RU2470307C1 - Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction - Google Patents
Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2470307C1 RU2470307C1 RU2011145395/10A RU2011145395A RU2470307C1 RU 2470307 C1 RU2470307 C1 RU 2470307C1 RU 2011145395/10 A RU2011145395/10 A RU 2011145395/10A RU 2011145395 A RU2011145395 A RU 2011145395A RU 2470307 C1 RU2470307 C1 RU 2470307C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protective antigen
- dna
- protein
- anthrax
- detection
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к областям медицинской биохимии, диагностической медицинской микробиологии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем, касается разработки нового способа для высокочувствительного определения белка протективного антигена сибирской язвы (РА) в инфицированных образцах биологического происхождения и окружающей среде.The invention relates to biotechnology, specifically to the fields of medical biochemistry, diagnostic medical microbiology, applied immunochemistry and the development of diagnostic test systems, it relates to the development of a new method for the highly sensitive determination of anthrax protective antigen (RA) protein in infected samples of biological origin and the environment.
Основной областью применения предлагаемого способа определения протективного антигена сибирской язвы являются биомедицина, микробиологическая диагностика, микробиологические исследования, разработка средств ранней и высокоэффективной специфической диагностики вирулентного возбудителя сибирской язвы, санитарно-гигиенический контроль за наличием возбудителя сибиреязвенной инфекции в окружающей среде и продуктах животного происхождения, предотвращение угрозы биотерроризма.The main field of application of the proposed method for determining the protective antigen of anthrax are biomedicine, microbiological diagnostics, microbiological studies, the development of early and highly effective specific diagnostics of the virulent causative agent of anthrax, sanitary and hygienic control over the presence of the causative agent of anthrax infection in the environment and animal products, and threat prevention bioterrorism.
Протективный антиген сибирской язвы представляет собой основной компонент экзотоксина, определяющего патогенность токсигенных штаммов грамположительной бактерии Bacillus anthracis, являющейся возбудителем особо опасного инфекционного заболевания сибирской язвы. Мономер РА имеет молекулярную массу 83 кДа. После протеолитической активации на поверхности клетки-хозяина, РА формирует интегрирующий в мембрану гептамер, который транслоцирует токсические ферменты эдема-фактор и летальный фактор в цитозоль, а также способен к транслокации гетерологичных белков [Petosa С., Collier R.J., Klimpel K.R. с соавт. // Nature. - 1997. - V.385, N.6619. - Р.833-838]. Рецептор для РА на поверхности клетки на данный момент не идентифицирован. Изучена третичная структура трансмембранного комплекса протективного антигена, кинетика транспорта веществ через мембранный канал, сформированный гептамером РА, проводились попытки применения этого белка для направленного транспорта лекарственных веществ. Протективный антиген является центральной мишенью для создания противосибиреязвенных вакцин на базе антител, некоторые из которых проходят клинические испытания.Anthrax protective antigen is the main component of exotoxin, which determines the pathogenicity of toxigenic strains of gram-positive bacteria Bacillus anthracis, which is the causative agent of a particularly dangerous anthrax infectious disease. The RA monomer has a molecular weight of 83 kDa. After proteolytic activation on the surface of the host cell, RA forms a heptamer integrating into the membrane, which translocates the toxic enzymes edema factor and lethal factor into the cytosol, and is also capable of translocation of heterologous proteins [Petosa C., Collier R.J., Klimpel K.R. et al. // Nature. - 1997. - V.385, N.6619. - P.833-838]. A receptor for RA on the cell surface has not yet been identified. The tertiary structure of the transmembrane complex of the protective antigen, the kinetics of the transport of substances through the membrane channel formed by the heptamer of RA were studied, attempts were made to use this protein for the targeted transport of drugs. A protective antigen is a central target for the development of antibody-based anti-sirulent vaccines, some of which are undergoing clinical trials.
Особенностью сибиреязвенной инфекции является протекающий практически бессимптомно ранний этап синтеза компонентов сибиреязвенного токсина, включая протективный антиген, и последующий быстрый переход инфицированного организма в так называемую "точку невозврата", при которой эффективность традиционно применяемой терапии антибиотиками не способна скомпенсировать развитие токсической патологии. Экспериментально показано, что концентрация протективного антигена у морских свинок через 24 часа после интраназальной инфекции спорами не превышает 0,1 нг на мл крови и достигает нанограммов только через 30-36 часов, однако, летальный исход возможен уже на вторые-третьи сутки после заражения, кроме того, появление в крови животных РА, как правило, предшествует появлению бактериемии [Kobiler D., Weiss S., Levy H. с соавт. // Infect, and Immun., - 2006. - V.74, N.10, Р.5871-5876]. Ранняя диагностика накопления протективного антигена при сибиреязвенной инфекции и своевременно примененная терапия обеспечивают благоприятный прогноз исхода заболевания. Применение в клинической практике специфичных и высокочувствительных диагностических тест-систем, способных определять крайне низкие (менее 1 нг) концентрации РА на ранних этапах сибиреязвенной инфекции, предотвращает риск летального исхода, а для эффективного предотвращения последствий массовых эпидемий или биотеррористических атак необходима детекция протективного антигена в количестве менее 1-10 пг.A characteristic feature of anthrax infection is the almost asymptomatic early stage of the synthesis of anthrax toxin components, including a protective antigen, and the subsequent rapid transition of the infected organism to the so-called “point of no return”, in which the effectiveness of the traditionally used antibiotic therapy is not able to compensate for the development of toxic pathology. It was experimentally shown that the concentration of protective antigen in guinea pigs 24 hours after intranasal infection with spores does not exceed 0.1 ng per ml of blood and reaches nanograms only 30-36 hours, however, a lethal outcome is possible already on the second or third day after infection, in addition, the appearance in the blood of animals of RA, as a rule, precedes the appearance of bacteremia [Kobiler D., Weiss S., Levy H. et al. // Infect, and Immun., - 2006. - V.74, N.10, P.5871-5876]. Early diagnosis of accumulation of protective antigen in anthrax infection and timely treatment provide a favorable prognosis of the outcome of the disease. The use in clinical practice of specific and highly sensitive diagnostic test systems capable of detecting extremely low (less than 1 ng) RA concentrations in the early stages of anthrax infection prevents the risk of death, and for the effective prevention of the consequences of mass epidemics or bioterrorist attacks, the detection of protective antigen in the amount of less than 1-10 pg.
Высокая специфичность и чувствительность детекции сибиреязвенной инфекции на ранних этапах не достижима способами, традиционно применяемыми на сегодняшний день в медицинской диагностике - иммуноферментным анализом (ИФА) и классической полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Чувствительность наиболее эффективных вариантов ИФА, задействующих флюоресцентные и хемилюминесцентные конъюгаты антител, не превышает 100 пг, а большинство систем ИФА применимо лишь при накоплении в тканях значительного количества патогенной бактерии, что происходит лишь через 50-72 часа после инфекции, то есть при приближении инфицированного организма к "точке невозврата" и к гибели [Mabry R., Brasky K., Geiger R с соавт. // Clin. and Vaccine Immunol. - 2006. - V.13, N.6. - P.671-677]. Специфичность ПЦР-амплификации фрагментов генов B. anthracis и ее потенциал в качестве диагностического инструмента сильно зависимы от качества и количества детектируемой ДНК-матрицы и количества примесей в исследуемых образцах близкородственной ДНК [Janse I., Hamidjaja R.A., Bok J.A., and van Rotterdam B.J. // BMC Microbiology. - 2010. - V.10. - P.314].The high specificity and sensitivity of the detection of anthrax infection in the early stages is not achievable by the methods traditionally used today in medical diagnostics - enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and classical polymerase chain reaction (PCR). The sensitivity of the most effective ELISA variants involving fluorescent and chemiluminescent conjugates of antibodies does not exceed 100 pg, and most ELISA systems are applicable only when a significant amount of the pathogenic bacterium accumulates in the tissues, which occurs only 50-72 hours after infection, i.e. when an infected organism approaches to the "point of no return" and to death [Mabry R., Brasky K., Geiger R et al. // Clin. and Vaccine Immunol. - 2006. - V.13, N.6. - P.671-677]. The specificity of the PCR amplification of B. anthracis gene fragments and its potential as a diagnostic tool are highly dependent on the quality and quantity of the detected DNA matrix and the amount of impurities in the samples of closely related DNA [Janse I., Hamidjaja R.A., Bok J.A., and van Rotterdam B.J. // BMC Microbiology. - 2010. - V.10. - P.314].
Решение проблемы повышения чувствительности анализа в диагностике сибиреязвенной инфекции на ранних этапах осуществляется при помощи ПЦР, проводимой в режиме реального времени, применения масс-спектрометрических методов, использования технологий аптамеров. Несмотря на значительно более высокую чувствительность по сравнению с традиционными методами ИФА и ПЦР, каждый из этих способов детекции имеет ряд существенных ограничений. В случае работы с образцами окружающей среды и биологическими пробами ПЦР-диагностика B.anthracis в режиме реального времени требует тщательного подбора условий реакции, долгой и сложной процедуры предварительной обработки образцов, постоянного дублирования экспериментов и борьбы с фоновыми загрязнениями [Antwerpen M.H., Zimmermann P., Bewley К. с соавт. // Mol. Cell. Probes. - 2008. - V.22. - Р.313-315]. Реакция крайне чувствительна к контаминации и легко приводит к ложноположительным результатам. Масс-спектрометрическая детекция применяется для детекции компонентов токсина сибирской язвы и обладает высокой чувствительностью (1-5 пг) [Boyer А.Е., Gallegos-Candela M., Lins R.C. с соавт. // Molecules. - 2011. - V.16, N.3. - Р.2391-2413], но при широкомасштабном применении для разнородных образцов может оказаться неспецифичной и осложняется необходимостью предварительной очистки мишени, что неизбежно приводит к потерям времени и материала и, таким образом, не может использоваться для ранней диагностики и для количественного определения токсина и его компонентов. Аптамерные системы определения компонентов сибиреязвенного патогена, обладая преимуществом прямого узнавания антигена и, как следствие, высокой скоростью тестирования, на данный момент недостаточно оптимизированы и не имеют достаточной аффинности и специфичности для обеспечения высокой чувствительности разрабатываемых на их основе способов детекции. Нижний порог чувствительности детекции существующими аптамерами протективного антигена составляет 1 нМ [Cella L.N., Sanchez P., Zhong W. с соавт. // Anal. Chem. - 2010. - V.82, N.5. - Р.2042-2047]. На данный момент большинство этих методов выявления ранних стадий сибиреязвенной инфекции находится на стадии экспериментальных разработок и не существуют в виде стандартизованных коммерчески доступных диагностических тест-систем.The solution to the problem of increasing the sensitivity of the analysis in the diagnosis of anthrax infection in the early stages is carried out using real-time PCR, the use of mass spectrometric methods, and the use of aptamer technologies. Despite the significantly higher sensitivity compared to traditional ELISA and PCR methods, each of these detection methods has a number of significant limitations. In the case of working with environmental samples and biological samples, real-time PCR diagnostics of B.anthracis requires careful selection of reaction conditions, a long and complicated pre-treatment of samples, constant duplication of experiments and the control of background pollution [Antwerpen MH, Zimmermann P., Bewley, K. et al. // Mol. Cell. Probes - 2008. - V.22. - R. 313-315]. The reaction is extremely sensitive to contamination and easily leads to false positive results. Mass spectrometric detection is used to detect anthrax toxin components and is highly sensitive (1-5 pg) [Boyer A.E., Gallegos-Candela M., Lins R.C. et al. // Molecules. - 2011 .-- V.16, N.3. - R.2391-2413], but with widespread use for dissimilar samples it may turn out to be nonspecific and complicated by the need for preliminary cleaning of the target, which inevitably leads to loss of time and material and, therefore, cannot be used for early diagnosis and for quantitative determination of toxin and its components. Aptameric systems for determining the components of the anthrax pathogen, having the advantage of direct recognition of the antigen and, as a consequence, the high testing speed, are currently not optimized enough and do not have sufficient affinity and specificity to ensure high sensitivity of the detection methods developed on their basis. The lower threshold of detection sensitivity by existing aptamers of protective antigen is 1 nM [Cella L.N., Sanchez P., Zhong W. et al. // Anal. Chem. - 2010 .-- V.82, N.5. - R. 2042-2047]. At the moment, most of these methods for detecting the early stages of anthrax infection are at the stage of experimental development and do not exist in the form of standardized commercially available diagnostic test systems.
Известен способ детекции, основанный на флюоресцентном иммуноанализе и примененный в коммерчески доступной диагностической тест-системе, одобренной Научной ассоциацией по качеству аналитических инструментов (АОАС) и ориентированной на определение наличия спор сибирской язвы в окружающей среде и биологических образцах ("RAMP Anthrax Test", Response Biomedical Corporation, США), обладающий высокой чувствительностью (предел чувствительности - 4 нг спор). Однако, помимо того, что детекция по этому способу требует наличия специфического оборудования от того же производителя (RAMP Reader), данный способ весьма дорогостоящий, применим лишь к споровой форме бактерии B. anthracis и не пригоден для обнаружения бактерий в вегетативной форме или для детекции компонентов летального токсина на достаточно ранних стадиях заражения с целью проведения своевременной терапии.A known detection method based on fluorescence immunoassay and used in a commercially available diagnostic test system approved by the Scientific Association for the Quality of Analytical Instruments (AOAC) and focused on determining the presence of anthrax spores in the environment and biological samples ("RAMP Anthrax Test", Response Biomedical Corporation, USA), which has a high sensitivity (limit of sensitivity - 4 ng spores). However, in addition to the fact that detection by this method requires specific equipment from the same manufacturer (RAMP Reader), this method is very expensive, applicable only to the spore form of B. anthracis bacteria and is not suitable for detecting bacteria in the vegetative form or for detecting components lethal toxin in the early stages of infection in order to conduct timely therapy.
Известен способ детекции протективного антигена сибирской язвы на основе ИФА ("Anthrax Protective Antigen IgG ELISA", BioQuant, CIIIA), однако, он основан на детекции специфических антител против протективного антигена, которые могут появиться лишь на поздних стадиях инфекции, когда терапия неэффективна.A known method for the detection of anthrax protective antigen by ELISA ("Anthrax Protective Antigen IgG ELISA", BioQuant, CIIIA), however, it is based on the detection of specific antibodies against protective antigen, which can appear only in the late stages of infection when therapy is ineffective.
Известен способ определения инфекции Bacillus anthracis, разработанный на основе ПЦР (производимая НАРВАК "Тест-система для идентификации бактерий вида Bacillus anthracis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), разработанная в РосНИПЧИ "Микроб", г.Саратов, "Тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции", набор для определения сибиреязвенной инфекции на основе ПЦР "Anthrax Bacillus PCR Kit DNA PCR Instrument", Gentaur Molecular Products, США). Недостатком способа определения на основе традиционной ПЦР является долгая и сложная схема пробоподготовки, необходимая для получения воспроизводимых результатов и исключения ложноположительных сигналов, сложность количественной оценки результатов анализа, а также невозможность применения этих систем на ранних стадиях инфекции.A known method for determining the infection of Bacillus anthracis, developed on the basis of PCR (produced by NARVAC "Test system for identification of bacteria of the species Bacillus anthracis by polymerase chain reaction (PCR), developed in RosNIPCHI" Microbe ", Saratov," Test system for DNA detection B. anthracis pX01 + polymerase chain reaction method, Anthrax Bacillus PCR Kit DNA PCR Instrument, anthrax Bacillus PCR Kit for detecting anthrax infection, Gentaur Molecular Products, USA) The disadvantage of the traditional PCR detection method is the long and complicated sample preparation, neo necessary for obtaining reproducible results and elimination of false positive signals, the complexity of quantifying analysis, as well as the inability of these systems in the early stages of infection.
Известен способ определения сибиреязвенной инфекции, основанный на ПЦР, проводимой в режиме реального времени (набор "RealArt™ В. anthracis PCR Kit", Qiagen, США). Данный способ обладает высокой чувствительностью к спорам и вегетативным клеткам сибирской язвы (предел чувствительности детекции до 50 вегетативных клеток или спор), однако он не позволяет детектировать летальный токсин и его компоненты и проводить анализ на ранних стадиях развития заболевания.A known method for determining anthrax infection, based on real-time PCR (set "RealArt ™ B. anthracis PCR Kit", Qiagen, USA). This method is highly sensitive to spores and vegetative anthrax cells (detection limit of up to 50 vegetative cells or spores), however, it does not allow to detect a lethal toxin and its components and to analyze it in the early stages of the disease.
Известен способ определения протективного антигена сибирской язвы, базирующийся на амплификации фрагментов этого гена при помощи ПЦР, проводимой в режиме реального времени ("LightCycler Bacillus anthracis kit; Roche Applied Science, США), он имеет высокую возпроизводимость и чувствительность, однако, этот способ не позволяет количественно определить уровень протективного антигена В. anthracis и, таким образом, не дает представления об уровне угрозы интоксикации.A known method for determining the protective antigen of anthrax, based on the amplification of fragments of this gene using real-time PCR ("LightCycler Bacillus anthracis kit; Roche Applied Science, USA), it has high reproducibility and sensitivity, however, this method does not allow quantitatively determine the level of protective antigen of B. anthracis and, thus, does not give an idea of the level of threat of intoxication.
Известен и активно разрабатывается наиболее технически близкий к заявляемому способ детекции биологических молекул, объединяющий преимущества специфичности иммунологической детекции с высокой чувствительностью полимеразной цепной реакции [US Patent 5665539]. Данный подход, получивший название иммуно-ПЦР, в своем простейшем варианте основан на иммобилизации антигена на твердой фазе с последующей детекцией его при помощи специфического антитела, ковалентно или нековалентно связанного с ДНК-матрицей, позволяющей провести амплификацию сигнала при помощи ПЦР. Оптимизированными вариантами данного способа являются иммобилизация на твердой фазе антитела к одному из эпитопов антигена и последующая детекция антигена антителом к его другому эпитопу [Komatsu M., Kobayashi D., Saito К. с соавт. // Clin. Chem. - 2001. - V.47, N.7. - Р.1297-1301], повышение чувствительности за счет апмлификации ДНК-матрицы при помощи различных вариантов ПЦР в режиме реального времени с применением флюоресцентной метки [Canto C.L., Sumita L.M., Machado A.F. с соавт. // Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. - 2008. - V.50, N.I - P.61-63], внедрение улучшенных конъюгатов и модификаций матриц ДНК [Niemeyer C.M., Wacker R. and Adier M // Nucleic Acids Res. - 2003. - V.31, N.16. - P.90] и др. Способы определения на базе имммуно-ПЦР успешно применялись для детекции различных инфекционных патогенов, в частности, для детекции Шига-токсина патогенных штаммов E.coli [Не X., Qi W., 
Разработка способов детекции сибиреязвенной инфекции или протективного антигена B.anthracis на основе иммуно-ПЦР не проводилась.The development of methods for the detection of anthrax infection or the protective antigen B.anthracis based on immuno-PCR has not been carried out.
Изобретение решает задачу создания высокочувствительного способа идентификации протективного антигена сибирской язвы на основе иммунодетекции, сопряженной с ПЦР в режиме реального времени, применимого для его выявления в образцах биологических жидкостей и тканей на ранних и поздних этапах развития сибиреязвенной инфекции, а также в продуктах питания и окружающей среде, употребимого для работы как с инфекционно опасными, так и с инактивированными пробами.The invention solves the problem of creating a highly sensitive method for identifying anthrax protective antigen based on immunodetection, coupled with real-time PCR, applicable for its detection in samples of biological fluids and tissues at the early and late stages of anthrax infection, as well as in food and the environment used to work with both infectious and inactivated samples.
Поставленная задача решается за счет способа детекции протективного антигена сибирской язвы с помощью пары моноклональных антител, специфичных к белку РА, одно из которых, иммобилизованое на твердом носителе (хроматографических носителях и парамагнитных частицах) за счет взаимодействия с белком G бактерий рода Streptococcus, служит для связывания РА, находящегося в исследуемой пробе, а второе (биотинилированное) антитело детектирует РА и посредством мостика, образованного тетравалентной молекулой нейтравидина, связывается с биотинилированными фрагментами ДНК, используемыми в качестве субстрата для ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени.The problem is solved by a method for detecting anthrax protective antigen using a pair of monoclonal antibodies specific for the RA protein, one of which immobilized on a solid support (chromatographic carriers and paramagnetic particles) due to the interaction of Streptococcus bacteria with protein G serves to bind RA located in the test sample, and the second (biotinylated) antibody detects RA and, through a bridge formed by the tetravalent neutravidin molecule, binds to biotinylated DNA fragments used as a substrate for PCR amplification with fluorescence signal detection in real time.
Также поставленная задача решается за счет применения покрытых белком G бактерий рода Streptococcus хроматографических носителей и парамагнитных частиц, которые позволяют иммобилизовать на поверхности частиц антитело к протективному антигену, провести специфическое связывание РА из жидких образцов, избавиться от содержащихся в образцах загрязнений на ранних этапах эксперимента и провести отделение ДНК-матрицы, применяемой для конечной ПЦР-амплификации, от других компонентов детекционного комплекса.The task is also solved by the use of chromatographic carriers and paramagnetic particles coated with protein G of bacteria of the Streptococcus genus, which allow immobilizing an antibody to a protective antigen on the particle surface, carry out specific binding of RA from liquid samples, get rid of the contaminants contained in the samples at the early stages of the experiment, and separation of the DNA matrix used for the final PCR amplification from other components of the detection complex.
Также поставленная задача решается за счет применения высокоаффинных моноклональных антител, специфичных к различным эпитопам белка РА, в силу чего не происходит конкуренции антител за сайт связывания в структуре белка, что способствует повышению чувствительности детекции.Also, the problem is solved by the use of high-affinity monoclonal antibodies specific for different epitopes of the RA protein, due to which there is no competition of antibodies for the binding site in the protein structure, which increases the sensitivity of detection.
Также поставленная задача решается за счет конъюгата ДНК с нейтравидином, образующего молекулярную "сетку", при использовании которой для детекции возможно увеличить количество матричных молекул ДНК, связанных с единичной молекулой биотинилированного антитела и, таким образом, амплифицировать сигнал.The task is also solved by the conjugate of DNA with neutravidin, forming a molecular "network", using which to detect it is possible to increase the number of matrix DNA molecules associated with a single biotinylated antibody molecule and, thus, amplify the signal.
Также поставленная задача решается за счет блокировки поверхности твердой фазы раствором Денхардт-ДНК, которая препятствует неспецифической сорбции конъюгата ДНК-нейтравидин на поверхности магнитных частиц и пробирок стрипов и снижает вероятность ложноположительных результатов эксперимента.The task is also solved by blocking the surface of the solid phase with a Denhardt-DNA solution, which prevents nonspecific sorption of the DNA-neutravidin conjugate on the surface of magnetic particles and strip tubes and reduces the likelihood of false-positive experimental results.
Также поставленная задача решается за счет отделения ДНК-матрицы, применяемой для конечной ПЦР-амплификации, от прочих компонентов образованного детекционного комплекса посредством обработки специфической эндонуклеазой рестрикции, не нарушающей первичную структуру ДНК и сохраняющей возможность амплификации матричной ДНК в режиме реального времени по методу TaqMan, что способствует снижению фонового сигнала в эксперименте.Also, the problem is solved by separating the DNA matrix used for the final PCR amplification from other components of the formed detection complex by treatment with a specific restriction endonuclease that does not violate the primary DNA structure and retains the ability to amplify matrix DNA in real time using the TaqMan method, which helps to reduce the background signal in the experiment.
Также поставленная задача решается за счет применения в анализе редко встречающейся в окружающей среде ДНК-матрицы, оптимизированной для проведения ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени, что снижает вероятность возникновения ложноположительного сигнала при детекции, позволяет существенно повысить чувствительность метода и провести количественное определение содержания РА в исследуемых образцах.The task is also solved by using a DNA matrix that is rarely found in the environment, which is optimized for real-time PCR amplification with fluorescence detection of the signal, which reduces the likelihood of a false-positive signal during detection, significantly increases the sensitivity of the method, and quantitatively determination of RA content in the studied samples.
Техническим результатом изобретения является создание эффективного высокочувствительного способа детекции протективного антигена сибирской язвы, применимого для нужд клинической диагностики и мониторинга окружающей среды и качества продуктов питания. Отличием предлагаемого способа является осуществление детекции на базе двух специфических моноклональных антител к различным эпитопам белка РА, одно из которых посредством биотин-нейтравидинового взаимодействия связывается с ДНК, служащей матрицей для проведения ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени. С использованием разработанного способа можно детектировать протективный антиген сибирской язвы в концентрации до 0,1 пМ.The technical result of the invention is the creation of an effective highly sensitive method for the detection of protective antigen of anthrax, applicable for the needs of clinical diagnostics and monitoring of the environment and food quality. The difference of the proposed method is the detection based on two specific monoclonal antibodies to different epitopes of the RA protein, one of which, through biotin-neutravidin interaction, binds to DNA, which serves as a matrix for PCR amplification with fluorescence signal detection in real time. Using the developed method, it is possible to detect anthrax protective antigen at a concentration of up to 0.1 pM.
В предлагаемом техническом решении специфичность узнавания РА обеспечивается за счет пары высокоаффинных моноклональных антител, взаимодействующих с различными эпитопами молекулы РА. Это позволяет повысить чувствительность метода и избежать конкуренции антител за один эпитоп на молекуле белка РА. Одно из антител подвергается биотинилированию для последующего присоединения конъюгата ДНК с нейтравидином.In the proposed technical solution, the specificity of recognition of RA is ensured by a pair of high-affinity monoclonal antibodies that interact with various epitopes of the RA molecule. This makes it possible to increase the sensitivity of the method and to avoid competition of antibodies for one epitope on the RA protein molecule. One of the antibodies undergoes biotinylation for subsequent attachment of the DNA conjugate with neutravidin.
Предлагаемое техническое решение предусматривает использование нековалентного конъюгата ДНК с нейтравидином, который представляет собой молекулярную "сетку", образованную за счет взаимодействия биотина, находящегося на 5'-концах двухцепочечного фрагмента ДНК с тетравалентной молекулой нейтравидина. Наиболее эффективным является формирование таких комплексов в эквимолярном соотношении биотинилированной ДНК к белку нейтравидина. Нейтравидин является белком авидинового ряда, характеризующимся высокой специфичностью и эффективностью взаимодействия с биотином. Применение молекулярной "сетки" вместо несвязанных фрагментов биотинилированной ДНК повышает количество ДНК-матрицы, удерживаемой единичной молекулой антитела, и более чем в 10 раз увеличивает чувствительность метода.The proposed technical solution involves the use of a non-covalent conjugate of DNA with neutravidin, which is a molecular "network" formed by the interaction of biotin located at the 5'-ends of a double-stranded DNA fragment with a tetravalent neutravidin molecule. The most effective is the formation of such complexes in the equimolar ratio of biotinylated DNA to neutravidin protein. Neutravidin is an avidin protein characterized by high specificity and effectiveness of interaction with biotin. The use of a molecular "grid" instead of unbound fragments of biotinylated DNA increases the amount of DNA matrix held by a single antibody molecule and increases the sensitivity of the method by more than 10 times.
Существенным условием успешного использования заявленного способа является блокировка свободных валентностей связывания твердой фазы, которая осуществляется пятикратным раствором Денхардт, содержащим 1% ДНК спермы лосося для предотвращения неспецифического связывания с поверхностью конъюгата ДНК-нейтравидин.An essential condition for the successful use of the claimed method is the blocking of free valencies of solid phase binding, which is carried out with a five-fold Denhardt solution containing 1% salmon sperm DNA to prevent non-specific binding to the surface of the DNA-neutravidin conjugate.
Важным достоинством предлагаемого способа определения ПА является применение в качестве носителя комплекса парамагнитных частиц, которые допускают проведение автоматизации этого метода детекции с использованием роботизированных дозаторов и промывочных устройств и минимизирует контакт оператора с потенциально инфицированным материалом. Кроме парамагнитных частиц предпочтительными матрицами для иммобилизации антитела к РА являются: 1) немагнитные пористые и непористые полимерные микросферы и микрочастицы; 2) хроматографические носители; 3) микрочастицы, образуемые коллоидным золотом; 4) квантовые точки; 5) пористые и непористые полимерные поверхности; 6) рабочие поверхности биосенсоров.An important advantage of the proposed method for determining PA is the use of a complex of paramagnetic particles as a carrier, which allow the automation of this detection method using robotic dispensers and flushing devices and minimizes operator contact with potentially infected material. In addition to paramagnetic particles, preferred matrices for immobilizing antibodies to RA are: 1) non-magnetic porous and non-porous polymer microspheres and microparticles; 2) chromatographic media; 3) microparticles formed by colloidal gold; 4) quantum dots; 5) porous and non-porous polymer surfaces; 6) working surfaces of biosensors.
К преимуществам заявленного способа определения протективного антигена сибирской язвы относятся: 1) высокая чувствительность метода, позволяющая провести диагностику накопления белка протективного антигена на ранних стадиях заражения сибирской язвой, своевременно начать терапию инфицированного, предотвратить возможность возникновения эпидемии или нейтрализовать последствия биотеррористической атаки; 2) гомологичность заявленного метода в части реагентов, материалов и оборудования стандартному иммуноферментному анализу и технологиям ПЦР-диагностики, применяемым в клинической практике; 3) высокая специфичность детекции РА, обеспечивающаяся примененным принципом иммунодетекции, и низкая вероятность получения ложноположительных сигналов по сравнению со стандартными методами ПЦР-диагностики; 4) возможность проведения быстрого автоматизированного анализа большого количества образцов; 5) дешевизна большинства используемых в анализе материалов; 6) возможность экстраполяции разработанного способа для детекции любых других патогенных и непатогенных молекул при подборе соответствующей пары специфических моноклональных детектирующих антител.The advantages of the claimed method for determining the protective antigen of anthrax include: 1) high sensitivity of the method, which allows to diagnose the accumulation of protein of protective antigen in the early stages of infection of the anthrax, to start therapy of an infected person in a timely manner, to prevent the possibility of an epidemic or to neutralize the effects of a bioterrorist attack; 2) the homology of the claimed method in terms of reagents, materials and equipment to standard enzyme immunoassay and PCR diagnostic technologies used in clinical practice; 3) the high specificity of RA detection, which is ensured by the applied principle of immunodetection, and the low probability of receiving false-positive signals compared to standard PCR diagnostic methods; 4) the ability to conduct rapid automated analysis of a large number of samples; 5) the cheapness of most materials used in the analysis; 6) the possibility of extrapolating the developed method for the detection of any other pathogenic and non-pathogenic molecules when selecting the appropriate pair of specific monoclonal detecting antibodies.
Изобретение осуществляют следующим образом:The invention is as follows:
Моноклональное антитело, специфичное к белку протективного антигена сибирской язвы, связывают на парамагнитных частицах за счет взаимодействия с иммобилизованным на их поверхности белком G бактерий рода Streptococcus. Свободные валентности поверхности планшета и парамагнитных частиц блокируют пятикратным раствором Денхардт, содержащим 1% ДНК спермы лосося. Троекратно промывают планшет и частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА.Monoclonal antibody specific for anthrax protective antigen protein is bound on paramagnetic particles due to interaction with Streptococcus bacteria G protein immobilized on their surface. The free valencies of the surface of the tablet and paramagnetic particles are blocked with a five-fold Denhardt solution containing 1% salmon sperm DNA. The tablet and particles are washed three times with a solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM sodium chloride and 5 mM EDTA.
Проводят подготовку проб инфицированного биологического материала или образцов окружающей среды и продуктов питания. Для этого биологические жидкости центрифугируют для освобождения от клеточного дебриса и добавляют к супернатанту 1/10 раствора, содержащего 200 мМ трис-HCl, 1 М хлорида натрия и 50 мМ ЭДТА. Твердые образцы продуктов питания и почвы гомогенизируют с раствором, содержащим 40 мМ трис-HCl рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия и 10 мМ ЭДТА, и инкубируют при встряхивании на шейкере в течение 10 минут, после чего удаляют твердые частицы центрифугированием.Samples of infected biological material or environmental and food samples are prepared. For this, biological fluids are centrifuged to release cell debris and 1/10 of a solution containing 200 mM Tris-HCl, 1 M sodium chloride and 50 mM EDTA is added to the supernatant. Solid food and soil samples are homogenized with a solution containing 40 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM sodium chloride and 10 mM EDTA, and incubated with shaking on a shaker for 10 minutes, after which the solids are removed by centrifugation.
Подготовленные пробы инкубируют с антителом, иммобилизованным на поверхности парамагнитных частиц в течение 1 часа. После трехкратной промывки частиц раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА, к ним добавляют биотинилированное антитело и инкубируют парамагнитные частицы с биотинилированным антителом при комнатной температуре со встряхиванием в течение 30 минут, после чего повторяют промывку парамагнитных частиц.The prepared samples are incubated with an antibody immobilized on the surface of paramagnetic particles for 1 hour. After washing the particles three times with a solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM sodium chloride and 5 mM EDTA, they add biotinylated antibody and incubate the paramagnetic particles with biotinylated antibody at room temperature with shaking for 30 minutes, after which washing the paramagnetic particles is repeated.
К связанному на поверхности парамагнитных частиц сэндвичу "антитело-протективный антиген-биотинилированное антитело" добавляют раствор нековалентного конъюгата ДНК с нейтравидином (молекулярная "сетка") и инкубируют парамагнитные частицы с конъюгатом в течение 30 минут. Промывку поверхности частиц от не связавшегося конъюгата с ДНК проводят раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия.An antibody-protective antigen-biotinylated antibody sandwich bound to the surface of paramagnetic particles is added with a solution of a non-covalent DNA conjugate with neutravidin (molecular "network") and paramagnetic particles with the conjugate are incubated for 30 minutes. The surface of the particles was washed from an unbound DNA conjugate with a solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM sodium chloride.
После полного удаления промывочного раствора в лунки планшета или пробирки стрипа добавляют буферный раствор для эндонуклеазы рестрикции Sac I, содержащий фермент Sac I в концентрации 50 ед/мл. Рестрикцию проводят при 37°С в течение 1 часа, затем помещают планшет на магнитную плату для фиксации частиц за счет магнитного взаимодействия и переносят супернатант из лунок планшета в пробирки для ПЦР.After complete removal of the wash solution, Sac I restriction endonuclease buffer containing Sac I enzyme at a concentration of 50 u / ml is added to the wells of the plate or strip tube. Restriction is carried out at 37 ° C for 1 hour, then the plate is placed on a magnetic plate to fix the particles due to magnetic interaction and the supernatant is transferred from the plate wells to PCR tubes.
В пробирки для ПЦР, содержащие продукты рестрикции, отобранные с парамагнитных частиц, обработанных рестриктазой Sac I, вносят 10 объемов смеси для амплификации, содержащей буфер для ПЦР-амплификации, праймеры, рекомбинантную Taq-полимеразу и пробу TaqMan для проведения реакции ПЦР в режиме реального времени. Детекция флюоресцентного сигнала проводится при температуре отжига праймеров 57°С и времени элонгации 1 минута с использованием прибора для ПЦР в режиме реального времени в течение 50 циклов амплификации.10 volumes of an amplification mixture containing a buffer for PCR amplification, primers, a recombinant Taq polymerase and a TaqMan sample for real-time PCR reaction are added to PCR tubes containing restriction products taken from paramagnetic particles treated with Sac I restrictase. . The fluorescence signal is detected at an annealing temperature of primers of 57 ° C and an elongation time of 1 minute using a real-time PCR device for 50 amplification cycles.
Отрицательные контрольные значения флюоресценции фиксируются в лунках планшета или пробирках в составе стрипа, не содержащих тестируемых образцов. Положительные контрольные значения флюоресценции регистрируются в лунках или пробирках, содержащих фиксированные количества белка протективного антигена сибирской язвы, взятого в известной концентрации. Принципиальная схема осуществления изобретения приведена на фиг.1. Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:Negative fluorescence control values are recorded in the wells of the tablet or tubes in the composition of the strip that do not contain test samples. Positive fluorescence control values are recorded in wells or test tubes containing fixed amounts of anthrax protective antigen protein taken at a known concentration. A schematic diagram of an embodiment of the invention is shown in figure 1. The invention is illustrated by the following graphic materials:
Фиг.1. Схема постановки эксперимента при определении протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Figure 1. The scheme of the experiment in determining the protective antigen of anthrax by immunodetection, coupled with PCR amplification.
Фиг.2. Последовательность ДНК, используемая при определении протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. Последовательности ДНК, соответствующие олигонуклеотидам, использованным для амплификации фрагмента, сайтам эндонуклеазы рестрикции SacI и пробе TaqMan, примененной для проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени, выделены подчеркиванием. Последовательности ДНК, соответствующие олигонуклеотидам, использованным для детекции фрагмента ПЦР в режиме реального времени, выделены жирным шрифтом.Figure 2. The DNA sequence used to determine the anthrax protective antigen by immunodetection coupled to PCR amplification. DNA sequences corresponding to the oligonucleotides used to amplify the fragment, SacI restriction endonuclease sites and the TaqMan sample used for real-time PCR amplification are underlined. DNA sequences corresponding to the oligonucleotides used to detect a real-time PCR fragment are shown in bold.
Фиг.3. Последовательности олигонуклеотидов, используемых для приготовления конъюгата ДНК-матрицы с нейтравидином и проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени. На фиг.3 представлены последовательности пробы TaqMan, биотинилированных праймеров, использованных для наработки ДНК-матрицы, конъюгированной с нейтравидином, и праймеров, примененных для проведения реакции ПЦР в режиме реального времени с пробой TaqMan. Проба TaqMan содержит на 5'-конце карбоксифлюоресцеин (FAM), а на 3'-конце гаситель флюоресценции RTQ1 (разработка компании Syntol, Россия).Figure 3. The sequence of oligonucleotides used to prepare the conjugate of the DNA template with neutravidin and real-time PCR amplification. Figure 3 presents the sequence of the TaqMan sample, biotinylated primers used to generate the DNA matrix conjugated with neutravidin, and primers used to conduct real-time PCR reaction with TaqMan sample. The TaqMan sample contains carboxyfluorescein (FAM) at the 5'-end, and RTQ1 fluorescence quencher (developed by Syntol, Russia) at the 3'-end.
Фиг.4. Получение конъюгата биотинилированной ДНК с нейтравидином для определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле комплексов биотинилированной ДНК с нейтравидином, сформированных при различном молярном соотношении ДНК к нейтравидину. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы #SM1163 (Fermentas), 2 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 1:2, 3 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 2:1, 4 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 1:1.Figure 4. Obtaining a conjugate of biotinylated DNA with neutravidin to determine the protective antigen of anthrax by immunodetection coupled with PCR amplification. The results of polyacrylamide gel electrophoresis of complexes of biotinylated DNA with neutravidin, formed at different molar ratios of DNA to neutravidin. Lane 1 - molecular weight marker # SM1163 (Fermentas), 2 - molar ratio of DNA to neutravidin 1: 2, 3 - molar ratio of DNA to neutravidin 2: 1, 4 - molar ratio of DNA to neutravidin 1: 1.
Фиг.5. Типичные результаты определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией в режиме реального времени. Результаты измерения флюоресценции в реакции ПЦР-амплификации по методу TaqMan в режиме реального времени при определении протективного антигена по способу иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. По вертикальной оси изложены значения флюоресценции в единицах, по горизонтальной оси представлено количество циклов ПЦР-амплификации. Кривая 1 - положительный контроль (образец с концентрацией РА 100 рМ), кривая 2 - отрицательный контроль (образец, не содержащий РА), кривые 3-8 - экспериментальные образцы с различным содержанием РА.Figure 5. Typical results of determining the anthrax protective antigen by immunodetection, coupled with real-time PCR amplification. The results of fluorescence measurements in the reaction of PCR amplification according to the TaqMan method in real time when determining the protective antigen by the method of immunodetection coupled with PCR amplification. The vertical axis shows the fluorescence values in units; the horizontal axis represents the number of PCR amplification cycles.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.For a better understanding of the invention, the following are examples of its specific implementation.
Пример 1. Получение биотинилированного антитела для определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 1. Obtaining biotinylated antibodies to determine the protective antigen of anthrax by immunodetection, coupled with PCR amplification.
Выделение антител для детекции протективного антигена сибирской язвы проводят из асцитной жидкости. Отобранную асцитную жидкость подвергают центрифугированию при 10000 об/мин в течение 15 минут для удаления клеточного дебриса. К полученному супернатанту добавляют равный объем буфера, содержащего 40 мМ трис-HCl рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия, и проводят высаливание антитела из раствора добавлением насыщенного сульфата аммония до концентрации 50%, а затем выдерживают сульфатный раствор в течение 1 часа при температуре +4°С для формирования осадка. Полученный сульфатный осадок собирают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 15 минут и растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия. Полученный белковый раствор центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 минут для удаления нерастворенных примесей и наносят на колонку Protein G (GE Healthcare, США), уравновешенную 10 объемами буфера, использованного для растворения белка. Колонку промывают 10 объемами того же буфера для удаления не связавшегося белка и элюируют белок антитела раствором, содержащим 100 мМ глицин-HCl рН 2,6 и 100 мМ хлорида натрия. Приводят значение рН раствора к 8.0 добавлением раствора 1 М триса-основание с использованием рН-бумаги. Определяют концентрацию полученного белка антитела спектрофотометрически и анализируют его чистоту электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле по методике Laemmli.Isolation of antibodies for the detection of anthrax protective antigen is carried out from ascites fluid. The collected ascites fluid was centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes to remove cell debris. An equal volume of buffer containing 40 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM sodium chloride was added to the obtained supernatant, and the antibody was salted out of the solution by adding saturated ammonium sulfate to a concentration of 50%, and then the sulfate solution was kept for 1 hour at a temperature + 4 ° C to form a precipitate. The resulting sulfate precipitate was collected by centrifugation at 12000 rpm for 15 minutes and dissolved in a buffer containing 50 mm Tris-HCl pH 7.5, 100 mm sodium chloride. The resulting protein solution was centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes to remove undissolved impurities and applied to a Protein G column (GE Healthcare, USA), balanced with 10 volumes of buffer used to dissolve the protein. The column is washed with 10 volumes of the same buffer to remove unbound protein and the antibody protein is eluted with a solution containing 100 mM glycine-HCl pH 2.6 and 100 mM sodium chloride. The pH of the solution is adjusted to 8.0 by adding a solution of 1 M Tris-base using pH paper. The concentration of the obtained antibody protein is determined spectrophotometrically and its purity is analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis according to the Laemmli method.
Полученный белок антитела троекратно диализуют против 100 объемов фосфатного буфера, содержащего 20 мМ Na2HPO4 и 100 мМ хлорида натрия для удаления аминогрупп. Готовят раствор NHS-биотина в DMSO из расчета 1 мг/мл и добавляют полученный раствор к раствору антитела в объемном соотношении 1:8. Проводят реакцию биотинилирования при +4°С в течение ночи со встряхиванием и троекратно диализуют против 100 объемов фосфатного буфера, содержащего 20 мМ Na2HPO4 и 100 мМ хлорида натрия для удаления не связавшегося биотина.The resulting antibody protein is dialyzed three times against 100 volumes of phosphate buffer containing 20 mM Na 2 HPO 4 and 100 mM sodium chloride to remove amino groups. Prepare a solution of NHS-Biotin in DMSO at the rate of 1 mg / ml and add the resulting solution to the antibody solution in a volume ratio of 1: 8. The biotinylation reaction is carried out at + 4 ° C overnight with shaking and dialysed three times against 100 volumes of phosphate buffer containing 20 mM Na 2 HPO 4 and 100 mM sodium chloride to remove unbound biotin.
Полноту биотинилирования контролируют постановкой иммуноблота с детекцией биотинилированного антитела конъюгатом нейтравидин-пероксидаза (Pierce, США).The completeness of biotinylation is monitored by setting up an immunoblot with detection of a biotinylated antibody by a neutravidin peroxidase conjugate (Pierce, USA).
Пример 2. Приготовление проб для определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 2. The preparation of samples to determine the protective antigen of anthrax by immunodetection, coupled with PCR amplification.
Подготовку проб инфицированного биологического материала проводят следующим образом. Отобранные образцы биологических жидкостей (кровь, моча, слюна) центрифугируют при 5000 об/мин и температуре +4°С для освобождения от клеточного дебриса, отбирают супернатант и повторно центрифугируют его при 10000 об/мин в течение 15 минут. К супернатанту добавляют 1/10 стерильного раствора, содержащего 200 мМ трис-HCl, 1 М хлорида натрия и 50 мМ ЭДТА.Samples of infected biological material are prepared as follows. Selected samples of biological fluids (blood, urine, saliva) are centrifuged at 5000 rpm and a temperature of + 4 ° C to release cell debris, the supernatant is taken and centrifuged again at 10000 rpm for 15 minutes. 1/10 sterile solution containing 200 mM Tris-HCl, 1 M sodium chloride and 50 mM EDTA was added to the supernatant.
К образцам биологических тканей, почвы и продуктов питания добавляют раствор, содержащий 40 мМ трис-HCl рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия и 10 мМ ЭДТА из расчета один объем раствора (в мл) на одну единицу массы твердого образца (в г) и растирают в гомогенизаторе Дунса (20 ударов плотно прилегающего пестика) во льду. Полученный однородный гомогенат встряхивают на шейкере при температуре +4°С в течение 10 минут и удаляют твердые частицы центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 минут.A solution containing 40 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM sodium chloride and 10 mM EDTA is added to samples of biological tissues, soil and food products based on one solution volume (in ml) per unit mass of solid sample (in g) and triturated in a Duns homogenizer (20 strokes of a tight-fitting pestle) in ice. The resulting homogeneous homogenate is shaken on a shaker at a temperature of + 4 ° C for 10 minutes and solids are removed by centrifugation at 10,000 rpm for 15 minutes.
В случае необходимости проводят уничтожение в образцах жизнеспособных клеток и спор возбудителя сибирской язвы прогревом при 95°С в течение 1 часа.If necessary, killing of viable cells and spores of the anthrax pathogen in samples is carried out by heating at 95 ° C for 1 hour.
Подготовленные образцы хранят при температуре +4°С в течение 4 часов до проведения анализа или замораживают при -70°С для длительного хранения.Prepared samples are stored at a temperature of + 4 ° C for 4 hours prior to analysis or frozen at -70 ° C for long-term storage.
Пример 3. Приготовление конъюгата биотинилированной ДНК с нейтравидином для определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 3. The preparation of a conjugate of biotinylated DNA with neutravidin to determine the protective antigen of anthrax by immunodetection, coupled with PCR amplification.
В качестве ДНК для получения конъюгата с нейтравидином и матрицы для последующей ПЦР-амплификации в режиме реального времени используют фрагмент геномной ДНК Fusarium avenaceum длиной 747 пар оснований (фиг.2). Праймеры для амплификации фрагмента на 5'-концах модифицируют биотином (фиг.3). Наработку биотинилированного фрагмента ДНК проводят ПЦР амплификацией при помощи Taq-полимеразы при температуре отжига праймеров 56°С и времени элонгации фрагмента 1 минута. Продукты ПЦР-реакции осаждают 3 объемами этанола с добавлением 1/10 объема ацетата натрия рН 5,2 и растворяют в 0,5 мл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl рН 7,5 и 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. Раствор ДНК центрифугируют для удаления нерастворенных примесей и наносят на гель-фильтрационную колонку Superdex-200 (GE-Healthcare, Великобритания), уравновешенную тем же буфером, для удаления побочных продуктов синтеза и не задействованных в синтезе олигонуклеотидов. Гель-фильтрацию проводят при скорости потока 0,5 мл/мин, выход разделяемых продуктов контролируют спектрофотометрически. Определяют содержание целевого фрагмента ДНК во фракциях гель-фильтрации электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие синтезированный фрагмент, осаждают 3 объемами этанола с добавлением 1/10 объема ацетата натрия рН 5,2 и растворяют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА. Количество ДНК в полученном растворе определяют спектрофотометрически.As DNA to obtain a conjugate with neutravidin and matrix for subsequent PCR amplification in real time using a fragment of genomic DNA Fusarium avenaceum length of 747 base pairs (figure 2). Primers for amplification of the fragment at the 5'-ends are modified with biotin (figure 3). The biotinylated DNA fragment is produced by PCR amplification using Taq polymerase at annealing temperature of the primers of 56 ° C and the fragment elongation time of 1 minute. PCR reaction products precipitated with 3 volumes of ethanol with the addition of 1/10 volume of sodium acetate pH 5.2 and dissolved in 0.5 ml of buffer containing 20 mm Tris-HCl pH 7.5 and 300 mm sodium chloride, 5 mm EDTA. The DNA solution is centrifuged to remove undissolved impurities and applied to a Superdex-200 gel filtration column (GE-Healthcare, UK), equilibrated with the same buffer, to remove by-products of the synthesis and not involved in the synthesis of oligonucleotides. Gel filtration is carried out at a flow rate of 0.5 ml / min, the yield of the separated products is controlled spectrophotometrically. The content of the target DNA fragment in the gel filtration fractions was determined by agarose gel electrophoresis. Fractions containing the synthesized fragment are precipitated with 3 volumes of ethanol with the addition of 1/10 volume of sodium acetate pH 5.2 and dissolved in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 100 mM sodium chloride and 5 mM EDTA. The amount of DNA in the resulting solution is determined spectrophotometrically.
Готовят раствор нейтравидина (Pierce, США) из расчета 1 мг/мл и смешивают его в эквимолярном соотношении с раствором ДНК. Смесь инкубируют при +4°С в течение ночи. Образование молекулярной "сетки" биотинилированной ДНК с нейтравидином контролируют электрофорезом ДНК в полиакриламидном геле по замедлению скорости миграции продуктов разделения против исходного фрагмента ДНК (фиг.4). Полученный конъюгат биотинилированной ДНК с нейтравидином очищают от несвязанной ДНК и нейтравидина гель-фильтрацией на колонке Superdex-200 (GE-Healthcare, Великобритания), уравновешенной буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА. Содержание конъюгата во фракциях гель-фильтрации контролируют электрофорезом в агарозном геле. Очищенный конъюгат концентрируют с использованием Microcon YM-50 (Millipore, США). Спектрофотометрически определяют концентрацию конъюгата по ДНК и белку и на основании этих данных рассчитывают соотношение ДНК к белку в полученной молекулярной "сетке". К конъюгату добавляют глицерин до 50% и хранят по аликвотам при температуре -70°С.Prepare a solution of neutravidin (Pierce, USA) at a rate of 1 mg / ml and mix it in an equimolar ratio with a solution of DNA. The mixture was incubated at + 4 ° C overnight. The formation of a molecular "grid" of biotinylated DNA with neutravidin is controlled by polyacrylamide gel electrophoresis of DNA to slow the migration rate of separation products against the original DNA fragment (Fig. 4). The resulting biotinylated DNA-neutravidin conjugate was purified from unbound DNA and neutravidin by gel filtration on a Superdex-200 column (GE-Healthcare, UK), equilibrated with buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM sodium chloride and 5 mM EDTA . The conjugate content in the gel filtration fractions was controlled by agarose gel electrophoresis. The purified conjugate was concentrated using Microcon YM-50 (Millipore, USA). The concentration of the conjugate is determined spectrophotometrically from DNA and protein, and based on these data, the ratio of DNA to protein in the resulting molecular "grid" is calculated. Up to 50% glycerol is added to the conjugate and stored in aliquots at a temperature of -70 ° C.
Пример 4. Постановка иммунодетекции протективного антигена и связывание его с ДНК-матрицей для последующей ПЦР-амплификации в режиме реального времени.Example 4. Immunodetection of a protective antigen and its binding to a DNA template for subsequent real-time PCR amplification.
В лунки иммунологического микропланшета разносят по 300 мкл раствора Денхардт (20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 1% Ficoll 400, 1% поливинилпирролидон, 1% бычий сывороточный альбумин), содержащего 1% ДНК спермы лосося, и инкубируют в течение 1 часа при 37°С для блокировки свободных валентностей поверхности микропланшета. Парамагнитные частицы с иммобилизованным белком G бактерий семейства Streptococcus (Protein G Magnetic Beads, New England Biolabs, США) наносят в лунки микропланшета в количестве 10 мкл суспензии частиц на лунку. Помещают планшет на магнитную плату прибора Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США) и трижды промывают парамагнитные частицы, удерживаемые магнитным взаимодействием с платой, буферным раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА с применением программы MAGx3. В лунки планшета по 50 мкл разносят раствор антитела к протективному антигену сибирской язвы, содержащий 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 20 мкг/мл антитела. Инкубируют планшет в течение 1 часа при комнатной температуре со встряхиванием. Проводят блокировку свободных валентностей поверхности парамагнитных частиц приготовленным на том же буфере раствором Денхардт, содержащим 1% ДНК спермы лосося. Для этого в лунки микропланшета добавляют 300 мкл раствора Денхардт-ДНК и инкубируют при встряхивании в течение 1 часа при 37°С. Троекратно промывают парамагнитные частицы с применением прибора Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США) раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. В лунки микропланшета разносят по 100 мкл подготовленные образцы, содержащие протективный антиген сибирской язвы в различных концентрациях. В лунки, служащие отрицательным контролем, добавляют буферный раствор, содержащий 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА, либо экспериментальные образцы, заведомо не содержащие белка протективного антигена. Инкубируют планшет при встряхивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Троекратно промывают парамагнитные частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА с применением прибора Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США). В лунки планшета добавляют по 100 мкл раствора, содержащего биотинилированное антитело, узнающее другой эпитоп белка протективного антигена сибирской язвы, и инкубируют планшет при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре. Троекратно промывают парамагнитные частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА с применением прибора Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США). В лунки планшета добавляют по 100 мкл раствора 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА, содержащего конъюгат биотинилированной ДНК с нейтравидином в количестве 0,1 мкг ДНК на пробирку, и инкубируют планшет при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего троекратно промывают парамагнитные частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия с применением прибора Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США).300 μl of a Denhardt solution (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM sodium chloride, 1
После полного удаления промывочного раствора в лунки планшета разносят по 50 мкл однократный буферный раствор для эндонуклеазы рестрикции Sac I, содержащий фермент Sac I в концентрации 50 ед/мл. Планшет инкубируют при 37°С в течение 1 часа, помещают планшет на магнитную плату и переносят супернатант из лунок планшета в пробирки для ПЦР. К 1/10 отобранного супернатанта добавляют смесь для ПЦР-амплификации в режиме реального времени.After complete removal of the wash solution, 50 μl of a single Sac I restriction endonuclease buffer solution containing the Sac I enzyme at a concentration of 50 u / ml is dispensed into the wells of the plate. The plate was incubated at 37 ° C for 1 hour, the plate was placed on a magnetic board, and the supernatant was transferred from the plate wells to PCR tubes. A real-time PCR amplification mixture is added to 1/10 of the selected supernatant.
Пример 5. Проведение ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени для определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 5. Real-time PCR amplification with fluorescence signal detection to determine the anthrax protective antigen by immunodetection coupled with PCR amplification.
Для проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени в пробирки для ПЦР, содержащие по 5 мкл продуктов рестрикции ДНК-матрицы, отобранных с парамагнитных частиц, обработанных рестриктазой Sac I, разносят по 50 мкл 1х реакционную смесь для амплификации (Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ, "Синтол", Россия), содержащую по 300 нМ каждого из праймеров для амплификации, 1 единицу рекомбинантной Taq-полимеразы и 200 нМ зонда TaqMan (фиг.3). Реакцию амплификации проводят на приборе для ПЦР амплификации в режиме реального времени MiniOpticon Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США) с использованием следующего протокола:To carry out real-time PCR amplification, in PCR tubes containing 5 μl of restriction products of the DNA template, selected from paramagnetic particles treated with Sac I restriction enzyme, 50 μl of 1x reaction mixture for amplification are distributed (Reaction mixture 2.5x for PCR-RV, Syntol, Russia) containing 300 nM of each of the amplification primers, 1 unit of recombinant Taq polymerase and 200 nM TaqMan probe (Fig. 3). The amplification reaction is carried out on a MiniOpticon Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA) instrument for real-time PCR amplification using the following protocol:
Регистрацию нарастания флюоресценции ведут при длине волны 520 нм. Пробы, содержащие протективный антиген сибирской язвы, показывают нарастание флюоресценции с 5 по 30 цикл реакции амплификации (фиг.5). Нарастания флюоресценции в контрольных пробах в этом диапазоне циклов реакции не обнаруживают. Применив калибровочную кривую, построенную на основании зависимости номера цикла, на котором начинает регистрироваться изменение флюоресценции, от значений концентрации белка протективного антигена в контрольных образцах, определяют концентрацию белка протективного антигена в исследуемых пробах.The increase in fluorescence is recorded at a wavelength of 520 nm. Samples containing anthrax protective antigen show an increase in fluorescence from 5 to 30 of the amplification reaction cycle (Fig. 5). No increase in fluorescence in control samples was detected in this range of reaction cycles. Applying the calibration curve constructed on the basis of the dependence of the cycle number, on which the change in fluorescence begins to be recorded, on the values of the protein concentration of protective antigen in control samples, the concentration of protein of the protective antigen in the studied samples is determined.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011145395/10A RU2470307C1 (en) | 2011-11-09 | 2011-11-09 | Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011145395/10A RU2470307C1 (en) | 2011-11-09 | 2011-11-09 | Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2470307C1 true RU2470307C1 (en) | 2012-12-20 |
Family
ID=49256623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011145395/10A RU2470307C1 (en) | 2011-11-09 | 2011-11-09 | Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2470307C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2549463C1 (en) * | 2013-12-03 | 2015-04-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Method of determining botulinum neurotoxin of type a based immunodetection, combined with polymerase chain reaction |
| RU2569196C1 (en) * | 2014-07-10 | 2015-11-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | METHOD TO DETECT AVAILABILITY OF BACTERIA Escherichia coli O157:H7 IN BIOLOGICAL AND FOOD SAMPLES BASED ON IMMUNODETECTION COUPLED WITH POLYMERASE CHAIN REACTION |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100239594A1 (en) * | 2005-08-03 | 2010-09-23 | Vidadi Yusibov | Compositions and methods for production of immunoglobulins |
| RU2410699C1 (en) * | 2009-11-13 | 2011-01-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | Method of obtaining erythrocytal anthrax antigenic diagnosticum for detection of antibodies to protective antigen |
| RU2418860C1 (en) * | 2009-11-18 | 2011-05-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральное Агентство по науке и инновациям | Method of detecting presence of anthrax infection in biological fluids and environment |
-
2011
- 2011-11-09 RU RU2011145395/10A patent/RU2470307C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100239594A1 (en) * | 2005-08-03 | 2010-09-23 | Vidadi Yusibov | Compositions and methods for production of immunoglobulins |
| RU2410699C1 (en) * | 2009-11-13 | 2011-01-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | Method of obtaining erythrocytal anthrax antigenic diagnosticum for detection of antibodies to protective antigen |
| RU2418860C1 (en) * | 2009-11-18 | 2011-05-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральное Агентство по науке и инновациям | Method of detecting presence of anthrax infection in biological fluids and environment |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RU 2418860 C1 (ROSSIJSKAJA FEDERATSIJA, ОТ IMENI KOTOROJ VYSTUPAET FEDERALNOE AGENTSTVO PO NAUKE I INNOVATSIJAM (RU).UCHREZHDENIE ROSSIJSKOJ AKADEMII NAUK INSTITUT BIOORGANICHESKOJ KHIMII IM. AKADEMIKOV M.M. SHEMJAKINA I JU.A. OVCHINNIKOVA RAN), 20.05.2011. RU 2410699 C1 (FEDERALNOE GOSUDARSTVENNOE UCHREZHDENIE ZDRAVOOKHRANENIJA VOLOOGRADSKIJ NAUCHNO-ISSLEDOVATEL'SKIJ PROTIVOCHUMNIJ INSTITUT ROSPATREBNADZORA), 27.01.2011. US 20100239594 A1 (VIDADI YUSIBOV, VADIM METT, ANNA HULL), 23.09.2010. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2549463C1 (en) * | 2013-12-03 | 2015-04-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Method of determining botulinum neurotoxin of type a based immunodetection, combined with polymerase chain reaction |
| RU2569196C1 (en) * | 2014-07-10 | 2015-11-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | METHOD TO DETECT AVAILABILITY OF BACTERIA Escherichia coli O157:H7 IN BIOLOGICAL AND FOOD SAMPLES BASED ON IMMUNODETECTION COUPLED WITH POLYMERASE CHAIN REACTION |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Screening of highly-specific aptamers and their applications in paper-based microfluidic chips for rapid diagnosis of multiple bacteria | |
| US8735564B2 (en) | Fast results hybrid capture assay and system | |
| JP5188808B2 (en) | Homogeneous analyte detection | |
| ES2424269T3 (en) | Immuno-PCR sandwich sandwich | |
| Fischer et al. | A quantitative real-time immuno-PCR approach for detection of staphylococcal enterotoxins | |
| JP3143477B2 (en) | Method based on the use of bacteriophage for the detection of biological molecules in biological samples | |
| WO2008122310A1 (en) | Method for the detection of an analyte in biological matrix | |
| Mietze et al. | Combined MLST and AFLP typing of Bartonella henselae isolated from cats reveals new sequence types and suggests clonal evolution | |
| US20110177523A1 (en) | Methods of analyzing samples for bacteria using whole cell capture and atp analysis | |
| Mohseni et al. | A comparative evaluation of ELISA, PCR, and serum agglutination tests for diagnosis of Brucella using human serum | |
| Janardhanan et al. | RNA aptasensor for rapid detection of natively folded type A botulinum neurotoxin | |
| Mudili et al. | RETRACTED ARTICLE: A novel IgY-Aptamer hybrid system for cost-effective detection of SEB and its evaluation on food and clinical samples | |
| Widiyanti et al. | Development of immunochromatography-based methods for detection of leptospiral lipopolysaccharide antigen in urine | |
| JPWO2011068189A1 (en) | Method for detecting microorganisms belonging to Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium | |
| Hosseiniporgham et al. | A rapid phage assay for detection of viable Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk | |
| Tallent et al. | Novel platform for the detection of Staphylococcus aureus enterotoxin B in foods | |
| Mygind et al. | Topological analysis of Chlamydia trachomatis L2 outer membrane protein 2 | |
| RU2470307C1 (en) | Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction | |
| Wang et al. | Triplex PCR combined with magnetic separation strategy for rapid and specific detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in hospital samples | |
| JP2018506020A (en) | Analyte detection on solid supports by immunoassay combined with nucleic acid amplification | |
| Hu et al. | Antibodies specific for nucleic acids and applications in genomic detection and clinical diagnostics | |
| JP5124601B2 (en) | Detection method, identification method and kit of oxa-type β-lactamase producing bacterium | |
| RU2569196C1 (en) | METHOD TO DETECT AVAILABILITY OF BACTERIA Escherichia coli O157:H7 IN BIOLOGICAL AND FOOD SAMPLES BASED ON IMMUNODETECTION COUPLED WITH POLYMERASE CHAIN REACTION | |
| AU773046B2 (en) | Test system for detecting different markers, and production and use thereof | |
| Ataee et al. | Molecular screening of staphylococcal enterotoxin B gene in clinical isolates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201110 |