RU2397251C1 - Set for detecting legionellosis agent in biological material and environmental medium - Google Patents
Set for detecting legionellosis agent in biological material and environmental medium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2397251C1 RU2397251C1 RU2009117048/13A RU2009117048A RU2397251C1 RU 2397251 C1 RU2397251 C1 RU 2397251C1 RU 2009117048/13 A RU2009117048/13 A RU 2009117048/13A RU 2009117048 A RU2009117048 A RU 2009117048A RU 2397251 C1 RU2397251 C1 RU 2397251C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pneumophila
- legionellosis
- pcr
- samples
- biological material
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выявления возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора.The invention relates to the field of biotechnology and can be used to identify the causative agent of legionellosis in biological material and environmental objects in practical health care and the Rospotrebnadzor service.
Легионеллез - одно из опасных инфекционных заболеваний, протекающих в форме тяжелых пневмоний, при которой до 15% случаев заканчиваются летальным исходом, или в форме респираторных заболеваний.Legionellosis is one of the dangerous infectious diseases occurring in the form of severe pneumonia, in which up to 15% of cases are fatal, or in the form of respiratory diseases.
Большинство случаев легионеллеза связано с видом Legionella pneumophila, однако наибольшую опасность представляют Legionella pneumophila I серогруппы (1). Другие виды легионелл, такие как L. bozemanii, L. longbeachae, L. micdadei и др., вызывают заболевания преимущественно у лиц со сниженным иммунным статусом (2).Most cases of legionellosis are associated with the species Legionella pneumophila, however, the most dangerous are Legionella pneumophila I serogroups (1). Other legionella species, such as L. bozemanii, L. longbeachae, L. micdadei, etc., cause diseases mainly in individuals with reduced immune status (2).
Легионеллы размножаются внутри макрофагов и локализуются в «неперевариваемой» фаголизосоме, поэтому для лечения используют антибактериальные препараты, способные проникать через мембраны клеток и накапливаться внутри вакуолей, что отличает лечение при пневмонии, вызванной другими возбудителями (3).Legionella multiply inside macrophages and are localized in the “indigestible” phagolysosome, therefore antibacterial drugs are used for treatment that can penetrate cell membranes and accumulate inside vacuoles, which distinguishes treatment for pneumonia caused by other pathogens (3).
В связи с этим ранняя диагностика в клинических образцах возбудителя легионеллеза позволяет корректировать лечение больного и избежать тяжелых последствий, а своевременное и быстрое выявление его в объектах окружающей среды способствует предотвращению эпидемических вспышек.In this regard, early diagnosis in clinical samples of the causative agent of legionellosis allows you to adjust the patient’s treatment and avoid serious consequences, and timely and quick detection of it in environmental objects helps to prevent epidemic outbreaks.
Эффективность лечения больных и эпидемиологического надзора за Legionella spp. во многом определяется качеством лабораторной диагностики. Для диагностики легионеллеза применяют бактериологические, иммунологические, молекулярно-генетические методы исследования.The efficacy of patient management and epidemiological surveillance of Legionella spp. is largely determined by the quality of laboratory diagnostics. For the diagnosis of legionellosis, bacteriological, immunological, molecular genetic research methods are used.
Бактериологический метод диагностики легионеллеза является «золотым стандартом», однако чувствительность его составляет в среднем не более 60%, несмотря на применение высококачественных питательных сред (4). Кроме невысокой чувствительности, недостатком культурального метода является его продолжительность. Максимальное количество видимых колоний вырастает на 5-8 сутки.The bacteriological method for diagnosing legionellosis is the “gold standard”, but its sensitivity is on average no more than 60%, despite the use of high-quality nutrient media (4). In addition to low sensitivity, the disadvantage of the cultural method is its duration. The maximum number of visible colonies grows by 5-8 days.
Иммунологические методы исследования обладают достаточно высокой чувствительностью, например, с помощью коммерческих ИФА тест-систем возможно обнаружение антигена Legionella pneumophila I серогруппы, чувствительность метода до 97%.Immunological research methods have a fairly high sensitivity, for example, using commercial ELISA test systems, it is possible to detect the antigen Legionella pneumophila I of the serogroup, the sensitivity of the method is up to 97%.
Иммунохроматографический анализ (ИХА) позволяет выявлять растворимый легионеллезный антиген в моче, и чувствительность достигает 95% (5, 6, 7). Недостатком данного метода является то, что он не может быть применен для другого клинического материала (мокрота, кровь, лаваж и др.) и проб из объектов окружающей среды.Immunochromatographic analysis (IHA) allows the detection of soluble legionella antigen in the urine, and the sensitivity reaches 95% (5, 6, 7). The disadvantage of this method is that it cannot be applied to other clinical material (sputum, blood, lavage, etc.) and samples from environmental objects.
Основной недостаток коммерческих ИФА и ИХА тест-систем состоит в том, что они не рассчитаны на диагностику инфекций, вызванных Legionella pneumophila 2-16 серогрупп и Legionella spp. (8).The main disadvantage of commercial ELISA and IHA test systems is that they are not designed to diagnose infections caused by Legionella pneumophila 2-16 serogroups and Legionella spp. (8).
В настоящее время наиболее перспективным считают молекулярно-генетические методы исследования, основанные на детекции ДНК возбудителя в исследуемом материале. Методом ПЦР возможно исследовать биологический материал - мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, плевральную жидкость, мазки из ротоглотки, кровь, микро- и макроаутоптаты, а также пробы из объектов окружающей среды - воду, смывы, образцы биопленки, а также чистые культуры возбудителя.At present, molecular genetic research methods based on the detection of the pathogen DNA in the test material are considered the most promising. Using PCR, it is possible to study biological material - sputum, bronchoalveolar lavage, pleural fluid, oropharyngeal swabs, blood, micro and macroautopaths, as well as samples from environmental objects - water, washes, biofilm samples, as well as pure cultures of the pathogen.
Важным этапом при разработке ПЦР тест-систем является подбор мишеней для детекции возбудителя.An important step in the development of PCR test systems is the selection of targets for the detection of the pathogen.
Известно использование в качестве мишеней для детекции Legionella spp. и L. pneumophila фрагментов генов mip, 16S рДНК, 5S рДНК, 23S-5S, dotA для ПЦР с учетом результатов методом электрофореза (ПЦР-ЭФ) (9, 10). Описанные мишени не обеспечивают достаточного уровня надежности для клинической диагностики легионеллеза при выполнении ПЦР-ЭФ (11).Known for use as targets for the detection of Legionella spp. and L. pneumophila fragments of the mip, 16S rDNA, 5S rDNA, 23S-5S, dotA genes for PCR, taking into account the results by electrophoresis (PCR-EF) (9, 10). The described targets do not provide a sufficient level of reliability for the clinical diagnosis of legionellosis during PCR-EF (11).
При тщательном изучении нуклеотидных последовательностей генома Legionella pneumophila установлено, что вариабельность фрагмента гена 16S рДНК размером 1434 п.н. у штаммов Legionella pneumophila составила 2,0-6,0% (в среднем 31 полиморфный нуклеотид) между L. pneumophila и другими видами легионелл. При исследовании генов 23S-5S вариабельность среди штаммов L. pneumophila составила 7,4%, а между L. pneumophila и другими видами - 14,0-20,0%. Гены 23S (143 п.н.) и 5S (91 п.н.) обладали высокой гомологией, тогда как межгенный участок 23S-5S (102 п.н.) характеризовался высоким содержанием полиморфных нуклеотидов. Исходя из полученных данных, видно, что применение этих мишеней в ПЦР целесообразно только при использовании системы праймеров и зондов с учетом результатов в режиме «реального» времени (ПЦР-РВ).A careful study of the nucleotide sequences of the Legionella pneumophila genome revealed that the variability of the 16S rDNA gene fragment of 1434 bp in strains of Legionella pneumophila was 2.0-6.0% (an average of 31 polymorphic nucleotide) between L. pneumophila and other legionella species. In the study of 23S-5S genes, the variability among L. pneumophila strains was 7.4%, and between L. pneumophila and other species - 14.0-20.0%. The 23S (143 bp) and 5S (91 bp) genes were highly homologous, while the 23S-5S intergenic region (102 bp) was characterized by a high content of polymorphic nucleotides. Based on the data obtained, it is clear that the use of these targets in PCR is advisable only when using a system of primers and probes, taking into account the results in the "real" time (PCR-RV).
Известен набор для детекции Legionella spp., содержащий праймеры для амплификации, для внутреннего контроля и зонд, позволяющий выявлять возбудителя с помощью ПЦР-РВ (12).Known kit for the detection of Legionella spp., Containing primers for amplification, for internal control and a probe that allows the identification of the pathogen using PCR-RV (12).
Известен коммерческий набор IQ-Check (BioRad) для скрининга легионелл в окружающей среде, сконструированный американскими исследователями (13). Однако описанный набор не предназначен для выявления возбудителя легионеллеза в биологическом материале (мокроте, бронхоальвеолярном лаваже, плевральной жидкости, мазках из ротоглотки, крови, микро- и макро-аутоптатов). Кроме того, высокая стоимость набора и невозможность выполнения с его помощью ПЦР с электрофоретическим учетом результатов ограничивают его применение в практических лабораториях, так как ПЦР с учетом результатов в режиме «реального времени» предусматривает использование дорогостоящего оборудования.The well-known commercial IQ-Check kit (BioRad) for screening legionella in the environment, designed by American researchers (13). However, the described kit is not intended to identify the causative agent of legionellosis in biological material (sputum, bronchoalveolar lavage, pleural fluid, oropharyngeal swabs, blood, micro and macro autopsies). In addition, the high cost of recruitment and the inability to perform PCR with electrophoretic consideration of the results limit its use in practical laboratories, since PCR, taking into account the results in “real time” mode, involves the use of expensive equipment.
Проведенный поиск по патентам и научно-техническим источникам информации показал отсутствие сведений о наборах, предназначенных для выявления L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флюоресцентным учетом результатов, обеспечивающих детекцию возбудителя в биологическом материале и объектах окружающей среды, а также доступных для работы в лабораториях России. Таким образом, существует потребность в создании недорогого, чувствительного и специфичного набора, который нашел бы широкое применение в практическом здравоохранении.A search by patents and scientific and technical sources of information showed a lack of information on kits designed to detect L. pneumophila by PCR with electrophoretic and hybridization-fluorescence results, which ensure the detection of the pathogen in biological material and environmental objects, as well as available for work in laboratories of Russia. Thus, there is a need to create an inexpensive, sensitive and specific kit that would be widely used in practical health care.
Задачей изобретения является создание набора для детекции возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды с возможностью использования его в ПЦР с электорофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.The objective of the invention is to provide a kit for the detection of the causative agent of legionellosis in biological material and environmental objects with the possibility of using it in PCR with electrophoretic and hybridization-fluorescence-based results.
Техническим результатом заявляемого изобретения является высокоспецифичное и быстрое выявление L. pneumophila 1-14 серогрупп в биологическом материале и объектах окружающей среды.The technical result of the claimed invention is a highly specific and rapid detection of L. pneumophila 1-14 serogroups in biological material and environmental objects.
Технический результат достигается набором для детекции возбудителя легионеллеза. Заявляемый набор содержит видоспецифичные праймеры Lp1 - 5'-GCTTGGTGCTGTGAAAGGTА-3', Lp2 - 5'-ССТССААТAAAGGAGATGCАА-3' и зонд Lp-з - 5'-ROX-TCACCGTACGCACATCCGCA-BHQ2-3', используемые при амплификации фрагмента гена ftsZ L. pneumophila в пределах с 397 по 758 нуклеотид полной последовательности локуса, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 1.The technical result is achieved by a kit for the detection of the causative agent of legionellosis. The inventive kit contains species-specific primers Lp1 - 5'-GCTTGGTGCTGTGAAAGGTA-3 ', Lp2 - 5'-ССТССААТAAAGGAGATGCAА-3' and a probe Lp-5'-ROX-TCXCACCgts of f 'L. B-amplification of f' L. Bac pneumophila ranging from 397 to 758 nucleotides of the complete sequence of a locus having the nucleotide sequence of
При конструировании набора для детекции возбудителя легионеллеза особое значение придавали выбору новых ДНК - мишеней.When designing a kit for the detection of the causative agent of legionellosis, particular importance was attached to the selection of new DNA targets.
На основании анализа нуклеотидной последовательности генома возбудителя L. pneumophila проверены 10 генов, участвующих в жизнедеятельности клетки (house keeping), и отобран фрагмент гена ftsZ. Сравнительные данные нуклеотидных последовательностей 10 генов (жизнеобеспечения) L. pneumophila и других видов легионелл представлены в табл.1 и 2. Анализ нуклеотидных последовательностей указанных генов L. pneumophila и других видов легионелл представлен по генетической базе данных GenBank NCBI. Секвенирование фрагмента гена ftsZ у штаммов L. pneumophila, выделенных на территории Российской Федерации, и их сравнение с нуклеотидной последовательностью аналогичных участков у референс-штаммов L. pneumophila Philadelphia 1, Corby, Paris, Lens (GenBank NCBI: NC- 002942, CP 00675, NC- 006368, NC- 006369) показало, что наиболее перспективным для подбора праймеров при разработке ПЦР является фрагмент гена ftsZ, кодирующего синтез тубулиноподобного белка (с 397 по 758 нуклеотид). В результате тщательной проверки качества определения нуклеотидной последовательности была выведена консенсусная последовательность фрагмента гена ftsZ SEQ ID NO 1:Based on the analysis of the nucleotide sequence of the genome of the causative agent of L. pneumophila, 10 genes involved in the activity of the cell (house keeping) were tested, and a fragment of the ftsZ gene was selected. Comparative data of the nucleotide sequences of 10 genes (life support) of L. pneumophila and other legionella species are presented in Tables 1 and 2. Analysis of the nucleotide sequences of these genes of L. pneumophila and other legionella species is presented on the GenBank NCBI genetic database. Sequencing of a fragment of the ftsZ gene in L. pneumophila strains isolated in the Russian Federation and their comparison with the nucleotide sequence of similar sites in reference strains of L. pneumophila Philadelphia 1, Corby, Paris, Lens (GenBank NCBI: NC - 002942, CP 00675, NC - 006368, NC - 006369) showed that the most promising for the selection of primers in the development of PCR is a fragment of the ftsZ gene encoding the synthesis of tubulin-like protein (from 397 to 758 nucleotides). As a result of a thorough quality control of the determination of the nucleotide sequence, the consensus sequence of the ftsZ gene fragment
Обоснование выбора праймеров и зонда.Justification for the selection of primers and probe.
На следующей стадии конструировали набор олигонуклеотидных праймеров, специфических для детекции L. pneumophila. На основании консенсусной последовательности выбранного фрагмента гена ftsZ с помощью программы Primer Premier-V5 (Premier Bio Soft International) и алгоритма BLAST подобранны олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающему амплификацию фрагмента данного локуса размером 185 п.н. Выбор праймеров осуществляли с учетом возможности регистрации результатов как в режиме «реального времени», так и с помощью электрофореза. Для использования праймеров в ПЦР-РВ подбирали зонд формата TaqMan (Lp-з) в онлайн-режиме на интернет-сайте www.genscript.com. Подобранные зонд Lp-з - 5'-ROX-TCACCGTACGCACATCCGCA-BHQ2-3' к участку гена fisZ и праймеры: Lpl - 5'-GCTTGGTGCTGTGAAAGGTA-3', Lp2 - 5'-CCTCCAATAAAGGAGATGCAA-3' обеспечивают высокую специфичность реакции и позволяют выявлять возбудителя легионеллеза в образцах из объектов окружающей среды и биологического материала.In the next step, a set of oligonucleotide primers specific for the detection of L. pneumophila was constructed. Based on the consensus sequence of the selected fragment of the ftsZ gene using the Primer Premier-V5 program (Premier Bio Soft International) and the BLAST algorithm, oligonucleotide primers were selected to amplify a 185 bp fragment of this locus. The choice of primers was carried out taking into account the possibility of recording the results both in the "real time" mode and using electrophoresis. To use the primers in PCR-RV, a TaqMan (Lp-3) format probe was selected in online mode at www.genscript.com. Selected probe Lp-z - 5'-ROX-TCACCGTACGCACATCCGCA-BHQ2-3 'to the fisZ gene region and primers: Lpl - 5'-GCTTGGTGCTGTGAAAGGTA-3', Lp2 - 5'-CCTCCAATAAAGGAGATGCAA high specificity and high specificity 3 ' causative agent of legionellosis in samples from environmental objects and biological material.
Специфичность праймеров оценивали методом множественного сравнения последовательностей, используя программное обеспечение, например BLAST (Lastaew для оценки полиморфизмов в сравниваемых последовательностях).The specificity of the primers was evaluated by multiple sequence comparison using software such as BLAST (Lastaew to evaluate polymorphisms in the compared sequences).
Данные праймеры не образуют вторичных структур (шпилек) и димеров, что способствует эффективному связыванию их с матричной ДНК.These primers do not form secondary structures (hairpins) and dimers, which contributes to their effective binding to matrix DNA.
Для определения аналитической чувствительности ПЦР использовали количественно охарактеризованные разведения рекомбинантных плазмид с клонированным фрагментом гена ftsZ, а также препаратов ДНК, выделенных из проб, содержащих L. pneumophila различных серогрупп в концентрации 1×103-1×105 м.к./мл. Результаты представлены на фиг.1 и 2.To determine the analytical sensitivity of PCR, quantitatively characterized dilutions of recombinant plasmids with a cloned fragment of the ftsZ gene were used, as well as DNA preparations isolated from samples containing L. pneumophila of various serogroups at a concentration of 1 × 10 3 -1 × 10 5 MK / ml. The results are presented in figures 1 and 2.
Для характеристики специфичности ПЦР применяли выборку штаммов из целевой коллекции различных микроорганизмов. Специфичность ПЦР с праймерами на основе нуклеотидной последовательности ftsZ гена представлена в табл.3.To characterize the specificity of PCR, a selection of strains from the target collection of various microorganisms was used. The specificity of PCR with primers based on the nucleotide sequence of the ftsZ gene is presented in table 3.
В результате проведенной оценки установлено, что выбранные праймеры и зонд для детекции L. pneumophila обладают высокой чувствительностью - 1·103 м.к./мл и специфичностью 100%.As a result of the assessment, it was found that the selected primers and probe for the detection of L. pneumophila have high sensitivity - 1 · 10 3 MK./ml and a specificity of 100%.
Подобраны оптимальные параметры реакции амплификации с олигонуклеотидными праймерами и системой « праймер - зонд»:The optimal parameters of the amplification reaction with oligonucleotide primers and the primer-probe system were selected:
- концентрация праймеров - от 5 до 16 пМ;- concentration of primers - from 5 to 16 pM;
- концентрация зонда - от 1 до 5 пМ;- probe concentration - from 1 to 5 pM;
- концентрация MgCl - от 2 до 3 пМ;- concentration of MgCl - from 2 to 3 pM;
- концентрация Tag-полимеразы - от 1 до 1,5 ед.;- concentration of Tag polymerase - from 1 to 1.5 units;
- температура, при которой определяется уровень флуоресценции в пробах, - от 54 до 60°С;- the temperature at which the level of fluorescence in the samples is determined is from 54 to 60 ° C;
- количество циклов, во время которых считывается флуоресценция, - от 30 до 40;- the number of cycles during which fluorescence is read, from 30 to 40;
- температура отжига праймеров - от 50-64°С;- temperature annealing of primers - from 50-64 ° C;
- время каждого шага цикла - 30-60 с;- the time of each step of the cycle is 30-60 s;
- количество циклов: 35-40;- number of cycles: 35-40;
- время предварительной денатурации 1-5 мин;- pre-denaturation time 1-5 minutes;
- время завершающей элонгации 1-7 мин.- time of the final elongation of 1-7 minutes
Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для выполнения ПЦР-ЭФ. Подобранная концентрация праймеров Lp1 и Lp2, фермента Tag-полимеразы в концентрации 1,0 ед. и зонда Lp-з необходима и достаточна для обеспечения высокой специфичности и эффективности проведения реакции и позволяют получить легко детектируемые количества ампликонов. Сущность изобретения подтверждена примерами.The optimal composition of the reaction mixture for PCR-EF was experimentally established. The selected concentration of primers Lp1 and Lp2, the enzyme Tag polymerase at a concentration of 1.0 units and the Lp-z probe is necessary and sufficient to ensure high specificity and efficiency of the reaction and allow to obtain easily detectable amounts of amplicons. The invention is confirmed by examples.
Пример 1. Выявление ДНК возбудителя L. pneumophila в биологическом материале (мокроте, бронхоальвеолярном лаваже, плевральной жидкости, мазках из ротоглотки, крови, микро- и макро-аутоптатов) с помощью ПЦР с электрофоретическим учетом результатов.Example 1. Detection of the DNA of the pathogen L. pneumophila in biological material (sputum, bronchoalveolar lavage, pleural fluid, smears from the oropharynx, blood, micro and macro autopsy samples) using PCR with electrophoretic results.
Для выявления возбудителя легионеллеза биологический материал обеззараживают путем добавления в подготовленные пробы 300 мкл раствора, содержащего 6 М гуанидинтиоцианата, и прогревают в течение 15 мин при температуре 64°С.To identify the causative agent of legionellosis, the biological material is decontaminated by adding 300 μl of a solution containing 6 M guanidine thiocyanate to the prepared samples and heated for 15 minutes at a temperature of 64 ° C.
Выделение ДНК. В обеззараженные пробы добавляют 30 мкл сорбента, затем инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая на вортексе 10 с, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 с. Отбирают супернатант и к осадку добавляют 300 мкл раствора для отмывки сорбента от клеточного дебриса и других веществ, которые могут ингибировать реакцию амплификацию; перемешивают и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 с. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют 1 мл второго отмывочного раствора (10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 50% этанол), перемешивают и инкубируют при температуре 64°С. Надосадочную жидкость удаляют, проводят отмывку осадка 400 мкл ацетона, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 с. Осадок высушивают в течение 10 мин при температуре 64°С, добавляют 50 мкл ТЕ-буфера и инкубируют при температуре 64°С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе, центрифугируют 12000 об/мин в течение 2 мин; супернатант используют в ПЦР.DNA isolation. 30 μl of the sorbent is added to the disinfected samples, then they are incubated for 10 min at room temperature, periodically shaking on a vortex for 10 s, centrifuged at 12000 rpm for 20 s. The supernatant is taken and 300 μl of the solution is added to the precipitate to wash the sorbent from cell debris and other substances that can inhibit the amplification reaction; mix and centrifuge at 12,000 rpm for 20 s. The supernatant is removed, and 1 ml of the second washing solution (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 50% ethanol) is added to the precipitate, stirred and incubated at 64 ° C. The supernatant is removed, the precipitate is washed with 400 μl of acetone, centrifuged at 12000 rpm for 20 s. The precipitate is dried for 10 min at a temperature of 64 ° C, add 50 μl of TE buffer and incubated at a temperature of 64 ° C for 10 min, periodically shaking on a vortex, centrifuged at 12,000 rpm for 2 min; supernatant is used in PCR.
Для проведения ПЦР в микропробирках объемом 0,5 мл готовят общую ПЦР-смесь исходя из того, что на одну пробу необходимо 10 мкл реакционной смеси и 0,2 мкл фермента Tag-полимеразы. Полученную смесь тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и добавляют по 10 мкл в микропробирки, содержащие смесь праймеров и дНТФ под слоем парафина. Затем в пробирки вносят по 10 мкл ДНК, выделенных из исследуемых проб. Пробирка с отрицательным контрольным образцом содержит 10 мкл ТЕ-буфера, а пробирка с положительным контрольным образцом содержит 10 мкл ПКО ДНК L. pneumophila. Микропробирки, содержащие контрольные и опытные образцы, переносят в термоциклер, предварительно нагретый до 95°С, и проводят амплификацию по подобранной программе.For PCR in 0.5 ml microtubes, a general PCR mixture is prepared on the basis that 10 μl of the reaction mixture and 0.2 μl of the Tag polymerase enzyme are needed per sample. The resulting mixture was thoroughly mixed in a microcentrifuge / shaker and 10 μl was added to microtubes containing a mixture of primers and dNTP under a layer of paraffin. Then, 10 μl of DNA isolated from the studied samples is introduced into the tubes. A negative control tube contains 10 μl of TE buffer, and a positive control tube contains 10 μl of L. pneumophila DNA PCO. Microtubes containing control and experimental samples are transferred to a thermal cycler preheated to 95 ° C and amplification is carried out according to the selected program.
Детекцию продуктов амплификации проводят с помощью электрофореза в 1,5-2,5% агарозном геле по методике, приведенной в руководствах Л.А.Остермана и Т.Маниатиса (14,15). Результаты представлены в табл.3.Amplification products are detected by electrophoresis in a 1.5-2.5% agarose gel according to the method described in the manuals of L.A. Osterman and T. Maniatis (14.15). The results are presented in table.3.
Пример 2. Выявление возбудителя L. pneumophila в объектах окружающей среды (вода, смывы, образцы биопленки).Example 2. Detection of the pathogen L. pneumophila in environmental objects (water, swabs, biofilm samples).
Выявление возбудителя легионеллеза из объектов окружающей среды осуществляют аналогично примеру 1. Результаты детекции возбудителя легионеллеза в биологическом материале представлены в табл.4, а в пробах из объектов окружающей среды - в табл.5.Identification of the causative agent of legionellosis from environmental objects is carried out analogously to example 1. The results of detection of the causative agent of legionellosis in biological material are presented in table 4, and in samples from environmental objects in table 5.
Параллельно с использованием заявляемого набора проводили исследования образцов другими методами. Полученные данные показали высокий процент совпадения результатов.In parallel with the use of the inventive kit, samples were studied by other methods. The data obtained showed a high percentage of coincidence of the results.
Пример 3. Детекция L. pneumophila в образцах, искусственно контаминированных микроорганизмом различных серогрупп.Example 3. Detection of L. pneumophila in samples artificially contaminated by a microorganism of various serogroups.
Выделение ДНК и проведение ПЦР проводили аналогично примеру 1. Результаты представлены в табл.6.DNA isolation and PCR was carried out analogously to example 1. The results are presented in table.6.
Описанное изобретение не ограничивается указанными в таблицах объектами, которые предназначены только для иллюстрирования. Любые клинические образцы и объекты внешней среды находятся в сфере действия настоящего изобретения.The described invention is not limited to the objects indicated in the tables, which are intended only for illustration. Any clinical samples and environmental objects are within the scope of the present invention.
На основе выбранных праймеров и зонда сконструированы тест-системы «Ген L. pneumophila - РЭФ» и «Ген L. pneumophila - РГФ» для индикации L. pneumophila. Тест-системы прошли апробацию на базе Ставропольского НИПЧИ и ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» и находятся на стадии внедрения в производство.Based on the selected primers and probe, test systems “L. pneumophila gene - REF” and “L. pneumophila gene - RGF” were designed to indicate L. pneumophila. Test systems have been tested on the basis of the Stavropol Scientific Research Institute for Scientific and Technical Research and State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" and are at the stage of implementation in production.
Таким образом, использование новой мишени и соответствующих наборов праймеров и зонда к ним для детекции L. pneumophila 1-14 серогрупп с помощью ПЦР с электрофоретическим и/или гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов обеспечивает раннюю диагностику возбудителя (в течение 3-4 ч), что способствует эффективности лечения больных, повышает качество эпидемиологического надзора за объектами окружающей среды. Предлагаемый набор праймеров и зонда доступен для любой практической лаборатории здравоохранения, так как позволяет выполнять исследования при различном уровне оснащенности оборудованием и реактивами.Thus, the use of a new target and the corresponding sets of primers and probe for them for the detection of L. pneumophila 1-14 serogroups by PCR with electrophoretic and / or hybridization-fluorescence analysis of the results provides early diagnosis of the pathogen (within 3-4 hours), which contributes to the effectiveness of treatment of patients, improves the quality of epidemiological surveillance of environmental objects. The proposed set of primers and probe is available for any practical healthcare laboratory, as it allows you to perform studies at various levels of equipment and reagents.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009117048/13A RU2397251C1 (en) | 2009-05-04 | 2009-05-04 | Set for detecting legionellosis agent in biological material and environmental medium |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009117048/13A RU2397251C1 (en) | 2009-05-04 | 2009-05-04 | Set for detecting legionellosis agent in biological material and environmental medium |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2397251C1 true RU2397251C1 (en) | 2010-08-20 |
Family
ID=46305483
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009117048/13A RU2397251C1 (en) | 2009-05-04 | 2009-05-04 | Set for detecting legionellosis agent in biological material and environmental medium |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2397251C1 (en) |
-
2009
- 2009-05-04 RU RU2009117048/13A patent/RU2397251C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3368268B2 (en) | Universal eubacterial nucleic acid probe and method | |
EP3320110B1 (en) | 16s ribosomal rna universal primers and use thereof in microbiological analysis and diagnostics | |
KR101798211B1 (en) | Method for the detection and characterization of a toxinogenic Clostridium difficile strain | |
JP2010537650A (en) | Method for detecting bacteria and fungi | |
US8597877B2 (en) | Polymorphic loci that differentiate Escherichia coli O157:H7 from other strains | |
KR20130044217A (en) | Assays and kits for serotyping pseudomonas aeruginosa and oligonucleotide sequences useful in such methods and kits | |
EP2014775B1 (en) | Method for the detection of bacterial species of the genera Anaplasma/Ehrlichia and Bartonella | |
US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
RU2360972C1 (en) | Method detection and evaluation of biotype, serogroup and toxigenicity of cholera agent and related kit | |
Hu et al. | Simultaneous analysis of foodborne pathogenic bacteria by an oligonucleotide microarray assay | |
CA2718214A1 (en) | Detection of bacteria belonging to the genus campylobacter by targeting cytolethal distending toxin | |
US20160017407A1 (en) | Methods for Microorganism Detection and Identification | |
RU2397251C1 (en) | Set for detecting legionellosis agent in biological material and environmental medium | |
WO2007082259A2 (en) | Surrogate markers for viral infections and other inflammatory responses | |
KR101886520B1 (en) | Method for diagnosing latent infection phase of Johne's Disease | |
US7582738B2 (en) | Diagnostic assay for Wiskott-Aldrich syndrome and genetically related disorders | |
US7531309B2 (en) | PCR based capsular typing method | |
EP2723891B1 (en) | Diagnostic methods for detecting clostridium difficile | |
US20100167951A1 (en) | Dna chip for detection of staphylococcus aureus | |
Hamdan et al. | High Prevalence of Staphylococcal Enterotoxins (SEs) Virulence Genes Among Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Isolated from Patients with Different Clinical Manifestations in Khartoum State, Sudan | |
Demir et al. | Comparison of tul4, fopA, 16S rRNA and RD1 gene regions of Francisella tularensis strains isolated from Sivas, Turkey | |
KR20070069680A (en) | Dna chip for detection of staphylococcus aureus | |
KR100935919B1 (en) | DNA chip for detection of infectious bacteria | |
US20110160075A1 (en) | Diagnostic assay for orientia tsutsugamushi by detection of responsive gene expression | |
Dash et al. | Human brain damage detection using porA marker |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130505 |