RU2510833C1 - Cell product for treating and correcting hepatic impairment - Google Patents
Cell product for treating and correcting hepatic impairment Download PDFInfo
- Publication number
- RU2510833C1 RU2510833C1 RU2012147531/10A RU2012147531A RU2510833C1 RU 2510833 C1 RU2510833 C1 RU 2510833C1 RU 2012147531/10 A RU2012147531/10 A RU 2012147531/10A RU 2012147531 A RU2012147531 A RU 2012147531A RU 2510833 C1 RU2510833 C1 RU 2510833C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- liver
- cells
- cell
- cell product
- acute
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области регенеративной медицины и клеточных технологий, в частности, к получению клеточных продуктов, компенсирующих функциональную недостаточность печени, и может быть использовано в экстракорпоральных системах детоксикации (биоискусственная печень), а также при непосредственной трансплантации пациентам в заместительной клеточной терапии широкого спектра острых и хронических патологий печени, в том числе для лечения циррозов, острой и хронической печеночной недостаточности, возникающей вследствие вирусных, химических, медикаментозных и иных повреждений печени, а также для восстановления генетических дефектов тканей и органов энтодермального происхождения.The invention relates to the field of regenerative medicine and cellular technologies, in particular, to the production of cellular products that compensate for functional liver failure, and can be used in extracorporeal detoxification systems (bioartificial liver), as well as in direct transplantation to patients in cell replacement therapy for a wide range of acute and chronic liver pathologies, including for the treatment of cirrhosis, acute and chronic liver failure resulting from viral Chemical, pharmacological and other damage to the liver, as well as genetic defects to restore tissues and organs of endodermal origin.
Сложность терапии патологий печени и недостаток донорских органов обуславливают поиск новых альтернативных способов лечения. По данным статистики в Российской Федерации количество пациентов с различными хроническими и острыми заболеваниями печени превосходит 200000 человек в год. Несмотря на достижения современной медицины, лечение хронических и острых патологий печени с использованием стандартных терапевтических приемов оказывается недостаточным, смертность сохраняется на уровне 80-90%. В то же время методики экстракорпоральной детоксикации несовершенны, а системы для восполнения синтетической функции печени практически не разработаны.The complexity of the treatment of liver pathologies and the lack of donor organs determine the search for new alternative methods of treatment. According to statistics in the Russian Federation, the number of patients with various chronic and acute liver diseases exceeds 200,000 people per year. Despite the achievements of modern medicine, the treatment of chronic and acute liver pathologies using standard therapeutic methods is insufficient, mortality remains at the level of 80-90%. At the same time, methods of extracorporeal detoxification are imperfect, and systems for replenishing the synthetic function of the liver are practically not developed.
В связи с дефицитом донорских органов, необходимых для трансплантации печени, а также недостаточной эффективностью и ограниченными возможностями традиционных методов экстракорпоральной детоксикации наибольший интерес в настоящее время представляют клеточные технологии, позволяющие возместить дисфункцию печени посредством инъекции пациенту и/или перфузии регенеративных клеток ex vivo.Due to the shortage of donor organs necessary for liver transplantation, as well as the insufficient efficiency and limited capabilities of traditional methods of extracorporeal detoxification, cellular technologies are currently of greatest interest, allowing to compensate for liver dysfunction by injection of the patient and / or perfusion of regenerative cells ex vivo.
Большое количество накопленных за последние годы данных свидетельствует, что эффективность замещения дефектов тканей и восполнения детоксикационных и синтетических функций поврежденной печени главным образом зависят от используемого в клеточных продуктах типа клеток. Получение в достаточном количестве терминально дифференцированных и функционально активных клеток представляет собой ключевую и первостепенную задачу современной клеточной биологии.A large amount of data accumulated over recent years indicates that the effectiveness of replacing tissue defects and replenishing the detoxification and synthetic functions of a damaged liver mainly depends on the type of cells used in cellular products. Obtaining a sufficient number of terminally differentiated and functionally active cells is a key and paramount task of modern cell biology.
Известен биотрансплантат для лечения хронических диффузных заболеваний печени, цирроза печени и портальной гипертензии, содержащий в физиологическом растворе суспензию смешанной популяции клеток, выделенной из фетальных тканей человека, в которой 40% составляют стволовые клетки, включая стромальные мезенхимные и печеночные бипотентные стволовые клетки, а остальные 60% -прогениторные клетки в различной стадии дифференциации, включая молодые незрелые гепатобласты и клетки-предшественники эритроидного ряда, гемопоэтические клетки, при этом смешанная популяция клеток биотрансплантата характеризуется экспрессией следующих поверхностных маркеров: CD13, CD29, CD44, CD90, CD117 (c-Kit) и отсутствием экспрессии CD34 (RU №2368384, A61K 35/407, опубл. 27.09.2009).Known biotransplant for the treatment of chronic diffuse diseases of the liver, cirrhosis of the liver and portal hypertension, containing in a physiological solution a suspension of a mixed population of cells isolated from human fetal tissues, in which 40% are stem cells, including stromal mesenchymal and hepatic bipotent stem cells, and the remaining 60 % progenitor cells at various stages of differentiation, including young immature hepatoblasts and erythroid progenitor cells, hematopoietic cells, including a mixed population of biotransplantata cells characterized by the expression of the following surface markers: CD13, CD29, CD44, CD90, CD117 (c-Kit) and the lack of expression of CD34 (RU №2368384, A61K 35/407, published 27.09.2009.).
Недостаток известного биотрансплантата заключается в том, что источником клеток являются фетальные ткани человека, получение которых сопряжено с разрушением эмбрионов. Этические проблемы и мораторий на использование человеческих эмбрионов в качестве донорского материала исключает возможность широкого использования указанного биотрансплантата в клинической практике. Кроме того, известный биотрансплантат не обеспечивает эффективную нормализацию показателей функции печени при острой печеночной недостаточности, т.к. не предназначен для использования в аппаратах «искусственная печень».A disadvantage of the known biograft is that the source of cells is human fetal tissues, the production of which is associated with the destruction of embryos. Ethical issues and a moratorium on the use of human embryos as donor material preclude the widespread use of this biograft in clinical practice. In addition, the known biograft does not provide an effective normalization of liver function indices in acute liver failure, because not intended for use in "artificial liver" devices.
Из патента RU 2272638 известен биотрансплантат для лечения хронического гепатита и цирроза печени, который, по одному из вариантов, характеризуется тем, что содержит культуру фетальных гепатоцитов человека из печени эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности, селективно размноженных в условиях культивирования, и представляет собой суспензию клеточной культуры в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн клеток на 1 кг веса пациента. Биотрансплантат по второму варианту исполнения характеризуется тем, что он содержит мезенхимные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала путем дезагрегации ткани с последующим культивированием на ростовой среде, содержащей трансферрин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления гомогенной клеточной культуры с содержанием агрекан- и коллаген II экспрессирующих клеток не менее 80%, и представляет собой суспензию указанных клеток в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн клеток на 1 кг веса пациента (RU №2272638, A61K 35/407, опубл. 27.03.2006).From patent RU 2272638 a biograft is known for the treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis, which, according to one of the options, is characterized by the fact that it contains a culture of human fetal hepatocytes from the liver of human embryos of the 1-2 trimester of pregnancy, selectively propagated under cultivation conditions, and represents a suspension of cell culture in physiological saline with a concentration of cellular elements of 1-15 million cells per 1 kg of patient weight. According to the second embodiment, the biograft is characterized in that it contains mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from fetal, donor or autologous material by tissue disaggregation followed by cultivation on growth medium containing transferrin, insulin, fibroblast growth factor and heparin before the accumulation of homogeneous cell culture with an agrecan- and collagen II-expressing cell content of at least 80%, and is a suspension of these cells in physiological saline with a concentration of cells malign elements 1-15 million cells per 1 kg of patient weight (RU No. 2272638, A61K 35/407, publ. 03/27/2006).
Однако известный биотрансплантат не обладает достаточной терапевтической эффективностью, поскольку входящие в него клеточные компоненты неспособны дифференцироваться при трансплантации в гепатоцитоподобные клетки. В случае использования клеток фетальной ткани существуют морально-этические ограничения и высокий риск злокачественной трансформации эмбриональных клеток. Кроме того, известный биотрансплантат не обеспечивает эффективную нормализацию показателей функции печени при острой печеночной недостаточности, т.к. не предназначен для использования в аппаратах «искусственная печень».However, the known biograft does not have sufficient therapeutic efficacy, since the cellular components included in it are unable to differentiate upon transplantation into hepatocyte-like cells. In the case of using fetal tissue cells, there are moral and ethical limitations and a high risk of malignant transformation of embryonic cells. In addition, the known biograft does not provide an effective normalization of liver function indices in acute liver failure, because not intended for use in "artificial liver" devices.
Известен биологический материал В.Е.Рябинина для искусственной печени, который содержит лиофилизированный цитозоль с микросомальной и митохондриальной фракциями печени, суспендированный в дистиллированной воде. Материал используется в качестве экстракорпоральной "искусственной печени", которая временно и частично обеспечивает обменные процессы между материалом для искусственной печени и кровью пациента с острой печеночной недостаточностью (RU №2135194, A61K 35/407, опубл. 27.08.1999).Known biological material of V.E. Ryabinin for an artificial liver, which contains a lyophilized cytosol with microsomal and mitochondrial fractions of the liver, suspended in distilled water. The material is used as an extracorporeal "artificial liver", which temporarily and partially provides metabolic processes between the material for the artificial liver and the blood of a patient with acute liver failure (RU No. 2135194, A61K 35/407, published on 08.27.1999).
Недостатком аналога является то, что лиофилизированный цитозоль с микросомальной и митохондриальной фракциями печени позволяет лишь временно восполнить детоксикационную функцию печени, но неспособен к восполнению синтетических функций печени, в связи с чем известный аналог не обладает достаточной терапевтической эффективностью и непригоден для лечения и коррекции хронической печеночной недостаточности.The disadvantage of the analogue is that the lyophilized cytosol with microsomal and mitochondrial fractions of the liver can only temporarily replenish the detoxification function of the liver, but is unable to replenish the synthetic functions of the liver, and therefore the known analogue does not have sufficient therapeutic efficacy and is unsuitable for the treatment and correction of chronic liver failure .
Также известна биоискусственная печень для экстракорпоральной системы очистки, характеризующаяся тем, что содержит живые гепатоциты свиньи или человека на коллагеновом микроносителе (US6858146, A61F 2/02, опубл. 22.02.2005).A bioartificial liver for an extracorporeal purification system is also known, characterized in that it contains live pig or human hepatocytes on a collagen microcarrier (US6858146, A61F 2/02, publ. 02.22.2005).
Однако известная биоискусственная печень может вызвать серьезную реакцию иммунной системы пациента (от аллергии до анафилактического шока), поскольку содержит гепатоциты свиньи, синтезирующие ксеногенные белки. Помимо этого использование тканей животных может нести риск заражения ксеногенными инфекционными заболеваниями. В случае использования гепатоцитов человека возникает проблема недостатка донорской печени, а также невозможность использования гепатоцитов в аутологичном варианте, так как пациент с печеночной недостаточностью не может быть донором. Кроме того, известная биоискусственная печень не предназначена для лечения и коррекции хронической печеночной недостаточности.However, the well-known bio-artificial liver can cause a serious reaction of the patient's immune system (from allergies to anaphylactic shock), because it contains pig hepatocytes that synthesize xenogenic proteins. In addition, the use of animal tissue may carry the risk of infection with xenogenic infectious diseases. In the case of the use of human hepatocytes, the problem of a lack of a donor liver arises, as well as the impossibility of using hepatocytes in an autologous version, since a patient with liver failure cannot be a donor. In addition, the well-known bio-artificial liver is not intended for the treatment and correction of chronic liver failure.
Наиболее близким аналогом является трансплантат для лечения печеночной недостаточности, включающий гетерогенный биосовместимый биодеградируемый гель на основе коллагена, имеющий общий объем не менее 0,1 мл и наименьший линейный размер не менее 0,2 мм, размеры пор 30-500 мкм, суммарную пористость 50-98%, посаженные на него аутологичные прогениторные клетки костного мозга после их культивирования in vitro и культивированные аутологичные клетки печени, причем концентрация клеток печени и костного мозга 2×106-15×106 клеток на 1 см3 гетерогенного геля и соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4 (RU №2425645, А61В 17/00, опубл. 10.08.2011).The closest analogue is a transplant for the treatment of liver failure, including a heterogeneous biocompatible biodegradable collagen-based gel, with a total volume of at least 0.1 ml and the smallest linear size of at least 0.2 mm, pore sizes of 30-500 microns, total porosity of 50- 98% planted on it, autologous bone marrow progenitor cells after their culture in vitro and cultured autologous liver cells, the concentration of liver and bone marrow cells 2 × 10 June -15 × 10 6 cells per 1 cm 3 and heterogeneous gel ootnoshenie bone marrow cells to liver cells from 1: 1 to 1: 4 (RU №2425645, A61V 17/00, published on 10.08.2011.).
Однако ближайший аналог не обладает достаточной терапевтической эффективностью, поскольку введение гепатоцитов позволяет только временно улучшить функцию печени, не влияя существенным образом на процессы репарации поврежденной печеночной паренхимы. Помимо этого взятие биоптатов костного мозга и печени - травматичная и болезненная процедура, которую не всегда можно провести пациенту с печеночной недостаточностью. Кроме того, известный клеточный продукт не обеспечивает эффективную нормализацию показателей функции печени при острой печеночной недостаточности, т.к. не предназначен для использования в аппаратах «искусственная печень».However, the closest analogue does not have sufficient therapeutic efficacy, since the introduction of hepatocytes only temporarily improves liver function, without significantly affecting the repair processes of damaged hepatic parenchyma. In addition, taking bone marrow and liver biopsy samples is a traumatic and painful procedure that can not always be performed on a patient with liver failure. In addition, the well-known cell product does not provide an effective normalization of liver function indices in acute liver failure, because not intended for use in "artificial liver" devices.
Задачей изобретения является разработка клеточного продукта на основе стволовых клеток взрослого человека, который позволит обеспечить эффективное восполнение недостатка синтетической и детоксикационной функций печени при острой и хронической печеночной недостаточности при его использовании как в аппаратах типа «искусственная печень», так и при непосредственной трансплантации в поврежденную печень.The objective of the invention is to develop a cell product based on stem cells of an adult, which will provide effective compensation for the lack of synthetic and detoxification functions of the liver in acute and chronic liver failure when used both in devices such as "artificial liver", and during direct transplantation into a damaged liver .
Еще одной задачей является получение стволовых клеток человека из легкодоступного источника, способных к терминальным стадиям гепатоцитарной дифференцировки и поддержанию дифференцированного состояния в течение длительного периода времени при использовании клеточного продукта in vivo (при введении в организм) или ex vivo (в экстракорпоральной печени).Another objective is to obtain human stem cells from an easily accessible source, capable of terminal stages of hepatocytic differentiation and maintaining a differentiated state for a long period of time when using the cell product in vivo (when introduced into the body) or ex vivo (in extracorporeal liver).
Технический результат изобретения заключается в расширении спектра действия и повышении функциональной и репаративной активности клеточного продукта для лечения и коррекции печеночной недостаточности.The technical result of the invention is to expand the spectrum of action and increase the functional and reparative activity of the cell product for the treatment and correction of liver failure.
Технический результат достигается за счет используемой популяции протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, способной дифференцироваться в составе клеточного продукта в функционально активные гепатоцитоподобные клетки, что позволяет нормализовать функции печени при острой или хронической печеночной недостаточности и в свою очередь повышает эффективность использования заявленного клеточного продукта для регенерации и детоксикации пораженной печени как in vivo (при трансплантации в организм), так и ех vivo (в экстракорпоральной печени).The technical result is achieved due to the used population of ductal stem cells of the submandibular salivary gland, which is able to differentiate in the composition of the cell product into functionally active hepatocyte-like cells, which allows normalizing liver function in acute or chronic liver failure and, in turn, increases the efficiency of using the claimed cell product for regeneration and detoxification of the affected liver both in vivo (during transplantation into the body) and ex vivo (in extracorporeal Flax liver).
Все указанное позволит повысить качество лечения дефектов печени различной этиологии, сократить сроки лечения и риски возникновения осложнений за счет длительного и адекватного улучшения функциональной и репаративной активности клеток.All of the above will improve the quality of treatment of liver defects of various etiologies, reduce treatment time and the risks of complications due to a long and adequate improvement in the functional and reparative activity of cells.
Сущность изобретения заключается в следующем.The invention consists in the following.
Клеточный продукт для лечения и коррекции печеночной недостаточности содержит стволовые клетки взрослого человека в коллагеновом геле и отличается тем, что из стволовых клеток он содержит популяцию протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, обработанных вальпроевой кислотой в концентрации 0,1-40 мМ и культивированных в коллагеновом геле, при этом стволовые клетки характеризуются фенотипом CD49f+/EpCAM+ и в процессе обработки вальпроевой кислотой и культивирования в коллагеновом геле изменяют профиль экспрессии на 1AAT+/PEPCK+/G6P+/TDO+/CYP Р4503А13+, а также приобретают способность синтезировать мочевину и альбумин.The cell product for the treatment and correction of liver failure contains adult stem cells in a collagen gel and is distinguished by the fact that from stem cells it contains a population of ductal stem cells of the submaxillary salivary gland treated with valproic acid at a concentration of 0.1-40 mM and cultured in collagen gel while stem cells are characterized by the phenotype CD49f + / EpCAM + and during the treatment with valproic acid and cultivation in a collagen gel, the expression profile is changed to 1AAT + / PEPCK + / G6P + / TDO + / CYP P4503A13 +, and also acquire the ability to synthesize urea and albumin.
Источником исходных стволовых клеток служит подчелюстная слюнная железа взрослого донора, в том числе для аутологичной или аллогенной трансплантации. Взятие клеточного материала может быть проведено легко, без последствий для донора и не связано с этическими проблемами, которые возникают при использовании эмбриональных клеток и различных фетальных тканей.The source of the original stem cells is the submandibular salivary gland of an adult donor, including for autologous or allogeneic transplantation. The capture of cellular material can be carried out easily, without consequences for the donor and is not associated with ethical problems that arise when using embryonic cells and various fetal tissues.
Из уровня техники известно, что энтодермальные протоковые стволовые клетки подчелюстной слюнной железы человека и функционально активные клетки печени принадлежат к одному и тому же зародышевому листку и поэтому могут служить источником стволовых клеток для лечения паренхимных органов. Так, известен способ получения протоковых стволовых клеток из подчелюстной слюнной железы для лечения дисфункций печени (US №7659121, C12N 5/00, опубл. 09.02.2010).It is known from the prior art that endodermal ductal stem cells of the human submandibular salivary gland and functionally active liver cells belong to the same germinal leaf and therefore can serve as a source of stem cells for the treatment of parenchymal organs. So, there is a method of obtaining ductal stem cells from the submandibular salivary gland for the treatment of liver dysfunctions (US No. 7659121, C12N 5/00, publ. 09.02.2010).
Согласно данному методу из слюнной подчелюстной железы человека выделяют стволовые клетки, позитивные по CD49f, которые в процессе дифференциации в гепатоцитарном направлении экспрессируют маркеры HNF-3α, альфа-фетопротеин и альбумин. Предполагается, что полученная популяция клеток способна восстанавливать дефекты тканей печени при трансплантации пациенту.According to this method, stem cells positive for CD49f are isolated from the salivary submandibular gland of a person, which express HNF-3α, alpha-fetoprotein and albumin markers during differentiation in the hepatocytic direction. It is assumed that the resulting cell population is able to repair liver tissue defects during transplantation to the patient.
Однако получить полноценно функционально активные гепатоцитоподобные клетки из этой популяции так и не удалось из-за неустойчивой индукции дифференцировки исходной популяции стволовых клеток в гепатоцитарном направлении.However, it was not possible to fully obtain functionally active hepatocyte-like cells from this population due to the unstable induction of differentiation of the initial stem cell population in the hepatocyte direction.
Изобретательский уровень настоящего изобретения обеспечивается тем, что из протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы была выделена уникальная популяция стволовых клеток, экспрессирующая маркеры CD49f (маркер протоковых клеток) и EpCAM (маркер адгезии эпителиальных клеток), которая достоверно способна к дифференцировке в гепатоцитоподобные клетки с высокой биологической активностью. Обработка вальпроевой кислотой приводит к трансформации клеток в менее дифференцированное состояние и позволяет приблизить их к общему с гепатоцитами клеточному предшественнику. При этом, как было впервые установлено заявителем на моделях in vitro, повышается уровень экспрессии гена Tbx3, необходимого для гепатоцитарной дифференцировки, что обеспечивает упрощение и ускорение процессов последующей трансдифференцировки в гепатоцитарном направлении. Входящий в состав клеточного продукта коллагеновый гель обеспечивает пространственную 3-D ориентацию и приближает клетки к состоянию in vivo, при которых указанная популяция клеток за короткий срок наиболее эффективно дифференцируются до функционально активных гепатоцитоподобных клеток. Кроме того, в заявленном клеточном продукте культивированные в коллагеновом геле клетки способны сохранять дифференцированное состояние и высокую синтетическую и детоксикационную активность в течение длительного периода времени, что обеспечивает эффективность использования клеточного продукта in vivo (при введении в организм) или ex vivo (в экстракорпоральной печени).The inventive step of the present invention is ensured by the fact that a unique population of stem cells expressing CD49f markers (duct cell marker) and EpCAM (epithelial cell adhesion marker), which is reliably capable of differentiating into high hepatocyte-like cells, was isolated from ductal stem cells of the submandibular salivary gland activity. Treatment with valproic acid leads to the transformation of cells into a less differentiated state and allows them to be brought closer to the cellular precursor common with hepatocytes. Moreover, as was first established by the applicant on in vitro models, the level of expression of the Tbx3 gene required for hepatocytic differentiation increases, which simplifies and accelerates the processes of subsequent transdifferentiation in the hepatocytic direction. The collagen gel included in the composition of the cell product provides 3-D spatial orientation and brings the cells closer to the in vivo state, in which the indicated cell population most effectively differentiates into functionally active hepatocyte-like cells in a short time. In addition, in the claimed cell product, collagen gel-cultured cells are able to maintain a differentiated state and high synthetic and detoxification activity for a long period of time, which ensures the efficiency of using the cell product in vivo (when introduced into the body) or ex vivo (in extracorporeal liver) .
Для изготовления клеточного продукта по изобретению предпочтительно используют коллаген I типа, который является основным компонентом межклеточного матрикса печени. При этом предпочтительная концентрация коллагена в геле составляет 3-6%, а исходная концентрация стволовых клеток предпочтительно равна 106-107 клеток на 1 см3 геля.Type I collagen, which is the main component of the intercellular matrix of the liver, is preferably used to make the cell product of the invention. Moreover, the preferred concentration of collagen in the gel is 3-6%, and the initial concentration of stem cells is preferably 10 6 -10 7 cells per 1 cm 3 of gel.
Клеточный продукт по изобретению имеет несколько различных вариантов возможного использования. Так, заявленный клеточный продукт может найти применение при прямой трансплантации в организм пациента в качестве средства заместительной клеточной терапии для восстановления дефектов тканей печени, стимуляции регенерации, восполнения недостаточности функций гепатоцитов и устранения фиброзных осложнений.The cell product of the invention has several different possible uses. So, the claimed cell product can be used for direct transplantation into the patient’s body as a means of cell replacement therapy to repair liver tissue defects, stimulate regeneration, compensate for hepatocyte insufficiency and eliminate fibrotic complications.
Благодаря своей структуре и консистенции клеточный продукт по изобретению не отторгается организмом при трансплантации и не подвергается инкапсуляции в фиброзную капсулу. Выделяемые клетками факторы роста способствуют прорастанию кровеносных сосудов внутрь трансплантата, а структура продукта не препятствует этому процессу. Благодаря этому клетки в составе трансплантата сохраняют жизнеспособность и свои функции. Вследствие того, что клетки в составе трансплантата находятся в 3D условиях, им не нужно время для адаптации к условиям организма и они могут выполнять синтетические и детоксикационные функции сразу после трансплантации. Клеточный продукт помимо этого также активно синтезирует широкий спектр биологически активных веществ, в том числе фактор роста нервов, эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия и др., что может оказывать стимулирующее действие на собственные клетки реципиента.Due to its structure and consistency, the cell product of the invention is not rejected by the body during transplantation and is not encapsulated in a fibrous capsule. Growth factors secreted by cells contribute to the germination of blood vessels inside the graft, and the product structure does not interfere with this process. Due to this, the cells in the graft retain viability and their functions. Due to the fact that the cells in the transplant are in 3D conditions, they do not need time to adapt to the conditions of the body and they can perform synthetic and detoxification functions immediately after transplantation. In addition, the cell product also actively synthesizes a wide range of biologically active substances, including nerve growth factor, epidermal growth factor, endothelial growth factor, etc., which can have a stimulating effect on the recipient's own cells.
Другим возможным вариантом использования клеточного продукта для коррекции и лечения печеночной недостаточности является его применение в экстракорпоральной системе «биоискусственная печень», через которую перфузируется кровь реципиента с пораженной печенью. При быстро развивающейся недостаточности печени заявленный клеточный продукт способен обеспечить стабильность состояния пациента и стимулировать эндогенную регенерацию печени, тем самым позволяя избежать трансплантации донорской печени.Another possible use of the cell product for the correction and treatment of liver failure is its use in the extracorporeal system "bioartificial liver", through which the blood of the recipient with the affected liver is perfused. With rapidly developing liver failure, the claimed cellular product is able to ensure the stability of the patient's condition and stimulate endogenous liver regeneration, thereby avoiding transplantation of the donor liver.
Клеточный продукт по изобретению может быть использован для лечения хронических и острых гепатитов и циррозов печени, развившихся вследствие гепатотропных вирусов (вирусы гепатита B, C, D, G, F, TTV, CMV, EBV), токсического фактора (алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.), метаболических нарушений (гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность α1-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии), аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит) и многих других факторов.The cell product according to the invention can be used to treat chronic and acute hepatitis and cirrhosis of the liver, developed as a result of hepatotropic viruses (hepatitis B, C, D, G, F, TTV, CMV, EBV viruses), toxic factor (alcohol, drugs, industrial substances etc.), metabolic disorders (hemochromatosis, Wilson-Konovalov’s disease, α1-antitrypsin deficiency, type IV glycogenosis, galactosemia, hereditary tyrosinosis, hereditary hyperbilirubinemia), autoimmune diseases (primary biliary cirrhosis, primary sclerosis cholangitis, autoimmune hepatitis) and many other factors.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение клеточного продукта для лечения и коррекции печеночной недостаточности.Example 1. Obtaining a cell product for the treatment and correction of liver failure.
Технология получения клеточного продукта по изобретению предполагает реализацию нескольких этапов, а именно этапа получения популяции энтодермальных стволовых клеток, этапа обработки клеток вальпроевой кислотой и этапа культивирования клеток в коллагеновом геле.The technology for producing a cell product according to the invention involves the implementation of several stages, namely, the stage of obtaining a population of endodermal stem cells, the stage of processing the cells with valproic acid and the stage of culturing cells in a collagen gel.
Этап 1. Получение популяции энтодермальных стволовых клеток из подчелюстной слюнной железы.Stage 1. Obtaining a population of endodermal stem cells from the submandibular salivary gland.
Донорскую ткань (часть подчелюстной слюнной железы размером 0,5-2 см3) переносят в стерильную пробирку со средой DMEM/F12 и гентамицином (40 мкг/мл). Начиная с этого момента работают в стерильных условиях, отвечающих требованиям GMP (Good Manufacturing Practice). После удаления фиброзной капсулы и кровеносных сосудов ткань измельчают, дважды промывают фосфатно-солевым буфером (DPBS), осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 0,8 тыс. об/мин, инкубируют ткань с 4 мг/мл коллагеназы IV типа (всего - 1 мл на 0,5 см3 ткани) в среде DMEM/F12 60 минут при 37°С.Donor tissue (part of the submandibular salivary gland with a size of 0.5-2 cm 3 ) is transferred into a sterile tube with DMEM / F12 medium and gentamicin (40 μg / ml). From this moment, they work under sterile conditions that meet the requirements of GMP (Good Manufacturing Practice). After removing the fibrous capsule and blood vessels, the tissue is crushed, washed twice with phosphate-buffered saline (DPBS), precipitated by centrifugation for 5 minutes at 0.8 thousand rpm, incubated with 4 mg / ml type IV collagenase (total - 1 ml per 0.5 cm 3 tissue) in DMEM / F12 medium for 60 minutes at 37 ° C.
Затем к клеткам добавляют 10 мл полной ростовой среды, содержащей DMEM/F12 1:1, эмбриональную телячью сыворотку (7-20%, оптимально 10%); + глутамин (2 мМ); + 1х инсулин-трансферрин-селенит (ITS) и эпидермальный фактор роста (EGF) (5-80 нг/мл, оптимально 10-20 нг/мл). Взвесь клеток активно пипетируют в течение 5 минут, затем пропускают через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40-100 мкм и осаждают клетки центрифугированием в течение 2 мин при 0,8 тыс. об/мин.Then, 10 ml of a complete growth medium containing DMEM / F12 1: 1, fetal calf serum (7-20%, optimally 10%) was added to the cells; + glutamine (2 mM); + 1x insulin-transferrin-selenite (ITS) and epidermal growth factor (EGF) (5-80 ng / ml, optimally 10-20 ng / ml). A suspension of cells is actively pipetted for 5 minutes, then passed through a nylon filter with a pore diameter of 40-100 μm and the cells are pelleted by centrifugation for 2 minutes at 0.8 thousand rpm.
Далее проводят магнитную сепарацию по маркерам CD49f и EpCAM, для чего полученную суспензию клеток ресуспендируют в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера, инкубируют с первыми антителами (anti-human CD49f и anti-human EpCAM) в течение 30 минут при 4°С, концентрация антител - 1 мкг/106 клеток. Промывают 5 мл фосфатно-солевого буфера и инкубируют с вторыми антителами (коньюгированными с магнитными частицами) в течение 20 минут, далее проводят магнитную сепарацию на колонках по инструкциям производителя. Отсортированные клетки осаждают центрифугированием (5 минут при 300 g), ресуспендируют в полной ростовой среде, подсчитывают. Рассаживают на покрытые коллагеном I типа культуральные чашки из расчета 5×103 клеток на см2. Клетки культивируют при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2.Next, magnetic separation is carried out using the CD49f and EpCAM markers, for which the resulting cell suspension is resuspended in 0.5 ml of phosphate-buffered saline, incubated with the first antibodies (anti-human CD49f and anti-human EpCAM) for 30 minutes at 4 ° C. the concentration of antibodies is 1 μg / 10 6 cells. Wash with 5 ml of phosphate-buffered saline and incubate with second antibodies (conjugated with magnetic particles) for 20 minutes, then carry out magnetic separation on columns according to the manufacturer's instructions. Sorted cells are pelleted by centrifugation (5 minutes at 300 g), resuspended in complete growth medium, counted. Plated on collagen type I coated culture dishes at the rate of 5 × 10 3 cells per cm 2 . Cells are cultured at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 .
Этап 2. Обработка клеток вальпроевой кислотой.Stage 2. Treatment of cells with valproic acid.
При достижении нужного количества клеток (5×107-108) их подвергают воздействию 0,1-40 мМ (оптимально 1 мМ) вальпроевой кислоты в течение 4-6 дней (оптимально 5 дней).Upon reaching the desired number of cells (5 × 10 7 -10 8 ) they are exposed to 0.1-40 mm (optimally 1 mm) of valproic acid for 4-6 days (optimally 5 days).
Этап 3. Культивирование клеток в коллагеновом геле.Stage 3. Cultivation of cells in a collagen gel.
Коллаген типа I (Sigma) растворяют в стерильной 0.1% уксусной кислоте в концентрации 5 мг/мл.Type I collagen (Sigma) is dissolved in sterile 0.1% acetic acid at a concentration of 5 mg / ml.
Клетки после обработки вальпроевой кислотой снимают трипсином и разводят в фосфатно-солевом буфере. В отдельную пробирку добавляют стерильные компоненты в следующей очередности: 0.34 М NaOH (Sigma) до конечной концентрации 0.023 мМ, 7.5% Na2CO3 (ПанЭко) до конечной концентрации 0.26%, 10× DMEM (Sigma) до конечной концентрации 1%, глутамин (Gibco) до конечной концентрации 2 мМ, 100× HEPES (Gibco) до конечной концентрации 1%, эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота (HyClone) до конечной концентрации 10%. Затем добавляют раствор коллагена в уксусной кислоте до конечной концентрации коллагена 4%. После этого 2-3 раза перемешивают и добавляют клетки в фосфатно-солевом буфере исходя из расчета, что конечная концентрация клеток 106-107 клеток на 1 см3 геля.Cells after treatment with valproic acid are removed with trypsin and diluted in phosphate-buffered saline. Sterile components are added to a separate tube in the following order: 0.34 M NaOH (Sigma) to a final concentration of 0.023 mm, 7.5% Na 2 CO 3 (PanEco) to a final concentration of 0.26%, 10 × DMEM (Sigma) to a final concentration of 1%, glutamine (Gibco) to a final concentration of 2 mM, 100 × HEPES (Gibco) to a final concentration of 1%, fetal bovine serum (HyClone) to a final concentration of 10%. A solution of collagen in acetic acid is then added to a final collagen concentration of 4%. After this, mix 2-3 times and add cells in phosphate-buffered saline based on the calculation that the final concentration of cells is 10 6 -10 7 cells per 1 cm 3 of gel.
Помещают гель с клетками в чашки Петри и инкубируют в CO2-инкубаторе при 37°C в течение 30 минут до полного застывания. После полимеризации геля в чашки добавляют эквивалентный объем полной ростовой среды, клетки в геле культивируют в течение 10 суток в CO2-инкубаторе в стандартных условиях, среду меняют каждые 2 дня. После 10 дней инкубации клеток в геле клеточный продукт готов к использованию.Place the gel with cells in Petri dishes and incubate in a CO 2 incubator at 37 ° C for 30 minutes until completely solidified. After polymerization of the gel, an equivalent volume of the complete growth medium is added to the plates, the cells in the gel are cultured for 10 days in a CO 2 incubator under standard conditions, the medium is changed every 2 days. After 10 days of incubation of the cells in the gel, the cell product is ready for use.
Исследование профиля экспрессии и уровня синтеза белков в полученном клеточном продукте в сравнении с гепатоцитами показывает, что исходная популяция клеток в составе клеточного продукта изменяет профиль экспрессии: в них возрастает экспрессия 1AAT, PEPCK, G6P, TDO, CYP P4503A13, что характерно для гепатоцитов. Уровень синтеза мочевины и альбумина клетками слюнной железы в геле достигает уровня синтеза этих веществ гепатоцитами в аналогичных условиях.A study of the expression profile and the level of protein synthesis in the obtained cellular product in comparison with hepatocytes shows that the initial population of cells in the composition of the cellular product changes the expression profile: they increase the expression of 1AAT, PEPCK, G6P, TDO, CYP P4503A13, which is typical for hepatocytes. The level of synthesis of urea and albumin by salivary gland cells in the gel reaches the level of synthesis of these substances by hepatocytes under similar conditions.
Пример 2. Оценка эффективности клеточного продукта для восполнения синтетической функции печени при трансплантации.Example 2. Evaluation of the effectiveness of the cell product to replenish the synthetic function of the liver during transplantation.
Полученный по примеру 1 клеточный продукт трансплантируют самцам мышей C57Black, имеющим хроническую патологию печени, вызванную воздействием четыреххлористого углерода.Obtained in example 1, the cell product is transplanted to male C57Black mice with chronic liver disease caused by exposure to carbon tetrachloride.
Клеточный продукт с размером 0,3 мм3 трансплантируют животным опытной группы в паренхиму печени (по 2 трансплантации на одно животное). В качестве контроля используют гель без клеток аналогичного размера, который трансплантируют животным контрольной группы.A cell product with a size of 0.3 mm 3 is transplanted into animals of the experimental group into the liver parenchyma (2 transplants per animal). As a control, a gel without cells of a similar size is used, which is transplanted into animals of the control group.
В течение последующих 4 недель измеряют биохимические показатели крови опытной и контрольной групп животных. Результаты исследования представлены в табл.1.Over the next 4 weeks, biochemical blood parameters of the experimental and control groups of animals are measured. The results of the study are presented in table 1.
цииDays after transplant
tions
В результате исследования установлено, что в контрольной группе животных наблюдалось значительное увеличение количества билирубина в крови, содержание мочевины и альбумина было пониженным по сравнению с нормальным значением. В течение 4 недель наблюдения биохимические показатели крови животных контрольной группы стабильно улучшались: содержание билирубина снижалось с 204 мкМ и составило в итоге 110 мкМ. В опытной группе снижение концентрации билирубина в крови было более выраженным, концентрация билирубина составила около 54 мкМ к концу наблюдения, что говорит об активной детоксикационной функции введенного препарата. Концентрация мочевины составила около 4 мМ для контрольной группы животных к концу наблюдения и 7 мМ для опытной группы, в то время как у мышей с неповрежденной печенью концентрация мочевины составляет 8 мМ.The study found that in the control group of animals there was a significant increase in the amount of bilirubin in the blood, the content of urea and albumin was reduced compared to the normal value. During 4 weeks of observation, the biochemical blood parameters of the animals of the control group steadily improved: the bilirubin content decreased from 204 μM and amounted to 110 μM. In the experimental group, the decrease in the concentration of bilirubin in the blood was more pronounced, the concentration of bilirubin was about 54 μM at the end of the observation, which indicates an active detoxification function of the administered drug. The urea concentration was about 4 mM for the control group of animals at the end of the observation and 7 mM for the experimental group, while the concentration of urea in mice with intact liver was 8 mM.
Таким образом, клеточный продукт по изобретению способен восполнять недостаточность синтетической функции на уровне гепатоцитов.Thus, the cell product according to the invention is able to compensate for the lack of synthetic function at the level of hepatocytes.
Пример 3. Оценка эффективности клеточного продукта для экстракорпоральной детоксикации.Example 3. Evaluation of the effectiveness of the cell product for extracorporeal detoxification.
Для оценки эффективности полученного по примеру 1 клеточного продукта для экстракорпоральной детоксикации берут сыворотку крови от самцов крыс с патологией печени и пропускают ее через колонку с клеточным продуктом со скоростью 2 мл/мин в CO2 инкубаторе при 37°C и 5% CO2.To evaluate the effectiveness of the cell product obtained in Example 1 for extracorporeal detoxification, blood serum was taken from male rats with liver pathology and passed through a cell product column at a rate of 2 ml / min in a CO 2 incubator at 37 ° C and 5% CO 2 .
В качестве контроля 1 используют сыворотку крови до пропускания через клеточный продукт. В качестве контроля 2 используют гель без клеток.As control 1, use blood serum before passing through the cell product. As control 2, a gel without cells was used.
Результаты эксперимента по детоксикации представлены в табл.2.The results of the detoxification experiment are presented in Table 2.
Как видно из табл.2, после пропускания сыворотки крови через гель без клеток значительного изменения биохимических показателей тестируемых образцов (в сравнении с контролем 1) замечено не было. Показатели альбумина билирубина и мочевины колебались вокруг изначального значения (около 25 г/л, 175 мкМ и 3 мМ соответственно). В то время как в опытной группе наблюдались изменения биохимических показателей крови: 54 г/л альбумина, 95 мкМ билирубина и 6 мМ мочевины, что свидетельствует об эффективности клеточного продукта для использования в аппаратах экстракорпоральной печени.As can be seen from table 2, after passing the blood serum through a gel without cells, a significant change in the biochemical parameters of the tested samples (in comparison with control 1) was not observed. The bilirubin and urea albumin values fluctuated around the initial value (about 25 g / l, 175 μM and 3 mm, respectively). While in the experimental group there were observed changes in blood biochemical parameters: 54 g / l of albumin, 95 μM bilirubin and 6 mm urea, which indicates the effectiveness of the cell product for use in extracorporeal liver apparatuses.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012147531/10A RU2510833C1 (en) | 2012-11-08 | 2012-11-08 | Cell product for treating and correcting hepatic impairment |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012147531/10A RU2510833C1 (en) | 2012-11-08 | 2012-11-08 | Cell product for treating and correcting hepatic impairment |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2510833C1 true RU2510833C1 (en) | 2014-04-10 |
Family
ID=50437662
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012147531/10A RU2510833C1 (en) | 2012-11-08 | 2012-11-08 | Cell product for treating and correcting hepatic impairment |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2510833C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2800017C1 (en) * | 2022-04-20 | 2023-07-14 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр" Российской академии наук ("Томский НИМЦ") | Way to treat liver cirrhosis |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2272638C1 (en) * | 2004-08-18 | 2006-03-27 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) |
| RU2373942C2 (en) * | 2007-12-26 | 2009-11-27 | Федеральное государственное учреждение "Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method for treating chronic and acute renal failure by foetal stem and progenitor cells |
| RU2425645C1 (en) * | 2010-03-18 | 2011-08-10 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method and transplant for treatment of liver failure |
| EP2137300B1 (en) * | 2007-04-26 | 2011-10-26 | Ramot at Tel-Aviv University Ltd. | Pluripotent autologous stem cells from oral or gastrointestinal mucosa |
-
2012
- 2012-11-08 RU RU2012147531/10A patent/RU2510833C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2272638C1 (en) * | 2004-08-18 | 2006-03-27 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) |
| EP2137300B1 (en) * | 2007-04-26 | 2011-10-26 | Ramot at Tel-Aviv University Ltd. | Pluripotent autologous stem cells from oral or gastrointestinal mucosa |
| RU2373942C2 (en) * | 2007-12-26 | 2009-11-27 | Федеральное государственное учреждение "Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method for treating chronic and acute renal failure by foetal stem and progenitor cells |
| RU2425645C1 (en) * | 2010-03-18 | 2011-08-10 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method and transplant for treatment of liver failure |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2800017C1 (en) * | 2022-04-20 | 2023-07-14 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр" Российской академии наук ("Томский НИМЦ") | Way to treat liver cirrhosis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| LU500561B1 (en) | In vitro construction method and use of liver organoids | |
| CN103989710B (en) | Isolated liver stem cells | |
| Wang et al. | Cell-to-cell contact induces mesenchymal stem cell to differentiate into cardiomyocyte and smooth muscle cell | |
| KR101195838B1 (en) | Isolated pluripotent adult stem cells and methods for isolating and cultivating the same | |
| US8455251B2 (en) | Method for isolating and culturing adult stem cells derived from human amniotic epithelium | |
| Kitamura et al. | Establishment and characterization of renal progenitor like cells from S3 segment of nephron in rat adult kidney | |
| EP1948786B1 (en) | Multipotent stem cells derived from human adipose tissue and cellular therapeutic agents comprising the same | |
| CN107012117B (en) | Pluripotent stem cells isolatable from body tissue | |
| US20190367883A1 (en) | Regulating stem cells | |
| JP2008515413A (en) | Identification and isolation of pluripotent cells from non-osteochondral mesenchymal tissue | |
| Deng et al. | Urine-derived stem cells facilitate endogenous spermatogenesis restoration of busulfan-induced nonobstructive azoospermic mice by paracrine exosomes | |
| Choi et al. | Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood | |
| JPWO2015137419A1 (en) | Activator of mesenchymal stem cells, activated mesenchymal stem cells and method for producing the same | |
| CN109893541B (en) | Application of exosome derived from menstrual blood stem cells in preparation of medicine for treating intrauterine adhesion | |
| Tong et al. | Generation of bioartificial hearts using decellularized scaffolds and mixed cells | |
| JP5388297B2 (en) | Adipo cluster | |
| KR20120006386A (en) | Stem cell derived from first trimester placenta and cellular therapeutic agents comprising the same | |
| WO2009080794A1 (en) | Method for preparing cell-specific extracellular matrices | |
| JP2005287479A (en) | Method for extracting tissue stem cell and device using the method | |
| RU2510276C1 (en) | Method for preparing cells for replacement cell therapy of hepatic pathology | |
| CN110090227A (en) | Purposes of the human amnion membrane in treatment graft versus host disease(GVH disease) | |
| Huang et al. | A novel primary culture method for rat choroidal epithelial cells | |
| RU2510833C1 (en) | Cell product for treating and correcting hepatic impairment | |
| JP2023511003A (en) | A differentiation method to secure large numbers of oligodendrocytes by degrading 3D organoids prepared from human pluripotent stem cells | |
| RU2272638C1 (en) | Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) |