RU2432577C2 - Thrombosis monitor and method of thrombosis monitoring - Google Patents
Thrombosis monitor and method of thrombosis monitoring Download PDFInfo
- Publication number
- RU2432577C2 RU2432577C2 RU2008119500/15A RU2008119500A RU2432577C2 RU 2432577 C2 RU2432577 C2 RU 2432577C2 RU 2008119500/15 A RU2008119500/15 A RU 2008119500/15A RU 2008119500 A RU2008119500 A RU 2008119500A RU 2432577 C2 RU2432577 C2 RU 2432577C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- thrombus
- formation
- thrombus formation
- coagulation
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к способу мониторинга эффективности антитромботического лекарственного средства, введенного пациенту или подобному индивидууму, и, в частности, к устройству и способу общей оценки свертываемости крови и образования тромбоцитарного тромба в среде, эквивалентной кровотоку, с цельной кровью или плазмой, содержащей тромбоциты.The present invention relates to a method for monitoring the effectiveness of an antithrombotic drug administered to a patient or a similar individual, and in particular, to a device and method for the general assessment of blood coagulation and platelet formation in a medium equivalent to blood flow with whole blood or plasma containing platelets.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Например, атеротромбоз (такой как при инфаркте миокарда) вызывает серьезное образование тромба, так что атероматозная бляшка разрушается на участке артериосклероза, тромбоциты сцепляются с коллагеном, включающим тканевые факторы, контактирующие с кровотоком. Далее происходят сложные процессы агрегации тромбоцитов, активации системы свертывания крови и им подобные, приводя к образованию тромба, вызывающего серьезную обструкцию сосуда. Сердечное заболевание, такое как инфаркт миокарда, представляет собой тяжелое заболевание, и оно является второй по частоте ведущей причиной общей смертности в Японии.For example, atherothrombosis (such as with myocardial infarction) causes a serious blood clot, so that the atheromatous plaque is destroyed in the area of arteriosclerosis, platelets adhere to collagen, including tissue factors in contact with the bloodstream. Further, complex processes of platelet aggregation, activation of the blood coagulation system and the like occur, leading to the formation of a blood clot, which causes severe obstruction of the vessel. Heart disease, such as myocardial infarction, is a serious illness, and it is the second leading cause of general mortality in Japan.
Однако образование тромба происходит только в атеросклеротической области, приводя к инфаркту миокарда, а выраженная тенденция к образованию тромбов во всем организме не наблюдается. Исследования in vitro не подходят для оценки тенденции к образованию тромбов и мониторинга антитромботического эффекта при антитромботической терапии. Таким образом, важно производить общую оценку свертывания крови и состояния тромбоцитов (сцепления и агглютинации) в присутствии кровотока.However, the formation of a blood clot occurs only in the atherosclerotic region, leading to myocardial infarction, and a pronounced tendency to the formation of blood clots throughout the body is not observed. In vitro studies are not suitable for assessing the tendency to blood clots and for monitoring the antithrombotic effect in antithrombotic therapy. Thus, it is important to make an overall assessment of blood coagulation and platelet status (adhesion and agglutination) in the presence of blood flow.
До настоящего времени, свертываемость крови оценивали определением частичного активированного тромбопластинового времени (АРТТ), тромбопластинового времени (РТ) с использованием плазмы. АРТТ главным образом отражает эндогенное свертывание, а РТ главным образом отражает экзогенное свертывание. Исследование тромбоцитов крови проводится путем использования обогащенной тромбоцитами плазмы и добавления активирующего тромбоциты вещества, такого как ADP (аденозиндифосфат) или коллаген, для оценки посредством этого свертываемости тромбоцитов в результате изменения их скорости проникновения или подобных явлений. Кроме того, время свертывания цельной крови можно определить по времени образования сгустка цельной крови, времени образования сгустка цельной крови после повторного добавления кальция и тому подобного.To date, blood coagulation has been evaluated by determining the partial activated thromboplastin time (ARTT), thromboplastin time (PT) using plasma. ARTT mainly reflects endogenous coagulation, and PT mainly reflects exogenous coagulation. A study of blood platelets is carried out by using platelet-rich plasma and adding a platelet activating substance, such as ADP (adenosine diphosphate) or collagen, to thereby evaluate platelet coagulation as a result of a change in their penetration rate or similar phenomena. In addition, the clotting time of whole blood can be determined by the time of formation of a clot of whole blood, the time of formation of a clot of whole blood after repeated addition of calcium and the like.
Далее, в устройствах обследования, использующих цельную кровь, применяется тромбокластограмма, которая контролирует активацию факторов свертывания, агглютинацию тромбоцитов и им подобные показатели.Further, in examination devices using whole blood, a thromboclastogram is used that controls the activation of coagulation factors, platelet agglutination, and the like.
Однако тромб растет в крови in vivo. Напротив, указанный выше способ исследования или ему подобные производит определение in vitro, т.е. в состоянии, закрытом для кровотока. Таким образом, нельзя наблюдать рост тромба in vivo.However, a blood clot grows in blood in vivo. On the contrary, the above research method or the like makes an in vitro determination, i.e. in a condition closed to the bloodstream. Thus, in vivo thrombus growth cannot be observed.
В качестве предложений по решению указанных выше проблем в патентом документе JP 2004-251630 А и непатентных документах Blood 1990; 75, стр.390-398; Blood, 1999; август, 1:94(3), стр.968-75, раскрыт способ, включающий пропускание крови с введенным в нее антитромботическим лекарственным средством через коллаген и мониторинг с помощью конфокального микроскопа сцепления или агглютинации тромбоцитов, меченных флюоресцентной меткой.As suggestions for solving the above problems in the patent document JP 2004-251630 A and non-patent documents Blood 1990; 75, pp. 390-398; Blood, 1999; August, 1:94 (3), pp. 968-75, a method is disclosed comprising passing blood with an antithrombotic drug introduced into it through collagen and monitoring with a confocal microscope of adhesion or platelet agglutination labeled with a fluorescent label.
Однако в способе, описанном в указанном патентном документе, наблюдение проводится в присутствии противосвертывающего лекарственного средства. Таким образом, мониторингом морфологического изменения в тромбоцитах оценивается тот факт, что в системе свертывания крови не происходит образования тромба, вызванного сцеплением или агглютинацией тромбоцитов, или способность генерирования тромба уменьшена. Следовательно, такая оценка не отражает связь активации тромбоцитов с системой свертывания крови. Поэтому указанное изобретение приемлемо для оценки эффективности антитромбоцитарного лекарственного средства, но оно не способно контролировать сам тромб и весь процесс формирования тромба. Кроме того, флюоресцентный микроскоп является дорогостоящим, поэтому его едва ли можно использовать для общих исследований.However, in the method described in said patent document, the observation is carried out in the presence of an anticoagulant drug. Thus, monitoring the morphological changes in platelets evaluates the fact that there is no blood clot formation in the blood coagulation system caused by platelet adhesion or agglutination, or the thrombus generation ability is reduced. Therefore, this assessment does not reflect the association of platelet activation with the blood coagulation system. Therefore, this invention is acceptable for evaluating the effectiveness of an antiplatelet drug, but it is not able to control the thrombus itself and the entire process of thrombus formation. In addition, a fluorescence microscope is expensive, so it can hardly be used for general research.
Кроме того, в патентном документе JP 2006-145345 А, текучесть крови после введения антикоагулянта определяется пропусканием крови через силиконовую камеру, подобную мелкой расческе. Аналогичным образом в этом способе также используется кровь после введения антикоагулянта, так что влияние системы свертывания определить невозможно. Кроме того, вязкость в данном способе имеет большую индивидуальную вариабельность, так что трудно оценить воздействие медикаментозной терапии, используя указанную систему.In addition, in JP 2006-145345 A, blood flow after administration of an anticoagulant is determined by passing blood through a silicone chamber similar to a fine comb. Similarly, this method also uses blood after administration of an anticoagulant, so that the effect of the coagulation system cannot be determined. In addition, the viscosity in this method has a large individual variability, so it is difficult to assess the impact of drug therapy using the specified system.
Тромбоцит активируется системой свертывания, в то время как система свертывания стимулируется активированными тромбоцитами. Другими словами, введение антикоагулянтов также ингибирует активацию тромбоцитов, так что нельзя наблюдать эффективность антитромботического лекарственного средства. Кроме того, если не проводится какая-либо антикоагуляционная терапия, то кровь быстро сворачивается, так что ее нельзя использовать при исследовании.The platelet is activated by the coagulation system, while the coagulation system is stimulated by activated platelets. In other words, the administration of anticoagulants also inhibits platelet activation, so that the effectiveness of an antithrombotic drug cannot be observed. In addition, if any anticoagulation therapy is not performed, then the blood coagulates rapidly, so that it can not be used in the study.
Краткое изложение существа изобретенияSummary of the invention
Задачей настоящего изобретения является создание устройства и способа общей оценки образования тромбов из-за свертывания крови и образования тромбоцитарного тромба в условиях среды, эквивалентной кровотоку, при потоке цельной крови или плазмы, содержащей тромбоциты (в описании настоящего изобретения они могут совместно именоваться «кровью»), при мониторинге эффективности антитромботического лекарственного средства, введенного пациенту или подобному индивидууму.The objective of the present invention is to provide a device and method for the overall assessment of blood clots due to blood coagulation and the formation of a platelet thrombus in an environment equivalent to blood flow, with the flow of whole blood or plasma containing platelets (in the description of the present invention they can collectively be referred to as "blood") when monitoring the effectiveness of an antithrombotic drug administered to a patient or similar individual.
Для решения указанной выше задачи согласно настоящему изобретению предложено устройство для мониторинга образования тромба, которое контролирует образование тромба путем пропускания крови после введения антикоагулянта через канал, который имитирует кровеносный сосуд, в то же время проводя антикоагуляционную обработку, или стимулируя свертывание крови, причем устройство содержит: камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал; впускную трубку, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба; и трубку для лекарственного средства, которая соединена с впускной трубкой и через которую подается лекарственное средство, которое стимулирует свертываемость крови (далее именуемое «стимулятором свертывания»), или лекарственное средство, которое осуществляет антикоагуляционное действие. В настоящем изобретении термин «мониторинг» означает не только визуальную оценку образования тромба, визуализацию, но также оценку степени образования тромба в переводе на цифровую характеристику путем определения давления или подобного показателя.To solve the above problem, the present invention provides a device for monitoring the formation of a blood clot, which controls the formation of a blood clot by passing blood after administering an anticoagulant through a channel that simulates a blood vessel, while performing anticoagulation treatment, or stimulating blood coagulation, the device comprising: a thrombus formation chamber, at least in a part of which a thrombus causing material is placed; an inlet tube that is connected to the thrombus formation chamber and through which blood flows into the thrombus formation chamber; and a medicament tube that is connected to the inlet tube and through which a medicament that stimulates blood coagulation (hereinafter referred to as the “coagulation stimulant”) or a medicament that has an anticoagulant effect is supplied. In the present invention, the term “monitoring” means not only a visual assessment of the formation of a blood clot, visualization, but also an assessment of the degree of formation of a blood clot in terms of a digital characteristic by determining pressure or a similar indicator.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложено устройство для мониторинга образования тромба, которое содержит камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал, впускную трубку, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба, и впускную трубку для ингибитора образования тромба, которая соединена с камерой образования тромба, и где происходит смешивание ингибитора образования тромба с кровью после пропускания через камеру образования тромба.In addition, according to the present invention, there is provided a device for monitoring thrombus formation, which comprises a thrombus formation chamber, at least in part of which a thrombus-producing material is placed, an inlet tube that is connected to the thrombus formation chamber and through which blood flows into the thrombus formation chamber and an inlet tube for a blood clot inhibitor that is connected to a blood clot chamber and where the blood clot inhibitor is mixed after passing through of thrombus formation chamber.
В этом случае устройство мониторинга образования тромба предпочтительно размещено на подложке.In this case, the thrombus formation monitoring device is preferably located on the substrate.
Устройство для мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит насос для создания избыточного давления во впускной трубке и/или трубке для лекарственного средства или насос для аспирации содержимого выпускной трубки, которая соединена с камерой образования тромба и предназначена для удаления крови из камеры образования тромба.The thrombus formation monitoring device according to the present invention preferably comprises a pump for generating overpressure in the inlet tube and / or drug tube or an aspiration pump for the contents of the outlet tube, which is connected to the thrombus formation chamber and is designed to remove blood from the thrombus formation chamber.
Устройство мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит устройство измерения давления и камеру для получения изображений, а также камеру образования тромба.The thrombus formation monitoring device according to the present invention preferably comprises a pressure measuring device and an imaging camera, as well as a thrombus formation chamber.
Кроме того, вызывающий образование тромба материал содержит тканевой фактор (тканевой тромбопластин).In addition, the thrombus-causing material contains tissue factor (tissue thromboplastin).
Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ мониторинга образования тромба, содержащий следующие этапы: направление крови после введения антикоагулянта в камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал, и обеспечивающий одновременно антикоагуляционную обработку или стимулирование свертывания крови, для контроля, посредством этого, образования тромба. В настоящем изобретении признак «направление крови» и «обеспечение одновременно антикоагуляционной обработки или стимулирование свертывания крови» может представлять собой состояние, при котором в канале происходит реакция, обеспечивающая антикоагуляцию, или реакция, стимулирующая свертывание, и включает состояние, при котором обеспечивается протекание препарата, высвобождающего средство, осуществляющее антикоагуляционное действие, или средства, стимулирующего свертывание, при смешивании с кровью в канале, или состояние, при котором обеспечивается быстрое протекание препарата, высвобождающего средство, осуществляющее антикоагуляционное действие, или средства, стимулирующего свертывание, после смешивания с кровью.Further, according to the present invention, there is provided a method for monitoring the formation of a blood clot, comprising the steps of: directing blood after introducing an anticoagulant into a thrombus formation chamber, at least in a part of which a material causing a blood clot is formed, and which simultaneously provides anticoagulation treatment or stimulation of blood coagulation, for monitoring , through this, the formation of a blood clot. In the present invention, the sign “blood flow” and “simultaneously providing anticoagulation treatment or stimulation of blood coagulation” can be a condition in which a reaction that provides anticoagulation, or a reaction that stimulates coagulation, occurs in the channel and includes a condition in which the drug flows, releasing an anticoagulant or coagulation promoting agent when mixed with blood in a channel, or a condition in which rum provides a quick course of the drug, releasing an anticoagulant, or coagulation promoting agent, after mixing with blood.
В способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы антикоагуляционная обработка представляла собой обработку веществами, образующими хелаты кальция, такие как лимонная кислота, и антикоагуляционная обработка осуществлялась донором свободного кальция.In the method for monitoring the formation of a blood clot according to the present invention, it is preferable that the anticoagulation treatment is a treatment with substances that form calcium chelates, such as citric acid, and the anticoagulation treatment is carried out by a free calcium donor.
В способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы антикоагуляционная обработка представляла собой обработку аптамером тромбина, и антикоагуляционная обработка осуществлялась антисмысловой ДНК аптамера тромбина.In the method for monitoring the formation of a thrombus according to the present invention, it is preferable that the anticoagulation treatment is a thrombin aptamer treatment and the anticoagulation treatment is carried out with the antisense DNA of the thrombin aptamer.
В способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно контролировать образование тромба подачей обработанной антикоагулянтом крови в камеру образования тромба, в то же время стимулируя свертывание крови без осуществления антикоагуляционной обработки. В этом случае средство для стимуляции свертывания крови предпочтительно представляет собой добавление тканевого тромбопластина.In the method for monitoring the formation of a blood clot according to the present invention, it is preferable to control the formation of a blood clot by supplying anticoagulant-treated blood to the thrombus formation chamber while at the same time stimulating blood coagulation without anticoagulation treatment. In this case, the agent for stimulating blood coagulation is preferably the addition of tissue thromboplastin.
Кроме того, в способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению кровь, свертываемость которой была снижена одним или более антикоагуляционными средствами, предпочтительно перестают подвергать антикоагуляционной обработке, по меньшей мере, одним видом средства, осуществляющего антикоагулционную обработку, которая соответствует использованному средству антикоагуляционной обработки. В этом случае предпочтительно, чтобы средства антикоагуляционной обработки представляли собой фактор, ингибирующий фазу контакта, и вещество, образующее хелат кальция, а средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку, представляло собой донор свободного кальция. Далее, также предпочтительно, чтобы средства антикоагуляционной обработки представляли собой фактор, ингибирующий фазу контакта, и гепарин, а средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку, представляло собой гепариназу. Также предпочтительно, чтобы средства антикоагуляционной обработки представляли собой фактор, ингибирующий фазу контакта, такой как фактор свертываемости крови XII, калликреин или ему подобный, и аптамер тромбина, а средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку, представляло собой антисмысловую ДНК аптамера тромбина. Ингибитор фактора свертываемости крови XII представляет собой предпочтительно ингибитор трипсина, полученный из маиса.In addition, in the method for monitoring the formation of a blood clot according to the present invention, blood whose coagulability has been reduced by one or more anticoagulation agents, preferably is no longer subjected to anticoagulation treatment with at least one type of anticoagulation treatment that corresponds to the anticoagulation treatment used. In this case, it is preferable that the anticoagulant treatment agent is a contact phase inhibiting factor and the calcium chelate forming substance, and the anticoagulation treatment agent is a free calcium donor. Further, it is also preferred that the anticoagulant treatment agent is a contact phase inhibiting factor and heparin, and the anticoagulation treatment agent is heparinase. It is also preferable that the anticoagulant treatment means be a contact phase inhibiting factor such as blood coagulation factor XII, kallikrein or the like, and the thrombin aptamer, and the anticoagulant treatment agent is the antisense thrombin aptamer DNA. The clotting factor XII inhibitor is preferably a trypsin inhibitor derived from maize.
В способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно определить давление во время притока и/или оттока крови из камеры образования тромба.In the method for monitoring the formation of a blood clot according to the present invention, it is preferable to determine the pressure during the influx and / or outflow of blood from the thrombus formation chamber.
В способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению вызывающий образование тромба материал предпочтительно включает коллаген и тканевой фактор.In the method for monitoring thrombus formation according to the present invention, the thrombus-producing material preferably includes collagen and tissue factor.
Устройство мониторинга образования тромба по п.1 формулы настоящего изобретения содержит камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал, впускную трубку, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба, и трубку для лекарственного средства, которая соединена с впускной трубкой и через которую подается лекарственное средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку, или лекарственное средство, которое стимулирует свертываемость крови. Поэтому кровь, которая обработана антикоагулянтом для предотвращения свертывания крови, взятой у пациента после введения ему антикоагулянта, в канале, проходящем в камеру образования тромба, можно контролировать путем преднамеренного образования тромба в камере образования тромба. Таким образом, эффективность антитромботического средства можно специально контролировать в среде, аналогичной внутренней среде тела человека. Кроме того, средство антикоагуляционной обработки можно применять во время взятия проб крови. Поэтому преимущество состоит в том, что образцы после взятия образцов крови можно хранить в течение определенного периода времени, а время исследования можно выбирать случайным образом.The thrombus formation monitoring device according to
В соответствии с п.2 устройство мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению содержит камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал, впускную трубку, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба, и впуск для ингибитора образования тромба, который соединен с камерой образования тромба и смешивает ингибитор образования тромба с кровью после пропускания через камеру образования тромба. Поэтому можно проводить наблюдение за тромбом так, как описано выше. Кроме того, свертывание крови не происходит ниже по потоку в камере образования тромба, и поэтому можно предотвратить влияние на определение давления и более тонко контролировать изменения давления.According to
Небольшое количество крови можно контролировать, когда устройство для мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению сформировано на подложке. Кроме того, устройство снабжено насосом для создания избыточного давления во впускной трубке и/или трубке лекарственного средства, или насосом для аспирации (отсоса) содержимого выпускной трубки, которая соединена с камерой образования тромба и предназначена для удаления крови из камеры образования тромба. Поэтому кровь и лекарственное средство для стимуляции свертывания крови могут стабильно течь в течение заданного периода времени при заданном давлении или заданной скорости потока.A small amount of blood can be controlled when the blood clot monitoring device of the present invention is formed on a substrate. In addition, the device is equipped with a pump to create excess pressure in the inlet tube and / or drug tube, or a pump for aspiration (suction) of the contents of the outlet tube, which is connected to the thrombus formation chamber and is designed to remove blood from the thrombus formation chamber. Therefore, blood and a blood coagulation stimulation drug can flow stably for a predetermined period of time at a given pressure or predetermined flow rate.
Если устройство для мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению содержит устройство для измерения давления, то степень образования тромба можно переводить в цифры, так что можно выполнять количественную оценку.If the device for monitoring the formation of a blood clot according to the present invention contains a device for measuring pressure, the degree of formation of a blood clot can be converted into numbers, so that a quantitative assessment can be performed.
Устройство можно легко установить, когда материал, вызывающий образование тромба, содержит коллаген. Образование тромба можно эффективно вызвать, когда вызывающий образование тромба материал дополнительно содержит тканевой фактор, такой как тканевой тромбопластин, вместе с коллагеном.The device can be easily installed when the material causing the formation of a blood clot contains collagen. Thrombus formation can be effectively triggered when the thrombus-forming material further comprises a tissue factor, such as tissue thromboplastin, together with collagen.
Если устройство для мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению содержит камеру для получения изображения камеры образования тромба, то появление тромба можно наблюдать в виде изображения, и затем изображение может храниться.If the thrombus formation monitoring apparatus of the present invention comprises a camera for acquiring an image of a thrombus formation chamber, then the appearance of a thrombus can be observed as an image, and then the image can be stored.
Далее, в соответствии с п.9 формулы настоящего изобретения способ мониторинга образования тромба содержит этапы: направление крови после введения антикоагулянта в камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал, проводя при этом антикоагуляционную обработку или стимулируя свертывание крови. Таким образом, образование тромба на вызывающем образование тромба материале можно контролировать при стимуляции свертывания крови путем пропускания крови, которая была получена антикоагуляционной обработкой крови, взятой после введения пациенту антитромботического лекарственного средства для предотвращения свертывания. Поэтому эффективность антитромботического лекарственного средства можно точно контролировать в среде, аналогичной внутренней среде тела человека. Кроме того, антикоагуляционное средство можно применять для взятия проб крови. Поэтому имеется преимущество в том, что образцы после взятия проб крови можно хранить в течение определенного периода времени, и время исследования можно выбрать случайным образом. Если антикоагуляционная обработка представляет собой обработку веществом, образующим хелат кальция, таким как лимонная кислота, и антикоагуляционная обработка осуществляется донором свободного кальция, то легко можно получить реагент, и, таким образом, оно предпочтительно. Если антикоагуляционная обработка представляет собой обработку аптамером тромбина, и антикоагуляционная обработка осуществляется антисмысловой ДНК аптамера тромбина, то можно проводить исследование, в то же время отражая физиологическую концентрацию ионов кальция в крови.Further, in accordance with paragraph 9 of the claims of the present invention, a method for monitoring blood clot formation comprises the steps of: directing blood after administration of an anticoagulant to a thrombus formation chamber, at least in a part of which a material causing a blood clot is placed, while performing anticoagulation treatment or stimulating blood coagulation . Thus, the formation of a blood clot on the material causing the formation of a blood clot can be controlled by stimulating blood coagulation by passing blood, which was obtained by anticoagulation treatment of blood taken after administration of an antithrombotic drug to a patient to prevent coagulation. Therefore, the effectiveness of the antithrombotic drug can be precisely controlled in an environment similar to the internal environment of the human body. In addition, an anticoagulant can be used to take blood samples. Therefore, there is an advantage in that the samples after taking blood samples can be stored for a certain period of time, and the study time can be randomly selected. If the anticoagulation treatment is a treatment with a calcium chelate forming substance, such as citric acid, and the anticoagulation treatment is carried out with a free calcium donor, a reagent can easily be obtained, and thus it is preferred. If the anticoagulation treatment is a thrombin aptamer treatment, and the anticoagulation treatment is carried out by the antisense DNA of the thrombin aptamer, then a study can be carried out while reflecting the physiological concentration of calcium ions in the blood.
Кроме того, в соответствии с п.12 формулы настоящего изобретения можно также контролировать образование тромба пропусканием крови после антикоагуляционной обработки в камеру образования тромба без проведения антикоагуляционной обработки, в то же время стимулируя свертываемость крови. Поэтому образование тромба можно наблюдать при небольшом количестве крови и можно уменьшить дискомфорт пациента. Кроме того, в этом случае не всегда требуется трубка для лекарственного средства, так что устройство мониторинга образования тромба можно упростить. В случае, если тканевой тромбопластин используется в качестве средства, стимулирующего свертываемость крови, то свертываемость крови можно стимулировать активацией свертывающей системы альтернативным путем, который избегает активацию фактора XII и активацию калликреина для контроля образования тромба в камере образования тромба.In addition, in accordance with
Кроме того, образование тромба можно контролировать простой операцией воздействия на кровь, подвергнутую антикоагуляционной обработке с использованием одного или нескольких видов антикоагуляционных средств, по меньшей мере, одним видом осуществляющего антикоагуляционную обработку средства, соответствующего использованному средству антикоагуляционной обработки. В этом случае, когда антикоагуляционная обработка проводится ингибитором фактора контактной фазы и агентом, образующим хелат кальция, и антикоагуляционная обработка осуществляется донором свободного кальция, или когда антикоагуляционная обработка проводится ингибитором фактора контактной фазы и гепарином, и антикоагуляционная обработка проводится гепариназой, то антикоагуляционнная обработка, оказывающая эффект во время мониторинга формирования тромба, представляет собой антикоагуяционную обработку ингибитором фактора контактной фазы, поэтому мониторинг образования тромба можно осуществлять в более физиологичных условиях, в частности отражая двухвалентный ион металла, связанный с тромбом, такого как кальция или магния. В этом случае, когда антикоагуляционная обработка проводится ингибитором фактора контактной фазы, таким как фактор XII свертывания крови или калликреин и аптамер тромбина, а затем антикоагуляционная обработка проводится антисмысловой ДНК аптамера ингибирования тромбина, то кровь можно хранить в течение длительного периода. Кроме того, антикоагуляционную обработку можно эффективно проводить, когда в качестве ингибитора фактора XII свертывания крови используется ингибитор трипсина, полученный из маиса.In addition, the formation of a blood clot can be controlled by a simple operation on the blood subjected to anticoagulation treatment using one or more types of anticoagulation agents, at least one type of anticoagulation treatment, corresponding to the used anticoagulation treatment. In this case, when the anticoagulation treatment is carried out by a contact phase factor inhibitor and an agent forming a calcium chelate, and the anticoagulation treatment is carried out by a free calcium donor, or when the anticoagulation treatment is carried out by a contact phase factor inhibitor and heparin, and the anticoagulation treatment is carried out by heparinase, then the anticoagulation treatment that provides effect during monitoring of thrombus formation, is an anticoagulation treatment with a contact factor inhibitor Phase II, however monitoring thrombus formation can be carried out in a more physiological conditions, in particular reflecting the divalent metal ion bound to thrombus, such as calcium or magnesium. In this case, when the anticoagulation treatment is carried out by a contact phase factor inhibitor, such as coagulation factor XII or kallikrein and thrombin aptamer, and then the anticoagulation treatment is carried out by the antisense DNA of the thrombin inhibition aptamer, the blood can be stored for a long period. In addition, anticoagulation treatment can be effectively carried out when a trypsin inhibitor derived from maize is used as an inhibitor of factor XII blood coagulation.
Если в способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению выполняется измерение давления во время притока и/или выпуска крови из камеры образования тромба, то степень образования тромба можно переводить в цифры, так что можно легко выполнять количественную оценку с использованием очень простого устройства.If, in the method for monitoring the formation of a blood clot according to the present invention, pressure is measured during the inflow and / or release of blood from the blood clot chamber, the degree of blood clot formation can be converted into numbers, so that it is easy to quantify using a very simple device.
Кроме того, если материал, вызывающий образование тромба, содержит коллаген и тканевой фактор, то устройство можно легко установить и можно эффективно вызвать образование тромба.In addition, if the material causing the formation of a blood clot contains collagen and tissue factor, the device can be easily installed and the formation of a blood clot can be effectively caused.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
В дальнейшем изобретение поясняется описанием предпочтительных вариантов воплощения со ссылками на сопроводительные чертежи, на которых:The invention is further explained in the description of the preferred embodiments with reference to the accompanying drawings, in which:
фиг.1 изображает схему устройства мониторинга образования тромба согласно первому варианту осуществления изобретения;figure 1 depicts a device for monitoring the formation of a blood clot according to the first embodiment of the invention;
фиг.2(а) - схему установки вызывающего образование тромба материала 15 в примерах 3, 5 и 6 согласно изобретению;figure 2 (a) is a diagram of the installation causing the formation of a
фиг.2(b) - схему образования тромба в примерах 3, 5 и 6 согласно изобретению;figure 2 (b) is a diagram of the formation of a blood clot in examples 3, 5 and 6 according to the invention;
фиг.3(а) - схему установки вызывающего образование тромба материала 15 в примере 4 согласно изобретению;figure 3 (a) is a diagram of the installation causing the formation of a
фиг.3(b) - схему образования тромба в примере 4 согласно изобретению;figure 3 (b) is a diagram of the formation of a blood clot in example 4 according to the invention;
фиг.4 - схему основной части устройства мониторинга образования тромба (основной корпус микрочипа) согласно второму варианту осуществления изобретения;4 is a diagram of the main part of the device for monitoring the formation of a blood clot (main body of the microchip) according to the second embodiment of the invention;
фиг.5 - схему основной части устройства мониторинга образования тромба (крышка микрочипа) согласно второму варианту осуществления изобретения;5 is a diagram of a main part of a blood clot monitoring device (microchip cover) according to a second embodiment of the invention;
фиг.6 - схему образования тромба в примере 7 согласно второму варианту осуществления изобретения;6 is a diagram of the formation of a blood clot in example 7 according to a second embodiment of the invention;
фиг.7 - схему основной части устройства мониторинга образования тромба (основной корпус микрочипа) согласно второму варианту осуществления изобретения;7 is a diagram of the main part of the device for monitoring the formation of a thrombus (main body of the microchip) according to the second embodiment of the invention;
фиг.8 - схему основной части устройства мониторинга образования тромба (крышка микрочипа) согласно второму варианту осуществления изобретения;8 is a diagram of a main part of a blood clot monitoring device (microchip cover) according to a second embodiment of the invention;
фиг.9 - схемы основных частей устройства мониторинга образования тромба согласно третьему варианту осуществления изобретения; фиг.9(А) - вся схема, фиг.9(В) - основной корпус микрочипа, и фиг.9(С) - крышка микрочипа согласно изобретению;Fig.9 is a diagram of the main parts of the device for monitoring the formation of a blood clot according to a third embodiment of the invention; Fig.9 (A) is the whole diagram, Fig.9 (B) is the main body of the microchip, and Fig.9 (C) is the cover of the microchip according to the invention;
фиг.10 - схему системы мониторинга образования тромба, содержащей устройство для мониторинга образования тромба согласно изобретению;figure 10 - diagram of a monitoring system for the formation of a blood clot containing a device for monitoring the formation of a blood clot according to the invention;
фиг.11(А) - форму волн тромбоэластограммы свертывания при добавлении 10 мкМ каждого из аптамеров к экзоциту I и экзоциту II в кровь после выдержки при комнатной температуре в течение 15 мин и добавлении 40 мкМ каждого из антисмысловых ДНК обоих аптамеров согласно изобретению;11 (A) is the coagulation thromboelastogram waveform when 10 μM of each aptamer is added to exocyte I and exocyte II into the blood after exposure at room temperature for 15 minutes and 40 μM of each of the antisense DNAs of both aptamers according to the invention are added;
фиг.11(В) - форму волн тромбоэластограммы крови непосредственно после взятия проб крови согласно изобретению;11 (B) is a wave form of blood thromboelastogram immediately after taking blood samples according to the invention;
фиг.12 - схему устройства согласно четвертому варианту осуществления настоящего изобретения; фиг.12(А) - полный чертеж, фиг.12(В) - крышка микрочипа, и фиг.12(С) - подложку микрочипа согласно изобретению;12 is a diagram of an apparatus according to a fourth embodiment of the present invention; Fig. 12 (A) is a complete drawing, Fig. 12 (B) is a microchip cover, and Fig. 12 (C) is a microchip substrate according to the invention;
фиг.13 - диаграммы измерений давлений примера 17 (контроль), примера 18 (гепарин) и примера 19 (Reopro) согласно изобретению;Fig - diagrams of pressure measurements of example 17 (control), example 18 (heparin) and example 19 (Reopro) according to the invention;
фиг.14 - диаграммы измерений давлений при добавлении гепарина в количестве 0 (контроль), 0,2, 0,5 и 1 ЕД/мл гепарина согласно изобретению;Fig - diagrams of pressure measurements when adding heparin in the amount of 0 (control), 0.2, 0.5 and 1 PIECES / ml of heparin according to the invention;
фиг.15 - диаграммы измерений давлений при добавлении гепарина в количестве 0 (контроль), 2, 5 и 10 мкг/мл согласно изобретению.Fig - diagrams of pressure measurements when adding heparin in the amount of 0 (control), 2, 5 and 10 μg / ml according to the invention.
Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретенияDescription of preferred embodiments of the invention
На фиг.1 представлена схема первого варианта осуществления устройства мониторинга образования тромба по настоящему изобретению.1 is a diagram of a first embodiment of a thrombus formation monitoring device of the present invention.
Устройство мониторинга образования тромба согласно настоящему варианту осуществления содержит камеру 10 образования тромба; впускную трубку 11, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба, и трубку для лекарственного средства 12, которая соединена с выпускной трубкой и через которую подается лекарственное средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку или стимулирующее свертывание крови.The thrombus formation monitoring device according to the present embodiment comprises a
Камера 10 образования тромба имеет по существу цилиндрическую форму и содержит материал, который вызывает образование тромба в части ее внутренней полости. Камера может быть изготовлена из прозрачного стекла, термопластической смолы или подобного материала. Примеры материала, который вызывает образование тромба, включают коллаген, vWF (фактор фон Виллебранда), ранее полученный тромб и материалы на волокнистой основе из шелка, хлопка или им подобной ткани. Эти материалы можно использовать отдельно или в комбинации двух или более из них. Коллаген особенно предпочтителен, потому что его можно легко получить, с ним легко манипулировать, и он может быть предоставлен в виде модели, аналогичной кровеносному сосуду. Коллаген может включать тканевой фактор. Материал, вызывающий образование тромба, из коллагена или vWF предпочтительно представлен в виде покрытия внутренней поверхности камеры образования тромба 10 для предотвращения вытекания вызывающего образование тромба материала вместе с потоком крови. Покрытие можно легко нанести, например как описано в документе JP 05-260950 A или в документе Blood 1995 April 1; 85(7): 1826-35, растворением коллагена в кислотном растворе и погружением в него подложки, имеющей гидрофильность, такую же, как у стекла или полистирола, с последующим промыванием и сушкой для покрытия поверхности материала.The
Далее, предпочтительно, чтобы материал, вызывающий образование тромба, в виде волокнистого материала или ранее полученного тромба мог быть в состоянии, пригодном для фиксации внутри камеры образования тромба 10. Далее, путем импрегнации коллагеном гигроскопичного тонкого волокнистого материала, такого как хлопок, неплетеная ткань или трикотажная ткань, и их сушки можно получить вызывающий образование тромба материал с более высокой способностью вызывать образование тромба. Кроме того, подложка может погружаться в раствор коллагена, содержащий тканевой тромбопластин, и затем сушиться для дополнительного усиления ее способности вызывать образование тромба.Further, it is preferable that the material causing the formation of a thrombus, in the form of a fibrous material or a previously obtained thrombus, can be in a state suitable for fixing inside the
Вызывающий образование тромба материал можно выбрать в зависимости от внутреннего диаметра камеры образования тромба 10 и объекта мониторинга. Если в качестве модели представлен атероматоз, вызывающий инфаркт миокарда, то предпочтительно, чтобы содержался один коллаген, или содержался и коллаген, и тканевой тромбопластин. Кроме того, предпочтительнее, чтобы в канале можно было сформировать суженную часть в камере образования тромба для воздействия напряжения сдвига на камеру образования тромба. Далее, в случае изучения образования тромба при инфаркте миокарда и инфаркте мозга сердечного происхождения или тому подобного состояния, при котором тромб может переноситься из другой части тела с кровотоком и прикрепляться, вызывая окклюзию кровеносного сосуда, в другой части тела, предпочтительно, чтобы предварительно произошло сцепление небольшой части тромба с камерой образования тромба 10, представленной в виде материала, вызывающего образование тромба, с последующим мониторингом роста тромба, образованного на нем. В случае изучения тромбоза кровеносного капилляра, внутренний просвет канала в камере образования тромба может быть разделен на множество каналов, каждый из которых имеет диаметр от 10 до 30 мкм. Если камера образования тромба 10 имеет суженную часть диаметром 100 мкм или менее, то канал может подвергаться окклюзии небольшим тромбом, образованным в такой суженной части. Поэтому нет необходимости в использовании дополнительного материала, вызывающего образование тромба, так что образование тромба можно контролировать средством, стимулирующим свертывание крови, или антикоагулянтом. Поэтому настоящее изобретение содержит эту суженную часть в качестве материала, вызывающего образование тромба.The thrombus-producing material can be selected depending on the inner diameter of the thrombus-forming
Материал, вызывающий образование тромба, может представлять собой только покрытие коллагеном или vWF. Камера 10 образования тромба в части покрытия может быть предпочтительно сужена и представлена для части 14, так что можно контролировать агрегацию тромбоцитов, вызванную напряжением сдвига. В случае покрытия коллагеном в качестве материала, вызывающего образования тромба, предпочтительно, чтобы для получения высокой способности сцепления с поверхностью, по меньшей мере, часть подложки была изготовлена из стекла или пластика. Кроме того, часть, на которой предстоит поместить камеру 10 образования тромба, или часть камеры 10 образования тромба, где находится материал, вызывающий образование тромба, может быть изготовлена в виде съемной кассеты. Этот вариант предпочтительнее, потому что полученный тромб можно легко отмыть или наблюдать, или материал, вызывающий образование тромба, можно легко заменить новым материалом. В этом случае кассета может образовывать герметичное для жидкости соединение кольцевым уплотнителем из силиконовой резины или подобного материала. Предпочтительно, конец кассеты, противоположный ее концу, соединенному с впускной трубкой 11 камеры 10 образования тромба, может быть соединен с выпускной трубкой 13, которая обеспечивает возможность выпуска крови. Предпочтительно, выпускная трубка 13 может быть разделена цилиндрической бобиной, и ее наконечник может быть снабжен манометром 41, например манометром диафрагмального типа. С другой стороны, наконечник выпускной трубки 13 предпочтительно соединен с контейнером для хранения (не показан).The material causing the formation of a blood clot can only be a collagen or vWF coating. The
Впускная трубка 11, соединенная с камерой 10 образования тромба, может быть изготовлена с использованием прозрачного стекла, термопластичной смолы или подобного материала. Конец впускной трубки 11, противоположный ее другому концу, соединяющемуся с камерой 10 образования тромба, соединен со шприцем 20, который подает кровь. Шприц 20 соединен с насосом 30 и сдавливающим средством (не показано), так что поршень шприца 20 надавливается при заданном давлении. Насос может представлять собой обычный насос, имеющийся в продаже. Альтернативно, насос может представлять собой шприцевый насос, изготовленный экструзией шприца воздухом при постоянном давлении, или переворачиванием шприца, так что поршень находится сверху, и воздействуя на поршень своим весом.The
Впускная трубка 11 может быть предпочтительно разделена цилиндрической бобиной, и ее конец предпочтительно снабжен манометром 40, таким как манометр диафрагмального типа, в части впускной трубки 11 около камеры 10 образования тромба.The
Кровь в шприце 20 подвергается антикоагуляционной обработке. Примеры средства антикоагуляционной обработки включают цитрат натрия или цитрат калия, оксалат натрия или оксалат калия, цитратно-декстрозный раствор (ACD) и этилендиаминтетраацетат (EDTA). Такое средство антикоагуляционной обработки можно использовать в форме порошка, лиофилизированного продукта или раствора, такого как водный раствор. Среди этих антикоагуляционных средств в целом предпочтителен 3,2% цитрат натрия, потому что он доступен. В этом случае один объем средства антикоагуляционной обработки предпочтительно смешивается с 9 объемами крови.Blood in the
Цельная кровь или плазма без средства антикоагуляционной обработки сворачивается в пределах нескольких минут. Свертывание можно уменьшить или устранить добавлением вещества, образующего хелат кальция, такого как цитрат. В частности, сообщалось, что цитрат может ингибировать агглютинацию и функции протромбиназы и экзогенной и эндогенной теназы.Whole blood or plasma without anticoagulation treatment coagulates within a few minutes. Coagulation can be reduced or eliminated by the addition of a calcium chelate forming substance such as citrate. In particular, citrate has been reported to inhibit the agglutination and function of prothrombinase and exogenous and endogenous tenase.
Обработанную цитратом кровь можно хранить в жидкой форме в течение заданного периода времени (например, от нескольких часов до нескольких дней) и перерабатывать в препараты крови, такие как продукт цитофереза, плазму, обогащенную тромбоцитами, и плазму с низким содержанием тромбоцитов. Содержащую цитрат плазму можно хранить примерно при -70°С или ниже в течение длительного периода времени (от нескольких месяцев до нескольких лет). В настоящем изобретении можно также использовать цельную кровь и плазму и, в этом случае, можно предпочтительно снова добавлять кальций или подобные вещества.Blood treated with citrate can be stored in liquid form for a predetermined period of time (for example, from several hours to several days) and processed into blood products such as a product of cytopheresis, platelet rich plasma, and low platelet plasma. Plasma containing citrate can be stored at about -70 ° C or lower for a long period of time (from several months to several years). Whole blood and plasma can also be used in the present invention, and in this case, calcium or the like can preferably be added again.
Однако цельная кровь или плазма с вновь добавленным кальцием спонтанно сворачивается ввиду контактной активации в любом из большинства контейнеров для хранения. В этом случае контактная активация может происходить в пределах около 2-4 мин. С учетом этого в настоящем изобретении антикоагуляционное средство, такое как кальций, можно добавить непосредственно после мониторинга образования тромба во вновь приготовленную обработкой цитратом кровь после взятия пробы крови и замораживания для хранения и последующего размораживания, или в содержащую тромбоциты плазму.However, whole blood or plasma with newly added calcium coagulates spontaneously due to contact activation in any of most storage containers. In this case, contact activation can occur within about 2-4 minutes. With this in mind, in the present invention, an anticoagulant, such as calcium, can be added immediately after monitoring the formation of a blood clot into a newly prepared citrate-treated blood after taking a blood sample and freezing it for storage and subsequent thawing, or in platelet-containing plasma.
Другие антикоагуляционные средства могут включать гепарин, гирудин, гирулог (пептид С-концевой области гирудина), апротинин, антитромбиновое антитело, аптамер тромбина, ингибитор трипсина, полученный из маиса (1977, J. Biol. Chem 252, 8105). Эти материалы ингибируют свертывание крови путем ингибирования каскада свертывания в результате ингибирования фактора свертываемости крови и поэтому иногда в описании настоящего изобретения будут именоваться как «ингибиторы факторов свертывания».Other anticoagulant agents may include heparin, hirudin, hirulog (peptide of the C-terminal region of hirudin), aprotinin, antithrombin antibody, thrombin aptamer, trypsin inhibitor derived from maize (1977, J. Biol. Chem 252, 8105). These materials inhibit blood coagulation by inhibiting the coagulation cascade as a result of inhibition of coagulation factor, and therefore are sometimes referred to in the description of the present invention as “coagulation factor inhibitors”.
Образец крови для мониторинга можно взять любым способом, таким как способ, при котором ингибитор факторов свертывания предварительно помещается в шприц или вакуумный сосуд для взятия крови, и затем набирается кровь, или способ, при котором ингибитор факторов свертывания быстро добавляется в кровь непосредственно после взятия пробы крови для получения посредством этого крови, подвергнутой антикоагуляционной обработке.A blood sample for monitoring can be taken in any way, such as a method in which a coagulation factor inhibitor is first placed in a syringe or a vacuum vessel for taking blood, and then blood is collected, or a method in which a coagulation factor inhibitor is quickly added to the blood immediately after sampling blood for receiving through this blood, subjected to anticoagulation treatment.
Далее, кровь собирается в вакуумный сосуд для взятия крови, содержащий ингибитор факторов свертывания, такой как гепарин, и затем для разрушения гепарина добавляются гепариназа и средство антикоагуляционной обработки, подходящее для мониторинга, так что гепарин замещается средством антикоагуляционной обработки, подходящим для цели мониторинга. Кроме того, кровь собирается в вакуумный сосуд для взятия крови, содержащий лимонную кислоту, и затем добавляют хлорид кальция и ингибитор фактора свертывания, подходящий для цели мониторинга, такой как ингибитор трипсина, полученный из маиса, или аптамер тромбина. Поэтому кровь, подвергнутую антикоагуляционной обработке, можно собирать в зависимости от цели мониторинга.Next, blood is collected in a vacuum blood collection vessel containing a coagulation factor inhibitor such as heparin, and then heparinase and an anticoagulation agent suitable for monitoring are added to break down the heparin, so that heparin is replaced with an anticoagulation agent suitable for the purpose of monitoring. In addition, blood is collected in a vacuum blood collection vessel containing citric acid, and then calcium chloride and a coagulation factor inhibitor suitable for the monitoring purpose, such as a trypsin inhibitor derived from maize, or a thrombin aptamer are added. Therefore, blood subjected to anticoagulation treatment can be collected depending on the purpose of monitoring.
Трубка для лекарственного средства 12, соединенная с камерой 10 образования тромба, может быть изготовлена из прозрачного стекла, термопластичной смолы или подобных материалов. Конец трубки для лекарственного средства 12, который противоположен ее другой стороне, соединяющейся с камерой 10 образования тромба, соединен со шприцем 21 для подачи лекарственного средства, осуществляющего антикоагуляционную обработку, или лекарственного средства, стимулирующего свертывание крови. Шприц 21 может быть соединен с насосом 31 и сдавливающим средством (не показано), так что поршень шприца 21 может надавливаться при заданном давлении. Насос может представлять собой обычный насос, имеющийся в продаже. Альтернативно, насос может представлять собой шприцевый насос, изготовленный экструзией шприца воздухом при заданном давлении, или переворачиванием шприца, так что поршень находится сверху, и воздействуя на поршень грузом. Трубка для лекарственного средства 12 заполняется средством, осуществляющим антикоагуляционную обработку, или средством, стимулирующим свертывание крови, как описано ниже.The
Для проведения мониторинга тромба устройством мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению шприц 20 заполняют цельной кровью или плазмой, содержащей тромбоциты, и подвергают антикоагуляционной обработке цитратом натрия (раствором А). Шприц 21 заполнят лекарственным средством, которое обеспечивает антикоагуляционную обработку, таким как раствор хлорида кальция (раствор В). Раствор А и раствор В подают во впускную трубку 11 насосами 30 и 31 соответственно так, чтобы раствор В мог достичь концентрации от 5 до 20 ммоль, при которой можно инициировать каскад свертывания раствора А. В последующем, раствор А и раствор В смешиваются во впускной трубке 11, так что смесь направляется в камеру 10 образования тромба. Затем коллаген или подобное вещество, способное вызвать образование тромба, предварительно наносится на часть внутренней поверхности камеры 10 образования тромба для формирования материала, вызывающего образование тромба. Камера образования тромба может быть изготовлена из прозрачной пластиковой трубки. Образование тромба можно легко контролировать устройством мониторинга крови, проходящей через такую просматриваемую ввиду прозрачности камеру 10 образования тромба.To monitor thrombus, the thrombus formation monitoring device according to the present invention, the
Мониторинг образования тромба можно осуществлять визуальной оценкой крови, протекающей в течение заданного периода времени через камеру (камеру 10 образования тромба), обработанную коллагеном, а затем удалением крови из нее. Когда насос для подачи раствора А и раствора В засасывает воздух, то раствор А и раствор В можно подавать под постоянным давлением. Поэтому образование тромба на коллагене можно контролировать по уменьшению скорости потока крови, вытекающей из выпускной трубки 13. Альтернативно, когда манометр устанавливается около камеры 10 образования тромба на части впускной трубки 11 и выпускной трубки 13, образование тромба на коллагене можно контролировать наблюдением изменения внутреннего давления в камере 10 образования тромба. Альтернативно, образование тромба на коллагене можно наблюдать под микроскопом при изготовлении камеры 10 образования тромба толщиной 500 мкм или менее. В частности, можно легко наблюдать тромб в обогащенной тромбоцитами плазме, потому что он хорошо виден, и образование тромба можно также наблюдать невооруженным глазом. Далее, можно также флюоресцентно метить тромбоциты крови и контролировать их флюоресценцию флюоресцентным микроскопом.Monitoring the formation of a blood clot can be carried out by a visual assessment of blood flowing for a predetermined period of time through a chamber (
Примеры лекарственного средства для осуществления антикоагуляционной обработки образующим хелаты агентом, таким как лимонная кислота, содержат: галиды кальция, такие как хлорид кальция, бромид кальция и йодид кальция; неорганические соли кальция, такие как фосфат кальция, сульфат кальция, нитрат кальция и бикарбонат кальция; и кальциевые соли органических кислот, такие как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, масляная кислота, альгиновая кислота, молочная кислота, глюконовая кислота, глицериновая кислота и глицерофосфорная кислота, которые представляют собой соединения кальция, предоставленные в виде доноров свободного кальция.Examples of a medicament for performing anticoagulation treatment with a chelating agent, such as citric acid, comprise: calcium halides such as calcium chloride, calcium bromide and calcium iodide; inorganic calcium salts such as calcium phosphate, calcium sulfate, calcium nitrate and calcium bicarbonate; and calcium salts of organic acids, such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, alginic acid, lactic acid, gluconic acid, glyceric acid and glycerophosphoric acid, which are calcium compounds provided as free calcium donors.
Средство, осуществляющее антикоагуляционное действие, можно выбрать и использовать в зависимости от ингибитора факторов свертывания, когда антикоагуляционная обработка проводится ингибитором факторов свертывания (средство антикоагуляционной обработки). Например, в качестве средства, осуществляющего антикоагуляционное действие, когда антикоагуляционная обработка проводится гепарином, можно использовать протамин, гепариназу или антитело против гепарина. В качестве средства, имеющего антикоагуляционное действие, когда антикоагуляционные обработки проводятся гирудином, гирулогом и апротинином, можно использовать средство, осуществляющее антикоагуляционное действие, такое как соответственно антитело против гирудина, антитело против гирулога и антитело против апротинина.The anticoagulation agent may be selected and used depending on the coagulation factor inhibitor when the anticoagulation treatment is carried out by the coagulation factor inhibitor (anticoagulation treatment agent). For example, as an anticoagulant, when the anticoagulation treatment is carried out with heparin, a protamine, heparinase or an anti-heparin antibody can be used. As an agent having an anticoagulant effect, when the anticoagulant treatments are performed with hirudin, hirulog and aprotinin, an anticoagulant agent such as an anti-hirudin antibody, an anti-hirulog antibody and an anti-aprotinin antibody can be used.
Примеры средства, осуществляющего антикоагуляционное действие, когда антикоагуляционная обработка проводится с использованием антитела против тромбина в качестве ингибитора фактора свертывания, включают: полностью инактивированный тромбин, такой как РРАСК-тромбин (D-Phe-Pro-Arg-хлорметилкетон)-тромбин; фрагмент разрушения тромбина и синтетический полипептид, содержащий распознающий антитело эпитоп тромбина.Examples of an anticoagulant agent when the anticoagulation treatment is performed using an anti-thrombin antibody as an inhibitor of coagulation factor include: fully inactivated thrombin, such as PPAC-thrombin (D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketone) -thrombin; thrombin disruption fragment; and a synthetic polypeptide comprising an antibody-recognizing thrombin epitope.
Антитела, используемые при антикоагуляционной обработке или осуществлении антикоагуляции, предпочтительно включают антитела, из которых домены Fc удалены папаиназой или подобными веществами, для минимизации их эффекта на систему комплемента, или такие антитела как антитела куриных яиц, неспособных активировать систему комплемента человека.Antibodies used in anticoagulation treatment or anticoagulation, preferably include antibodies from which the Fc domains are removed by papainase or similar substances to minimize their effect on the complement system, or antibodies such as chicken egg antibodies that are unable to activate the human complement system.
Когда аптамер тромбина (Blood. 1993 Jun 15; 81(12): 3271-6 или J Mol Biol. 1997 Oct 10; 272(5): 688-98), который представляет собой однонитевую олиго ДНК, используется в качестве средства для антикоагуляционной обработки, вещество, которое связывается с аптамером тромбина и ингибирует его функции, такое как антисмысловая ДНК или антисмысловая РНК, можно использовать в качестве средства, осуществляющего антикоагуляционное действие. Когда два вида аптамеров тромбина, один, распознающий экзоцит I, и другой, распознающий экзоцит II, используются в комбинации, то можно получить очень высокий эффект антикоагуляционной обработки, по сравнению со случаем, в котором каждый из них используется отдельно. Антисмысловая ДНК, используемая в этом случае, может представлять собой антисмысловую ДНК против части аптамера тромбина, пока она существенно инактивирует антитромбиновую функцию аптамера тромбина.When the thrombin aptamer (Blood. 1993
Кроме того, аптамер тромбина и его антисмысловая ДНК эффективны соответственно в качестве средства антикоагуляционной обработки и средства, осуществляющего антикоагуляционное действие, что описано со ссылкой на представленные ниже справочные примеры.In addition, the thrombin aptamer and its antisense DNA are effective, respectively, as a means of anticoagulation treatment and a means that performs anticoagulation action, which is described with reference to the following reference examples.
Систему свертывания нельзя активировать в пределах нескольких часов, когда антикоагуляционная обработка проводится гепарином. Таким образом, кровь можно хранить в течение длительного периода времени при мониторинге образования тромба. Однако, например, бывает случай, когда антикоагуляционная обработка не подходит для исследования крови, взятой у пациента, которому вводили гепарин.The coagulation system cannot be activated within a few hours when the anticoagulation treatment is carried out with heparin. Thus, blood can be stored for a long period of time while monitoring the formation of a blood clot. However, for example, there is a case when anticoagulation treatment is not suitable for the study of blood taken from a patient who was injected with heparin.
С другой стороны, гирудин, гирулог и антитромбиновое антитело представляют собой ингибиторы для ингибирования превращения фибриногена в фибрин ингибированием тромбина, который действует на конечную стадию системы свертывания. Однако фактор фазы контакта (такой как пре-калликреин или фактор XII) каскада свертывания постепенно активируется даже в случае полного ингибирования тромбина, так что может происходить активация выше по каскаду свертывания. Поэтому существует случай, который не подходит для длительного хранения крови.On the other hand, hirudin, hirulog and antithrombin antibody are inhibitors for inhibiting the conversion of fibrinogen to fibrin by inhibiting thrombin, which acts on the final stage of the coagulation system. However, the contact phase factor (such as pre-kallikrein or factor XII) of the coagulation cascade is gradually activated even if thrombin is completely inhibited, so activation upstream of the coagulation cascade can occur. Therefore, there is a case that is not suitable for long-term storage of blood.
Апротинин также ингибирует активность калликреина на фазе контакта для задержки эндогенного каскада свертывания крови. Однако каскад свертывания постепенно активируется даже в условиях ингибирования активности калликреина, так что кровь сворачивается через несколько часов даже в присутствии апротинина.Aprotinin also inhibits the activity of kallikrein in the contact phase to delay the endogenous blood coagulation cascade. However, the coagulation cascade is gradually activated even under conditions of inhibition of kallikrein activity, so that blood coagulates after a few hours even in the presence of aprotinin.
Поэтому при мониторинге образования тромба крови примерно через несколько десятков минут можно контролировать образование тромба антикоагуляционной обработкой ингибитором тромбина и/или апротинином. Однако это может не быть предпочтительным в случае требуемого длительного времени для начала мониторинга или требуемого длительного времени для мониторинга.Therefore, when monitoring the formation of a blood clot, after approximately several tens of minutes, it is possible to control the formation of a blood clot by anticoagulation treatment with a thrombin inhibitor and / or aprotinin. However, this may not be preferable in the case of the required long time to start monitoring or the required long time for monitoring.
Когда образование тромба контролируется через 1 час или более от момента взятия пробы крови, антикоагуляционную обработку можно проводить с использованием аптамера тромбина в комбинации с полученным из маиса ингибитором трипсина, гирудина и апротинина. Альтернативно, небольшое количество гепарина, например менее чем 1 ЕД/мл, которое представляет собой уровень, который не оказывает большого влияния на время свертывания, можно использовать в комбинации с ингибитором фактора фазы контакта или ингибитором тромбина.When thrombus formation is monitored after 1 hour or more from the time a blood sample is taken, anticoagulation can be performed using the thrombin aptamer in combination with a trypsin, hirudin, and aprotinin inhibitor derived from maize. Alternatively, a small amount of heparin, for example less than 1 U / ml, which is a level that does not have a large effect on clotting time, can be used in combination with a contact phase factor inhibitor or thrombin inhibitor.
Намного более выраженный эффект антикоагуляционной обработки можно получить, когда аптамер тромбина используется в комбинации с двумя видами аптамеров для экзоцита I и экзоцита II. Далее, антисмысловая ДНК соответствующих аптамеров может немедленно осуществить антикоагуляционную обработку.A much more pronounced effect of anticoagulation treatment can be obtained when the thrombin aptamer is used in combination with two types of aptamers for exocyte I and exocyte II. Further, the antisense DNA of the respective aptamers can immediately carry out anticoagulation treatment.
В образец крови также заранее добавляют ингибитор фактора фазы контакта или ингибитор тромбина, такой как ингибитор, полученный из маиса (ингибитор фактора XII), или апротинин (ингибитор калликреина), и ингибитор тромбина, такой как аптамер тромбина, а затем добавляют антисмысловую ДНК аптамера тромбина (ингибитор ДНК) или подобное вещество. Таким образом, функция одного ингибитора тромбина ингибируется для осуществления функционального ингибирования тромбина с последующим быстрым направлением потока образца в камеру образования тромба. В результате, например, экзогенный каскад свертывания можно активировать тканевым фактором (тканевым тромбопластином) или ему подобным, так что стимулируется свертывание крови, и можно контролировать физиологическое образование тромба.A contact phase inhibitor or thrombin inhibitor, such as an inhibitor obtained from maize (factor XII inhibitor), or aprotinin (a kallikrein inhibitor), and a thrombin inhibitor, such as a thrombin aptamer, are also added to the blood sample in advance, and then the antisense thrombin aptamer DNA is added (DNA inhibitor) or the like. Thus, the function of a single thrombin inhibitor is inhibited to effect a functional inhibition of thrombin, followed by a rapid flow of the sample into the thrombus formation chamber. As a result, for example, an exogenous coagulation cascade can be activated by a tissue factor (tissue thromboplastin) or the like, so that blood coagulation is stimulated, and the physiological formation of a blood clot can be controlled.
Альтернативно, антикоагуляционную обработку можно проводить и ингибитором средства антикоагуляционной обработки, и полученным из маиса трипсином, которые способны осуществлять антикоагуляционную обработку, таким как вещества, образующие хелаты (лимонная кислота), гепарин или им подобные; и донор свободного кальция, такой как хлорид кальция; или гепариназе можно затем дать возможность осуществить соответствующую антикоагуляционную обработку с последующим предоставлением возможности крови течь в камеру образования тромба для стимуляции свертывания крови активацией экзогенного каскада свертывания.Alternatively, anticoagulation treatment can be performed with an anticoagulation agent inhibitor and maize trypsin, which are capable of performing anticoagulation treatment, such as chelating agents (citric acid), heparin or the like; and a free calcium donor such as calcium chloride; or heparinase can then be allowed to carry out appropriate anticoagulation treatment, followed by allowing blood to flow into the thrombus formation chamber to stimulate blood coagulation by activating an exogenous coagulation cascade.
В этом случае вызывающий образование тромба материал может предпочтительно содержать соответствующее количество тканевого фактора (тканевого тромбопластина). В частности, предпочтительно, чтобы вызывающий образование тромба материал мог покрываться смесью, полученной смешиванием коллагена с тканевым тромбопластином с последующей сушкой, потому что образование тромба стимулируется только в камере образования тромба. Когда используется вызывающий образование тромба материал, покрытый раствором коллагена, содержащим тканевой фактор (тканевой тромбопластин) в качестве атероматозной модели, то можно проводить мониторинг, который отражает патологический механизм.In this case, the thrombus-forming material may preferably contain an appropriate amount of tissue factor (tissue thromboplastin). In particular, it is preferable that the thrombus-forming material can be coated with a mixture obtained by mixing collagen with tissue thromboplastin, followed by drying, because thrombus formation is stimulated only in the thrombus-forming chamber. When a thrombus causing material is used coated with a collagen solution containing tissue factor (tissue thromboplastin) as an atheromatous model, monitoring can be performed that reflects a pathological mechanism.
Кроме того, образование тромба можно контролировать добавлением донора свободного кальция и ингибитором трипсина к крови, подвергнутой антикоагуляционной обработке соединением, образующим хелаты кальция, таким как лимонная кислота, и обеспечением быстрого тока крови в камеру образования тромба, или добавлением гепариназы и ингибитора трипсина к крови, подвергнутой антикоагуляционной обработке гепарином, и затем обеспечением быстрого потока крови в камеру образования тромба. В описанном выше способе, при котором образование тромба контролируется смешиванием подвергнутой антикоагуляционной обработке крови, полученной с использованием одного или более видов средств для антикоагуляционной обработки, по меньшей мере, с одним средством, осуществляющим антикоагуляционную обработку, соответствующим используемому средству, и затем обеспечением быстрого потока крови в камеру образования тромба, можно использовать устройство мониторинга образования тромба (фиг.9).In addition, the formation of a blood clot can be controlled by the addition of a free calcium donor and a trypsin inhibitor to the blood, subjected to anticoagulation treatment with a calcium chelating compound such as citric acid, and by allowing rapid blood flow to the blood clot chamber, or by adding heparinase and a trypsin inhibitor to the blood, subjected to anticoagulation treatment with heparin, and then providing a rapid flow of blood into the thrombus formation chamber. In the method described above, in which the formation of a blood clot is controlled by mixing the anticoagulated blood obtained using one or more types of anticoagulation treatment with at least one anticoagulation treatment corresponding to the agent used and then ensuring a fast blood flow into the thrombus formation chamber, a thrombus formation monitoring device can be used (Fig. 9).
Указанные выше ингибиторы тромбина, такие как гирудин и аптамеры тромбина, синтезированные низкомолекулярные ингибиторы фактора фазы контакта, и средства антикоагуляционной обработки из белка дорогостоящи, по сравнению с любыми из средств антикоагуляционной обработки, таких как лимонная кислота и EDTA, которые образуют хелаты с кальцием и им подобные. Однако они не изменяют концентрацию двухвалентных ионов металлов, таких как кальций, магний и цинк, так что образование тромба при первоначальных концентрациях этих ионов в крови пациента может отражаться при мониторинге. Поэтому становится возможным мониторинг, который больше отражает клиническое состояние пациента.The above thrombin inhibitors, such as hirudin and thrombin aptamers, synthesized low molecular weight contact phase factor inhibitors, and protein anticoagulation agents are expensive compared to any anticoagulation agent such as citric acid and EDTA that form chelates with calcium and it like that. However, they do not change the concentration of divalent metal ions, such as calcium, magnesium and zinc, so that the formation of a blood clot at the initial concentration of these ions in the patient’s blood can be reflected during monitoring. Therefore, monitoring becomes possible, which more closely reflects the clinical condition of the patient.
Свертывание крови можно подавить ингибированием фактора фазы контакта, такого как активированный фактор XII или калликреин. Однако сообщалось, что активация XIIа и калликреин не вносит большого вклада в действительное физиологическое образование тромба или гемостаз. В действительности, вообще нет данных о кровотечении или подобном явлении даже у пациента с врожденной недостаточностью фактора XII, пре-калликреина или им подобных. В частности, при атеротромбозе, таком как инфаркт миокарда, широко известно, что система свертывания активируется тканевым фактором благодаря бляшке, вызванной артериосклерозом. Фактор XII может активироваться главным образом тромбином на активированном тромбоците. Поэтому при выполнении антикоагуляционной обработки, когда ингибитор для ингибирования активации фактора XII, или прекалликреина, или ингибитора для ингибирования активированного фактора XII, или калликреина используется в качестве антикоагуляционного средства, нет необходимости добавления средства, осуществляющего антикоагуляционное действие. Путем добавления в кровь любого вещества, которое активирует экзогенное свертывание, такого как тканевой фактор (например, тканевой тромбопластин), или материала, вызывающего образование тромба, вместо средства антикоагуляционной обработки, или добавлением вещества в материал, вызывающий образование тромба, система свертывания активируется альтернативным путем, который избегает активации фактора XII и активации калликреина для стимуляции свертывания крови, так что образование тромба можно контролировать в камере образования тромба.Blood coagulation can be suppressed by inhibiting the contact phase factor, such as activated factor XII or kallikrein. However, it was reported that activation of XIIa and kallikrein does not contribute much to the actual physiological formation of a blood clot or hemostasis. In fact, there is generally no evidence of bleeding or the like even in a patient with congenital deficiency of factor XII, pre-kallikrein or the like. In particular, with atherothrombosis, such as myocardial infarction, it is widely known that the coagulation system is activated by a tissue factor due to a plaque caused by arteriosclerosis. Factor XII can be activated mainly by thrombin on an activated platelet. Therefore, when performing anticoagulation treatment, when an inhibitor for inhibiting the activation of factor XII, or prekallikrein, or an inhibitor for inhibiting activated factor XII, or kallikrein is used as an anticoagulant, there is no need to add an anticoagulating agent. By adding to the blood any substance that activates exogenous coagulation, such as tissue factor (e.g. tissue thromboplastin), or a thrombus-producing material instead of an anticoagulation agent, or by adding a substance to the thrombus-forming material, the coagulation system is activated in an alternative way which avoids the activation of factor XII and the activation of kallikrein to stimulate blood coagulation, so that the formation of a thrombus can be controlled in the thrombus formation chamber.
В качестве средств антикоагуляционной обработки, которые можно использовать при мониторинге образования тромба, после стимуляции свертывания крови добавлением вещества, которое активирует экзогенное свертывание, такого как тканевой фактор, без добавления средства, осуществляющего антикоагуляционное действие, иллюстрируются синтезированные низкомолекулярные ингибиторы, такие как ингибитор калликреина PKSI-527 (Thromb Res 57: 889, 1990) и D-Phe-Arg-CK, который представляет собой ингибитор активированного фактора XII (Cal Biochem. Co., Ltd.). Кроме того, белковые ингибиторы включают антитела против протеазы контактной фазы в каскаде свертывания, такие как антитело против калликреина, антитело против прекалликреина, антитело против фактора свертывания XII, антитело против активированного фактора свертывания XII, и ингибитор трипсина, полученный из маиса.As anticoagulation agents that can be used to monitor blood clot formation, after stimulating blood coagulation by adding a substance that activates exogenous coagulation, such as tissue factor, without adding an anticoagulation agent, the synthesized low molecular weight inhibitors, such as the PKSI-kallikrein inhibitor, are illustrated 527 (Thromb Res 57: 889, 1990) and D-Phe-Arg-CK, which is an activated factor XII inhibitor (Cal Biochem. Co., Ltd.). In addition, protein inhibitors include anti-contact phase protease antibodies in the coagulation cascade, such as an anti-kallikrein antibody, an anti-precallicrein antibody, an anti-coagulation factor XII antibody, an anti-coagulation factor XII antibody, and a trypsin inhibitor derived from maize.
Для мониторинга образования тромба после стимуляции свертывания крови добавлением вещества, которое активирует экзогенное свертывание, без добавления средства, осуществляющего антикоагуляционное действие, в частности, с точки зрения доступности и антикоагуляционной способности, предпочтительно, чтобы кровь была однократно подвергнута антикоагуляционной обработке комбинацией лимонной кислоты и полученным из маиса ингибитором трипсина или комбинацией аптамера тромбина и полученного из маиса ингибитора трипсина, и кровь затем хранилась, потому что можно повысить степень свободы операции мониторинга. Далее, непосредственно перед мониторингом образования тромба, продолжается антикоагуляционная обработка полученным из маиса ингибитором трипсина, в то время как другая антикоагуляционная обработка частично осуществляется донором свободного кальция или антисмысловой ДНК аптамера тромбина. В этом случае в качестве модели атероматозного тромба предпочтительно активировать экзогенное свертывание использованием материала, вызывающего образование тромба, покрытого коллагеном, или содержащим коллаген тканевым тромбопластином, для стимуляции свертывания.To monitor the formation of a blood clot after stimulating blood coagulation by adding a substance that activates exogenous coagulation, without adding an anticoagulant, in particular in terms of accessibility and anticoagulation ability, it is preferable that the blood be subjected to anticoagulation treatment once with a combination of citric acid and obtained from maize with a trypsin inhibitor or a combination of thrombin aptamer and a maize trypsin inhibitor, and the blood is then stored It familiarizes because it can increase the degree of freedom of the monitoring operation. Further, immediately before monitoring the formation of a blood clot, anticoagulation treatment with a trypsin inhibitor obtained from maize continues, while other anticoagulation treatment is partially carried out by a donor of free calcium or antisense DNA of the thrombin aptamer. In this case, as a model of an atheromatous thrombus, it is preferable to activate exogenous coagulation using a material that causes the formation of a thrombus coated with collagen or collagen-containing tissue thromboplastin to stimulate coagulation.
Контейнеры, используемые при мониторинге образования тромба, такие как шприц для подачи крови и вакуумный сосуд для сбора крови, предпочтительно покрыты гепарином или материалом, обладающим антитромботической способностью и совместимостью с кровью, таким как поливиниллактоамид (PVLA) или поли-2-метоксиэтилакрилат (РМЕА).The containers used to monitor blood clot formation, such as a syringe for blood supply and a vacuum vessel for collecting blood, are preferably coated with heparin or a material with antithrombotic ability and blood compatibility, such as polyvinyl lactoamide (PVLA) or poly-2-methoxyethyl acrylate (PMEA) .
В устройстве мониторинга образования тромба в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения трубка и камера образования тромба могут быть объединены друг с другом на подложке тонким каналом, таким как микрочип.In a thrombus formation monitoring device according to another embodiment of the present invention, the tube and the thrombus formation chamber can be combined with each other on a substrate by a thin channel, such as a microchip.
На фиг.4 показан вид в плане основной части устройства мониторинга образования тромба в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения. На фиг.4 в подложке 100 образована канавка, и на ней сформирован контур. Этот вариант осуществления сконфигурирован следующим образом. На небольшом куске подложки выполнены камера образования тромба в качестве основной части устройства мониторинга образования тромба, впускная трубка, которая соединена с камерой образования тромба, и через которую кровь течет в камеру образования тромба, и трубка для лекарственного средства, которая соединена с впускной трубкой и через которую в камеру образования тромба вводится лекарственное средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку, или лекарственное средство, стимулирующее свертывание крови, все элементы объединены в единое целое друг с другом и представлены в виде контура микрочипа. В этом варианте осуществления части, кроме основной части, объединены в единое целое на подложке, аналогичны первому варианту осуществления.4 is a plan view of a main part of a blood clot monitoring device in accordance with a second aspect of the present invention. 4, a groove is formed in the
На фиг.4 подложка 100 представляет собой основной корпус микрочипа, и ее материалы могут представлять собой любые из группы, состоящей из металла, стекла, пластика, силикона и им подобным. При наблюдении тромба предпочтителен прозрачный материал. Для формирования контура предпочтителен пластиковый материал. Поэтому особенно предпочтителен прозрачный пластиковый материал. Когда он выбран из силиконовой смолы, такой как полидиметилсилоксан (PDMS), его способность сцепления очень высока. Таким образом, контур может быть образован контактным связыванием с крышкой без клея или ему подобного. Когда используется подложка из полистирола, то канал можно легко покрыть PVLA и подвергнуть антитромботической обработке. Далее РМЕА может также обеспечить возможность простой, эффективной антитромботической обработки (см. справочный пример 4).4, the
На фиг.5 представлен вид в плане подложки, которая служит крышкой микрочипа, которая наложена поверх и связана с подложкой 100 (фиг.4). Подложка 200 (фиг.5) представляет собой прозрачное предметное стекло или пластину или листок, которые изготовлены из пластика или подобного материала. Подложка 200 в виде крышки наложена поверх и связана с подложкой 100, так что контур подложки может быть сформирован из камеры 110 образования тромба, впускной трубки 111 и трубки для лекарственного средства 112.FIG. 5 is a plan view of a substrate that serves as a microchip cover that is overlaid and connected to the substrate 100 (FIG. 4). The substrate 200 (figure 5) is a transparent glass slide or plate or sheet, which are made of plastic or similar material. A
Для обеспечения внутренней поверхности камеры 110 образования тромба материалом, вызывающим развитие тромба 115, например, коллаген или ему подобный материал можно наносить на заданное положение установки подложки 200. Устройство для мониторинга образования тромба можно получить, когда подложка 100 и подложка 200 связываются друг с другом соединением или подгонкой при направлении внутрь поверхности с нанесенным коллагеном подложки 200. Ввиду простого нанесения коллаген можно предпочтительно наносить на плоскую подложку 200, не имеющую канавки. Кроме того, тканевой тромбопластин предпочтительно наносится после смешивания с коллагеном, потому что можно получить вызывающий образование тромба материал, имеющий более высокую способность вызывать образование тромба. Далее для легкого образования тромба нанесенным коллагеном стекло, имеющее часть с нанесенным коллагеном, может подвергаться дополнительной обработке, такой как замещение стекла матовым стеклом или подобным материалом, так что площадь поверхности можно увеличить.To provide the inner surface of the
Соединительная часть 100А, соединительная часть 100В и соединительная часть 100С подложки 100 соединены с трубками (не показаны), которые образуют соответственно части впускной трубки, трубки для лекарственного средства и выпускной трубки. Таким образом, каждая из соединительной части 100А и соединительной части 100В соединена с насосами (не показаны) через трубки. Подвергнутая антикоагуляционной обработке кровь инжектируется из соединительной части 100А, а антикоагуляционное средство, соответствующее средству антикоагуляционной обработки, инжектируется из соединительной части 100В.The connecting
В соответствии с этим вариантом осуществления образование тромба можно контролировать крайне небольшим количеством крови, так что можно уменьшить дискомфорт для пациента. Кроме того, тромбоциты, сцепленные с подложкой 200 со стороны подложки 200, можно контролировать мечением тромбоцитов флюоресцентным реагентом, таким как мепакрин.In accordance with this embodiment, a blood clot can be controlled with an extremely small amount of blood, so that discomfort for the patient can be reduced. In addition, platelets adhered to the
Далее, контур 100D имеет герметизируемый конец, в котором блокируется воздух. Таким образом, контур 100D предоставлен в виде манометра. Конец контура 100D может быть предпочтительно предоставлен с регулирующим клапаном 100Е для снятия давления или увеличения чувствительности, когда контур 100D предоставлен в виде манометра. Регулирующий клапан 100Е может быть закрыт колпачком или липкой лентой, и его объем можно изменить наполнением, таким как смола, в зависимости от требуемой чувствительности. Контур 100D образован низким с тем, чтобы предотвратить смешивание крови с воздухом и предотвратить утечку воздуха. Толщина контура 100D зависит от материала подложки 100, но составляет примерно от 0,1 до 0,5 мм. Внутренне давление впускной трубки 111 устройства мониторинга образования тромба увеличивается образованием тромба, воздух в контуре 100D сжимается кровью, так что подвергнутую антикоагуляционной обработке кровь можно ввести в контур 100D именно в таком количестве. Внутреннее давление можно контролировать перемещением крови в контуре 100D в любое время.Further, the
Сцепление тромбоцитов с коллагеном, активацию системы свертывания на активированных тромбоцитах и накопление активированных тромбоцитов агглютинацией тромбоцитов можно контролировать соответственно устройством мониторинга образования тромба и/или способом мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению.The adhesion of platelets to collagen, the activation of the coagulation system on activated platelets and the accumulation of activated platelets by platelet agglutination can be controlled respectively by a thrombus formation monitoring device and / or a method for monitoring blood clot formation according to the present invention.
Далее, для воспроизведения образования тромба при атеротромбозе, суженные части 14 и 114 сформированы соответственно на камерах 10 и 110 образования тромба. Поэтому можно осуществлять мониторинг, который также отражает напряжение сдвига, создающее агглютинацию тромбоцитов.Further, to reproduce the formation of a thrombus during atherothrombosis, the narrowed
На фиг.9 показана основная часть устройства мониторинга образования тромба в соответствии с третьим вариантом осуществления настоящего изобретения. На фиг.9 изображены впускная трубка 322 для ингибитора свертывания крови и впускная трубка 317 для подачи давления, которая смешивает ингибитор свертывания крови с кровью, находящейся ниже по потоку от камеры образования тромба. В этом варианте осуществления трубка для лекарственного средства не предоставлена выше по потоку от камеры образования тромба.Fig. 9 shows a main part of a blood clot monitoring device in accordance with a third embodiment of the present invention. Fig. 9 shows an
В соответствии с третьим вариантом осуществления в кровь, собранную после добавления средства антикоагуляционной обработки (например, лимонной кислоты и полученного из маиса ингибитора трипсина), кроме того, добавляется средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку (например, донор свободного кальция), непосредственно перед измерением и затем вводится в шприц 320. В последующем, жидкость для заполнения под давлением крови, такая как минеральное масло, вдавливается в шприц из впускной трубки 317 для подачи давления, соединенной со шприцем 320, выдавливая посредством этого кровь в микрочип 300.According to a third embodiment, blood collected after the addition of an anticoagulant treatment agent (e.g., citric acid and a trypsin inhibitor obtained from maize) is further added to an anticoagulation treatment agent (e.g. a free calcium donor) immediately before measurement and then is introduced into the
Увеличение давления, оказываемого на шприц 320 с образцом, показывает состояние окклюзии канала образованным тромбом, так что мониторинг образования тромба по изменению давления особенно подходит для мониторинга модели прочного атероматозного тромба, в котором образуется обструктивный тромб. Вызывающий образование тромба материал может без определенного ограничения представлять собой материал, полученный из коллагена и тканевого фактора. Например, вызывающий образование тромба материал эффективен для мониторинга образования тромба, когда свертывание крови стимулируется активацией экзогенного свертывания.An increase in the pressure exerted on the
Во время измерения давления, для более точного измерения давления в канале при образовании тромба, ингибитор свертывания крови вводится через впускную трубку 322 для ингибитора свертывания крови и смешивается с кровью, находящейся ниже по потоку от камеры образования тромба, через канал, сформированный в микрочипе 300. Таким образом, можно предотвратить образование тромба в крови, находящейся в канале, следующем за камерой образования тромба. Поэтому такая конфигурация предпочтительна, потому что можно определенно и точно измерить изменение давления в канале, которое вызвано сужением или закрытием канала образованием тромба в камере образования тромба.During the measurement of pressure, to more accurately measure the pressure in the channel during the formation of a blood clot, the blood coagulation inhibitor is introduced through the
Ингибитор свертывания крови может предпочтительно без определенного ограничения представлять собой средство антикоагуляционной обработки, используемое в настоящем изобретении. При учете эффективности затрат и возможности манипулирования предпочтительно выбрать любое из тех средств, которые предотвращают свертывание крови альбуминоидной деформацией, включающие щелочной или кислотный раствор, спирт, мочевину и додецилсульфат натрия.The coagulation inhibitor may preferably, without particular limitation, be the anticoagulation treatment agent used in the present invention. When considering cost effectiveness and the possibility of manipulation, it is preferable to choose any of those means that prevent blood coagulation by albuminoid deformation, including alkaline or acid solution, alcohol, urea and sodium dodecyl sulfate.
В описанном варианте осуществления устройство мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению включает засасывающий насос на выпускной трубке 313, вместо впускной трубки 317 подачи давления, чтобы устройство могло определить степень образования тромба на основании изменения засасывающего давления (отрицательное давление). Такая конфигурация может привести к более эффективному измерению, в то же время предотвращая возникновение ситуации, когда жидкость для подачи давления минерального масла или ей подобная смешивается с кровью в области контакта, и смесь подается, когда количество небольшое, в случае использования насоса, который производит непрямое выталкивание крови через жидкость, отделенную в виде слоя, как описано ниже.In the described embodiment, the thrombus formation monitoring device of the present invention includes a suction pump on an
Далее, нет необходимости в использовании закрытого контейнера, такого как шприц, в качестве контейнера (емкости для образца) для подачи крови в устройство мониторинга образования тромба по настоящему изобретению. Таким образом, контейнер может не иметь крышки и может быть открытым для воздуха. В результате, можно упростить устройство мониторинга образования тромба. Далее, в устройстве мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению внутреннее давление в канале отрицательное. Таким образом, когда устройство для мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению изготавливают в виде микрочипа, например, даже в случае неполного сцепления между основным корпусом микрочипа и крышкой микрочипа, вообще нет утечки крови. В некоторых случаях его можно использовать в качестве устройства мониторинга образования тромба путем подгонки основного корпуса микрочипа и крышки микрочипа вместе, когда подгонка является точной.Further, there is no need to use a closed container, such as a syringe, as a container (sample container) for supplying blood to the blood clot monitoring device of the present invention. Thus, the container may not have a lid and may be open to air. As a result, a blood clot monitoring device can be simplified. Further, in the thrombus formation monitoring device of the present invention, the internal pressure in the channel is negative. Thus, when the device for monitoring the formation of a blood clot according to the present invention is made in the form of a microchip, for example, even in the case of incomplete adhesion between the main body of the microchip and the cover of the microchip, there is no blood leak at all. In some cases, it can be used as a blood clot monitoring device by fitting the main body of the microchip and the lid of the microchip together when the fit is accurate.
На фиг.10 показано дополнительно систематизированное устройство А мониторинга образования тромба.Figure 10 shows an additionally systematic device A for monitoring the formation of a blood clot.
Устройство А мониторинга образования тромба заполняет микронасос 330 подачи жидкостью, имеющей плотность, меньшую чем кровь. Затем жидкость вдавливается в шприц для образца 320, в который кровь поступает через впускную трубку 317 подачи давления, и затем наслаивается на кровь, посредством этого выдавливая кровь в микрочип 300. Выдавленная кровь смешивается со средством, осуществляющим антикоагуляционную обработку, инжектированным из трубки для лекарственного средства 312, с последующим поступлением в камеру 311 образования тромба. Жидкость для накачивания крови в микронасос 330 подачи может представлять собой любое из масел и жиров, такое как жидкий парафин, минеральное масло и силиконовое масло, и физиологический раствор. Таким образом, становится возможным предотвращение загрязнения и микронасоса 330 подачи, и датчика давления 340 кровью непрямым выталкиванием крови.The thrombus formation monitoring device A fills the
Такой насос для непрямой экструзии крови жидкостью, отделенной слоем от крови, можно использовать в устройстве мониторинга образования тромба в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения.Such a pump for indirect extrusion of blood with a liquid separated by a layer from the blood can be used in a blood clot monitoring device in accordance with any embodiment of the present invention.
Датчик 340 давления может определить давление, подаваемое на шприц образца 320 микронасосом 330 подачи.The
В этом устройстве А мониторинга образования тромба состояние образования тромба можно распознать более детально анализом изображения. В частности, в случае мечения тромбоцитов и лейкоцитов хинакрином и затем мониторинга их сцепления и агглютинации с коллагеном, освещенность на единицу площади вследствие проявления флюоресцентного цвета контролируется анализом изображения. Таким образом, результаты мониторинга можно оценить и хранить в виде данных. Анализ изображения можно проводить обработкой изображения, захваченного флюоресцентным стереоскопическим микроскопом 308, камерой, управляемой компьютером 307, и представлением изображения на дисплее.In this thrombus formation monitoring device A, a thrombus formation state can be recognized in more detail by image analysis. In particular, in the case of labeling platelets and leukocytes with quinacrine and then monitoring their adhesion and agglutination with collagen, the illumination per unit area due to the manifestation of fluorescent color is controlled by image analysis. Thus, monitoring results can be evaluated and stored as data. Image analysis can be performed by processing an image captured by a fluorescence
Поэтому в устройстве А мониторинга образования тромба можно всесторонне определить состояние образования тромба по результатам анализа изображения и изменению давления, подаваемого на поршень с образцом 320.Therefore, in the device A monitoring the formation of a blood clot, it is possible to comprehensively determine the state of the formation of a blood clot from the results of image analysis and the change in pressure supplied to the piston with a sample of 320.
Устройство мониторинга образования тромба можно систематизировать, используя устройство мониторинга образования тромба по любому из вариантов осуществления согласно настоящему изобретению.The thrombus formation monitoring device can be systematized using the thrombus formation monitoring device according to any one of the embodiments according to the present invention.
На фиг.12 представлена схема устройства мониторинга образования тромба четвертого варианта осуществления настоящего изобретения. Устройство мониторинга образования тромба снабжено камерой для наблюдения образования тромба.12 is a diagram of a blood clot monitoring device of a fourth embodiment of the present invention. The device for monitoring the formation of a blood clot is equipped with a camera for observing the formation of a blood clot.
Например, в устройстве мониторинга образования тромба в кровь, подвергнутую антикоагуляционной обработке лимонной кислотой и полученным из маиса ингибитором трипсина, добавляется средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку (например, донор свободного кальция), и производится быстрое заполнение ею шприца 420. Шприц 420 аспирируется насосом 414, соединенным с выпускной трубкой 413, для предоставления возможности крови проходить через камеру образования тромба 411, образуя посредством этого тромб. Степень образования тромба можно определить изменением засасывающего давления (отрицательного давления).For example, in a device for monitoring the formation of a blood clot in a blood subjected to anticoagulation treatment with citric acid and a trypsin inhibitor obtained from maize, an anticoagulation treatment agent (for example, a free calcium donor) is added and the
Для предотвращения свертывания крови после прохождения через камеру образования тромба с закупоркой вследствие этого выпускной трубки 413 или воздействия на измерение давления, во впускной трубке для ингибитора образования тромба 422 происходит смешивание ингибитора образования тромба с кровью после прохождения через камеру образования тромба.To prevent blood clotting after passing through the thrombus formation chamber with blockage, as a result of the
Камера 430 (например, камера, управляемая компьютером) расположена под микрочипом 400 для получения изображения камеры образования тромба, так что можно эффективно использовать пространство над микрочипом. По направляющим 433 камера 430 может передвигаться вперед и назад и вокруг места образования тромба. Путем использования камеры 430, которая имеет функцию сохранения ее положения вдоль оси Х и оси Y, она может получать изображения, в то же время регулярно двигаясь вокруг множества определенных точек. При указанной выше конфигурации можно контролировать процесс образования тромба во времени по широкой площади камеры образования тромба 411, даже если увеличение камеры 430 установлено на высокий уровень. Далее, оптический источник 432 (например, светоизлучающий диод) предпочтительно расположен вокруг камеры 430, поскольку оптический источник 432 может одновременно передвигаться, в то же время поддерживая свое позиционное взаимоотношение с камерой 430. Предпочтительно, чтобы оптический источник 432 был способен излучать свет при длине волн, которые могут возбуждать определенное флюоресцентное вещество вместе с белым светом, в зависимости от флюоресцентного материала, который служит в виде мишени визуализации, обеспечивая возможность возбуждения различных флюоресцентных материалов.A camera 430 (for example, a computer-controlled camera) is located under the microchip 400 to obtain an image of a thrombus formation chamber, so that space above the microchip can be effectively used. Along the
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Далее настоящее изобретение будет детально пояснено определенными примерами. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.Further, the present invention will be explained in detail by certain examples. However, the present invention is not limited to these examples.
Пример 1Example 1
Устройство мониторинга образования тромба (фиг.1) используется для заполнения шприца 20 50 мл обработанной цитратом крови (раствором А), содержащей 9 частей по объему крови сразу после смешивания образца крови с 1 частью по объему 3,2% цитрата натрия, и для заполнения шприца 21 10 мл 0,2 М CaCl2 (раствор В). Шприцы 20 и 21 соединены с прозрачной нейлоновой трубкой (впускной трубкой 11 и трубкой 12 для лекарственного средства) с внутренним диаметром 3 мм. Обе трубки соединены вместе у Т-образного соединения (цилиндрической бобины) и затем соединены с поликарбонатной камерой 10 образования тромба с внутренним диаметром 3 мм и длиной 1 см через одиночную нейлоновую трубку (впускную трубку 11) с внутренним диаметром 3 мм и длиной 3 см. Сама камера 10 образования тромба сконструирована в виде съемной кассеты. Соединительная часть между кассетой и нейлоновой трубкой (впускной трубкой 11) изготовлена герметичной для жидкости посредством кольцевого уплотнителя, изготовленного из силиконовой резины. Стеклянный элемент фиксирован на внутренней стороне кассеты клеем на эпоксидной основе, образуя посредством этого суженную часть 14. Суженная часть 14 сконструирована так, что самый суженный участок суженной части 14 может иметь внутренний диаметр (максимальный зазор между суженной частью 14 и внутренней стенкой) 1,5 мм. Кроме того, камера 10 образования тромба соединена герметично для жидкости с трубкой, такой как выпускная трубка 13, имеющая такой же диаметр и изготовленная из того же материала, посредством кольцевого уплотнителя, изготовленного из силиконовой резины, и, таким образом, изготавливается устройство 1 мониторинга тромба (фиг.1). Следует отметить, что манометры 40 и 41 фланцевого типа установлены соответственно на частях впускной трубки 11 и выпускной трубки 13 около камеры 10 образования тромба посредством соединений (цилиндрических бобин). Кроме того, стеклянный материал суженной части на внутренней поверхности камеры 10 образования тромба получают так, что коллаген наносится в виде покрытия в качестве вызывающего образование тромба материала 15 на стеклянную суженную часть на внутренней поверхности погружением в 0,1N раствор уксусной кислоты, содержащий 1% нерастворимый коллаген типа I (изготавливаемый Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и затем сушкой. Шприцы 20 и 21 перевернуты так, что поршни находятся на верхней стороне, и затем на поршни воздействуют силы тяжести с тем, чтобы дать возможность раствору А и раствору В течь в шприцевые насосы со скоростью соответственно 5 мл/мин и со скоростью 0,5 мл/мин.A blood clot monitoring device (FIG. 1) is used to fill a syringe with 20 50 ml of citrate-treated blood (solution A) containing 9 parts by volume of blood immediately after mixing a blood sample with 1 part by volume of 3.2% sodium citrate, and to fill
Когда раствор А и раствор В текут в течение 10 мин, через несколько минут возникает разница между показаниями манометров 40 и 41 во впускной трубке 11 и выпускной трубке 13, и затем такая разность со временем увеличивается. Одновременно подтверждается, что кровь, вытекающая из выпускной трубки 13, также постепенно уменьшается. Когда поток всех растворов завершается, в устройство 1 мониторинга образования тромба течет физиологический солевой раствор для промывания камеры 10 образования тромба. Таким образом, образование тромба можно обнаружить в камере 10 образования тромба визуальным наблюдением.When solution A and solution B flow for 10 minutes, after a few minutes there is a difference between the readings of the pressure gauges 40 and 41 in the
Пример 2Example 2
Устройство 1 мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 1, за исключением того, что в раствор А примера 1, кроме того, добавляли нефракционированный гепарин (полученный из слизистой оболочки свиней) в концентрации 1 мг/мл.A thrombus
В этом случае нет разности давления, и не происходит уменьшения потока крови, и тромб нельзя найти в камере 10 образования тромба визуальным наблюдением после промывания физиологическим солевым раствором.In this case, there is no pressure difference, and there is no decrease in blood flow, and a blood clot cannot be found in the
Пример 3Example 3
Устройство 1 мониторинга образования тромба изготавливали способом, аналогичным примеру 1, за исключением того, что стеклянная трубка диаметром 3 мм и длиной 5 см была использована в виде камеры 10 образования тромба кассетного типа, каждый из шприцев 20 и 21 был соединен со шприцевыми насосами, приводимыми в действие электрическими моторчиками, а вместо суженной части 14 и коллагена, нанесенного в виде покрытия в качестве материала, вызывающего образование тромба 15, на суженную часть 14 (фиг.2а) прикрепляли клеем кусок шелка длиной 1,5 см, погруженный в коллаген примера 1 и высушенный при 4°С, в качестве материала, вызывающего образование тромба 15, на внутреннюю поверхность камеры 10 образования тромба, которая имеет размер 5 см внутрь от соединительной части стеклянной трубки и впускной трубки 11.The thrombus
После течения раствора А в шприц 20 со скоростью 3 мл/мин и раствора В в шприц 21 со скоростью 0,3 мл/мин в течение 15 мин, камеру 10 образования тромба отсоединяли и ее внутреннюю поверхность затем промывали физиологическим солевым раствором. В результате, визуальное наблюдение подтвердило, что тромб 16 длиной около 1 см и толщиной около 1 мм в форме кометы (фиг.2b), который, как представляется, образовался с находящейся ниже по потоку стороны шелка в качестве начальной точки и распространился вниз по потоку, был прикреплен к внутренней поверхности стеклянной трубки. Считают, что влияние потока крови может вызвать образование тромба в форме кометы.After solution A flowed into
Самая широкая часть тромба имела ширину около 3 мм.The widest part of the thrombus had a width of about 3 mm.
Пример 4Example 4
Устройство 1 мониторинга образования тромба изготавливали способом, аналогичным примеру 3, за исключением того, что вместо шелка (фиг.3а) 50 мкл крови без антикоагуляционной обработки закапывали на внутреннюю поверхность стеклянной трубки пастеровской пипеткой и затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 15 мин, посредством этого получая тромб в форме диска диаметром около 2 мм в качестве вызывающего образование тромба материала 15.The thrombus
Способом, аналогичным примеру 3, после протекания раствора А и раствора В, камеру 10 образования тромба удаляли и затем ее внутреннюю поверхность промывали физиологическим солевым раствором. В результате, визуальное наблюдение подтвердило, что к внутренней поверхности стеклянной трубки был прикреплен тромб 16 длиной около 1 см и толщиной около 1 мм в форме кометы (фиг.3b), проходящий в направлении ниже по потоку, в то же самое время оборачивающий тромб в качестве вызывающего образование материала 15. Считают, что влияние потока крови может вызвать образование тромба в форме кометы.In a manner analogous to example 3, after the flow of solution A and solution B, the
Самая широкая часть тромба имела ширину около 3 мм.The widest part of the thrombus had a width of about 3 mm.
Пример 5Example 5
Устройство 1 мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 3, за исключением того, что в раствор А, кроме того, добавляли Argаtroban (зарегистрированная марка, изготавливаемая Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.) в качестве средства антикоагуляционной обработки в концентрации 0,1 мг/мл относительно раствора А примера 3.A thrombus
В результате, визуальное наблюдение не подтвердило присутствия тромба в стеклянной трубке после промывания физиологическим солевым раствором.As a result, visual observation did not confirm the presence of a blood clot in a glass tube after washing with physiological saline.
Пример 6Example 6
Устройство 1 мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 3, за исключением того, что подвергнутую антикоагуляционной обработке кровь получали добавлением гирудина в концентрации 1 мкг/мл относительно цельной крови и использовали в качестве раствора А, а поликлональное антитело против гирудина (изготовленное COSMO BIO CO., LTD.), растворенное в концентрации 1 мг/мл в физиологическом солевом растворе, относительно крови, использовали в качестве раствора В.A thrombus
В этом случае было подтверждено почти такое же образование тромба, как в примере 3.In this case, almost the same thrombus formation was confirmed as in Example 3.
Пример 7Example 7
Получали 10 мл цельной крови (раствора А), которую подвергали антикоагуляционной обработке добавлением в кровь сразу после взятия образца крови 10 мг/мл апротинина и 1 мкг/мл рекомбинантного гирудина (изготовленного Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); и 1 мл раствора (раствора В), который получали добавлением поликлонального антитела против гирудина (изготовленного COSMO BIO CO., LTD.), из которого был удален домен Fc иммобилизованной папаином смолой до 1000-кратно разбавленного физиологического солевого раствора 1 флакона/мл тромбопластинового реагента (изготовленного Sysmex Corporation) в качестве лекарственного средства для стимуляции свертывания крови.Received 10 ml of whole blood (solution A), which was subjected to anticoagulation treatment by adding to the blood immediately after taking a
Для изготовления устройства мониторинга образования тромба использовали подложку 100 (фиг.4), которая изготовлена из полидиметилсилоксана шириной 40 мм, длиной 70 мм и толщиной 1,5 мм, и подложку 200, показанную на фиг.5, которая имеет толщину 1 мм и изготовлена из стекла таких же размеров.For the manufacture of a blood clot monitoring device, a substrate 100 (FIG. 4) was used, which is made of
Контур, содержащий камеру образования тромба 110, формировали вырезанием канавки глубиной 0,5 мм на поверхности подложки 100 (фиг.4). Глубина части канавки, которая подлежит предоставлению в виде впускной трубки 111, составляет 1 мм. Длина контура 100D составляет 30 мм. Сквозное отверстие диаметром 1 мм образовано на конце канавки и представлено в виде регулирующего клапана 100Е, который закрывается приводимым в действие и закрываемым колпачком. Камера 110 образования тромба имеет длину 30 мм и ширину 2,5 мм в более широкой части и суженную часть 114, имеющую ширину 0,5 мм. Затем предоставлено сквозное отверстие диаметром 1 мм в качестве каждой из соединительных частей 100А и 100В. Кроме того, сквозное отверстие диаметром 2,5 мм предоставлено в виде соединительной части 100С.The contour containing the
Коллаген в форме ленты шириной 10 мм наносили в качестве вызывающего образование тромба материала 115 на подложку 200 в положение, покрывающее суженную часть 114 подложки 100 (фиг.5). Нанесение коллагена проводится так, что прикрепляется прямоугольная маскировочная лента, соответствующая суженной части 114 подложки 200, и затем она покрывается десорбирующим агентом на основе силикона SRX-211 (Dow Corning Toray Co., Ltd.). В последующем, маскирующая лента отслаивается. Затем производили закапывание раствор коллагена типа 1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), растворенного в 0,1 N уксусной кислоте так, чтобы 1% его был свободен от десорбирующего агента, и затем оставляли стоять в течение 1 ч при 25°С. После этого коллаген на слое десорбирующего агента промывали очищенной водой и коллаген наносили только на прямоугольную стеклянную область, соответствующую суженной части 114, где десорбирующий агент не был нанесен.Ribbon-shaped collagen with a width of 10 mm was applied as a
В последующем, поверхность подложки 200 с нанесенным коллагеном и поверхность подложки 100 с сформированным контуром соединяли вместе лицом к лицу.Subsequently, the surface of the collagen coated
Соединительные части 100А и 100В соединены с силиконовыми трубками, имеющим внутренний диаметр 1 мм от задней поверхности (свободная от контура сторона) подложки 100, и затем соединены соответственно с 10-мл шприцем, заполненным раствором А, и 1-мл шприцем, заполненным раствором В. Каждый из этих шприцев соответственно соединен с шприцевыми насосами. Следует отметить, что другая соединительная часть 100С соединена с силиконовой трубкой, имеющей внутренний диаметр 2,5 мм, которая предоставлена в качестве выпускной трубки.The connecting
Раствор А инжектируется из соединительной части 100А при скорости потока 0,3 мл/мин. Раствор В инжектируется из соединительной части 100В при скорости потока 0,03 мл/мин.Solution A is injected from the connecting
Раствору А и раствору В предоставляли возможность течь соответственно из соединительной части 100А и соединительной части 100В в течение 5 мин. Физиологический солевой раствор инжектировали из соединительной части 100А для отмывания крови. В результате, образование тромба подтверждается главным образом на области а и области b (фиг.6) на обработанной коллагеном поверхности подложки 200.Solution A and solution B were allowed to flow respectively from the connecting
Пример 8Example 8
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 7, со следующими исключениями: раствор А получали так, что в кровь сразу после взятия образца крови добавляли поликлональное антитело против фактора XII (изготовленное COSMO BIO CO., LTD.), из которого папаином был иссечен домен Fc, в концентрации 0,3 мг/мл и нефракционированный гепарин свиного происхождения (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в дозе 0,3; раствор В получали разведением тромбопластинового реагента (изготовленного Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) в 50 раз; нанесение коллагена проводили на предварительно обработанную область прозрачной полистирольной подложки 200 (толщиной 1 мм) с нанесенным коллагеном (фиг.8) капанием раствора, полученного растворением перманганата калия в концентрированной серной кислоте. В концентрации 2 г/л, подвергая взаимодействию при 25°С в течение 10 мин с последующим быстрым промыванием очищенной водой, коллаген наносили капанием раствора, в котором коллаген типа 1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), растворенный в 0,1 N уксусной кислоте, растворяли в концентрации 1% на предварительно обработанную область и оставляли стоять при 25°С в течение 1 ч с последующим вымыванием очищенной водой, а подложку 100 без суженной части использовали для камеры 110 образования тромба (фиг.7). Следует отметить, что соединительная часть 100С подложки 100 имеет сквозное отверстие диаметром 1 мм, соединенное с силиконовой трубкой с внутренним диаметром 1 мм в качестве выпускной трубки.A thrombus formation monitoring device was made and the thrombus formation was then monitored in a manner analogous to Example 7, with the following exceptions: solution A was prepared so that a polyclonal antibody against factor XII (manufactured by COSMO BIO CO., LTD.) Was added to the blood immediately after taking a blood sample. from which papain was excised Fc domain, at a concentration of 0.3 mg / ml and unfractionated heparin of porcine origin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a dose of 0.3; Solution B was prepared by diluting 50 times with a thromboplastin reagent (manufactured by Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.); collagen deposition was carried out on a pre-treated area of a transparent polystyrene substrate 200 (1 mm thick) with collagen deposited (Fig. 8) by dripping a solution obtained by dissolving potassium permanganate in concentrated sulfuric acid. At a concentration of 2 g / l, reacting at 25 ° C for 10 min followed by a quick wash with purified water, the collagen was applied by dripping a solution in which type 1 collagen (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in 0.1 N acetic acid, was dissolved in a concentration of 1% on the pre-treated area and left to stand at 25 ° C for 1 h, followed by washing with purified water, and the
После протекания раствора А и раствора В в течение 10 мин физиологический солевой раствор инжектировали из соединительной части 100А для вымывания крови, посредством этого, подтверждая сцепление красного тромба с канальной частью области подложки 200 с нанесенным коллагеном.After the flow of solution A and solution B for 10 min, physiological saline was injected from the connecting
Пример 9Example 9
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 7, за исключением того, что:A thrombus formation monitoring device was made and the thrombus formation was then monitored in a manner analogous to Example 7, except that:
раствор А получали так, что кровь сразу после взятия образца крови подвергали антикоагуляционной обработке добавлением апротинина в концентрации 0,05 мг/мл и рекомбинантного гирудина (изготовленного Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в концентрации 1 мкг/мл и затем добавляли хинакрин (Sigma Co., Ltd.);solution A was obtained so that blood immediately after taking a blood sample was subjected to anticoagulation treatment by adding aprotinin at a concentration of 0.05 mg / ml and recombinant hirudin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a concentration of 1 μg / ml and then quinacrine (Sigma Co., Ltd.);
соединительную часть 100В закрывали колпачком и только раствор А затем инжектировали из соединительной части 100А со скоростью потока 1 мл/мин.the connecting
При наблюдении флюоресцентным стереоскопическим микроскопом, сфокусированным на поверхность предметного стекла подложки 200 с нанесенным коллагеном, проявление флюоресцентного света зеленого хинкрина было подтверждено на части поверхности с нанесенным коллагеном, и такая область распространялась со временем в виде пятнистой области. Через 10 мин проявление зеленого флюоресцентного света, которое могло быть вызвано сцеплением тромбоцитов, было подтверждено на большей части поверхности с нанесенным коллагеном.When observed with a fluorescence stereoscopic microscope focused on the surface of a slide glass of a collagen coated
Пример 10Example 10
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 9, за исключением того, что раствор А получали без добавления хиналина.A thrombus formation monitoring device was made and thrombus formation was then monitored in a manner analogous to Example 9, except that solution A was obtained without the addition of quinaline.
Кровь инжектировали из соединительной части 100А со скоростью потока 1 мл/мин. Когда трубку соединительной части 100С сжимали для ее перекрытия на 2 с во время инжекции, кровь сразу перемещалась на 20 мм от точки разветвления в контуре 100D, что сопровождалось увеличением внутреннего давления. Даже после открытия соединительной части 100С кровь не перемещалась от 20-мм точки, так что можно было подтвердить увеличение давления.Blood was injected from the connecting
Пример 11Example 11
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 8, за исключением того, что:A thrombus formation monitoring device was manufactured and thrombus formation was then monitored in a manner analogous to Example 8, except that:
добавляли поликлональное антитело против тромбина (COSMO BIO CO., LTD.), из которого был удален домен Fc папаином, до концентрации 30 мкг/мл вместо гепарина раствора А примера 8;polyclonal anti-thrombin antibody (COSMO BIO CO., LTD.) was added, from which the Fc domain was removed by papain to a concentration of 30 μg / ml instead of the heparin solution A of Example 8;
и далее добавляли раствор В примера 8 с тромбином РРАСК в концентрации 5 мг/мл.and then solution B of Example 8 with thrombin PPAC at a concentration of 5 mg / ml was added.
После протекания раствора А и раствора В течение 15 мин физиологический солевой раствор инжектировали из соединительной части 100А для вымывания крови. В результате, было подтверждено, что красный тромб был прикреплен на части канала области подложки 200, обработанной коллагеном.After the flow of solution A and solution For 15 min, physiological saline solution was injected from the connecting
Пример 12Example 12
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 7, за исключением того, что:A thrombus formation monitoring device was made and the thrombus formation was then monitored in a manner analogous to Example 7, except that:
раствор А получали так, что 50 мл крови, в которую сразу после взятия пробы крови добавляли 0,5 ЕД/мл гепарина и 10 мкг/мл апротинина, центрифугировали при 800 об/мин и обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) получали из супернатанта, таким образом, получая раствор А; иSolution A was prepared so that 50 ml of blood, to which immediately 0.5 U / ml heparin and 10 μg / ml aprotinin were added immediately after blood sampling, was centrifuged at 800 rpm and platelet-rich plasma (PRP) was obtained from the supernatant, such thus obtaining a solution A; and
раствор, в котором тромбопластиновый реагент в концентрации 1 флакон/мл (Sysmex Corporation) разбавляли в 30 раз физиологическим солевым раствором, использовали в качестве раствора В.a solution in which a thromboplastin reagent at a concentration of 1 vial / ml (Sysmex Corporation) was diluted 30 times with physiological saline was used as solution B.
Образование тромба в суженной части 114 контролировали в течение 15 мин, используя стереоскопический микроскоп. Подтверждали наличие множества тромбоцитарных сгустков, прикрепленных вокруг суженной части 114. Также наблюдалось, что количество сгустков увеличивалось, и их размер также увеличивался, причем тромбоцитарные сгустки повторно прикреплялись и отсоединялись.The formation of a blood clot in the narrowed
Пример 13Example 13
Образование тромба контролировали пропусканием раствора А и раствора В способом, аналогичным примеру 7, со следующими исключениями:The formation of a blood clot was controlled by passing solution A and solution B in a manner analogous to example 7, with the following exceptions:
раствор А получали добавлением 500 мкг эритроцитов, собранных из отцентрифугированного осадка в 20 мл PRР раствора А примера 12;Solution A was prepared by adding 500 μg of red blood cells collected from a centrifuged pellet in 20 ml of PRP solution A of Example 12;
раствор, в котором тромбопластиновый реагент в концентрации 1 флакон/мл (Sysmex Corporation) разбавляли в 30 раз физиологическим солевым раствором, использовали в качестве раствора В;a solution in which a thromboplastin reagent at a concentration of 1 vial / ml (Sysmex Corporation) was diluted 30 times with physiological saline was used as solution B;
предметное стекло получали покрытием всей поверхности подложки 200 десорбирующим агентом SRX-211 (Dow Corning Toray Co., Ltd.) на основе силикона; иA glass slide was prepared by coating the entire surface of the
приблизительно 1 мкл цельной крови сцеплялся с поверхностью около концевой точки расширения расширяющейся части, в последующем распространяясь до ширины 2,5 мм, которая прилегает к находящейся выше по потоку от суженной части 114 части камеры образования тромба 110 на подложке 100, затем цельную кровь оставляли отстаиваться при комнатной температуре в течение 10 мин для того, чтобы вызвать ее свертывание, и образовывался предварительный тромб, предназначенный для использования в качестве материала, вызывающего образование тромба.approximately 1 μl of whole blood adhered to the surface near the extension end point of the expanding part, subsequently spreading to a width of 2.5 mm, which is adjacent to the
Область прикрепления тромба контролировали стереоскопическим микроскопом в течение 15 мин. Образование нового красного тромба, который располагался ниже по потоку от предварительного тромба в качестве исходной точки, было подтверждено примерно через 5 мин, он в целом распространялся вниз по потоку в течение периода до 15 мин, и его ширина увеличивалась до 2,5 мм. Было подтверждено, что кровь текла вдоль образованного тромба или текла через зазоры между образованным тромбом.The thrombus attachment area was monitored with a stereoscopic microscope for 15 minutes. The formation of a new red thrombus, which was located downstream of the preliminary thrombus as a starting point, was confirmed after about 5 minutes, it generally spread downstream for up to 15 minutes, and its width increased to 2.5 mm. It was confirmed that blood flowed along the formed blood clot or flowed through the gaps between the formed blood clot.
Пример 14Example 14
Образование тромба контролировали пропусканием раствора А и раствора В способом, аналогичным примеру 7, со следующими исключениями:The formation of a blood clot was controlled by passing solution A and solution B in a manner analogous to example 7, with the following exceptions:
в 50 мл крови сразу после взятия образца крови добавляли аптамер тромбина экзоцита I (GGTTGGTGTGGTTGG: SEQ ID № 1) в конечной концентрации 5 мкМ и полученный из маиса ингибитор трипсина (COSMO BIO CO., LTD.) в конечной концентрации 30 мкг/мл и центрифугировали при 800 об/мин в течение 10 мин, и из супернатанта формировали обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) и предоставляли в качестве раствора А;exocyte I thrombin aptamer (GGTTGGTGTGGTTGG: SEQ ID No. 1) at a final concentration of 5 μM and a trypsin inhibitor obtained from maize (COSMO BIO CO., LTD.) at a final concentration of 30 μg / ml and were added to 50 ml of blood immediately after taking a blood sample. centrifuged at 800 rpm for 10 min, and platelet-rich plasma (PRP) was formed from the supernatant and provided as solution A;
антисмысловую ДНК (CCAACCACACCAACC: SEQ ID № 2) растворяли в физиологическом солевом растворе так, чтобы ее концентрация была 150 мкМ, и предоставляли в виде раствора В; иantisense DNA (CCAACCACACCAACC: SEQ ID No. 2) was dissolved in physiological saline so that its concentration was 150 μM, and provided as solution B; and
во время нанесения на предметное стекло ингибитора образования тромба 115 раствор, который получали смешиванием раствора коллагена примера 7 с раствором, полученным растворением 1 флакона тромбопластинового реагента (Sysmex Corporation) в 1 мл очищенной воды и затем диализировали в соотношении 5:1, накапывали на область без нанесенного силикона и сушили воздухом при 4°С.during application of a
Образование тромба в суженной части 114 контролировали в течение 5 мин, используя стереоскопический микроскоп. Было подтверждено наличие множества тромбоцитарных сгустков, прикрепленных вокруг суженной части 114. Мониторинг также показал, что количество сгустков увеличивалось с одновременным увеличением их размеров, причем тромбоцитарные сгустки повторно прикреплялись и отсоединялись.The formation of a thrombus in the narrowed
Пример 15Example 15
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба контролировали способом, аналогичным примеру 14, со следующими исключениями:A thrombus formation monitoring device was manufactured and thrombus formation was monitored in a manner analogous to Example 14, with the following exceptions:
после получения PRP такой же процедурой, как в примере 14, непосредственно перед измерением добавляли антисмысловую ДНК (CCAACCACACCAACC: SEQ ID № 2), чтобы ее концентрация была 15 мкМ, посредством этого осуществляя антитромбиновую обработку, и полученный раствор предоставляли в качестве раствора А;after obtaining PRP by the same procedure as in Example 14, antisense DNA (CCAACCACACCAACC: SEQ ID No. 2) was added immediately before measurement so that its concentration was 15 μM, thereby performing an antithrombin treatment, and the resulting solution was provided as solution A;
инжекционное отверстие соединительной части 100В закрывали способом, аналогичным примеру 9;the injection hole of the connecting
коллаген типа I (коллагеновый реагент для покрытия чашки для клеточной культуры коллагеном, маточный раствор типа I-А, Cellmatrix Co., Ltd.) использовали вместо раствора коллагена примера 14; иtype I collagen (collagen reagent for coating a cell culture dish with collagen, type I-A mother liquor, Cellmatrix Co., Ltd.) was used instead of the collagen solution of Example 14; and
только раствор А пропускали со скоростью потока 0,2 мл/мин в течение 5 мин.only solution A was passed at a flow rate of 0.2 ml / min for 5 minutes.
Образование тромба в суженной части 114 контролировали, используя стереоскопический микроскоп. Было подтверждено наличие множества тромбоцитарных сгустков, прикрепленных вокруг суженной части 114. Мониторинг также показал, что количество сгустков увеличивалось с одновременным увеличением их размеров, причем тромбоцитарные сгустки повторно прикреплялись и отсоединялись.The formation of a thrombus in the narrowed
Пример 16Example 16
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали способом, аналогичным примеру 7, со следующими исключениями:A thrombus formation monitoring device was made by a method similar to Example 7, with the following exceptions:
на поверхности подложки формировали канавку глубиной 0,1 мм врезанием контура (фиг.7), в то же время оставляя разделительные стенки так, что были получены вогнутые ряды, каждый длиной 1 мм и шириной 40 мкм, проходящие по всей поверхности нижней части вокруг центра камеры образования тромба 110 с интервалами между ними 40 мкм;a groove of 0.1 mm deep was formed on the surface of the substrate by cutting the contour (Fig. 7), while leaving the dividing walls so that concave rows were obtained, each 1 mm long and 40 μm wide, extending over the entire surface of the lower part around the center
инжекционное отверстие соединительной части 100В закрывали способом, аналогичным примеру 9; иthe injection hole of the connecting
подложка 200 представляла собой предметное стекло без обработки поверхности. Зазор (канал) между разделительными стенками имитирует кровяной капилляр.
Цельную кровь сразу после взятия пробы подвергали антикоагуляционной обработке добавлением полученного из маиса ингибитора трипсина при конечной концентрации 30 мкг/мл и экзоцита I аптамера тромбина при конечной концентрации 10 мкМ. Непосредственно перед мониторингом добавляли антисмысловую ДНК экзоцита I аптамера тромбина так, чтобы ее концентрация была 30 мкМ, с последующей инжекцией из 100А при скорости потока 0,05 мл/мин в течение 5 мин.Whole blood immediately after sampling was subjected to anticoagulation treatment by adding a trypsin inhibitor obtained from maize at a final concentration of 30 μg / ml and exocyte I thrombin aptamer at a final concentration of 10 μM. Immediately before monitoring, the antisense DNA of thrombin aptamer exocyte I was added so that its concentration was 30 μM, followed by injection from 100A at a flow rate of 0.05 ml / min for 5 minutes.
Образование тромба в зазоре между разделительными стенками контролирвали, используя стереоскопический микроскоп. В результате, каналы последовательно закрывались во время мониторинга в течение 5 мин. Мониторинг выявил, что примерно половина каналов была закрыта образованным тромбом.The formation of a thrombus in the gap between the dividing walls was monitored using a stereoscopic microscope. As a result, the channels were sequentially closed during monitoring for 5 minutes. Monitoring revealed that approximately half of the canals were blocked by an formed thrombus.
Пример 17Example 17
Использовали устройство подачи жидкости шприцевого типа (фиг.9). Микрочип 300, где подложка и крышка микрочипа (фиг.9(В) и фиг.9(С)) были изготовлены из тех же материалов, как материалы примера 7, соединяли сдавливанием. Микрочип 300 содержит впускную трубку 322 для ингибитора свертывания крови и выпускную трубку 313, которые были присоединены к подложке 100, как в случае выпускной трубки примера 7. Однако все канавки микрочипа 300 (фиг.9) были сформированы глубиной 200 мкм. Также был сформирован канал так, чтобы кровь могла вводиться в канал из шприца для образцов 320, при этом канал имел ширину 1 мм и длину 40 мм и был соединен с камерой образования тромба 311, состоящей из узкого канала, имеющего ширину 200 мкм и длину 10 мм, и впускной трубки для ингибитора свертывания крови 322. Раствор готовили так, что содержимое 1 флакона реагента РТ Sysmex Corporation (тканевой тромбопластин) растворяли в 1 мл очищенной воды и затем диализировали в очищенной воде. Диализированный продукт в очищенной воде смешивали с коллагеном типа I (изготовленным Nitta Gelatin Inc.) в соотношении 1:1. Раствор наносили на поверхность материала, вызывающего образование тромба 315. После этого часть с нанесенным раствором сушили при 4°С на воздухе и камеру 311 образования тромба покрывали и использовали в качестве материала, вызывающего образование тромба 315. Кровь брали после добавления средства антикоагуляционной обработки, так что конечные концентрации соответствующих компонентов в шприце составили 25 мкг/мл для полученного из маиса ингибитора трипсина, 10 мкМ для экзоцита I аптамера тромбина и 10 мкМ для экзоцита II аптамера тромбина (5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3': seq id № 3). Непосредственно перед мониторингом в собранную таким образом кровь добавляли антисмысловые ДНК в отношении аптамеров тромбина экзоцита I и II так, чтобы каждая из них достигла концентрации 40 мкМ. Затем шприц (шприц емкостью 1 мл, изготовленный Terumo Corporation) заполняли кровью и предоставляли в качестве шприца для образца 320, показанного на фиг.9. Устройство My Flow (изготовленное Arbiotec Co., Ltd.), которое представляет собой насос микроподачи, способный контролировать внутреннее давление подающего жидкость наноса, было соединено с трубкой для подачи давления 317. Минеральное масло вдавливали в микрочип 300 из верхней части шприца 320, и кровь выталкивалась в микрочип 300 со скоростью потока 50 мкл/мин при одновременном контроле давления, оказываемого на шприц для образца 320.A syringe type fluid supply device was used (FIG. 9). The
В качестве ингибитора свертывания из впускной трубки 322 для ингибитора свертываемости крови подавали 1 М Tris-HCl (рН 10) со скоростью потока 50 мкл/мин. Давление начинало расти через 6 мин после начала измерения давления.As a coagulation inhibitor,
Давление, повторяющее его изменения в сторону повышения и понижения вследствие движения тромба («контроль», показанный на фиг.13), поднялось до 80 кПа.The pressure, repeating its changes in the direction of increase and decrease due to the movement of the thrombus ("control", shown in Fig.13), rose to 80 kPa.
Пример 18Example 18
Взятие образцов крови проводили при добавлении средства антикоагуляционной обработки способом, аналогичным примеру 17. Затем, проводили такую же процедуру, как процедура примера 17, за исключением того, что нефракционированный гепарин добавляли в концентрации 1 ЕД/мл. Затем проводили измерение давления. Давление возрастало примерно до 10 кПа («Гепарин», показанный на фиг.13).Blood sampling was carried out by adding an anticoagulation agent in a manner analogous to Example 17. Then, the same procedure as the procedure of Example 17 was carried out, except that unfractionated heparin was added at a concentration of 1 U / ml. Then a pressure measurement was performed. The pressure increased to about 10 kPa (Heparin shown in FIG. 13).
Пример 19Example 19
Взятие образца крови проводили с добавлением средства антикоагуляционной обработки способом, аналогичным примеру 17. Затем, проводили такую же процедуру, как процедура примера 17, за исключением того, что добавляли ReoPro (LILLY Co., Ltd.) в концентрации 50 мкг/мл. Затем проводили измерение давления. При измерении в течение 18 мин невозможно было подтвердить увеличение давления («ReoPro», показанный на фиг.13).A blood sample was taken with the addition of an anticoagulation agent in a manner analogous to Example 17. Then, the same procedure as the procedure of Example 17 was carried out, except that ReoPro (LILLY Co., Ltd.) was added at a concentration of 50 μg / ml. Then a pressure measurement was performed. When measured for 18 minutes, it was not possible to confirm the increase in pressure (“ReoPro” shown in FIG. 13).
Пример 20Example 20
Взятие образца крови проводили с добавлением 3,2% лимонной кислоты, так что соотношение между лимонной кислотой и кровью составляло 1:9. Затем добавляли кровь с полученным из маиса ингибитором трипсина в концентрации 25 мкг/мл для проведения антикоагуляционной обработки. Сразу после добавления хлорида кальция в кровь, подвергнутую антикоагуляционнной обработке, так, чтобы его концентрация достигла 15 мМ относительно крови, подвергнутой антикоагуляционнной обработке во время мониторинга образования тромба, кровь добавляли в шприц (шприц емкостью 1 мл, изготовленный Terumo Corporation) с последующим втеканием крови в такой же микрочип, как микрочип в примере 17, при скорости потока 40 мкл/мин. Затем изменение давления измеряли, используя то же устройство, что в примере 17. Давление начинало возрастать через 15 мин после начала измерения давления, и оно возрастало примерно до 60 кПа.A blood sample was taken with the addition of 3.2% citric acid, so that the ratio between citric acid and blood was 1: 9. Then, blood was added with a maize-derived trypsin inhibitor at a concentration of 25 μg / ml for anticoagulation treatment. Immediately after adding calcium chloride to the anticoagulant treated blood, so that its concentration reaches 15 mM relative to the anticoagulant treated blood during monitoring of blood clot formation, blood is added to the syringe (1 ml syringe manufactured by Terumo Corporation) followed by blood flowing in the same microchip as the microchip in example 17, at a flow rate of 40 μl / min. Then, the pressure change was measured using the same device as in Example 17. The pressure began to increase 15 minutes after the start of the pressure measurement, and it increased to about 60 kPa.
Пример 21Example 21
Взятие образца крови проводили с добавлением средства антикоагуляционной обработки способом, аналогичным примеру 20. Затем, проводили такую же процедуру, как процедура примера 20, за исключением того, что гепарин добавляли соответственно в концентрациях 0,2 ЕД/мл, 0,5 ЕД/мл и 1 ЕД/мл. Затем проводили измерение давления. Результаты показаны на фиг.14.A blood sample was taken with the addition of anticoagulation treatment in a manner analogous to example 20. Then, the same procedure as the procedure of example 20 was carried out, except that heparin was added respectively in concentrations of 0.2 U / ml, 0.5 U / ml and 1 U / ml. Then a pressure measurement was performed. The results are shown in FIG.
Пример 22Example 22
Взятие образца крови проводили с добавлением средства антикоагуляционной обработки способом, аналогичным примеру 20. Затем проводили такую же процедуру, как процедура примера 20, за исключением того, что добавляли ReoPro (LILLY Co., Ltd.) в концентрации 2 мкг/мл. Затем проводили измерение давления. Давление начинало расти через 20 мин после начала измерения давления, и оно росло примерно до 15 кПа через 25 мин (фиг.15).A blood sample was taken with the addition of an anticoagulation agent in a manner analogous to Example 20. Then the procedure was the same as that of Example 20, except that ReoPro (LILLY Co., Ltd.) was added at a concentration of 2 μg / ml. Then a pressure measurement was performed. The pressure began to increase 20 minutes after the start of the pressure measurement, and it grew to about 15 kPa after 25 minutes (Fig. 15).
Пример 23Example 23
Использовали устройство подачи жидкости шприцевого типа, показанное на фиг.12. Кроме того, микрочип 400, где подложка 200 и крышка микрочипа и подложка 100 в виде корпуса микрочипа, показанного на фиг.12(В) и фиг.12(С), были соединены сдавливанием. Выпускную трубку 413, изготовленную из тефлона (зарегистрированной торговой марки), заполняли минеральным маслом и один ее конец соединяли с микрочипом 400 через соединительную трубку 412, изготовленную из силиконовой резины, а другой ее конец соединяли с засасывающим насосом 414, в который был вставлен датчик давления. Впускную трубку, образующую канал микрочипа 400, соединяли со шприцем 420 через соединительную трубку 412, изготовленную из силиконовой резины. Один конец впускной трубки для ингибитора свертываемости крови 422, изготовленной из тефлона (зарегистрированной торговой марки), соединяли с насосом подачи жидкости 423, другой конец которой соединяли с концом камеры образования тромба через соединительную трубку 412, изготовленную из силиконовой резины. Таким образом, микрочип 400 соединяли с выпускной трубкой 413, шприцем 420 и впускной трубкой для ингибитора свертываемости крови 422, получали устройство В мониторинга образования тромба. Управляемую компьютером камеру 430, снабженную оптическим источником освещения 432 (испускающим свет диодом), которая была установлена и могла перемещаться на направляющей 433, устанавливали под камеру образования тромба.The syringe type fluid supply device shown in FIG. 12 was used. In addition, the microchip 400, where the
Все канавки на микрочипах имели глубину 120 мкм.All grooves on the microchips had a depth of 120 μm.
Канал, в который была введена кровь, имел ширину 800 мкм и длину 7 мм. Суженный канал имел ширину 200 мкм и длину 10 мм.The channel into which the blood was introduced had a width of 800 μm and a length of 7 mm. The narrowed channel had a width of 200 μm and a length of 10 mm.
Раствор получали так, что содержимое 1 флакона реагента РТ (тканевого тромбопластина, Sysmex Corporation) растворяли в 1 мл очищенной воды и затем диализировали в очищенной воде, диализированный продукт в очищенной воде смешивали с коллагеном типа I (изготовленным Nitta Gelatin Inc.) в соотношении 1:1. Затем раствор наносили на область подложки 200 микрочипа, обращенную к каналу суженной части на поверхности, подлежащей соединению сдавливанием с подложкой 100 микрочипа. После этого часть с нанесенной жидкостью подвергали вакуумной сушке при 4°С, и затем подложку 100 и подложку 200 соединяли сдавливанием друг с другом, обеспечивая получение микрочипа 400, имеющего камеру 411 образования тромба.The solution was prepared so that the contents of 1 vial of RT reagent (tissue thromboplastin, Sysmex Corporation) were dissolved in 1 ml of purified water and then dialyzed in purified water, the dialyzed product in purified water was mixed with type I collagen (manufactured by Nitta Gelatin Inc.) in a ratio of 1 :one. Then, the solution was applied to the region of the
Взятие проб крови проводили, используя вакуумный сосуд для сбора крови, в который был заключен цитрат натрия в качестве антикоагуляционного средства. Непосредственно перед введением в шприц 420 в кровь добавляли хлорид кальция в конечной концентрации 12,5 мМ и полученный из маиса ингибитор трипсина в конечной концентрации 25 мкг/мл.Blood sampling was carried out using a vacuum blood collection vessel in which sodium citrate was enclosed as an anticoagulant. Immediately prior to injection into the
Устройство My Flow (изготовленное Arbiotec Co., Ltd.), которое представляет собой насос микроподачи, способный контролировать внутреннее давление подающего жидкость наноса, было соединено с выпускной трубкой 413 в качестве насоса 414. Таким образом, всасывание выполняли со скоростью 15 мкл/мин при одновременном контроле внутреннего давления в канале.A My Flow device (manufactured by Arbiotec Co., Ltd.), which is a micropump pump capable of controlling the internal pressure of a sediment supplying fluid, was connected to the
В качестве ингибитора свертывания 1 М Tris-HCl (рН 10) пропускали из впускной трубки для ингибитора свертывания крови 422 при скорости потока 8 мкл/мин. Образование главным образом белого тромба наблюдали через 4 мин от начала измерения давления, в то время как было подтверждено снижение внутреннего давления. Кроме того, было подтверждено, что внутреннее давление снизилось до 30 кПа через 10 мин от начала.As a coagulation inhibitor, 1 M Tris-HCl (pH 10) was passed from the inlet tube for the
Далее, образование тромба наблюдали получением изображений при движении камеры 430 вокруг области образования тромба в канале. Положение, в котором наблюдалось образование тромба, запоминалось, и камера 430 получала изображения при регулярном перемещении вокруг множества определенных точек. В результате, в динамике во времени регистрировался рост и разрушение множества больших тромбов.Further, thrombus formation was observed by imaging as the
Далее будут описаны выполненные справочные эксперименты для демонстрации эффективности аптамеров тромбина и их антисмысловых ДНК в качестве соответственно средств антикоагуляционной обработки и средств, осуществляющих антикоагуляционное действие.The following reference experiments will be described to demonstrate the effectiveness of thrombin aptamers and their antisense DNAs as anticoagulation agents and anticoagulation agents, respectively.
Контрольный эксперимент 1
Была предоставлена кровь немедленно после ее взятия, а также кровь, полученная добавлением одной десятой объема 300 мкг/мл полученного из маиса ингибитора трипсина в первую порцию крови, и кровь, полученная добавлением аптамера тромбина, который распознает экзоцит I, во вторую порцию крови, чтобы была получена концентрация 5 мкМ. Затем для этих трех видов крови в пробирках Эппендорфа (изготовленных из полипропилена) измеряли время, затрачиваемое на свертывание. Пробирку с образцом переворачивали кверху дном через каждую минуту, и подтверждали его текучесть. Кровь без добавок показала время свертывания 9 мин. Напротив, кровь с добавлением ингибитора трипсина показала время свертывания 22 мин. Далее, кровь после добавления аптамера тромбина, показала время свертывания 62 мин.Blood was provided immediately after it was taken, as well as blood obtained by adding one tenth of a volume of 300 μg / ml of trypsin inhibitor obtained from maize to the first portion of the blood, and blood obtained by adding the thrombin aptamer, which recognizes exocyte I, to the second portion of the blood, so that a concentration of 5 μM was obtained. Then, for these three types of blood, the time required for clotting was measured in Eppendorf tubes (made of polypropylene). The tube with the sample was turned upside down every minute, and its fluidity was confirmed. Blood without additives showed a clotting time of 9 minutes. In contrast, blood supplemented with a trypsin inhibitor showed a clotting time of 22 minutes. Further, the blood after the addition of the thrombin aptamer showed a clotting time of 62 minutes.
Далее, когда 5 мкМ аптамера тромбина, который распознает экзоцит I, и 5 мкМ аптамера тромбина, который распознает экзоцит II, использовали в комбинации, свертывание крови не было подтверждено даже через 3 ч даже в случае отсутствия в крови ингибитора трипсина.Further, when 5 μM thrombin aptamer that recognizes exocyte I and 5 μM thrombin aptamer that recognizes exocyte II were used in combination, blood coagulation was not confirmed even after 3 hours even if there was no trypsin inhibitor in the blood.
Аптамер тромбина, распознающий экзоцит I: 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3' SEQ ID № 1,Thrombin aptamer recognizing exocyte I: 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3 'SEQ ID No. 1,
Аптамер тромбина, распознающий экзоцит II: 5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3' SEQ ID № 3).Thrombin aptamer recognizing exocyte II: 5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3 'SEQ ID No. 3).
Контрольный эксперимент 2
Измерение АРТТ проводили на 200 мкМ плазмы относительно каждого из образца А с добавлением 10 мкМ физиологического солевого раствора, образца В с добавлением 10 мкМ 500 мкМ аптамера тромбина, распознающего экзоцит I, и образца С с добавлением 10 мкл раствора, содержащего 500 мкМ аптамера тромбина, распознающего экзоцит I, и 1500 мкМ антисмысловой ДНК аптамера тромбина, распознающего экзоцит I. АРТТ образца А составило 44 с, образца В 2 мин или более и образца С 45 с.ARTT was measured on 200 μM plasma relative to each of sample A with the addition of 10 μM physiological saline, sample B with the addition of 10 μM 500 μM thrombin aptamer recognizing exocyte I, and sample C with 10 μl of a solution containing 500 μM thrombin aptamer, recognizing exocyte I, and 1500 μM antisense DNA of the thrombin aptamer recognizing exocyte I. The ARTT of sample A was 44 s,
Контрольный эксперимент 3
Фиг.11(А) представляет собой анализ формы волны свертывания по тромбоэластограмме при хранении крови с добавлением 10 мкл аптамеров к экзоциту I и экзоциту II при комнатной температуре в течение 15 мин, и затем добавлении 40 мкМ антисмысловых ДНК обоих аптамеров. Фиг.11(В) представляет форму волны тромбоэластограммы крови сразу после взятия образца крови.11 (A) is a thromboelastogram coagulation waveform analysis during blood storage with the addition of 10 μl aptamers to exocyte I and exocyte II at room temperature for 15 min, and then 40 μM antisense DNA of both aptamers. 11 (B) is a blood thromboelastogram waveform immediately after taking a blood sample.
Как очевидно по результатам, представленным на фиг.11(А) и 11(В), было обнаружено, что добавление двух видов аптамеров тромбина обеспечивает возможность хранения крови, и антисмысловая ДНК может осуществить ее антикоагуляционную обработку.As is evident from the results presented in FIGS. 11 (A) and 11 (B), it was found that the addition of two types of thrombin aptamers provides the ability to store blood, and antisense DNA can carry out its anticoagulation treatment.
По результатам контрольных экспериментов 1-3 очевидно, что комбинация полученного из маиса ингибитора трипсина и аптамера тромбина может эффективно ингибировать свертывание цельной крови, и что антикоагуляционный эффект аптамера тромбина можно инактивировать антисмысловой ДНК к аптамеру тромбина.According to the results of
Контрольный эксперимент 4Control experiment 4
Далее будет описана эффективность воздействий покрытия РМЕА при хранении крови и сцепление тромбоцитов с подложкой.Next, the effectiveness of the effects of the PMEA coating during blood storage and platelet adhesion to the substrate will be described.
(1) Раствор метанола, содержащий 1% РМЕА, полученный в соответствии с JP 04-152952 A, наносили на 2,5-мл контейнер из акриловой смолы (внутренние размеры: 1 см × 1 см × 4,5 см) и затем сушили при 90°С в течение 10 мин. В последующем, 760 мкл крови, подвергнутой антикоагуляционной обработке 2% лимонной кислотой, добавляли в каждый не покрытый контейнер и контейнер, покрытый РМЕА, с последующей аспирацией пипеткой через каждые 5 мин для подтверждения свертывания крови.(1) A methanol solution containing 1% PMEA obtained in accordance with JP 04-152952 A was applied to a 2.5 ml acrylic resin container (internal dimensions: 1 cm × 1 cm × 4.5 cm) and then dried at 90 ° C for 10 minutes Subsequently, 760 μl of blood subjected to anticoagulation treatment with 2% citric acid was added to each uncoated container and a container coated with PMEA, followed by pipetting every 5 minutes to confirm blood coagulation.
Следовательно, непокрытый контейнер проявил очевидное увеличение вязкости через 30 мин и свертывание через 60 мин. В отличие от этого контейнер, покрытый РМЕА, проявил очевидное увеличение вязкости через 35 мин, но время наступления свертывания удлинилось до 90 мин.Consequently, the uncoated container showed an obvious increase in viscosity after 30 minutes and coagulation after 60 minutes. In contrast, the PMAA coated container showed an obvious increase in viscosity after 35 minutes, but the coagulation onset time lengthened to 90 minutes.
(2) Указанный РМЕА плоским слоем наносили на прозрачную акриловую пластину. Ее использовали вместо покрытой коллагеном пластины примера 9 (фиг.8), и эксперимент по адгезии меченных хинакрином тромбоцитов и лейкоцитов в крови проводили способом, аналогичным примеру 9.(2) The indicated PMEA was applied flat on a transparent acrylic plate. It was used instead of the collagen-coated plate of Example 9 (Fig. 8), and an experiment on the adhesion of quinacrine-labeled platelets and leukocytes in the blood was carried out in a manner analogous to Example 9.
В результате, очевидная адгезия или агглютинация тромбоцитов и лейкоцитов наблюдалась через 10 мин от начала течения крови. Напротив, адгезия или агглютинация тромбоцитов и лейкоцитов на акриловой пластине, покрытой РМЕА, не наблюдалась даже через 30 мин.As a result, obvious adhesion or agglutination of platelets and leukocytes was observed 10 minutes after the onset of blood flow. In contrast, platelet and white blood cell adhesion or agglutination on an acrylic plate coated with PMAA was not observed even after 30 minutes.
По приведенным выше результатам в устройстве мониторинга образования тромба по настоящему изобретению путем покрытия РМЕА шприцев для хранения крови, трубки, подложки и подобных поверхностей можно подавить образование тромба на месте, отличном от камеры образования тромба. Поэтому предполагается, что может быть достигнут мониторинг образования тромба, специфичный для камеры мониторинга образования тромба.According to the above results, in the thrombus formation monitoring device of the present invention by coating the PMEA syringes for storing blood, a tube, a substrate, and similar surfaces, thrombus formation can be suppressed at a place other than the thrombus formation chamber. Therefore, it is contemplated that thrombus formation monitoring specific to the thrombus formation monitoring chamber can be achieved.
В представленном выше описании настоящее изобретение было описано со ссылкой на предпочтительные варианты осуществления. Однако настоящее изобретение не ограничивается примерами и вариантами осуществления, описанными выше, и можно применять различные модификации, не отходя от сущности настоящего изобретения. Например, можно устанавливать высокое давление, создаваемое насосом, и устанавливать небольшой диаметр выпускной трубки. В этом случае во впускной трубке и в выпускной трубке может создаваться противодавление, так что можно осуществлять мониторинг образования тромба, в то же время контролируя объемный кровоток в условиях нагрузки внутренним давлением, соответствующим давлению крови. Далее, скорость потока крови в это время можно свободно контролировать посредством давления, создаваемого насосом, и степенью дросселирования выпускной трубки.In the above description, the present invention has been described with reference to preferred embodiments. However, the present invention is not limited to the examples and embodiments described above, and various modifications can be applied without departing from the spirit of the present invention. For example, you can set the high pressure generated by the pump and set the small diameter of the exhaust pipe. In this case, backpressure can be created in the inlet tube and in the outlet tube, so that the formation of a blood clot can be monitored while at the same time controlling the volumetric blood flow under load conditions with internal pressure corresponding to the blood pressure. Further, the blood flow rate at this time can be freely controlled by the pressure generated by the pump and the degree of throttling of the discharge tube.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Устройство мониторинга образования тромба и способ мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению можно с успехом использовать при всесторонней оценке свертывания крови и образования тромбоцитарного тромба в среде, эквивалентной кровотоку, с использованием цельной крови или плазмы, содержащей тромбоциты, для оценки эффективности антитромботического лекарственного средства, вводимого пациенту, или тому подобного.The thrombus formation monitoring device and the thrombus formation monitoring method according to the present invention can be successfully used in a comprehensive assessment of blood coagulation and platelet formation in an environment equivalent to blood flow, using whole blood or plasma containing platelets to evaluate the effectiveness of an antithrombotic drug administered to a patient , or the like.
Claims (11)
камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен материал, вызывающий образование тромба,
впускную трубку, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба,
контейнер для подачи крови, соединенный с впускной трубкой,
питающий насос для контейнера,
датчик давления, предназначенный для измерения давления, приложенного к контейнеру.1. A device for monitoring the formation of a blood clot by passing subjected to anticoagulation treatment of blood through a channel simulating a blood vessel, and while performing anticoagulation treatment or stimulation of blood coagulation, containing:
a thrombus formation chamber, at least in a part of which a material causing thrombus formation is placed,
an inlet tube that is connected to the thrombus formation chamber and through which blood flows into the thrombus formation chamber,
a blood supply container connected to the inlet tube,
container feed pump
pressure sensor for measuring the pressure applied to the container.
определяют давление, приложенное к контейнеру, при этом материал, вызывающий образование тромба, размещен по меньшей мере в части камеры образования тромба.8. A method for monitoring the formation of a blood clot, which consists in directing blood after administration of an anticoagulant from the container into the blood clot chamber by pressing on a fluid having a density lower than the blood layer placed on the blood layer, while performing anticoagulation treatment of blood or stimulating coagulation blood
determine the pressure applied to the container, while the material causing the formation of a thrombus, is placed at least in part of the thrombus formation chamber.
Applications Claiming Priority (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005-302557 | 2005-10-18 | ||
JP2005302557 | 2005-10-18 | ||
JP2005308065 | 2005-10-24 | ||
JP2005-308065 | 2005-10-24 | ||
JP2005-334594 | 2005-11-18 | ||
JP2005-358448 | 2005-12-13 | ||
JP2005358448 | 2005-12-13 | ||
JP2006-036148 | 2006-02-14 | ||
JP2006234270 | 2006-08-30 | ||
JP2006-234270 | 2006-08-30 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008119500A RU2008119500A (en) | 2009-11-27 |
RU2432577C2 true RU2432577C2 (en) | 2011-10-27 |
Family
ID=41476166
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008119500/15A RU2432577C2 (en) | 2005-10-18 | 2006-10-18 | Thrombosis monitor and method of thrombosis monitoring |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2432577C2 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014046943A1 (en) * | 2012-09-18 | 2014-03-27 | Cynvenio Biosystems, Inc. | Fluid reservoir |
RU2732969C2 (en) * | 2015-10-21 | 2020-09-25 | Фрезениус Медикал Кэа Дойчланд Гмбх | Device, system and method for pressure-based detection of blood clot |
-
2006
- 2006-10-18 RU RU2008119500/15A patent/RU2432577C2/en active
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014046943A1 (en) * | 2012-09-18 | 2014-03-27 | Cynvenio Biosystems, Inc. | Fluid reservoir |
CN105163857A (en) * | 2012-09-18 | 2015-12-16 | 辛温尼奥生物系统公司 | Fluid reservoir |
US9802197B2 (en) | 2012-09-18 | 2017-10-31 | Cynvenio Biosystems, Inc. | Fluid reservoir |
CN105163857B (en) * | 2012-09-18 | 2017-11-07 | 珠海丽珠圣美医疗诊断技术有限公司 | fluid reservoir |
RU2732969C2 (en) * | 2015-10-21 | 2020-09-25 | Фрезениус Медикал Кэа Дойчланд Гмбх | Device, system and method for pressure-based detection of blood clot |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2008119500A (en) | 2009-11-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9039972B2 (en) | Apparatus for monitoring thrombus formation | |
RU2543652C2 (en) | Method for platelet function testing and platelet function testing device | |
EP2228657B1 (en) | Microchip and blood monitoring device | |
Picker | In-vitro assessment of platelet function | |
JP5752055B2 (en) | Platelet testing microchip and platelet testing apparatus using the same | |
JP2014506319A (en) | Blood collection device containing blood stabilizer | |
WO2017177104A1 (en) | Reconstitution solution for spray-dried plasma | |
JP2008539438A (en) | Method and device for monitoring platelet function | |
RU2432577C2 (en) | Thrombosis monitor and method of thrombosis monitoring | |
JP4833727B2 (en) | Thrombus monitoring method and thrombus monitoring apparatus using vascular endothelial cells | |
RU2727753C1 (en) | Method of determining degree of hydrodynamic activation of von willebrand factor and device for its implementation |