RU2435855C2 - Method for producing replicative influenza virus particles, cell composition (versions), cell culture composition and application thereof - Google Patents
Method for producing replicative influenza virus particles, cell composition (versions), cell culture composition and application thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2435855C2 RU2435855C2 RU2007128336/10A RU2007128336A RU2435855C2 RU 2435855 C2 RU2435855 C2 RU 2435855C2 RU 2007128336/10 A RU2007128336/10 A RU 2007128336/10A RU 2007128336 A RU2007128336 A RU 2007128336A RU 2435855 C2 RU2435855 C2 RU 2435855C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- virus
- influenza
- influenza virus
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 76
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 115
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 60
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 claims description 26
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 22
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims description 20
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 15
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 8
- 108091034135 Vault RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 6
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 138
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 65
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 64
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 64
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 43
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 42
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 36
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 33
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 33
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 33
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 33
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 30
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 21
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 20
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 20
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 17
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 15
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 101710102873 Polymerase basic protein 2 Proteins 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 11
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 8
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 8
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 8
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 7
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 6
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 6
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 6
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 5
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 241000856131 recombinant Influenza A viruses Species 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- 101150002210 34 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 description 3
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 3
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108091080980 Hepatitis delta virus ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012570 Opti-MEM I medium Substances 0.000 description 2
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N amantadine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(N)C3 DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003805 amantadine Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UBCHPRBFMUDMNC-UHFFFAOYSA-N 1-(1-adamantyl)ethanamine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(C(N)C)C3 UBCHPRBFMUDMNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 241000941423 Grom virus Species 0.000 description 1
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006479 Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010019372 Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001508691 Martes zibellina Species 0.000 description 1
- 101710199769 Matrix protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000845082 Panama Species 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 235000001630 Pyrus pyrifolia var culta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002609 Pyrus pyrifolia var. culta Species 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001468001 Salmonella virus SP6 Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042406 direct acting antivirals neuraminidase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000007407 health benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000037799 influenza C Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960001226 live attenuated influenza Drugs 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- UMWKZHPREXJQGR-XOSAIJSUSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]decanamide Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO UMWKZHPREXJQGR-XOSAIJSUSA-N 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229960003752 oseltamivir Drugs 0.000 description 1
- VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N oseltamivir Chemical compound CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 229960000888 rimantadine Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002911 sialidase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229960001028 zanamivir Drugs 0.000 description 1
- ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N zanamivir Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)C=C(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
- C12N2760/18651—Methods of production or purification of viral material
Abstract
Description
Данное изобретение относится к области получения противовирусной вакцины.This invention relates to the field of obtaining an antiviral vaccine.
Вирусы гриппа (Orthomyxoviridae) являются РНК-вирусами с «минус-цепью» с сегментированным геномом (Taubenberger and Layne, Molecular Diagnosis Vol.6 No.4 2001). Они подразделяются на две группы: одну, включающую в себя вирусы гриппа А и В, и другую, состоящую из вируса гриппа С, на основе существенных антигенных различий между их нуклеопротеином и матриксными белками. Эти три типа вирусов различаются также по патогенности и организации генома. Тип А обнаружен в широком диапазоне теплокровных животных, а типы В и С являются преимущественно патогенами человека. Вирусы гриппа А дополнительно подразделяются посредством антигенной характеристики гемагглютинина (НА) и гликопротеинов поверхности NA, которые выступают от поверхности вириона. В настоящее время имеются 15 подтипов НА и девять подтипов NA. Вирусы типа А инфицируют большое разнообразие животных, в том числе птиц, свиней, лошадей, людей и других млекопитающих. Водоплавающие птицы служат в качестве природного резервуара для всех известных подтипов вирусов гриппа А и, возможно, являются источником генетического материала для пандемичных штаммов вируса гриппа человека.Influenza viruses (Orthomyxoviridae) are negative chain RNA viruses with a segmented genome (Taubenberger and Layne, Molecular Diagnosis Vol.6 No.4 2001). They are divided into two groups: one, which includes influenza A and B viruses, and the other, consisting of influenza C virus, based on significant antigenic differences between their nucleoprotein and matrix proteins. These three types of viruses also differ in pathogenicity and genome organization. Type A is found in a wide range of warm-blooded animals, and types B and C are mainly human pathogens. Influenza A viruses are further subdivided by the antigenic characteristics of hemagglutinin (HA) and glycoproteins of the NA surface, which protrude from the surface of the virion. There are currently 15 subtypes of HA and nine subtypes of NA. Type A viruses infect a wide variety of animals, including birds, pigs, horses, humans and other mammals. Waterfowl serve as a natural reservoir for all known subtypes of influenza A viruses and may be the source of genetic material for pandemic strains of the human influenza virus.
В отличие от родственных парамиксовирусов, вирусы гриппа имеют сегментированный РНК-геном. Вирусы гриппа А и В имеют сходную структуру, тогда как вирус гриппа С является более дивергентным. Если вирусы типа А и В, каждый, содержат восемь дискретных генных сегментов, кодирующих по меньшей мере один белок каждый, вирус типа С содержит семь дискретных сегментов, с объединением сегментов 4 и 6 типов А и В. Вирусы гриппа А и В покрыты выступами из трех белков: НА, NA и матриксного белка 2 (M2). Вирусы гриппа С имеют только один поверхностный гликопротеин. Каждый сегмент РНК вируса гриппа инкапсидирован нуклеопротеинами (NP) с образованием рибонуклеотиднуклеопротеиновых (РНП) комплексов. Три белка полимеразы ассоциированы с одним концом этого РНП-комплекса. РНП окружены мембраной с матриксным белком (matrix 1) в виде интегральной части. Фосфолипидная часть этой оболочки образуется из клеточной мембраны хозяина. В вирусной частице обнаружен также неструктурный белок 2 (NS2).Unlike related paramyxoviruses, influenza viruses have a segmented RNA gene. Influenza A and B viruses have a similar structure, while influenza C virus is more divergent. If type A and B viruses each contain eight discrete gene segments encoding at least one protein each, type C virus contains seven discrete segments, combining segments 4 and 6 of types A and B. Influenza A and B viruses are covered with protrusions from three proteins: HA, NA, and matrix protein 2 (M2). Influenza C viruses have only one surface glycoprotein. Each influenza virus RNA segment is encapsulated by nucleoproteins (NP) to form ribonucleotide nucleoprotein (RNP) complexes. Three polymerase proteins are associated with one end of this RNP complex. RNPs are surrounded by a membrane protein with matrix protein (matrix 1) as an integral part. The phospholipid portion of this membrane is formed from the host cell membrane. Non-structural protein 2 (NS2) was also found in the viral particle.
Руководящие указания Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) являются следующими. Сначала обозначают тип вируса (А, В и С), затем хозяина (если им не является человек), место выделения, количество выделений и год выделения (отделенный наклонными штрихами). Для вируса типа А подтипы НА и NA отмечают в скобках). Например, штаммами, включенными в недавно разработанную трехвалентную вакцину для сезона 2000-2001, являются: А/Panama/2007/99 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (H1N1) и B/Yamanashi/16/98. С 1977 года были обнаружены два подтипа вируса гриппа А, совместно циркулирующие в людях: H1N1 и H3N2.The World Health Organization (WHO) guidelines are as follows. First indicate the type of virus (A, B and C), then the host (if it is not a person), the place of selection, the number of secretions and the year of isolation (separated by oblique strokes). For type A virus, the HA and NA subtypes are indicated in parentheses). For example, the strains included in the recently developed trivalent vaccine for the 2000-2001 season are A / Panama / 2007/99 (H3N2), A / New Caledonia / 20/99 (H1N1) and B / Yamanashi / 16/98. Since 1977, two subtypes of influenza A virus have been discovered that circulate together in humans: H1N1 and H3N2.
Вирусы гриппа накапливают точковые мутации во время репликации, так как их РНК-полимеразный комплекс не имеет корректирующей активности. Мутации, которые изменяют аминокислоты в антигенных частях поверхностных гликопротеинов, могут придавать селективные преимущества вирусному штамму, позволяя ему ускользнуть от предсуществующего иммунитета. Молекула НА инициирует инфицирование связыванием с рецепторами на определенных клетках-хозяевах. Антитела против белка НА предотвращают связывание рецептора и являются очень эффективными в предотвращении повторной инфекции тем же самым штаммом. НА может ускользать от ранее приобретенного иммунитета либо посредством антигенного дрейфа, в котором мутации циркулирующего в данный момент гена НА разрушают связывание антитела, либо посредством антигенной изменчивости, когда вирус приобретает НА нового подтипа. Давления антигенного дрейфа являются неодинаковыми на протяжении молекулы НА, причем положительно отобранные изменения встречаются преимущественно в глобулярной головке белка НА. Эти изменения накапливаются также в большей степени в НА, чем NA. Изменения в других белках вируса гриппа происходят более медленно. Подобным образом, давление антигенного дрейфа является наивысшим в адаптированных к человеку штаммах гриппа, промежуточным в адаптированных к синьям и лошадям штаммах гриппа и наименьшим в адаптированных к птицам штаммах.Influenza viruses accumulate point mutations during replication, as their RNA polymerase complex has no corrective activity. Mutations that alter amino acids in the antigenic parts of surface glycoproteins can confer selective benefits to the viral strain, allowing it to elude preexisting immunity. The HA molecule initiates infection by binding to receptors on specific host cells. Antibodies against the HA protein prevent receptor binding and are very effective in preventing reinfection with the same strain. HA can elude previously acquired immunity either by antigenic drift in which mutations of the currently circulating HA gene break down antibody binding, or by antigenic variation when the virus acquires HA of a new subtype. Antigenic drift pressures are not the same throughout the HA molecule, with positively selected changes occurring predominantly in the globular head of the HA protein. These changes also accumulate to a greater extent in HA than NA. Changes in other flu virus proteins occur more slowly. Similarly, antigenic drift pressure is highest in human-adapted influenza strains, intermediate in blue and horse-adapted influenza strains, and lowest in bird-adapted strains.
Поскольку вирусы гриппа имеют сегментированный геном, совместная инфекция двух различных штаммов в одного и того же хозяина может приводить к получению новых реарранжированных штаммов гриппа, содержащих различные комбинации исходных генных сегментов. Известно, что существуют пятнадцать подтипов НА в диких птицах, они обеспечивают источник НА и являются новыми для людей. Появление в кровотоке человека штамма гриппа с новым подтипом антигенной изменчивости было причиной двух последних пандемий в 1957 и 1968 годах и, наиболее вероятно, причиной пандемии гриппа в 1918 году. Чтобы соответствовать всему, что известно относительно появления пандемичных вирусов гриппа, пандемичный штамм должен иметь НА-антигенность, отличающуюся от НА-антигенности, преобладающей в данный момент; этот НА не может циркулировать в кровотоке людей в течение 60-70 лет; и этот вирус должен быть передающимся от человека к человеку. Как в 1957 году, так и в 1968 году пандемии происходили из изменчивости в НА, и в обоих случаях НА пандемичных штаммов были близкородственными птичьим штаммам. Хотя одним из абсолютных требований для пандемии является то, что НА должен изменяться, степень, до которой может или должен изменяться этот вирус, является неизвестной. Только пандемичные вирусы 1957 и 1968 года являются доступными для непосредственного исследования, причем пандемичный вирус 1918 года характеризуют с использованием молекулярной археологии. В 1957 году три гена были заменены генами, подобными птичьим генам: НА, NA и субъединицы полимеразного комплекса (РВ1). В 1968 году были заменены только НА и РВ1.Since influenza viruses have a segmented genome, co-infection of two different strains in the same host can result in new rearranged influenza strains containing various combinations of the original gene segments. It is known that there are fifteen subtypes of HA in wild birds; they provide a source of HA and are new to humans. The appearance in the bloodstream of a human strain of influenza with a new subtype of antigenic variation was the cause of the last two pandemics in 1957 and 1968 and, most likely, the cause of the influenza pandemic in 1918. In order to match everything that is known regarding the emergence of pandemic influenza viruses, the pandemic strain must have HA antigenicity different from the HA antigenicity currently prevailing; this ON cannot circulate in the bloodstream of people for 60-70 years; and this virus must be human-to-human. Both in 1957 and in 1968, pandemics occurred from variability in NA, and in both cases, the pandemic strains were closely related to bird strains. Although one of the absolute requirements for a pandemic is that HA must change, the extent to which this virus can or should change is unknown. Only the pandemic viruses of 1957 and 1968 are available for direct investigation, and the pandemic virus of 1918 is characterized using molecular archeology. In 1957, three genes were replaced by genes similar to bird genes: HA, NA, and the polymerase complex subunits (PB1). In 1968, only NA and PB1 were replaced.
Специфическая диагностика инфекции гриппа может быть выполнена посредством выделения вируса, теста ингибирования гемагглютинации (HI), детектирования антигена при помощи иммуноанализа, серологических тестов, демонстрации NA-активности в секрециях или на основе молекулярных анализов. Пробы могут быть собраны в виде слюны, назофарингеального (носоглоточного) мазка или назофарингеального промывания, полученного полосканием забуференным солевым раствором. Стандартом для диагностики гриппа была иммунологическая характеристика после культивирования. Серологический анализ обеспечивает точный, но ретроспективный способ для инфекции гриппа, так как он требует сбора сывороток как в остром периоде, так и во время выздоровления.Specific diagnosis of influenza infection can be performed by isolating a virus, a hemagglutination inhibition test (HI), detecting antigen by immunoassay, serological tests, demonstrating NA activity in secretions, or based on molecular analyzes. Samples can be collected in the form of saliva, nasopharyngeal (nasopharyngeal) swab, or nasopharyngeal lavage obtained by rinsing with buffered saline. The standard for the diagnosis of influenza was immunological characterization after cultivation. Serological analysis provides an accurate but retrospective method for influenza infection, as it requires the collection of sera both in the acute period and during recovery.
Вирусы гриппа могут выращиваться в содержащих зародыш куриных яйцах или в ряде систем культуры ткани. Добавление трипсина (для активации расщеплением НА) делает возможным размножение вируса гриппа в клетках почки собаки Madin-Darby (MDCK) и других линиях. Первичным способом получения вакцины является все еще культивирование вирусов гриппа в яйцах. Культивирование в клеточных линиях обычно используют для первичного выделения вирусов гриппа человека (как типа А, так и типа В). Многие вирусы гриппа человека могут культивироваться непосредственно в аллантоисной полости содержащих зародыш яиц. Некоторые вирусы гриппа А и В требуют начального культивирования в амниотической полости и последующей адаптации к аллантоисной полости. После выделения культуры большинство изолятов гриппа точно идентифицируют с использованием иммуноанализов или иммунофлуоресценции. Молекулы НА вирусов гриппа связывают остатки сиаловой кислоты на поверхности респираторных клеток для достижения вхождения вируса.Influenza viruses can be grown in embryonic chicken eggs or in a number of tissue culture systems. Adding trypsin (to be activated by HA cleavage) makes it possible to propagate the influenza virus in Madin-Darby dog kidney cells (MDCK) and other lines. The primary way to get the vaccine is still culturing the flu viruses in the eggs. Cultivation in cell lines is usually used for the primary isolation of human influenza viruses (both type A and type B). Many human influenza viruses can be cultured directly in the allantoic cavity of the eggs containing the embryo. Some influenza A and B viruses require initial cultivation in the amniotic cavity and subsequent adaptation to the allantoic cavity. After isolating the culture, most influenza isolates are accurately identified using immunoassays or immunofluorescence. Molecules of influenza viruses bind sialic acid residues on the surface of respiratory cells to achieve virus entry.
Штаммы гриппа могут быть охарактеризованы антигенно с использованием способности вирусов гриппа агглютинировать эритроциты in vitro. Анти-НА-антитела могут ингибировать агглютинацию. Таким образом, анализ ингибирования гемагглютинации (HI) является одним из стандартных способов, используемых для характеристики штаммов гриппа. HI-анализы используют для определения, являются ли штаммы проб иммунологически родственными (т.е. перекрестно-реактивными) с современными вакцинными штаммами. Типирующие сыворотки, обычно продуцируемые у хорьков, добавляют в лунки в серии двукратных разведений, и лаборанты оценивают лунки для анализа путем сравнительного наблюдения суспендированных эритроцитов с агглютинированными эритроцитами. В большинстве ситуаций используют панель сывороток для сопоставления штаммов проб с вакцинными и ссылочными штаммами, и во время каждого конкретного сезона гриппа, и огромное количество штаммов проб последовательно сопоставляют при помощи HI-анализов. ВОЗ обеспечивает руководящие указания и сотрудничающие с ВОЗ центры обеспечивают руководство в отношении идентификации антигенных характеристик индивидуальных вирусных штаммов и может обеспечивать эти штаммы тем, кто желает их получить. Штаммы проб распределяют по категориям в соответствии с иммунологическими родословными, например, A/Moscow/10/99 (H3N2)-подобные, A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-подобные, и B/Beijing/184/93-подобные вирусы. Например, штаммы проб, которые не поддаются характеристике в HI-анализах, лабораторные работники должны инокулировать в хорьков для получения штамм-специфической антисыворотки. Когда новая антисыворотка готова, опять выполняют HI-анализы, как описано. Если эта новая сыворотка обнаруживает значительные гэпы в перекрестной реактивности (обычно определяемые как четырехкратное различие между пробой и вакцинными штаммами), ее включают в рутинную лабораторную панель и используют для обнаружения новых эпидемических штаммов. Таким образом, HI-анализы являются чрезвычайно важными в достижении контроля вируса гриппа для отбора вакцинного штамма и являются наиболее часто используемыми способами для оценки антигенного дрейфа.Influenza strains can be characterized antigenically using the ability of influenza viruses to agglutinate red blood cells in vitro. Anti-HA antibodies can inhibit agglutination. Thus, hemagglutination inhibition (HI) analysis is one of the standard methods used to characterize influenza strains. HI assays are used to determine if sample strains are immunologically related (i.e., cross-reactive) with modern vaccine strains. Typing sera typically produced in ferrets are added to wells in a series of two-fold dilutions, and laboratory technicians evaluate the wells for analysis by comparing the observation of suspended red blood cells with agglutinated red blood cells. In most situations, a serum panel is used to compare sample strains with vaccine and reference strains, and during each particular influenza season, and a huge number of sample strains are sequentially compared using HI assays. WHO provides guidance and WHO collaborating centers provide guidance on the identification of antigenic characteristics of individual viral strains and can provide these strains to those who wish to obtain them. Sample strains are categorized according to immunological ancestries, for example, A / Moscow / 10/99 (H3N2) -like, A / New Caledonia / 20/99 (H1N1) -like, and B / Beijing / 184/93-like viruses. For example, strains of samples that cannot be characterized in HI assays, laboratory workers must inoculate in ferrets to obtain strain-specific antisera. When the new antiserum is ready, HI assays are again performed as described. If this new serum detects significant gaps in cross-reactivity (usually defined as a four-fold difference between sample and vaccine strains), it is included in a routine laboratory panel and used to detect new epidemic strains. Thus, HI assays are extremely important in achieving control of the influenza virus to select a vaccine strain and are the most commonly used methods for assessing antigenic drift.
Штаммы гриппа могут быть охарактеризованы путем генетического сравнения последовательностей отдельных генных сегментов, и опять руководящие указания ВОЗ и сотрудничающих с ВОЗ центров обеспечивают руководство в отношении идентификации индивидуальной идентичности РНК-сегментов, содержащих геном вируса гриппа; сегментов нуклеиновой кислоты вируса гриппа А и В, кодирующих нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (РВ1), основную полимеразу 2 (РВ2), кислую полимеразу (РА), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (М1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2), и сегментов нуклеиновой кислоты вируса гриппа С, кодирующих нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (РВ1), основную полимеразу 2 (РВ2), гемагглютинин-нейраминидаза-подобный гликопротеин (HN), матриксные белки (М1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).Influenza strains can be characterized by genetic comparison of the sequences of individual gene segments, and again the guidelines of WHO and WHO collaborating centers provide guidance on identifying the individual identity of RNA segments containing the influenza virus genome; Influenza A and B virus nucleic acid segments encoding nucleoprotein (NP), basic polymerase 1 (PB1), basic polymerase 2 (PB2), acid polymerase (RA), hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), matrix proteins (M1 and M2) and non-structural protein (NS1 and NS2), and influenza C nucleic acid segments encoding nucleoprotein (NP), basic polymerase 1 (PB1), basic polymerase 2 (PB2), hemagglutinin-neuraminidase-like glycoprotein (HN), matrix proteins (M1 and M2) and non-structural protein (NS1 and NS2).
Запросы на ссылочные штаммы, например, для антигенного анализа, для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот и для идентификации вакцинных вирусов могут адресоваться ВОЗ Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, 45 Poplar Road, Parkville, Victoria 3052, Australia (fax: +61 3 9389 1881, web site: http//www.influenza centre.org); the WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute of Infections Diseases, Gakuen 4-7-1, Musashi Murayama, Tokyo 208-0011, Japan (fax: -81 42 5610812 или +81 42 5652498); WHO Collaborating Center for Surveillance, Epidemiology and Control of Influenza, Centers for Disease Control and Prevention 1600 Clifton Road, Mail stop G16, Atlanta, GA 30333, United States of America (fax: +1 404 639 23 34); или the WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute for Medical Research, The Ridgeway, Mill Hill, London NW7 1AA, England (fax: +44 208 906 4477). Обновленная эпидемиологическая информация доступна на веб-сайте ВОЗ в и в системе географической информации, FluNet, в . Осознание воздействия гриппа и пользы для здоровья и экономических преимуществ его предупреждения являются растущими, и в период последнего десятилетия наблюдали применение и выгоды вакцинации, и количество лекарственных средств против гриппа существенно увеличивается. Вследствие более длинной ожидаемой продолжительности жизни во многих странах, все большее количество людей находятся при риске осложнений, нагрузка на системы здравоохранения во время эпидемий гриппа все более широко признается, и более частые международные путешествия создали возможности для распространения этого вируса, в то время как введение новых продуктов увеличило возможности предупреждения и лечения этого заболевания. Около 50 стран имеют финансируемые правительством национальные программы иммунизации, и эта вакцина является доступной во многих других странах. Конкретные рекомендации в отношении применения этой вакцины варьируются, но обычно включают в себя ежегодную иммунизацию для индивидуумов пожилого возраста и индивидуумов старше 6 месяцев, которые находятся при увеличенном риске тяжелого заболевания вследствие предсуществующего хронического медицинского состояния. В некоторых странах вакцину используют для уменьшения распространения гриппа на индивидуумов, находящихся при увеличенном медицинском риске. Страны-участники должны рассматривать пользу активностей предупреждения гриппа в контексте их приоритетов общественного здравоохранения в целом. Инактивированные вакцины классифицируют в виде нескольких типов, в зависимости от того, содержат ли они целые вирусные частицы, частично разрушенные вирусные частицы (расщепленные вакцины) или очищенные антигены оболочки (субъединичные вакцины). Некоторые субъединичные вакцины были объединены с адъювантом или системой доставки.Requests for reference strains, for example, for antigenic analysis, for comparing nucleic acid sequences, and for identifying vaccine viruses, can be addressed to WHO Collaborating Center for Reference and Research on Influenza, 45 Poplar Road, Parkville, Victoria 3052, Australia (fax: +61 3 9389 1881, website: http // www.influenza center.org); the WHO Collaborating Center for Reference and Research on Influenza, National Institute of Infections Diseases, Gakuen 4-7-1, Musashi Murayama, Tokyo 208-0011, Japan (fax: -81 42 5610812 or +81 42 5652498); WHO Collaborating Center for Surveillance, Epidemiology and Control of Influenza, Centers for Disease Control and
Несколько стран лицензировали живые аттенуированные вакцины против гриппа для определенных групп-мишеней. Две различных композиции вакцины 1 использовали на здоровых взрослых людях и детях в Российской Федерации, а другая живая вакцина была интенсивно испытана, но еще не была лицензирована. Пока более доступными являются живые аттенуированные вакцины, обычно они еще не рекомендованы для предупреждения гриппа.Several countries have licensed live attenuated influenza vaccines for specific target groups. Two different vaccine 1 compositions were used on healthy adults and children in the Russian Federation, and the other live vaccine was extensively tested but not yet licensed. While live attenuated vaccines are more affordable, they are usually not yet recommended for the prevention of influenza.
Два класса антивирусных агентов были разработаны для предупреждения и лечения гриппа. Ингибиторы М2, амантадин и римантадин, ограничиваются лечением вирусов гриппа А, и сообщалось, что они являются эффективными в предупреждении инфекции. Хотя оба продукта вызывают некоторые побочные действия, значительные неврологические побочные действия являются более частыми с амантадином. Ингибиторы нейраминидазы, такие как занамивир и озелтамивир, были недавно лицензированы для лечения гриппа типов А и В в ряде стран, и сообщалось, что они являются эффективными для профилактики. В пациентах, получающих оба класса антивирусного агента, были детектированы устойчивые мутанты. Хотя это не считают в настоящее время важной проблемой общественного здравоохранения, ситуация может измениться, если эти лекарственные средства используются в очень большом масштабе.Two classes of antiviral agents have been developed for the prevention and treatment of influenza. M2 inhibitors, amantadine and rimantadine, are limited to the treatment of influenza A viruses, and have been reported to be effective in preventing infection. Although both products cause some side effects, significant neurological side effects are more frequent with amantadine. Neuraminidase inhibitors, such as zanamivir and oseltamivir, have recently been licensed for the treatment of type A and B influenza in several countries and have been reported to be effective in prevention. Resistant mutants have been detected in patients receiving both classes of antiviral agent. Although this is not currently considered an important public health problem, the situation may change if these drugs are used on a very large scale.
ВОЗ поддерживает глобальную программу международного надзора, осуществляемую кооперацией 110 национальных центров гриппа, расположенных в 82 странах, и 4 сотрудничающих с ВОЗ центрах по изучению гриппа, расположенных в Атланте (Соединенные Штаты), Лондоне (Соединенное Королевство Великобритании и Северной Ирландии), Мельбурне (Австралия) и Токио (Япония). Эти центры обеспечивают раннюю систему предостережения в отношении появляющихся штаммов с эпидемическим потенциалом. Эта система является важной, так как эффективность вакцин гриппа уменьшается, если они не содержат штаммов, циркулирующих в настоящее время. ВОЗ публикует рекомендации в отношении состава вакцин, которые могут быть найдены в Weekly Epidemiological Record (например, см. публикацию 9, 2004, 79, стр. 88 или ), опубликованную Всемирной Организацией Здравоохранения, в феврале в отношении вакцин, используемых в северном полушарии, и в сентябре в отношении вакцин, используемых в южном полушарии. Поскольку грипп имеет менее выраженные сезонные распределения в экваториальных районах, эпидемиологические рассмотрения будут влиять на то, какие из этих рекомендаций (февраля или сентября) являются подходящими для вакцин при использовании в экваториальных странах.WHO supports a global surveillance program implemented by a collaboration of 110 national influenza centers located in 82 countries and 4 WHO collaborating centers for influenza research in Atlanta (United States), London (United Kingdom of Great Britain and Northern Ireland), Melbourne (Australia) ) and Tokyo (Japan). These centers provide an early warning system for emerging strains with epidemic potential. This system is important because the effectiveness of influenza vaccines is reduced if they do not contain strains currently circulating. WHO publishes recommendations for vaccine composition that can be found in the Weekly Epidemiological Record (e.g. see
Центры совместного сотрудничества проводят антигенные и генетические анализы изолятов гриппа, предоставляемых национальными центрами. Когда наблюдается доказательство изменчивости антигенов, это сопоставляют с эпидемиологическими данными для оценки эпидемиологического значения вариантов. Репрезентативные изоляты сравнивают с существующими вакцинными штаммами с использованием панелей сывороток человека, собранных до и после вакцинации, для оценки того, можно ли ожидать, что существующие вакцины будут защищать против этих вирусов. После публикации ВОЗ ежегодных рекомендаций в отношении вакцин изготовителям обеспечивают поставки быстро размножающихся штаммов для облегчения генерирования посевного материала вирусов для получения вакцин. Тесты на безопасность и эффективность вакцин против гриппа включают в себя инактивацию вируса, микробную стерильность, измерение химикалиев, используемых для разрушения вируса и подтверждение рекомендуемой концентрации антигена. Рекомендуется, что вакцины должны соответствовать требованиям ВОЗ, однако национальные регулирующие ведомства должны одобрить конкретные вакцинные вирусы, используемые в каждой стране. Национальные ведомства общественного здравоохранения являются ответственными за рекомендации в отношении применения этой вакцины. ВОЗ опубликовала также рекомендации в отношении предупреждения инфекций, вызываемых вирусом гриппа. (См. WER No. 35, 2002, pp.281-288). Вакцины против гриппа получали в содержащих зародыш куриных яйцах в течение более 50 лет, но недавно были предприняты значительные усилия для развития систем культуры клеток для получения вакцин. Общепринятая стандартная методология в содержащих зародыш куриных яйцах является крайне трудоемкой и имеет несколько главных недостатков: требуются миллионы яиц; в США более чем 100 миллионов на сезон, яйца должны быть инокулированы и собраны по отдельности; требуется экстенсивная очистка с рядом стадий фильтрации и центрифугирования для гарантии освобождения от белка яйца для минимизации риска аллергий; требуются многие стадии производства, которые являются трудными для автоматизации и являются трудоемкими, не говоря уже о затратах времени и подвергании загрязнению.Collaboration centers conduct antigenic and genetic analyzes of influenza isolates provided by national centers. When evidence of antigenic variation is observed, this is compared with epidemiological data to evaluate the epidemiological significance of the variants. Representative isolates are compared to existing vaccine strains using human serum panels collected before and after vaccination to assess whether existing vaccines can be expected to protect against these viruses. Following the publication of annual vaccine recommendations by WHO, manufacturers are supplying rapidly propagating strains to manufacturers to facilitate the generation of virus seed for vaccines. Tests for the safety and effectiveness of influenza vaccines include inactivation of the virus, microbial sterility, measurement of the chemicals used to destroy the virus, and confirmation of the recommended antigen concentration. It is recommended that vaccines be in accordance with WHO requirements, but national regulatory authorities must approve the specific vaccine viruses used in each country. National public health authorities are responsible for advising on the use of this vaccine. WHO has also published recommendations for the prevention of influenza virus infections. (See WER No. 35, 2002, pp. 281-288). Influenza vaccines have been received in embryonic chicken eggs for more than 50 years, but significant efforts have recently been made to develop cell culture systems for vaccine production. The generally accepted standard methodology in embryonic chicken eggs is extremely time-consuming and has several major drawbacks: millions of eggs are required; in the United States more than 100 million per season, eggs must be inoculated and collected separately; extensive cleaning is required with a number of filtration and centrifugation steps to guarantee release of egg protein to minimize the risk of allergies; it requires many stages of production that are difficult to automate and laborious, not to mention time consuming and exposure to pollution.
Таким образом, существует давнишняя потребность в индустрии для развития технологии производства вакцин, которая демонстрирует преимущества над существующей технологией производства вакцин, т.е. посредством развития протоколов приготовления, которые будут использовать особые штаммы клеток, способные поддерживать рост вируса гриппа и адаптированные к росту в автоматизированных биореакторах, на биологических носителях или в других системах культуры клеток, для замены существующей методологии производства вакцин.Thus, there is a long-standing need in the industry for the development of vaccine production technology, which demonstrates advantages over existing vaccine production technology, i.e. through the development of preparation protocols that will use special strains of cells that can support the growth of the influenza virus and adapted to grow in automated bioreactors, on biological media, or in other cell culture systems, to replace the existing vaccine production methodology.
Часто предлагаются охарактеризованные непрерывные клеточные линии, такие как клетки Vero или другие клетки, полученные из приматов, для использования в получении вакцин вирусов гриппа. Однако регистрирующие ведомства в наши дни уклоняются от вакцин, получаемых в клетках приматов, которые предназначаются для использования в отношении человека. Все более и более такие ведомства рекомендуют, чтобы все продукты, полученные из клеток приматов (таких как Vero), были свободны от оставшихся интактных клеток, и выражают продолжающуюся озабоченность в отношении уровня остаточного материала, такого как ДНК клеток приматов, в продуктах, изготовляемых из этих клеток. Хотя Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) считает приемлемым предел остаточной ДНК из непрерывных клеточных линий 10 нг на дозу для противовирусных вакцин при парентеральном введении, регистрирующие ведомства продолжают считать этот уровень риском, создаваемым на случайной основе клеточным материалом приматов, таким как ДНК, для противовирусных вакцин.Characterized continuous cell lines, such as Vero cells or other cells derived from primates, are often offered for use in the preparation of influenza virus vaccines. However, registration authorities today are shying away from vaccines obtained in primacy cells that are intended to be used against humans. Increasingly, such departments are recommending that all products derived from primate cells (such as Vero) be free of remaining intact cells, and express continuing concern about the level of residual material, such as primate cell DNA, in products made from these cells. Although the World Health Organization (WHO) considers acceptable a limit of residual DNA from continuous cell lines of 10 ng per dose for parenteral antiviral vaccines, registries continue to consider this level as a risk from randomly generated primacy cell material, such as DNA, for antiviral vaccines .
В течение продолжительного времени фундаментальное исследование вирусов гриппа А затруднялось отсутствием доступности эффективных систем обратной генетики. Хотя самые ранние способы обратной генетики для РНК-вирусов с минус-цепью были фактически разработаны для вируса гриппа А, получение этого вируса исключительно из рекомбинантной ДНК было достигнуто лишь недавно.For a long time, a fundamental study of influenza A viruses was hampered by the lack of access to effective reverse genetics systems. Although the earliest reverse genetics methods for negative-strand RNA viruses were actually developed for influenza A virus, obtaining this virus exclusively from recombinant DNA has only recently been achieved.
Рекомбинантный вирус гриппа получали после трансфекции эукариотических клеток набором из восьми плазмид, из которых каждый из сегментов геномной вирусной РНК (вРНК) транскрибировался РНК-полимеразой I, и набором из четырех дополнительных плазмид, экспрессирующих нуклеопротеин (NP) и белки полимеразы PB1, PB2 и PA. Сообщенные эффективности получения вируса с использованием этих 12-плазмидных систем были относительно низкими.Recombinant influenza virus was obtained after transfection of eukaryotic cells with a set of eight plasmids, of which each of the segments of genomic viral RNA (vRNA) was transcribed by RNA polymerase I, and a set of four additional plasmids expressing nucleoprotein (NP) and polymerase proteins PB1, PB2 and PA . The reported efficacy of virus production using these 12-plasmid systems was relatively low.
После коэкспрессии пяти дополнительных плазмид, кодирующих гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки 1 и 2 (М1 и М2) и неструктурный белок 2 (NS2), титры вируса в супернатантах могли быть увеличены. Изящной модификацией этих 12- и 17-плазмидных систем является обеспечение двунаправленных векторов для уменьшения количества трансфицированных плазмид до восьми. С этой системой вирусная РНК с минус-цепью и мРНК с плюс-цепью могут быть синтезированы из одной и той же плазмиды.After coexpression of five additional plasmids encoding hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), matrix proteins 1 and 2 (M1 and M2) and non-structural protein 2 (NS2), virus titers in supernatants could be increased. An elegant modification of these 12- and 17-plasmid systems is to provide bi-directional vectors to reduce the number of transfected plasmids to eight. With this system, minus chain viral RNA and plus chain mRNA can be synthesized from the same plasmid.
Способность получать рекомбинантный вирус гриппа А облегчает будущее исследование вируса гриппа, однако все еще не было найдено практическое решение использования рекомбинантного вируса гриппа А, полученного способами обратной генетики, до достаточно высоких титров в получении вакцин, вследствие того факта, что большинство клеточных систем, если не все клеточные системы, используемые в получении вакцин, не позволяют или позволяют только в небольшой степени, реплицировать вышеописанные рекомбинантные вирусы вследствие несовместимости между полимеразами, участвующими в системах обратной генетики, и наиболее часто используемыми разновидностями клеток.The ability to produce recombinant influenza A virus facilitates future research on the influenza virus, but a practical solution has still not been found to use recombinant influenza A virus obtained by reverse genetics methods to sufficiently high titers in vaccines, due to the fact that most cell systems, if not all cell systems used in the preparation of vaccines do not allow, or only to a small extent, allow the replication of the above recombinant viruses due to incompatibilities and between polymerases involved in the reverse genetics systems, and the most commonly used species cells.
Вирус гриппа А является РНК-вирусом с минус-цепью. Это означает, что в одном цикле репликации продуцируются три типа РНК: отрицательная смысловая вРНК, положительная смысловая кРНК и положительная смысловая мРНК. В отличие от вирусной РНК (вРНК) эта мРНК является кэппированной и имеет поли(А)-хвост. Первые А-остатки этого поли(А)-хвоста мРНК соответствуют короткому участку U-остатков в этом геноме, который считают сигналом остановки транскрипции/полиаденилирования. Считается, что полимераза, когда она достигает этого участка U-остатков, подвергается повторяющимся циклам обратного смещения и таким путем создает полный поли(А)-хвост мРНК.Influenza A virus is a negative chain RNA virus. This means that in one replication cycle, three types of RNA are produced: negative sense vRNA, positive sense cRNA and positive sense mRNA. Unlike viral RNA (vRNA), this mRNA is capped and has a poly (A) tail. The first A residues of this poly (A) tail of the mRNA correspond to the short portion of the U residues in this genome, which is considered to be a signal for stopping transcription / polyadenylation. It is believed that polymerase, when it reaches this site of U-residues, undergoes repeated reverse biasing cycles and in this way creates a complete poly (A) tail of mRNA.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Данное изобретение обеспечивает систему обратной генетики для вируса гриппа, которая может быть применена в типах клеток различных видов. Полимераза I является ядрышковым ферментом, который транскрибирует рибосомную РНК и в изобилии экспрессируется в растущих клетках. рРНК, подобно вРНК, не имеет кэпа и поли(А)-хвоста, и, следовательно, полимераза I может быть использована для получения вРНК из кДНК. Транскрипция вирусной кДНК полимеразой I позволяет генерировать вирус-подобные РНК с правильными 5'- и 3'-концами. Однако в то время как аппарат транскрипции полимеразы II часто является совместимым с генами из различных видов, транскрипция полимеразы I проявляет строгую, хотя и не абсолютную видоспецифичность. Эта видоспецифичность сообщается взаимодействием факторов транскрипции с промотором и, в меньшей степени, белок-белковыми взаимодействиями между этими факторами. Эта видоспецифичность основанных на полимеразе I систем обратной генетики является основным недостатком развития вакцин, прежде всего потому, что промоторы полимеразы I для клеток других видов, чем человек, такие как промотор собачьей или птичьей полимеразы I, еще не были описаны, тогда как в промышленности часто используются хорошо определенные собачьи (например, клетки почки собаки Madin Darby (MDCK)) или птичьи клетки (фибробласты куриного зародыша (CEF)) для получения вакцины против вируса гриппа.The present invention provides a reverse genetics system for influenza virus that can be used in cell types of various types. Polymerase I is a nucleolar enzyme that transcribes ribosomal RNA and is expressed in abundance in growing cells. rRNA, like vRNA, does not have a cap and a poly (A) tail, and therefore, polymerase I can be used to obtain vRNA from cDNA. Transcription of viral cDNA by polymerase I allows the generation of virus-like RNAs with the correct 5'- and 3'-ends. However, while the transcription apparatus of polymerase II is often compatible with genes from various species, transcription of polymerase I exhibits strict, although not absolute species specificity. This species-specificity is reported by the interaction of transcription factors with a promoter and, to a lesser extent, by protein-protein interactions between these factors. This species-specificity of reverse genetics-based polymerase I systems is the main disadvantage of vaccine development, primarily because the promoters of polymerase I for cells of other species than humans, such as the dog or bird polymerase I promoter, have not yet been described, while in industry often well-defined canine (e.g. Madin Darby dog kidney cells (MDCK)) or bird cells (chicken germ fibroblasts (CEF)) are used to obtain the influenza virus vaccine.
Данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую генный сегмент вируса гриппа и промотор полимеразы бактериофага, или комплементарную цепь указанной нуклеиновой кислоты. В противоположность открытию Neuman & Kawaoka (Virology 287, 243-240, 2001), показывающему, что, в отличие от несегментированных вирусов, бросающимся в глаза исключением, где, как считали, не работает полимераза Т7, был вирус гриппа, генерирование которого включает в себя дополнительную сложность синтеза восьми вирусных РНК, наряду с этой полимеразой и нуклеопротеином из клонированной кДНК, данное изобретение обеспечивает значительную гибкость (свободу) в отношении плазмидных векторов для этой основанной на полимеразе бактериофага технологии обратной генетики, и в отношении элементов, которые они содержат. Например, авторы этого изобретения использовали РНК-полимеразу бактериофага Т7 для получения вРНК или кРНК-подобных молекул РНК, но могут быть использованы различные другие РНК-полимеразы, такие как РНК-полимераза бактериофага SP6. В предпочтительном варианте осуществления, изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую генный сегмент вируса гриппа и промотор Т7, или комплементарную цепь указанной нуклеиновой кислоты, позволяющую авторам основать систему этого изобретения для экспрессии генных сегментов вируса гриппа под контролем промотора Т7. В одном варианте осуществления, терминатор полимеразы отсутствует. Предпочтительно, указанная нуклеиновая кислота была обеспечена одним или двумя дополнительными остатками гуанина после промотора. Для создания вакцины получена нуклеиновая кислота согласно изобретению, которая содержит генный сегмент, который происходит из вируса гриппа, который рекомендован ВОЗ для вакцинации. В предпочтительном варианте осуществления изобретение связано с нуклеиновой кислотой, содержащей генный сегмент вируса гриппа А и промотор Т7 или комплементарную цепь указанной нуклеиновой кислоты.The present invention provides a nucleic acid comprising a gene segment of an influenza virus and a bacteriophage polymerase promoter, or a complementary strand of said nucleic acid. In contrast to the discovery of Neuman & Kawaoka (Virology 287, 243-240, 2001), showing that, unlike non-segmented viruses, the striking exception, where T7 polymerase was not thought to work, was the influenza virus, the generation of which includes the additional complexity of synthesizing eight viral RNAs, along with this polymerase and nucleoprotein from cloned cDNA, this invention provides significant flexibility (freedom) regarding plasmid vectors for this reverse gene polymerase-based bacteriophage technology iki, and the elements they contain. For example, the authors of this invention used T7 bacteriophage RNA polymerase to obtain vRNA or cRNA-like RNA molecules, but various other RNA polymerases, such as bacteriophage SP6 RNA polymerase, can be used. In a preferred embodiment, the invention provides a nucleic acid comprising an influenza virus gene segment and a T7 promoter, or a complementary strand of said nucleic acid, allowing the authors to establish a system of this invention for expression of influenza virus gene segments under the control of the T7 promoter. In one embodiment, a polymerase terminator is missing. Preferably, said nucleic acid has been provided with one or two additional guanine residues after the promoter. To create a vaccine obtained nucleic acid according to the invention, which contains a gene segment that comes from the influenza virus, which is recommended by WHO for vaccination. In a preferred embodiment, the invention relates to a nucleic acid comprising an influenza A virus gene segment and a T7 promoter or a complementary strand of said nucleic acid.
В частности, в двунаправленной системе предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота согласно изобретению не содержала терминатор Т7. Поскольку эта полимераза предпочтительно экспрессируется из плазмиды, трансфицированной вместе с плазмидами, экспрессирующими этот вирус, предложенная здесь система не ограничена определенными видами. Хотя системы обратной генетики на основе полимеразы Т7 используют иногда для высвобождения от несегментированных вирусов с минус-цепью, система обратной генетики для сегментированного вируса гриппа, основанная на технологии полимеразы бактериофага, ранее никогда не использовалась успешно. Один лимитирующий фактор в системах обратной генетики, использующих полимеразу Т7 для транскрипции кДНК, иногда пытаются преодолеть путем введения остатков G в сайт инициации транскрипции для усиления запускаемой полимеразой Т7 транскрипции. Этот подход использовали в спасении, например, RV, VSV и SV, однако, Zobel et al (Virology, 1994 Jul; 202(1):477-9; Nucleic Acids Res. 1993 Aug 11; 21(16):3607-14) указывают на то, что как 5'-, так и 3'-концы генного сегмента вируса гриппа А не должны быть точно определены для правильного функционирования вирусной полимеразы; таким образом, дополнительное добавление нуклеотидов в сайты транскрипции и введение остатков G в сайт инициации транскрипции не являются необходимыми. Однако неожиданно в предпочтительном варианте осуществления изобретения авторы получили нуклеиновую кислоту согласно изобретению, имеющую по меньшей мере один дополнительный остаток гуанина после промотора Т7, и даже предпочтительно, чтобы два дополнительных остатка гуанина следовали после промотора Т7. Данное изобретение связано также с клетками почки собаки Madin Darby (MDCK) или фибробластной клеткой куриного зародыша (CEF), содержащей полимеразу Т7. В частности, данное изобретение связано с клеткой, снабженной по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Данное изобретение облегчает использование мультиплазмидной системы, такой как 17-плазмидная или 12-плазмидная или 8-плазмидная система, и, поскольку изобретение связано с клеткой, содержащей нуклеиновую кислоту согласно изобретению, дополнительно содержащую полимеразу Т7, предпочтительно экспрессируемую из плазмиды, трансфицированной вместе с одной или несколькими плазмидами, способными экспрессировать генный сегмент вируса гриппа согласно изобретению, эта система не ограничена определенными видами. Заявлено также применение клетки согласно изобретению, где указанная полимераза Т7 содержит сигнал ядерной локализации. В предпочтительном варианте осуществления клетка не является клеткой приматов, в результате чего можно избежать введения ДНК приматов в клеточный материал или вакцину, полученную из нуклеиновой кислоты или клетки согласно изобретению. Предпочтительно используют клетку MDCK или клетку CEF. Преимуществом изобретения является то, что для этой системы обратной генетики не нужен вирус-помощник (хелперный вирус), все вирусные частицы, полученные путем трансфекции, содержат желаемую нуклеиновую кислоту и могут быть использованы без разработки процедур клонирования в последующей системе получения вакцины. Данное изобретение впервые связано с реплицирующейся вирусной частицей, содержащей нуклеиновую кислоту согласно изобретению. В US 5166057 такая вирусная частица, способная к репликации, не была получена, и другие попытки использования системы Т7 для сегментированного вируса гриппа были также безуспешны до создания данного изобретения. Композиции культур клеток с титрами вируса ~104 вирусных частиц согласно изобретению могут быть легко получены без репликации вируса в культуре трансфицированных клеток, которые могут быть повышены до >107, когда вирусу дают реплицироваться. Особенно важно, что репликация частицы согласно изобретению достигается без вируса-помощника (хелперного вируса). Такая композиция культуры клеток, содержащая клетку или материал, полученные из клетки согласно изобретению, или вирус или материал, полученные из вирусной частицы согласно изобретению, может быть предпочтительно использована для приготовления фармацевтической композиции, направленной на генерирование иммунологической защиты против инфицирования субъекта вирусом гриппа. Определенно клетки согласно изобретению не были получены в US 5166057. Таким образом, данное изобретение связано также со способом получения реплицирующейся (репликативной) частицы вируса гриппа, предусматривающим культивирование клетки по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, используемая в указанном способе, содержала по меньшей мере один, а предпочтительно, семь или восемь генных сегментов вируса гриппа и промотор полимеразы бактериофага или комплементарную цепь указанной нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот. Кроме того, предпочтительно, чтобы указанный сегмент не содержал терминатора полимеразы бактериофага, причем предпочтительно, чтобы такой сегмент был обеспечен по меньшей мере одним дополнительным остатком гуанина, следующим за промотором, или был обеспечен двумя дополнительными остатками гуанина, следующими за промотором. Предпочтительно указанные сегменты происходят из вируса гриппа, который рекомендован ВОЗ для целей создания вакцины, например, генный сегмент вируса гриппа А. Наконец, данное изобретение обеспечивает репликативную частицу вируса гриппа, получаемую по описанному здесь способу. Таким образом, изобретение связано также со способом генерирования иммунологической защиты против инфицирования субъекта вирусом гриппа, предусматривающим введение нуждающемуся в этом субъекту композиции согласно изобретению. Такие композиции предпочтительно получены в виде вакцины, т.е. путем смешивания вирусных частиц или вирусных белков, полученных из таких частиц (субъединичные вакцины) с подходящим фармацевтическим носителем, таким как солевой раствор или адъювант (например, соль алюминия или другой обычно используемый эксципиент (см., например, http://www.cdc.gov/nip/publications/pink/Appendices/A/Excipient.pdf.).In particular, in a bidirectional system, it is preferred that the nucleic acid of the invention does not contain a T7 terminator. Since this polymerase is preferably expressed from a plasmid transfected with plasmids expressing the virus, the system proposed here is not limited to certain species. Although T7 polymerase reverse genetics systems are sometimes used to release negative segmented non-segmented viruses, the reverse genetics system for a segmented influenza virus based on bacteriophage polymerase technology has never been used successfully. One limiting factor in reverse genetics systems using T7 polymerase for cDNA transcription is sometimes tried to be overcome by introducing G residues into the transcription initiation site to enhance T7 polymerase-triggered transcription. This approach has been used in rescue, for example, RV, VSV and SV, however, Zobel et al (Virology, 1994 Jul; 202 (1): 477-9; Nucleic Acids Res. 1993 Aug 11; 21 (16): 3607-14 ) indicate that both the 5'- and 3'-ends of the gene segment of the influenza A virus should not be precisely determined for the proper functioning of the viral polymerase; thus, the additional addition of nucleotides to transcription sites and the introduction of G residues at the transcription initiation site are not necessary. However, unexpectedly in a preferred embodiment of the invention, the authors obtained a nucleic acid according to the invention having at least one additional guanine residue after the T7 promoter, and it is even preferable that two additional guanine residues follow the T7 promoter. The invention is also related to Madin Darby dog kidney cells (MDCK) or chicken embryonic fibroblast cell (CEF) containing T7 polymerase. In particular, this invention relates to a cell equipped with at least one nucleic acid according to the invention. This invention facilitates the use of a multiplasmid system, such as a 17-plasmid or 12-plasmid or 8-plasmid system, and since the invention is associated with a cell containing a nucleic acid according to the invention, additionally containing T7 polymerase, preferably expressed from a plasmid transfected with one or several plasmids capable of expressing the gene segment of the influenza virus according to the invention, this system is not limited to certain species. The use of a cell according to the invention is also claimed, wherein said T7 polymerase contains a nuclear localization signal. In a preferred embodiment, the cell is not a primate cell, as a result of which the introduction of primate DNA into the cellular material or vaccine derived from the nucleic acid or cell of the invention can be avoided. Preferably, an MDCK cell or a CEF cell is used. An advantage of the invention is that for this reverse genetics system no helper virus (helper virus) is needed, all virus particles obtained by transfection contain the desired nucleic acid and can be used without developing cloning procedures in the subsequent vaccine production system. This invention is first associated with a replicating viral particle containing a nucleic acid according to the invention. In US 5166057, such a replicable viral particle was not obtained, and other attempts to use the T7 system for a segmented influenza virus were also unsuccessful before the invention. Compositions of cell cultures with virus titers of ~ 10 4 virus particles according to the invention can be easily obtained without virus replication in a culture of transfected cells, which can be raised to> 10 7 when the virus is allowed to replicate. It is particularly important that particle replication according to the invention is achieved without a helper virus (helper virus). Such a cell culture composition comprising a cell or material obtained from a cell according to the invention, or a virus or material obtained from a virus particle according to the invention, can preferably be used to prepare a pharmaceutical composition aimed at generating immunological protection against infection of a subject with influenza virus. Specifically, the cells according to the invention were not obtained in US 5166057. Thus, the present invention also relates to a method for producing a replicating (replicative) particle of an influenza virus, comprising culturing a cell with at least one nucleic acid according to the invention. Preferably, the at least one nucleic acid used in the method comprises at least one, and preferably seven or eight, gene segments of the influenza virus and a bacteriophage polymerase promoter or a complementary strand of said nucleic acid or nucleic acids. In addition, it is preferable that said segment does not contain a bacteriophage polymerase terminator, and it is preferable that such a segment be provided with at least one additional guanine residue following the promoter, or be provided with two additional guanine residues following the promoter. Preferably, said segments are derived from an influenza virus that is recommended by WHO for the purpose of creating a vaccine, for example, a gene segment of influenza A virus. Finally, the present invention provides a replicative particle of an influenza virus obtained by the method described herein. Thus, the invention also relates to a method for generating immunological protection against infection of a subject with an influenza virus, comprising administering to a subject in need of a composition according to the invention. Such compositions are preferably formulated as a vaccine, i.e. by mixing viral particles or viral proteins derived from such particles (subunit vaccines) with a suitable pharmaceutical carrier, such as saline or adjuvant (for example, an aluminum salt or other commonly used excipient (see, for example, http: //www.cdc .gov / nip / publications / pink / Appendices / A / Excipient.pdf.).
Подписи к фигурамCaptions to figures
Фиг.1. Конструкции, использованные для системы обратной генетики на основе T7pol. См. текст подробного описания стратегий клонирования.Figure 1. The constructs used for the T7pol reverse genetics system. See text for a detailed description of cloning strategies.
Фиг.2. FACS-анализ клеток 293Т, трансфицированных конструкциями, кодирующими GFP-минигеномы (0,6 мкг), гены T7pol (0,6 мкг) и полимеразы вируса гриппа А (каждого по 1 мкг). Левая панель: % GFP-положительных клеток спустя 30 часов после трансфекции. Правая панель: уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция) в GFP-положительной фракции. На оси Х, показаны трансфицированные конструкции GFP-минигеномов либо в смысловой (S), либо в антисмысловой (AS) ориентации, с указанным количеством дополнительных нуклеотидов G. Черные столбцы показывают котрансфекции всех 4 компонентов комплекса полимеразы вируса гриппа А (PB2, PB1, PA и NP), белые столбцы показывают контрольные трансфекции, из которых исключена конструкция pHMG-NP.Figure 2. FACS analysis of 293T cells transfected with constructs encoding GFP minigenomes (0.6 μg), T7pol genes (0.6 μg) and influenza A virus polymerase (each 1 μg). Left panel:% GFP-positive cells 30 hours after transfection. Right panel: GFP expression level (mean fluorescence) in the GFP-positive fraction. The X axis shows the transfected constructs of GFP minigenomes in either sense (S) or antisense (AS) orientations with the indicated number of additional nucleotides G. Black bars show cotransfection of all 4 components of the influenza A virus polymerase complex (PB2, PB1, PA and NP), white bars show control transfections from which the pHMG-NP construct was excluded.
Фиг.3. FACS-анализ клеток 293Т, трансфицированных 0,6 мкг антисмысловых GFP-минигеномов с двумя дополнительными остатками G, 4 мкг конструкций полимеразы вируса гриппа А и 0,6 мкг каждого из T7pol (C) дикого типа, T7pol, содержащего сигнал ядерной локализации (N), или обеих конструкций в соотношении 1:1 (C/N). Левая панель: % GFP-положительных клеток спустя 30 часов после трансфекции. Правая панель: уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция) в GFP-положительной фракции.Figure 3. FACS analysis of 293T cells transfected with 0.6 μg of antisense GFP minigenomes with two additional G residues, 4 μg of influenza A polymerase constructs, and 0.6 μg of each of the wild-type T7pol (C) containing nuclear localization signal (N ), or both designs in a 1: 1 ratio (C / N). Left panel:% GFP-positive cells 30 hours after transfection. Right panel: GFP expression level (mean fluorescence) in the GFP-positive fraction.
Фиг.4. FACS-анализ клеток 293Т или BSR-T7, трансфицированных 0,6 мкг конструкции, кодирующей антисмысловой GFP-минигеном с двумя дополнительными остатками G, и 4 мкг конструкций полимеразы вируса гриппа А. Показан уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция) в GFP-положительной фракции клеток. Клетки трансфицировали плазмидой или не трансфицировали плазмидой, экспрессирующей T7pol, содержащей сигнал ядерной локализации (293Т против 293 N или BSR-T7 против BSR-T7 N). Черные столбцы показывают котрансфекции всеми 4 компонентами комплекса полимеразы вируса гриппа А (PB2, PB1, PA и NP), белые столбцы показывают контрольные трансфекции, из которых была исключена конструкция pHMG-NP.Figure 4. FACS analysis of 293T or BSR-T7 cells transfected with 0.6 μg of the construct encoding the antisense GFP minigen with two additional G residues and 4 μg of influenza A polymerase constructs. GFP expression level (mean fluorescence) in the GFP-positive fraction is shown cells. Cells were transfected with a plasmid or not transfected with a plasmid expressing T7pol containing a nuclear localization signal (293T versus 293 N or BSR-T7 versus BSR-T7 N). Black bars indicate cotransfection with all 4 components of the influenza A virus polymerase complex (PB2, PB1, PA, and NP), white bars indicate control transfections from which the pHMG-NP construct was excluded.
Фиг.5. FACS-анализ клеток 293Т, трансфицированных 0,6 мкг конструкции, кодирующей антисмысловой GFP-минигеном с двумя дополнительными остатками G (AS-2G) или смысловой GFP-минигеном (S-0G), и 0,6 мкг плазмиды, экспрессирующей T7pol с сигналом ядерной локализации, и 4 мкг плазмид, экспрессирующих гены полимеразы вируса гриппа А. Левая панель: % GFP-положительных клеток спустя 30 часов после трансфекции. Правая панель: уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция) в GFP-положительной фракции. Черные столбцы показывают котрансфекции всеми 4 компонентами комплекса полимеразы вируса гриппа А (PB2, PB1, PA и NP), белые столбцы показывают контрольные трансфекции, из которых была исключена конструкция pHMG-NP.Figure 5. FACS analysis of 293T cells transfected with 0.6 μg of the construct encoding the antisense GFP minigen with two additional G residues (AS-2G) or sense GFP minigen (S-0G), and 0.6 μg of the plasmid expressing T7pol with the signal nuclear localization, and 4 μg of plasmids expressing influenza A polymerase genes A. Left panel:% GFP-positive cells 30 hours after transfection. Right panel: GFP expression level (mean fluorescence) in the GFP-positive fraction. Black bars indicate cotransfection with all 4 components of the influenza A virus polymerase complex (PB2, PB1, PA, and NP), white bars indicate control transfections from which the pHMG-NP construct was excluded.
Фиг.6. FACS-анализ клеток 293Т и MDCK, трансфицированных 0,6 мкг конструкций, кодирующих GFP-антисмысловой минигеном с двумя дополнительными остатками G (AS-2G), 0,6 мкг плазмиды, экспрессирующей T7pol с сигналом ядерной локализации, и 4 мкг плазмид, экспрессирующих гены полимеразы вируса гриппа А. Левая панель: % GFP-положительных клеток спустя 30 часов после трансфекции. Правая панель: уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция) в GFP-положительной фракции. Черные столбцы показывают котрансфекции всеми 4 компонентами комплекса полимеразы вируса гриппа А (PB2, PB1, PA и NP), белые столбцы показывают контрольные трансфекции, из которых была исключена конструкция pHMG-NP.6. FACS analysis of 293T and MDCK cells transfected with 0.6 μg of constructs encoding a GFP antisense minigen with two additional G residues (AS-2G), 0.6 μg of a plasmid expressing T7pol with a nuclear localization signal, and 4 μg of plasmids expressing influenza A polymerase genes A. Left panel:% GFP-positive cells 30 hours after transfection. Right panel: GFP expression level (mean fluorescence) in the GFP-positive fraction. Black bars indicate cotransfection with all 4 components of the influenza A virus polymerase complex (PB2, PB1, PA, and NP), white bars indicate control transfections from which the pHMG-NP construct was excluded.
Подробное описаниеDetailed description
Пример 1Example 1
Генерирование рекомбинантного вируса гриппа А с использованием основанной на РНК-полимеразе Т7 системы обратной генетикиGeneration of Recombinant Influenza A virus using T7 RNA polymerase-based reverse genetics system
ВведениеIntroduction
В течение продолжительного времени фундаментальное исследование вирусов гриппа А затруднялось отсутствием доступности эффективных систем обратной генетики. Хотя самые ранние способы обратной генетики для РНК-вирусов с минус-цепью были фактически разработаны для вируса гриппа А (7, 18), получение этого вируса исключительно из рекомбинантной ДНК было достигнуто лишь недавно (9, 20).For a long time, a fundamental study of influenza A viruses was hampered by the lack of access to effective reverse genetics systems. Although the earliest reverse genetics methods for negative strand RNA viruses were actually developed for influenza A virus (7, 18), obtaining this virus exclusively from recombinant DNA was only recently achieved (9, 20).
Вирус гриппа А является РНК-вирусом с минус-цепью. Во время цикла репликации этого вируса образуются три типа РНК: отрицательная смысловая геномная вирусная РНК (вРНК), положительная смысловая РНК, комплементарная этой геномной РНК (кРНК) и положительная смысловая мессенджер-РНК (мРНК). В то время как вРНК и кРНК содержат по существу немодифицированные концы, мРНК является кэппированной и имеет поли(А)-хвост (16).Influenza A virus is a negative chain RNA virus. During the replication cycle of this virus, three types of RNA are formed: negative sense genomic viral RNA (vRNA), positive sense RNA, complementary to this genomic RNA (cRNA) and positive sense messenger RNA (mRNA). While vRNA and cRNA contain essentially unmodified ends, mRNA is capped and has a poly (A) tail (16).
РНК-полимераза I (PolI) является ядрышковым ферментом, который транскрибирует рибосомную РНК (рРНК) и в изобилии экспрессируется в растущих клетках. Подобно вРНК, рРНК не имеет кэпа и поли(А)-хвоста (23). Hobom et al. (19, 21, 29) успешно получали искусственные подобные вРНК вируса гриппа сегменты с точными 5'- и 3'-концами с использованием PolI. Транскрипция кДНК, клонированной в контексте промотор PolI-терминатор-кассеты позволила генерировать вРНК-подобные молекулы с правильными 5'- и 3'-концами (29). Последующие исследования, которые включали в себя хелперный вирус гриппа, продемонстрировали, что эти геномные молекулы вРНК могли узнаваться и реплицироваться комплексом полимеразы вируса гриппа и упаковываться в вирусы, являющиеся потомством вируса гриппа. Эта система позволяла генерировать вирусы гриппа, содержащие мутации в одном из вирусных генных сегментов или дополнительный генный сегмент, что позволило исследовать вирусные гены и их продукты. В результате применения хелперного вируса, требовался отбор вируса-трансфектанта, что является довольно трудоемким.RNA polymerase I (PolI) is a nucleolar enzyme that transcribes ribosomal RNA (rRNA) and is expressed in abundance in growing cells. Like vRNA, rRNA does not have a cap and a poly (A) tail (23). Hobom et al. (19, 21, 29) successfully obtained artificial influenza virus vRNA-like segments with exact 5'- and 3'-ends using PolI. Transcription of cDNA cloned in the context of the PolI-terminator-cassette promoter allowed the generation of vRNA-like molecules with regular 5'- and 3'-ends (29). Subsequent studies, which included the influenza helper virus, demonstrated that these genomic vRNA molecules could be recognized and replicated by the influenza virus polymerase complex and packaged into viruses that are offspring of the influenza virus. This system allowed the generation of influenza viruses containing mutations in one of the viral gene segments or an additional gene segment, which allowed the study of viral genes and their products. As a result of the use of helper virus, the selection of a transfectant virus was required, which is rather laborious.
Neumann et al. создали систему PolI для извлечения вирусов гриппа А полностью из клонированной кДНК (20). кДНК, кодирующие полноразмерные вРНК вируса гриппа А, клонировали между промотором PolI человека и терминатором PolI мыши. В принципе, трансфекция этих восьми плазмид в эукариотические клетки должна была привести к синтезу всех восьми вРНК гриппа. Эмбриональные клетки почки человека (293Т) котрансфицировали этими восемью экспрессионными плазмидами и плазмидами, экспрессирующими вирусный нуклеопротеин и белки полимеразы PB2, PB1 и РА от промотора РНК-полимеразы II (PolII). Эти вРНК, синтезированные клеточной PolI, упаковывали в РНП и извлекали количества, превышающие 1×103 бляшкообразующих единиц инфекционного вируса на мл (бое/мл) супернатанта. Котрансфекция плазмидами, экспрессирующими остальные структурные вирусные белки, приводила к существенному увеличению продукции вируса, а именно 3×104-5×107 бое/мл (20). Fodor et al. сообщали о сходной системе для извлечения вируса гриппа А (9). Эта система зависела от восьми плазмид, кодирующих все восемь кДНК вРНК, фланкированных промотором PolI человека, но она содержала последовательность рибозима вируса гепатита δ (HδVrib), а не последовательность терминатора PolI. Эти плазмиды котрансфицировали в клетки Vero с четырьмя плазмидами, экспрессирующими белки PB1, PB2, PA и NP от основного позднего промотора типа 2 аденовируса. С использованием равных количеств каждой из экспрессионных плазмид Fodor et al. сообщили степень высвобождения 1-2 инфекционных вирусных частиц из 106 трансфицированных клеток (9). Авторы данного изобретения сконструировали сходную систему обратной генетики для продуцирования рекомбинантного вируса гриппа А/PR/8/34. Авторы сделали вывод, что титры вируса ~104 могут быть получены без репликации вируса в культуре трансфицированных клеток, и эти титры могут быть увеличены до >107, когда вирусу дают реплицироваться (4). Поскольку эти запускаемые полимеразой PolI системы требовали котрансфекции 12-16 плазмид, было необходимым применение клеточных линий, которые могли быть трансфицированы с высокой эффективностью, для эффективного продуцирования рекомбинантного вируса.Neumann et al. created the PolI system for the extraction of influenza A viruses completely from cloned cDNA (20). cDNAs encoding the full-length influenza A virus vRNAs were cloned between the human PolI promoter and the mouse PolI terminator. In principle, transfection of these eight plasmids into eukaryotic cells should have led to the synthesis of all eight influenza vRNAs. Human kidney embryonic cells (293T) were cotransfected with these eight expression plasmids and plasmids expressing the viral nucleoprotein and protein polymerase PB2, PB1 and RA from the RNA polymerase II promoter (PolII). These vRNAs synthesized by cellular PolI were packaged in RNP and amounts greater than 1 × 10 3 plaque-forming units of the infectious virus per ml (bout / ml) supernatant were recovered. Cotransfection with plasmids expressing the remaining structural viral proteins led to a significant increase in virus production, namely 3 × 10 4 -5 × 10 7 ppm / ml (20). Fodor et al. reported a similar system for the extraction of influenza A virus (9). This system depended on eight plasmids encoding all eight vRNA cDNAs flanked by the human PolI promoter, but it contained the hepatitis δ virus ribozyme sequence (HδVrib) rather than the PolI terminator sequence. These plasmids were co-transfected into Vero cells with four plasmids expressing the proteins PB1, PB2, PA and NP from the main late adenovirus type 2 promoter. Using equal amounts of each of the expression plasmids, Fodor et al. reported the degree of release of 1-2 infectious viral particles from 10 6 transfected cells (9). The inventors have constructed a similar reverse genetics system to produce the recombinant influenza virus A / PR / 8/34. The authors concluded that ~ 10 4 virus titers can be obtained without virus replication in the culture of transfected cells, and these titers can be increased to> 10 7 when the virus is allowed to replicate (4). Since these PolI polymerase-triggered systems required co-transfection of 12-16 plasmids, it was necessary to use cell lines that could be transfected with high efficiency to efficiently produce recombinant virus.
Затем Hoffmann et al. разработали двунаправленную систему транскрипции PolI-PolII для генерирования вируса гриппа А только из восьми плазмид (12). В этой двунаправленной системе кДНК вРНК встраивали между промотором PolI человека и минимальными последовательностями терминатора PolI мыши. Всю эту конструкцию встраивали между промотором PolII и сайтом полиаденилирования. Это делало возможной транскрипцию вРНК и мРНК от промоторов PolI и PolII соответственно из единой конструкции. Котрансфекция восьми плазмид PolI-PolII, каждая из которых кодирует один из генных сегментов вируса гриппа А, в клетках 293Т, сокультивируемых с клетками почки собаки Madin Darby, приводила к извлечению инфекционного вируса гриппа А с выходами до 2×107 бое/мл супернатанта (12). Применение одной матрицы для синтеза как мРНК, так и вРНК уменьшало количество плазмид, требуемых для генерирования вируса. Сообщалось, что эффективность генерирования вируса в этой системе было сходным с эффективностью однонаправленной (12-16 плазмид) системы PolI.Then Hoffmann et al. developed a bidirectional PolI-PolII transcription system to generate influenza A virus from only eight plasmids (12). In this bidirectional cDNA system, vRNA was inserted between the human PolI promoter and the minimum mouse PolI terminator sequences. This entire construct was inserted between the PolII promoter and the polyadenylation site. This made possible the transcription of vRNA and mRNA from the PolI and PolII promoters, respectively, from a single construct. Cotransfection of eight PolI-PolII plasmids, each of which encodes one of the gene segments of the influenza A virus, in 293T cells co-cultivated with Madin Darby dog kidney cells, led to the extraction of the influenza A virus in yields of up to 2 × 10 7 fights / ml supernatant ( 12). The use of a single matrix for the synthesis of both mRNA and vRNA reduced the number of plasmids required to generate the virus. It was reported that the efficiency of virus generation in this system was similar to that of the unidirectional (12-16 plasmids) PolI system.
В то время как промоторы PolII часто являются совместимыми с аппаратом транскрипции из различных видов, транскрипция от промоторов PolI проявляет строгую, хотя и не абсолютную видоспецифичность. Эта видоспецифичность сообщается взаимодействием факторов транскрипции с промотором и, в меньшей степени, белок-белковыми взаимодействиями между этими факторами (23).While PolII promoters are often compatible with a transcription apparatus from various species, transcription from PolI promoters exhibits strict, although not absolute species specificity. This species-specificity is reported by the interaction of transcription factors with the promoter and, to a lesser extent, by protein-protein interactions between these factors (23).
Эта видоспецифичность основанных на PolI (полимеразе I) систем обратной генетики образует главный недостаток. Описанные выше системы обратной генетики использовали промотор PolI человека, ограничивающий продуцирование рекомбинантного вируса только клетками, происходящими из приматов, такими как клетки 293Т или клетки Vero. Хотя промоторы PolI были охарактеризованы для нескольких видов, в том числе для человека, мыши, крысы и свиньи (8, 14, 17), они остаются неизвестными для многих других видов. Клетки собак и птиц рутинным образом используют для исследования вируса гриппа А и получения вакцин, но промоторы PolI собак и птиц до сих пор не были описаны. Для улучшения гибкости технологии обратной генетики для вируса гриппа авторы данного изобретения пытались разработать универсальную систему обратной генетики. Авторы решили создать систему на основе экспрессии генных сегментов вируса гриппа А под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 (pT7). Поскольку РНК-полимераза бактериофага Т7 (T7pol) может подаваться в клетки трансфекцией или посредством использования стабильно модифицированных клеточных линий, эта система не ограничивается клетками из конкретных видов.This species-specificity of PolI (polymerase I) -based reverse genetics systems forms a major disadvantage. The reverse genetics systems described above used the human PolI promoter, restricting the production of the recombinant virus to only cells derived from primates, such as 293T cells or Vero cells. Although PolI promoters have been characterized for several species, including humans, mice, rats, and pigs (8, 14, 17), they remain unknown for many other species. Dog and bird cells are routinely used for influenza A virus research and vaccines, but the PolI promoters of dogs and birds have not yet been described. To improve the flexibility of reverse genetics technology for influenza virus, the authors of this invention tried to develop a universal system of reverse genetics. The authors decided to create a system based on the expression of influenza A virus gene segments under the control of the R7 polymerase promoter of bacteriophage T7 (pT7). Since T7 bacteriophage RNA polymerase (T7pol) can be delivered to cells by transfection or through the use of stably modified cell lines, this system is not limited to cells from specific species.
Системы обратной генетики на основе T7pol используют для получения несегментированных вирусов с минус-цепью. Schnell et al. были первыми в получении несегментированных вирусов с минус-цепью только из клонированной кДНК (27). Клон кДНК делали кодирующим полноразмерную анти-геномную РНК вируса бешенства (RV). Эта кДНК была фланкирована pT7 и последовательностью НδVrib после последовательности терминатора T7pol (tT7). После транскрипции с использованием T7pol точный 3'-конец генома получают аутолитическим отщеплением последовательности НδVrib на 3'-конце. Эту плазмиду котрансфицировали с экспрессионными плазмидами, кодирующими вирусный N-белок и белки полимеразы L и Р под контролем pT7 в клетки, экспрессирующие T7pol. Эта процедура приводила к высвобождению рекомбинантного RV, но только приблизительно из 1 из 2×107 трансфицированных клеток (27). С тех пор сходные системы были описаны для семейств Paramyxoviridae, Rhabdoviridae и Filoviridae несегментированных NSV (10).T7pol-based reverse genetics systems are used to produce non-segmented negative-chain viruses. Schnell et al. were the first to produce non-segmented negative chain viruses from cloned cDNA only (27). A cDNA clone was made encoding the full-length anti-genomic rabies virus (RV) RNA. This cDNA was flanked by pT7 and the HδVrib sequence after the T7pol terminator sequence (tT7). After transcription using T7pol, the exact 3'-end of the genome is obtained by autolytic cleavage of the HδVrib sequence at the 3'-end. This plasmid was co-transfected with expression plasmids encoding the viral N protein and L and P polymerase proteins under the control of pT7 to T7pol expressing cells. This procedure resulted in the release of recombinant RV, but only from about 1 in 2 × 10 7 transfected cells (27). Since then, similar systems have been described for the families Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, and Filoviridae of non-segmented NSV (10).
Для успешного извлечения несегментированных вирусов с минус-цепью из кДНК, очень часто получают положительную смысловую антигеномную РНК (кРНК), а не отрицательную смысловую вРНК. Считают, что одновременное присутствие голой отрицательной смысловой вРНК и положительной смысловой мРНК, кодирующих вирусные белки, будет приводить к гибридизации, предотвращающей сборку генома в рибонуклеопротеиновые комплексы (РНП) (27). Вирусы с минус-цепью обычно не встречаются с такой проблемой, так как они всегда сохраняют их геном в форме РНП, что препятствует гибридизации. Извлечение вируса Сендаи (15), вируса парагриппа типа 3 (6) и метапневмовируса человека (11) сообщалось с кДНК, кодирующей антисмысловую геномную РНК; однако эффективности были значимо более низкими, чем результаты с положительной смысловой РНК. Этот принцип был также применен для высвобождения рекомбинантного вируса гриппа. Hoffmann et al. (13) также определяли эффективность получения рекомбинантного вируса гриппа из антигеномной положительной смысловой РНК. В противоположность несегментированным и сегментированным вирусам с минус-цепью, реплицирующимся только в цитоплазме, вирус гриппа А мог быть получен как из геномных, так и антигеномных векторов со сходными эффективностями.For the successful extraction of non-segmented negative chain viruses from cDNA, positive sense antigenomic RNA (cRNA) is very often obtained, rather than negative sense vRNA. It is believed that the simultaneous presence of naked negative sense mRNA and positive sense mRNA encoding viral proteins will lead to hybridization that prevents the assembly of the genome into ribonucleoprotein complexes (RNPs) (27). Viruses with a negative chain usually do not encounter such a problem, since they always preserve their genome in the form of RNP, which prevents hybridization. Extraction of Sendai virus (15), type 3 parainfluenza virus (6), and human metapneumovirus (11) has been reported with cDNA encoding antisense genomic RNA; however, efficiencies were significantly lower than results with positive sense RNA. This principle has also been applied to release recombinant influenza virus. Hoffmann et al. (13) also determined the effectiveness of obtaining recombinant influenza virus from antigenic positive sense RNA. In contrast to non-segmented and segmented negative-chain viruses that replicate only in the cytoplasm, influenza A virus could be obtained from both genomic and antigenomic vectors with similar efficiencies.
Одним из ограничивающих факторов в системах высвобождения вирусов с использованием рТ7 является то, что остатки в положениях +1 - +3 могут влиять на транскрипцию. Наблюдали, что транскрипция кДНК может быть увеличена введением 2 или 3 остатков G непосредственно ниже рТ7 (22). Это наблюдение было применено для получения, например, рекомбинантного RV (27), вируса везикулярного стоматита (28), респираторного синтициального вируса (3) и метапневмовируса человека (11). По-видимому, для этих вирусов дополнительные остатки G в одном из концов генома не влияли на репликацию вируса, но оказывали положительное действие на запускаемую T7pol транскрипцию.One limiting factor in virus release systems using pT7 is that residues at positions +1 to +3 may affect transcription. It has been observed that cDNA transcription can be increased by introducing 2 or 3 G residues immediately below pT7 (22). This observation was used to obtain, for example, recombinant RV (27), vesicular stomatitis virus (28), respiratory syncytial virus (3), and human metapneumovirus (11). Apparently, for these viruses, additional G residues at one end of the genome did not affect the replication of the virus, but had a positive effect on the T7pol-triggered transcription.
Системы на основе T7pol использовали широко для исследований обратной генетики вируса гриппа (18), но до настоящего времени не было описано получение на основе плазмид рекомбинантного вируса гриппа. Здесь авторы изобретения впервые описывают систему обратной генетики на основе T7pol для получения рекомбинантного вируса гриппа.T7pol-based systems have been widely used to study the reverse genetics of the influenza virus (18), but the preparation of recombinant influenza virus based on plasmids has not yet been described. Here, the inventors for the first time describe a reverse genetics system based on T7pol to produce a recombinant influenza virus.
Материалы и способыMaterials and methods
Клетки и вирусыCells and viruses
Клетки почки собаки Madin Darby (MDCK) культивировали в среде ЕМЕМ (BioWhittaker), дополненной 10% ФТС, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамином, 1,5 мг/мл бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES и заменимыми аминокислотами. Клетки 293Т культивировали в DMEM (BioWhittaker), дополненной 10% ФТС, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамином, 1 мМ пируватом натрия и заменимыми аминокислотами. Клетки BSR-T7, линию клеток детеныша хомячка, стабильно экспрессирующую РНК-полимеразу Т7 (2). Клетки BSR-T7 выращивали в DMEM, дополненной 10% ФТС, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамином, 1 мМ пируватом натрия и 0,5 мг/мл G418 (Life Technologies, Breda, The Netherlands). Вирус гриппа А/PR/8/34, адаптированный для репликации в содержащих зародыш куриных яйцах и не способный к оптимальной репликации в культурах клеток млекопитающих, пассировали семь раз при низкой множественности заражения в клетках MDCK, выращиваемых в среде Episerf (Gibco BRL), дополненной 10 МЕ/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина. После седьмого пассажа рутинным образом получали титры вируса 108 TCID50/мл.Madin Darby dog kidney cells (MDCK) were cultured in EMEM (BioWhittaker) supplemented with 10% FCS, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 2 mM glutamine, 1.5 mg / ml sodium bicarbonate, 10 mM HEPES and interchangeable amino acids. 293T cells were cultured in DMEM (BioWhittaker) supplemented with 10% FCS, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate and essential amino acids. BSR-T7 cells, a hamster cub cell line stably expressing T7 RNA polymerase (2). BSR-T7 cells were grown in DMEM supplemented with 10% FCS, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate and 0.5 mg / ml G418 (Life Technologies, Breda, The Netherlands) . Influenza virus A / PR / 8/34, adapted for replication in embryonic chicken eggs and not capable of optimal replication in mammalian cell cultures, was passaged seven times with low multiplicity of infection in MDCK cells grown in Episerf medium (Gibco BRL) supplemented with 10 IU / ml penicillin and 10 μg / ml streptomycin. After the seventh passage, virus titers of 10 8 TCID 50 / ml were routinely obtained.
Трансфекция клеток 293Т293T Cell Transfection
Транзиторные опосредованные фосфатом кальция трансфекции клеток 293Т выполняли по существу, как описано (24). Клетки высевали за день до трансфекции в желатинизированные культуральные чашки с диаметром 100 мм для получения 50% конфлюэнтных монослоев. После ночной трансфекции среду для трансфекции заменяли свежей средой, дополненной 2% ФТС, для получения вируса или 10% ФТС для всех других трансфекций. Клетки инкубировали в течение 30-72 часов, после чего супернатанты собирали и клетки анализировали на флуоресценцию, если необходимо. Плазмиду pEGFP-N1 (Clontech, BD Biosciences, Amsterdam, The Netherlands) трансфицировали параллельно во всех экспериментах и процент флуоресцентных клеток измеряли в FACSCalibur (Becton Dickinson) проточном цитометре, подтверждая, что эффективность трансфекции была в диапазоне 95-100 процентов. Содержащие вирус супернатанты осветляли центрифугированием в течение 10 минут при 300 × g. Титры вируса в супернатанте определяли либо сразу же, либо после хранения при 4°С в течение менее, чем одной недели, или при -80°С не дольше, чем одна неделя.Transient calcium phosphate mediated transfection of 293T cells was performed essentially as described (24). Cells were seeded the day before transfection into gelatinized culture dishes with a diameter of 100 mm to obtain 50% confluent monolayers. After overnight transfection, the transfection medium was replaced with fresh medium supplemented with 2% FCS to obtain the virus or 10% FCS for all other transfections. Cells were incubated for 30-72 hours, after which supernatants were harvested and cells were analyzed for fluorescence, if necessary. Plasmid pEGFP-N1 (Clontech, BD Biosciences, Amsterdam, The Netherlands) was transfected simultaneously in all experiments and the percentage of fluorescent cells was measured in a FACSCalibur (Becton Dickinson) flow cytometer, confirming that the transfection efficiency was in the range of 95-100 percent. Virus-containing supernatants were clarified by centrifugation for 10 minutes at 300 × g. Virus titers in the supernatant were determined either immediately or after storage at 4 ° C for less than one week, or at -80 ° C for no longer than one week.
Трансфекция клеток MDCKMDCK cell transfection
Транзиторную трансфекцию клеток MDCK выполняли по существу, как описано ранее (1). Вкратце, 240 мкл среды Optimem I (Gibco BRL) добавляли к 10 мкл Липофектамина 2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. К этой смеси добавляли предназначенное количество ДНК, доведенное до объема 50 мкл с использованием среды Optimem I. Эту смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. После инкубирования добавляли 200 мкл культуральной среды MDCK (см. выше) без пенициллина и стрептомицина и эту смесь добавляли к 1×106 клеток MDCK в суспензии в 6-луночном планшете. После 5 часов инкубации клетки промывали дважды PBS и культивировали в 2 мл культуральной среды MDCK без пенициллина и стрептомицина. Эту среду заменяли культуральной средой MDCK, содержащей 2% ФТС, после ночного инкубирования.Transient transfection of MDCK cells was performed essentially as described previously (1). Briefly, 240 μl of Optimem I medium (Gibco BRL) was added to 10 μl of
Трансфекция клеток BSR-T7BSR-T7 Cell Transfection
Для транзиторной трансфекции клеток BSR-T7, 400000 клеток высевали в 6-луночную культуральную чашку за день перед трансфекцией с получением 50-70% конфлюэнтных монослоев. Бессывороточную DMEM (240 мкл) добавляли к 10 мкл Липофектамина 2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 минут. К этой смеси добавляли ДНК, доведенную до 50 мкл бессывороточной DMEM, и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Перед трансфекцией среду заменяли 2 мл бессывороточной DMEM. После инкубации смесь для трансфекции добавляли по каплям к этим клеткам и инкубировали в течение 5 часов при 37°С. После трансфекции клетки промывали один раз PBS и добавляли 2 мл DMEM, дополненной 2% ФТС, для получения вируса или 10% ФТС для FACS-анализов.For transient transfection of BSR-T7 cells, 400,000 cells were plated in a 6-well culture plate one day before transfection to obtain 50-70% confluent monolayers. Serum free DMEM (240 μl) was added to 10 μl of
ПлазмидыPlasmids
Использовали эукариотические экспрессионные векторы, кодирующие T7pol (pAR3126 и pAR3132). Тогда как плазмида pAR3126 кодирует T7pol дикого типа, плазмида pAR3132 экспрессирует T7pol, содержащий сигнал ядерной локализации (NLS), который эффективно нацеливает T7pol на ядро клетки (5). Эукариотические экспрессионные плазмиды, из которых экспрессируются белки полимеразы вируса гриппа А, использовали промотор гидроксиметилглутарил-кофермент А-редуктазы мыши, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA и pHMG-NP (25).Eukaryotic expression vectors encoding T7pol (pAR3126 and pAR3132) were used. Whereas plasmid pAR3126 encodes wild-type T7pol, plasmid pAR3132 expresses T7pol containing a nuclear localization signal (NLS) that efficiently targets T7pol to the cell nucleus (5). Eukaryotic expression plasmids from which influenza A polymerase proteins are expressed used the mouse hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase promoter, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA, and pHMG-NP (25).
НδVrib pPolI-Cat-RT (25) амплифицировали при помощи ПЦР и клонировали в сайты XbaI-BamHI pSP72. Последовательность tT7, расщепленную BamHI-EcoRV, клонировали в сайты BamHI-HpaI pSP72-НδVrib с получением pSP72-НδVrib-tT7 (MS24). Олигонуклеотид, кодирующий рТ7, лигировали в сайты NdeI-XbaI pSP72-НδVrib-tT7 в подходящем контексте относительно введенных сайтов BbsI с получением вектора pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 (MS25, фиг.1). Открытую рамку считывания зеленого флуоресцентного белка (GFP), фланкированную NCR из сегмента 5 вируса гриппа А/PR/8/34, клонировали в сайты BbsI pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 с использованием pSP-Hu-GFP-Mu (4) в качестве матрицы. Этот GFP-минигеном клонировали, как в смысловой, так и в антисмысловой ориентациях, и он содержал 0/2/3 дополнительных остатков G непосредственно ниже рТ7 (фиг.1).HδVrib pPolI-Cat-RT (25) was amplified by PCR and cloned into XbaI-BamHI pSP72 sites. The tT7 sequence cleaved by BamHI-EcoRV was cloned into the BamHI-HpaI sites of pSP72-HδVrib to give pSP72-HδVrib-tT7 (MS24). The oligonucleotide encoding pT7 was ligated into the NdeI-XbaI sites pSP72-HδVrib-tT7 in a suitable context relative to the introduced BbsI sites to obtain the vector pSP72-pT7-HδVrib-tT7 (MS25, Fig. 1). The open reading frame of green fluorescent protein (GFP) flanked by NCR from segment 5 of influenza virus A / PR / 8/34 was cloned into BbsI sites pSP72-pT7-HδVrib-tT7 using pSP-Hu-GFP-Mu (4) as matrices. This GFP minigen was cloned in both sense and antisense orientations, and it contained 0/2/3 of additional G residues immediately below pT7 (FIG. 1).
Для клонирования генных сегментов вируса гриппа А/PR/8/34 в pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 двунаправленные конструкции вируса гриппа А/PR/8/34, описанные de Wit et al. (4), использовали в качестве матрицы для ПЦР (четвертый 3'-нуклеотид соответствовал последовательностям вируса гриппа А/PR/8/34, сообщенным в базе данных National Influenza sequence Database). Праймеры, содержащие сайт рестрикции AarI, использовали для клонирования сегментов 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, и лигирование тупых концов использовали для сегмента 5; эти генные сегменты клонировали в сайты BbsI в антисмысловой ориентации, и они содержали 2 дополнительных остатка G после рТ7.For cloning gene segments of the influenza A / PR / 8/34 virus into pSP72-pT7-HδVrib-tT7, the bidirectional influenza A / PR / 8/34 constructs described by de Wit et al. (4), was used as a template for PCR (the fourth 3'-nucleotide corresponded to the sequences of the influenza A / PR / 8/34 virus reported in the National Influenza sequence Database). Primers containing the AarI restriction site were used to clone
Двунаправленный вектор pSP72-рТ7-НδVrib-tT7-pCMV (MS65, фиг.1) получали клонированием промотора CMV (pCMV) ниже tT7 для создания возможности получения мРНК из соответствующих генных сегментов. pCMV амплифицировали при помощи ПЦР с использованием праймеров, содержащих сайты рестрикции AseI. pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 частично расщепляли AseI и pCMV лигировали ниже tT7 в подходящем направлении для получения мРНК из генного сегмента.The bidirectional vector pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV (MS65, FIG. 1) was obtained by cloning the CMV promoter (pCMV) below tT7 to enable the preparation of mRNA from the corresponding gene segments. pCMV was amplified by PCR using primers containing AseI restriction sites. pSP72-pT7-HδVrib-tT7 was partially digested with AseI and pCMV was ligated below tT7 in an appropriate direction to obtain mRNA from the gene segment.
Сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 снова клонировали для получения каждой из двунаправленных запускаемых T7pol конструкций вируса гриппа А/PR/8/34.Influenza A / PR / 8/34 segments were again cloned to produce each of the bi-directional T7pol-triggered influenza A / PR / 8/34 constructs.
Авторы изобретения генерировали также набор двунаправленных векторов, из которых был делетирован tT7. Это выполняли расщеплением pSP72-рТ7-НδVrib-tT7-pCMV BamHI-BpeEI, обработкой ферментом Кленова и повторным лигированием с получением pSP72-рТ7-НδVrib-pCMV (MS90, фиг.1).The inventors also generated a set of bidirectional vectors from which tT7 was deleted. This was done by digesting pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV with BamHI-BpeEI, digesting with Klenov enzyme and re-ligating to obtain pSP72-pT7-HδVrib-pCMV (MS90, FIG. 1).
Сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 снова клонировали для получения каждой из двунаправленных запускаемых T7pol конструкций вируса гриппа А/PR/8/34.Influenza A / PR / 8/34 segments were again cloned to produce each of the bi-directional T7pol-triggered influenza A / PR / 8/34 constructs.
Все плазмиды секвенировали с использованием набора для секвенирования Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) и Генетического Анализатора 3100 (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями изготовителя.All plasmids were sequenced using the Big Dye Terminator v3.1 sequencing kit (Applied Biosystems) and the 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) according to the manufacturer's instructions.
Получение рекомбинантного вируса с использованием системы на основе T7polObtaining a recombinant virus using a system based on T7pol
Клетки 293 Т трансфицировали, как описано выше, 5 мкг из каждой из однонаправленных плазмид, содержащих генный сегмент PR/8/34, 5 мкг каждой из экспрессионных плазмид HMG-PB2, HMG-PB1, HMG-PA, HMG-NP и 15 мкг pAR3132. Альтернативно, авторы трансфицировали 5 мкг из каждой из двунаправленных плазмид, содержащих генный сегмент PR/8/34, и 15 мкг pAR3132. Супернатанты собирали спустя 72 часа после трансфекции и 1 мл использовали для инфицирования конфлюэнтного монослоя клеток MDCK.293 T cells were transfected, as described above, with 5 μg from each of the unidirectional plasmids containing the PR / 8/34 gene segment, 5 μg of each of the expression plasmids HMG-PB2, HMG-PB1, HMG-PA, HMG-NP and 15 μg pAR3132. Alternatively, we transfected 5 μg from each of the bidirectional plasmids containing the PR / 8/34 gene segment and 15 μg pAR3132. Supernatants were collected 72 hours after transfection and 1 ml was used to infect the confluent monolayer of MDCK cells.
Инфицирования и определения титров вирусаInfection and determination of virus titers
Перед инокуляцией клетки MDCK промывали дважды PBS и 1 мл супернатанта клеток 293Т использовали для инокуляции конфлюэнтного монослоя клеток MDCK в 6-луночном планшете; 40 мкг трипсина (2,5%, Bio Whittaker) добавляли во время инфицирования. Планшеты выдерживали при 37°С в течение 1 часа и промывали два раза PBS, после чего добавляли 2 мл среды ЕМЕМ (BioWhittaker), дополненной 4% БСА, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамином, 1,5 мг/мл бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES, заменимыми аминокислотами и 20 мкг/мл трипсина (среда для инфицирования). Через 3 дня после инфицирования супернатанты этих культур собирали и испытывали на активность НА в качестве индикатора инфицирования этих клеток. Определения титров вируса выполняли, как описано ранее (26). Вкратце, готовили десятикратные серийные разведения супернатантов трансфицированных клеток в среде для инфицирования. Перед инокуляцией эти клетки промывали два раза PBS. 100 мкл разведенных культуральных супернатантов использовали для инокуляции конфлюэнтного монослоя клеток MDCK в 96-луночных планшетах. После 1 часа при 37°С эти клетки промывали опять PBS и в каждую лунку добавляли 200 мкл свежей среды для инфицирования. Через 3 дня после инфицирования супернатанты этих культур испытывали на активность НА в качестве индикатора инфицирования клеток в отдельных лунках. Титры инфицирования рассчитывали из 10 повторностей в соответствии со способом Spearman-Karber (26).Prior to inoculation, MDCK cells were washed twice with PBS and 1 ml of 293T cell supernatant was used to inoculate a confluent monolayer of MDCK cells in a 6-well plate; 40 μg of trypsin (2.5%, Bio Whittaker) was added during infection. The plates were kept at 37 ° C for 1 hour and washed twice with PBS, after which 2 ml of EMEM medium (BioWhittaker) supplemented with 4% BSA, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 2 mM glutamine, 1, 5 mg / ml sodium bicarbonate, 10 mM HEPES, essential amino acids and 20 μg / ml trypsin (infection medium). 3 days after infection, supernatants of these cultures were collected and tested for HA activity as an indicator of infection of these cells. Virus titer determinations were performed as previously described (26). Briefly, ten-fold serial dilutions of transfected cell supernatants were prepared in infection medium. Before inoculation, these cells were washed twice with PBS. 100 μl of diluted culture supernatants were used to inoculate a confluent monolayer of MDCK cells in 96-well plates. After 1 hour at 37 ° C, these cells were washed again with PBS and 200 μl of fresh infection medium was added to each well. 3 days after infection, the supernatants of these cultures were tested for HA activity as an indicator of cell infection in individual wells. Infection titers were calculated from 10 replicates according to the Spearman-Karber method (26).
Результатыresults
Анализы GFP-минигеномов с использованием однонаправленной системы обратной генетики на основе T7polTFPp-based unidirectional reverse genetics assays for GFP minigenomes
Конструировали однонаправленный вектор, содержащий рТ7, НδVrib и tT7. Открытую рамку считывания GFP, фланкированную некодирующими районами (NCR) сегмента 5 вируса гриппа А/PR/8/34, клонировали в pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 в смысловой (S) и антисмысловой (AS) ориентации с 0, 2 или 3 дополнительными остатками G (фиг.1 и приложения 2 и 3). Эти конструкции были названы S-0G, S-2G, S-3G, AS-0G, AS-2G и AS-3G соответственно. Авторы изобретения испытывали, какие из этих возможных конструкций приводили к наилучшей эффективности.A unidirectional vector was constructed containing pT7, HδVrib and tT7. The open GFP reading frame, flanked by non-coding regions (NCR) of segment 5 of influenza A / PR / 8/34, was cloned into pSP72-pT7-HδVrib-tT7 in sense (S) and antisense (AS) orientations with 0, 2 or 3 additional residues G (FIG. 1 and appendices 2 and 3). These designs were named S-0G, S-2G, S-3G, AS-0G, AS-2G and AS-3G, respectively. The inventors tested which of these possible designs led to the best efficiency.
Авторы трансфицировали клетки 293Т одним из этих GFP-минигеномов (S-0G, S-2G, S-3G, AS-0G, AS-2G, AS-3G), плазмидой экспрессии T7pol (pAR3132) и четырьмя плазмидами, экспрессирующими белки РВ2, РВ1, РА и NP (pHMG-PB2, pHMG-PB1, pHMG-PA, pHMG-NP). В качестве контролей, авторы выполняли те же самые трансфекции, из которых исключали pHMG-NP, что должно было приводить к отсутствию репликации этого GFP-минигенома. Через 30 часов после трансфекции эти клетки анализировали на предмет флуоресценции в FACSCalibur. Эти результаты изображены на фиг.2. Из левой панели можно видеть, что наивысшую долю GFP-положительных клеток наблюдали после трансфекции GFP-минигенома в антисмысловой ориентации, с двумя дополнительными остатками G.The authors transfected 293T cells with one of these GFP minigenomes (S-0G, S-2G, S-3G, AS-0G, AS-2G, AS-3G), a T7pol expression plasmid (pAR3132), and four plasmids expressing PB2 proteins, PB1, PA, and NP (pHMG-PB2, pHMG-PB1, pHMG-PA, pHMG-NP). As controls, the authors performed the same transfections from which pHMG-NP was excluded, which would result in a lack of replication of this GFP minigenome. 30 hours after transfection, these cells were analyzed for fluorescence in FACSCalibur. These results are depicted in figure 2. From the left panel, you can see that the highest proportion of GFP-positive cells was observed after transfection of the GFP-minigenome in the antisense orientation, with two additional G residues.
Другие конструкции GFP-минигеномов также давали долю GFP-положительных клеток, но несколько более низкую. При сравнении средней флуоресценции GFP-положительных клеток (фиг.2, правая панель), опять GFP-минигеномы в антисмысловой ориентации с двумя дополнительными остатками G показывали наилучшую производительность. В этом эксперименте GFP-минигеном в смысловой ориентации с двумя дополнительными остатками G обнаруживал самую плохую производительность, а другие конструкции были промежуточными.Other constructs of GFP-minigenomes also gave a fraction of GFP-positive cells, but slightly lower. When comparing the average fluorescence of GFP-positive cells (Fig. 2, right panel), again GFP-minigenomes in the antisense orientation with two additional G residues showed the best performance. In this experiment, with a GFP minigen in a sense orientation with two additional residues, G showed the worst performance, while other constructs were intermediate.
Хотя авторы изобретения наблюдали некоторую вариацию в отношении доли GFP-экспрессирующих клеток и уровней экспрессии GFP между различными плазмидами GFP-минигеномов от эксперимента к эксперименту (данные не показаны), GFP-минигеном в антисмысловой ориентации с двумя дополнительными остатками G обычно был наиболее производительным, и, следовательно, эта конструкция была отобрана для последующих экспериментов.Although the inventors observed some variation in the proportion of GFP-expressing cells and the levels of GFP expression between different plasmids of GFP minigenomes from experiment to experiment (data not shown), the antisense GFP minigenome with two additional G residues was usually the most productive, and therefore, this design was selected for subsequent experiments.
Ядерная экспрессия T7pol против цитоплазматической экспрессии T7polNuclear expression of T7pol versus cytoplasmic expression of T7pol
Одной проблемой, которая потенциально должна была быть решена авторами изобретения, была экспрессия T7pol. Для обратной генетики парамиксовируса, использовали T7pol, экспрессируемый первично в цитоплазме клетки, что является желательным, так как репликация парамиксовируса также имеет место в цитоплазме. Вирусы гриппа реплицируются в ядре клетки, и, следовательно, экспрессия T7pol в цитоплазме не является наилучшим выбором. Таким образом, авторы изобретения хотели сравнить уровень экспрессии GFP, когда либо используется цитоплазматическая версия T7pol (плазмида AR3126), либо используется T7pol, содержащий сигнал ядерной локализации (NLS, плазмида pAR3132).One problem that could potentially be solved by the inventors was the expression of T7pol. For reverse paramyxovirus genetics, T7pol was used, expressed primarily in the cytoplasm of the cell, which is desirable since replication of paramyxovirus also takes place in the cytoplasm. Influenza viruses replicate in the cell nucleus, and therefore, the expression of T7pol in the cytoplasm is not the best choice. Thus, the inventors wanted to compare the level of GFP expression when either the cytoplasmic version of T7pol (plasmid AR3126) is used, or T7pol containing the nuclear localization signal (NLS, plasmid pAR3132) is used.
Результаты этого эксперимента показаны на фиг.3. При использовании плазмиды экспрессии T7pol дикого типа, средняя флуоресценция GFP в положительных клетках была равна 521. Этот уровень экспрессии GFP мог быть увеличен значимо с использованием T7pol, который содержал сигнал ядерной локализации (средняя флуоресценция равна 1106). При объединении конструкций T7pol с сигналом ядерной локализации и без сигнала ядерной локализации (в отношении 1:1, при поддержании неизменным общего количества трансфицированной плазмиды) наблюдали промежуточный уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция была равна 775). В многочисленных независимых экспериментах с использованием большого разнообразия экспрессирующих GFP-минигеном плазмид эти результаты были воспроизводимыми; наблюдали 2-10-кратное увеличение экспрессии GFP при использовании ядерной версии T7pol (данные не показаны). Таким образом, в последующих экспериментах авторы использовали T7pol, содержащий сигнал ядерной локализации.The results of this experiment are shown in FIG. When using the wild-type T7pol expression plasmid, the average GFP fluorescence in positive cells was 521. This level of GFP expression could be increased significantly using T7pol, which contained a nuclear localization signal (average fluorescence is 1106). When T7pol constructs were combined with a nuclear localization signal and without a nuclear localization signal (in the ratio of 1: 1, while maintaining the total number of transfected plasmids unchanged), an intermediate level of GFP expression was observed (average fluorescence was 775). In numerous independent experiments using a wide variety of GFP-minigen expressing plasmids, these results were reproducible; a 2-10-fold increase in GFP expression was observed using the nuclear version of T7pol (data not shown). Thus, in subsequent experiments, the authors used T7pol containing a nuclear localization signal.
Транзиторная экспрессия T7pol против стабильной экспрессии T7polTransient expression of T7pol versus stable expression of T7pol
Для некоторых систем обратной генетики парамиксовирусов T7pol подается не посредством плазмидной трансфекции, а посредством использования клеточной линии, которая делает возможной стабильную экспрессию T7pol. Для этой цели доступны клетки детеныша хомячка (BSR-T7). Авторы изобретения испытывали, могут ли клетки BSR-T7 использоваться для транскрипции минигенома вируса гриппа-GFP, который мог бы затем реплицироваться комплексом полимеразы вируса гриппа, приводя к экспрессии GFP (фиг.4).For some paramyxovirus reverse genetics systems, T7pol is not delivered via plasmid transfection, but through the use of a cell line that enables stable expression of T7pol. Hamster cub cells (BSR-T7) are available for this purpose. The inventors tested whether BSR-T7 cells could be used to transcribe the influenza-GFP virus minigenome, which could then be replicated by the influenza virus polymerase complex, resulting in the expression of GFP (Figure 4).
Как можно видеть на фиг.4, высокая флуоресценция GFP в клетках 293Т в сильной степени зависит от экспрессии T7pol. В клетках BSR-T7 наблюдали относительно высокие уровни экспрессии GFP после котрансфекции GFP-минигенома с комплексом полимеразы вируса гриппа в отличие от трансфекций, из которых была исключена плазмида pHMG-NP. Было обнаружено, что после добавления плазмиды, экспрессирующей ядерную версию T7pol, экспрессия GFP была еще более высокой. Относительно высокие уровни экспрессии GFP в клетках BSR-T7 предполагают, что стабильная экспрессия T7pol является более эффективной, чем транзиторная (временная) экспрессия вследствие трансфекции. Однако эксперимент, в котором ядерный T7pol был обеспечен трансфекцией, предполагает, что для обратной генетики вируса гриппа стабильная клеточная линия, экспрессирующая ядерный T7pol, могла бы быть даже более эффективной, чем T7pol дикого типа.As can be seen in FIG. 4, the high fluorescence of GFP in 293T cells is highly dependent on the expression of T7pol. Relatively high levels of GFP expression were observed in BSR-T7 cells after cotransfection of the GFP minigenome with the influenza virus polymerase complex, in contrast to transfections from which the plasmid pHMG-NP was excluded. It was found that after the addition of a plasmid expressing the nuclear version of T7pol, the expression of GFP was even higher. Relatively high levels of GFP expression in BSR-T7 cells suggest that stable T7pol expression is more effective than transient (transient) expression due to transfection. However, an experiment in which nuclear T7pol was provided by transfection suggests that for reverse genetics of influenza virus, a stable cell line expressing nuclear T7pol might be even more effective than wild-type T7pol.
Получение рекомбинантного вируса с использованием однонаправленной системы обратной генетики на основе T7polObtaining a recombinant virus using a unidirectional reverse genetics system based on T7pol
Затем генные сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 клонировали в вектор pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 для генерирования рекомбинантного вируса гриппа А/PR/8/34.The influenza A / PR / 8/34 virus gene segments were then cloned into the pSP72-pT7-HδVrib-tT7 vector to generate the recombinant influenza A / PR / 8/34 virus.
Авторы трансфицировали клетки 293Т восемью конструкциями, кодирующими генные сегменты вируса гриппа А/PR/8/34, pT7pol (pAR3132), pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA и pHMG-NP. После трансфекции к среде добавляли трипсин для создания возможности репликации получаемых вирусов. Через 72 часа после трансфекции супернатанты собирали и использовали для инокуляции клеток MDCK. Через 3 дня после инокуляции выполняли НА-тест на супернатанте этих клеток MDCK в качестве указания на репликацию вируса. НА-тест был положительным. Затем определяли титр вируса супернатантов 293Т и MDCK. Было показано, что титр вируса в супернатанте 293Т был равен 1,6×101 TCID50/мл; было показано, что титр вируса в супернатанте MDCK был равен 2,0×107 TCID50/мл. Несколько более низкие титры вируса в клетках 293Т и MDCK получали, когда трипсин не добавляли к клеткам 293Т после трансфекции (данные не показаны). Таким образом, это показывает впервые высвобождение вируса гриппа А с использованием плазмиды только с рекомбинантным вирусом гриппа А, которое не использует промотор PolI.We transfected 293T cells with eight constructs encoding the gene segments of the influenza virus A / PR / 8/34, pT7pol (pAR3132), pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA and pHMG-NP. After transfection, trypsin was added to the medium to allow replication of the resulting viruses. 72 hours after transfection, supernatants were collected and used to inoculate MDCK cells. 3 days after inoculation, a HA test was performed on the supernatant of these MDCK cells as an indication of virus replication. The NA test was positive. Then the titer of the
Двунаправленная система Т7Bidirectional T7 system
Затем авторы изобретения хотели разработать двунаправленную систему обратной генетики под контролем рТ7. Плазмидный вектор получали клонированием pCMV в pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 с получением вектора pSP72-рТ7-НδVrib-tT7-pCMV (фиг.1). Открытую рамку считывания GFP, фланкированную некодирующими районами (NCR) сегмента 5 вируса гриппа А/PR/8/34, клонировали в pSP72-рТ7-НδVrib-tT7-pCMV в антисмысловой (AS) ориентации с 2 дополнительными остатками G. Поскольку авторы изобретения ожидали, что эта плазмида будет приводить к экспрессии GFP без необходимости репликации минигенома комплексом полимеразы вируса гриппа, (pCMV находится в смысловой ориентации относительно этого минигенома), авторы изготовили также сходную конструкцию, содержащую этот минигеном (0 остатков G) в смысловой ориентации относительно рТ7 (следовательно, в антисмысловой ориентации относительно pCMV). Эти минигеномные плазмиды трансфицировали в клетки 293Т вместе с плазмидами, экспрессирующими ядерный T7pol и pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA и pHMG-NP. Клетки анализировали FACS спустя 30 часов (фиг.5).Then, the inventors wanted to develop a bi-directional reverse genetics system under the control of pT7. The plasmid vector was obtained by cloning pCMV into pSP72-pT7-HδVrib-tT7 to obtain the vector pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV (Fig. 1). An open GFP reading frame flanked by non-coding regions (NCR) of influenza A virus segment 5 / A / PR / 8/34 was cloned in pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV in antisense (AS) orientation with 2 additional G residues. As the inventors expected that this plasmid will lead to the expression of GFP without the need for replication of the minigenome by the influenza polymerase complex, (pCMV is in the sense orientation relative to this minigenome), the authors also made a similar construct containing this minigenome (0 G residues) in the sense orientation itelno pT7 (hence, in the antisense orientation relative pCMV). These minigenomic plasmids were transfected into 293T cells together with plasmids expressing nuclear T7pol and pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA and pHMG-NP. Cells were analyzed by FACS after 30 hours (Figure 5).
Трансфекция смыслового GFP-минигенома (S-0G) неполным комплексом полимеразы вируса гриппа приводила к очень небольшому количеству GFP-положительных клеток (фиг.5, левая панель) с очень низкой экспрессией GFP (фиг.5, правая панель). В присутствии полного комплекса полимеразы вируса гриппа ~7% клеток были GFP-положительными со средней флуоресценцией ~1200. С использованием этой плазмиды с антисмысловым GFP-минигеномом относительно большая доля клеток (~10%) экспрессировала GFP в отсутствие полного комплекса полимеразы вируса гриппа, но только при низких уровнях (средняя флуоресценция GFP 182). После котрансфекции полного комплекса полимеразы вируса гриппа доля клеток, экспрессирующих GFP, не увеличивалась, тогда как уровень экспрессии GFP на клетку значимо увеличивался (средняя флуоресценция GFP 1205). Таким образом, из этого эксперимента авторы смогли сделать вывод, что двунаправленный экспрессионный вектор был функциональным; авторы наблюдали низкие уровни экспрессии GFP без необходимости комплекса полимеразы вируса гриппа вследствие образования мРНК GFP из pCMV. Следует отметить, что это было подтверждено трансфекцией клеток 293Т только плазмидой AS-2G GFP-минигенома, приводящей к сходным уровням экспрессии GFP (~19% клеток, экспрессирующих при средней флуоресценции 128, данные не показаны). Кроме того, авторы наблюдали увеличенные уровни экспрессии GFP в присутствии комплекса полимеразы вируса гриппа как результат репликации минигенома, транскрибируемого от рТ7. Таким образом, двунаправленная экспрессионная плазмида рТ7-pCMV была функциональной.Transfection of the semantic GFP minigenome (S-0G) with an incomplete influenza polymerase complex resulted in a very small number of GFP-positive cells (Fig. 5, left panel) with very low GFP expression (Fig. 5, right panel). In the presence of a complete influenza polymerase complex, ~ 7% of the cells were GFP-positive with an average fluorescence of ~ 1200. Using this plasmid with antisense GFP-minigenome, a relatively large proportion of cells (~ 10%) expressed GFP in the absence of the full complex of influenza virus polymerase, but only at low levels (average GFP 182 fluorescence). After cotransfection of the full complex of the influenza virus polymerase, the proportion of cells expressing GFP did not increase, while the level of GFP expression per cell increased significantly (average fluorescence of GFP 1205). Thus, from this experiment, the authors were able to conclude that the bidirectional expression vector was functional; the authors observed low levels of GFP expression without the need for an influenza virus polymerase complex due to the formation of GFP mRNA from pCMV. It should be noted that this was confirmed by transfection of 293T cells with plasmid AS-2G of the GFP minigenome only, resulting in similar levels of GFP expression (~ 19% of cells expressing with an average fluorescence of 128, data not shown). In addition, the authors observed increased levels of GFP expression in the presence of the influenza virus polymerase complex as a result of replication of the minigenome transcribed from pT7. Thus, the bidirectional expression plasmid pT7-pCMV was functional.
Продуцирование рекомбинантного вируса с использованием двунаправленной системы обратной генетики на основе T7polRecombinant virus production using a bi-directional reverse genetics system based on T7pol
Затем генные сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 клонировали в вектор pSP72-рТ7-НδVrib-tT7-pCMV для генерирования рекомбинантного вируса гриппа А/PR/8/34.The influenza A / PR / 8/34 virus gene segments were then cloned into the pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV vector to generate the recombinant influenza A / PR / 8/34 virus.
Авторы изобретения трансфицировали клетки 293Т восемью конструкциями, кодирующими генные сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 и pT7pol (pAR3132). После трансфекции к среде добавляли трипсин для создания возможности репликации продуцируемых вирусов. Через 72 часа после трансфекции супернатанты собирали и использовали для инокуляции клеток MDCK. Через 3 дня после инокуляции выполняли НА-тест на супернатанте этих клеток MDCK в качестве указания на репликацию вируса. Этот НА-тест был отрицательным, свидетельствуя о том, что не был извлечен рекомбинантный вирус.The inventors transfected 293T cells with eight constructs encoding the gene segments of the influenza virus A / PR / 8/34 and pT7pol (pAR3132). After transfection, trypsin was added to the medium to allow replication of the produced viruses. 72 hours after transfection, supernatants were collected and used to inoculate MDCK cells. 3 days after inoculation, a HA test was performed on the supernatant of these MDCK cells as an indication of virus replication. This HA test was negative, indicating that no recombinant virus was recovered.
Из репортерных анализов минигеномов с использованием двунаправленных векторов для экспрессии генов РВ2, РВ1, РА и NP, авторы получили доказательство того, что экспрессия белка из этих плазмид была очень низкой (данные не показаны). Авторы предположили, что последовательность tT7 препятствовала транскрипции от pCMV, приводя к низкому продуцированию кодируемых генов. Таким образом, авторы генерировали новую двунаправленную плазмиду, из которой была удалена последовательность tT7 (pSP72-рТ7-НδVrib-pCMV). Генные сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 клонировали в вектор pSP72-рТ7-НδVrib-pCMV для генерирования рекомбинантного вируса гриппа А/PR/8/34. В начальных попытках опять не продуцировался рекомбинантный вирус. Однако после некоторой оптимизации количества плазмид, использованных для трансфекции, авторы успешно получали рекомбинантный вирус. Количества плазмид, используемые для этого эксперимента, были 10 мкг каждой из конструкций, кодирующих РВ2, РВ1, РА и НА, и 5 мкг каждой из конструкций, кодирующих NP, NA, MA и NS. Хотя титры рекомбинантного вируса были недетектируемыми в клетках 293Т, последующая инокуляция клеток MDCK приводила к вирусу с начальным титром 1,3×105 TCID50/мл.From reporter analyzes of minigenomes using bidirectional vectors for expression of the PB2, PB1, PA, and NP genes, the authors obtained evidence that protein expression from these plasmids was very low (data not shown). The authors suggested that the tT7 sequence impeded transcription from pCMV, resulting in low production of encoded genes. Thus, the authors generated a new bi-directional plasmid from which the tT7 sequence (pSP72-pT7-HδVrib-pCMV) was deleted. The influenza A / PR / 8/34 gene segments were cloned into the pSP72-pT7-HδVrib-pCMV vector to generate the recombinant influenza A / PR / 8/34 virus. In the initial attempts, again no recombinant virus was produced. However, after some optimization of the number of plasmids used for transfection, the authors successfully obtained a recombinant virus. The number of plasmids used for this experiment was 10 μg of each of the constructs encoding PB2, PB1, PA and HA, and 5 μg of each of the constructs encoding NP, NA, MA and NS. Although recombinant virus titers were not detectable in 293T cells, subsequent inoculation of MDCK cells resulted in a virus with an initial titer of 1.3 × 10 5 TCID 50 / ml.
T7pol-система в клетках MDCKT7pol system in MDCK cells
Для обеспечения дополнительного доказательства универсального характера системы обратной генетики на основе T7pol авторы испытывали репликацию GFP-минигенома в клетках MDCK, а не в клетках 293Т. Хотя эксперименты с клетками BSR-T7 уже обеспечили доказательство того, что система обратной генетики на основе T7pol работает в клетках, происходящих не из клеток приматов (фиг.4), клетки MDCK более широко используются для исследования вируса гриппа и получения вакцины.To provide additional evidence of the universal nature of the reverse genetics system based on T7pol, the authors tested the replication of the GFP minigenome in MDCK cells, and not in 293T cells. Although experiments with BSR-T7 cells have already provided evidence that the T7pol reverse genetics system works in non-primate cells (Figure 4), MDCK cells are more widely used to study the influenza virus and to obtain the vaccine.
Как можно видеть на фиг.6, было обнаружено, что система обратной генетики на основе T7pol является функциональной в клетках MDCK. Вместе с результатами на клетках BSR-T7 (фиг.4) эти эксперименты указывают на то, что система обратной генетики на основе T7pol действительно представляет «универсальную» систему, применимую для большого разнообразия типов клеток. Из этого эксперимента можно также сделать вывод, что теперь является возможным получение рекомбинантного вируса гриппа из клеток, не являющихся клетками приматов.As can be seen in Fig.6, it was found that the reverse genetics system based on T7pol is functional in MDCK cells. Together with the results on BSR-T7 cells (FIG. 4), these experiments indicate that the reverse genetics system based on T7pol really represents a “universal” system applicable to a wide variety of cell types. From this experiment, we can also conclude that it is now possible to obtain a recombinant influenza virus from cells that are not primate cells.
Здесь авторы изобретения впервые показали получение рекомбинантного вируса гриппа А/PR/8/34 (MDCK-адаптированного штамма NIBSC) с использованием системы на основе T7pol в клетках 293Т. Однако нет никаких предположений, которые ограничивают применение этих способов только в отношении вируса гриппа А А/PR/8/34; они могут быть применены ко всем вирусам гриппа типов А, В и С, а также к другим сегментированным РНК-вирусам с минус-цепью. Нет также предположений, которые ограничивают применение этих способов только в отношении клеток 293Т, BSR-Т7 и MDCK; T7pol может поставляться, например, трансфекцией широкого диапазона клеточных линий, в которых мог бы затем продуцироваться рекомбинантный вирус.Here, the inventors first showed the preparation of a recombinant influenza virus A / PR / 8/34 (MDCK-adapted strain of NIBSC) using a T7pol-based system in 293T cells. However, there are no suggestions that limit the use of these methods only for influenza A virus A / PR / 8/34; they can be applied to all influenza viruses of types A, B and C, as well as to other segmented RNA viruses with a negative chain. There are also no assumptions that limit the use of these methods only for 293T, BSR-T7, and MDCK cells; T7pol can be supplied, for example, by transfection of a wide range of cell lines in which a recombinant virus could then be produced.
Существует также значительная гибкость (свобода) в отношении плазмидных векторов для технологии обратной генетики на основе T7pol и в отношении элементов, которые они содержат. Здесь авторы использовали РНК-полимеразу бактериофага Т7 для получения вРНК или кРНК-подобных молекул РНК, но могли бы также использоваться различные другие РНК-полимеразы, такие как РНК-полимераза бактериофага SP6. В показанных здесь экспериментах РНК-полимераза Т7 была модифицирована таким образом, что она содержит сигнал ядерной локализации большого Т-антигена SV40, но РНК-полимераза может быть модифицирована с использованием различных других сигналов ядерного нацеливания (например, сигналов белка К hnRNP). Здесь авторы изобретения использовали последовательность рибозима вируса гепатита дельта, но были описаны другие последовательности рибозимов, которые могли бы использоваться альтернативно. Наконец, описанная здесь система не зависит от применения экспрессирующих векторов белков полимеразы вируса гриппа, основанных на мышином промоторе гидроксиметилглутарил-кофермент А-редуктазы (pHMG-конструкции); могут быть использованы белки полимеразы из широкого диапазона вирусов гриппа, и они могут быть экспрессированы с использованием широкого диапазона экспрессирующих векторов.There is also considerable flexibility (freedom) with respect to plasmid vectors for T7pol reverse genetics technology and with respect to the elements that they contain. Here, the authors used T7 bacteriophage RNA polymerase to obtain vRNA or cRNA-like RNA molecules, but various other RNA polymerases such as SP6 bacteriophage RNA polymerase could also be used. In the experiments shown here, T7 RNA polymerase was modified so that it contains the nuclear localization signal of the SV40 large T antigen, but RNA polymerase can be modified using various other nuclear targeting signals (e.g., K hnRNP protein signals). Here, the inventors used the hepatitis delta virus ribozyme sequence, but other ribozyme sequences that could be used alternatively have been described. Finally, the system described here is independent of the use of expression vectors of influenza virus polymerase proteins based on the mouse promoter of hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase (pHMG constructs); polymerase proteins from a wide range of influenza viruses can be used, and they can be expressed using a wide range of expression vectors.
Пример 2Example 2
Рекомбинантный вирус получают, как описано выше, на основе высокопроизводительного молекулярного скелета вируса (например, полученного из вакцинного штамма А/PR/8/34) с генами НА и NA релевантного эпидемического вируса (например, А/Moscow/10/99). После получения рекомбинантного вируса трансфекцией, этот вирус амплифицируют в подходящем клеточном субстрате (например, яйцах, клетках MDCK, клетках Vero) до достаточно высоких количеств. После размножения в содержащих зародыш куриных яйцах аллантоисную жидкость осветляют центрифугированием в течение 10 минут при 1000 × g и фильтрованием через фильтр 0,45 микрометров. После этого этот вирус осаждают центрифугированием в течение 1,5 часов при 150000 × g при 4°С и ресуспендируют в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS). Затем вирус обрабатывают 2% деканоил-N-метилглюкамидом (MEGA), наносят на слой 25% сахарозы в PBS и центрифугируют в течение 1,5 часов при 250000 × g при 4°С. Затем верхний слой, содержащий белки НА и NA, диализуют против PBS и чистоту и количество этого белкового препарата подтверждают с использованием 12,5% ДСН-полиакриламидных гелей, окрашенных Кумасси бриллиантовым синим. Хорьков иммунизируют внутримышечно ~10 микрограммами белков НА/NA. Если желательно, вакцинации могут выполняться с использованием последовательного множественного введения доз или с использованием адъювантов (MF59, ISCOM). Титры антител против НА и NA в пробах сыворотки, собранной до и после вакцинации, определяют с использованием анализов ингибирования гемагглютинации, анализов ингибирования нейраминидазы, ELISA, анализов нейтрализации вируса и т.д. Вакцинированных и контрольных животных повторно иммунизируют спустя 6 недель после вакцинации с использованием дозы, инфицирующей 50% клеток культуры ткани 1×105 (TCID50), вируса гриппа А/Moscow/10/99 или гетерологичного изолята вируса. После иммунизации берут пробы в виде мазков из носа и глотки животных ежедневно в течение 10 дней и количество вируса, экскретируемого инфицированными животными, определяют количественными ПЦР-анализами или определениями количеств вируса. Таким образом, полученный индуцированный вакциной иммунитет может быть подтвержден количественным определением увеличения титров антител и уровня защиты против инфицирования введенным вирусом.The recombinant virus is obtained, as described above, on the basis of a high-performance molecular skeleton of the virus (for example, obtained from the vaccine strain A / PR / 8/34) with the genes HA and NA of the relevant epidemic virus (for example, A / Moscow / 10/99). After receiving the recombinant virus by transfection, the virus is amplified in a suitable cell substrate (eg, eggs, MDCK cells, Vero cells) to sufficiently high amounts. After propagation in the eggs containing the embryo, the allantoic liquid is clarified by centrifugation for 10 minutes at 1000 × g and filtered through a 0.45 micrometer filter. After this, the virus is precipitated by centrifugation for 1.5 hours at 150,000 × g at 4 ° C and resuspended in phosphate buffered saline (PBS). The virus is then treated with 2% decanoyl-N-methylglucamide (MEGA), applied to a layer of 25% sucrose in PBS and centrifuged for 1.5 hours at 250,000 × g at 4 ° C. Then, the top layer containing HA and NA proteins was dialyzed against PBS and the purity and amount of this protein preparation was confirmed using 12.5% SDS polyacrylamide gels stained with Coomassie brilliant blue. Ferrets are immunized intramuscularly with ~ 10 micrograms of HA / NA proteins. If desired, vaccinations can be carried out using sequential multiple doses or using adjuvants (MF59, ISCOM). Antibody titers against HA and NA in serum samples collected before and after vaccination are determined using hemagglutination inhibition assays, neuraminidase inhibition assays, ELISA, virus neutralization assays, etc. Vaccinated and control animals are re-immunized 6 weeks after vaccination using a dose infecting 50% of tissue culture cells 1 × 10 5 (TCID 50 ), influenza A / Moscow / 10/99 virus or heterologous virus isolate. After immunization, samples are taken in the form of swabs from the nose and pharynx of animals daily for 10 days, and the amount of virus excreted by infected animals is determined by quantitative PCR analyzes or quantification of the virus. Thus, the resulting vaccine-induced immunity can be confirmed by quantifying the increase in antibody titers and the level of protection against infection by the introduced virus.
СсылкиReferences
Claims (26)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP04078527 | 2004-12-24 | ||
| EP04078527.1 | 2004-12-24 | ||
| US64100305P | 2005-01-04 | 2005-01-04 | |
| US60/641,003 | 2005-01-04 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011122117/10A Division RU2011122117A (en) | 2004-12-24 | 2011-05-31 | RESCUE FROM INFLUENZA VIRUS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007128336A RU2007128336A (en) | 2009-01-27 |
| RU2435855C2 true RU2435855C2 (en) | 2011-12-10 |
Family
ID=34928779
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007128336/10A RU2435855C2 (en) | 2004-12-24 | 2005-12-22 | Method for producing replicative influenza virus particles, cell composition (versions), cell culture composition and application thereof |
| RU2011122117/10A RU2011122117A (en) | 2004-12-24 | 2011-05-31 | RESCUE FROM INFLUENZA VIRUS |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011122117/10A RU2011122117A (en) | 2004-12-24 | 2011-05-31 | RESCUE FROM INFLUENZA VIRUS |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7959930B2 (en) |
| EP (2) | EP2295542B1 (en) |
| JP (2) | JP5620048B2 (en) |
| KR (1) | KR101272487B1 (en) |
| CN (1) | CN101379183B (en) |
| AU (1) | AU2005318087B2 (en) |
| BR (1) | BRPI0518568A2 (en) |
| CA (1) | CA2592439C (en) |
| DK (1) | DK1831357T3 (en) |
| ES (1) | ES2395813T3 (en) |
| HK (1) | HK1125674A1 (en) |
| IL (1) | IL183888A (en) |
| MX (1) | MX2007007889A (en) |
| NO (1) | NO20073737L (en) |
| NZ (1) | NZ556061A (en) |
| PT (1) | PT1831357E (en) |
| RU (2) | RU2435855C2 (en) |
| TW (2) | TWI402344B (en) |
| WO (1) | WO2006067211A1 (en) |
| ZA (1) | ZA200705145B (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2783430C1 (en) * | 2022-03-16 | 2022-11-14 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Puumala virus minigenomic system for evaluating the antiviral activity of rna-dependent rna polymerase inhibitors |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL157003A0 (en) | 2001-01-19 | 2004-02-08 | Vironovative Bv | A virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals |
| CN1646684B (en) | 2002-02-21 | 2010-10-06 | 免疫医疗疫苗公司 | Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus |
| BRPI0518568A2 (en) * | 2004-12-24 | 2008-11-25 | Solvay Pharm Bv | Method for producing a replicative influenza virus particle without the use of helper virus, replicative influenza virus particle, Cell, composition, use of a composition, Method for generating immunological protection against infection of an individual with an influenza virus, , Nucleic acid |
| JP2008543331A (en) | 2005-06-21 | 2008-12-04 | メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド | Methods and compositions for expressing viral negative sense RNA in canine cells |
| US7790434B2 (en) | 2005-06-21 | 2010-09-07 | Medimmune, Llc | Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells |
| NZ594482A (en) | 2005-11-04 | 2012-11-30 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Influenza vaccines with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant |
| US8697087B2 (en) | 2005-11-04 | 2014-04-15 | Novartis Ag | Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators |
| KR20080069232A (en) | 2005-11-04 | 2008-07-25 | 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 에스.알.엘. | Emulsions with free aqueous-phase surfactant as adjuvants for split influenza vaccines |
| JP2009514839A (en) | 2005-11-04 | 2009-04-09 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル | Adjuvant influenza vaccine containing cytokine inducer |
| ES2420829T3 (en) | 2005-11-04 | 2013-08-27 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Vaccines adjuvant with non-virion antigen prepared from influenza viruses grown in cell culture |
| EA015271B1 (en) | 2006-01-27 | 2011-06-30 | Новартис Вэксинс Энд Диагностикс Гмбх & Ко Кг | Influenza vaccines containing hemagglutinin and matrix proteins |
| EP2004226A1 (en) | 2006-03-24 | 2008-12-24 | Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH & Co. KG | Storage of influenza vaccines without refrigeration |
| US9254318B2 (en) | 2006-03-31 | 2016-02-09 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines |
| US7682619B2 (en) | 2006-04-06 | 2010-03-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine influenza virus |
| GB0614460D0 (en) | 2006-07-20 | 2006-08-30 | Novartis Ag | Vaccines |
| KR20090057015A (en) | 2006-09-11 | 2009-06-03 | 노파르티스 아게 | Making influenza virus vaccines without using eggs |
| US20110045022A1 (en) | 2006-12-06 | 2011-02-24 | Theodore Tsai | Vaccines including antigen from four strains of influenza virus |
| US9474798B2 (en) | 2007-06-18 | 2016-10-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines |
| PL2185191T3 (en) | 2007-06-27 | 2013-02-28 | Novartis Ag | Low-additive influenza vaccines |
| GB0810305D0 (en) | 2008-06-05 | 2008-07-09 | Novartis Ag | Influenza vaccination |
| EA201071086A1 (en) | 2008-03-18 | 2011-04-29 | Новартис Аг | ADVANCED METHOD FOR OBTAINING VACCINE ANTIGENS OF THE VIRUS VIRUS |
| CN102307590A (en) | 2009-02-10 | 2012-01-04 | 诺华有限公司 | Influenza vaccines with reduced amounts of squalene |
| EA201171032A1 (en) | 2009-02-10 | 2012-02-28 | Новартис Аг | TREATMENT SCHEMES WITH THE HELP OF VACCINE AGAINST FLU, ASSOCIATED WITH PANDEMIC STRAINS |
| CA2752041A1 (en) | 2009-02-10 | 2010-08-19 | Novartis Ag | Influenza vaccines with increased amounts of h3 antigen |
| USH2283H1 (en) | 2009-04-27 | 2013-09-03 | Novartis Ag | Vaccines for protecting against influenza |
| KR20120039047A (en) | 2009-07-31 | 2012-04-24 | 노파르티스 아게 | Reverse genetics systems |
| US9109013B2 (en) | 2009-10-26 | 2015-08-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in vero cells |
| US10130697B2 (en) | 2010-03-23 | 2018-11-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses |
| EP2576773A2 (en) * | 2010-06-02 | 2013-04-10 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG | Methods and helper viruses for the generation of rna virus |
| FR2962739B1 (en) * | 2010-07-13 | 2014-01-31 | Univ Claude Bernard Lyon | MODIFIED VIRAL STRAINS AND METHOD FOR IMPROVING VACCINE SEED PRODUCTION OF INFLUENZA VIRUSES |
| AU2012324398A1 (en) | 2011-10-20 | 2014-05-01 | Seqirus UK Limited | Adjuvanted influenza B virus vaccines for pediatric priming |
| GB201218195D0 (en) | 2012-10-10 | 2012-11-21 | Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie | Composition |
| WO2014145287A2 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | University Of Maryland | Swine influenza viruses and constructs and uses thereof |
| JP2016524915A (en) | 2013-07-15 | 2016-08-22 | ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション | High titer recombinant influenza virus with enhanced replication in MDCK, Vero cells or eggs |
| WO2015196150A2 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
| US10633422B2 (en) | 2015-06-01 | 2020-04-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA |
| CN108290932A (en) | 2015-06-09 | 2018-07-17 | 圣诺菲·帕斯图尔公司 | The method of the nucleotide sequence of the engineered influenza proteins of Optimized Coding Based |
| WO2016207853A2 (en) | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Seqirus UK Limited | Antigenically matched influenza vaccines |
| US9890363B2 (en) | 2015-07-06 | 2018-02-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
| CN108027371B (en) | 2015-07-07 | 2020-08-18 | 思齐乐 | Efficacy test for influenza |
| US11197925B2 (en) | 2016-02-19 | 2021-12-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza B virus replication for vaccine development |
| JP2022527235A (en) | 2019-01-23 | 2022-06-01 | 義裕 河岡 | Mutations that impart genetic stability to additional genes in influenza virus |
| CN113874496A (en) | 2019-02-08 | 2021-12-31 | 威斯康星校友研究基金会(Warf) | Humanized cell lines |
| CN114929269A (en) | 2019-05-01 | 2022-08-19 | 威斯康星校友研究基金会(Warf) | Improved influenza virus replication for vaccine development |
| US11807872B2 (en) | 2019-08-27 | 2023-11-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5854037A (en) | 1989-08-28 | 1998-12-29 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines |
| US6001634A (en) | 1989-08-28 | 1999-12-14 | Palese; Peter | Recombinant negative strand RNA viruses |
| US5166057A (en) * | 1989-08-28 | 1992-11-24 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand rna virus expression-systems |
| US6887699B1 (en) | 1990-05-22 | 2005-05-03 | Medimmune Vaccines, Inc. | Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines |
| US6544785B1 (en) * | 1998-09-14 | 2003-04-08 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses |
| DE122008000061I1 (en) | 1999-04-06 | 2009-02-12 | Wisconsin Alumni Res Found | RECOMBINANT INFLUENZA VIRUSES FOR VACCINATION AND GENE THERAPY |
| US8715940B2 (en) * | 1999-04-06 | 2014-05-06 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of making recombinant influenza virus |
| DE60033284T3 (en) | 1999-07-14 | 2014-10-30 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | IN VITRO RECONSTITUTION OF SEGMENTED NEGATIVE RADIATION RNA VIRUSES |
| CN1384877B (en) * | 1999-08-02 | 2010-10-27 | 惠氏 | Rescue of mumps virus from cDNA |
| US6764685B1 (en) * | 2000-03-21 | 2004-07-20 | Medimmune Vaccines, Inc. | Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines |
| IL152426A (en) * | 2000-04-28 | 2011-07-31 | St Jude Childrens Res Hospital | Dna transfection system for the generation of infectious negative strand rna virus |
| AU2001270033A1 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-08 | Wyeth Holdings Corporation | Nucleotide sequence of influenza A/Udorn/72 (H3N2) genome |
| CN1646684B (en) * | 2002-02-21 | 2010-10-06 | 免疫医疗疫苗公司 | Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus |
| KR101169468B1 (en) * | 2002-04-26 | 2012-08-01 | 메디뮨 엘엘씨 | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
| US7037707B2 (en) * | 2003-09-04 | 2006-05-02 | St. Jude Children's Research Hospital | Method for generating influenza viruses and vaccines |
| BRPI0518568A2 (en) * | 2004-12-24 | 2008-11-25 | Solvay Pharm Bv | Method for producing a replicative influenza virus particle without the use of helper virus, replicative influenza virus particle, Cell, composition, use of a composition, Method for generating immunological protection against infection of an individual with an influenza virus, , Nucleic acid |
-
2005
- 2005-12-22 BR BRPI0518568-8A patent/BRPI0518568A2/en not_active IP Right Cessation
- 2005-12-22 JP JP2007547535A patent/JP5620048B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-22 CN CN2005800447512A patent/CN101379183B/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-22 RU RU2007128336/10A patent/RU2435855C2/en not_active IP Right Cessation
- 2005-12-22 EP EP10182258A patent/EP2295542B1/en not_active Not-in-force
- 2005-12-22 ES ES05825287T patent/ES2395813T3/en active Active
- 2005-12-22 AU AU2005318087A patent/AU2005318087B2/en not_active Ceased
- 2005-12-22 WO PCT/EP2005/057092 patent/WO2006067211A1/en active Application Filing
- 2005-12-22 EP EP05825287A patent/EP1831357B1/en active Active
- 2005-12-22 US US11/722,769 patent/US7959930B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-22 KR KR1020077017093A patent/KR101272487B1/en not_active IP Right Cessation
- 2005-12-22 CA CA2592439A patent/CA2592439C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-22 PT PT58252875T patent/PT1831357E/en unknown
- 2005-12-22 NZ NZ556061A patent/NZ556061A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-12-22 DK DK05825287.5T patent/DK1831357T3/en active
- 2005-12-22 MX MX2007007889A patent/MX2007007889A/en active IP Right Grant
- 2005-12-23 TW TW094146438A patent/TWI402344B/en not_active IP Right Cessation
- 2005-12-23 TW TW101113590A patent/TWI495724B/en not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-06-13 IL IL183888A patent/IL183888A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-06-21 ZA ZA200705145A patent/ZA200705145B/en unknown
- 2007-07-18 NO NO20073737A patent/NO20073737L/en not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-04-30 HK HK09104018.1A patent/HK1125674A1/en not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-04-15 US US13/088,120 patent/US20120156241A1/en not_active Abandoned
- 2011-05-31 RU RU2011122117/10A patent/RU2011122117A/en not_active Application Discontinuation
-
2012
- 2012-03-22 JP JP2012065345A patent/JP5702321B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DE WIT EMMIE et al. Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments. VIRUS RESEARCH, v.103, no.1-2, July 2004. HOFFMANN E. ET AL: "AMBISENSE APPROACH FOR THE GENERATION OF INFLUENZA A VIRUS: VRNA AND MRNA SYNTHESIS FROM ONE TEMPLATE" VIROLOGY, RAVEN PRESS, NEW YORK, NY, US, v.267, no.2, 15 February 2000 (2000-02-15), p.310-317. NEUMANN GABRIELE ET AL. Synthesis of influenza virus: New impetus from an old enzyme, RNA polymerase I. VIRUS RESEARCH, v.82, no.1-2, 30 January 2002 (2002-01-30), p.153-158. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2783430C1 (en) * | 2022-03-16 | 2022-11-14 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Puumala virus minigenomic system for evaluating the antiviral activity of rna-dependent rna polymerase inhibitors |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2435855C2 (en) | Method for producing replicative influenza virus particles, cell composition (versions), cell culture composition and application thereof | |
| JP6352974B2 (en) | High titer recombinant influenza virus for vaccine | |
| JP4986859B2 (en) | Defective influenza virus particles | |
| US8597661B2 (en) | Neuraminidase-deficient live influenza vaccines | |
| JP2017197555A (en) | Influenza viruses with mutant pb2 gene segment as attenuated live vaccines | |
| JP2009534039A (en) | Methods and compositions for expressing minus-strand viral RNA in canine cells | |
| AU2011204881B2 (en) | Rescue of influenza virus | |
| RU2420577C2 (en) | Conditionally defective particle of influenza virus and methods of producing thereof (versions) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161223 |