gla-белков, что представляет значительный интерес для биотехнологии и потенциально позволяет существенно уменьшить затраты при получении рекомбинантных факторов свертывания крови Vila, IX, X, протромбина, а также белка С, использующихся в качестве лекарственных средств.This goal was achieved by the fact that the authors of the present invention for the first time cloned and sequenced the region of the open reading frame (OPC) reading of VKORC1 cDNA obtained from CHO cell line DG-44. Overexpression of ORS of an autologous VKORC1 Chinese hamster controlled by the CHEF1 promoter revealed a sharp increase in the enzymatic activity of VKORC1 in the CHO DG-44 cell line. Overexpression of human OPC VKORC1 in the same expression vector resulted in a significantly smaller increase in the enzymatic activity of VKORC1. Thus, co-expression of the Chinese hamster’s autologous VKORC1 gene under the control of a strong promoter can increase the level of secretion of recombinant Gla proteins, which is of significant interest for biotechnology and potentially can significantly reduce the costs of obtaining recombinant blood coagulation factors Vila, IX, X, prothrombin, as well as protein C, used as medicines.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является субъединица 1 комплекса 2,3-эпоксиредуктазы витамина К (VKORC1) китайского хомячка, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2.Thus, an object of the present invention is the
Также объектом настоящего изобретения является фрагмент ДНК, кодирующий VKORC1, описанную выше.Also an object of the present invention is a DNA fragment encoding VKORC1 described above.
Также объектом настоящего изобретения является фрагмент ДНК, описаный выше, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.Also an object of the present invention is a DNA fragment described above, presented in the List of sequences under the number SEQ ID NO: 1.
Также объектом настоящего изобретения является плазмида, обладающая способностью к экспрессии в клетке китайского хомячка, содержащая фрагмент ДНК, описанный выше, под контролем промотора, функционирующего в указанной клетке.Also an object of the present invention is a plasmid that is capable of expression in a Chinese hamster cell, containing the DNA fragment described above, under the control of a promoter that functions in the specified cell.
Также объектом настоящего изобретения является плазмида, описанная выше, в которой указанным промотором является сильный промотор.Also an object of the present invention is a plasmid as described above, wherein said promoter is a strong promoter.
Также объектом настоящего изобретения является плазмида, описанная выше, в которой указанной плазмидой является плазмида p1.2-Zeo-CHO-VKORC1, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:5.Also an object of the present invention is a plasmid as described above, wherein said plasmid is plasmid p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 represented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 5.
Также объектом настоящего изобретения является клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом, в которой повышена активность VKORC1 по п.1.Also an object of the present invention is a Chinese hamster cell, a protein producer with a Gla domain, in which VKORC1 activity according to
Также объектом настоящего изобретения является клетка, описанная выше, в которой экспрессия VKORC1 повышена за счет повышения экспрессии VKORC1 в указанной клетке.Also an object of the present invention is a cell as described above, in which the expression of VKORC1 is increased by increasing the expression of VKORC1 in the specified cell.
Также объектом настоящего изобретения является клетка, описанная выше, в которой экспрессия VKORC1 повышена за счет трансформации указанной клетки плазмидой по п.4.Also an object of the present invention is a cell as described above, in which the expression of VKORC1 is enhanced by transformation of the indicated cell with the plasmid according to
Также объектом настоящего изобретения является клетка, описанная выше, в которой экспрессия VKORC1 повышена за счет использования сильного промотора, функционирующего в указанной клетке.Also an object of the present invention is a cell as described above, in which the expression of VKORC1 is enhanced by the use of a strong promoter that functions in the specified cell.
Также объектом настоящего изобретения является клетка, описанная выше, при этом указанной клеткой является клетка СНО DG44.Also an object of the present invention is a cell as described above, wherein said cell is a CHO DG44 cell.
Также объектом настоящего изобретения является клетка, описанная выше, в которой белок с Gla-доменом выбран из группы, состоящей из факторов свертывания крови, таких как (протромбин или фактор II, факторы VII, IX, X; антикоагулянтов, таких как белок С, белок S, белок Z; остеокальцин или Gla-белок кости, матриксный Gla-белок кости (MGP); белок регулятор клеточного цикла Gas6 (growth arrest specific gene 6 protein) и трансмембранных Gla-белков (TMGPs).Another object of the present invention is a cell as described above, in which a protein with a Gla domain is selected from the group consisting of coagulation factors, such as (prothrombin or factor II, factors VII, IX, X; anticoagulants, such as protein C, protein S, protein Z; osteocalcin or Gla bone protein, matrix Gla bone protein (MGP); protein regulator of the cell cycle Gas6 (growth arrest
Также объектом настоящего изобретения является способ получения белка с Gla-доменом, включающий стадии культивирования описанной выше в питательной среде и выделения полученного белка с Gla-доменом из культуральной жидкости.Another object of the present invention is a method for producing a protein with a Gla domain, comprising the steps of culturing the above described in a nutrient medium and isolating the obtained protein with a Gla domain from the culture fluid.
Также объектом настоящего изобретения является способ, описанный выше, в котором культивируют клетки СНО DG44/p1.2-Zeo-CHO-VKORC1.Another object of the present invention is the method described above, in which cultivate CHO cells DG44 / p1.2-Zeo-CHO-VKORC1.
Также объектом настоящего изобретения является способ, описанный выше, в котором белок с Gla-доменом выбран из группы, состоящей из факторов свертывания крови, таких как (протромбин или фактор II, факторы VII, IX, X; антикоагулянтов, таких как белок С, белок S, белок Z; остеокальцин или Gla-белок кости, матриксный Gla-белок кости (MGP); белок регулятор клеточного цикла Gas6 (growth arrest specific gene 6 protein) и трансмембранных Gla-белков (TMGPs).Another object of the present invention is the method described above, in which a protein with a Gla domain is selected from the group consisting of coagulation factors, such as (prothrombin or factor II, factors VII, IX, X; anticoagulants, such as protein C, protein S, protein Z; osteocalcin or Gla bone protein, matrix Gla bone protein (MGP); protein regulator of the cell cycle Gas6 (growth arrest
Более подробно настоящее изобретение описано ниже.In more detail, the present invention is described below.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание системы для оверэкспрессии белков с Gla-доменом в клетках китайского хомячка.The technical problem solved by the authors was the creation of a system for the overexpression of proteins with a Gla domain in Chinese hamster cells.
Технический результат достигался путем клонирования области открытой рамки считывания кДНК гена VKORC1 китайского хомячка, конструирования на ее основе новой экспрессионной плазмидной ДНК, в частности p1.2-Zeo-CHO-VKORC1, пригодной для трансфекции клеток-продуцентов белков с Gla-доменом и последующей селекции вспомогательного трансгена, позволяющей получать линии-продуценты белков с Gla-доменом с высоким уровнем продукции полностью гамма-карбоксилированного целевого белка и достаточной стабильностью основного и вспомогательного трансгенов в геноме.The technical result was achieved by cloning the open reading frame of the cDNA gene of the Chinese hamster VKORC1 gene, constructing a new expression plasmid DNA based on it, in particular p1.2-Zeo-CHO-VKORC1, suitable for transfection of protein producing cells with a Gla domain and subsequent selection auxiliary transgene, allowing to obtain production lines of proteins with a Gla domain with a high level of production of a fully gamma-carboxylated target protein and sufficient stability of the main and auxiliary transgenes in ohm.
В основе технического решения лежит разработанная авторами плазмидная ДНК p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 длиной 12318 п.о., кодирующая ген VKORC1 китайского хомячка под контролем промотора гена CHEF1 (Chinese Hamster translation Elongation Factor 1 alpha), функционирующего в клетке китайского хомячка и фланкированного нетранскрибируемыми областями гена CHEF1, а также генетический элемент, обеспечивающий возможность селекции клонов с инсерциями экспрессионной кассеты в геноме клеток продуцентов. Функциональные промотор и терминатор гена CHEF1 обеспечивают конститутивную экспрессию целевого гена; последовательность кДНК гена VKORC1 китайского хомячка обеспечивает экспрессию полипептидной цепи фермента, последовательность, включающая промотор SV40 и ген фермента устойчивости к действию антибиотика зеоцина (Zeo) обеспечивает возможность селекции стабильно трансфицированных клеток СНО в присутствии зеоцина.The technical solution is based on the 12318 bp plasmid DNA p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 developed by the authors, encoding the Chinese hamster VKORC1 gene under the control of the promoter of the CHEF1 gene (Chinese Hamster
Термин «субъединица 1 комплекса 2,3-эпоксиредуктазы витамина K (VKORC1)» означает фермент, катализирующий следующую реакцию: 2-метил-3-фитил-1,4-нафтохинон+окисленный дитиотреитол⇔2,3-эпокси-2,3-дигидро-2-метил-3-фитил-1,4-нафтохинон+1,4-дитиотреитол. Указанную активность классифицируют как ЕС 1.1.4.1. Предыдущее название - витамин K-зависимый фактор дефицита свертывания крови 2 (vitamin K dependent clotting factors deficiency 2, VKCFD2). Наличие активности ацил-СоА-дегидрогеназы может быть установлено способом, описанным, например, Goodstadt L. и Ponting C.P. (Vitamin К epoxide reductase: homology, active site and catalytic mechanism. Trends Biochem Sci. 2004 Jun; 29(6):289-92) или способом, описанным в Примерах 5 или 7. В настоящий момент известны VKORC1 человека, мыши, крысы. Так, аминокислотная последовательность рекомбинантного фермента VKORC1 человека представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:4. Последовательность ОРС гена, кодирующего рекомбинантный фермент VKORC1 человека, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:3. Примером VKORC1 китайского хомячка согласно настоящему изобретению является фермент, последовательность которого приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2 или его функциональный вариант. Последовательность белка депонирована заявителем в GenBank (03-APR-2012) под номером AFG26681.1.The term "
Термин "вариант белка", используемый в настоящем изобретении, означает белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, в котором сохраняется активность указанного белка. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 15, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 5. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для функции белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру или активность. Следовательно, вариант белка может быть представлен белками с гомологией не менее 80%, предпочтительно, не менее 90%, и, наиболее предпочтительно, не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей, при условии, что активность белка такого сохраняется.The term "protein variant", as used in the present invention, means a protein with changes in sequence, be it deletion, insertion, addition or substitution of amino acids, in which the activity of the specified protein is maintained. The number of changes in a protein variant depends on the position or type of amino acid residue in the tertiary structure of the protein. It can be from 1 to 15, preferably from 1 to 10, more preferably from 1 to 5. These changes in variants can occur in areas that are not critical for protein function. These changes are possible because some amino acids have a high homology to each other, therefore, such changes do not affect the tertiary structure or activity. Therefore, a protein variant can be represented by proteins with homology of at least 80%, preferably at least 90%, and most preferably at least 95%, with respect to the complete amino acid sequence shown in the Sequence List, provided that the activity of the protein this is preserved.
Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.Homology between two amino acid sequences can be determined using known methods, for example, the BLAST 2.0 computer program, which counts three parameters: amino acid number, identity, and similarity.
Замена, делеция, вставка или добавление одной или нескольких аминокислотных остатков являются консервативной (-ыми) мутацией (-ями), если сохраняется активность. Типичным примером консервативной мутации является консервативная замена. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Не на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, He или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu.Substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acid residues is a conservative mutation (s) if activity is maintained. A typical example of a conservative mutation is a conservative substitution. Examples of conservative substitutions include replacing Ala with Ser or Thr, replacing Arg with Gln, His or Lys, replacing Asn with Glu, Gln, Lys, His or Asp, replacing Asp with Asn, Glu or Gln, replacing Cys with Ser or Ala, replacing Gln with Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, replacing Glu with Asn, Gln, Lys or Asp, replacing Gly with Pro, replacing His with Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, replacing Not with Leu, Met, Val or Phe, replace Leu with Ile, Met, Val or Phe, replace Lys with Asn, Glu, Gln, His or Arg, replace Met with Ile, Leu, Val or Phe, replace Phe with Trp, Tyr, Met, He or Leu, replacing Ser with Thr or Ala, replacing Thr with Ser or Ala, replacing Trp with Phe or Tyr, replacing Tyr with His, Phe or Trp, and replacing Val with Met, Ile or Leu.
Фрагментом ДНК, кодирующим VKORC1 китайского хомячка согласно настоящему изобретению, является любой (с точки зрения вырожденности генетического кода) фрагмент ДНК, кодирующий фермент из китайского хомячка, обладающий активностью VKORC1.A DNA fragment encoding a Chinese hamster VKORC1 according to the present invention is any (from the point of view of the degeneracy of the genetic code) DNA fragment encoding a Chinese hamster enzyme having VKORC1 activity.
Примером последовательности ОРС гена, кодирующего фермент VKORC1 клеток китайского хомячка DG44 согласно настоящему изобретению, является последовательность, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Указанная последовательность депонирована 03.04.2012 заявителем в базу данных GenBank под номером JQ400047.1. Аминокислотная последовательность фермента VKORC1 клеток китайского хомячка DG44 согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2.An example of an OPC sequence of a gene encoding the VKORC1 enzyme of Chinese hamster DG44 cells according to the present invention is the sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. The indicated sequence was deposited on 04.03.2012 by the applicant into the GenBank database under the number JQ400047.1. The amino acid sequence of the VKORC1 enzyme of Chinese hamster DG44 cells according to the present invention is presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 2.
Фрагменты ДНК, которые кодируют, по существу, те же регуляторные элементы могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько нуклеотидов в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.DNA fragments that encode essentially the same regulatory elements can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of the DNA fragment (SEQ ID NO: 1), for example, by the method of site-directed mutagenesis, so that one or more nucleotides in a particular site will be delegated, replaced, inserted or added. DNA fragments modified as described above can be obtained using conventional processing methods to obtain a mutation.
Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный вектор позволяет получить высокопродуктивный клон клеток с увеличенным содержанием ферментов, осуществляющих гамма-карбоксилирование, определяются по ферментативной активности витамин-K эпоксиредуктазного комплекса в лизате клеточной массы (при этом удельная ферментативная активность определяется как отношение скорости восстановления 2,3-эпоксида витамина K1 лизатом клеток в присутствии избытка донора электронов, например дитиотреитола, и концентрации общего белка в исследуемом лизате). Измерение удельной ферментативной активности описано в Примерах 5 и 7.Indicators of functional activity, in which it is believed that the obtained vector allows to obtain a highly productive clone of cells with an increased content of gamma-carboxylation enzymes, is determined by the enzymatic activity of the vitamin K epoxy reductase complex in the cell mass lysate (the specific enzymatic activity is defined as the ratio of the
Измерение степени превращения 2,3-эпоксида витамина K в восстановленную форму витамина К может быть проведено путем последовательного отбора аликвот из лизата исследуемых клеток, смешанных с донором электронов дитиотреитолом и субстратом реакции -2,3-эпоксидом витамина K1, экстракции всех форм витамина K1 смесью гексана и изопропанола, последующим отделением органической фазы, ее выпариванием в вакууме, растворением нелетучего осадка в минимальном объеме метанола, хроматографическом разделении окисленной и восстановленной форм витамина K1 на колонке для обращенно-фазовой хроматографии, расчета объемов пиков форм витамина K1 и вычисления доли восстановленной формы витамина K1.The degree of conversion of 2,3-epoxide of vitamin K to the reduced form of vitamin K can be measured by sequential selection of aliquots from the lysate of the studied cells mixed with an electron donor dithiothreitol and a substrate of the reaction of 2,3-epoxide of vitamin K1, extraction of all forms of vitamin K1 with a mixture hexane and isopropanol, followed by separation of the organic phase, its evaporation in vacuum, dissolution of the non-volatile precipitate in a minimum volume of methanol, chromatographic separation of the oxidized and reduced forms of vitamin K1 on a column for reverse phase chromatography, calculating peak volumes of forms of vitamin K1 and calculating the proportion of reduced forms of vitamin K1.
Активность фермента в клетке может быть повышена за счет увеличения количества соответствующей мРНК, повышения количества соответствующего фермента, или увеличения удельной активности фермента. Количество соответствующей мРНК может быть увеличено за счет увеличения числа копий соответствующего гена или за счет усиления транскрипции соответствующего гена, достигаемого путем использования более сильного промотора, снятия репрессии, или за счет увеличения стабильности мРНК. Количество соответствующего фермента может быть повышено за счет усиления трансляции соответствующей мРНК, достигаемого модификацией нуклеотидной последовательности сайта связывания рибосом соответствующей мРНК или за счет увеличения его стабильности. Удельная активность фермента может быть увеличена за счет введения соответствующих мутаций в аминокислотную последовательность фермента.The activity of the enzyme in the cell can be increased by increasing the amount of the corresponding mRNA, increasing the amount of the corresponding enzyme, or by increasing the specific activity of the enzyme. The amount of the corresponding mRNA can be increased by increasing the number of copies of the corresponding gene or by enhancing the transcription of the corresponding gene, achieved by using a stronger promoter, removing repression, or by increasing the stability of the mRNA. The amount of the corresponding enzyme can be increased by enhancing the translation of the corresponding mRNA achieved by modifying the nucleotide sequence of the ribosome binding site of the corresponding mRNA or by increasing its stability. The specific activity of the enzyme can be increased by introducing appropriate mutations in the amino acid sequence of the enzyme.
Методы усиления экспрессии гена включают увеличение числа копий гена. Введение гена в вектор, способный функционировать в клетке согласно настоящему изобретению, увеличивает число копий гена.Methods for enhancing gene expression include increasing the number of copies of a gene. The introduction of a gene into a vector capable of functioning in a cell according to the present invention increases the number of copies of the gene.
Термин «плазмида, обладающая способностью к экспрессии в клетке китайского хомячка» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии в клетке-хозяине внедренного в него гена, например, такие как промотор, терминатор, и элементов для отбора клонов с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме. Конкретным примером генетических элементов, согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор гена CHEF1, и ген фермента, обеспечивающего устойчивость клеток к действию зеоцина.The term "plasmid capable of expression in a Chinese hamster cell" means a plasmid DNA containing all the necessary genetic elements for expression in a host cell of a gene embedded in it, for example, such as a promoter, terminator, and elements for selection of clones with multiple copies of expression cassettes in the genome. A specific example of genetic elements according to the present invention is, but is not limited to, the CHEF1 gene promoter and an enzyme gene that provides cell resistance to zeocin.
Конкретным примером такой плазмиды является плазмида p1.2-Zeo-CHO-VKORC1. Карта экспрессионной плазмиды p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 согласно настоящему изобретению, приведена на Фиг. 1, последовательность плазмиды представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:5. Карта экспрессионной плазмиды p1.2-Zeo-hVKORC1, кодирующей VKORC1 человека, приведена на Фиг. 2, последовательность плазмиды представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:6.A specific example of such a plasmid is plasmid p1.2-Zeo-CHO-VKORC1. A map of the expression plasmid p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 according to the present invention is shown in FIG. 1, the sequence of the plasmid is presented in the List of sequences under the number SEQ ID NO: 5. A map of the expression plasmid p1.2-Zeo-hVKORC1 encoding human VKORC1 is shown in FIG. 2, the sequence of the plasmid is presented in the List of sequences under the number SEQ ID NO: 6.
Практические функциональные свойства плазмиды, содержащей ген VKORC1 китайского хомячка, p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 (SEQ ID NO:5) можно оценить по сравнению с контрольной плазмидой p1.2-Zeo-hVKORC1 (SEQ ID NO:6), содержащей OPC VKORC1 человека.The practical functional properties of the plasmid containing the Chinese hamster VKORC1 gene, p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 (SEQ ID NO: 5) can be compared with the control plasmid p1.2-Zeo-hVKORC1 (SEQ ID NO: 6) containing OPC VKORC1 person.
Плазмида p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 размером 12318 п.о. состоит из:Plasmid p1.2-Zeo-CHO-
1) фрагмента размером 501 п.о. (6446-6946), включающего открытую рамку считывания VKORC1 китайского хомячка, последовательность Козак, обеспечивающую инициацию трансляции и стоп-кодон;1) a fragment of size 501 bp (6446-6946), including an open reading frame VKORC1 of a Chinese hamster, a Kozak sequence that provides translation initiation and a stop codon;
2) фрагмента векторной плазмиды p1.2-Zeo размером 11817 п.о. (6947-6445), содержащего элементы для экспрессии целевого белка в клетках млекопитающих (функциональный вирусный промотор, сигнал полиаденилирования и функциональный терминатор) и селекционный маркер для отбора в эукариотических клетках, а также элементы, необходимые для продукции плазмиды в бактериальной клетке - область начала репликации и селекционный маркер.2) a fragment of the vector plasmid p1.2-Zeo with a size of 11817 bp (6947-6445), which contains elements for the expression of the target protein in mammalian cells (functional viral promoter, polyadenylation signal and functional terminator) and a selection marker for selection in eukaryotic cells, as well as elements necessary for plasmid production in a bacterial cell - the region where replication begins and a selection marker.
Указанная плазмида содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: PvuI (1409), AbsI (6446), AfeI (6522), NheI (6947), KpnI (11089), PsiI (12204).The indicated plasmid contains unique recognition sites for restriction endonucleases: PvuI (1409), AbsI (6446), AfeI (6522), NheI (6947), KpnI (11089), PsiI (12204).
Плазмида была получена с использованием стандартных методов генной инженерии, коммерчески доступных плазмид и химически синтезированных олигонуклеотидов [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989].The plasmid was obtained using standard methods of genetic engineering, commercially available plasmids and chemically synthesized oligonucleotides [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989].
Усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения множества копий гена в геном. Для введения множества копий гена в геном выполняется гомологичная рекомбинация с использованием в качестве целевых последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Последовательности с множеством копий в геномной ДНК, включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся ДНК, или инвертированные повторы на концах транспонируемых элементов. Также возможно включить ген в состав транспозона и обеспечить его перенос для введения множества копий гена в хромосомную ДНК.Enhanced gene expression can also be achieved by introducing multiple copies of the gene into the genome. To introduce multiple copies of a gene into the genome, homologous recombination is performed using the target sequences present on the chromosome in multiple copies. Multiple copy sequences in genomic DNA include, but are not limited to, repetitive DNA, or inverted repeats at the ends of transposed elements. It is also possible to incorporate the gene into the transposon and provide for its transfer to introduce multiple copies of the gene into the chromosomal DNA.
Усиление экспрессии гена также может быть достигнуто путем подстановки фрагмента ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. Использование сильного промотора можно сочетать с увеличением копий гена.Enhanced gene expression can also be achieved by substituting the DNA fragment of the present invention under the control of a strong promoter. Using a strong promoter can be combined with an increase in gene copies.
С другой стороны, действие промотора может быть усилено, например, введением в промотор мутации, ведущей к увеличению уровня транскрипции локализованного за промотором гена. Кроме того, возможно ввести нуклеотидную замену в область промотора гена на хромосоме, результатом чего является усиление функции промотора.On the other hand, the action of the promoter can be enhanced, for example, by introducing a mutation into the promoter, leading to an increase in the level of transcription of the gene localized behind the promoter. In addition, it is possible to introduce a nucleotide substitution in the region of the promoter of the gene on the chromosome, resulting in an increase in the function of the promoter.
Усиление трансляции может быть достигнуто путем введения во фрагмент ДНК согласно настоящему изобретению более эффективной последовательности Козак. Последовательность Козак располагается вокруг старт-кодона целевого гена и способствует инициации трансляции мРНК целевого гена. Использование сильного промотора можно сочетать с использованием более эффективной последовательности Козак.Enhanced translation can be achieved by introducing into the DNA fragment according to the present invention a more efficient Kozak sequence. The Kozak sequence is located around the start codon of the target gene and helps to initiate translation of the mRNA of the target gene. Using a strong promoter can be combined using a more efficient Kozak sequence.
Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Согласно настоящему изобретению термин «клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом» означает клональную линию клеток китайского хомячка, обладающую способностью к продукции и секреции белка с Gla-доменом, когда она согласно настоящему изобретению выращивается в питательной среде. Используемый здесь термин «клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом» также означает линию клеток, которые способна секретировать белок с Gla-доменом в количестве не менее чем 0,1 мкг/мл, более предпочтительно, не менее чем 1 мкг/мл при культивировании в суспензионной культуре в бессывороточной среде. Указанный белок с Gla-доменом секретируется указанными клетками в культивационную среду.Methods for preparing plasmid DNA, DNA restriction and ligation, transformation, selection of nucleotides as a primer, etc. may be conventional methods known to a person skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). According to the present invention, the term "Chinese hamster cell - producer of a protein with a Gla domain" means a clonal Chinese hamster cell line that is capable of producing and secreting a protein with a Gla domain when it is grown in a culture medium according to the present invention. The term “Chinese hamster cell - producer of a protein with a Gla domain” as used herein also means a cell line that is capable of secreting a protein with a Gla domain in an amount of not less than 0.1 μg / ml, more preferably not less than 1 μg / ml when cultured in suspension culture in serum-free medium. The specified protein with a Gla domain is secreted by these cells into the cultivation medium.
В качестве примера предпочтительных клеток яичника китайского хомячка может быть приведена линия СНО DG44 (Invitrogen cGMP banked, США; Mol Cell Biol 5, 1750-1759 Kaufman RJ et al. 1985). Круг сублиний СНО не ограничен каким-либо образом, например, могут быть использованы сублинии СНО CHOZN DHFR, CHO DUKX B11 и подобные им.An example of a preferred Chinese hamster ovary cell is the CHO line DG44 (Invitrogen cGMP banked, USA;
Конкретным примером линии для получения продуцента фактора свертывания крови VIII человека с делегированным В-доменом согласно настоящему изобретению является линия СНО DG44, но спектр линий клеток не ограничиваются ей.A specific example of a line for producing a producer of human coagulation factor VIII with a delegated B domain according to the present invention is the CHO line DG44, but the range of cell lines is not limited thereto.
Белком с Gla-доменом является белок, выбранный из группы, состоящей из факторов свертывания крови, таких как (протромбин или фактор II, факторы VII, IX, X; антикоагулянтов, таких как белок С, белок S, белок Z; остеокальцин или Gla-белок кости, матриксный Gla-белок кости (MGP); белок регулятор клеточного цикла Gas6 (growth arrest specific gene 6 protein) и трансмембранных Gla-белков (TMGPs).A protein with a Gla domain is a protein selected from the group consisting of coagulation factors, such as (prothrombin or factor II, factors VII, IX, X; anticoagulants such as protein C, protein S, protein Z; osteocalcin or Gla- bone protein, matrix Gla-bone protein (MGP); protein regulator of the cell cycle Gas6 (growth arrest
Также для реализации настоящего изобретения еще одной технической задачей явилось создание способа получения высокопродуктивных и стабильных при последовательном пассировании линий клеток млекопитающих-продуцентов белков с Gla-доменом с увеличенным содержанием ферментов, обеспечивающих гамма-карбоксилирование, с использованием эукариотической клетки (или эукариотической клетки-продуцента Gla-домен содержащих белков), трансфицированной экспрессионной плазмидой.Also, for the implementation of the present invention, another technical task was the creation of a method for producing highly productive and stable during sequential passage of cell lines of mammalian protein producers with a Gla domain with an increased content of enzymes providing gamma-carboxylation using a eukaryotic cell (or a Gla eukaryotic producer cell -domain containing proteins) transfected with an expression plasmid.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения белка с Gla-доменом в клетках китайского хомячка, включающего культивирование в питательной среде описанных выше клеток - продуцентов белка с Gla-доменом, и выделение полученного целевого рекомбинантного белка из культуральной жидкости.It is also an object of the present invention to provide a method for producing a protein with a Gla domain in Chinese hamster cells, comprising culturing in the nutrient medium the above-described cells producing protein with a Gla domain, and isolating the obtained target recombinant protein from the culture fluid.
Выращивание клеток, выделение и очистка целевого белка из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам культивирования, в которых рекомбинантный белок продуцируется с использованием клеток млекопитающих.Cell growth, isolation and purification of the target protein from a culture or similar liquid can be carried out in a manner similar to traditional cultivation methods in which a recombinant protein is produced using mammalian cells.
Питательная среда, используемая для культивирования, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста клеток. В качестве источника углерода могут использоваться различные углеводы, такие как глюкоза или сахароза и другие органические кислоты. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.The culture medium used for cultivation can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, an appropriate amount of nutritional supplements necessary for cell growth. Various carbohydrates such as glucose or sucrose and other organic acids can be used as a carbon source. As the nitrogen source, various inorganic ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural sources of nitrogen, can be used. As mineral additives, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. As vitamins, thiamine, yeast extract, and the like can be used.
Выращивание может осуществляться в аэробных условиях, предпочтительно с повышенным содержанием СО2 (8%), таких как перемешивание культуральной жидкости в колбах, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. Обычно, выращивание в течение от 12 часов до 4 дней приводит к накоплению целевого рекомбинантного белка в культуральной среде или в цитоплазме клетки.The cultivation can be carried out under aerobic conditions, preferably with a high content of CO 2 (8%), such as mixing the culture fluid in the flasks, at a temperature in the range from 20 to 40 ° C, preferably in the range from 30 to 38 ° C. Usually, growing for 12 hours to 4 days leads to the accumulation of the target recombinant protein in the culture medium or in the cytoplasm of the cell.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования, а затем целевой белок может быть выделен и очищен методами хроматографии и/или концентрирования.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation, and then the target protein can be isolated and purified by chromatography and / or concentration.
Особенности настоящего изобретения и результаты его практического применения приведены на следующих Фигурах и Примерах.Features of the present invention and the results of its practical application are shown in the following Figures and Examples.
Краткое описание Фигур.Short Description of Figures.
На Фигуре 1 показана карта экспрессионной плазмиды p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 (длина 12318 пар оснований). Используются следующие обозначения: pUC origin - область начала репликации плазмиды pUC; bla - открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину; bla promoter - прокариотический промотор гена bla; EBVTR -участок терминального повтора вируса Эпштейна-Барр человека; СНО EEF1A UFR функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 5′ нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген; transcription start - точка начала транскрипции, Kozak - область, кодирующая последовательность Козак для кэп-зависимой инициации трансляции, СНО VKORC ORF - ОРС гена VKORC1 китайского хомячка, stop - стоп-кодон, СНО EEF1A DFR функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 3′ нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген; SV40 early promoter -промотор ранних генов вируса SV40, Zeo(R)- ген устойчивости к селекционному агенту - антибиотику зеоцину, SV40 pA - сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 1 shows a map of the expression plasmid p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 (
На Фигуре 2 показана карта экспрессионной плазмиды p1.2-Zeo-hVKORC1 (длина 12324 пар оснований). Обозначения аналогично Фигуре 1. hVKORC1 ORF - ОРС гена VKORC1 человека.Figure 2 shows a map of the expression plasmid p1.2-Zeo-hVKORC1 (
На Фигуре 3 показана схема получения экспрессионных плазмид pCMV6-Entry-CHO-VKORC1 и pCMV6-Entry-hVKORC1. Используются следующие обозначения: Линейные фрагменты ДНК изображены в виде прямоугольников, плазмиды - кругов. Пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, сплошной линией обозначены стадии рестрикции-лигирования, названия эндонуклеаз рестрикции, использовавшихся для клонирования, указаны под названием плазмид курсивом, названия олигонуклеотидных праймеров показаны прямым шрифтом.The Figure 3 shows the scheme for obtaining expression plasmids pCMV6-Entry-CHO-VKORC1 and pCMV6-Entry-hVKORC1. The following notation is used: Linear DNA fragments are shown in the form of rectangles, plasmids - circles. The dotted line indicates the PCR stages, the solid line indicates the restriction-ligation stages, the names of the restriction endonucleases used for cloning are indicated under the name of the plasmids in italics, the names of the oligonucleotide primers are shown in direct font.
На Фигуре 4 показана карта экспрессионного вектора pCMV6-Entry (длина 4927 пар оснований). Используются следующие обозначения: CMV-promoter - цитомегаловирусный промотор, polyA - сигнал полиаденилирования гормона роста быка, ColE1 - бактериальная область начала репликации, f1 - область начала репликации бактериофага f1, Kan/Neo - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу с бактериальным промотором, обеспечивающая устойчивость бактерий к канамицину, SV40 - ранний промотор полиомавируса SV40, обеспечивающий экспрессию аминогликозид-3'-фосфотрансферазы в эукариотических клетках, что позволяет вести их селекцию антибиотиком G418. Направления транскрипции генов указаны стрелками.Figure 4 shows a map of the expression vector pCMV6-Entry (
На Фигуре 5 показана карта экспрессионной плазмиды pCMV6-Entry-CHO-VKORC1 (длина 5238 пар оснований). Обозначения аналогично фигуре 4, а также: CHOVKORC1 - ОРС гена VKORC1 китайского хомячка, Kozak - последовательность Козак, обеспечивающая инициацию трансляции в клетках эукариот. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 5 shows a map of the expression plasmid pCMV6-Entry-CHO-VKORC1 (
На Фигуре 6 показана карта экспрессионной плазмиды pCMV6-Entry-h VKORC1 (длина 5244 пар оснований). Обозначения аналогично Фигуре 5. hVKORC1 - ОРС гена VKORC1 человека.Figure 6 shows a map of the expression plasmid pCMV6-Entry-h VKORC1 (
На Фигуре 7 показана схема получения экспрессионных плазмид p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и р1.2-Zeo-hVKORC1. Обозначения аналогично Фигуре 3The Figure 7 shows the scheme for obtaining expression plasmids p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 and p1.2-Zeo-hVKORC1. Designations similar to Figure 3
На Фигуре 8 показана карта экспрессионного вектора p1.2-Zeo (длина 11838 пар оснований). Используются следующие обозначения: pUC origin - область начала репликации плазмиды pUC; bla - открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину; bla promoter - прокариотический промотер гена bla; EBVTR - участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR); 5CHEF функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' НТО этого гена; 3CHEF функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' НТО этого гена; SV40 promoter - область промотора вируса SV40; SV40 рА, terminator - терминатор и сигнал полиаденилирования вируса SV40; zeoR - ген устойчивости к зеоцину. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 8 shows a map of the expression vector p1.2-Zeo (length 11838 base pairs). The following notation is used: pUC origin - region of the beginning of replication of the plasmid pUC; bla - open reading frame of beta-lactamase, which provides resistance to ampicillin; bla promoter - prokaryotic promoter of the bla gene; EBVTR - plot of the terminal repeat of the Epstein-Barr virus person (EBVTR); 5CHEF functional promoter of the
На Фигуре 9 показаны зависимости уровней восстановления эпоксида витамина K1 (VK1>0) от концентрации лизатов (А) и времени реакции(В). Концентрация общего белка для зависимости уровня превращения VK1>0 от времени реакции - 0,81 мг/мл, время реакции для зависимости уровня превращения VK1>0 от концентрации общего белка в лизатах - 3 ч. Все уровни восстановления скорректированы на величину фонового уровня восстановления VK1>0 в отсутствие лизатов. Обозначения: с VKORC1 - лизат клеток, стабильно трансфицированных плазидой p1.2-Zeo-CHO-VKORCl; hVKORC1 - лизат клеток, стабильно трансфицированных плазидой p1.2-Zeo-h VKORC1; СНО DG-44 - лизат нетрансфицированных клеток линии СНО DG-44.The Figure 9 shows the dependence of the levels of recovery of vitamin K1 epoxide (VK1> 0) on the concentration of lysates (A) and reaction time (B). The concentration of total protein for the dependence of the level of conversion of VK1> 0 on the reaction time is 0.81 mg / ml, the reaction time for the dependence of the level of conversion of VK1> 0 on the concentration of total protein in lysates is 3 hours. All recovery levels are corrected for the background level of recovery of VK1 > 0 in the absence of lysates. Designations: with VKORC1 — a lysate of cells stably transfected with the plasmid p1.2-Zeo-CHO-VKORCl; hVKORC1 — lysate of cells stably transfected with p1.2-Zeo-h VKORC1; CHO DG-44 - lysate of non-transfected CHO DG-44 cell line.
На Фигуре 10 показана оценка максимальной скорости реакции восстановления эпоксида витамина K1 (VK1>0), катализируемой VKORC1 китайского хомячка и человека. Время реакции - 3 ч. Обозначения аналогично Фиг.9.The Figure 10 shows the assessment of the maximum reaction rate of the recovery of vitamin K1 epoxide (VK1> 0), catalyzed by VKORC1 Chinese hamster and man. The reaction time is 3 hours. Designations are similar to Fig.9.
На Фигуре 11 показаны результаты определения числа копий экспрессионных кассет, содержащих ОРС VKORC1 китайского хомячка и человека. Копийность генов нормализована на копийность опорного гена китайского хомячка PPIB с известной копийностью 1. Планкой погрешности обозначены стандартные отклонения, не менее трех параллельных определений для каждого образца. Относительная погрешность определения числа копий опорного гена не более 30% для всех образцов. Обозначения: Zeo - область ОРС маркера устойчивости к действию зеоцина, остальные обозначения аналогично Фиг.9.The Figure 11 shows the results of determining the number of copies of expression cassettes containing OPC VKORC1 Chinese hamster and man. The copy number of genes is normalized to the copy number of the reference gene of the Chinese hamster PPIB with the known
На Фигуре 12 показаны относительные уровни мРНК оверэкспрессированных ОРС VKORC1 китайского хомячка и человека, нормализованные на уровень мРНК бета-актина. Планкой погрешности обозначены стандартные отклонения, не менее трех параллельных определений для каждого образца. Относительная погрешность определения уровня мРНК бета-актина не более 30% для всех образцов. Обозначения; "СНО DG-44 с" - амплификация при помощи праймеров к искусственному гену VKORC1 китайского хомячка; "СНО DG-44 h" - амплификация при помощи праймеров к ОРС VKORC1 человека, комплементарных ОРС эндогенной мРНК VKORC1 китайского хомячка и ОРС VKORC1 человека, остальные обозначения аналогично Фиг.9.Figure 12 shows the relative mRNA levels of overexpressed OPC VKORC1 of a Chinese hamster and a human normalized to beta-actin mRNA level. The error bar indicates standard deviations, at least three parallel determinations for each sample. The relative error in determining the level of beta-actin mRNA is not more than 30% for all samples. Designations; "CHO DG-44 s" - amplification using primers to the artificial hamster gene VKORC1 of a Chinese hamster; "CHO DG-44 h" - amplification using primers for human OPC VKORC1 complementary to the OPC of the endogenous mRNA VKORC1 of the Chinese hamster and the OPC of VKORC1 human, the remaining designations are similar to Fig. 9.
Существо и промышленная применимость изобретения в биотехнологии иллюстрируются следующими примерами.The essence and industrial applicability of the invention in biotechnology are illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение плазмидной ДНК pAL-CHOVKORC1.Example 1. Obtaining plasmid DNA pAL-CHOVKORC1.
Из замороженной биомассы, содержащей 2 млн клеток CHO-DG44, реагентом TRI Reagent (MRC) была выделена РНК, растворена в воде с 0.5 мкг/мкл проверена на 1,2% ТАЕ агарозном геле. Синтез кДНК проводили набором MINT по протоколу производителя, используя 2 мкл РНК матрицы. Реакционная смесь 10 мкл была разбавлена в 2 раза водой и использована для амплификации кДНК набором Encycio PCR Kit по протоколу производителя. Состав реакционной смеси (10×PCR-буфер - 5 мкл; Encycio полимераза- 1 мкл, dNTP (по 10 мкМ каждого) - 1 мкл, M1-праймер (SEQ ID NO:7) - 10 мкM 2 мкл, первая цепь cDNA, разбавленная в 2 раза - 2 мкл, вода до 50 мкл). Режим амплификации: 95°С - 1 мин и 17 циклов: 95°С - 20 с/66°С - 15 с/72°С - 3 мин. кДНК очищали на колонке, элюировали 50 мкл 5 мМ tris-HCl pH 8.0, концентрация составила 25 нг/мкл. Амплифицированную кДНК перед использованием прогревали 65°С 1 мин, перемешивали, аликвоту разбавляли водой в 20 раз, использовали 1 мкл разбавленной кДНК на 25 мкл ПЦР-смеси. Вели ПЦР, используя праймеры vkof1, vkof2, vkor1 (SEQ ID NO:8-10).RNA was isolated from frozen biomass containing 2 million CHO-DG44 cells using TRI Reagent reagent (MRC), dissolved in water with 0.5 μg / μl and tested on a 1.2% TAE agarose gel. The cDNA synthesis was performed using a MINT kit according to the manufacturer's protocol using 2 μl of the RNA template. The reaction mixture of 10 μl was diluted 2 times with water and used for amplification of cDNA kit Encycio PCR Kit according to the manufacturer's protocol. The composition of the reaction mixture (10 × PCR buffer - 5 μl; Encycio polymerase - 1 μl, dNTP (10 μM each) - 1 μl, M1 primer (SEQ ID NO: 7) - 10
ПЦР проводили при помощи смеси Tersus polymerase mix или Encycio PCR Kit no (ЗАО «Евроген») инструкции производителя на приборе РТС-100 Thermal Cycler («MJ Reseach», США). В параллельных экспериментах использовали реакционную смесь, содержавшую дополнительно 5% DMSO и не содержавшую DMSO. Режим амплификации: 1) 95°С - 3 мин и 39 циклов: 95°С - 20 с/градиент 52-65°С - 20 с/72°С -1 мин, финальная элонгация 72°С - 5 мин; 2) 1) 95°С - 3 мин, 30 циклов: 95°С - 20 с/ инкремент от 65°С с шагом 0,5°С/цикл - 20 с/72°С - 1 мин, 10 циклов: 95°С - 20 с/ 54°С - 20 с/72°С -1 мин, финальная элонгация 72°С - 5 мин.PCR was performed using a Tersus polymerase mix or Encycio PCR Kit no (CJSC Evrogen) manufacturer's instructions on a RTS-100 Thermal Cycler device (MJ Reseach, USA). In parallel experiments, a reaction mixture containing an additional 5% DMSO and not containing DMSO was used. Amplification mode: 1) 95 ° С - 3 min and 39 cycles: 95 ° С - 20 s / gradient 52-65 ° С - 20 s / 72 ° С -1 min, final elongation 72 ° С - 5 min; 2) 1) 95 ° C - 3 min, 30 cycles: 95 ° C - 20 s / increment from 65 ° C in increments of 0.5 ° C / cycle - 20 s / 72 ° C - 1 min, 10 cycles: 95 ° С - 20 s / 54 ° С - 20 s / 72 ° С -1 min, final elongation 72 ° С - 5 min.
Продукты ПЦР выделяли из 1% агарозного геля, используя набор реактивов «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США) по протоколу производителя, после чего лигировали в Т-вектор PAL-TA («Евроген», Россия) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора («Fermentas», Литва). Лигирование вели в объеме 10 мкл при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е. coli штамма DH5α, с генотипом F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 end A1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е. coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 20 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42С в течение 45 секунд и инкубировали на льду в течение 5 минут. После чего добавляли 800 мкл питательного бульона SOB и инкубировали при 37°С в течение 60 минут. Затем переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара, и помещали в термостат на 18 часов при 37С. Колонии Е. coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров SP6 и T7prom (SEQ ID NO:11-12). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и проводили выделение плазмидной ДНК набором реактивов «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя, первичную нуклеотидную последовательность области вставки полученной плазмиды pAL-CHOVKORC 1 определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров SP6 и T7prom (SEQ ID NO:11-12).PCR products were isolated from 1% agarose gel using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System reagent kit (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol, after which they were ligated into the PAL-TA T-vector (Eurogen, Russia ) using T4 phage DNA ligase and standard buffer solution (Fermentas, Lithuania). Ligation was carried out in a volume of 10 μl with a molar ratio of vector and insert 1:10, for 2-20 hours at room temperature. The obtained ligase mixtures transformed E. coli cells of strain DH5α, with the genotype F-φ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1 end A1 hsdR17 (r k -, m k +) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1. For this, 5 μl of the ligase mixture was added to 200 μl of a frozen E. coli cell suspension, incubated on ice for 20 minutes to sorb plasmid DNA, heated to 42 ° C for 45 seconds, and incubated on ice for 5 minutes. Then 800 μl of SOB nutrient broth was added and incubated at 37 ° C for 60 minutes. Then the suspension was transferred to a Petri dish with solid agar medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg / 1 ml of agar, and placed in a thermostat for 18 hours at 37 ° C. Colonies of E. coli, selected as a result of blue-white screening, were analyzed by PCR from clones from primers SP6 and T7prom (SEQ ID NO: 11-12). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Amp nutrient broth and plasmid DNA was isolated using a set of Wizard Plus SV Minipreps reagents (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol, the primary nucleotide sequence of the insertion region of the obtained plasmid pAL-
Последовательность ОРС гена, кодирующего фермент VKORC 1 клеток китайского хомячка DG44 согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Последовательность депонирована 03.04.2012 заявителем в GenBank JQ400047.1 Аминокислотная последовательность фермента VKORC 1 клеток китайского хомячка DG44 согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2. Последовательность ОРС белка депонирована заявителем в GenBank (03-APR-2012) AFG26681.1.The OPC sequence of the gene encoding the
Полученную плазмиду pAL-CHOVKORC 1, содержащую ОРС гена VKORC 1 клеток китайского хомячка DG44, использовали для получения экспрессионных конструкций.The obtained plasmid pAL-
Пример 2. Получение экспрессионной плазмидной ДНК pCMV6-Entry-CHO VKORC1.Example 2. Obtaining expression plasmid DNA pCMV6-Entry-CHO VKORC1.
При помощи адапторных праймеров AD-VKOR-BglRF и AD-CVKOR-AsiGRN2 (SEQ ID NO:13-14) и pAL-CHOVKORC1 в качестве матрицы получили ПЦР-продукт, содержащий ОРС VKORC1 китайского хомячка с добавленными рестриктными сайтами для субклонирования. Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор PAL-TA как описано в примере 1 с образованием pAL-CHOVKORC1-АВ, анализировали методом ПЦР с клонов и секвенированием области вставки, используя праймеры SP6 и T7prom (SEQ ID NO:11-12).Using the adapter primers AD-VKOR-BglRF and AD-CVKOR-AsiGRN2 (SEQ ID NO: 13-14) and pAL-CHOVKORC1, a PCR product containing Chinese hamster OPC VKORC1 with added restriction sites for subcloning was obtained as a template. The resulting PCR product was cloned into the PAL-TA vector as described in Example 1 to form pAL-CHOVKORC1-AB, analyzed by clone PCR and sequencing of the insertion region using primers SP6 and T7prom (SEQ ID NO: 11-12).
Плазмиду pAL-CHOVKORC1-AB с подтвержденной первичной нуклеотидной последовательностью рестрицировали BglII. и AsiGI (изошизомер AgeI) переносили фрагмент, содержащий ОРС в вектор pCMV6-Entry (Кат №PS 100001 Origene, США, Фиг.4), рестрицированный BglII-XmaI, с образованием pCMV6-Entry-CHOVKORC1 (Фиг.5, SEQ ID NO:15). Для этого продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли набором реактивов Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System no методике производителя. Реакцию лигирования очищенных фрагментов и трансформацию лигатами клеток Е. со/г штамма DHSa вели как описано в примере 1. Трансформантов высевали на агаризованную среду с канамицином (30 мкг/1 мл агара). Е. coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров AD-VKOR-BglRF и AD-CVKOR-AsiGRN2(SEQ ID NO:13-14). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan (30 мкг/мл), проводили выделение плазмидной ДНК набором «Wizard Plus SV Minipreps». Нуклеотидную последовательность верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-VKOR-BglRF и AD-CVKOR-AsiGRN2 (SEQ ID NO:13-14).Plasmid pAL-CHOVKORC1-AB with a confirmed primary nucleotide sequence was restricted with BglII. and AsiGI (AgeI isoschizomer) transferred the fragment containing OPC to the pCMV6-Entry vector (Cat No. PS 100001 Origene, USA, FIG. 4), restricted with BglII-XmaI, to form pCMV6-Entry-CHOVKORC1 (FIG. 5, SEQ ID NO :fifteen). For this, the restriction products were separated on a 1% agarose gel and isolated using the Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System reagent kit according to the manufacturer's method. The ligation reaction of the purified fragments and the transformation of E. co / g of DHSa strain by ligates was carried out as described in Example 1. Transformants were seeded on an agar medium with kanamycin (30 μg / 1 ml of agar). E. coli was analyzed by PCR from clones from the primers AD-VKOR-BglRF and AD-CVKOR-AsiGRN2 (SEQ ID NO: 13-14). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan nutrient broth (30 μg / ml), plasmid DNA was isolated using the Wizard Plus SV Minipreps kit. The nucleotide sequence was verified by PCR sequencing from the primers AD-VKOR-BglRF and AD-CVKOR-AsiGRN2 (SEQ ID NO: 13-14).
Плазмидную ДНК pCMV6-Entry-CHOVKORCl (SEQ ID NO:15) для трансфекции нарабатывали в клетках Е. соli (штамм Stbl4, #11635018 «Invitrogen»). Клетки культивировали в 0.5 л среды ТВ-Kan (30 мкг/мл) 18 ч, и выделяли плазмиды набором EndoFree Plasmid MaxiKit («Qiagen», США) по протоколу производителя.The plasmid DNA pCMV6-Entry-CHOVKORCl (SEQ ID NO: 15) for transfection was generated in E. coli cells (Stbl4 strain, # 11635018 "Invitrogen"). Cells were cultured in 0.5 L of TV-Kan medium (30 μg / ml) for 18 h, and plasmids were isolated using the EndoFree Plasmid MaxiKit kit (Qiagen, USA) according to the manufacturer's protocol.
Полученную экспрессионную плазмиду pCMV6-Entry-CHOVKORC1, содержащую ОРС гена VKORC 1 клеток китайского хомячка DG44, использовали для получения стабильно трансфицированных поликлональных линий клеток СНО.The obtained expression plasmid pCMV6-Entry-CHOVKORC1 containing the
Пример 3. Получение экспрессионной плазмидной ДНК pCMV6-Entry-hVKORC1.Example 3. Obtaining expression plasmid DNA pCMV6-Entry-hVKORC1.
При помощи праймеров AD-hVKO-BglF и AD-hVKO-AsiGR (SEQ ID NO:16-17) и Origene clone SC 112318 (Origene, США), соответствующему кДНК VKORC 1 человека (GenBank ID NM_024006.4), в качестве матрицы получили ПЦР-продукт, содержащий ОРС VKORC 1 человека человека с добавленными рестриктными сайтами для субклонирования. Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор PAL-TA как описано в примере 1, с образованием pAL-hVKORC1-AB, анализировали методом ПЦР с клонов и секвенированием области вставки, используя праймеры SP6 и T7prom (SEQ ID NO:11-12).Using primers AD-hVKO-BglF and AD-hVKO-AsiGR (SEQ ID NO: 16-17) and Origene clone SC 112318 (Origene, USA) corresponding to human VKORC cDNA 1 (GenBank ID NM_024006.4), as a template Got a PCR product containing
Плазмиду pAL-h VKORC 1-АВ с подтвержденной первичной нуклеотидной последовательностью рестрицировали BglII и AsiGI (Agel) и переносили фрагмент, содержащий ОРС, в вектор pCMV6-Entry (Кат №PS 100001 Origene, США Фиг.4), рестрицированный BglII-XmaI, с образованием pCMV6-Entry-hVKORCl (Фиг.6, SEQ ID NO:18). Для этого продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли с помощью набора реактивов Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System по методике производителя. Лигирование очищенных фрагментов и трансформацию лигатами клеток Е. coli штамма DH5α вели как описано в примере 1. Трансформантов высевали на агаризованную среду с канамицином (30 мкг/1 мл агара). Е. coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров AD-hVKO-BglFn AD-hVKO-AsiGR (SEQ ID NO:16-17). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, проводили выделение плазмидной ДНК набором «Wizard Plus SV Minipreps». Нуклеотидную последовательность верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-hVKO-BglFn AD-hVKO-AsiGR (SEQ ID NO:16-17).Plasmid pAL-h VKORC 1-AB with a confirmed primary nucleotide sequence was restricted with BglII and AsiGI (Agel) and the fragment containing OPC was transferred to pCMV6-Entry vector (Cat No. PS 100001 Origene, USA Figure 4), restricted with BglII-XmaI, with the formation of pCMV6-Entry-hVKORCl (Fig.6, SEQ ID NO: 18). For this, the restriction products were separated on a 1% agarose gel and isolated using the Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System reagent kit according to the manufacturer's procedure. Ligation of purified fragments and transformation of E. coli strain DH5α by ligates was carried out as described in Example 1. Transformants were plated on agar medium with kanamycin (30 μg / 1 ml agar). E. coli was analyzed by PCR from clones from the primers AD-hVKO-BglFn AD-hVKO-AsiGR (SEQ ID NO: 16-17). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan nutrient broth, plasmid DNA was isolated using the Wizard Plus SV Minipreps kit. The nucleotide sequence was verified by PCR sequencing from the primers AD-hVKO-BglFn AD-hVKO-AsiGR (SEQ ID NO: 16-17).
Плазмидную ДНК pCMV6-Entry-hVKORC1 (SEQ ID N0:18) для трансфекции нарабатывали в клетках E. coli (штамм Stbl4, #11635018 «Invitrogen»). Клетки культивировали в 0.5 л среды ТВ-Кап (30 мкг/мл) в течение 18 ч, и выделяли плазмиды набором EndoFree Plasmid MaxiKit («Qiagen», США) по протоколу производителя.Plasmid DNA pCMV6-Entry-hVKORC1 (SEQ ID N0: 18) for transfection was obtained in E. coli cells (Stbl4 strain, # 11635018 "Invitrogen"). Cells were cultured in 0.5 L of TV-Cap medium (30 μg / ml) for 18 h, and plasmids were isolated using the EndoFree Plasmid MaxiKit kit (Qiagen, USA) according to the manufacturer's protocol.
Полученную экспрессионную плазмиду pCMV6-Entry-hVKORC1, содержащую ОРС гена VKORC 1 человека, использовали для получения стабильно трансфицированных поликлональных линий клеток СНО.The obtained expression plasmid pCMV6-Entry-hVKORC1 containing the OPC of the
Пример 4. Получение стабильно трансфицированных экспрессионными плазмидами pCMV6-Entry-CHOVKORC1 и pCMV6-Entry-hVKORC1 поликлональных линий клеток СНО.Example 4. Obtaining stably transfected with expression plasmids pCMV6-Entry-CHOVKORC1 and pCMV6-Entry-hVKORC1 polyclonal CHO cell lines.
Клетки эпителия яичника китайского хомячка (СНО), линия DG-44 (Invitrogen, США), были трансфицированы очищенными суперскрученными плазмидами pCMV6-Entry-CHOVKORCl (SEQ ID N0:15), pCMV6-Entry-hVKORC1 (SEQ ID NO:18) и pEGFP-N2 (Clontech Кат. №6081-1, последовательность в GenBank U57608); плазмиду pEGFP-N2, кодирующую зеленый флюоресцентный белок, использовали в качестве отрицательного контроля. Был использован трансфекционный реагент FugeneHD (Promega, США) и соотношение 15 млн клеток/60 мкг ДНК/180 мкл FugeneHD/30 мл культивационного объема. Смесь ДНК и трансфекционного реагента готовили по инструкции производителя трансфекционного реагента и добавляли в суспензионную культуру клеток в указанном выше соотношении, одинаковом для обеих плазмид. Через 48 часов культивации трансфицированных клеток в перемешиваемых колбах культуральную среду заменили на селективную среду, содержавшую 750 мкг/мл антибиотика G418 (Sigma-Aldrich, США) и меняли ее в дальнейшем каждые 3 дня центрифугированием/ресуспендированием осадка клеток. При достижении культурами плотности 1,2 млн кл./мл и доле жизнеспособных клеток более 70% считали культуры установившимися, снижали концентрацию G418 до 250 мкг/мл и проводили отбор образцов клеточной массы для анализа.Chinese Hamster Ovary Epithelial Cells (CHO), line DG-44 (Invitrogen, USA), were transfected with purified supercoiled plasmids pCMV6-Entry-CHOVKORCl (SEQ ID N0: 15), pCMV6-Entry-hVKORC1 (SEQ ID NO: 18) and pEGFP-N2 (Clontech Cat. No. 6081-1, sequence in GenBank U57608); plasmid pEGFP-N2 encoding a green fluorescent protein was used as a negative control. FugeneHD transfection reagent (Promega, USA) and a ratio of 15 million cells / 60 μg DNA / 180 μl FugeneHD / 30 ml cultivation volume were used. A mixture of DNA and transfection reagent was prepared according to the instructions of the manufacturer of the transfection reagent and added to the cell suspension culture in the above ratio, the same for both plasmids. After 48 hours of cultivation of the transfected cells in the stirred flasks, the culture medium was replaced with a selective medium containing 750 μg / ml G418 antibiotic (Sigma-Aldrich, USA) and subsequently changed it every 3 days by centrifugation / resuspension of the cell pellet. When the cultures reached a density of 1.2 million cells / ml and the percentage of viable cells was more than 70%, the cultures were considered established, the concentration of G418 was reduced to 250 μg / ml, and cell mass samples were taken for analysis.
Пример 5. Определение удельной активности вариантов VKORC1 китайского хомяка и человека, находящихся под контролем промотора CMV.Example 5. Determination of the specific activity of VKORC1 variants of a Chinese hamster and a person under the control of the CMV promoter.
Измерение активности проводили по модифицированной методике [Rost S, Fregin A, Ivaskevicius V, Conzelmann E, Hortnagel К, Pelz HJ, Lappegard К, Seifried E, Scharrer I, Tuddenham EG, Muller CR, Strom TM, Oldenburg J. Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type 2. Nature. 2004 Feb 5; 427(6974):537-4L].The activity was measured according to the modified method [Rost S, Fregin A, Ivaskevicius V, Conzelmann E, Hortnagel K, Pelz HJ, Lappegard K, Seifried E, Scharrer I, Tuddenham EG, Muller CR, Strom TM, Oldenburg J. Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation
2,3-эпоксид витамина K1 синтезировали из хинона витамина K1 (Sigma Aldrich, США) окислением перекисью водорода и очищали согласно [Max Tishler, Louis F. Fieser, and Norman L. Wendler. Hydro, Oxido and Other Derivatives of Vitamin K1 and Related Compounds. Journal of the American Chemical Society 1940 62 (10), 2866-2871].
Для измерения активности готовили раствор для лизиса клеток состава 25 мМ имидазола рН=7.6, 0.5% CHAPS, 50% глицерина, 5 мМ бензамидина и раствор для проведения ферментативной реакции состава: 25 мМ имидазола рН=7.6, 0.5% CHAPS, 5 мМ CaCl2, 5 мМ DTT, 8 мкМ 2,3-эпоксида витамина K1. Проводили лизис образцов, содержащих по 5 млн клеток, в объеме 500 мкл раствора для лизиса на 1 пробирку, ресуспендировали клетки до исчезновения видимых глазом частиц, инкубировали 30 мин на льду и разрушали клетки при помощи гомогенизатора Даунса. Лизат осветляли центрифугированием 2 мин на 4 тыс. об/мин, отбирали по 10 мкл супернатанта для измерения содержания общего белка по Брэдфорд, в качестве стандарта концентрации белка использовали раствор бычьего сывороточного альбумина. Готовили серию двукратных разведений полученного осветленного лизата в растворе для лизиса и отрицательный контроль - пробирку с 30 мкл раствора для лизиса. В пробирки с разведениями лизата вносили по 500 мкл полного раствора для проведения ферментативной реакции, перемешивали, инкубировали 1 ч в термоблоке при температуре 30°С. После этого вели экстракцию, внося по 660 мкл раствора для экстракции состава изопропанол:гексан (3:2). Из верхней фазы отбирали по 450 мкл в новые пробирки, экстракт полностью выпаривали в вакуумной центрифуге при комнатной температуре, вносили в пробирки по 30 мкл метанола, перемешивали на вортексе и разделяли формы витамина K1 при помощи обращенно-фазовой хроматографии. Использовали колонку Symmetry С 18 75×4.6 mm (Waters, США), метанол в качестве подвижной фазы, скорость потока 1 мл/мин, длина волны детекции - 254 нм, температура колонки - 30°С, объем инъекции - 20 мкл. Для калибровки хроматографической системы и в качестве стандарта количества вещества использовали растворы 2,3-эпоксида и хинона витамина K1 в метаноле. Результаты представлены в таблице 1.To measure activity, a solution was prepared for lysis of cells with a composition of 25 mM imidazole pH = 7.6, 0.5% CHAPS, 50% glycerol, 5 mM benzamidine and a solution for the enzymatic reaction of the composition: 25 mM imidazole pH = 7.6, 0.5% CHAPS, 5
Выводы: при использовании плазмид с промотором CMV ферментативная активность VKORC1 в стабильно трансфицированных клетках практически не изменяется как для VKORC1 человека, так и для VKORC1 китайского хомячка.Conclusions: when using plasmids with the CMV promoter, the enzymatic activity of VKORC1 in stably transfected cells remains practically unchanged for both human VKORC1 and VKORC1 Chinese hamster.
Пример 6. Получение экспрессионных плазмидных ДНК p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и p1.2-Zeo-hVKORC1.Example 6. Obtaining expression plasmid DNA p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 and p1.2-Zeo-hVKORC1.
При помощи адапторных праймеров AD-CVKO-AbsIF и AD-CVKO-NheIR (SEQ ID NO:19-20) и pAL-СНО VKORC1 в качестве матрицы получили ПЦР-продукт, содержащий ОРС VKORC1 китайского хомячка с добавленными рестриктными сайтами для субклонирования. Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор PAL-TA как описано в примере 1 с образованием pAL-CHOVKORC1-AN, анализировали методом ПЦР с клонов и секвенированием области вставки, используя праймеры SP6 и T7prom (SEQ ID N0:11-12).Using adapter primers AD-CVKO-AbsIF and AD-CVKO-NheIR (SEQ ID NO: 19-20) and pAL-СНО VKORC1, a PCR product containing Chinese hamster OPC VKORC1 with added restriction sites for subcloning was obtained as a template. The resulting PCR product was cloned into the PAL-TA vector as described in Example 1 to form pAL-CHOVKORC1-AN, analyzed by clone PCR and sequencing of the insertion region using primers SP6 and T7prom (SEQ ID N0: 11-12).
Полученную плазмиду pAL-CHOVKORC1-AN с подтвержденной первичной нуклеотидной последовательностью рестрицировали AbsI и NheI переносили фрагмент, содержащий ОРС в вектор p1.2Zeo (OOO "ЛМБТ", заявка на патент RU2013122048, Фиг.8), рестрицированный AbsI и NheI, с образованием p1.2Zeo-CHOVKORC1 (Фиг.1, SEQ ID NO:5). Для этого продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли набором «Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System». Реакцию лигирования очищенных фрагментов и трансформацию лигатами клеток Е. coli штамма DH5α вели как описано в примере 1. Бактерии после трансформации высевали на агаризованную среду с карбеницилином (50 мкг/1 мл агара). Е. coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров AD-CVKO-AbsIF и AD-CVKO-NheIR (SEQ ID NO:19-20). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Carb (50 мкг/мл), проводили выделение плазмидной ДНК набором «Wizard Plus SV Minipreps». Нуклеотидную последовательность верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-CVKO-AbsIF и AD-CVKO-NheIR (SEQ ID NO:19-20).The resulting plasmid pAL-CHOVKORC1-AN with a confirmed primary nucleotide sequence was restricted with AbsI and NheI transferred the fragment containing OPC into p1.2Zeo vector (LMBT LLC, patent application RU2013122048, Fig. 8), restricted with AbsI and NheI, with the formation of p1 .2Zeo-CHOVKORC1 (Figure 1, SEQ ID NO: 5). For this, restriction products were separated on a 1% agarose gel and isolated using the Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System kit. The ligation reaction of the purified fragments and the transformation of E. coli strain DH5α by ligates was carried out as described in Example 1. After transformation, the bacteria were plated on an agar medium with carbenicillin (50 μg / 1 ml agar). E. coli was analyzed by PCR from clones from the primers AD-CVKO-AbsIF and AD-CVKO-NheIR (SEQ ID NO: 19-20). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Carb nutrient broth (50 μg / ml), plasmid DNA was isolated using the Wizard Plus SV Minipreps kit. The nucleotide sequence was verified by PCR sequencing from the primers AD-CVKO-AbsIF and AD-CVKO-NheIR (SEQ ID NO: 19-20).
При помощи праймеров AD-hVKO-AbsIF и AD-hVKO-NheIR (SEQ ID NO:21-22) и плазмиды Origene clone SC 112318 (Origene, США), кодирующей кДНК VKORC1 человека (GenBank ID NM_024006.4) в качестве матрицы получили ПЦР-продукт, содержащий ОРС VKORC1 человека с рестриктными сайтами для субклонирования. Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор PAL-TA как описано в примере 1, с образованием pAL-hVKORC1-AN, анализировали методом ПЦР с клонов и секвенированием области вставки, используя праймеры SP6 и T7prom (SEQ ID NO:11-12).Using primers AD-hVKO-AbsIF and AD-hVKO-NheIR (SEQ ID NO: 21-22) and plasmid Origene clone SC 112318 (Origene, USA) encoding human VKORC1 cDNA (GenBank ID NM_024006.4), the template was obtained PCR product containing human OPCOR VKORC1 with restriction sites for subcloning. The resulting PCR product was cloned into the PAL-TA vector as described in Example 1 to form pAL-hVKORC1-AN, analyzed by clone PCR and sequencing of the insertion region using primers SP6 and T7prom (SEQ ID NO: 11-12).
Плазмиду pAL-hVKORC1-AN с подтвержденной первичной нуклеотидной последовательностью рестрицировали AbsI и NheI, переносили фрагмент, содержащий ОРС в вектор pl.2Zeo (ЛМБТ, заявка на патент RU2013122048, Фиг.8), рестрицированный AbsI и NheI, с образованием p1.2Zeo-hVKORC1 (Фиг.2, SEQ ID NO:6). Для этого продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле, выделяли набором «Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System». Реакцию лигирования очищенных фрагментов и трансформацию лигатами клеток Е. coli штамма DH5a. вели, как описано в примере 1. Бактерии после трансформации высевали на агаризованную среду с канамицином (30 мкг/1 мл агара). Е. coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров AD-hVKO-AbsIF и AD-hVKO-NheIR (SEQ Ю N0:21-22). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, проводили выделение плазмидной ДНК набором «Wizard Plus SV Minipreps». Нуклеотидную последовательность верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-hVKO-AbsIF и AD-hVKO-NheIR (SEQ ID NO:21-22).Plasmid pAL-hVKORC1-AN with a confirmed primary nucleotide sequence was digested with AbsI and NheI, the fragment containing OPC was transferred to the vector pl.2Zeo (LBMT, patent application RU2013122048, Fig. 8), restricted with AbsI and NheI, with the formation of p1.2Zeo- hVKORC1 (Figure 2, SEQ ID NO: 6). For this, restriction products were separated on a 1% agarose gel, isolated using the Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System kit. The ligation reaction of purified fragments and transformation of E. coli strain DH5a by ligates. were conducted as described in example 1. Bacteria after transformation were plated on agar medium with kanamycin (30 μg / 1 ml agar). E. coli was analyzed by PCR from clones from the primers AD-hVKO-AbsIF and AD-hVKO-NheIR (SEQ U N0: 21-22). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan nutrient broth, plasmid DNA was isolated using the Wizard Plus SV Minipreps kit. The nucleotide sequence was verified by PCR sequencing from the primers AD-hVKO-AbsIF and AD-hVKO-NheIR (SEQ ID NO: 21-22).
Плазмидные ДНК p1.2Zeo-CHOVKORC1 и p1.2Zeo-hVKORC1 для трансфекции нарабатывали в клетках E. coli (штамм Stbl4, #11635018 «Invitrogen»). Клетки культивировали в 0.5 л среды TB-Carb (50 мкг/ мл) в течение 18 ч, и выделяли плазмиды с использованием набора EndoFree Plasmid MaxiKit («Qiagen», США) по протоколу производителя.Plasmid DNAs p1.2Zeo-CHOVKORC1 and p1.2Zeo-hVKORC1 for transfection were obtained in E. coli cells (Stbl4 strain, # 11635018 "Invitrogen"). Cells were cultured in 0.5 L of TB-Carb medium (50 μg / ml) for 18 h, and plasmids were isolated using the EndoFree Plasmid MaxiKit kit (Qiagen, USA) according to the manufacturer's protocol.
Полученные экспрессионные плазмиды p1.2Zeo-CHOVKORC1 (SEQ ID NO:5) и p1.2Zeo-hVKORCl (SEQ ID NO:6), содержащие соответственно ОРС гена VKORC1 китайского хомячка DG44 и ОРС гена VKORC1 человека, использовали для получения стабильно трансфицированных поликлональных популяций клеток СНО DG-44.The resulting expression plasmids p1.2Zeo-CHOVKORC1 (SEQ ID NO: 5) and p1.2Zeo-hVKORCl (SEQ ID NO: 6), respectively containing the OPC gene of the Chinese hamster DG44 DOC44 and the OPC gene VKORC1, were used to obtain stably transfected polyclonal populations CHO DG-44 cells.
Пример 7. Получение стабильно трансфицированных экспрессионными плазмидами р1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и p1.2-Zeo-hVKORC1 поликлональных популяций клеток СНО DG-44, измерение активности VKORC1.Example 7. Obtaining stably transfected with expression plasmids p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 and p1.2-Zeo-hVKORC1 polyclonal populations of CHO cells DG-44, measurement of VKORC1 activity.
Трансфекцию клеток линии СНО DG-44 очищенными плазмидами p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и p1.2-Zeo-hVKORC1, кодирующими VKORC1 китайского хомячка и человека, соответственно, проводили, как указано в Примере 4. Получали стабильно трансфицированные культуры при помощи культивации в присутствии 400 мкг/мл антибиотика зеоцин до восстановления жизнеспособности клеток выше 85%. Измерение активности VKORC1 в лизате клеток проводили, как указано в Примере 5, с изменениями - выравнивали концентрацию общего белка в лизатах перед добавлением субстрата реакции и использовали несколько двукратных разведений лизата исследуемых клеток в буферном растворе для лизиса. Реакцию вели 3 ч, отбирали пробы с интервалом 30 мин. Результаты измерения активности VKORC1 при времени реакции 3 ч приведены в Таблице 2, зависимости скоростей восстановления эпоксида витамина K1 (VK1>0) от концентрации лизатов и времени реакции приведены на Фиг.9. Максимальную скорость VKORC1 китайского хомячка и человека оценивали, проводя реакцию восстановления VK1>0 с максимальными концентрациями лизатов клеток, результаты приведены на Фиг.10.Transfection of CHO DG-44 cells with purified plasmids p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 and p1.2-Zeo-hVKORC1 encoding the Chinese hamster and human VKORC1, respectively, was carried out as described in Example 4. Stably transfected cultures were obtained using cultivation in the presence of 400 μg / ml of the antibiotic zeocin to restore cell viability above 85%. Measurement of VKORC1 activity in the cell lysate was carried out, as described in Example 5, with changes — the concentration of total protein in the lysates was equalized before the addition of the reaction substrate and several double dilutions of the studied cells in the lysis buffer solution were used. The reaction was carried out for 3 hours; samples were taken at intervals of 30 minutes. The results of measuring VKORC1 activity at a reaction time of 3 hours are shown in Table 2, the dependences of the rates of recovery of vitamin K1 epoxide (VK1> 0) on the concentration of lysates and reaction time are shown in Fig. 9. The maximum rate of VKORC1 of a Chinese hamster and a human was evaluated by conducting a VK1> 0 recovery reaction with maximum cell lysate concentrations, the results are shown in FIG. 10.
Выводы: Уровень ферментативной активности VKORC1 может быть повышен в 24 раза при оверэкспрессии аутологичного VKORC1 китайского хомячка и только в 8 раз при оверэкспрессии VKORC1 человека. Оба ортолога VKORC1 практически не подвержены термоинактивации или протеолитическому распаду в течение 3-х часов. Скорость восстановления VK1>0 линейно зависит от концентрации обоих ферментов в выбранном диапазоне концентраций общего белка в лизатах. Максимальная скорость реакции, развиваемая в присутствии избытка VKORC1 китайского хомячка приблизительно вдвое выше максимальной скорости реакции, катализируемой избытком VKORC1 человека.Conclusions: The level of enzymatic activity of VKORC1 can be increased 24 times with the overexpression of an autologous VKORC1 Chinese hamster and only 8 times with the overexpression of human VKORC1. Both VKORC1 orthologs are practically not susceptible to thermal inactivation or proteolytic degradation within 3 hours. The recovery rate of VK1> 0 linearly depends on the concentration of both enzymes in the selected range of total protein concentrations in lysates. The maximum reaction rate developed in the presence of an excess of VKORC1 of a Chinese hamster is approximately twice as high as the maximum reaction rate catalyzed by an excess of VKORC1 of a person.
Пример 8. Измерение числа копий экспрессионных плазмид p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и р1.2-Zeo-hVKORC1, введенных в геном клеток и уровней мРНК VKORC1 китайского хомячка и человека в трансфицированных клетках.Example 8. Measurement of the number of copies of expression plasmids p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 and p1.2-Zeo-hVKORC1 introduced into the cell genome and levels of VKORC1 mRNA of a Chinese hamster and a human in transfected cells.
Количественный анализ копийности экспрессионной кассеты в геноме и уровня мРНК проводили методом ПНР в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием амплификатора iCycler iQ (Bio-Rad, США). Для ПЦР использовали готовую 5х реакционную смесь с горячим стартом, содержащую интеркалирующий краситель SYBR Green I, qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия). Каждую реакцию повторяли 3 раза в объеме 25 мкл, в 3-5 повторах.Quantitative analysis of the copy number of the expression cassette in the genome and the mRNA level was carried out by real-time PNR (PCR-RV) using the iCycler iQ amplifier (Bio-Rad, USA). For PCR, a ready-made 5-step hot-start reaction mixture containing intercalating dye SYBR Green I, qPCRmix-HS SYBR (Eurogen, Russia) was used. Each reaction was repeated 3 times in a volume of 25 μl, in 3-5 repetitions.
Геномную ДНК выделяли из 0,5-5 млн клеток набором «Wizard SV Genomic DNA Purification System» (Promega, США) по инструкции производителя. Суммарную РНК выделяли из 0,5-5 млн клеток набором «RNeasy Mini Kit» (Qiagen, США) по инструкции производителя. Для приготовления образцов кДНК использовали по 1 мкг суммарной РНК и набор реактивов «Mint» (Евроген, Россия).Genomic DNA was isolated from 0.5-5 million cells using the Wizard SV Genomic DNA Purification System kit (Promega, USA) according to the manufacturer's instructions. Total RNA was isolated from 0.5-5 million cells using the RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) according to the manufacturer's instructions. To prepare cDNA samples, we used 1 μg of total RNA and a set of Mint reagents (Eurogen, Russia).
Для определения копийности экспрессионной кассеты в геноме в качестве матрицы использовали геномную ДНК и олигонуклеотидные праймеры, не гомологичные геномным последовательностям китайского хомячка. Для VKORC1 СНО использовали праймеры к С-концевой области ОРС VKORC1 СНО и нетранслируемой области экспрессионной плазмиды р1.2-Zeo-CHO-VKORC1 - RT-cVKOspC-F и RT-cVKOspC-R (SEQ ID NO:23-24). Для VKORC1 человека использовали уникальные праймеры к гену человека - RT-hVKOR-f RT-hVKOR-r (SEQ ID NO:25-26).To determine the copy number of the expression cassette in the genome, genomic DNA and oligonucleotide primers not homologous to the Chinese hamster genomic sequences were used as templates. For VKORC1 CHO, primers were used for the C-terminal region of the OPC VKORC1 CHO and the untranslated region of the expression plasmid p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 — RT-cVKOspC-F and RT-cVKOspC-R (SEQ ID NO: 23-24). For human VKORC1, unique primers for the human gene, RT-hVKOR-f RT-hVKOR-r (SEQ ID NO: 25-26), were used.
Для определения уровня экспрессии мРНК генов VKORC1 в качестве матрицы использовали кДНК и уникальные олигонуклеотидные праймеры, не гомологичные последовательностям китайского хомячка.To determine the level of mRNA expression of the VKORC1 genes, cDNA and unique oligonucleotide primers not homologous to the sequences of the Chinese hamster were used as matrices.
Для VKORC1 СНО использовали праймеры RT-cVKOspN-F и RT-cVKOspN-R (SEQ ID NO:27-28), комплементарные участкам двух соседних экзонов искусственного гена, кодируемого плазмидой p1.2-Zeo-CHO-VKORC1. Таким образом, короткий продукт ПЦР мог образовываться только с кДНК-матрицы p1.2-Zeo-CHO-VKORC1, но не с геномных копий p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 или природного гена VKORC1 или природной кДНК VKORC1.For VKORC1 CHO, RT-cVKOspN-F and RT-cVKOspN-R primers (SEQ ID NO: 27-28), complementary to regions of two adjacent exons of the artificial gene encoded by p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 plasmid, were used. Thus, a short PCR product could be formed only from the p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 cDNA template, but not from the p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 genomic copies or the natural VKORC1 gene or the natural VKORC1 cDNA.
Для VKORC1 человека использовали пару праймеров RT-hVKOR-f RT-hVKOR-r (SEQ ID NO:25-26), специфичных к последовательности гена человека, кодируемой плазмидой p1.2-Zeo-hVKORC1.For human VKORC1, a pair of RT-hVKOR-f RT-hVKOR-r primers (SEQ ID NO: 25-26) specific for the human gene sequence encoded by p1.2-Zeo-hVKORC1 plasmid was used.
Для анализа геномной ДНК клеток обеих линий использовали пару праймеров к гену устойчивости к зеоцину - RT-Zeo-F и RT-Zeo-R (SEQ ID NO:29-30).For analysis of the genomic DNA of cells of both lines, a pair of primers for the zeocin resistance gene, RT-Zeo-F and RT-Zeo-R (SEQ ID NO: 29-30), was used.
Для амплификации опорных генов, в случае ПЦР с геномной ДНК, использовали праймеры к области гена пептидил-пролил изомеразы В (циклофилина В), предположительно уникальной для генома СНО, RT-PPIB-F и RT-PPIB-R (SEQ ID NO:31-32), а в случае ПЦР с кДНК использовали праймеры к бета-актину СНО - RT-bACT-F и RT-bACT-R (SEQ ID NO:33-34).For amplification of the reference genes, in the case of PCR with genomic DNA, primers were used for the peptidyl-prolyl isomerase B gene region (cyclophilin B), presumably unique to the CHO genome, RT-PPIB-F and RT-PPIB-R (SEQ ID NO: 31 -32), and in the case of PCR with cDNA, beta-actin CHO primers RT-bACT-F and RT-bACT-R were used (SEQ ID NO: 33-34).
Копийность экспрессионной кассеты определяли из калибровочной кривой, построенной для серийных разведений экспрессионных плазмид p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 для VKORC1 китайского хомячка и p1.2-Zeo-hVKORC1 для VKORC1 человека. Результаты ПЦР сравнивали с результатами для контрольного ампликона, представленного в геноме клеток СНО только один раз по поисковой выдаче алгоритма BLAST из базы данных NCBI Nucleotide Collection. При анализе уровней экспрессии мРНК было установлено, что эффективность ПЦР составляет не менее 99% для всех использованных пар праймеров, вычисление относительных концентраций мРНК проводили по формуле C=2^(-CT), где СТ - пороговый цикл амплификации.The copy cassette copyiness was determined from a calibration curve constructed for serial dilutions of expression plasmids p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 for VKORC1 Chinese hamster and p1.2-Zeo-hVKORC1 for human VKORC1. PCR results were compared with the results for the control amplicon presented in the genome of CHO cells only once by searching for BLAST algorithm from the NCBI Nucleotide Collection database. When analyzing mRNA expression levels, it was found that the PCR efficiency is at least 99% for all primer pairs used, and the relative mRNA concentrations were calculated using the formula C = 2 ^ (-CT), where CT is the threshold amplification cycle.
Выводы: Для обеих плазмид p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и p1.2-Zeo-hVKORC1 число копий экспрессионных кассет в геноме клеток составляет около 6 и не различается при амплификации областей ОРС VKORC1 и ОРС гена устойчивости к зеоцину (фиг.11). Уровень мРНК VKORC1 человека и китайского хомячка различается не более, чем в 1,33 раза (фиг.12). Таким образом, повышенная ферментативная активность оверэкспрессированного VKORC1 китайского хомячка определяется собственными свойствами фермента, а не большей эффективностью трансфекции или лучшим уровнем транскрипции искусственного гена.Conclusions: For both plasmids p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 and p1.2-Zeo-hVKORC1, the number of copies of expression cassettes in the cell genome is about 6 and does not differ upon amplification of the OPC regions of VKORC1 and the OPC of the zeocin resistance gene (Fig. 11 ) The human and Chinese hamster VKORC1 mRNA levels differ no more than 1.33 times (Fig. 12). Thus, the increased enzymatic activity of the over-expressed Chinese hamster VKORC1 is determined by the intrinsic properties of the enzyme, and not by a greater transfection efficiency or a better level of transcription of the artificial gene.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to Examples, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.
Список последовательностей приведен в графической части.The list of sequences is given in the graphic part.
Claims (12)
- область начала репликации плазмиды pUC;
- открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину;
- прокариотический промотор гена bla;
- участок терминального повтора вируса Эпштейна-Барр человека;
- функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 5′ нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген;
- область, кодирующая последовательность Козак для кэп-зависимой инициации трансляции;
- ОРС гена субъединицы 1 комплекса 2,3-эпоксиредуктазы витамина К (VKORC1) китайского хомячка со стоп-кодоном;
- функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 3′ нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген;
- промотор ранних генов вируса SV40;
- ген устойчивости к селекционному агенту; и
- сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40.1. Plasmid for expression in a Chinese hamster cell, in the following sequence, essentially containing the following elements:
- region of the beginning of replication of the plasmid pUC;
- an open reading frame of beta-lactamase, which provides resistance to ampicillin;
- prokaryotic promoter of the bla gene;
- plot of the terminal repeat of the Epstein-Barr virus of a person;
- functional promoter of the gene for the elongation factor 1 alpha of the Chinese hamster, 5 ′ untranslated region of this gene and untranscribed region flanking this gene;
- the region encoding the Kozak sequence for cap-dependent translation initiation;
- ORS of the gene subunit 1 complex of 2,3-epoxy reductase vitamin K (VKORC1) Chinese hamster with a stop codon;
- functional terminator and signal for polyadenylation of the gene for the elongation factor 1 alpha of the Chinese hamster, 3 ′ untranslated region of this gene and untranscribed region flanking this gene;
- promoter of the early genes of the SV40 virus;
- gene of resistance to a selection agent; and
- polyadenylation signal and terminator of the SV40 virus.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013131441/10A RU2535871C1 (en) | 2013-07-10 | 2013-07-10 | PLASMID FOR EXPRESSION IN CELL OF CHINESE HAMSTER, CELL OF CHINESE HAMSTER - PROTEIN PRODUCER WITH Gla-DOMAIN, AND METHOD FOR OBTAINING PROTEIN WITH Gla-DOMAIN |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013131441/10A RU2535871C1 (en) | 2013-07-10 | 2013-07-10 | PLASMID FOR EXPRESSION IN CELL OF CHINESE HAMSTER, CELL OF CHINESE HAMSTER - PROTEIN PRODUCER WITH Gla-DOMAIN, AND METHOD FOR OBTAINING PROTEIN WITH Gla-DOMAIN |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2535871C1 true RU2535871C1 (en) | 2014-12-20 |
Family
ID=53286161
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013131441/10A RU2535871C1 (en) | 2013-07-10 | 2013-07-10 | PLASMID FOR EXPRESSION IN CELL OF CHINESE HAMSTER, CELL OF CHINESE HAMSTER - PROTEIN PRODUCER WITH Gla-DOMAIN, AND METHOD FOR OBTAINING PROTEIN WITH Gla-DOMAIN |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2535871C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720934C2 (en) * | 2015-10-07 | 2020-05-14 | Бионтэк Рна Фармасьютикалз Гмбх | Sequence 3'-utr for rna stabilization |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2004136574A (en) * | 1997-05-01 | 2006-05-27 | Айкос Корпорейшен (Us) | TRANSCRIPTION REGULATORY DNA OF EF-1 HAMSTER GENE |
| WO2006063292A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Icos Corporation | Recombinant method for making multimeric proteins |
| WO2006067116A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-29 | Novo Nordisk Health Care Ag | Expression of gamma-carboxylated polypeptides in gamma-carboxylation deficient host systems |
| US20060194284A1 (en) * | 2005-02-28 | 2006-08-31 | Baxter International Inc. | Recombinant co-expression of vitamin K epoxide reductase subunit 1 to improve vitamin K dependent protein expression |
-
2013
- 2013-07-10 RU RU2013131441/10A patent/RU2535871C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2004136574A (en) * | 1997-05-01 | 2006-05-27 | Айкос Корпорейшен (Us) | TRANSCRIPTION REGULATORY DNA OF EF-1 HAMSTER GENE |
| WO2006063292A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Icos Corporation | Recombinant method for making multimeric proteins |
| WO2006067116A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-29 | Novo Nordisk Health Care Ag | Expression of gamma-carboxylated polypeptides in gamma-carboxylation deficient host systems |
| US20060194284A1 (en) * | 2005-02-28 | 2006-08-31 | Baxter International Inc. | Recombinant co-expression of vitamin K epoxide reductase subunit 1 to improve vitamin K dependent protein expression |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| XU X. et al., The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line, Nature Biotechnology, v.29, n.8, p. 735-741. GenBank N * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720934C2 (en) * | 2015-10-07 | 2020-05-14 | Бионтэк Рна Фармасьютикалз Гмбх | Sequence 3'-utr for rna stabilization |
| US11492628B2 (en) | 2015-10-07 | 2022-11-08 | BioNTech SE | 3′-UTR sequences for stabilization of RNA |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2006234788B2 (en) | A host cell comprising a vector for production of proteins requiring gamma-carboxylation | |
| KR20150014941A (en) | Microorganisms and processes for the production of isoprene | |
| AU2008205445A1 (en) | Method for producing gamma-carboxlated proteins | |
| KR20070110106A (en) | Recombinant co-expression of vitamin k epoxide reductase subunit 1 to improve vitamin k dependent protein expression | |
| Kovnir et al. | A highly productive CHO cell line secreting human blood clotting factor IX | |
| Cardillo et al. | Production of tropane alkaloids by biotransformation using recombinant Escherichia coli whole cells | |
| KR100983878B1 (en) | Process for Producing Human Thrombin by Gene Modification Technique | |
| RU2535871C1 (en) | PLASMID FOR EXPRESSION IN CELL OF CHINESE HAMSTER, CELL OF CHINESE HAMSTER - PROTEIN PRODUCER WITH Gla-DOMAIN, AND METHOD FOR OBTAINING PROTEIN WITH Gla-DOMAIN | |
| RU2585532C2 (en) | Plasmid for expression of human recombinant blood clotting factor ix, cho cell producing human recombinant blood clotting factor ix and method of producing said factor | |
| KR20190095429A (en) | Glutathione reductase | |
| Guarna et al. | Effect of cDNA copy number on secretion rate of activated protein C | |
| JPWO2005080572A1 (en) | Triterpene hydroxylase | |
| US20160215278A1 (en) | Method for mass production of factor vii/viia derivatives | |
| JP2022514083A (en) | How to reduce misuptake of non-canonical branched chain amino acids | |
| CN104293737B (en) | A kind of host cell comprising expressive function recombinant human blood coagulation factors VII carrier and its high level expression method | |
| US11781107B2 (en) | Microorganisms engineered for muconate production | |
| JP2006280368A (en) | Method for producing organic acid | |
| US8013137B2 (en) | Modified enteropeptidase protein | |
| Da Silva Lameira | Structural insights, biochemical characterization and physiological role of pyruvate: quinone oxidoreductase in Corynebacterium glutamicum | |
| AU2008202376B2 (en) | Process for producing human thrombin by gene modification technique | |
| WO2016198499A1 (en) | IMPROVED METHOD FOR PRODUCTION OF γ-CARBOXYLATED POLYPEPTIDES | |
| GB2498705A (en) | Recombinant Alternative Oxidase |