RU2522801C2 - Method for detecting transcription level of gene coding human chemokine ccl2 (mcp-1) and kit for implementing it - Google Patents

Method for detecting transcription level of gene coding human chemokine ccl2 (mcp-1) and kit for implementing it Download PDF

Info

Publication number
RU2522801C2
RU2522801C2 RU2012141458/10A RU2012141458A RU2522801C2 RU 2522801 C2 RU2522801 C2 RU 2522801C2 RU 2012141458/10 A RU2012141458/10 A RU 2012141458/10A RU 2012141458 A RU2012141458 A RU 2012141458A RU 2522801 C2 RU2522801 C2 RU 2522801C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cdna
mcp1
rpl32
amplification
genes
Prior art date
Application number
RU2012141458/10A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2012141458A (en
Inventor
Максим Леонидович Филиппенко
Ульяна Александровна Боярских
Евгений Александрович Храпов
Александр Николаевич Силков
Сергей Витальевич Сенников
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН)
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Институт химической биологии и фундаментальной медицины" Сибирского отделения Российской академии наук (ФГБУ "ИХБФМ" СО РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН), Федеральное государственное бюджетное учреждение "Институт химической биологии и фундаментальной медицины" Сибирского отделения Российской академии наук (ФГБУ "ИХБФМ" СО РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН)
Priority to RU2012141458/10A priority Critical patent/RU2522801C2/en
Publication of RU2012141458A publication Critical patent/RU2012141458A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2522801C2 publication Critical patent/RU2522801C2/en

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: group of inventions relates to biotechnology. A method for detecting an expression level of MCP1 (CCL2) gene provides assessing its iRNA amount by a polymerase chain reaction with reverse transcription (RT-PCR) with real-time signal detection in human sampled cells, tissues and biological fluids. What is developed is a kit for quantitation of iRNA of MCP1 involving combinations of oligonucleotide primers and fluorescent probes for real-time RT-PCR to detect an amount of cDNA of MCP1 genes and RPL32, ACTB, PII normalisation genes.
EFFECT: using the group of inventions enables reducing calculation errors introduced when using one normalisation gene without increasing the number of amplifications, as well as reducing calculation errors raised in a simplified suggestion of the efficacy balance of the cDNA amplification reactions of MCP1 and a normalisation gene observed in ∆∆Ct method.
2 cl, 2 dwg, 3 tbl, 1 ex

Description

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии, и касается способа определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин CCL2 (МСР-1) человека методом ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени, и набора для его осуществления.The present invention relates to medicine, in particular immunology, allergology and molecular biology, and relates to a method for determining the level of transcription of a gene encoding a human chemokine CCL2 (MCP-1) by RT-PCR with real-time detection of results, and a kit for its implementation .

Метод ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени широко используется в лабораторной диагностике и научно-исследовательской работе. Основное применение метода - количественное определение молекул мРНК в образце, в том числе и определение уровня экспрессии мРНК генов, кодирующих цитокины человека.The RT-PCR method with real-time detection of results is widely used in laboratory diagnostics and research. The main application of the method is the quantitative determination of mRNA molecules in a sample, including the determination of the level of mRNA expression of genes encoding human cytokines.

Метод ОТ-ПЦР включает в себя три этапа: синтез молекул кДНК (ДНК, комплиментарных клеточной РНК) при помощи реакции обратной транскрипции; амплификацию последовательности кДНК, соответствующей фрагменту анализируемого гена; анализ полученных результатов и определение относительного количества и уровня экспрессии кДНК анализируемого гена в образце. Количество специфической кДНК в образце, с одной стороны, зависит от уровня экспрессии мРНК соответствующего гена в клетке, с другой стороны, оно определяется объемом клеточного материала в образце, степенью деградации анализируемой РНК и эффективностью реакции обратной транскрипции.The RT-PCR method includes three stages: synthesis of cDNA molecules (DNA, complementary to cellular RNA) using the reverse transcription reaction; amplification of the cDNA sequence corresponding to the fragment of the analyzed gene; analysis of the results and determination of the relative amount and level of cDNA expression of the analyzed gene in the sample. The amount of specific cDNA in the sample, on the one hand, depends on the level of mRNA expression of the corresponding gene in the cell, on the other hand, it is determined by the volume of cellular material in the sample, the degree of degradation of the analyzed RNA, and the efficiency of the reverse transcription reaction.

Вышеперечисленные факторы сложно стандартизовать для всех анализируемых образцов. Например, реакция обратной транскрипции чрезвычайно чувствительна к примесям контаминирующих агентов в образце, что может привести к 5-90% колебаниям эффективности реакции [Ferre F.A., Marchese P., Pezzoli S., Griffin E., Buxton H., Boyer V. Quantative PCR: an overview. // Polymerase Chain Reaction. / K.B.Mullis, Ferre F. R.A.Gibbs. - Burkhauser, Boston, 1994. - P.67-88]. Для того чтобы учесть влияние дополнительных факторов на количество кДНК анализируемого гена, для каждого из образцов рассчитывается так называемый «нормировочный коэффициент». При вычислении «нормировочного коэффициента» в каждом образце помимо количества кДНК анализируемого гена определяется количество кДНК «нормировочного гена». В качестве «нормировочных генов» выбираются гены, для которых уровень экспрессии в клетках различных образцов предположительно не изменяется. При выполнении этого условия изменение количества кДНК «нормировочного гена» будет зависеть в основном от влияния дополнительных факторов определяющих кинетику реакции обратной транскрипции.The above factors are difficult to standardize for all analyzed samples. For example, the reverse transcription reaction is extremely sensitive to contaminant contaminants in the sample, which can lead to 5-90% fluctuations in the reaction efficiency [Ferre FA, Marchese P., Pezzoli S., Griffin E., Buxton H., Boyer V. Quantative PCR : an overview. // Polymerase Chain Reaction. / K.B. Mullis, Ferre F. R.A. Gibbs. - Burkhauser, Boston, 1994. - P.67-88]. In order to take into account the influence of additional factors on the amount of cDNA of the analyzed gene, the so-called “normalization coefficient” is calculated for each of the samples. When calculating the “normalization coefficient” in each sample, in addition to the amount of cDNA of the analyzed gene, the amount of cDNA of the “normalization gene” is determined. As “normalization genes”, genes are chosen for which the expression level in the cells of various samples is not presumably changed. Under this condition, a change in the amount of cDNA of the “normalization gene” will depend mainly on the influence of additional factors determining the kinetics of the reverse transcription reaction.

Подобным свойством обладают, как правило, гены «домашнего хозяйства». Как было показано в публикациях, для нормализации можно использовать гены b- и g-актина [Song Q., Wei Т., Lees-Miller S., Ainemri E., Walters D., Lavin M.F. Resistance ofactin to cleavage during apoptosis. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1997. - N1. - P.157-62], циклофилина [Jaschke A., Mi, H. Tropschug, M. Human Т cell cyclophilinl8 binds to thiol-specific antioxidant protein Aopi and stimulates its activity. // J Mol Biol. - 1998. - N4. - P.63-69], глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) [Tarze A., Deniaud, A. Le Bras, M. Maillier, E. Molle, D. Larochette, N. Zamzami, N. Jan, G. Kroemer, G. Brenner, C. GAPDH, a novel regulator of the pro-apoptotic mitochondrial membrane permeabilization. // Oncogene. - 2007. - N26. - P.2606-2620], гипоксантин фосфорибозилтрансферазы (HRPT) [Foss D.L., Baarsch M.J., Murtaugh M.P. Regulation of hypoxanthine phosphoribosyltransferase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and beta-actin mRNA expression in porcine immune cells and tissues. // Anim Biotechnol. - 1998. - N1. - P.67-78.], рибосомального протеина L32 и других рибосомных белков, 18S, 28S rRNA [Finnegan М.С., Goepel J.R., Hancock B.W., Goyns M.H. Investigation of the expression of housekeeping genes in non-Hodgkin's lymphoma. // Leuk Lymphoma. - 1993. - N10. - P.387-393.], РНК-полимеразы II типа (PII), ТАТА-бокс связывающий белок (TBP) [Thellin О., Zorzi W., Lakaye В., De Borman В., Coumans В., Hennen G., Grisar Т., Igout A., Heinen E. Housekeeping genes as internal standards: use and limits // Journal of Biotechnology. - 1999. - N75. - P.291-295].As a rule, genes of the “household” possess a similar property. As has been shown in publications, b- and g-actin genes can be used for normalization [Song Q., Wei T., Lees-Miller S., Ainemri E., Walters D., Lavin M.F. Resistance ofactin to cleavage during apoptosis. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1997. - N1. - P.157-62], cyclophilin [Jaschke A., Mi, H. Tropschug, M. Human T cell cyclophilinl8 binds to thiol-specific antioxidant protein Aopi and stimulates its activity. // J Mol Biol. - 1998. - N4. - P.63-69], glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) [Tarze A., Deniaud, A. Le Bras, M. Maillier, E. Molle, D. Larochette, N. Zamzami, N. Jan, G. Kroemer, G. Brenner, C. GAPDH, a novel regulator of the pro-apoptotic mitochondrial membrane permeabilization. // Oncogene. - 2007. - N26. - P.2606-2620], hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HRPT) [Foss D.L., Baarsch M.J., Murtaugh M.P. Regulation of hypoxanthine phosphoribosyltransferase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and beta-actin mRNA expression in porcine immune cells and tissues. // Anim Biotechnol. - 1998. - N1. - P.67-78.], L32 ribosomal protein and other ribosomal proteins, 18S, 28S rRNA [Finnegan M.S., Goepel J.R., Hancock B.W., Goyns M.H. Investigation of the expression of housekeeping genes in non-Hodgkin's lymphoma. // Leuk Lymphoma. - 1993. - N10. - P.387-393.], Type II RNA polymerase (PII), TATA box binding protein (TBP) [Thellin O., Zorzi W., Lakaye B., De Borman B., Coumans B., Hennen G ., Grisar T., Igout A., Heinen E. Housekeeping genes as internal standards: use and limits // Journal of Biotechnology. - 1999. - N75. - P.291-295].

Недостатком способа нормирования данных с использованием одного нормировочного гена является значительная вариабельность результатов анализа при неверном выборе нормировочного гена. Не существует идеального нормировочного гена, для которого уровень экспрессии будет оставаться постоянным в независимости от ткани и состояния клеток в анализируемом образце. Само понятие постоянного уровня экспрессии гена является достаточно условным. Характер экспрессии многих «нормировочных генов» может варьировать [Goldsworthy S.M., Goldsworthy T.L., Sprankle C.S., Butterworth B.E. Variation in expression of genes used for normalization of Northern blots after induction of cell proliferation. // Cell Prolif. - 1993. - N6. - P.511-518]. Например, экспрессия таких часто используемых для вычисления «нормировочного коэффициента» генов как RPL32 и G3PDH изменяется под влиянием митогенных агентов [Thellin О., Zorzi W., Lakaye В., De Borman В., Coumans В., Hennen G., Grisar Т., Igout A., Heinen E. Housekeeping genes as internal standards: use and limits // Journal of Biotechnology. - 1999. - N75. - Р.291-295]. Экспрессия многих генов домашнего хозяйства тканеспецифична, в частности, было показано, что экспрессия гена b-2-микроглобулина (В2М) различается в 112 раз в тканях мозга плода и лейкоцитах. Ген АСТВ экспрессируется в 22 раза интенсивнее в кардиомиоцитах по сравнению с фибробластами [Schmittgen T.D., Zakrajsek B.A. Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR. // Genome Biology. - 2002. - N3. - P.3401-3411]. В связи с этим выбор «нормировочного гена» является одним из самых ответственных этапов при проведении анализа. Наиболее оптимальным можно считать подход, при котором анализируется экспрессия одновременно нескольких «нормировочных генов». «Нормировочный коэффициент» при этом вычисляется как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения относительного количества кДНК всех «нормировочных генов» [Tricarico С., Pinzani P., Bianchi S., Paglierani M., Distante V., Pazzagli M., Bustin S.A., Orlando С.Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. // Anal Biochem. - 2002. - N309. - P.293-300]. Использование такого подхода тоже имеет свои недостатки, связанные в первую очередь с необходимостью постановки большого числа реакций ОТ-ПЦР, что крайне неудобно в условиях клинически значимого приложения метода. Кроме того, данный подход иногда невозможен в связи с крайне малым количеством клеточного материала в образце.The disadvantage of the method of data normalization using one normalization gene is the significant variability of the analysis results with the wrong choice of the normalizing gene. There is no ideal normalization gene for which the expression level will remain constant regardless of the tissue and state of cells in the analyzed sample. The very concept of a constant level of gene expression is rather arbitrary. The expression pattern of many “normalization genes” may vary [Goldsworthy S.M., Goldsworthy T.L., Sprankle C.S., Butterworth B.E. Variation in expression of genes used for normalization of Northern blots after induction of cell proliferation. // Cell Prolif. - 1993. - N6. - P.511-518]. For example, the expression of genes such as RPL32 and G3PDH, often used to calculate the “normalization coefficient”, changes under the influence of mitogenic agents [Thellin O., Zorzi W., Lakaye B., De Borman B., Coumans B., Hennen G., Grisar T ., Igout A., Heinen E. Housekeeping genes as internal standards: use and limits // Journal of Biotechnology. - 1999. - N75. - R.291-295]. The expression of many housekeeping genes is tissue-specific, in particular, it was shown that the expression of the b-2-microglobulin (B2M) gene differs 112 times in fetal brain tissues and white blood cells. The ASTV gene is expressed 22 times more intensively in cardiomyocytes compared with fibroblasts [Schmittgen T.D., Zakrajsek B.A. Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR. // Genome Biology. - 2002. - N3. - P.3401-3411]. In this regard, the choice of the “normalizing gene” is one of the most critical steps in the analysis. The most optimal approach is that in which the expression of several “normalizing genes” is analyzed simultaneously. In this case, the “normalization coefficient” is calculated as the geometric mean or arithmetic average of the relative amount of cDNA of all “normalization genes” [Tricarico C., Pinzani P., Bianchi S., Paglierani M., Distante V., Pazzagli M., Bustin SA , Orlando C. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. // Anal Biochem. - 2002. - N309. - P.293-300]. The use of this approach also has its drawbacks, associated primarily with the need to formulate a large number of RT-PCR reactions, which is extremely inconvenient in the context of clinically significant application of the method. In addition, this approach is sometimes impossible due to the extremely small amount of cellular material in the sample.

Другим слабым моментом метода ОТ-ПЦР является этап анализа полученных измерений. В большинстве случаев уровень экспрессии кДНК оценивается относительно уровня экспрессии нормировочного гена при помощи метода ДДС1. При этом относительное количество мРНК определяется в соответствии с уравнением (1)Another weak point of the RT-PCR method is the stage of analysis of the obtained measurements. In most cases, the level of cDNA expression is estimated relative to the level of expression of the normalization gene using the DDS1 method. In this case, the relative amount of mRNA is determined in accordance with equation (1)

X S 1 X S 2 = 2 Δ Δ C t ( 1 )

Figure 00000001
X S one X S 2 = 2 - Δ Δ C t ( one )
Figure 00000001

гдеWhere

ΔΔCt=(CtS1-CtNorm1)-(CtS2-CtNorm)ΔΔCt = (Ct S1 -Ct Norm1 ) - (Ct S2 -Ct Norm )

Ct - значение цикла амплифакации в точке пересечения кинетической кривой накопления продукта амплификации с линией порогового уровня флуоресценции. Пороговый уровень флуоресценции определяется автоматически программным обеспечением прибора;Ct is the value of the amplification cycle at the point of intersection of the kinetic curve of accumulation of the amplification product with the line of the threshold level of fluorescence. The threshold level of fluorescence is determined automatically by the instrument software;

CtS1 и CtS2 - значение порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена в двух сравниваемых образцах s1 и s2;Ct S1 and Ct S2 - value of the threshold cDNA amplification cycle of the analyzed gene in two compared samples s1 and s2;

CtNorm1 и CtNorm2 - значение порогового цикла амплификации кДНК нормировочного гена в двух сравниваемых образцах s1 и s2.Ct Norm1 and Ct Norm2 are the values of the threshold cycle of amplification of the normalization gene cDNA in two compared samples s1 and s2.

Использование метода ΔΔCt возможно при условии, что эффективности реакций амплификации кДНК анализируемого и нормировочного генов равны и близки к 100%. Невыполнение этого условия приводит к значительным ошибкам в результатах. Однако на практике выполнения этого условия добиться очень сложно.Using the ΔΔCt method is possible provided that the efficiency of the cDNA amplification reactions of the analyzed and normalizing genes are equal and close to 100%. Failure to do so will result in significant errors in the results. However, in practice it is very difficult to achieve this condition.

Задача, решаемая предложенным изобретением, заключается в устранении перечисленных недостатков и создании более достоверного и быстрого метода определения уровня транскрипции гена МСР1, применимого в том числе и в клинической практике.The problem solved by the proposed invention is to eliminate the above disadvantages and create a more reliable and quick method for determining the level of transcription of the MCP1 gene, which is also applicable in clinical practice.

Предложенный способ определения уровня транскрипции гена МСР1 методом ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени предполагает: выделение РНК из образцов анализируемого материала (кровь, ткани, соскобы, пунктаты, клеточные культуры), синтез кДНК с помощью реакции обратной транскрипции, амплификацию кДНК генов с помощью ПЦР в реальном времени. Предложен набор для осуществления способа, отличающийся использованием специфических олигонуклеотидных праймеров и флюоресцентных зондов, а также набором нормировочных генов (RPL32, АСТВ, PII), подобранных для максимально корректного расчета уровня CCL2 (МСР1) в образцах РНК. Нормирование полученных результатов осуществляют при помощи нормировочного коэффициента, рассчитанного как среднее арифметическое количества в образце кДНК генов RPL32, АСТВ и PII, кодирующих рибосомный белок L32, b-актин и полимеразу-II соответственно. При этом амплификация кДНК генов RPL32, АСТВ и PII осуществляется при помощи одной triplex-ПЦР.The proposed method for determining the level of transcription of the MCP1 gene by RT-PCR with real-time detection of the results involves: isolation of RNA from samples of the analyzed material (blood, tissues, scrapings, punctate, cell cultures), cDNA synthesis using the reverse transcription reaction, amplification of cDNA genes using real-time PCR. A kit for implementing the method is proposed, characterized by the use of specific oligonucleotide primers and fluorescence probes, as well as a set of normalization genes (RPL32, ASTV, PII), selected for the most correct calculation of the level of CCL2 (MCP1) in RNA samples. The results obtained are normalized using a normalization coefficient calculated as the arithmetic mean of the amount of cDNA of the RPL32, ASTV and PII genes encoding ribosomal protein L32, b-actin and polymerase-II, respectively. In this case, the cDNA amplification of the RPL32, ASTV and PII genes is carried out using one triplex-PCR.

При определении относительного количества кДНК гена МСР1 и нормировочных генов RPL32, АСТВ и PII используют калибровочную кривую, построенную при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых в 6-ти последовательно убывающих трехкратных разведениях известных концентраций. Стандарт представляет собой смесь фрагментов ДНК, несущих амплифицируемую последовательность кДНК генов RPL32, АСТВ, PII и МСР1 длиной по 500 пар нуклеотидов. Относительное количество кДНК каждого гена определяется исходя из уравнения калибровочной кривой, при этом учитывается эффективность амплификации каждой из реакций амплификации.When determining the relative amount of cDNA of the MCP1 gene and normalization genes RPL32, ASTV and PII, a calibration curve is used that was constructed by amplification of standard DNA samples taken in 6 successively decreasing triplicates of known concentrations. The standard is a mixture of DNA fragments carrying an amplifiable cDNA sequence of the RPL32, ASTV, PII, and MCP1 genes of 500 nucleotide pairs in length. The relative amount of cDNA of each gene is determined based on the equation of the calibration curve, taking into account the efficiency of amplification of each of the amplification reactions.

Технический результат, достигаемый при использовании предложенного метода заключается:The technical result achieved using the proposed method is:

во-первых, в уменьшении ошибки вычисления, вносимой при использовании одного нормировочного гена без увеличения числа амплификаций;firstly, to reduce the calculation error introduced when using one normalization gene without increasing the number of amplifications;

во-вторых, в уменьшении ошибки вычислений, возникающей при упрощенном предположении о равенстве эффективности реакций амплификации кДНК МСР1 и нормировочного гена, имеющего место в методе ΔΔCt.secondly, in reducing the calculation error arising under the simplified assumption that the amplification reactions of the MCP1 cDNA amplification reactions are equal to the normalization gene that occurs in the ΔΔCt method.

Образцы ткани для анализаSamples for analysis

В качестве образцов для проведения анализа могут быть использованы цельная кровь, мононуклеарные клетки крови, биоптаты, пунктаты, соскобы слизистой, клеточные культуры.Whole blood, mononuclear blood cells, biopsy samples, punctate, mucosal scrapings, cell cultures can be used as samples for analysis.

Выделение РНК из образцов.Isolation of RNA from samples.

Способы выделения суммарной РНК из образцов ткани млекопитающих включают следующие стадии: измельчение образцов в гомогенизаторе или в жидком азоте (относится к плотным сложно гомогенизируемым фрагментам ткани), лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия, а также спектрофотометрическое определение количества РНК. Гомогенизацию кусочков ткани можно проводить вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например TissueLyser (Qiagen). Для лизиса клеток и выделения РНК могут быть использованы различные протоколы. В классических методах для лизиса клеток и выделения РНК используют сильные хаотропные агенты в сочетании с детергентами, такие как гуанидинизотиоцианат и саркозил, далее следуют последовательные экстракции фенолом при рН5 5,0 и хлороформом для денатурации и удаления белков и геномной ДНК [Chomczynsci P., Sacci N. Single-step method of RNA isolation by Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 1987 / Vol 162. P 156-159]. Далее РНК осаждают в присутствии изопропанола или этанола или сорбируют на твердом носителе, например Silica S-5631(Sigma) или спин-колонке (Qiagen; Promega). Для предотвращения разрушения РНК РНКазами могут быть использованы ингибиторы рибонуклеаз, такие, например, как рекомбинантный RNAsin (Promega). Для элиминации примесей геномной ДНК можно обработать полученный препарат РНК очищенной от рибонуклеаз ДНКазой, однако при небольшом количестве материала этого шага лучше избежать для предотвращения возможной потери и деградации РНК. Выделение РНК может быть выполнено при помощи метода с использованием реагента Trizol®Reagent [Invitrogen] или при помощи коммерчески доступных наборов, таких как RNeasy kits (Qiagen), SV Total RNA Isolation System (Promega) и т.д.Methods for isolating total RNA from mammalian tissue samples include the following stages: grinding samples in a homogenizer or in liquid nitrogen (refers to dense, difficult to homogenize tissue fragments), cell lysis, RNA isolation and purification, RNA quality control by electrophoresis in 1% agarose gel in the presence of dye ethidium bromide, as well as spectrophotometric determination of the amount of RNA. Homogenization of tissue pieces can be carried out manually, grinding with a pestle in a ceramic mortar, or using mechanical homogenizers, for example TissueLyser (Qiagen). Various protocols can be used for cell lysis and RNA isolation. In classical methods, strong chaotropic agents are used in combination with detergents, such as guanidine isothiocyanate and sarcosyl, for subsequent cell lysis and RNA isolation, followed by sequential extraction with phenol at pH5 5.0 and chloroform to denature and remove proteins and genomic DNA [Chomczynsci P., Sacci N. Single-step method of RNA isolation by Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 1987 / Vol 162. P 156-159]. RNA is then precipitated in the presence of isopropanol or ethanol or sorbed on a solid support, for example Silica S-5631 (Sigma) or spin column (Qiagen; Promega). In order to prevent RNA degradation by RNases, ribonuclease inhibitors, such as, for example, recombinant RNAsin (Promega), can be used. To eliminate impurities of genomic DNA, it is possible to treat the resulting RNA preparation with DNase purified from ribonuclease, however, with a small amount of material, this step is best avoided to prevent possible loss and degradation of RNA. RNA isolation can be performed using the Trizol® Reagent [Invitrogen] method or using commercially available kits such as RNeasy kits (Qiagen), SV Total RNA Isolation System (Promega), etc.

Синтез кДНК при помощи реакция обратной транскрипции.Synthesis of cDNA using a reverse transcription reaction.

В результате реакции обратной транскрипции на РНК-матрице синтезируется одноцепочечная цепь ДНК. Образующиеся при этом молекулы кДНК более стабильны по сравнению с нестабильными молекулами РНК и могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции до количеств, необходимых для детекции.As a result of the reverse transcription reaction on the RNA matrix, a single-stranded DNA chain is synthesized. The resulting cDNA molecules are more stable compared to unstable RNA molecules and can be amplified by polymerase chain reaction to the amounts necessary for detection.

Реакцию обратной транскрипции можно проводить при помощи различных коммерческих препаратов обратных транскриптаз, например обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), C.Therm Polymerase и др. Может быть использована термостабильная ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth), обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Mn2+.The reverse transcription reaction can be carried out using various commercial reverse transcriptase preparations, for example, Moloni mouse leukemia virus (M-MLV), avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase, PowerScript (M-MLV-RT point mutation), C. Therm Polymerase, etc. Thermostable Thermus thermophilus (Tth) DNA polymerase, which has reverse transcriptase activity in the presence of Mn 2+ ions, can be used.

Реакцию обратной транскрипции начинается с формирования двухцепочечной затравки, для этого можно использовать различные типы праймеров. Например, oligo(dT)n праймеры (число n обычно равно 12-18), связывающиеся с эндогенным полиА-хвостом на 3'-конце мРНК. Эти праймеры целесообразно использовать для получения полноразмерных кДНК. К 3'-концу oligo(dT) последовательности могут быть добавлены нуклеотиды А, С или G, чтобы «заякорить» праймер на границе транскрипта и поли-А тракта.The reverse transcription reaction begins with the formation of a double-stranded seed, for this you can use various types of primers. For example, oligo (dT) n primers (n is usually 12-18) that bind to the endogenous polyA tail at the 3'-end of the mRNA. These primers should be used to obtain full-sized cDNA. Nucleotides A, C or G can be added to the 3'-end of the oligo (dT) sequence to “anchor” the primer at the border of the transcript and the poly-A tract.

Другой вариант праймеров - случайные гексануклеотидные праймеры (статистические праймеры), гибридизующиеся в нескольких участках на протяжении РНК. В реакции обратной транскрипции с использованием статистических праймеров синтезируются более короткие (в среднем около 500 п.н.) фрагменты кДНК. Реакция обратной транскрипции с использованием статистических праймеров, как правило, проходит более эффективно, в особенности при обратной транскрипции GC-богатых районов и 5'-областей мРНК.Another variant of the primers is random hexanucleotide primers (statistical primers) that hybridize in several regions throughout the RNA. In the reverse transcription reaction using statistical primers, shorter (on average about 500 bp) cDNA fragments are synthesized. The reverse transcription reaction using statistical primers, as a rule, proceeds more efficiently, especially during reverse transcription of GC-rich regions and 5'-regions of mRNA.

Кроме гексамерных праймеров могут быть использованы и более длинные 9-12-мерные праймеры. Также можно использовать статистические праймеры в комбинации с oligo(dT) праймерами или специфическими праймерами, комплиментарными последовательности анализируемого гена.In addition to hexamer primers, longer 9-12-dimensional primers can also be used. You can also use statistical primers in combination with oligo (dT) primers or specific primers complementary to the sequence of the analyzed gene.

Амплификация кДНК генов RPL32, АСТВ, PII и МСР1 при помощи ПЦР с детекцией в режиме реального времени.Amplification of cDNA of RPL32, ASTV, PII, and MCP1 genes using real-time PCR.

Амплификацию фрагментов транскриптов генов RPL32, АСТВ, PII и МСР1 выполняют при помощи пар праймеров, комплиментарных транскриптам. При выборе праймеров для амплификации кДНК PII и МСР1 необходимо учитывать экзон-интронную структуру гена и размещать праймеры таким образом, чтобы их сайты гибридизации располагались в различных экзонах. Таким образом, достигается супрессирование возможных примесей геномной ДНК в образце. Это правило необязательно выполнять при выборе праймеров для амплификации кДНК RPL32 и АСТВ, так как для этих генов в геноме человека содержится большое количество псевдогенов. В этом случае при выборе праймеров необходимо учитывать имеющийся полиморфизм генов и псевдогенов RPL32 и АСТВ для того, чтобы минимизовать гибридизацию праймеров с последовательностью псевдогенов.Amplification of fragments of transcripts of the RPL32, ASTV, PII, and MCP1 genes is performed using pairs of primers complementary to transcripts. When choosing primers for amplification of PII and MCP1 cDNA, it is necessary to take into account the exon-intron structure of the gene and place the primers so that their hybridization sites are located in different exons. Thus, suppression of possible impurities of genomic DNA in the sample is achieved. This rule does not have to be followed when choosing primers for amplification of RPL32 cDNA and ASTV, since for these genes the human genome contains a large number of pseudogenes. In this case, when choosing primers, it is necessary to take into account the existing polymorphism of genes and pseudogenes RPL32 and ASTV in order to minimize hybridization of the primers with the sequence of pseudogenes.

Реакция амплификации может быть выполнена с использование коммерчески доступного препарата ДНК полимеразы Thermus aquaticus, например HS Taq ДНК полимераза, (Евроген), GoTaq® Hot Start Polymerase (Promega) и др. Амплификации кДНК гена МСР1 выполняется с использование пары праймеров, комплиментарных последовательности транскрипта МСР1, амплификация кДНК генов RPL32, АСТВ и РII выполняется в одной пробирке с использованием одновременно трех пар праймеров, комплиментарных последовательностям транскриптов RPL32, АСТВ и PII. В качестве матрицы используется синтезированная на суммарной клеточной РНК кДНК.The amplification reaction can be performed using a commercially available Thermus aquaticus DNA polymerase preparation, for example, HS Taq DNA polymerase, (Eurogen), GoTaq® Hot Start Polymerase (Promega), etc. MCP1 cDNA amplification is performed using a pair of primers complementary to the MCP1 transcript sequence The amplification of cDNA of the RPL32, ASTV and PII genes is performed in one tube using simultaneously three pairs of primers complementary to the sequences of RPL32, ASTV and PII transcripts. As a matrix, cDNA synthesized on total cellular RNA is used.

Накопление продуктов амплификации МСР1 детектируется в режиме реального времени при помощи одного из способов:The accumulation of MCP1 amplification products is detected in real time using one of the methods:

- или при помощи интекалирующего с двухцепочечной ДНК флуоресцентного красителя с высоким индексом дискриминации флуоресценции у связанной и несвязанной форм, например SYBR GreenI (Invitrogen);- or by using a double-stranded DNA intercalating fluorescent dye with a high fluorescence discrimination index in the bound and unbound forms, for example SYBR GreenI (Invitrogen);

- или при помощи олигонуклеотидной пробы типа TaqMan комплементарной центральной части амплифицируемого фрагмента транскрипта. Проба длиной 20-30 нуклеотидов несет на 5'-конце флуорофор (FAM, R6G, ROX) и на 3'-конце не флуоресцентный тушитель (BHQ, FTQ и др.). На каждом цикле амплификации габридизованная проба гидролизуется со стороны 5'-конца, при этом флуорофор пространственно разобщается с тушителем и, как следствие, увеличивается флуоресценция реакционной смеси.- or using an oligonucleotide sample of the TaqMan type complementary to the central part of the amplified transcript fragment. A sample of 20-30 nucleotides in length carries a fluorophore (FAM, R6G, ROX) at the 5'-end and a non-fluorescent quencher at the 3'-end (BHQ, FTQ, etc.). At each amplification cycle, the gabridized sample is hydrolyzed from the 5'-end, while the fluorophore is spatially disconnected from the quencher and, as a result, the fluorescence of the reaction mixture increases.

Накопление продуктов triplex-амплификации кДНК генов RPL32, АСТВ и PII детектируется при помощи трех олигонуклеотидных проб типа TaqMan, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов транскриптов RPL32, АСТВ и PII.The accumulation of triplex amplification products of cDNA of the RPL32, ASTV and PII genes is detected using three oligonucleotide probes of the TaqMan type, complementary to the central part of the amplified fragments of RPL32, ASTV and PII transcripts.

Для выбора последовательности праймеров и проб типа TaqMan может быть использовано доступное программное обеспечение, например OligoAnalyser v. 1.0.3, BeaconDisigner v. 7.0 и другие. Предпочтительно использование следующих пар праймеров:Available software such as OligoAnalyser v. Can be used to select primers and samples of TaqMan type. 1.0.3, BeaconDisigner v. 7.0 and others. The use of the following primer pairs is preferred:

CCL2-F 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3'CCL2-F 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3 '

CCL2-R 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3'CCL2-R 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3 '

CCL2-pr 5'-FAM-CCCTTCTGTGCCTGCTGCTCATAG-3'CCL2-pr 5'-FAM-CCCTTCTGTGCCTGCTGCTCATAG-3 '

ACTB_F 5'-GTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'ACTB_F 5'-GTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 '

ACTB_R 5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'ACTB_R 5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3 '

ACTB_pr 5'-R6G-CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGA-BHQ-3'ACTB_pr 5'-R6G-CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGA-BHQ-3 '

RPL32_F 5'-CAACATTGGTTATGGAAGCAACA-3'RPL32_F 5'-CAACATTGGTTATGGAAGCAACA-3 '

RPL32_R 5'-TGACGTTGTGGACCAGGAACT-3'RPL32_R 5'-TGACGTTGTGGACCAGGAACT-3 '

RPL32_pr 5'-FAM-ACATGCTGCCCAGTGGCTTCCG-BHQ-3'RPL32_pr 5'-FAM-ACATGCTGCCCAGTGGCTTCCG-BHQ-3 '

POLR2A_F 5'-GCACCACGTCCAATGACAT-3'POLR2A_F 5'-GCACCACGTCCAATGACAT-3 '

POLR2A_R 5'-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3'POLR2A_R 5'-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3 '

POLR2A_pr 5'-ROX-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT- BHQ-3'POLR2A_pr 5'-ROX-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT- BHQ-3 '

Определение количества кДНК генов RPL32, АСТВ, PII и МСР1 выполняется при помощи уравнения калибровочной кривой с учетом эффективности каждой реакции амплификации. Для построения калибровочной кривой одновременно с анализируемыми образцами амплифицируются стандартные образцы ДНК с известной последовательно уменьшающейся в три раза концентрацией ДНК. Стандартный образец представляет собой смесь двуцепочечных фрагментов ДНК длиной 500 п.н., несущих последовательности амплифицируемых фрагментов транскриптов RPL32, АСТВ, PII и МСР1. Калибровочная кривая строится в зависимости от значений Ct и Log количества ДНК в стандартном образце. В соответствии с полученным графиком калибровочной кривой при помощи регрессионного анализа определяются коэффициенты линейного уравнения калибровочной кривой. Полученное уравнение используется для определения количества кДНК RPL32, АСТВ, PII и МСР1 в анализируемых образцах.The determination of the amount of cDNA of the RPL32, ASTV, PII, and MCP1 genes is performed using the equation of the calibration curve taking into account the effectiveness of each amplification reaction. To construct a calibration curve, standard DNA samples with a known successively three-fold decrease in DNA concentration are amplified simultaneously with the analyzed samples. The standard sample is a 500 bp double-stranded DNA mixture containing sequences of amplified fragments of RPL32, ASTV, PII, and MCP1 transcripts. The calibration curve is plotted against the Ct and Log values of the amount of DNA in the standard sample. In accordance with the obtained graph of the calibration curve using regression analysis, the coefficients of the linear equation of the calibration curve are determined. The resulting equation is used to determine the amount of cDNA RPL32, ASTV, PII and MCP1 in the analyzed samples.

Определение уровня транскрипции кДНК гена МСР1 осуществляется за счет нормирования полученного количества кДНК МСР1 в образце. Для этого рассчитывается нормировочный коэффициент. Нормировочный коэффициент рассчитывается как среднее арифметическое количества кДНК RPL32, АСТВ, PII в образце.Determination of the transcription level of cDNA of the MCP1 gene is carried out by normalizing the amount of MCP1 cDNA in the sample. For this, a normalization coefficient is calculated. The normalization coefficient is calculated as the arithmetic mean of the amount of cDNA RPL32, ASTV, PII in the sample.

Для проведения ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени различными фирмами разработаны амплификаторы, например ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), CFX96 (Bio-Rad), отечественные приборы ДТ-322 (ДНК-Технология). Применение ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени позволяет уменьшить риск контаминации и автоматизировать процесс диагностики. Постановка реакции занимает от 40 минут до двух часов (в зависимости от используемого амплификатора) и включает одновременное проведение ПЦР, детекцию флуоресцентного сигнала, обработку данных и их представление в графическом виде с помощью специального программного обеспечения.To perform real-time PCR, various companies have developed amplifiers, for example, ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), CFX96 (Bio-Rad), and domestic devices DT-322 (DNA-Technology). The use of PCR with the detection of results in real time can reduce the risk of contamination and automate the diagnostic process. The reaction takes from 40 minutes to two hours (depending on the amplifier used) and includes simultaneous PCR, detection of a fluorescent signal, data processing and their presentation in graphical form using special software.

Изобретение осуществляется следующим образом.The invention is as follows.

Пример 1.Example 1

Материалом исследования являлись образцы периферической крови здоровых доноров и пациентов с атопическим дерматитом в стадии обострения. Образцы периферической крови объемом 5 мл забирались в пробирки, содержащие 0,1М раствор ЭДТА (антикоагулянт, препятствующий свертыванию крови).The research material was peripheral blood samples of healthy donors and patients with atopic dermatitis in the acute stage. Samples of peripheral blood with a volume of 5 ml were collected in tubes containing 0.1 M EDTA solution (anticoagulant that prevents blood coagulation).

Выделение мононуклеарных клеток крови (МКК). Разделение клеточных элементов крови проводили методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла -верографина (плотность 1,077 г/мл). Методика выделения лимфоцитов крови на фиколле [Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone ma rrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol.21. - Suppl. 97 - p.1-9]. Полученные клетки ресуспендировались в культуральной среде RPMI, содержащей 10% FBS и 0,03% глутамина в концентрации 106 кл/мл, и высевались в лунки 24-луночного культурального планшета по 1000 мкл/лунку. Клетки культивировались в течение 24 ч при 37°С и 5%-ном содержании СO2 в атмосфере.Isolation of Mononuclear Blood Cells (MCC). The separation of the cellular elements of the blood was carried out by centrifugation in a density gradient of ficoll-verografin (density 1.077 g / ml). The technique of isolation of blood lymphocytes on ficoll [Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol.21. - Suppl. 97 - p. 1-9]. The resulting cells were resuspended in RPMI culture medium containing 10% FBS and 0.03% glutamine at a concentration of 10 6 cells / ml and plated in 1000 μl / well in the 24-well culture plate. Cells were cultured for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 in the atmosphere.

Выделение РНК и синтез кДНК в реакции обратной транскрипции. Клетки после 24 ч культивирования освобождали от кондиционных сред методом центрифугирования при 600g и лизировали реагентом Trisol (Invitrogen). Суммарную клеточную РНК выделяли согласно рекомендациям Invitrogen. Качество препаратов РНК оценивали по итогам электрофоретического разделения в 1,3% агарозном геле. Реакцию обратной транскрипции проводили при 42°С в течение 45 мин в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Tris-HCl (рН 8,3), 5 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 50 мМ KCl, 0,2 мМ dNTP, Stat-9 праймер (10 нг/мкл), 100 ед. акт. ДНК зависимой РНК полимеразы MoMLV (Biosan, ИХБФМ СОРАН) и 500 нг суммарной клеточной РНК.RNA isolation and cDNA synthesis in a reverse transcription reaction. Cells after 24 h of cultivation were freed from conditioned media by centrifugation at 600 g and lysed with Trisol reagent (Invitrogen). Total cellular RNA was isolated according to the recommendations of Invitrogen. The quality of RNA preparations was evaluated by electrophoretic separation in a 1.3% agarose gel. The reverse transcription reaction was carried out at 42 ° C for 45 min in 20 μl of the reaction mixture containing 10 mm Tris-HCl (pH 8.3), 5 mm MgCl 2 , 10 mm DTT, 50 mm KCl, 0.2 mm dNTP, Stat-9 primer (10 ng / μl), 100 units Act. MoMLV DNA-dependent RNA polymerase (Biosan, SORAN ICBPM) and 500 ng of total cellular RNA.

Амплификация кДНК гена МСР1 с детекцией в режиме реального времени. Реакция амплификации выполнялась при помощи термоциклеров с оптическим блоком для детекции флуоресценции iQ5 iCycler или CFX96(Bio-Rad). Возможность регистрации флуоресценции в режиме реального времени достигалась за счет добавления в реакционную смесь интеркалирующего красителя SYBRGreen I (способ 1) или при помощи гибридизационных проб типа TaqMan (способ 2).Amplification of cDNA of the MCP1 gene with real-time detection. The amplification reaction was carried out using thermal cyclers with an optical unit for iQ5 iCycler or CFX96 fluorescence detection (Bio-Rad). The possibility of real-time fluorescence detection was achieved by adding SYBRGreen I intercalating dye to the reaction mixture (method 1) or using TaqMan type hybridization samples (method 2).

Способ 1. ПЦР проводилась в объеме 25 мкл, реакционная смесь содержала 10 мМ Tris-HCl (рН 8.9); 55 мМ KCl; 0,05% Tween 20; 2,5 мМ MgCl2, 0,2 мM dNTP, 300 мM праймеров (прямой и обратный), 0.5 ед. акт. Taq-ДНК полимеразы (Biosan, ИХБФМ СОРАН), SYBRGreen I [1:25000] и 0.1-5 нг кДНК.Method 1. PCR was carried out in a volume of 25 μl, the reaction mixture contained 10 mm Tris-HCl (pH 8.9); 55 mM KCl; 0.05% Tween 20; 2.5 mm MgCl 2 , 0.2 mm dNTP, 300 mm primers (forward and reverse), 0.5 units Act. Taq DNA polymerase (Biosan, ICBPM SORAN), SYBRGreen I [1: 25000] and 0.1-5 ng cDNA.

Для амплификации использовались праймеры: прямой праймер - 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3' и обратный праймер - 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3'.For amplification, primers were used: forward primer - 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3 'and reverse primer - 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3'.

Протокол амплификации:Amplification Protocol:

- первичная денатурация - 3 минуты при 96°С- primary denaturation - 3 minutes at 96 ° C

- амплификационный цикл (×40)- amplification cycle (× 40)

- денатурация - 10 секунд при 96°С- denaturation - 10 seconds at 96 ° C

- отжиг праймеров - 10 секунд при 60°С- primer annealing - 10 seconds at 60 ° C

- элонгация - 10 секунд при 72°С- elongation - 10 seconds at 72 ° C

- съем сигнала - 10 секунд при 86°С (температуре плавления продукта амплификации)- signal pick-up - 10 seconds at 86 ° C (melting point of the amplification product)

- построение кривой плавления - нагревание амплификационной смеси с 75 до 95°С, с шагом 0,5°С, сопровождающееся съемом флуоресцентного сигнала на каждом шаге в течение 10 секунд.- building a melting curve - heating the amplification mixture from 75 to 95 ° C, in increments of 0.5 ° C, accompanied by a fluorescence signal at each step for 10 seconds.

Специфичность амплификации подтверждалась при анализе кривых плавления, а также электрофоретическим анализом в 8% полиакриламидном геле.The specificity of amplification was confirmed by analysis of the melting curves, as well as by electrophoretic analysis in an 8% polyacrylamide gel.

Способ 2. ПЦР проводилась в объеме 25 мкл, реакционная смесь содержала 65 мМ Tris-HCl (рН 8.9); 24 мМ (NH4)2SO4; 0,05% Tween 20; 2,5 мМ MgCl2, 0,2 мM dNTP, 300 мM праймеров (прямой и обратный), 100 мM Taq-Man проба, 0.5 ед. акт. Taq-ДНК полимеразы (Biosan, ИХБФМ СОРАН) и 0.1-5 нг кДНК.Method 2. PCR was carried out in a volume of 25 μl, the reaction mixture contained 65 mm Tris-HCl (pH 8.9); 24 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.05% Tween 20; 2.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, 300 mM primers (forward and reverse), 100 mM Taq-Man assay, 0.5 unit Act. Taq DNA polymerase (Biosan, ICBPM SORAN) and 0.1-5 ng cDNA.

Протокол амплификации:Amplification Protocol:

- первичная денатурация - 3 минуты при 96°С- primary denaturation - 3 minutes at 96 ° C

- амплификационный цикл (×40)- amplification cycle (× 40)

- денатурация - 10 секунд при 96°С- denaturation - 10 seconds at 96 ° C

- отжиг праймеров, элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 60 секунд при 60°С.- annealing of primers, elongation and removal of the fluorescent signal - 60 seconds at 60 ° C.

Специфичность амплификации подтверждалась электрофоретическим анализом в полиакриламидном геле.The specificity of amplification was confirmed by polyacrylamide gel electrophoretic analysis.

Для амплификации использовались олигонуклеотидные пробы: прямой праймер - 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3' и обратный праймер - 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3', гибридизационная проба - 5'-FAM-CCCTTCTGTGCCTGCTGCTCATAG-3'.For amplification, oligonucleotide samples were used: direct primer - 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3 'and reverse primer - 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3', hybridization probe - 5'-FAM-CCCTTCTGTGCCTGCTGCTC.

Амплификация кДНК генов RPL32, АСТВ и PII с детекцией в режиме реального времени. ПЦР проводилась в объеме 25 мкл, реакционная смесь содержала 65 мМ Tris-HCl (pH 8.9); 24 мМ (NH4)2SO4; 0,05% Tween 20; 2,5 мМ MgCl2 0,2 мM dNTP, 300 мM праймеров (RPL32_F и RPL32_R, ACTB_F и ACTB_R, PII_F и PII_R), 100 мM Taq-Man пробы (RPL32_pr, ACTB_pr, PII_pr), 0.5 ед. акт. Taq-ДНК полимеразы (Biosan, ИХБФМ СОРАН) и 0.1-5 нг кДНК.Amplification of cDNA of RPL32, ASTV and PII genes with real-time detection. PCR was carried out in a volume of 25 μl, the reaction mixture contained 65 mm Tris-HCl (pH 8.9); 24 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.05% Tween 20; 2.5 mM MgCl 2 0.2 mM dNTP, 300 mM primers (RPL32_F and RPL32_R, ACTB_F and ACTB_R, PII_F and PII_R), 100 mM Taq-Man samples (RPL32_pr, ACTB_pr, PII_pr), 0.5 units. Act. Taq DNA polymerase (Biosan, ICBPM SORAN) and 0.1-5 ng cDNA.

Протокол амплификации:Amplification Protocol:

- первичная денатурация - 3 минуты при 96°С- primary denaturation - 3 minutes at 96 ° C

- амплификационный цикл (×40)- amplification cycle (× 40)

- денатурация - 10 секунд при 96°С- denaturation - 10 seconds at 96 ° C

- отжиг праймеров, элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 60 секунд при 60°С.- annealing of primers, elongation and removal of the fluorescent signal - 60 seconds at 60 ° C.

Специфичность амплификации подтверждалась электрофоретическим анализом в полиакриламидном геле.The specificity of amplification was confirmed by polyacrylamide gel electrophoretic analysis.

Для амплификации использовались олигонуклеотидные пробы:For amplification, oligonucleotide samples were used:

АСТВ: прямой праймер 5'-GTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3', обратный праймер 5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3', гибридизационная проба 5'-R6G-CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGA-BHQ-3'ASTV: direct primer 5'-GTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 ', reverse primer 5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3', hybridization test 5'-R6G-CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGA-BHQ-3 '

RPL32: прямой праймер 5'-CAACATTGGTTATGGAAGCAACA-3', обратный праймер 5'-TGACGTTGTGGACCAGGAACT-3', гибридизационная проба 5'-FAM-ACATGCTGCCCAGTGGCTTCCG-BHQ-3'RPL32: forward primer 5'-CAACATTGGTTATGGAAGCAACA-3 ', reverse primer 5'-TGACGTTGTGGACCAGGAACT-3', hybridization probe 5'-FAM-ACATGCTGCCCAGTGGCTTCCG-BHQ-3 '

PII: прямой праймер 5'-GCACCACGTCCAATGACAT-3', обратный праймер 5'-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3', гибридизационная проба 5'-ROX-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ-3'.PII: direct primer 5'-GCACCACGTCCAATGACAT-3 ', reverse primer 5'-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3', hybridization test 5'-ROX-TACCACGTCATCTCCTTTTGATGGCTCCTAT-BHQ-3 '.

Анализ результатов ОТ-ПЦР.Analysis of the results of RT-PCR.

Всего было проанализировано 48 образцов, из них 24 образца МКК, полученных от здоровых доноров, и 24 образца МКК от пациентов с атопическим дерматитом. Определение относительного количества кДНК RPL32, АСТВ, PII и МСР1 в анализируемых образцах выполняли при помощи уравнения калибровочной кривой. Для этого одновременно с анализируемыми образцами амплифицировали 5 стандартных образцов с последовательно уменьшающейся в три раза концентрацией ДНК (st1-1 y.e., st2-3 y.e., st3-9 y.e., st4-27 y.e., st5-81 y.e.). Для каждого образца при помощи программного обеспечения прибора определяли величину порогового цикла (Ct), при котором значение флуоресценции реакционной смеси достигало некоторого «порогового» уровня (Т) одинакового для всех сравниваемых образцов.A total of 48 samples were analyzed, of which 24 samples of MCC obtained from healthy donors, and 24 samples of MCC from patients with atopic dermatitis. The relative amount of cDNA RPL32, ASTV, PII and MCP1 in the analyzed samples was determined using the equation of the calibration curve. For this, 5 standard samples were amplified simultaneously with the analyzed samples with a DNA concentration successively decreasing by three times (st1-1 y.e., st2-3 y.e., st3-9 y.e., st4-27 y.e., st5-81 y.e.). For each sample, the threshold cycle value (Ct) was determined using the instrument software at which the fluorescence value of the reaction mixture reached a certain “threshold” level (T) that was the same for all compared samples.

Количество кДНК (Х0) в образце вычислялось при помощи уравнения:The amount of cDNA (X 0 ) in the sample was calculated using the equation:

Log(X0)=a+b*Ct,Log (X 0 ) = a + b * Ct,

где а=log(T) и b=log(1+Eff).where a = log (T) and b = log (1 + Eff).

Условия амплификации выбирались таким образом, что эффективность (Eff) ПЦР оставалась постоянной для всех анализируемых образцов и образцов калибровочной кривой, следовательно, коэффициент b=log(1+E)=const.The amplification conditions were chosen so that the efficiency (Eff) of PCR remained constant for all analyzed samples and samples of the calibration curve, therefore, the coefficient b = log (1 + E) = const.

Коэффициенты а и b уравнения вычислялись при построении уравнения калибровочной кривой. Уравнение калибровочной кривой определяло взаимосвязь значений Ct, полученных при амплификации пяти стандартных образцов, и значений lg(X0) этих образцов (в нашем случае это Igl, lg3, lg9, lg27, lg81).The coefficients a and b of the equation were calculated when constructing the equation of the calibration curve. The calibration curve equation determined the relationship between the Ct values obtained from the amplification of five standard samples and the log (X 0 ) values of these samples (in our case, these are Igl, log3, log9, log27, log81).

На фиг.1А приведены кривые увеличения интенсивности флуоресценции реакционной смеси при амплификации фрагмента транскрипта МСР1 для 5-ти стандартных образцов с последовательно уменьшающейся в три раза концентрацией ДНК в зависимости от номера цикла ПЦР. Амплификация выполнена способом 2 с использованием пары праймеров и гибридизационной TaqMan пробы. На фиг.1Б приведен график калибровочной кривой, определяющий зависимость значений Ct, полученных при амплификации пяти стандартных образцов, и значений lg(X0) этих образцов (lg1, lg3, lg9, lg27, lg81).On figa shows curves of increasing the fluorescence intensity of the reaction mixture during amplification of a fragment of the transcript MCP1 for 5 standard samples with successively decreasing three times the concentration of DNA depending on the number of PCR cycles. Amplification was performed by method 2 using a pair of primers and TaqMan hybridization assay. On figb shows a graph of the calibration curve that determines the dependence of the Ct values obtained by amplification of five standard samples, and the values of lg (X 0 ) of these samples (lg1, lg3, lg9, lg27, lg81).

Эффективность амплификации определялась как угол наклона калибровочной кривой. Для всех пар праймеров эффективность амплификации составила не меньше 90%. Значения эффективности реакций амплификации кДНК RPL32, АСТВ, PII и МСР1 приведены в таблице 1.Amplification efficiency was determined as the angle of inclination of the calibration curve. For all pairs of primers, the amplification efficiency was not less than 90%. The values of the efficiency of the amplification reactions of cDNA RPL32, ASTV, PII and MCP1 are shown in table 1.

Для оценки воспроизводимости значений порогового цикла (Ct) все анализируемые образцы с каждой парой праймеров амплифицировались в тройном повторе. Разница значений Ct между повторами была не более 0,3 цикла.To assess the reproducibility of the threshold cycle (Ct) values, all analyzed samples with each pair of primers were amplified in triplicate. The difference in the Ct values between repetitions was no more than 0.3 cycles.

Для определения относительного уровня экспрессии кДНК МСР1 полученные для анализируемых образцов значения относительного количества кДНК МСР1 нормировались при помощи нормировочного коэффициента, рассчитанного как среднее арифметическое количества кДНК генов RPL32, АСТВ, PIITo determine the relative level of MCP1 cDNA expression, the values of the relative amount of MCP1 cDNA obtained for the analyzed samples were normalized using a normalization coefficient calculated as the arithmetic mean of the amount of cDNA of the RPL32, ASTV, PII genes

Нормировочные гены должны характеризоваться постоянным уровнем экспрессии в клетках и не зависеть от анализируемого образца. Для того чтобы оценить вариабельность изменения уровня экспрессии генов RPL32, АСТВ, PII между образцами рассчитывались попарные коэффициенты корреляции (R2) между количеством кДНК RPL32 и АСТВ, RPL32 и PII, АСТВ и РII. Значения попарных коэффициенов корреляции Пирсона (R2) количеств кДНК нормировочных генов RPL32, АСТВ, РII представлены в таблице 2. Во всех случаях были получены высокие коэффициенты корреляции не ниже 0,73.Normalization genes should be characterized by a constant level of expression in the cells and not depend on the analyzed sample. In order to assess the variability of the level of expression of the RPL32, ASTV, PII genes between samples, pairwise correlation coefficients (R 2 ) between the amount of RPL32 cDNA and ASTV, RPL32 and PII, ASTV and PII were calculated. The values of the pairwise Pearson correlation coefficients (R 2 ) of the cDNA quantities of the normalizing genes RPL32, ASTV, PII are presented in Table 2. In all cases, high correlation coefficients of at least 0.73 were obtained.

Сравнение результатов, полученных при определении уровня транскрипции кДНК МСР1 методом ОТ-ПЦР и количества белка МСР1 методом ИФА.Comparison of the results obtained when determining the level of transcription of MCP1 cDNA by RT-PCR and the amount of MCP1 protein by ELISA.

Оценка уровня продукции белка МСР1 мононуклеарными клетками проводилась в кондиционных средах культур, собранных после центрифугирования культивированных 24 часа клеток. Аликвоты образцов хранили при -20°С до анализа.Assessment of the level of MCP1 protein production by mononuclear cells was carried out in conditioned culture media collected after centrifugation of cultured 24 hours cells. Aliquots of the samples were stored at -20 ° C until analysis.

Анализ уровня МСР-1 проводили иммуноферментным методом (ИФА) используя коммерческие наборы ЗАО «Вектор-Бэст» Новосибирск, в точном соответствии с инструкцией производителя. Детекция результатов ИФА проводилась на планшетном анализаторе TriStar LB941 (Berthold Technology Inc.).The analysis of the MCP-1 level was carried out by the enzyme immunoassay (ELISA) using commercial sets of Vector-Best CJSC Novosibirsk, in strict accordance with the manufacturer's instructions. ELISA results were detected on a TriStar LB941 analyzer (Berthold Technology Inc.).

На фиг.2 приведен график зависимости значений уровня экспрессии кДНК МСР1, определенных методом ОТ-ПЦР, и значений количества белка МСР1, определенных методом ИФА в 48-ми образцах культур мононуклеарных клеток. Полученные при помощи метода ОТ-ПЦР значения уровня экспрессии кДНК МСР1 достоверно коррелировали с соответствующими значениями количества белка МСР1, определенными методом ИФА. Коэффициент корреляции Пирсона R2 составил 0.63, что соответствует уровню статистической значимости <0.001 (для числа степеней свободы n=46).Figure 2 shows a graph of the dependence of the values of the expression level of MCP1 cDNA, determined by RT-PCR, and the values of the amount of MCP1 protein, determined by ELISA in 48 samples of mononuclear cell cultures. The values of the expression level of MCP1 cDNA obtained using the RT-PCR method were significantly correlated with the corresponding values of the amount of MCP1 protein determined by ELISA. The Pearson correlation coefficient R 2 was 0.63, which corresponds to a level of statistical significance <0.001 (for the number of degrees of freedom n = 46).

В таблице 3 приведены результаты статистического анализа показателей уровней экспрессии кДНК МСР1 и количеств белка МСР1 в образцах МКК от здоровых доноров и пациентов с атопическим дерматитом в стадии обострения. Анализ показал, что среднее значение уровня экспрессии кДНК МСР1 в образцах МКК, полученных от здоровых доноров, значимо выше уровня экспрессии кДНК МСР1 в образцах МКК пациентов с атопическим дерматитом в стадии обострения (с уровнем значимости р<0.02).Table 3 shows the results of a statistical analysis of the levels of MCP1 cDNA expression and the amounts of MCP1 protein in MCC samples from healthy donors and patients with atopic dermatitis in the acute stage. The analysis showed that the average value of the MCP1 cDNA expression level in MCC samples obtained from healthy donors is significantly higher than the MCP1 cDNA expression level in MCC samples of patients with atopic dermatitis in the acute stage (with significance level p <0.02).

Результаты ИФА также свидетельствуют, что клетки МКК, полученные от здоровых доноров, продуцируют значимо большее количество белка МСР1 чем МКК пациентов с атопическим дерматитом (с уровнем значимости р<0.001) (таблица 3).ELISA results also indicate that MCC cells obtained from healthy donors produce a significantly larger amount of MCP1 protein than MCC cells in patients with atopic dermatitis (with significance level p <0.001) (table 3).

Таблица 1.Table 1. Название генаGene name Метод ПЦРPCR method ЭффективностьEfficiency МСР1MCP1 амплификация с SYBRGreenIamplification with SYBRGreenI 96,696.6 амплификация с TaqMan пробойamplification with TaqMan breakdown 94,094.0 RPL32Rpl32 triplex-ПЦР с TaqMan пробамиtriplex-PCR with TaqMan samples 98,298.2 АСТВASTV 95,595.5 PIIPii 92,792.7

Таблица 2.Table 2. RPL32Rpl32 АСТВASTV РIIRII RPL32Rpl32 0.860.86 0.730.73 ACTSACTS 0.910.91 PIIPii

Таблица 3.Table 3. МКК здоровых доноров (n=24)MCC healthy donors (n = 24) МКК пациентов с атопическим дерматитом (n=24)MCC of patients with atopic dermatitis (n = 24) Среднее значение (условные единицы)Average value (conventional units) Стандартное отклонениеStandard deviation Среднее значение (у.е.)Average value (c.u.) Стандартное отклонениеStandard deviation Уровень значимости непарного t-теста (Р)The significance level of the unpaired t-test (P) уровень экспрессии кДНК МСР1the level of expression of the MCP1 cDNA 1,271.27 1,031,03 0,550.55 0,670.67 0.020.02 количество белка МСР1the amount of protein MCP1 0,930.93 0,470.47 0,340.34 0,410.41 <0.001<0.001

Перечень последовательностей олигонуклеотидов к заявке «Способ определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин CCL2 (MCP-1) человека, и набор для его осуществления».The list of oligonucleotide sequences for the application "Method for determining the level of transcription of a gene encoding a chemokine CCL2 (MCP-1) person, and a kit for its implementation."

Набор для определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин CCL2 (MCP-1) человека по п.1, включающий: A kit for determining the level of transcription of a gene encoding a human CCL2 chemokine (MCP-1) according to claim 1, including:

а) олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР кДНК генов RPL32, ACTB и PII, кодирующих рибосомный белок L32, b-актин и полимеразу-II соответственно a) oligonucleotide primers and samples for amplification using one triplex-PCR cDNA of the RPL32, ACTB and PII genes encoding ribosomal protein L32, b-actin and polymerase-II, respectively

ACTB_F 5'-GTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'ACTB_F 5'-GTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 '

ACTB_R 5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'ACTB_R 5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3 '

ACTB_pr 5'-R6G-CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGA - BHQ- 3'ACTB_pr 5'-R6G-CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGA - BHQ- 3 '

RPL32_F 5'-CAACATTGGTTATGGAAGCAACA-3'RPL32_F 5'-CAACATTGGTTATGGAAGCAACA-3 '

RPL32_R 5'-TGACGTTGTGGACCAGGAACT-3'RPL32_R 5'-TGACGTTGTGGACCAGGAACT-3 '

RPL32_pr 5'-FAM-ACATGCTGCCCAGTGGCTTCCG-BHQ- 3'RPL32_pr 5'-FAM-ACATGCTGCCCAGTGGCTTCCG-BHQ- 3 '

POLR2A_F 5'-GCACCACGTCCAATGACAT-3'POLR2A_F 5'-GCACCACGTCCAATGACAT-3 '

POLR2A_R 5'-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3'POLR2A_R 5'-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3 '

POLR2A_pr 5'- ROX-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT- BHQ-3' POLR2A_pr 5'- ROX-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT- BHQ-3 '

б) олигонуклеотидные праймеры и проба для амплификации при помощи ПЦР кДНК гена, кодирующего CCL2 (MCP-1)b) oligonucleotide primers and a sample for amplification using PCR cDNA of the gene encoding CCL2 (MCP-1)

ССL2-F 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3'CCL2-F 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3 '

ССL2-R 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3'CCL2-R 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3 '

ССL2-pr 5'-FAM-CCCTTCTGTGCCTGCTGCTCATAG-3'.CCL2-pr 5'-FAM-CCCTTCTGTGCCTGCTGCTCATAG-3 '.

Claims (2)

1. Способ определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин CCL2 (МСР1) человека, включающий выделение РНК из образцов анализируемого материала (кровь, ткани, соскобы, пунктаты, клеточные культуры), синтез кДНК с помощью реакции обратной транскрипции, амплификацию кДНК генов с помощью ПЦР в реальном времени, отличающийся тем, что
а) нормирование полученных результатов выполняют при помощи нормировочного коэффициента, рассчитанного как среднее арифметическое количества в образце кДНК генов RPL32, АСТВ и PII, кодирующих рибосомный белок L32, b-актин и полимеразу-II соответственно, при этом амплификацию кДНК генов RPL32, АСТВ и PII осуществляют при помощи одной triplex-ПЦР;
б) накопление продуктов амплификации детектируют в режиме реального времени при помощи одного из способов:
1б) при помощи интеркалирующего с двухцепочечной ДНК флуоресцентного красителя с высоким индексом дискриминации флуоресценции у связанной и несвязанной форм, например, SYBR GreenI (Invitrogen);
2б) при помощи олигонуклеотидной пробы типа TaqMan комплементарной центральной части амплифицируемого фрагмента транскрипта; проба длиной 20-30 нуклеотидов несет на 5'-конце флуорофор (FAM, R6G, ROX) и на 3'-конце не флуоресцентный тушитель (BHQ, FTQ и др.);
в) определение относительного количества кДНК гена МСР1 и нормировочных генов RPL32, АСТВ и PII осуществляют при помощи калибровочной кривой, построенной при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых в 6-ти последовательно убывающих трехкратных разведениях известных концентраций; стандарт представляет собой смесь фрагментов ДНК, несущих амплифицируемую последовательность кДНК генов RPL32, АСТВ, PII и МСР1 длиной по 500 пар нуклеотидов; относительное количество кДНК каждого гена определяют исходя из уравнения калибровочной кривой, при этом учитывается эффективность амплификации каждой из реакций амплификации.
1. A method for determining the level of transcription of a gene encoding a human CCL2 chemokine (MCP1), including the isolation of RNA from samples of the analyzed material (blood, tissues, scrapings, punctate, cell cultures), cDNA synthesis using the reverse transcription reaction, amplification of cDNA genes using PCR in real time, characterized in that
a) the normalization of the results is carried out using a normalization coefficient calculated as the arithmetic mean of the cDNA sample of the RPL32, ASTV and PII genes encoding the ribosomal protein L32, b-actin and polymerase-II, respectively, while the cDNA amplification of the RPL32, ASTV and PII genes carried out using one triplex-PCR;
b) the accumulation of amplification products is detected in real time using one of the methods:
1b) using a double-stranded DNA intercalating fluorescent dye with a high fluorescence discrimination index in the bound and unbound forms, for example, SYBR GreenI (Invitrogen);
2b) using an oligonucleotide sample of the TaqMan type complementary to the central part of the amplified fragment of the transcript; a sample of 20-30 nucleotides in length carries a fluorophore (FAM, R6G, ROX) at the 5'-end and a non-fluorescent quencher at the 3'-end (BHQ, FTQ, etc.);
c) the determination of the relative amount of cDNA of the MCP1 gene and normalization genes RPL32, ASTV and PII is carried out using a calibration curve constructed by amplification of standard DNA samples taken in 6 successively decreasing triplicates of known concentrations; the standard is a mixture of DNA fragments carrying an amplifiable cDNA sequence of the RPL32, ASTV, PII, and MCP1 genes with a length of 500 nucleotide pairs; the relative amount of cDNA of each gene is determined based on the equation of the calibration curve, taking into account the amplification efficiency of each of the amplification reactions.
2. Набор для определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин CCL2 (МСР1) человека по п.1, включающий:
а) олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР кДНК генов RPL32, АСТВ и PII, кодирующих рибосомный белок L32, b-актин и полимеразу-II соответственно
ACTB_F 5'-GTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'
ACTB_R 5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'
ACTB_pr 5'-R6G-CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGA-BHQ-3'
RPL32_F 5'-CAACATTGGTTATGGAAGCAACA-3'
RPL32_R 5'-TGACGTTGTGGACCAGGAACT-3'
RPL32_pr 5'-FAM-ACATGCTGCCCAGTGGCTTCCG-BHQ-3'
POLR2A_F 5'-GCACCACGTCCAATGACAT-3'
POLR2A_R 5'-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3'
POLR2A_pr 5'- ROX-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ-3'
б) олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи ПЦР кДНК гена, кодирующего CCL2 (МСР1)
CCL2-F 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3'
CCL2-R 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3'
CCL2-pr 5'-FAM-CCCTTCTGTGCCTGCTGCTCATAG-3'.
2. A kit for determining the level of transcription of a gene encoding a chemokine CCL2 (MCP1) of a person according to claim 1, including:
a) oligonucleotide primers and samples for amplification using one triplex-PCR cDNA of the RPL32, ASTV and PII genes encoding ribosomal protein L32, b-actin and polymerase-II, respectively
ACTB_F 5'-GTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 '
ACTB_R 5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3 '
ACTB_pr 5'-R6G-CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGA-BHQ-3 '
RPL32_F 5'-CAACATTGGTTATGGAAGCAACA-3 '
RPL32_R 5'-TGACGTTGTGGACCAGGAACT-3 '
RPL32_pr 5'-FAM-ACATGCTGCCCAGTGGCTTCCG-BHQ-3 '
POLR2A_F 5'-GCACCACGTCCAATGACAT-3 '
POLR2A_R 5'-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3 '
POLR2A_pr 5'- ROX-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ-3 '
b) oligonucleotide primers and samples for amplification using PCR cDNA of the gene encoding CCL2 (MCP1)
CCL2-F 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3 '
CCL2-R 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3 '
CCL2-pr 5'-FAM-CCCTTCTGTGCCTGCTGCTCATAG-3 '.
RU2012141458/10A 2012-09-27 2012-09-27 Method for detecting transcription level of gene coding human chemokine ccl2 (mcp-1) and kit for implementing it RU2522801C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012141458/10A RU2522801C2 (en) 2012-09-27 2012-09-27 Method for detecting transcription level of gene coding human chemokine ccl2 (mcp-1) and kit for implementing it

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012141458/10A RU2522801C2 (en) 2012-09-27 2012-09-27 Method for detecting transcription level of gene coding human chemokine ccl2 (mcp-1) and kit for implementing it

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012141458A RU2012141458A (en) 2014-04-27
RU2522801C2 true RU2522801C2 (en) 2014-07-20

Family

ID=50515052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012141458/10A RU2522801C2 (en) 2012-09-27 2012-09-27 Method for detecting transcription level of gene coding human chemokine ccl2 (mcp-1) and kit for implementing it

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2522801C2 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2587540C1 (en) * 2015-08-06 2016-06-20 Общество с ограниченной ответственностью "АБВ-ТЕСТ" Method of diagnosing condition of immune system of patient and set of primers, probes and standard samples for quantitative estimation of dna molecules trec, krec and number of genome equivalents of dna
RU2731062C1 (en) * 2019-10-22 2020-08-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России) METHOD FOR DETERMINING EXPRESSION LEVEL OF GENE CODING 1L-1β IN RABBIT EYE TISSUES (ORYCTOLAGUS CUNICULUS), AND KIT FOR IMPLEMENTATION THEREOF
RU2750940C1 (en) * 2020-08-07 2021-07-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России) Method for determining level of expression of gene encoding ccl-2 in tissues of eye of rabbit oryctolagus cuniculus, and kit for its determination

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TRICARICO С. et al, Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. Anal Biochem. 2002. N309. p.293-300. SONG Q. et al., Resistance ofactin to cleavage during apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA. 1997. N1. p.157-62. FINNEGAN М.С. et al, Investigation of the expression of housekeeping genes in non-Hodgkin’s lymphoma. Leuk Lymphoma. 1993. N10. p.387-393. THELLIN О. et al, Housekeeping genes as internal standards: use and limits. Journal of Biotechnology. 1999. N75. p.291-295 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2587540C1 (en) * 2015-08-06 2016-06-20 Общество с ограниченной ответственностью "АБВ-ТЕСТ" Method of diagnosing condition of immune system of patient and set of primers, probes and standard samples for quantitative estimation of dna molecules trec, krec and number of genome equivalents of dna
RU2731062C1 (en) * 2019-10-22 2020-08-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России) METHOD FOR DETERMINING EXPRESSION LEVEL OF GENE CODING 1L-1β IN RABBIT EYE TISSUES (ORYCTOLAGUS CUNICULUS), AND KIT FOR IMPLEMENTATION THEREOF
RU2750940C1 (en) * 2020-08-07 2021-07-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России) Method for determining level of expression of gene encoding ccl-2 in tissues of eye of rabbit oryctolagus cuniculus, and kit for its determination

Also Published As

Publication number Publication date
RU2012141458A (en) 2014-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20160340728A1 (en) Single-cell nucleic acid analysis
AU2012236880B2 (en) Telomere length measurement in formalin-fixed, paraffin embedded (FFPE) samples by quantitative PCR
JP7389551B2 (en) Detection of MET exon 14 deletion and related treatments
AU2016250529A1 (en) Method to increase sensitivity of next generation sequencing
JP2018501799A (en) Multiplex quantitative PCR
CN111020031A (en) Method for detecting tumor gene mutation by combining sequence specific blocker with specific PCR (polymerase chain reaction) program
JP2021513858A (en) Improved detection of microsatellite instability
Albani et al. Developmental validation of an enhanced mRNA-based multiplex system for body fluid and cell type identification
WO2014143714A2 (en) Methods for one step nucleic acid amplification of non-eluted samples
CN101875971A (en) Rapid detection of BRAF (Block-Repeated Active Flag) gene mutation
RU2522801C2 (en) Method for detecting transcription level of gene coding human chemokine ccl2 (mcp-1) and kit for implementing it
EP3378948B1 (en) Method for quantifying target nucleic acid and kit therefor
EP3617326A1 (en) Method for detecting minor bcr-abl1 gene
US20130171630A1 (en) Methods of using telomeres as markers for aging
CN102424833A (en) Chip and method for real-time PCR (polymerase chain reaction) gene detection at polygenic mutation site
JP7335871B2 (en) Multiplex detection of short nucleic acids
Felkin et al. Real-time quantitative polymerase chain reaction in cardiac transplant research
Shagin et al. Application of nonsense-mediated primer exclusion (NOPE) for preparation of unique molecular barcoded libraries
KR20180104135A (en) A method for diagnosing a disease accompanied by excessive cell death and a kit for performing the method
Zhao et al. Cytochrome c oxidase subunit 1-based human RNA quantification to enhance mRNA profiling in forensic biology
Skrzypczak-Zielinska et al. New analysis method of myotonic dystrophy 1 based on quantitative fluorescent polymerase chain reaction
JP2022521209A (en) Improved Nucleic Acid Target Concentration and Related Methods
Al-Temmemy et al. DETECTION OF A, A-MUTATIONS OF G6PD GENE ON MOLECULAR LEVEL IN IRAQI POPULATION

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20150928