RU2347579C1

RU2347579C1 - Method for production of cell culture for treatment of vascular demyelinating diseases of nervous system and cell culture produced by this method (versions)

Info

Publication number: RU2347579C1
Application number: RU2007125043/15A
Authority: RU
Inventors: Виктор Александрович Ступин (RU); Виктор Александрович Ступин
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Медицинские технологии"
Priority date: 2007-07-03
Filing date: 2007-07-03
Publication date: 2009-02-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: according to the first version, method includes extraction of allogenic mesenchymal stem cells culture from umbilical cord of newborn after normal delivery for their parenteral introduction in patient according to specified technology. According to the second version, method includes extraction of allogenic mesenchymal stem cells culture from placenta of newborn after normal delivery for their parenteral introduction in patient according to the same technology. The first and second preparations contain the following amount of allogenic mesenchymal stem cells in sterile physiological solution - in the range from 1 to 5 million cells in 5 ml of solution.

EFFECT: increase of therapeutical effect.

6 cl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины и может использоваться в способах получения препаратов для терапии больных с неврологической патологией различного генеза, таких как рассеянным склерозом и цереброваскулярными заболеваниями, сопровождающимися ишемией головного мозга (инфаркт головного мозга, внутримозговое кровоизлияние, хроническая ишемия головного мозга, дисциркуляторная энцефалопатия), а также заболеваний, связанных с дегенерацией тканей и аутоиммунными реакциями (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, мышечная дистрофия, миастения, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, мозжечковая дегенерация, последствия медленных нейроинфекций и др.),The invention relates to medicine and can be used in methods for producing drugs for the treatment of patients with neurological pathology of various origins, such as multiple sclerosis and cerebrovascular diseases accompanied by cerebral ischemia (cerebral infarction, intracerebral hemorrhage, chronic cerebral ischemia, discirculatory encephalopathy) as well as diseases associated with tissue degeneration and autoimmune reactions (Parkinson's disease, Alzheimer's disease, muscle distr raphy, myasthenia gravis, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, cerebellar degeneration, the effects of slow neuroinfections et al.),

В связи со сложностью структурно-функциональной организации нервной системы, ограниченностью сведений о причинах и особенно о механизмах развития патологических состояний, трудностями воздействия на соответствующие звенья патогенеза, сложностями биохимических высокоэнергозатратных церебральных нейро-глиальных перестроек архитектоники, лечение многих неврологических заболеваний всегда считалось одной из наиболее трудных задач клинической медицины,Due to the complexity of the structural and functional organization of the nervous system, limited information on the causes and especially on the mechanisms of the development of pathological conditions, difficulties in influencing the corresponding links of pathogenesis, difficulties in biochemical high-energy cerebral neuroglial rearrangements of architectonics, treatment of many neurological diseases has always been considered one of the most difficult clinical medicine tasks

Именно в силу сложной многоуровневой организации адекватного функционирования человеческий мозг и все структуры нервной системы являются плохо защищенными даже от минимальных экстра- или интрацеребральных воздействий; болезней, травм, воспалений, повреждений.It is precisely due to the complex multilevel organization of adequate functioning that the human brain and all structures of the nervous system are poorly protected even from minimal extra- or intracerebral influences; diseases, injuries, inflammations, injuries.

Повреждения структур центральной нервной системы наиболее плохо поддаются медикаментозной или хирургической коррекции, в силу чего на протяжении всей истории клинической медицины наиболее скромные успехи были достигнуты именно в разработке методов лечения тяжелых заболеваний нервной системы.Damage to the structures of the central nervous system is most difficult to respond to with medical or surgical correction, which is why throughout the history of clinical medicine the most modest successes have been achieved precisely in the development of methods for treating severe diseases of the nervous system.

В то же время быстрое техногенное развитие человечества ведет к увеличению социально значимых болезней, к которым относятся и многие виды патологии нервной системы, прежде всего сосудистые заболевания головного и спинного мозга, травмы нервной системы, тяжелые эндотоксикозы с диффузными нейрональными повреждениями, демиелинизирующие и инфекционные заболевания. Высокая заболеваемость этими инвалидизирующими формами неврологической патологии делают проблему поиска рациональных средств и методов терапии уже не только медицинской, но и социальной.At the same time, the rapid technological development of mankind leads to an increase in socially significant diseases, which include many types of pathology of the nervous system, primarily vascular diseases of the brain and spinal cord, injuries of the nervous system, severe endotoxemia with diffuse neuronal damage, demyelinating and infectious diseases. The high incidence of these disabling forms of neurological pathology makes the problem of finding rational means and methods of therapy not only medical, but also social.

Сложность функционально-морфологической организации эффективного функционирования центральной нервной системы, ее крайне низкая резистентность к таким повреждающим факторам, как ишемия и гипоксия, проводит к тому, что самые современные методы терапии сосудистых заболеваний нервной системы позволяют вернуться к «доинсультному» уровню жизни не более чем 25% пациентов. Остальные пациенты остаются инвалидами. Около 45% больных, перенесших инсульт, остаются тяжелыми инвалидами, нуждающимися в посторонней помощи, длительных и крайне дорогостоящих курсах реабилитации. Нерешенным остается в настоящее время и вопрос, касающийся больных с хронической ишемией головного мозга, заболевание которых имеет неуклонно прогрессирующий характер течения и приводящее к тяжелой деменции и инвалидизации.The complexity of the functional-morphological organization of the effective functioning of the central nervous system, its extremely low resistance to such damaging factors as ischemia and hypoxia, leads to the fact that the most modern methods of treatment of vascular diseases of the nervous system allow you to return to the "pre-stroke" standard of living no more than 25 % of patients. The remaining patients remain disabled. About 45% of stroke patients remain severely disabled, in need of assistance, long-term and extremely expensive rehabilitation courses. The issue regarding patients with chronic cerebral ischemia, whose disease has a steadily progressive course and leading to severe dementia and disability, remains unresolved at the present time.

К тяжело инвалидизирующим заболеваниям нервной системы относится и рассеянный склероз - хроническое прогрессирующее мультифакториальное заболевание нервной системы, развивающееся в результате аутоиммунного процесса, повреждающего миелин, являющийся главным «изолятором», обеспечивающим аксональную синаптическую передачу.Multiple sclerosis, a chronic progressive multifactorial disease of the nervous system that develops as a result of an autoimmune process that damages myelin, which is the main “isolator” that provides axonal synaptic transmission, also belongs to severely disabling diseases of the nervous system.

Формирующиеся в процессе возникновения и прогрессирования рассеянного склероза патоморфологические изменения структур центральной нервной системы проявляются очагами демиелинизации, т.н. бляшками. Очаги демиелинизации связаны с разрушением миелиновой оболочки проводящих путей центральной нервной системы, что и обуславливает быстрое развитие и стойкий характер очаговых неврологических расстройств, характерных для прогредиентного течения рассеянного склероза. Одновременно с процессом демиелинизации по краям бляшки в ряде случаев могут идти процессы ремиелинизации, обуславливающие ремиттирующее течение заболевания, однако, чаще всего они незначительно выражены и восстановление миелиновой оболочки по интенсивности и скорости несопоставимо с ее распадом. Запущенные патоиммунохимические дизрегуляции, вызванные особенностями системного и нейронального метаболизма при прогредиентном течении рассеянного склероза, крайне редко самостоятельно поддаются обратному развитию, приводя к стойкой инвалидизации больных молодого возраста, что, учитывая высокую заболеваемость, становится в настоящее время значительной медицинской и социальной проблемой.Pathomorphological changes in the structures of the central nervous system that are formed in the process of the onset and progression of multiple sclerosis are manifested by foci of demyelination, the so-called plaques. The foci of demyelination are associated with the destruction of the myelin sheath of the pathways of the central nervous system, which leads to the rapid development and persistent nature of focal neurological disorders characteristic of the progressive course of multiple sclerosis. At the same time as the process of demyelination along the edges of the plaque, in some cases remyelination processes can occur that cause the remitting course of the disease, however, most often they are slightly expressed and the restoration of the myelin sheath in intensity and speed is not comparable with its decay. Launched pathoimmunochemical dysregulations caused by the peculiarities of systemic and neuronal metabolism in the progressive course of multiple sclerosis are extremely rarely independently reversible, leading to persistent disability of young patients, which, given the high incidence, is now becoming a significant medical and social problem.

Значимость этой проблемы усугубляется недостаточной эффективностью всех известных на сегодняшний день методов терапии. Самыми широко применяющимися способами лечения рассеянного склероза являются: иммунносупрессивная терапия большими дозами кортикостероидов, применение цитостатиков, селективных иммуносупрессоров, интерферонов-бета, применение интерферонов-альфа.The significance of this problem is exacerbated by the lack of effectiveness of all currently known treatment methods. The most widely used methods of treating multiple sclerosis are: immunosuppressive therapy with large doses of corticosteroids, the use of cytostatics, selective immunosuppressants, interferon-beta, and the use of interferon-alpha.

Однако все эти методы терапии отличаются очень высокой стоимостью, необходимостью длительного (практически постоянного) применения, большим количеством побочных действий и эффективны далеко не у всех больных с рассеянным склерозом, что обуславливает необходимость поиска новых более эффективных методов терапии.However, all these methods of therapy are of very high cost, the need for long-term (almost constant) use, a large number of side effects and are far from effective in all patients with multiple sclerosis, which necessitates the search for new, more effective methods of therapy.

Именно в связи с огромным числом нерешенных до настоящего момента проблем лечения больных с ишемией головного мозга, рассеянным склерозом и другими неврологическими заболеваниями революционным шагом для клинической неврологии и в то же время патогенетически направленным методов терапии стала разработка методов терапевтического применения клеток-предшественников (стволовых прогениторных клеток) у данной категории больных.It is precisely in connection with the huge number of unsolved problems of treating patients with cerebral ischemia, multiple sclerosis, and other neurological diseases that have resolved to date, the development of methods for the therapeutic use of progenitor cells (stem progenitor cells) has become a revolutionary step for clinical neurology ) in this category of patients.

Основные принципы лечения путем трансплантации клеточных препаратов клетками заключаются в доставке к месту поломки дифференцированных клеток новых плюрипотентных клеток, которые под воздействием окружающих тканей дифференцируются в зрелые, способные выполнять специализированную функцию клетки, или в стимуляции пролиферации и дифференцировки собственных стволовых клеток биологически активными веществами, секретируемыми трансплантированными клетками.The main principles of treatment by transplantation of cell preparations with cells are the delivery of new pluripotent cells to the site of differentiated cell breakdown, which, under the influence of surrounding tissues, differentiate into mature cells capable of performing a specialized cell function, or stimulate the proliferation and differentiation of their own stem cells with biologically active substances secreted by the transplanted cells.

В больных органах и тканях процессы самообновления клеток нарушены. Дисбаланс самообновления стволовых клонов паренхимы/мезенхимы лежит в основе так называемых дегенеративных заболеваний, таких как атеросклероз, цирроз печени, «возрастные» изменения в легких и почках, глиоз и возрастная дегенерация головного и спинного мозга. Этим же в значительной степени объясняется невозможность восстановления пораженных участков мозга при инсульте, рассеянном склерозе, при повреждении мозга в результате травмы, гипоксии и т.д.In diseased organs and tissues, cell self-renewal processes are impaired. An imbalance in the self-renewal of stem clones of the parenchyma / mesenchyme underlies the so-called degenerative diseases, such as atherosclerosis, cirrhosis of the liver, “age-related” changes in the lungs and kidneys, gliosis and age-related degeneration of the brain and spinal cord. This also largely explains the impossibility of restoring the affected areas of the brain during stroke, multiple sclerosis, and brain damage due to trauma, hypoxia, etc.

В середине 1970-х годов А.Я.Фриденштейн с сотрудниками показали, что строма гематогенной ткани взрослых мышей и человека содержит плюрипотентные клетки, которые можно клонировать в различные линии. В постмитотическом состоянии эти клетки дифференцировались в остеобласты, адипоциты, хондроциты, миоциты. Эти плюрипотентные клетки были названы мезенхимальными стволовыми клетками. Таким образом, было показано, что стволовые регионарные клетки не только эмбриона, но и взрослого организма наделены пластичной плюрипотентностью, т.е. способностью активно развиваться, размножаться, продуцировать различные линии дифференцировки и кардинально менять метаболизм окружающих их тканей.In the mid-1970s, A.Ya. Fridenshtein and colleagues showed that the stroma of the hematogenous tissue of adult mice and humans contains pluripotent cells that can be cloned into different lines. In the postmitotic state, these cells differentiated into osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, myocytes. These pluripotent cells were called mesenchymal stem cells. Thus, it was shown that stem regional cells not only of the embryo, but also of the adult organism are endowed with plastic pluripotency, i.e. the ability to actively develop, multiply, produce various lines of differentiation and radically change the metabolism of the tissues surrounding them.

Началом пути к современной клеточной терапии у пациентов с патологией нервной системы стали пришедшиеся на 80-е годы попытки пересадки эмбриональных нервных тканей.The beginning of the path to modern cell therapy in patients with pathology of the nervous system began in the 80s when attempts were made to transplant embryonic nerve tissues.

Первым шагом в данном направлении было начатое в 1998 года исследование эффективности пересадки эмбриональной ткани (нейротрансплантация эмбриональной нервной ткани). В организме человека из-за особенностей метаболизма существует несколько иммунологически привелигированных мест, где пересадка не вызывает отторжения. К ним относится в том числе центральная нервная система, нервные стволы, ряд других органов.The first step in this direction was the study in 1998 of the effectiveness of embryonic tissue transplantation (neurotransplantation of embryonic nervous tissue). In the human body, due to the characteristics of metabolism, there are several immunologically privileged places where the transplant does not cause rejection. These include including the central nervous system, nerve trunks, a number of other organs.

Известен способ приготовления клеточного трансплантанта из фетальных тканей абортивного плода 17-21 недели внутриутробного развития для лечения широкого круга заболеваний, в том числе для лечения рассеянного склероза, при этом трансплантант должен содержать преимущественно клетки промежуточной области мозга, которые в наибольшей степени подвержены миграции (патент RU №2160112, опубл. 10.04.2000 г.).A known method of preparing a cell transplant from fetal tissues of an abortive fetus of 17-21 weeks of intrauterine development for the treatment of a wide range of diseases, including for the treatment of multiple sclerosis, the transplant should mainly contain cells of the intermediate region of the brain that are most susceptible to migration (RU patent No. 2160112, published on April 10, 2000).

Однако многочисленные этические и деонтологические проблемы применения эмбриональных тканей значительно ограничивают возможности данного метода применения стволовых клеток, в том числе у больных с нейродегенеративными заболеваниями и рассеянным склерозом.However, the numerous ethical and deontological problems of using embryonic tissues significantly limit the possibilities of this method of using stem cells, including in patients with neurodegenerative diseases and multiple sclerosis.

Известен «Биотрансплантант, способ его получения (варианты) и способ лечения ишемической болезни сердца (патент RU 2268061, опубл. 20.01.2006 г.) Биотрансплантант содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из фетального (печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель гестации для последующей аллотрансплантации) или донорского (костный мозг, подкожная жировая ткань, тимус у детей 6 лет для последующей аутотрансплантации) материала или из ткани скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности для лечения ишемической болезни сердца. Трансплантант вводят в нативную и/или стенозированную коронарную артерию и/или аортокоронарный шунт соответственно. МСК выращивают в виде прикрепленных колоний на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 10 мкг/мл гепарина. Из указанного патента также известен препарат для лечения мезенхимальными стволовыми клетками больных с ишемической болезнью сердца.The well-known "Biotransplant, its production method (options) and a method for the treatment of coronary heart disease (patent RU 2268061, publ. 01.20.2006) Biotransplant contains mesenchymal stem cells (MSCs) from fetal (liver 5-8 weeks, thymus 18-20 weeks, bone marrow 17-20 weeks, subcutaneous adipose tissue 17-19 weeks of gestation for subsequent allotransplantation) or donor (bone marrow, subcutaneous adipose tissue, thymus in 6 years old children for subsequent autotransplantation) material or from skeletal muscle tissue of human fetuses 1- 2 trimesters of pregnancy for the treatment of coronary heart disease. The graft is inserted into the native and / or stenotic coronary artery and / or coronary artery bypass graft, respectively. MSCs are grown as attached colonies on DMEM / F12 growth medium containing 15% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 10 μg / ml heparin. From this patent also known drug for the treatment of mesenchymal stem cells of patients with coronary heart disease.

Так же в 2006 году был изобретен «Биотрансплантант и способ лечения хронической ишемии нижних конечностей» (патент RU 2286159, опубл. 27.10.2006 г.), в котором биотрансплантант получен из МСК фетального (печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель гестации для последующей аллотрансплантации) или донорского (костный мозг, подкожная жировая ткань, тимус у детей 6 лет для последующей аутотрансплантации) материала, из миобластов фетальных скелетных мышц плодов человека 1-2 триместра беременности или из мышечной ткани взрослого человека (полученных при биопсии), а также из фибробластов кожи фетусов человека 1-2 триместра беременности, кожи взрослого человека (полученной в результате пластических операций или биопсии), липоаспиратов для лечения хронической ишемии нижних конечностей и ее осложнений. Клеточная терапия хронической ишемии нижних конечностей складывается из введения культивированного биотрансплантанта в общую бедренную терапию (100-500 млн МСК) при операции бедренно-тибиально-подколенного или бедренно-тибиального аутовенозного шунтирования, по другому варианту - инъекции МСК той же дозировки в мышцы голени, а при развитии атрофии мышц в пораженные мышцы вводят суспензию культуры миобластов, при язвенно-некротических осложнениях ишемии нижних конечностей дефект обкладывают суспензией, содержащей МСК и фибробласты.Also in 2006, “Biotransplant and a method for the treatment of chronic lower limb ischemia” was invented (patent RU 2286159, publ. 10/27/2006), in which the biotransplant was obtained from fetal MSC (liver 5-8 weeks, thymus 18-20 weeks , bone marrow 17-20 weeks, subcutaneous adipose tissue 17-19 weeks of gestation for subsequent allotransplantation) or donor (bone marrow, subcutaneous adipose tissue, thymus in children 6 years old for subsequent autotransplantation) material, from myoblasts of fetal skeletal muscle of human fetuses 1- 2 trimesters of pregnancy or muscle adult adult tissue (obtained by biopsy), as well as from fibroblasts of human fetus skin of the 1-2 trimester of pregnancy, adult skin (obtained as a result of plastic surgery or biopsy), lipoaspirates for the treatment of chronic lower limb ischemia and its complications. Cell therapy of chronic lower limb ischemia consists of the introduction of a cultured biotransplant into general femoral therapy (100-500 million MSCs) during surgery of the femoral-tibial popliteal or femoral-tibial autovenous bypass grafting, according to another variant - injection of MSC of the same dosage into the leg muscles, and with the development of muscle atrophy, a suspension of myoblast culture is injected into the affected muscles, with ulcerative necrotic complications of lower limb ischemia, the defect is surrounded by a suspension containing MSCs and fibroblasts.

Однако применение эмбриональных клеток в России запрещено законом о «клонировании» и не используется по этическим мотивам. Кроме того, на моделях животных женских особей доказано, что слишком большие дозировки стволовых клеток могут привести к негативным результатам. Нерешенность ряда морально-этических и юридических проблем трансплантологии эмбриональных тканей исключает практическое применение части исследований, что серьезно тормозит развитие названного направления терапии.However, the use of embryonic cells in Russia is prohibited by the law on “cloning” and is not used for ethical reasons. In addition, it has been proven in animal models of females that too large dosages of stem cells can lead to negative results. The unresolved number of moral, ethical and legal problems of transplantology of embryonic tissues excludes the practical application of part of the research, which seriously inhibits the development of this direction of therapy.

Известен способ нейрохирургической стереотоксической терапии инсульта составом человеческих нейральных клеток, клеточный препарат, а также источник и способ его получения для терапии инсульта (заявка US 2003/ 0211085, опубл. 13.11.2003 г.). На основании данного способа проведены многочисленные рандомизированные исследования.A known method of neurosurgical stereotoxic therapy of stroke with the composition of human neural cells, a cell preparation, as well as the source and method of its preparation for the treatment of stroke (application US 2003/0211085, publ. 13.11.2003). Based on this method, numerous randomized trials were conducted.

Однако необходимость нейрохирургического вмешательства значительно ограничивает возможности известного способа применения стволовых клеток, несмотря на его потенциально высокую целесообразность и явную саногенетическую направленность. Методы нейротрансплантации непосредственно в пораженные участки мозга чрезвычайно сложны и являются крайне дорогостоящими, при этом они не всегда безопасны для пациента. Клинические же эффекты этих операций оказались в ряде случаев кратковременными, а иногда сомнительными.However, the need for neurosurgical intervention significantly limits the possibilities of the known method of using stem cells, despite its potentially high feasibility and clear sanogenetic orientation. Methods of neurotransplantation directly into the affected areas of the brain are extremely complex and extremely expensive, while they are not always safe for the patient. The clinical effects of these operations were in some cases short-lived, and sometimes dubious.

Современным шагом в направлении клеточной терапии являются исследования крови и тканей пуповины, плаценты человека, которые рассматриваются в настоящее время в качестве одного из оптимальных источников стволовых клеток, обладающих высоким прогенераторным потенциалом.A modern step in the direction of cell therapy is the study of blood and umbilical cord tissue, human placenta, which are currently considered as one of the optimal sources of stem cells with high regenerative potential.

Пуповинная кровь и ткани пуповины являются достойным альтернативным источником стволовых клеток для трансплантации при многих тяжелых заболеваниях крови, наследственных нарушениях метаболизма, патологии центральной нервной системы и могут использоваться для аллогенной и аутологичной трансплантации.Cord blood and umbilical cord tissues are a worthy alternative source of stem cells for transplantation in many serious blood diseases, hereditary metabolic disorders, and pathology of the central nervous system and can be used for allogeneic and autologous transplantation.

Стволовые клетки, в больших количествах присутствующие в пуповинной крови и тканях пуповины, обладают высокой пролиферативной активностью, а также характеризуются наличием высокого титра маркера плюрипотентности и функциональной активности стволовых клеток т.н.- CD34+.Stem cells, which are present in large quantities in cord blood and umbilical cord tissues, have high proliferative activity and are also characterized by the presence of a high titer of pluripotency marker and the functional activity of stem cells, the so-called CD34 +.

В пуповинной крови, помимо высокого содержания стволовых клеток, также содержится большое число Т-лимфоцитов, которые ответственны за ингибирование реакций "трансплантант против хозяина" и оказывают противоопухолевое действие.In addition to the high content of stem cells, cord blood also contains a large number of T-lymphocytes, which are responsible for inhibiting the transplant versus host reaction and have an antitumor effect.

Известен также способ выделения мезенхимальных стволовых клеток (заявка на выдачу патента RU 2004110701/13, опубл. 09.04.2004 г.), который раскрывает формулу выделения МСК из жировой ткани, децидуальной или амниотической оболочки, хориальной стромы плаценты человека, включая обработку тканей раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбенко.There is also known a method for isolating mesenchymal stem cells (patent application RU 2004110701/13, published on April 9, 2004), which discloses a formula for isolating MSCs from adipose tissue, decidual or amniotic membrane, human placental chorion stroma, including tissue treatment with collagenase solution in the environment Needle in the modification of Dyulbenko.

До настоящего времени продолжаются широкие эксперименты in vivo, подтверждающие высокую плюрипотентность, способность к дифференцировке и высокий уровень метаболизма стволовых клеток, полученных из плаценты, пуповинной крови и тканей пуповины.To date, extensive in vivo experiments continue, confirming high pluripotency, differentiation ability, and a high level of stem cell metabolism derived from placenta, umbilical cord blood, and umbilical cord tissues.

Наиболее близким является способ получения препарата из костного мозга, пуповинной крови и периферической крови для терапии заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) (заявка ЕР 1658853, опубл. 27.01.2005 г., «Remedy for internal administration against cranial nerve disease containing mesenchimal cell as the active ingredient»). Из указанного источника информации известен также препарат для терапии инфаркта головного мозга для внутривенного введения пациенту, обладающий нейропротективным, регенераторным действием, что было подтверждено экспериментальными исследованиями.The closest is a method of obtaining a drug from bone marrow, cord blood and peripheral blood for the treatment of diseases of the central nervous system (CNS) (application EP 1658853, publ. January 27, 2005, "Remedy for internal administration against cranial nerve disease containing mesenchimal cell as the active ingredient "). A drug for the treatment of cerebral infarction for intravenous administration to a patient with a neuroprotective, regenerative effect is also known from this information source, which was confirmed by experimental studies.

Рядом экспериментальных исследований к настоящему времени показано, что выделяемые введенными стволовыми клетками нейрогуморальные факторы оказывают воздействие на нервную ткань реципиента, в том числе стимулируя аксоно-, миело- и ангиогенез.A number of experimental studies to date have shown that neurohumoral factors secreted by the introduced stem cells affect the nervous tissue of the recipient, including stimulating axon, myelo, and angiogenesis.

Таким образом, на сегодняшний день не вызывает сомнения тот факт, что в ряде случаев введенные различными способами, в том числе внутривенно, донорские стволовые клетки не только жизнеспособны в организме реципиента, но и могут развиваться там, превращаясь в определенные специализированные клеточные формы и выделяя биологически активные вещества, воздействующие на окружающие ткани мозга, что способствует процессам репарации, неоангиогенезу и усилению нейропластичности.Thus, today there is no doubt that in some cases donor stem cells introduced in various ways, including intravenously, are not only viable in the recipient’s body, but can also develop there, turning into certain specialized cellular forms and isolating biologically active substances that affect the surrounding brain tissue, which contributes to the processes of repair, neoangiogenesis and increased neuroplasticity.

Кроме того, сами прогениторные мезенхимальные стволовые клетки обладают выраженной иммунодепрессивной активностью, а клетки пуповинной крови и плаценты не обладают иммуногенностью, в связи с чем могут быть эффективными при лечении заболеваний, связанных с дегенерацией тканей и аутоиммунными реакциями (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, мышечная дистрофия, болезнь Хантингтона, мозжечковая дегенерация, последствия медленных нейроинфекций и др.), а также для лечения сосудистых и демиелинизирующих заболеваний.In addition, the progenitor mesenchymal stem cells themselves have pronounced immunosuppressive activity, and cord blood and placenta cells do not have immunogenicity, and therefore can be effective in the treatment of diseases associated with tissue degeneration and autoimmune reactions (Parkinson's disease, Alzheimer's disease, muscle dystrophy , Huntington’s disease, cerebellar degeneration, the consequences of slow neuroinfections, etc.), as well as for the treatment of vascular and demyelinating diseases.

В то же время ограничением известных способов получения препаратов для лечения неврологических заболеваний, в том числе сосудистых и демиелинизирующих заболеваний нервной системы, являются их значительная трудоемкость, а получаемые препараты обладают еще недостаточно высоким терапевтическим эффектом и не могут достаточно долго храниться до момента проведения клеточной терапии.At the same time, a limitation of the known methods for producing preparations for the treatment of neurological diseases, including vascular and demyelinating diseases of the nervous system, is their considerable laboriousness, and the resulting preparations have still not a sufficiently high therapeutic effect and cannot be stored for long enough until cell therapy is performed.

Решаемая изобретением задача - улучшение качества получаемого препарата и усиление терапевтического эффекта при лечении заболеваний центральной нервной системы (ЦНС).The problem solved by the invention is to improve the quality of the resulting preparation and enhance the therapeutic effect in the treatment of diseases of the central nervous system (CNS).

Технический результат, который может быть получен при осуществлении заявленного способа, - улучшение качественных показателей получаемых препаратов, таких как стойкость клинического позитивного эффекта при клеточной терапии неврологических заболеваний, в том числе демиелинизирующих заболеваний и заболеваний, сопровождающихся ишемией головного мозга.The technical result that can be obtained by implementing the claimed method is an improvement in the quality indicators of the preparations obtained, such as the persistence of a clinical positive effect in cell therapy of neurological diseases, including demyelinating diseases and diseases accompanied by cerebral ischemia.

Технический результат, который может быть получен при изготовлении препарата, - повышение его пролиферативного потенциала и уменьшение экспрессии антигенов гистосовместимости, увеличение регенерации поврежденных нервных тканей, что клинически сопровождается более значимым регрессом неврологической симптоматики, снижением инвалидизации и улучшением качества жизни пациентов и безопасности использования препарата.The technical result that can be obtained in the manufacture of the drug is an increase in its proliferative potential and a decrease in the expression of histocompatibility antigens, an increase in the regeneration of damaged nerve tissues, which is clinically accompanied by a more significant regression of neurological symptoms, a decrease in disability, and an improvement in the quality of life of patients and the safety of using the drug.

Дополнительный технический результат, который может быть достигнут, - увеличение срока хранения препарата до проведения сеанса клеточной терапии, расширение функциональных возможностей при введении его в организм пациента.An additional technical result that can be achieved is an increase in the shelf life of the drug before a cell therapy session, the expansion of functionality when it is introduced into the patient's body.

Для решения поставленной задачи с достижением указанного технического результата по первому варианту осуществления изобретения в известном способе получения препарата при лечении заболеваний нервной системы, включающем выделение из пуповины новорожденного после нормальных родов культуры стволовых клеток, согласно изобретению осуществляют выделение культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, при выделении аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина 100 ед./мл, 100 ед./мл амфотерицина в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1% раствором коллагеназы 1 типа, приготовленным на среде DMEM, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок клеток, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл. пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспензированный осадок клеток в ростовой среде DMEM переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду DMEM 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3, а перед проведением клеточной терапии монослой переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2, затем суспензию осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспензируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки пуповины в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл.To solve the problem with the achievement of the specified technical result according to the first embodiment of the invention, in a known method for producing a preparation for treating diseases of the nervous system, comprising isolating from the umbilical cord of a newborn after normal childbirth stem cell cultures, according to the invention, a culture of allogeneic mesenchymal stem cells is isolated for parenteral administration a patient with neurological pathology, with the allocation of allogeneic mesenchymal stem cells upovine is freed from blood residues and washed in Versen's solution with the addition of antibiotics 100 units / ml penicillin, 100 units / ml streptomycin 100 units / ml, 100 units / ml amphotericin for 1 hour at room temperature on a shaker, veins cannulated on both sides and washed first with Hanks solution, and then with 0.1% type 1 collagenase solution prepared on DMEM medium, and incubated at 37 ° C for 30 minutes, then the umbilical cord tissue is mechanically exposed, the separated cells are collected, washing them Hanks solution obtained after ME anicheskogo exposure and washing, the cell suspension was centrifuged at 1000 revs / min for 5 min to obtain cell pellet which is resuspended in growth DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, 100 u / ml. penicillin, 100 units / ml streptomycin, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate, a resuspended cell pellet in DMEM growth medium is transferred to culture plates and cultured until a monolayer is formed, changing DMEM growth medium 2 times a week, and when the monolayer is reached, cells are reseeded in a ratio of 1: 3, and before conducting cell therapy, the monolayer is suspended in a suspension by treatment with a mixture of Versen's solution and 0.25% trypsin solution in a 1: 1 ratio for 20 min at 37 ° C, which is then washed three times with physiological saline with pH 7 , 2, for em suspension were pelleted by centrifugation for 5 min at 1000 rev / min, resuspended in sterile normal saline cell pellet to obtain allogeneic mesenchymal stem cells from umbilical cord in an amount of 1-5 million cells in 5 ml.

Для решения поставленной задачи с достижением указанного технического результата по второму варианту осуществления изобретения в известном способе получения препарата при лечении заболеваний нервной системы, в том числе сосудистых и демиелинизирующих заболеваний, включающем выделение из плаценты новорожденного после нормальных родов культуры стволовых клеток, согласно изобретнию осуществляют выделение культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, при выделении культуры аллогенных мезенхимальных стволовых плаценту освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина 100 ед./мл, 100 ед./мл амфотерицина в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере, затем нарезают ткань плаценты на куски размером 1 см³ и обрабатывают их 0,1% раствором трипсина, приготовленным на среде DMEM, свободной от сыворотки, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани плаценты, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл. пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспензированный осадок в среде переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3, а перед проведением клеточной терапии монослой клеток переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки плаценты в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл.To solve the problem with achieving the specified technical result according to the second embodiment of the invention, in a known method for producing a preparation for treating diseases of the nervous system, including vascular and demyelinating diseases, including isolating a newborn from normal placenta stem cell cultures from the placenta, according to the invention, a culture is isolated allogeneic mesenchymal stem cells for parenteral administration to a patient with neurological pathology, with isolating a culture of allogeneic mesenchymal stem placenta is freed from blood residues and washed in a Versen solution with antibiotics 100 units / ml penicillin, 100 units / ml streptomycin 100 units / ml, 100 units / ml amphotericin for 1 hour at room temperature on a shaker, then cut the placental tissue into pieces 1 cm ³ in size and treat them with a 0.1% trypsin solution prepared in serum free DMEM and incubate at 37 ° C for 30 minutes, then perform mechanical action on the placental tissue collect leaking cells, washing them with Hanks solution, obtained after mechanical action and washing, the cell suspension is centrifuged at 1000 rpm for 5 min, obtaining a precipitate that is resuspended in DMEM growth medium containing 10% fetal cattle serum, 100 units / ml penicillin, 100 units / ml streptomycin, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate, the resuspended precipitate in the medium is transferred to culture plates and cultured until a monolayer is formed, changing the growth medium 2 times a week, and when the monolayer is reached, the cells are reseeded in the ratio 1: 3, and before conducting cell therapy, the monolayer of cells is transferred into suspension by treatment with a mixture of Versen's solution and 0.25% trypsin solution in a 1: 1 ratio for 20 min at 37 ° C, which is then washed three times with physiological saline with a pH of 7.2, then cells sediment give centrifugation for 5 min at 1000 rpm, the cell pellet is resuspended in sterile saline, receiving allogeneic mesenchymal stem cells of the placenta in an amount of from 1-5 million cells in 5 ml.

Возможны дополнительные варианты осуществления способа по первому и второму вариантам, в которых целесообразно, чтобы:Additional embodiments of the method according to the first and second options are possible, in which it is advisable that:

- выделение аллогенных мезенхимальных клеток производили из пуповины новорожденного после нормальных родов на 38-40 недели гестации.- the allocation of allogeneic mesenchymal cells was performed from the umbilical cord of a newborn after normal birth at 38-40 weeks of gestation.

Препарат для клеточной терапии при лечении заболеваний нервной системы включает полученную из пуповины новорожденного культуру стволовых клеток для парентерального введения их пациенту, при этом он получен с возможностью выделения культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в соответствии со способом по первому варианту, а количество аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в стерильном физиологическом растворе - в диапазоне от 1 до 5 млн клеток в 5 мл раствора.The preparation for cell therapy in the treatment of diseases of the nervous system includes a stem cell culture obtained from the umbilical cord of a newborn for parenteral administration to a patient, while it is prepared with the possibility of isolating a culture of allogeneic mesenchymal stem cells in accordance with the method of the first embodiment, and the number of allogeneic mesenchymal stem cells in sterile saline solution - in the range from 1 to 5 million cells in 5 ml of solution.

Препарат для клеточной терапии при лечении заболеваний нервной системы включает полученную из плаценты новорожденного культуру стволовых клеток для парентерального введения их пациенту, при этом он получен с возможностью выделения культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в соответствии со способом по второму варианту, а количество аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в стерильном физиологическом растворе препарате - в диапазоне от 1 до 5 млн клеток в 5 мл раствора.The preparation for cell therapy in the treatment of diseases of the nervous system includes a stem cell culture obtained from the placenta of a newborn for parenteral administration to a patient, while it is prepared with the possibility of isolating a culture of allogeneic mesenchymal stem cells in accordance with the method of the second embodiment, and the number of allogeneic mesenchymal stem cells in sterile saline preparation - in the range from 1 to 5 million cells in 5 ml of solution.

Для клеточной терапии неврологических заболеваний возникла необходимость получения мезенхимальных клеток из плаценты и/или пуповины новорожденного человека (с согласия роженицы) и их криоконсервации и хранения с возможностью дальнейшего использования.For cell therapy of neurological diseases, it became necessary to obtain mesenchymal cells from the placenta and / or umbilical cord of a newborn (with the consent of the woman in labor) and their cryopreservation and storage with the possibility of further use.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА ПО ПЕРВОМУ ВАРИАНТУ (клеточный материал из пуповины человека: получение, культивирование, хранение и транспортировка).EXAMPLE OF SPECIFIC IMPLEMENTATION OF THE METHOD FOR THE FIRST OPTION (cellular material from the human umbilical cord: production, cultivation, storage and transportation).

1. Тестирование донора.1. Donor testing.

Перед забором биологического материала проводится тестирование донора.Before sampling the biological material, a donor is tested.

Требования к забору крови для тестирования:Blood sampling requirements for testing:

1. Забор крови должен осуществляться с соблюдением всех правил асептики и антисептики.1. Blood sampling should be carried out in compliance with all the rules of asepsis and antiseptics.

2. Материал забирается в 2 пробирки по 5 миллилитров каждая.2. Material is collected in 2 test tubes of 5 milliliters each.

3. Хранение и транспортировка забранной крови должны осуществляться в специальных герметичных пробирках (вакутейнерах).3. Storage and transportation of collected blood should be carried out in special sealed tubes (vakuteynerov).

4. Материал должен быть доставлен в культуральную лабораторию не позднее чем через 24 часа от момента забора.4. Material must be delivered to the culture laboratory no later than 24 hours from the time of collection.

5. При краткосрочном хранении до транспортировки и при транспортировке обязательно соблюдение температурного режима от +2°С до +8°С.5. For short-term storage before transportation and during transportation, it is imperative that the temperature regime is observed from + 2 ° C to + 8 ° C.

Образцы крови доноров исследуются на наличие маркеров следующих инфекционных агентов:Blood samples of donors are examined for the presence of markers of the following infectious agents:

- вирусов гепатита В и С;- hepatitis B and C viruses;

- вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типов;- human immunodeficiency virus (HIV) types 1 and 2;

- вируса герпеса простого 1, 2 и 6 типов;- herpes simplex virus types 1, 2 and 6;

- вируса Эпштейна-Барр;- Epstein-Barr virus;

- цитомегаловируса;- cytomegalovirus;

- Toxoplasma Gondi;- Toxoplasma Gondi;

- сифилиса.- syphilis.

При заборе пуповины дополнительно, к вышеперечисленным анализам образцов крови, донорам (матерям) проводится исследование соскоба из цервикального канала на наличие маркеров уреоплазмы, хламидии и микоплазмы.When taking the umbilical cord, in addition to the above analyzes of blood samples, donors (mothers) are examined for scraping from the cervical canal for the presence of markers of ureoplasma, chlamydia and mycoplasma.

Выявление таких инфекций, как ВИЧ, сифилис, а также острых форм гепатитов В и С, является абсолютным противопоказанием для культивирования биологического материала и введения полученных клеток реципиенту.The detection of infections such as HIV, syphilis, as well as acute forms of hepatitis B and C, is an absolute contraindication for the cultivation of biological material and the introduction of the obtained cells to the recipient.

В случае выявления других инфекционных агентов у донора либо при наличии антител к ним решение о культивировании биологического материала и возможности введения клеточного препарата реципиенту принимает врач.If other infectious agents are detected in the donor or in the presence of antibodies to them, the doctor makes a decision on the cultivation of biological material and the possibility of introducing a cell preparation to the recipient.

В нашем исследовании выявление любых инфекционных агентов или антител к ним являлось абсолютным противопоказанием для культивирования биологического материала.In our study, the identification of any infectious agents or antibodies to them was an absolute contraindication for the cultivation of biological material.

2. Забор биологического материала.2. The intake of biological material.

Образцы пуповины человека собирют после нормальных родов на 38-40 недели гестации. После перевязки и перерезания пуповину помещают в стерильный контейнер, содержащий раствор Хенкса с добавлением пенициллина 100 мг/мл, стрептомицина 100 мг/мл и амфотерицина 100 мг/мл.Samples of the human umbilical cord are collected after normal delivery at 38–40 weeks of gestation. After ligation and cutting, the umbilical cord is placed in a sterile container containing Hanks solution with the addition of penicillin 100 mg / ml, streptomycin 100 mg / ml and amphotericin 100 mg / ml.

Образец помещается в стерильную изопропиленовую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл, заполненную средой для транспортировки биоматериала (например, среда Хенкса или физ. р-р с 10% аутосыворотки с добавлением антибиотика и антимикотика). Пробирка с биоматериалом помещается в термос со льдом или в сумку-холодильник, где поддерживается температура +2 - +8°С. Материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 24 часов.The sample is placed in a sterile isopropylene tube with a 15 ml screw cap filled with biomaterial transport medium (for example, Hanks medium or physical solution with 10% autoserum with the addition of antibiotic and antimycotics). The test tube with biomaterial is placed in a thermos with ice or in a cooler bag, where the temperature is maintained at +2 - + 8 ° С. Material must be delivered to the laboratory within 24 hours.

Биоматериал принимается только при наличии минимум 10 мл цельной крови для тестирования на инфекционные возбудители. Кровь транспортируется в тех же условиях, что и образцы биоматериала, т.е. стерильно и в холоде (+2 - +8°С).Biomaterial is taken only if there is a minimum of 10 ml of whole blood for testing for infectious pathogens. Blood is transported under the same conditions as samples of biomaterial, i.e. sterile and in cold (+2 - + 8 ° С).

В среднем на получение достаточного количества клеток для тестирования на инфекционные возбудители и на заморозку для криохранения уходит от 30-ти до 60-ти дней.On average, it takes from 30 to 60 days to get enough cells to test for infectious pathogens and to freeze for cryopreservation.

3. Получение и культивирование клеточных культур.3. Obtaining and culturing cell cultures.

Пуповину освобождают от остатков крови и тщательно промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина 100 ед./мл, 100 ед./мл амфотерицина) в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1% раствором коллагеназы 1 типа, приготовленным на среде DMEM, свободной от сыворотки, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок, который ресуспензируют в ростовой среде:The umbilical cord is freed from blood residues and washed thoroughly in a Versen solution with antibiotics (100 units / ml penicillin, 100 units / ml streptomycin 100 units / ml, 100 units / ml amphotericin) for 1 hour at room temperature on a shaker veins cannulated on both sides and washed first with Hanks solution and then with 0.1% type 1 collagenase solution prepared on serum free DMEM and incubated at 37 ° C for 30 minutes, then the umbilical cord is mechanically exposed collect the separated cells, washing them with by the Hanks solution obtained after mechanical action and washing, the cell suspension is centrifuged at 1000 rpm for 5 min, obtaining a precipitate that is resuspended in a growth medium:

DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл. пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия. Ресуспензированный осадок в среде переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду 2 раза в неделю. При достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3DMEM containing 10% fetal bovine serum, 100 units / ml. penicillin, 100 units / ml streptomycin, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate. The resuspended precipitate in the medium is transferred to culture dishes and cultured until a monolayer is formed, changing the growth medium 2 times a week. Upon reaching the monolayer, the cells are subcultured in a ratio of 1: 3

Для приготовления клеточного материала перед введением монослой клеток обрабатывают смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина (1:1) в течение 20 мин при 37°С, получая клеточную суспензию, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2. Затем клетки осаждают центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в стерильной среде для транспортировки в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл, получая готовый препарат. Непосредственно перед введением клеточный материал необходимо перевести в стерильный физиологический раствор.To prepare the cellular material, before the introduction of the monolayer, the cells are treated with a mixture of Versen's solution and 0.25% trypsin solution (1: 1) for 20 min at 37 ° C, obtaining a cell suspension, which is then washed three times with physiological saline with a pH of 7.2. Cells are then pelleted by centrifugation for 5 minutes at 1000 rpm. The precipitate is resuspended in a sterile medium for transportation in an amount of 1-5 million cells in 5 ml, obtaining the finished product. Immediately prior to administration, cellular material must be transferred to sterile saline.

4. Типирование полученных культур клеток.4. Typing of the obtained cell cultures.

Типирование клеточных культур, т.е. исследование того, к каким цитофенотипам относятся культивируемые клетки, осуществляют с помощью микроскопии неокрашенных препаратов и путем детекции специфических белков-маркеров цитофенотипов методами иммуноцитохимии и проточной цитофлуорометрии.Typing of cell cultures, i.e. the study of which cytophenotypes the cultured cells belong to is carried out using microscopy of unpainted preparations and by detection of specific protein markers of cytophenotypes by immunocytochemistry and flow cytometry.

Все клетки экспрессировали виментин-белок цитоплазматического скелета клеток, что является характерным для клеток мезенхимального ряда.All cells expressed the vimentin protein of the cytoplasmic skeleton of cells, which is characteristic of mesenchymal cells.

Полученные культуры были также исследованы на эспрессию маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD44 (НСАМ), CD49b (α₂β₁ integrin), CD54 (ICAM), CD90 (Thy-1), CD105 (endoglin), CD117 (c-kit). Иммуноцитохимическое окрашивание клеток пуповины не выявило различий в уровне экспрессии маркеров CD49b, CD90, CD117. Значительное количество клеток полученных культур экспрессировали маркер CD117 на уровне, близком к фоновому.The resulting cultures were also tested for the expression of mesenchymal stem cell markers CD44 (HCAM), CD49b (α ₂ β ₁ integrin), CD54 (ICAM), CD90 (Thy-1), CD105 (endoglin), CD117 (c-kit). Immunocytochemical staining of umbilical cord cells did not reveal differences in the expression level of markers CD49b, CD90, CD117. A significant number of cells of the obtained cultures expressed the marker CD117 at a level close to the background.

Уровень экспрессии CD49b был низким. Уровень экспрессии CD90 также был низким.The expression level of CD49b was low. The expression level of CD90 was also low.

В комплекс белков CD44 входит белок pgpl, являющийся одним из белков-транспортеров, обеспечивающих мультилекарственную устойчивость клеток. Известно, что значительное количество таких молекул, позволяющих поддерживать внутриклеточный гомеостаз и высокий уровень пролиферации даже в неблагоприятных условиях, выявляется на стволовых и прогениторных клетках. Высокий уровень экспрессии CD44 обнаруживался в культурах клеток пуповины, что является свидетельством значительного количества стволовых и прогениторных клеток в этих культурах.The CD44 protein complex includes the pgpl protein, which is one of the transporter proteins that provide multidrug resistance of cells. It is known that a significant number of such molecules, allowing to maintain intracellular homeostasis and a high level of proliferation even under adverse conditions, are detected on stem and progenitor cells. A high level of expression of CD44 was found in umbilical cord cultures, which is evidence of a significant number of stem and progenitor cells in these cultures.

Значительная часть популяции клеток пуповины экспрессировала нестин - маркер незрелых и прогениторных клеток.A significant portion of the umbilical cord cell population expressed nestin, a marker of immature and progenitor cells.

Значительная часть популяции клеток пуповины экспрессировала также коллагены I и II типов. В культурах клеток пуповины 20% экспрессировали маркер эндотелиоцитов - фактор фон Виллибранда.A significant portion of the umbilical cord population also expressed type I and II collagen. In umbilical cord cell cultures, 20% expressed an endotheliocyte marker, von Willibrand factor.

Было обнаружено, что, помимо вышеперечисленных маркеров, мезенхимальные клетки пуповины выделяли широкий спектр ангиогенных факторов.It was found that, in addition to the markers listed above, umbilical cord mesenchymal cells secreted a wide range of angiogenic factors.

Уровень экспрессии белков главного комплекса гистосовместимости (МНС I класса) в культурах клеток - важный показатель, который необходимо учитывать при оценке пригодности клеток для трансплантации. Культура клеток пуповины была неоднородна. В ней встречались мелкие клетки со средним уровнем экспрессии МНС I класса, а также крупные распластанные клетки, экспрессирующие эти белки на фоновом уровне. Полученные результаты позволяют обосновать применение клеток пуповины для аллогенных трасплантаций в связи с низким уровнем иммунного ответа организма на введение этих клеток.The expression level of proteins of the main histocompatibility complex (MHC class I) in cell cultures is an important indicator that must be taken into account when assessing the suitability of cells for transplantation. The umbilical cord culture was heterogeneous. It contained small cells with an average expression level of MHC class I, as well as large flattened cells expressing these proteins at the background level. The results obtained allow us to justify the use of umbilical cord cells for allogeneic transplantations due to the low level of the body's immune response to the introduction of these cells.

5. Потенциал дифференцировки клеток пуповины.5. The potential for differentiation of umbilical cord cells.

Мезенхимальные клетки пуповины являются мультипотентными, что подтвердилось дифференцировкой полученных культур в различные ткани, в том числе в нервную, жировую, хрящевую, костную.The umbilical cord mesenchymal cells are multipotent, which was confirmed by the differentiation of the resulting cultures into various tissues, including nervous, fat, cartilage, and bone.

Дифференцировку клеток плаценты в нервную ткань проводили в среде, содержащей глюкозу, трансферин, прогестрон, путресцин, хлорид селена, глутамин, бикарбонат натрия, HEPES, гепарин, EGF. По окончании времени дифференцировки клетки окрашивали антителами к Tuj I, GFAP, Nestin, MAP-2, (ЗШ-тубулину. Часть клеток экспрессировала эти маркеры.The differentiation of placental cells into nerve tissue was carried out in a medium containing glucose, transferrin, progestron, putrescine, selenium chloride, glutamine, sodium bicarbonate, HEPES, heparin, EGF. At the end of the time of differentiation, the cells were stained with antibodies to Tuj I, GFAP, Nestin, MAP-2, (ZS-tubulin. Some cells expressed these markers.

Дифференцировку полученных культур в жировую ткань проводили в среде, содержащей гидрокортизон, изобутилметилксантин, индометацин. Клетки пуповины накапливали жировые вакуоли, окрашенные в красный цвет жировым красным.The differentiation of the resulting cultures into adipose tissue was carried out in a medium containing hydrocortisone, isobutylmethylxanthine, indomethacin. Umbilical cord cells accumulated fat vacuoles stained red with fat red.

Дифференцировку полученных культур в костную ткань проводили в среде без сыворотки, содержащей аскорбиновую кислоту, глицерофосфат кальция, дексаметазон, в течение 3 недель. В клетках пуповины увеличивалась экспрессия маркерных белков остеобластов (остеонектина, остеопонтина и костного сиалопротеина), однако они не образовывали локусов окостенения.The differentiation of the obtained cultures into bone tissue was carried out in serum-free medium containing ascorbic acid, calcium glycerophosphate, dexamethasone, for 3 weeks. In umbilical cord cells, the expression of marker proteins of osteoblasts (osteonectin, osteopontin and bone sialoprotein) increased, but they did not form ossification loci.

Дифференцировку полученных культур в хрящевую ткань проводили в среде без сыворотки, содержащей дексаметазон, пролин, пируват, TGF-bl, TGF-ЬЗ, в течение 3 недель. Через 3 недели в культуре появлялись клетки, которые давали положительную окраску на сафранин О.The differentiation of the resulting cultures into cartilage was carried out in serum-free medium containing dexamethasone, proline, pyruvate, TGF-bl, TGF-L3, for 3 weeks. After 3 weeks, cells appeared in the culture that gave a positive color to safranin O.

6. Тестирование полученных культур клеток.6. Testing the resulting cell cultures.

Полученные культуры клеток проходили следующие испытания.The resulting cell cultures underwent the following tests.

1. Вирусологические исследования согласно протоколу на наличие маркеров вирусов гепатитов В и С, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типов, вируса герпеса простого 1, 2 и 6 типов, вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса, Toxoplasma Gondi.1. Virological studies according to the protocol for the presence of markers of hepatitis B and C viruses, human immunodeficiency virus (HIV) types 1 and 2, herpes simplex virus types 1, 2 and 6, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, Toxoplasma Gondi.

2. Бактериологическое исследование согласно протоколу на наличие аэробной и анаэробной микрофлоры, а также микроскопических грибов.2. Bacteriological research according to the protocol for the presence of aerobic and anaerobic microflora, as well as microscopic fungi.

На каждый клеточный препарат выдается паспорт соответствия с указанием результатов обследования культуры, объема, концентрации клеток, срока годности.For each cell preparation, a compliance certificate is issued indicating the results of the examination of the culture, volume, cell concentration, shelf life.

7. Криохранение клеточного материала.7. Cryopreservation of cellular material.

Клеточный материал переводится в среду для заморозки (ДМСО с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка) и помещается на длительное хранение в жидкий азот. Минимальное количество клеток, замораживаемых и помещаемых на хранение, 3 млн. Максимальный предел не установлен.Cellular material is transferred to freezing medium (DMSO supplemented with 10% fetal calf serum) and placed into long-term storage in liquid nitrogen. The minimum number of cells frozen and put into storage is 3 million. The maximum limit has not been established.

8. Приготовление суспензии клеток перед введением.8. Preparation of cell suspension before administration.

Мезенхимальные клетки пуповины переводят в суспензию путем трипсинизации, трижды промывают физиологическим раствором (рН 7,2) и суспендируют в забуференном физиологическом растворе в концентрации 1-5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора. Все операции проводят в стерильных условиях культурального бокса.The umbilical cord mesenchymal cells are suspended into the suspension by trypsinization, washed three times with physiological saline (pH 7.2) and suspended in buffered saline at a concentration of 1-5 million cells in 5 ml of physiological saline. All operations are carried out under sterile conditions of the culture box.

9. Кратковременное хранение и транспортировка клеточной суспензии.9. Short-term storage and transportation of cell suspension.

Кратковременное хранение и транспортировка клеточного материала проводились в стерильном вакутейнере (пробирка для забора крови) на холоду (+2 - +8°С). Для соблюдения температурного режима при транспортировке необходимо использовать термос или сумку-холодильник с охлаждающим агентом внутри. При соблюдении этих правил клеточный материал сохраняет свою жизнеспособность не менее 80% в течение 36-ти часов.Short-term storage and transportation of cellular material was carried out in a sterile vakuteyner (test tube for blood sampling) in the cold (+2 - + 8 ° C). To comply with the temperature regime during transportation, you must use a thermos or cooler bag with a cooling agent inside. Subject to these rules, the cellular material retains its viability of at least 80% for 36 hours.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА ПО ВТОРОМУ ВАРИАНТУ (клеточный материал из плаценты человека: получение, культивирование, хранение и транспортировка).EXAMPLE OF SPECIFIC IMPLEMENTATION OF THE METHOD FOR THE SECOND OPTION (cellular material from human placenta: production, cultivation, storage and transportation).

Тестирование донора и забор биологического материала осуществляют так же, как в примере осуществления способа по первому варианту по пунктам 1 и 2, при этом в качестве биологического материала используют плаценту.Testing of the donor and sampling of biological material is carried out in the same way as in the example embodiment of the method according to the first embodiment according to paragraphs 1 and 2, with the placenta being used as biological material.

Плаценту максимально возможно освобождают от остатков крови и тщательно промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина 100 ед./мл, 100 ед./мл амфотерицина) в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере, затем нарезают ткань плаценты на куски размером 1 см³ и обрабатывают их 0,1% раствором трипсина, приготовленным на среде DMEM, свободной от сыворотки, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани плаценты, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса. Полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок, который ресуспензируют в ростовой среде: DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия. Ресуспензированный осадок в среде переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду 2 раза в неделю. При достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3.The placenta is maximally freed from blood residues and washed thoroughly in Versen's solution with the addition of antibiotics (100 units / ml penicillin, 100 units / ml streptomycin 100 units / ml, 100 units / ml amphotericin) for 1 hour at room temperature on a shaker, then cut the placental tissue into pieces 1 cm ³ in size and treat them with a 0.1% trypsin solution prepared in serum free DMEM and incubate at 37 ° C for 30 minutes, then perform mechanical action on the placental tissue collect the separated cells by washing I have them with Hanks solution. The cell suspension obtained after mechanical action and washing is centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes to obtain a precipitate that is resuspended in a growth medium: DMEM containing 10% fetal cattle serum, 100 units / ml penicillin, 100 units / ml of streptomycin, 2 mm glutamine, 1 mm sodium pyruvate. The resuspended precipitate in the medium is transferred to culture dishes and cultured until a monolayer is formed, changing the growth medium 2 times a week. Upon reaching the monolayer, the cells are reseeded in a ratio of 1: 3.

Для приготовления клеточного материала перед введением монослой клеток обрабатывают смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина (1:1) в течение 20 мин при 37°С, получая клеточную суспензию, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2. Затем клетки осаждают центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в стерильной среде для транспортировки в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл (до 50-250 млн клеток в 250 мл). Непосредственно перед введением клеточный материал необходимо перевести в стерильный физиологический раствор.To prepare the cellular material, before the introduction of the monolayer, the cells are treated with a mixture of Versen's solution and 0.25% trypsin solution (1: 1) for 20 min at 37 ° C, obtaining a cell suspension, which is then washed three times with physiological saline with a pH of 7.2. Cells are then pelleted by centrifugation for 5 minutes at 1000 rpm. The pellet is resuspended in a sterile medium for transport in an amount of 1-5 million cells in 5 ml (up to 50-250 million cells in 250 ml). Immediately prior to administration, cellular material must be transferred to sterile saline.

Все клетки экспрессировали виментин - белок цитоплазматического скелета клеток, что является характерным для клеток мезенхимального ряда.All cells expressed vimentin, a protein of the cytoplasmic skeleton of cells, which is characteristic of mesenchymal cells.

Полученные культуры были также исследованы на эспрессию маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD44 (НСАМ), CD49b (α₂β₁ integrin), CD54 (ICAM), CD90 (Thy-1), CD 105 (endoglin), CD 117 (c-kit). Иммуноцитохимическое окрашивание клеток плаценты не выявило различий в уровне экспрессии маркеров CD49b, CD90, CD 117. Значительное количество клеток полученных культур экспрессировали маркер CD117 на уровне, близком к фоновому.The resulting cultures were also tested for the expression of mesenchymal stem cell markers CD44 (HCAM), CD49b (α ₂ β ₁ integrin), CD54 (ICAM), CD90 (Thy-1), CD 105 (endoglin), CD 117 (c-kit) . Immunocytochemical staining of placenta cells did not reveal differences in the expression level of markers CD49b, CD90, CD 117. A significant number of cells of the obtained cultures expressed the marker CD117 at a level close to the background.

В комплекс белков CD44 входит белок pgpl, являющийся одним из белков-транспортеров, обеспечивающих мультилекарственную устойчивость клеток. Известно, что значительное количество таких молекул, позволяющих поддерживать внутриклеточный гомеостаз и высокий уровень пролиферации даже в неблагоприятных условиях, выявляется на стволовых и прогениторных клетках.The CD44 protein complex includes the pgpl protein, which is one of the transporter proteins that provide multidrug resistance of cells. It is known that a significant number of such molecules, allowing to maintain intracellular homeostasis and a high level of proliferation even under adverse conditions, are detected on stem and progenitor cells.

Высокий уровень экспрессии CD44 обнаруживался в культурах клеток плаценты, что является свидетельством значительного количества стволовых и прогениторных клеток в этих культурах.A high level of expression of CD44 was found in placental cell cultures, which is evidence of a significant number of stem and progenitor cells in these cultures.

Значительная часть популяции клеток плаценты экспрессировала нестин - маркер незрелых и прогениторных клеток.A significant part of the placenta cell population expressed nestin, a marker of immature and progenitor cells.

Было обнаружено, что, помимо вышеперечисленных маркеров, клетки плаценты выделяли широкий спектр ангиогенных факторов.It was found that, in addition to the above markers, placental cells secreted a wide range of angiogenic factors.

Уровень экспрессии белков главного комплекса гистосовместимости (МНС I класса) в культурах клеток - важный показатель, который необходимо учитывать при оценке пригодности клеток для трансплантации. Культура клеток плаценты была неоднородна. В ней встречались клетки со средним уровнем экспрессии МНС I класса, а также крупные распластанные клетки, экспрессирующие эти белки на фоновом уровне. Полученные результаты позволяют предположить возможность применения клеток плаценты для аллогенных трасплантаций в связи с низким уровнем иммунного ответа организма на введение этих клеток, что будет подтверждено при отработке технологии применения клеточного материала.The expression level of proteins of the main histocompatibility complex (MHC class I) in cell cultures is an important indicator that must be taken into account when assessing the suitability of cells for transplantation. The culture of the placenta cells was heterogeneous. It met cells with an average level of expression of MHC class I, as well as large flattened cells expressing these proteins at the background level. The obtained results suggest the possibility of using placenta cells for allogeneic transplantations due to the low level of the body's immune response to the introduction of these cells, which will be confirmed by testing the technology of using cellular material.

5. Потенциал дифференцировки клеток плаценты.5. The potential for differentiation of placental cells.

В связи с предположением о присутствии в полученных культурах клеток плаценты большого количества прогениторных и стволовых клеток проведена оценка способности клеток в этих культурах дифференцироваться в жировую, костную, хрящевую, мышечную, нервную ткань и в гепатоциты.In connection with the assumption of the presence of a large number of progenitor and stem cells in the obtained placental cell cultures, the ability of the cells in these cultures to differentiate into adipose, bone, cartilage, muscle, nervous tissue and hepatocytes was evaluated.

Дифференцировку клеток плаценты в нервную ткань проводили в среде, содержащей глюкозу, трансферин, прогестрон, путресцин, хлорид селена, глутамин, бикарбонат натрия, HEPES, гепарин, EOF, bFGF. По окончании времени дифференцировки клетки окрашивали антителами к Tuj I, GFAP, Nestin, MAP-2 (Ш1-тубулину. Часть клеток экспрессировала эти маркеры.The differentiation of placental cells into nerve tissue was performed in a medium containing glucose, transferrin, progestron, putrescine, selenium chloride, glutamine, sodium bicarbonate, HEPES, heparin, EOF, bFGF. At the end of the time of differentiation, the cells were stained with antibodies to Tuj I, GFAP, Nestin, MAP-2 (Ш1-tubulin. Some cells expressed these markers.

Дифференцировку полученных культур в жировую ткань проводили в среде, содержащей гидрокортизон, изобутилметилксантин, индометацин. Клетки плаценты накапливали жировые вакуоли, окрашенные в красный цвет жировым красным.The differentiation of the resulting cultures into adipose tissue was carried out in a medium containing hydrocortisone, isobutyl methylxanthine, indomethacin. Placental cells accumulated fat vacuoles stained red with fat red.

Дифференцировку полученных культур в костную ткань проводили в среде без сыворотки, содержащей аскорбиновую кислоту, глицерофосфат кальция, дексаметазон, в течение 3 недель. Клетки плаценты экспрессировали маркерные белки остеобластов (остеонектин, остеопонтин и костный сиалопротеин), существенно увеличивалась активность щелочной фосфатазы, что свидетельствует о способности этих клеток дифференцироваться в клетки костной ткани.The differentiation of the obtained cultures into bone tissue was carried out in serum-free medium containing ascorbic acid, calcium glycerophosphate, dexamethasone, for 3 weeks. The placenta cells expressed marker proteins of osteoblasts (osteonectin, osteopontin and bone sialoprotein), the activity of alkaline phosphatase increased significantly, which indicates the ability of these cells to differentiate into bone tissue cells.

Дифференцировку полученных культур в хрящевую ткань проводили в среде без сыворотки, содержащей дексаметазон, пролин, пируват, TGF-b1, TGF-b3, в течение 3 недель. Через 3 недели в культуре появлялись клетки, которые давали положительную окраску на сафранин О.Differentiation of the obtained cultures into cartilage was carried out in serum-free medium containing dexamethasone, proline, pyruvate, TGF-b1, TGF-b3, for 3 weeks. After 3 weeks, cells appeared in the culture that gave a positive color to safranin O.

Дифференцировку полученных культур в мышечную ткань проводили в среде без эмбриональной телячьей сыворотки, но с добавлением лошадиной сыворотки, содержащей дексаметазон, гидрокортизон, в течение 3 недель. Идентификацию мышечных клеток проводили окрашиванием антителами к MyoDI, миогенину, тяжелой цепи миозина. Часть клеток в культуре экспрессировала эти маркеры.The differentiation of the resulting cultures in muscle tissue was carried out in a medium without fetal calf serum, but with the addition of horse serum containing dexamethasone, hydrocortisone, for 3 weeks. Muscle cells were identified by staining with antibodies to MyoDI, myogenin, myosin heavy chain. Part of the cells in the culture expressed these markers.

Дифференцировку клеток плаценты в гепатоциты проводили в среде, содержащей HGF, OSM, дексаметазон. После 3 недель дифференцировки методами проточной цитометрии и иммуноцитохимии было установлено, что некоторая часть клеток в культуре начинает экспрессировать существенные количества альбумина, что является одним из показателей дифференцировки клеток в гепатоциты.The differentiation of placental cells into hepatocytes was carried out in a medium containing HGF, OSM, dexamethasone. After 3 weeks of differentiation by flow cytometry and immunocytochemistry, it was found that some of the cells in the culture begin to express significant amounts of albumin, which is one of the indicators of differentiation of cells into hepatocytes.

Таким образом, клетки плаценты являются мультипотентными.Thus, placental cells are multipotent.

Полученные культуры клеток проходили следующие испытания:The resulting cell culture passed the following tests:

1. Вирусологические исследования согласно протоколу на наличие маркеров вирусов гепатитов В и С, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типов, вируса герпеса простого 1, 2 и 6 типов, вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса, Toxoplasma Gondi, Micoplasma hominis, Micoplasma pneumonia, Ureaplasma urealiticum, Ureaplasma parvum.1. Virological studies according to the protocol for the presence of markers of hepatitis B and C viruses, human immunodeficiency virus (HIV) types 1 and 2, herpes simplex virus types 1, 2 and 6, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, Toxoplasma Gondi, Micoplasma hominis, Micoplasma pneumonia, Ureaplasma urealiticum, Ureaplasma parvum.

На каждый клеточный материал выдается паспорт соответствия с указанием результатов обследования культуры, объема, концентрации клеток, срока годности.For each cellular material, a compliance certificate is issued indicating the results of the examination of the culture, volume, cell concentration, shelf life.

Криохранение клеточного материала, приготовление суспензии клеток перед введением, кратковременное хранение и транспортировка клеточной суспензии осуществляется так же, как в приведенном первом примере.Cryopreservation of cellular material, preparation of a cell suspension before administration, short-term storage and transportation of the cell suspension is carried out in the same way as in the first example.

Все вышеперечисленное позволяет считать заявленный способ включающим наиболее современную технологию «Получения, культивирования, хранения и транспортировки клеток из пуповины человека» новой, соответствующей изобретательскому уровню, оригинальной и рекомендуемой к использованию в лабораторной практике.All of the above allows us to consider the claimed method including the most modern technology "Obtaining, culturing, storage and transportation of cells from the umbilical cord of a person" new, corresponding to the inventive step, original and recommended for use in laboratory practice.

Предлагаемая технология является высокоэффективной, не требующей больших временных и финансовых затрат. Ее преимущества - научная обоснованность, безопасность и эффективность, подтвержденные в проведенных доклинических исследованиях в строгом соответствии с существующими нормативно-правовыми актами.The proposed technology is highly efficient, not requiring large time and financial costs. Its advantages are scientific validity, safety and efficacy, confirmed in preclinical studies in strict accordance with existing regulatory legal acts.

Готовая суспензия клеток (выделенных из пуповины и/или плаценты новорожденных) вводится пациенту посредством парентерального введения в дозировке от 1 млн до 250 млн клеток в 5-250 мл физиологического раствора соответственно в зависимости от заболевания, тяжести состояния больного и его массы тела. Парентеральное введение означает внутривенное, подкожное, эндолюмбальное, внутримышечное введение клеточной суспензии. Как показали исследования, наиболее предпочтительным является внутривенный способ введения. Таким образом, полученный заявленным способом препарат имеет расширенные функциональные возможности его введения пациенту по сравнению с другими препаратами.The finished suspension of cells (isolated from the umbilical cord and / or placenta of the newborn) is administered to the patient through parenteral administration in a dosage of 1 million to 250 million cells in 5-250 ml of physiological saline, respectively, depending on the disease, the severity of the patient's condition and his body weight. Parenteral administration means intravenous, subcutaneous, endolumbar, intramuscular administration of a cell suspension. Studies have shown that the intravenous route of administration is most preferred. Thus, the preparation obtained by the claimed method has the expanded functionality of its administration to the patient in comparison with other drugs.

Готовая суспензия клеток (выделенных из пуповины и/или плаценты новорожденных) вводится следующими способами.The finished suspension of cells (isolated from the umbilical cord and / or placenta of the newborn) is introduced in the following ways.

По первому варианту готовая суспензия клеток (выделенных из пуповины и/или плаценты новорожденных) вводится с помощью шприца внутривенно в кубитальную вену в положении пациента лежа или сидя без предварительной анестезии. Доза вводимого препарата составит от 1000000 до 5000000 клеток в 5,0 мл физиологического раствора или до 10000000 клеток в 10,0 мл физиологического раствора.According to the first embodiment, the finished suspension of cells (isolated from the umbilical cord and / or placenta of the newborn) is injected intravenously into the cubital vein in the patient’s position while lying or sitting without prior anesthesia. The dose of the injected drug will be from 1,000,000 to 5,000,000 cells in 5.0 ml of saline or up to 10,000,000 cells in 10.0 ml of saline.

По второму варианту готовая суспензия вводится пациентам путем подкожного введения культуры в положении пациента лежа или сидя без предварительной анестезии. Доза вводимого препарата составит от 1000000 до 5000000 клеток в 5,0 мл физиологического раствора.According to the second option, the finished suspension is administered to patients by subcutaneous injection of the culture in the patient's position while lying or sitting without prior anesthesia. The dose of the drug administered will be from 1,000,000 to 5,000,000 cells in 5.0 ml of physiological saline.

По третьему варианту готовая суспензия вводится пациентам с помощью системы для внутривенного введения (капельницы) внутривенно-капельно медленно в кубитальную вену в положении пациента лежа без предварительной анестезии со средней скоростью 60 капель в минуту. Доза вводимого препарата составит от 50000000 до 250000000 в 50-250 мл физиологического раствора.According to the third option, the finished suspension is administered to patients using the intravenous injection system (dropper) intravenously dropwise into the cubital vein in the patient's supine position without prior anesthesia at an average rate of 60 drops per minute. The dose of the drug administered will be from 50,000,000 to 250,000,000 in 50-250 ml of physiological saline.

По четвертому варианту готовая суспензия вводится пациентам путем внутримышечного введения культуры в положении пациента лежа на животе без предварительной анестезии. Доза вводимого препарата составит от 1000000 до 5000000 клеток в 5,0 мл физиологического раствора.In the fourth embodiment, the finished suspension is administered to patients by intramuscular injection of the culture in the patient’s supine position without prior anesthesia. The dose of the drug administered will be from 1,000,000 to 5,000,000 cells in 5.0 ml of physiological saline.

По пятому варианту готовая суспензия вводится пациентам путем эндолюмбального введения культуры. В положении пациента лежа на боку с приведенной к груди головой и к животу коленями в стерильных условиях обрабатывалась кожа йодом, затем протиралась 96% спиртовым раствором. После предварительной анестезии кожи между остистыми отростками III-IV поясничных позвонков 0,5% раствором новокаина выполнялся прокол одноразовой стерильной пункционной иглой в этом месте, где спинного мозга уже нет и где внутри позвоночного канала находятся корешки конского хвоста, омываемые ликвором в конечной цистерне. Спинно-мозговая жидкость стекала каплями в стерильную пробирку до объема 3 мл, после чего игла изымалась, а место манипуляции заклеивалось стерильной салфеткой. Доза вводимого препарата составит от 1000000 до 5000000 клеток в 5,0 мл физиологического раствора.In the fifth embodiment, the finished suspension is administered to patients by endolumbar administration of the culture. In the patient’s position, lying on its side with the head brought to the chest and to the stomach, the skin was treated with iodine under knees under sterile conditions, then it was rubbed with 96% alcohol solution. After preliminary anesthesia of the skin between the spinous processes of the III-IV lumbar vertebrae with a 0.5% novocaine solution, a single-use sterile puncture needle was punctured in this place where the spinal cord is no longer and where the cauda equina roots are washed by cerebrospinal fluid in the final tank. Cerebrospinal fluid was dripped dropwise into a sterile tube to a volume of 3 ml, after which the needle was removed, and the manipulation site was sealed with a sterile cloth. The dose of the drug administered will be from 1,000,000 to 5,000,000 cells in 5.0 ml of physiological saline.

Сеанс клеточной терапии проводится в процедурном кабинете.A cell therapy session is held in the treatment room.

Введение препарата производится с помощью шприцов объемом от 5,0 до 20,0 мл со специальными иглами.The drug is administered using syringes from 5.0 to 20.0 ml in volume with special needles.

Курс клеточной терапии с использованием клеточного материала рассчитан на 1-5 процедуры, в случае многократной (2-5) клеточной терапии интервал введения составляет не менее 1 недели и не более 6 месяцев.The course of cell therapy using cellular material is designed for 1-5 procedures, in the case of multiple (2-5) cell therapy, the administration interval is at least 1 week and no more than 6 months.

Эффект от введения препарата начинает проявляться уже через 1 месяц и постепенно нарастает, достигая стойкого клинического эффекта через 3-6 месяцев от момента первой инъекции.The effect of the drug administration begins to manifest itself after 1 month and gradually increases, reaching a stable clinical effect after 3-6 months from the moment of the first injection.

Было проведено открытое многоцентровое проспективное исследование 30 больных в возрасте от 32 до 45 лет с установленным в условиях стационарного обследования диагнозом рассеянный склероз, подтвержденным МРТ головного мозга, с дебютом заболевания в период не менее 3 лет до момента включение в исследование и наличием функционального неврологического дефицита (по EDSS>5 баллов). У 12 больных был установлен диагноз ремитирующего течения рассеянного склероза, у 18 - вторично-прогрессирующего.An open multicenter prospective study was conducted of 30 patients aged 32 to 45 years with a diagnosis of multiple sclerosis established in a stationary examination confirmed by MRI of the brain, with the onset of the disease at least 3 years before inclusion in the study and the presence of functional neurological deficit ( by EDSS> 5 points). In 12 patients, the diagnosis of remitting course of multiple sclerosis was established, in 18 - secondary progressive.

Больным вводили мезенхимальноподобные стволовые клетки, выделенные из пуповины и/или плаценты, в концентрации от 1-5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора внутривенно и/или внутримышечно и/или подкожно и/или эндолюмбально до 50-250 мл физиологического раствора внутривенно-капельно. Допускалась симптоматическая терапия. Больные, получавшие глюкокортикостероиды (метилпреднизолон, преднизолон), препараты интерферонов-бета (рефиб, бетаферон, авонекс), глатирамера ацетат (копаксон), из исследования были исключены.Patients were injected with mesenchymal-like stem cells isolated from the umbilical cord and / or placenta in a concentration of 1-5 million cells in 5 ml of physiological saline intravenously and / or intramuscularly and / or subcutaneously and / or endolumbally to 50-250 ml of saline intravenously . Symptomatic therapy was allowed. Patients who received glucocorticosteroids (methylprednisolone, prednisolone), interferon-beta preparations (refib, betaferon, avonex), glatiramer acetate (copaxone) were excluded from the study.

При поступлении в исследование и на 30, 90 и 180 сутки от момента введения клеточного материала проводилось: общесоматическое обследование, неврологический мониторинг, включающий анализ стандартизированной шкалы повреждений функциональных систем больных с рассеянным склерозом по D.F.Kurtzke (EDSS), шкалы NIH-NINDS, шкалу социальной приспособленности (Enviromental Status Scale), Бартель, клинический и биохимический анализы крови, ЭКГ, анализ крови и/или ликвора ПЦР на ДНК-содержащие вирусные геномы, индукторы процесса демиелинизиции (геномы вирусных гепатитов, цитомегаловируса, вируса Эпштейн-Барра), МРТ головного мозга, нейропсихологическое обследование по тестам беглости речи, 10 слов, «пятый лишний», MMSE, исследовалась оценка уровня качества жизни по специальной шкале «SF-36», ЭЭГ. Большинству пациентам (n=12) до лечения и в посттрансплантационный период исследовался количественный состав популяций и субпопуляций лимфоцитов, клетки - маркеры активации иммунной системы, реакции CD4+ и CD8+ после инкубации с нейроспецифическими белками, гуморальный иммунный ответ на ДНК и нейроспецифические белки.Upon admission to the study and on the 30th, 90th and 180th days from the moment of introduction of the cellular material, the following was performed: general examination, neurological monitoring, including analysis of the standardized scale of damage to functional systems of patients with multiple sclerosis according to DFKurtzke (EDSS), NIH-NINDS scale, social scale fitness (Enviromental Status Scale), Barthel, clinical and biochemical blood tests, ECG, PCR and / or CSF liquor analysis for DNA-containing viral genomes, demyelination inducers (viral hepatitis genomes, cyt omegalovirus, Epstein-Barr virus), MRI of the brain, neuropsychological examination by tests of fluency, 10 words, “fifth extra”, MMSE, the assessment of the quality of life on the special scale “SF-36”, EEG was studied. The majority of patients (n = 12) before treatment and in the post-transplant period studied the quantitative composition of lymphocyte populations and subpopulations, cells - markers of immune system activation, CD4 + and CD8 + reactions after incubation with neurospecific proteins, humoral immune response to DNA and neurospecific proteins.

В ходе исследования было выявлено положительное влияние терапии мезенхимальными стволовыми клетками больных рассеянным склерозом. У всех пациентов была достигнута ремиссия заболевания, обострений и тем более необходимости применения глюкокортикоидной терапии ни у кого из обследованных больных не было. Кроме того, на МР-томограммах в Т1 и Т2 режимах всех обследованных больных как через 30, 90, так и через 180 дней от момента клеточной терапии отмечается некоторый регресс старых очагов, новых активных очагов не выявлено. При динамической оценке степени тяжести по шкале EDSS через полгода введения стволовых клеток по сравнению с исходными данными отмечено статистически значимое снижение степени инвалидизации (6,4±1,6 и 4,3±0,9 соответственно, р<0,05), при этом снижение инвалидизации зарегистрировано также на 30 (6,0±1,3) и 90 сутки (5,1±1,1). Выявлено снижение уровня очаговой неврологической недостаточности по шкале NIH в 1,29 раз (3,6±0,9 при поступлении и 2,8±0,6 через полгода лечения). По шкале ESS в среднем зарегистрирован рост социальной приспособленности на 12% к концу 3 месяца исследования и на 14% к полугоду по сравнению с исходными данными (р>0,05). Анализ показателей опросника качества жизни SF-36 показал, что уже на 30 сутки после клеточной терапии практически все значения шкалы были существенно выше, чем при поступлении в исследование, к 180 дню исследования по всем базовым значениям субсфер опросника SF-36 был превышен 60 бальный барьер (субсферы «общее восприятие здоровья», «жизнеспособность» и «психическое здоровье» возросло соответственно 68,4; 69,0 и 73,8 баллов против 52,2; 49,3 и 54,7). Нейропсихологическое тестирование пациентов в динамике не дало статистически значимых результатов в связи с тем, что фоново больные имели высокие показатели. При анализе ЭЭГ всех больных выявлена положительная динамика с улучшением интегративных церебральных процессов, расширением зон представительства альфа-ритма, уменьшением выраженности диффузных изменений и межполушарной ассиметрии, более высокой средней частотой реакции усвоения ритма и уменьшением площади медленноволновой активности.The study revealed a positive effect of mesenchymal stem cell therapy in patients with multiple sclerosis. All patients achieved remission of the disease, exacerbations, and even more so, none of the examined patients needed glucocorticoid therapy. In addition, on MRI tomograms in T1 and T2 modes of all examined patients, both after 30, 90, and 180 days from the time of cell therapy, some regression of old foci is noted, no new active foci were detected. A dynamic assessment of severity by the EDSS scale after six months of stem cell administration compared with the initial data showed a statistically significant decrease in the degree of disability (6.4 ± 1.6 and 4.3 ± 0.9, respectively, p <0.05), with this reduction in disability was also recorded on 30 (6.0 ± 1.3) and 90 days (5.1 ± 1.1). A decrease in the level of focal neurological insufficiency on the NIH scale was found to be 1.29 times (3.6 ± 0.9 at admission and 2.8 ± 0.6 after six months of treatment). On an ESS scale, an average increase in social fitness was recorded by 12% by the end of 3 months of the study and by 14% by six months compared with the initial data (p> 0.05). Analysis of the indicators of the SF-36 quality of life questionnaire showed that already on the 30th day after cell therapy, almost all the scale values were significantly higher than when entering the study, by the 180th day of the study, the 60 point barrier was exceeded for all basic values of the SF-36 questionnaire subspheres (the subspheres “general perception of health”, “vitality” and “mental health” increased 68.4; 69.0 and 73.8 points, respectively, against 52.2; 49.3 and 54.7). Neuropsychological testing of patients in dynamics did not give statistically significant results due to the fact that background patients had high rates. When analyzing the EEG of all patients, a positive dynamics was revealed with an improvement in integrative cerebral processes, an expansion of the zones of alpha rhythm representation, a decrease in the severity of diffuse changes and interhemispheric asymmetry, a higher average frequency of rhythm assimilation reaction and a decrease in the area of slow-wave activity.

Важно отметить, что побочных эффектов клеточной терапии не было, при этом оценивались как ранние показатели безопасности, в том числе анафилактические реакции, так и поздние показатели безопасности (отсутствие болей, гиперемии, отеков, атрофии и некрозов, изменений общесоматического состояния, ЭКГ, клинических и биохимических показателей крови).It is important to note that there were no side effects of cell therapy, while both early safety indicators, including anaphylactic reactions, and late safety indicators (absence of pain, hyperemia, edema, atrophy and necrosis, changes in the general somatic state, ECG, clinical and blood biochemical parameters).

Было проведено также проспективное, открытое исследование эффективности использования клеточных препаратов у 20 больных в возрасте от 39 до 80 лет с ишемией головного мозга с периодом наблюдения 180 суток, с установленным клиническим диагнозом «Инфаркт мозга» (n=10), «Внутримозговое кровоизлияние» (n=4) или «Хроническая ишемия мозга» / «Дисциркуляторная энцефалопатия» (n=6), подтвержденный данными методов нейровизуализации, КТ/МРТ головного мозга. Всем пациентам вводили суспензию аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповины и/или плаценты путем однократного - трехкратного внутривенного и/или внутримышечного введения в дозировке 5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора и/или внутривенно-капельно медленно со средней скоростью 60 капель в минуту от 50000000 до 250000000 в 250 мл физиологического раствора. Всем больным проводился комплексный сомато-неврологический маниторинг, оценка качества жизни и нейро-психологического статуса.A prospective, open-ended study of the effectiveness of using cell preparations in 20 patients aged 39 to 80 years with cerebral ischemia with a follow-up period of 180 days, with a clinical diagnosis of cerebral infarction (n = 10), and “intracerebral hemorrhage” ( n = 4) or “Chronic cerebral ischemia” / “Discirculatory encephalopathy” (n = 6), confirmed by the data of neuroimaging methods, CT / MRI of the brain. All patients were injected with a suspension of allogeneic mesenchymal stem cells of the umbilical cord and / or placenta by single or triple intravenous and / or intramuscular injection at a dose of 5 million cells in 5 ml of physiological saline and / or intravenously dropwise at an average speed of 60 drops per minute from 50,000,000 to 250,000,000 in 250 ml of physiological saline. All patients underwent comprehensive somato-neurological monitoring, assessment of quality of life and neuro-psychological status.

В ходе исследования было выявлено положительное влияние терапии мезенхимальными стволовыми клетками больных с острой и хронической цереброваскулярной патологией. Клинический эффект заключался в более значимом регрессе неврологической недостаточности, улучшении функционального исхода заболевания, улучшении нейропсихологического статуса и улучшении качества жизни пациентов и их когнитивной сферы. Выявлено также достоверное улучшение спектра ЭЭГ и значимая регенерация патологического процесса на МРТ.The study revealed a positive effect of mesenchymal stem cell therapy in patients with acute and chronic cerebrovascular pathology. The clinical effect was a more significant regression of neurological insufficiency, improving the functional outcome of the disease, improving neuropsychological status and improving the quality of life of patients and their cognitive sphere. A significant improvement in the EEG spectrum and significant regeneration of the pathological process on MRI were also revealed.

Таким образом, клеточная терапия больных с рассеянным склерозом и цереброваскулярными заболеваниями, сопровождающимися ишемией головного мозга, приводит к уменьшению активности патологического процесса, снижению тяжести заболевания, уменьшению неврологической недостаточности, снижению инвалидизации и улучшению качества жизни пациентов, что субъективно пациентами выражается в уменьшении количества жалоб и увеличением функциональных возможностей. Отмечена хорошая переносимость и безопасность лечения мезенхимальными стволовыми клетками пуповины и плаценты в дозировке от 1-5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора до 50-250 млн клеток в 250 мл физиологического раствора.Thus, cell therapy of patients with multiple sclerosis and cerebrovascular diseases accompanied by cerebral ischemia leads to a decrease in the activity of the pathological process, a decrease in the severity of the disease, a decrease in neurological insufficiency, a decrease in disability, and an improvement in the quality of life of patients, which subjectively results in a decrease in the number of complaints and increased functionality. Good tolerance and safety of treatment with umbilical cord and placenta mesenchymal stem cells at a dosage of 1-5 million cells in 5 ml of physiological saline to 50-250 million cells in 250 ml of physiological saline was noted.

Пример №1. Пациент К., 41 год, с установленным и верифицированным МРТ диагнозом рассеянный склероз, вторично-прогрессирующее течение, с дебютом заболевния 3,5 года до поступления в исследование, имеющий множество активных и неактивных очагов на МР-томограмме головного мозга, функциональный неврологический дефицит и 10 баллов по шкале EDSS. Проведен курс клеточной терапии аллогенными мезенхимальными клетками пуповины человека (3 инъекции с интервалом 1 месяц, затем 3 месяца путем подкожного и внутривенного введения) в дозе 1,0-5,0 млн × 5,0 мл физиологического раствора готовой суспензии.Example No. 1. Patient K., 41 years old, with an established and verified MRI diagnosis of multiple sclerosis, a secondary progressive course, with a debut of the disease 3.5 years before admission to the study, which has many active and inactive foci on the MRI scan of the brain, functional neurological deficit and 10 points on the EDSS scale. A course of cell therapy was carried out with allogeneic umbilical cord mesenchymal cells (3 injections with an interval of 1 month, then 3 months by subcutaneous and intravenous administration) in a dose of 1.0-5.0 million × 5.0 ml of physiological saline solution of the finished suspension.

После проведения курса терапии мезенхимальными стволовыми клетками у пациента была достигнута стойкая ремиссия заболевания в течение 180 дней от момента первой инъекции. На МРТ через 30, 90 и 180 дней отмечается регресс старых очагов, новых активных очагов не выявлено. Кроме того, по шкале EDSS отмечено снижение степени инвалидизации уже через 1 месяц от момента включения пациента в исследование, которое сохранялось и через полгода введения стволовых клеток по сравнению с исходными данными. Выявлено также снижение уровня очаговой неврологической недостаточности по шкале NIH, по шкале ESS выявлен некоторый рост социальной приспособленности уже к концу 3 месяца исследования, что сохранялось и на 6 месяце, выявлено постепенное улучшение качества жизни пациента на 30, 60 и 180 сутки от момента первой инъекции. При анализе ЭЭГ отмечена положительная динамика с улучшением интегративных церебральных процессов, расширением зон представительства альфа-ритма, уменьшением выраженности диффузных изменений и межполушарной ассиметрии.After a course of therapy with mesenchymal stem cells, the patient achieved a stable remission of the disease within 180 days from the moment of the first injection. On MRI, after 30, 90 and 180 days, a regression of the old lesions was noted, no new active lesions were detected. In addition, according to the EDSS scale, a decrease in the degree of disability was noted already after 1 month from the moment the patient was included in the study, which continued after six months of stem cell administration compared with the initial data. A decrease in the level of focal neurological insufficiency according to the NIH scale was also detected, according to the ESS scale, a slight increase in social fitness was revealed by the end of the 3rd month of the study, which was preserved even at 6 months, a gradual improvement in the patient's quality of life was revealed on the 30th, 60th and 180th days from the moment of the first injection . When analyzing the EEG, positive dynamics was noted with an improvement in integrative cerebral processes, an expansion of the zones of alpha-rhythm representation, a decrease in the severity of diffuse changes and interhemispheric asymmetry.

Пример №2. Больной М., 48 лет, с острым инфарктом головного мозга в системе левой средней мозговой артерии (объем очага на МРТ 1,2×2,4 см), имеющий неврологический дефицит (NIH - 7 баллов, Бартель - 50 баллов, Рэнкин - 3 балла, MMSE - 21 балл). На 3 сутки от начала заболевания больному однократно был введен клеточный материал (мезенхимальные клетки, полученные из плаценты человека) путем внутримышечного введения в дозе 5,0 млн × 5,0 мл физиологического раствора. Через 1 и 3 месяца отмечено снижение выраженности неврологического дефицита по шкале NIH (4 и 2 балла соответственно); по шкале Бартель (95 и 100 баллов соответственно); Рэнкин - 2 и 1 балл соответственно; MMSE - 28 и 30 баллов соответственно. К 120 дню исследования у пациента неврологическая симптоматика полностью регрессировала и пациент был выписан на работу. Важно отметить, что к 180 суткам от момента проведения клеточной терапии на МР-томограмме с толщиной срезов 0,8 см патологического очага выявлено не было, что свидетельствует в пользу значимого позитивного влияния клеточной терапии пациента с острым инфарктом головного мозга.Example No. 2. Patient M., 48 years old, with acute cerebral infarction in the system of the left middle cerebral artery (focal volume on an MRI of 1.2 × 2.4 cm), having a neurological deficit (NIH - 7 points, Barthel - 50 points, Rankin - 3 point, MMSE - 21 points). On the 3rd day from the onset of the disease, the patient was once injected with cellular material (mesenchymal cells obtained from human placenta) by intramuscular injection in a dose of 5.0 million × 5.0 ml of physiological saline. After 1 and 3 months, a decrease in the severity of neurological deficit on the NIH scale was noted (4 and 2 points, respectively); on the Bartel scale (95 and 100 points, respectively); Rankin - 2 and 1 points respectively; MMSE - 28 and 30 points respectively. By the 120th day of the study, the patient's neurological symptoms completely regressed and the patient was discharged to work. It is important to note that by 180 days from the time of the cell therapy, an MRI tomogram with a section thickness of 0.8 cm did not reveal a pathological lesion, which indicates a significant positive effect of cell therapy in a patient with acute cerebral infarction.

Пример №3. Больная Р., 34 года, с установленным и верифицированным МРТ диагнозом рассеянный склероз, ремитирующее течение, пятое обострение, дебют заболевания в 29 лет. При поступлении в исследование на МР-томограмме выявлено множество активных очагов, функциональный неврологический дефицит (5 баллов по шкале NIH) и 11 баллов по шкале EDSS. Проведен курс клеточной терапии аллогенными мезенхимальными клетками пуповины человека (2 инъекции с интервалом 2 недели путем внутривенного введения) в дозе 50-250 млн клеток в 250,0 мл физиологического раствора.Example No. 3. Patient R., 34 years old, with an established and verified MRI diagnosis of multiple sclerosis, remitting course, fifth exacerbation, debut of the disease at 29 years old. Upon admission to the study on the MRI tomogram revealed many active foci, functional neurological deficit (5 points on the NIH scale) and 11 points on the EDSS scale. A course of cell therapy was carried out with allogeneic mesenchymal cells of the human umbilical cord (2 injections with an interval of 2 weeks by intravenous administration) at a dose of 50-250 million cells in 250.0 ml of physiological saline.

Уже через неделю после первой клеточной трансплантации у пациентки была достигнута ремиссия и выявлен существенный регресс неврологической симптоматики, оцененный по объективным шкалам. На МРТ через 30, 90 и 180 дней отмечается регресс старых очагов, новых активных очагов не выявлено. По шкале EDSS к 30 суткам исследования отмечено снижение степени инвалидизации до 5 баллов, на 180 суки - до 3 баллов, при этом обострений в течение полугода не было. Выявлено снижение уровня очаговой неврологической недостаточности по шкале NIH, по шкале ESS выявлен рост социальной приспособленности уже к концу 1 месяца исследования, что сохранялось и на 6 месяце, выявлено постепенное улучшение качества жизни по «SF-36» пациентки на 30, 60 и 180 сутки от момента первой инъекции. При анализе ЭЭГ отмечена положительная динамика с улучшением интегративных церебральных процессов, расширением зон представительства альфа-ритма. При исследовании количественного и качественного состава популяций лимфоцитов, клеткок-маркеров активации иммунной системы, реакции CD4+ и CD8+ после инкубации с нейроспецифическими белками, гуморальный иммунный ответ на ДНК и нейроспецифические белки, выявлено повышение относительного содержания зрелых Т-клеток на 11%, В-клеток на 9%, CD38+ на 13% и CD25+ на 10%. Наблюдались признаки активации иммунной системы за счет увеличения содержания CD25+ на 8%. В гуморальном звене иммунитета отмечалось увеличение уровней антител к нативной ДНК. Следует отметить отсутствие повышения уровня антител к нейроспецифическим белкам после трансплантации МСК.A week after the first cell transplantation, the patient achieved remission and revealed a significant regression of neurological symptoms, assessed according to objective scales. On MRI, after 30, 90 and 180 days, a regression of the old lesions was noted, no new active lesions were detected. According to the EDSS scale, by 30 days of the study, a decrease in the degree of disability to 5 points was noted, for 180 bitches - to 3 points, while there were no exacerbations within six months. A decrease in the level of focal neurological insufficiency on the NIH scale was revealed, according to the ESS scale, an increase in social fitness was revealed by the end of the 1st month of the study, which persisted at 6 months, a gradual improvement in the quality of life according to the "SF-36" of the patient on days 30, 60 and 180 was revealed from the moment of the first injection. When analyzing the EEG, positive dynamics was noted with the improvement of integrative cerebral processes, the expansion of the zones of alpha rhythm representation. In the study of the quantitative and qualitative composition of lymphocyte populations, cell markers of immune system activation, CD4 + and CD8 + reactions after incubation with neurospecific proteins, the humoral immune response to DNA and neurospecific proteins, an increase in the relative content of mature T cells by 11%, B cells by 9%, CD38 + by 13% and CD25 + by 10%. Signs of activation of the immune system were observed due to an 8% increase in CD25 + content. An increase in the levels of antibodies to native DNA was noted in the humoral immunity link. It should be noted that there is no increase in the level of antibodies to neurospecific proteins after transplantation of MSCs.

Как показали исследования, наиболее успешно заявленные варианты способа получения препарата для лечения сосудистых и демиелинизирующих заболеваний нервной системы промышленно применимы при лечении неврологических патологий различного генеза, таких как рассеянным склерозом и цереброваскулярными заболеваниями, сопровождающимися ишемией головного мозга (инфаркт головного мозга, внутримозговое кровоизлияние, хроническая ишемия головного мозга, дисциркуляторная энцефалопатия), а также заболеваний, связанных с дегенерацией тканей и аутоиммунными реакциями (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, мышечная дистрофия, миастения, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, мозжечковая дегенерация, последствия медленных нейроинфекций и др.).As studies have shown, the most successfully declared variants of a method for producing a drug for the treatment of vascular and demyelinating diseases of the nervous system are industrially applicable in the treatment of neurological pathologies of various origins, such as multiple sclerosis and cerebrovascular diseases accompanied by cerebral ischemia (cerebral infarction, intracerebral hemorrhage, chronic ischemia brain, discirculatory encephalopathy), as well as diseases associated with tissue degeneration and autoimmune reactions (Parkinson’s disease, Alzheimer's disease, muscular dystrophy, myasthenia gravis, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington’s disease, cerebellar degeneration, consequences of slow neuroinfections, etc.).

Claims

1. A method of obtaining a cell culture for the treatment of diseases of the nervous system, comprising isolating from the umbilical cord of a newborn after normal birth a stem cell culture, characterized in that the culture of allogeneic mesenchymal stem cells is isolated for parenteral administration to a patient with neurological pathology, when allogeneic mesenchymal stem cells are isolated the umbilical cord is freed from blood residues and washed in Versen's solution with the addition of antibiotics 100 units / ml penicillin, 100 units / ml strep tomycin, 100 units / ml amphotericin for 1 h at room temperature on a shaker, veins cannulated on both sides and washed first with Hanks solution and then with 0.1% type 1 collagenase solution prepared in DMEM medium and incubated at 37 ° C for 30 min, then the umbilical cord tissue is mechanically exposed, the separated cells are collected by washing them with Hanks solution. After mechanical action and washing, the cell suspension is centrifuged at 1000 rpm for 5 min, obtaining a cell pellet that resuspended they are diluted in DMEM growth medium containing 10% fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin, 100 units / ml streptomycin, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate, the resuspended cell pellet in DMEM growth medium is transferred to culture dishes and cultivated until a monolayer is formed, changing DMEM growth medium 2 times a week, and when the monolayer is reached, the cells are subcultured in a ratio of 1: 3, and before conducting cell therapy, the monolayer is transferred into suspension by treatment with a mixture of Versen's solution and 0.25% trypsin solution in correlation 1: 1 for 20 min at 37 ° C, which is then washed three times with physiological saline with a pH of 7.2, then the suspension is precipitated by centrifugation for 5 min at 1000 rpm, the cell pellet is resuspended in sterile physiological saline, obtaining allogeneic mesenchymal human umbilical cord stem cells in an amount of 1-5 million cells in 5 ml of physiological saline.

2. The method according to claim 1, characterized in that the allocation of allogeneic mesenchymal cells is produced from the umbilical cord of a newborn after normal delivery at 38-40 weeks of gestation.

3. A cell culture for the treatment of diseases of the nervous system, including a stem cell culture obtained from the umbilical cord of a newborn for parenteral administration to a patient, characterized in that it is obtained with the possibility of isolating a culture of allogeneic mesenchymal stem cells according to claim 1, wherein the number of allogeneic mesenchymal stem cells is cell culture - in the range from 1 to 5 million cells in 5 ml of physiological saline.

4. A method of obtaining a cell culture for the treatment of diseases of the nervous system, including the isolation of a newborn from the placenta after normal birth of a stem cell culture, characterized in that the culture of allogeneic mesenchymal stem cells is isolated for parenteral administration to a patient with neurological pathology, while the culture of allogeneic mesenchymal stem is isolated cells of the placenta are freed from blood residues and washed in Versen's solution with the addition of antibiotics 100 units / ml penicillin, 100 units ./ml streptomycin, 100 units / ml amphotericin for 1 h at room temperature on a shaker, then cut the placenta tissue into pieces 1 cm ³ in size and treat them with a 0.1% trypsin solution prepared in DMEM-free medium serum, and incubated at 37 ° C for 30 minutes, then a mechanical effect on the placenta tissue is performed, the separated cells are collected by washing them with Hanks solution obtained after mechanical treatment and washing, the cell suspension is centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, getting sediment which they are resuspended in DMEM growth medium containing 10% fetal bovine serum, 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate, the resuspended precipitate in the medium is transferred to culture plates and cultured until formation monolayer, replacing the growth medium 2 times a week, and when the monolayer is reached, the cells are subcultured in a 1: 3 ratio, and before conducting cell therapy, the monolayer of cells is transferred into suspension by treatment with a mixture of Versen's solution and 0.25% trypsin solution in the ratio 1: 1 for 20 min at 37 ° C, which is then washed three times with physiological saline with a pH of 7.2, then the cells are precipitated by centrifugation for 5 min at 1000 rpm, the cell pellet is resuspended in sterile saline, obtaining allogeneic mesenchymal stem human placenta cells in an amount of 1-5 million cells in 5 ml of physiological saline.

5. The method according to claim 4, characterized in that the allocation of allogeneic mesenchymal cells is produced from the placenta of the newborn after normal birth at 38-40 weeks of gestation.

6. A cell culture for the treatment of diseases of the nervous system, including a stem cell culture obtained from the placenta of a newborn for parenteral administration to a patient, characterized in that it is obtained with the possibility of isolating a culture of allogeneic mesenchymal stem cells according to claim 4, wherein the number of allogeneic mesenchymal stem cells cell culture - in the range from 1 to 5 million cells in 5 ml of physiological saline.