RU2341270C2 - Composition for stimulation of cell growth and regeneration, and methods of production thereof - Google Patents
Composition for stimulation of cell growth and regeneration, and methods of production thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2341270C2 RU2341270C2 RU2006146795/15A RU2006146795A RU2341270C2 RU 2341270 C2 RU2341270 C2 RU 2341270C2 RU 2006146795/15 A RU2006146795/15 A RU 2006146795/15A RU 2006146795 A RU2006146795 A RU 2006146795A RU 2341270 C2 RU2341270 C2 RU 2341270C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- composition
- agent
- cultivation
- tissue
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 230000034918 positive regulation of cell growth Effects 0.000 title abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 81
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 28
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 35
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 9
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims description 6
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims description 6
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims description 6
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 4
- 239000010408 film Substances 0.000 claims 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims 2
- 239000012265 solid product Substances 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 16
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 abstract description 11
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 58
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 12
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 10
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 10
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 6
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 5
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 5
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 5
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 4
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 4
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 208000008964 Chemical and Drug Induced Liver Injury Diseases 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 2
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 210000001174 endocardium Anatomy 0.000 description 2
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 2
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 2
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 235000019489 Almond oil Nutrition 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008168 almond oil Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000037020 contractile activity Effects 0.000 description 1
- 239000000490 cosmetic additive Substances 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000001258 dyslipidemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 150000002194 fatty esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004020 intracellular membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical class CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к фармакологической композиции, содержащей кондиционированную культуральную среду, полученную при культивировании лейкоцитов периферической крови и стволовых и/или прогениторных клеток в культуральной среде, а также разрушенные культивируемые клетки. Клетки, используемые для кондиционирования среды, могут быть генетически модифицированы в целях изменения концентрации белков, присутствующих в данной среде. В среде культивации могут содержаться белки, полученные из тканей паренхиматозных органов. Фармакологическую композицию используют для стимуляции регенерации органов и тканей. Фармакологическую композицию можно применять в качестве косметических добавок, пищевых добавок и добавок в корм животных, а также для культивирования клеток, фармацевтического применения и для стимуляции роста волос.The present invention relates to a pharmacological composition containing an air-conditioned culture medium obtained by culturing peripheral blood leukocytes and stem and / or progenitor cells in a culture medium, as well as destroyed cultured cells. The cells used to condition the medium can be genetically modified to change the concentration of proteins present in the medium. The cultivation medium may contain proteins obtained from the tissues of parenchymal organs. The pharmacological composition is used to stimulate the regeneration of organs and tissues. The pharmacological composition can be used as cosmetic additives, food additives and additives in animal feed, as well as for cell culture, pharmaceutical use and to stimulate hair growth.
Предпосылками создания изобретения послужил факт, что в процессе регенерации поврежденного органа, происходит активация лейкоцитов крови веществами, образующимися при разрушении тканей и органов. В результате проведенных исследований стало известно, что резекция паренхиматозных органов у экспериментальных животных вызывает изменение метаболической активности лейкоцитов, в особенности лимфоцитов. Перенос таких активированных клеток крови в организм интактного животного вызывает увеличение митозов в паренхиме того же органа, который был резецирован у оперированного животного. В процессе разрушения паренхиматозных клеток в кровь поступают вещества, как правило, внутриклеточный матрикс, которые вызывают метаболическую перестройку в лимфоидных органах. Лимфоциты начинают продуцировать вещества, способные изменять скорость пролиферации и дифференцировки других, не лимфоидных клеток, как правило, стволовых и прогениторных клеток костного мозга, а также стволовых клеток, находящихся в паренхиматозных органах.The prerequisites for the creation of the invention was the fact that in the process of regeneration of a damaged organ, blood leukocytes are activated by substances formed during the destruction of tissues and organs. As a result of the studies, it became known that resection of parenchymal organs in experimental animals causes a change in the metabolic activity of leukocytes, especially lymphocytes. The transfer of such activated blood cells into the body of an intact animal causes an increase in mitosis in the parenchyma of the same organ that was resected in the operated animal. In the process of destruction of parenchymal cells, substances enter the bloodstream, usually the intracellular matrix, which cause metabolic rearrangement in the lymphoid organs. Lymphocytes begin to produce substances that can change the rate of proliferation and differentiation of other non-lymphoid cells, as a rule, stem and progenitor cells of the bone marrow, as well as stem cells located in the parenchymal organs.
Очевидно, что использовать вышеуказанные механизмы переноса возможно с помощью культивирования клеток, участвующих в механизмах переноса. Питательная среда, используемая для культивации клеток обычно включает незаменимые аминокислоты, витамины, минералы, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. Внесение в питательную среду гормонов и ростовых факторов обеспечивает условия для нормального роста и дифференцировки культивируемых клеток. В процессе культивирования клеточная культура начинает продуцировать медиаторы и ростовые факторы, которые, как правило, призваны обеспечить оптимальные условия для пролиферации культивируемых клеток. Спектр продуцируемых веществ напрямую зависит от фенотипического состава культивируемых клеток, а также от факторов роста, которые были исходно привнесены в культуральную среду. Таким образом, в процессе культивирования клетки модифицируют культуральную среду, обогащая ее продуктами своей жизнедеятельности. В процессе культивирования клетки секретируют ряд важных клеточных метаболитов, регулирующих пролиферацию клеток, их адгезию, дифференцировку, миграцию, определяющих спектр синтезируемых и секретируемых метаболитов. Это могут быть различные клеточные метаболиты: секреторные, включая, например, биологически активные факторы роста, медиаторы воспаления и другие внеклеточные белки. В качестве примера можно привести: VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста), FGF (фактор роста тромбоцитов) и IGF (инсулиноподобный фактор роста) (Gonzalez-Rubio, M. et al., 1996, Kidney Int. 50(1):164-73; Abramovitch, R. et al., 1997, Int. J. Exp. Pathol. 78(2):57-70; Stein I. et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15(10):5363-8; Yang W. et al., 1997, FEBS Lett. 403(2):139-42; West, N.R. et al. 1995, J. Neurosci. Res. 40(5):647-59). Трансформирующий фактор роста (TGF-β), индуцируется в процессе заживления ран. Было также показано, что TGF-β способствует повышению экспрессии белков внеклеточного матрикса, включая коллаген и фибронектин (Ignotz et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4337-4345), и ускорению заживления ран (Mustoe et al., 1987, Science 237:1333-1335). Рядом других факторов роста, обладающих способностью к индуцированию ангиогенеза и заживлению ран, являются VEGF и основный FGF. Также известно, что биологические эффекты клеточных факторов роста и цитокинов определяют не только концентрацией отдельного цитокина, но, во многом, биологический эффект определяется соотношением отдельных цитокинов, например соотношение γ-ИНФ и ИЛ-4 определяет тип развития иммунной реакции (клеточный или гуморальный).Obviously, it is possible to use the above transfer mechanisms by culturing the cells involved in the transfer mechanisms. The culture medium used to cultivate cells typically includes essential amino acids, vitamins, minerals, carbohydrates, lipids, and nucleic acids. The introduction of hormones and growth factors into the nutrient medium provides the conditions for normal growth and differentiation of cultured cells. In the process of cultivation, the cell culture begins to produce mediators and growth factors, which, as a rule, are designed to provide optimal conditions for the proliferation of cultured cells. The spectrum of substances produced directly depends on the phenotypic composition of cultured cells, as well as on growth factors that were originally introduced into the culture medium. Thus, in the process of cultivation, the cells modify the culture medium, enriching it with the products of their vital functions. During cultivation, cells secrete a number of important cellular metabolites that regulate cell proliferation, their adhesion, differentiation, and migration, which determine the spectrum of synthesized and secreted metabolites. These can be various cellular metabolites: secretory, including, for example, biologically active growth factors, inflammatory mediators, and other extracellular proteins. Examples include VEGF (vascular endothelial growth factor), FGF (platelet growth factor) and IGF (insulin-like growth factor) (Gonzalez-Rubio, M. et al., 1996, Kidney Int. 50 (1): 164- 73; Abramovitch, R. et al., 1997, Int. J. Exp. Pathol. 78 (2): 57-70; Stein I. et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15 (10): 5363 -8; Yang W. et al., 1997, FEBS Lett. 403 (2): 139-42; West, NR et al. 1995, J. Neurosci. Res. 40 (5): 647-59). Transforming Growth Factor (TGF-β) is induced during wound healing. TGF-β has also been shown to increase the expression of extracellular matrix proteins, including collagen and fibronectin (Ignotz et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 4337-4345), and accelerate wound healing (Mustoe et al., 1987, Science 237: 1333-1335). A number of other growth factors with the ability to induce angiogenesis and wound healing are VEGF and basic FGF. It is also known that the biological effects of cellular growth factors and cytokines are determined not only by the concentration of a single cytokine, but, in many ways, the biological effect is determined by the ratio of individual cytokines, for example, the ratio of γ-INF and IL-4 determines the type of development of the immune response (cellular or humoral).
Однако значительная часть ростовых факторов, гормонов, медиаторов и других внеклеточных белков, которые секретируются культивируемыми клетками, во внеклеточной среде быстро инактивируются, т.е. теряют свою биологическую активность. С другой стороны, в составе культивируемых клеток находятся секреторные гранулы, содержащие белки. Зачастую белки, входящие в состав секреторных гранул, находятся в неактивном состоянии в виде прогормонов. Поэтому получение композиции, состоящей из культуральной среды, обогащенной клеточными метаболитами, секретируемыми культивируемыми клетками, а также из клеточного лизата, содержащего внутриклеточные белки, в том числе белки секреторных гранул, является весьма перспективным для последующего производства препаратов, повышающих процессы регенерации.However, a significant part of growth factors, hormones, mediators and other extracellular proteins that are secreted by cultured cells are rapidly inactivated in the extracellular medium, i.e. lose their biological activity. On the other hand, in the composition of cultured cells are secretory granules containing proteins. Often, the proteins that make up the secretory granules are inactive in the form of prohormones. Therefore, the preparation of a composition consisting of a culture medium enriched in cellular metabolites secreted by cultured cells, as well as from a cell lysate containing intracellular proteins, including proteins of secretory granules, is very promising for the subsequent production of drugs that enhance regeneration processes.
При этом дополнительное добавление тканеспецифического антигена, состоящего из веществ, полученных при разрушении тканей и органов, в культуральную среду приводит к изменению метаболической активности культивированных клеток, что проявляется в изменении внутриклеточного синтеза и секреции клеточных метаболитов.Moreover, the additional addition of tissue-specific antigen, consisting of substances obtained from the destruction of tissues and organs, into the culture medium leads to a change in the metabolic activity of cultured cells, which is manifested in a change in intracellular synthesis and secretion of cellular metabolites.
Прототипом предлагаемого изобретения является композиция, включающая средство для изменения скорости роста и репродукции клеток, содержащее кондиционированную клеточную культуральную среду, полученную при культивировании эукариотических клеток в трех измерениях, а также способ ее получения (Патент РФ 2280459 от 27.06.2006). Однако данная композиция не учитывает механизмов развития регенерации в ответ на действие повреждающих факторов.The prototype of the invention is a composition comprising a means for changing the growth and reproduction rates of cells, containing an conditioned cell culture medium obtained by culturing eukaryotic cells in three dimensions, as well as a method for producing it (RF Patent 2280459 of 06/27/2006). However, this composition does not take into account the mechanisms of development of regeneration in response to the action of damaging factors.
Предложенное изобретение свободно от вышеуказанных недостатков, поскольку в ее основе учтен механизм переноса регенераторных свойств от поврежденного органа к регенерирующим клеткам.The proposed invention is free from the above disadvantages, since it is based on the mechanism of transfer of regenerative properties from a damaged organ to regenerating cells.
Получение композиции, содержащей кондиционированную культуральную среду, полученную при культивировании лейкоцитов периферической крови и стволовых и/или прогениторных клеток в культуральной среде, а также лизат культивируемых клеток, а также композицию, полученную после того, как к культивируемым клеткам добавляется тканеспецифический антиген, получаемый из тканей того органа, регенерацию которого надо улучшить, открывает новые возможности в получении продуктов для использования в различных целях, включающих регенерацию тканей, например, при лечении ран и других дефектов ткани, а также при лечении хронических воспалительных и дегенерационных процессов внутренних органов и кожных покровов.Obtaining a composition containing conditioned culture medium obtained by culturing peripheral blood leukocytes and stem and / or progenitor cells in the culture medium, as well as a lysate of cultured cells, as well as a composition obtained after tissue-specific antigen obtained from tissues is added to the cultured cells of the organ whose regeneration must be improved, opens up new possibilities in obtaining products for use in various purposes, including tissue regeneration, example, in the treatment of wounds and other tissue defects, and in the treatment of inflammatory and chronic degenerative processes of the internal organs and integuments.
Заявителями настоящего изобретения описана композиция, содержащая кондиционированную культуральную среду, полученную при культивировании лейкоцитов периферической крови и стволовых и/или прогениторных клеток в культуральной среде и лизат культивируемых клеток, а также композицию, полученную после того, как к культивируемым клеткам добавляется тканеспецифический антиген, получаемый из тканей того органа, регенерацию клеток которого требуется простимулировать.The applicants of the present invention describe a composition containing a conditioned culture medium obtained by culturing peripheral blood leukocytes and stem and / or progenitor cells in a culture medium and a lysate of cultured cells, as well as a composition obtained after tissue-specific antigen obtained from cultured cells is obtained from tissues of the organ whose cell regeneration is to be stimulated.
Композиции, могут состоять из любой известной определенной или неопределенной среды и могут быть кондиционированы с использованием любых стволовых и/или прогениторных клеток. Эта среда может быть кондиционирована стромальными клетками, паренхиматозными клетками, мезенхимными стволовыми клетками, резервными клетками печени, стволовыми нервными клетками, стволовыми клетками поджелудочной железы и/или эмбриональными стволовыми клетками.Compositions may consist of any known defined or uncertain medium and may be conditioned using any stem and / or progenitor cells. This medium can be conditioned with stromal cells, parenchymal cells, mesenchymal stem cells, reserve liver cells, stem nerve cells, pancreatic stem cells and / or embryonic stem cells.
Клеточный лизат получается из любых культивируемых клеток, которые после культивирования разрушаются с использованием физических (ультразвук, электрический разряд, замораживание оттаивание), химических (ферменты, химические реагенты), механических (растирание) и других факторов, а также их комбинации, в результате чего наступает нарушение целостности клеточных структур. В процессе разрушения культивируемых клеток возможно, но не обязательно, использовать физические (снижение температуры, использование инертных газов), химические (ингибиторы протеолитических ферментов) и другие факторы, а также их комбинацию для снижения скорости процесса разрушения клеточных метаболитов протеолитическими ферментами.A cell lysate is obtained from any cultured cells that, after cultivation, are destroyed using physical (ultrasound, electrical discharge, freezing, thawing), chemical (enzymes, chemical reagents), mechanical (grinding) and other factors, as well as their combination, resulting in violation of the integrity of cell structures. In the process of destruction of cultured cells, it is possible, but not necessary, to use physical (temperature reduction, use of inert gases), chemical (inhibitors of proteolytic enzymes) and other factors, as well as their combination to reduce the rate of destruction of cellular metabolites by proteolytic enzymes.
Тканеспецифический антиген, добавляемый в культуральную среду, получается из ткани органа, соответствующего тому, регенерацию которого требуется простимулировать. Тканеспецифический антиген получается при разрушении ткани органа с использованием физических (ультразвук, электрический разряд, замораживание-оттаивание), химических (ферменты, химические реагенты), механических (растирание) и других факторов, а также их комбинации, в результате чего наступает нарушение целостности клеточных структур. В процессе приготовления тканеспецифического антигена возможно, но не обязательно, использовать физические (снижение температуры, использование инертных газов), химические (ингибиторы протеолитических ферментов) и другие факторы, а также их комбинацию, для снижения скорости процесса разрушения клеточных структур протеолитическими ферментами.A tissue-specific antigen added to the culture medium is obtained from the tissue of an organ corresponding to the one whose regeneration needs to be stimulated. Tissue-specific antigen is obtained during the destruction of organ tissue using physical (ultrasound, electric discharge, freezing-thawing), chemical (enzymes, chemical reagents), mechanical (grinding) and other factors, as well as their combination, resulting in a violation of the integrity of cellular structures . In the process of preparing a tissue-specific antigen, it is possible, but not necessary, to use physical (temperature reduction, use of inert gases), chemical (inhibitors of proteolytic enzymes) and other factors, as well as their combination, to reduce the rate of destruction of cellular structures by proteolytic enzymes.
Фармакологическая композиция, состоящая из кондиционированной культуральной среды, полученной при культивировании лейкоцитов периферической крови и стволовых и/или прогениторных клеток в культуральной среде, а также лизата культивируемых клеток может быть использована в любом состоянии. Физическими вариантами этой композиции являются, но не ограничиваются ими, жидкая или твердая среда, замороженная среда, лиофилизованная среда или среда, высушенная до порошкообразного состояния. Кроме того, эта композиция может быть приготовлена в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем, используемым в качестве носителя для внутреннего введения, для введения непосредственно в пищу или пищевой продукт, для получения мази или растирания - для местного. Кроме того, указанная композиция может быть дополнительно обработана для увеличения или уменьшения концентрации одного или нескольких факторов или компонентов, содержащихся в данной композиции. Так, например, композиция может быть обогащена факторами роста с использованием иммуноаффинной хроматографии. Также композиция может быть приготовлена в сочетании с антибиотиком, противовоспалительным агентом, противовирусным агентом, противогрибковым агентом, гормоном, противоопухолевым агентом, анальгетиком, анестезирующим средством или любой их комбинации.A pharmacological composition consisting of a conditioned culture medium obtained by culturing peripheral blood leukocytes and stem and / or progenitor cells in a culture medium, as well as a lysate of cultured cells, can be used in any condition. The physical options for this composition are, but are not limited to, liquid or solid media, frozen media, lyophilized media, or media dried to a powder state. In addition, this composition can be prepared in combination with a pharmaceutically acceptable excipient, used as a carrier for internal administration, for administration directly to food or food product, to obtain ointment or grinding for local. In addition, the composition may be further processed to increase or decrease the concentration of one or more factors or components contained in the composition. So, for example, the composition can be enriched with growth factors using immunoaffinity chromatography. Also, the composition can be prepared in combination with an antibiotic, anti-inflammatory agent, antiviral agent, antifungal agent, hormone, antitumor agent, analgesic, anesthetic, or any combination thereof.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к новым фармакологическим композициям, содержащим любую кондиционированную определенную или неопределенную культуральную среду, полученную при культивировании лейкоцитов периферической крови и стволовых и/или прогениторных клеток в культуральной среде, а также лизат культивируемых клеток, полученный из культивированных клеток, подвергнутых разрушению с использованием химических, физических, механических факторов или их комбинации. Указанные клетки представляют собой клетки человека или животного и такими клетками являются стромальные клетки, клетки крови, клетки костного мозга, паренхиматозные клетки, мезенхимные стволовые клетки, резервные клетки печени, стволовые нервные клетки, панкреатические стволовые клетки и/или эмбриональные стволовые клетки. Фармакологическая композиция будет содержать различные естественным образом секретированные белки, а также внутриклеточные метаболиты, синтезируемые клеткой и содержащиеся преимущественно в секреторных гранулах.The present invention relates to new pharmacological compositions containing any conditioned, defined or undefined culture medium obtained by culturing peripheral blood leukocytes and stem and / or progenitor cells in a culture medium, as well as a cultured cell lysate obtained from cultured cells that have been destroyed using chemical , physical, mechanical factors, or a combination thereof. These cells are human or animal cells, and such cells are stromal cells, blood cells, bone marrow cells, parenchymal cells, mesenchymal stem cells, reserve liver cells, stem nerve cells, pancreatic stem cells and / or embryonic stem cells. The pharmacological composition will contain various naturally secreted proteins, as well as intracellular metabolites synthesized by the cell and contained mainly in secretory granules.
Культуральная среда для культивирования клеток может быть любой средой для культивирования клеток, которая адекватно соответствует потребностям культивируемых клеток в питательных элементах. Примерами таких сред являются, но не ограничиваются ими, модифицированная по методу Дульбекко среда Игла (DMEM), среда Хэма F12, RPMI 1640, среда Исков, среда Маккой и другие композиции сред, известные специалистам, включая среды, описанные в работах Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Alan R.Liss, New York (1984) и Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England 1996. Указанная среда может быть дополнена любыми компонентами, необходимыми для поддержания нужной клеточной или тканевой культуры. Если это необходимо, то дополнительно может быть добавлена эмбриональная телячья сыворотка, которая представляет собой комплексный раствор альбуминов, глобулинов, стимуляторов роста и гормонов. Такая сыворотка не должна содержать патогенов и должна быть тщательно проверена на загрязнение микоплазмой, бактериями, грибками и вирусами.The cell culture medium may be any cell culture medium that adequately meets the nutrient needs of the cultured cells. Examples of such media include, but are not limited to, Dulbecco’s Eagle’s modified medium (DMEM), Ham’s F12 medium, RPMI 1640, Iscov’s medium, McCoy’s medium, and other media compositions known to those skilled in the art, including those described in Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Alan R. Liss, New York (1984) and Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England 1996. This medium can be supplemented with any components necessary to maintain the desired cell or tissue culture. If necessary, fetal calf serum can be added, which is a complex solution of albumin, globulin, growth stimulants and hormones. Such serum should not contain pathogens and should be carefully checked for contamination with mycoplasma, bacteria, fungi and viruses.
В данной среде могут культивироваться стромальные клетки, паренхиматозные клетки, мезенхимные стволовые клетки (клетки, коммитированные или некоммитированные в отношении направления дифференцировки), резервные клетки печени, стволовые нервные клетки, стволовые клетки поджелудочной железы и/или эмбриональные стволовые клетки. Такими клетками, среди прочих, являются, но не ограничиваются ими, клетки костного мозга, кожи, печени, поджелудочной железы, почек, нервной ткани, надпочечника, эпителия слизистой и гладких мышц. Такие ткани и/или органы могут быть получены путем соответствующей биопсии или после аутопсии.Stromal cells, parenchymal cells, mesenchymal stem cells (cells committed or uncommitted with respect to the direction of differentiation), reserve liver cells, stem cells, pancreatic stem cells and / or embryonic stem cells can be cultured in this medium. Such cells, among others, are, but are not limited to, cells of the bone marrow, skin, liver, pancreas, kidneys, nervous tissue, adrenal gland, epithelium of the mucosa and smooth muscles. Such tissues and / or organs can be obtained by appropriate biopsy or after autopsy.
Стволовые клетки и/или прогениторные могут быть выделены известными методами. Так, например, популяции стволовых клеток и методы их выделения и использования были недавно описаны Keller et al., Nature Med, 5:151-152 (1999), Smith Curr. Biol. 8:R802-804 (1998), Методы выделения и культивирования мезенхимных стволовых клеток известны специалистам. См., Mackay et al. Tissue Eng. 4:415-428 (1988); William et al., Am. Surg. 65:22-26 (1999). Аналогичным образом стволовые клетки нервной ткани могут быть выделены способом, описанным Flax et al., Nature Biotechnol, 16:1033-1039 (1998); и Frisen et al., Cell. Mol. Life Sci., 54:935-945 (1998).Stem cells and / or progenitor cells can be isolated by known methods. For example, stem cell populations and methods for their isolation and use have recently been described by Keller et al., Nature Med, 5: 151-152 (1999), Smith Curr. Biol. 8: R802-804 (1998), Methods for the isolation and cultivation of mesenchymal stem cells are known in the art. See, Mackay et al. Tissue Eng. 4: 415-428 (1988); William et al., Am. Surg. 65: 22-26 (1999). Similarly, stem cells of nerve tissue can be isolated by the method described by Flax et al., Nature Biotechnol, 16: 1033-1039 (1998); and Frisen et al., Cell. Mol. Life Sci., 54: 935-945 (1998).
Эти клетки могут быть культивированы любым известным способом, например, в монослое, на гранулах или в трехмерном слое и любым другим способом (т.е. в чашках для культивирования, в роллер-флаконах, в системах с непрерывным потоком и т.п.). Методы культивирования клеток и тканей хорошо известны специалистам и описаны, например, в Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques.These cells can be cultured by any known method, for example, in a monolayer, on granules or in a three-dimensional layer and in any other way (i.e., in culture dishes, in roller bottles, in continuous flow systems, etc.) . Methods of culturing cells and tissues are well known in the art and are described, for example, in Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques.
Кроме того, данная среда может быть подвергнута 10-20-кратному концентрированию с использованием концентрирующего устройства, работающего при избыточном давлении и имеющего фильтр с отсечкой 10000 мол. масс. (Amicon, Beverly, MA).In addition, this medium can be subjected to 10-20-fold concentration using a concentrating device operating at overpressure and having a filter with a cut-off of 10,000 mol. mass (Amicon, Beverly, MA).
Кроме того, кондиционированная среда может быть также обработана для выделения и очистки продукта, например, в целях удаления нежелательных протеаз. Используемые методы выделения и очистки продукта, которые позволяют сохранить оптимальную активность, хорошо известны специалистам. Так, например, может оказаться желательной очистка фактора роста, регуляторного фактора, пептидного гормона, антитела и т.п. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, гель-хроматография (с использованием матриц, таких как сефадекс), ионообменная хроматография, аффинная хроматография на хелате металла с нерастворимой матрицей, такой как перекрестно-сшитая агароза, ВЭЖХ-очистка и гидрофобная хроматография кондиционированной среды. Эти методы более подробно описаны в Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedure, см. выше. Само собой разумеется, что в зависимости от целей применения кондиционированной среды и/или полученных из нее продуктов должны быть приняты соответствующие меры для поддержания стерильности. Альтернативно может оказаться необходимой стерилизация, и она может быть осуществлена методами, известными специалистам, такими как, например, нагревание и/или стерилизация с помощью фильтра, при этом следует обеспечить сохранение нужной биологической активности.In addition, the conditioned medium can also be processed to isolate and purify the product, for example, in order to remove unwanted proteases. Used methods of isolation and purification of the product, which allow you to maintain optimal activity, are well known to specialists. Thus, for example, purification of a growth factor, a regulatory factor, a peptide hormone, an antibody, and the like may be desirable. Such methods include, but are not limited to, gel chromatography (using matrices such as Sephadex), ion exchange chromatography, affinity chromatography on a metal chelate with an insoluble matrix such as crosslinked agarose, HPLC purification, and hydrophobic chromatography of conditioned media. These methods are described in more detail in Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedure, see above. It goes without saying that, depending on the purpose of the application of the conditioned medium and / or the products obtained from it, appropriate measures must be taken to maintain sterility. Alternatively, sterilization may be necessary, and it can be carried out by methods known to those skilled in the art, such as, for example, heating and / or sterilization using a filter, while maintaining the desired biological activity.
Примеры осуществления изобретенияExamples of carrying out the invention
1 этап: Получение стволовых и прогениторных клеток для культивированияStage 1: Obtaining stem and progenitor cells for cultivation
На примере клеток костного мозгаOn the example of bone marrow cells
Для забора костного мозга используют доступ из переднего гребня подвздошной кости. Забор костного мозга проводится в условиях операционной при соблюдении тех же правил асептики, как и при других оперативных вмешательствах.For bone marrow collection, access from the anterior iliac crest is used. Bone marrow is taken under operating conditions, subject to the same aseptic rules, as with other surgical interventions.
После обработки кожи йодсодержащими растворами в области передних гребней делают прокол кожи и подкожно-жировой клетчатки, через который вставляют иглы для аспирации. После чего прокалывают кортикальную пластинку гребня подвздошной кости и аспирируют костный мозг из губчатого вещества кости. Для забора 50-150 мл костного мозга необходимо сделать несколько проколов кортикальной пластинки кости, для этого кожу и подкожно-жировую клетчатку перемещают аспирационной иглой. Классическая технология требует аспирировать костный мозг из каждого вкола малыми порциями (3-5) мл в 20-миллилитровый шприц.After treating the skin with iodine-containing solutions in the area of the anterior crests, a puncture of the skin and subcutaneous fat is made, through which needles for aspiration are inserted. After that, the cortical plate of the iliac crest is pierced and the bone marrow is aspirated from the spongy bone. For the collection of 50-150 ml of bone marrow, it is necessary to make several punctures of the cortical plate of the bone, for this the skin and subcutaneous fat are moved with an aspiration needle. Classical technology requires aspirating the bone marrow from each injection in small portions (3-5) ml into a 20-ml syringe.
Из аспирата костномозговой взвеси удаляют эритроциты. Для удаления эритроцитов можно использовать градиентное центрифугирование, лизис эритроцитов лизирующим раствором или комбинацию этих методов с другими, в результате чего наступает разделение эритроцитов и ядросодержащих клеток. Данные ядросодержащие клетки содержат как стволовые клетки, так и прогениторные.Red blood cells are removed from the bone marrow suspension aspirate. To remove red blood cells, you can use gradient centrifugation, lysis of red blood cells with a lysis solution, or a combination of these methods with others, resulting in the separation of red blood cells and nucleated cells. These nucleated cells contain both stem cells and progenitor cells.
На примере клеток, полученных из периферической кровиOn the example of cells obtained from peripheral blood
Вначале для повышения числа стволовых и прогениторных клеток в периферической крови животному перед забором клеток вводили в течение 2 дней внутривенно Г-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). Введение препарата позволило повысить уровень гемопоэтических стволовых клеток с 0,5% (контроль) до 3,5% от общего количества мононуклеарных клеток в периферической кровиInitially, G-CSF (granulocyte colony stimulating factor) was administered intravenously for 2 days to increase the number of stem and progenitor cells in peripheral blood. The introduction of the drug allowed to increase the level of hematopoietic stem cells from 0.5% (control) to 3.5% of the total number of mononuclear cells in peripheral blood
Далее проводят забор периферической крови любым известным способом и осуществляют удаление эритроцитов. Для удаления эритроцитов можно использовать градиентное центрифугирование, лизис эритроцитов лизирующим раствором или комбинацию этих методов с другими, в результате чего наступает разделение эритроцитов и ядросодержащих клеток. Данные ядросодержащие клетки содержат как стволовые клетки, так и прогениторные.Next, a peripheral blood sampling is carried out by any known method, and red blood cells are removed. To remove red blood cells, you can use gradient centrifugation, lysis of red blood cells with a lysis solution, or a combination of these methods with others, resulting in the separation of red blood cells and nucleated cells. These nucleated cells contain both stem cells and progenitor cells.
2 этап: Получение лейкоцитов периферической кровиStage 2: Obtaining peripheral blood leukocytes
Проводят забор периферической крови любым известным способом, после чего осуществляют получение лейкоцитарной суспензии: для этого 2 мл гепаринизированной крови смешивают с 1 мл подогретого до 37°С 3% раствора желатина и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 мин. После оседания эритроцитов слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, отбирают в пластиковые пробирки и отмывают 10-кратным объемом фосфатно-солевого буфера (рН=7,4). Затем лейкоциты после центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин ресуспендируют в растворе Хенкса без Са2+ и Mg2+. После подсчета числа лейкоцитов концентрацию клеток доводят до 106 кл.Peripheral blood sampling is carried out by any known method, after which a leukocyte suspension is obtained: for this, 2 ml of heparinized blood is mixed with 1 ml of a 3% gelatin solution heated to 37 ° C and incubated in an incubator at 37 ° C for 30 minutes. After erythrocyte sedimentation, the plasma layer enriched in leukocytes is taken into plastic tubes and washed with a 10-fold volume of phosphate-saline buffer (pH = 7.4). Then, the leukocytes after centrifugation for 10 min at 1000 rpm are resuspended in a Hanks solution without Ca 2+ and Mg 2+ . After counting the number of leukocytes, the cell concentration was adjusted to 10 6 cells.
3 этап: Культивирование клетокStage 3: Cell Culture
Полученные клетки, а именно лейкоциты периферической крови и стволовые и/или прогениторные клетки, ресуспендируют в культуральной ростовой среде. Клетки культивируют совместно при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 и при 95% влажности, в течение 1-60 суток.The resulting cells, namely peripheral blood leukocytes and stem and / or progenitor cells, are resuspended in a culture growth medium. Cells are cultured together at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and at 95% humidity for 1-60 days.
4 этап: Получение композицииStage 4: Obtaining the composition
После культивирования клетки вместе с культуральной средой переносят в пробирки, в которых клетки подвергаются разрушению с использованием физических (ультразвук, замораживание-оттаивание, электрический импульс и др.), и/или химических (ферменты, химические реагенты и др.), и/или механических (растирание и др.) методов или их комбинации, приводящих к нарушению клеточных структур. Полученную композицию, состоящую из культуральной среды и разрушенных культивированных клеток, можно использовать для приготовления инъекционных форм, таблетированных лекарственных форм, применять в виде пищевых добавок или высушивать, лиофилизировать, замораживать и т.д.After cultivation, the cells together with the culture medium are transferred to test tubes in which the cells are destroyed using physical (ultrasound, freeze-thaw, electric pulse, etc.), and / or chemical (enzymes, chemical reagents, etc.), and / or mechanical (grinding, etc.) methods or their combination, leading to disruption of cellular structures. The resulting composition, consisting of culture medium and destroyed cultured cells, can be used to prepare injection forms, tablet dosage forms, used as food additives, or dried, lyophilized, frozen, etc.
Мази готовятся с использованием в качестве основы медицинского вазелина. Фармакологическую композицию помещают в фарфоровую ступку и растирают фарфоровым пестиком до мелкодисперсного состояния. Затем к полученному порошку добавляют медицинский вазелин и тщательно перетирают до получения однородной (гомогенной) субстанции. Мазь наносилась на поверхность кожи.Ointments are prepared using medical vaseline as the basis. The pharmacological composition is placed in a porcelain mortar and ground with a porcelain pestle to a finely divided state. Then, medical vaseline is added to the obtained powder and carefully triturated to obtain a homogeneous (homogeneous) substance. Ointment was applied to the surface of the skin.
Инъекционные формы готовились: Стерильную фармакологическую композицию растворяли в дистиллированной воде. Раствор вводили внутрибрюшинно, внутримышечно, внутривенно или подкожно.Injection forms were prepared: The sterile pharmacological composition was dissolved in distilled water. The solution was administered intraperitoneally, intramuscularly, intravenously or subcutaneously.
Жидкие препараты для перорального введения могут быть изготовлены, например, в виде растворов, сиропов или суспензий. Такие жидкие препараты могут быть получены стандартными способами с использованием фармацевтически приемлемых добавок, таких как суспендирующие агенты (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгирующие агенты (например, лецитин или камедь акации); безводные носители (например, миндальное масло, жирные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла); и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота).Liquid preparations for oral administration can be made, for example, in the form of solutions, syrups or suspensions. Such liquid preparations can be prepared by standard methods using pharmaceutically acceptable additives, such as suspending agents (for example, sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); emulsifying agents (e.g. lecithin or acacia gum); anhydrous carriers (e.g., almond oil, fatty esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils); and preservatives (e.g. methyl or propyl p-hydroxybenzoates or sorbic acid).
Дополнительно композиция может быть получена с добавлением антибиотика, противовоспалительного агента, противовирусного агента, противогрибкового агента, гормона, противоопухолевого агента, анальгетика, анестезирующего средства или любой их комбинации. При этом добавление того или иного агента производится с учетом необходимого терапевтического эффекта определяемого специалистом.Additionally, the composition can be obtained with the addition of an antibiotic, anti-inflammatory agent, antiviral agent, antifungal agent, hormone, antitumor agent, analgesic, anesthetic, or any combination thereof. In this case, the addition of one or another agent is made taking into account the necessary therapeutic effect determined by a specialist.
Дополнительно композиция может быть получена с добавлением к культивируемым клеткам тканеспецифичного антигена.Additionally, the composition can be obtained by adding tissue-specific antigen to cultured cells.
В данном примере композиции 1 и 2 проводятся согласно вышеизложенному примеру.In this example,
3 этап: Получение тканеспецифичного антигенаStage 3: Obtaining tissue-specific antigen
Для получения тканеспецифичекого антигена брали свежевыделенную ткань органа. В качестве источника может быть использована аллогенная или ксеногенная ткань, при возможности используется биопсийный материал.To obtain tissue-specific antigen, freshly isolated organ tissue was taken. Allogeneic or xenogenic tissue may be used as a source, and biopsy material may be used if possible.
Для получения тканеспецифического антигена клетки органа или тканей разрушают, используя физические (ультразвук, замораживание-оттаивание, электрический импульс и др.), и/или химические (ферменты, химические реагенты и др.) и/или механические (растирание и др.), методы или их комбинации, приводящие к нарушению клеточных структур. Как пример: Ткань механически гомогенизируется на фрагменты не более 0,5 мм3. Полученный гомогенат заливается раствором Хенкса 1:1 и помещается в морозильную камеру на 1 час, затем ткань размораживают, данный цикл повторяют 3 раза. Затем гомогенат центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин. Супернатант отбирают и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм для обеспечения стерильности раствора. Концентрация белка в растворе определяется методом Лоури и должна находиться в диапазоне от 0,5 до 1 мг/мл.To obtain a tissue-specific antigen, cells of an organ or tissues are destroyed using physical (ultrasound, freezing-thawing, electrical impulse, etc.), and / or chemical (enzymes, chemicals, etc.) and / or mechanical (grinding, etc.), methods or combinations thereof, leading to disruption of cellular structures. As an example: The fabric is mechanically homogenized into fragments of not more than 0.5 mm 3 . The resulting homogenate is poured with Hanks' solution 1: 1 and placed in the freezer for 1 hour, then the fabric is thawed, this cycle is repeated 3 times. The homogenate is then centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes. The supernatant is collected and filtered through a filter with a pore diameter of 0.22 μm to ensure sterility of the solution. The protein concentration in the solution is determined by the Lowry method and should be in the range from 0.5 to 1 mg / ml.
При этом отмечено, что в основе метода получения тканеспецифичного антигена (ТА) лежит разрушение клеточных структур и оно может осуществляться:It was noted that the basis for the method of obtaining tissue-specific antigen (TA) is the destruction of cell structures and it can be carried out:
1. Механически - растирание ткани паренхиматозных органов (например, в фарфоровой ступке с использованием фарфорового пестика или в стеклянном гомогенизаторе).1. Mechanically - rubbing the tissue of the parenchymal organs (for example, in a porcelain mortar using a porcelain pestle or in a glass homogenizer).
2. С использованием физических методов (например, проведение циклов замораживания-оттаивания или обработка суспензии клеток ультразвуком).2. Using physical methods (for example, conducting freeze-thaw cycles or sonicating a cell suspension).
3. С использованием химических методов (например, обработка клеточной суспензии детергентами, которые разрушают липидный бислой клеточных и внутриклеточных мембран).3. Using chemical methods (for example, treating a cell suspension with detergents that destroy the lipid bilayer of cell and intracellular membranes).
4. Сочетанием вышеперечисленных методов (механическое перетирание ткани с последующем проведением циклов замораживания-оттаивания).4. A combination of the above methods (mechanical abrasion of the tissue, followed by freeze-thaw cycles).
В нашей работе мы изучали разные способы приготовления ТА и остановились на сочетании механического истирания с последующим проведением циклов замораживания-оттаивания. Мы выбрали данный метод как наиболее простой и быстро выполнимый. Однако проведенные нами исследования показали, что другие (вышеперечисленные методы) позволяют добиться такого же результата (изменяется время манипуляции, ряд методов требует дополнительного оборудования). В своей работе мы определяли уровень активности внутрилизосомальных ферментов (в частности, кислой фосфатазы) в супернатанте после разрушения тканей различными методами. Нами не было зафиксировано достоверных отличий при использовании разных методов разрушения тканей. Таким образом, данный «тканеспецифичный антиген», по нашему мнению, может быть получен любым известным способом.In our work, we studied different methods of preparing TA and settled on the combination of mechanical abrasion followed by freeze-thaw cycles. We chose this method as the simplest and fastest executable. However, our studies have shown that others (the above methods) can achieve the same result (the manipulation time varies, a number of methods require additional equipment). In our work, we determined the level of activity of intralysosomal enzymes (in particular, acid phosphatase) in the supernatant after tissue destruction by various methods. We have not recorded significant differences when using different methods of tissue destruction. Thus, this "tissue-specific antigen", in our opinion, can be obtained by any known method.
В нашей работе мы также изучали разные способы получения тканеспецифического антигена, тканеспецифический антиген, может быть получен не только при помощи центрифугирования и последующего фильтрования, но и он может быть в виде гомогената или супернанатата. Основным условием при этом является то, что он является тканеспецифическим антигеном ткани органа, «соответствующего поврежденному».In our work, we also studied different methods for producing a tissue-specific antigen, a tissue-specific antigen can be obtained not only by centrifugation and subsequent filtration, but it can also be in the form of a homogenate or supernanate. The main condition in this case is that it is a tissue-specific antigen of the tissue of the organ “corresponding to the damaged one”.
4 этап: Культивирование с использованием тканеспецифического антигенаStage 4: Cultivation using tissue-specific antigen
Полученные клетки, а именно лейкоциты периферической крови и стволовые и/или прогениторные клетки, ресуспендируют в культуральной ростовой среде. В среду для культивирования клеток также добавляется тканеспецифический антиген, полученный из ткани того органа, регенерацию клеток которого требуется простимулировать. Клетки и тканеспецифический антиген культивируют совместно при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 и при 95% влажности, в течение 1-60 суток. Супернатант тканеспецифического антигена добавлялся в культуральную среду в соотношении в среднем 1:30 (проверялся диапазон от 1:10 до 1:80).The resulting cells, namely peripheral blood leukocytes and stem and / or progenitor cells, are resuspended in a culture growth medium. A tissue-specific antigen obtained from the tissue of the organ whose cell regeneration is to be stimulated is also added to the cell culture medium. Cells and tissue-specific antigen are cultured together at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and at 95% humidity for 1-60 days. The tissue-specific antigen supernatant was added to the culture medium in an average ratio of 1:30 (the range from 1:10 to 1:80 was tested).
5 этап: Получение композиции проводят вышеуказанным способомStage 5: Preparation of the composition is carried out as described above.
Примеры, подтверждающие эффективность предложенной композиции.Examples confirming the effectiveness of the proposed composition.
Пример 1. Эффективность применения субстрата, полученного из культивированных клеток костного мозга, была изучена в опытах с моделированием дислипидемического повреждения печени у морских свинок.Example 1. The effectiveness of the use of a substrate obtained from cultured bone marrow cells was studied in experiments with modeling dyslipidemic liver damage in guinea pigs.
У морских свинок с хронической дислипидемией в течение 4 месяцев развивается жировая дистрофия печени и резко нарушается морфометрическая характеристика гепатоцитов (таблица 1). Для ускорения восстановительных процессов в печени животным была введена вышеописанная композиция - СККМ. В качестве 1 дозы принимали количество белка, полученное при разрушении 106 клеток культивированных в 5 мл культуральной среды, а также белок, содержащийся в культуральной среде, в которой клетки культивировались в среднем в течение 5 дней. В состав полученных из костного мозга клеток входили: стволовые мезенхимальные клетки (подтверждено культивированием), гемопоэтические прогениторные клетки (CD34+) и лимфоидные клетки. В качестве контроля был использован субстрат, полученный из мононуклеарных клеток периферической крови животных - СПК. Содержание белка в контрольном и опытном субстрате не отличалось друг от друга.In guinea pigs with chronic dyslipidemia, fatty liver develops within 4 months and the morphometric characteristics of hepatocytes are severely impaired (Table 1). To accelerate the recovery processes in the liver, the animals were introduced the above composition - SCKM. The amount of protein obtained by destroying 10 6 cells cultured in 5 ml of culture medium, as well as the protein contained in the culture medium in which cells were cultured on average for 5 days, was taken as 1 dose. The cells obtained from bone marrow included: stem mesenchymal cells (confirmed by cultivation), hematopoietic progenitor cells (CD34 +) and lymphoid cells. As a control, we used a substrate obtained from mononuclear cells of peripheral blood of animals - SEC. The protein content in the control and experimental substrate did not differ from each other.
Как видно из представленных данных (табл.1), введение СПК повышало регенерационную способность гепатоцитов при жировой дистрофии печени. Однако данный эффект был недостаточно выражен. Введение СККМ приводит к достоверному повышению процессов регенерации гепатоцитов в печени экспериментальных животных.As can be seen from the data presented (table 1), the introduction of SEC increased the regenerative ability of hepatocytes with fatty liver. However, this effect was not sufficiently pronounced. The introduction of SCKM leads to a significant increase in the processes of hepatocyte regeneration in the liver of experimental animals.
Пример 2. Получения фармакологической композиции при использовании в процессе культивирования тканеспецифического антигена.Example 2. Obtaining a pharmacological composition when used in the process of culturing tissue-specific antigen.
Использование композиции на модели повреждения миокарда крыс методом криодеструкции (КД). На 30 сутки в зоне повреждения ЛЖ происходило формирование рубцовой ткани округлой формы диаметром 6-7 мм со стороны эпикарда и 3 мм со стороны эндокарда; толщина стенки ЛЖ в центре рубца не превышала 1 мм. Как видно из таблицы 2, убыль относительной массы ЛЖ (на единицу массы тела) после криодеструкции составила примерно 13%, а для свободной стенки ЛЖ этот показатель составил 17%.Using the composition on a model of rat myocardial damage by cryodestruction (CD). On the 30th day in the area of the LV damage, the formation of rounded scar tissue with a diameter of 6-7 mm from the side of the epicardium and 3 mm from the side of the endocardium occurred; LV wall thickness in the center of the scar did not exceed 1 mm. As can be seen from table 2, the decrease in the relative mass of the left ventricle (per unit mass) after cryodestruction was approximately 13%, and for the free wall of the left ventricle this indicator was 17%.
Площадь некроза после криодеструкции по отношению к общей площади свободной стенки ЛЖ составила со стороны эпикарда 25.1±3.6%, со стороны эндокарда - 23.0±4.2%. Площадь трансмурального некроза после криодеструкции по отношению к общей площади свободной стенки ЛЖ составила со стороны эпикарда 11.4±0.7%, со стороны эндокарда - 6.4±2.5%.The area of necrosis after cryodestruction with respect to the total area of the left LV wall was 25.1 ± 3.6% on the epicardial side and 23.0 ± 4.2% on the endocardial side. The area of transmural necrosis after cryodestruction with respect to the total area of the free wall of the LV was 11.4 ± 0.7% from the side of the epicardium and 6.4 ± 2.5% from the side of the endocardium.
Таким образом, проведенная морфометрия макропрепаратов поврежденного сердца позволила установить достоверное снижение мышечной массы ЛЖ, что неизбежно должно было бы привести к снижению его сократительной активности.Thus, the morphometry of macro preparations of the damaged heart made it possible to establish a significant decrease in LV muscle mass, which would inevitably lead to a decrease in its contractile activity.
Основные этапы:Main steps:
а) Получение стволовых и прогениторных клеток.a) Obtaining stem and progenitor cells.
Стволовые клетки и прогениторные клетки получали от интактного животного той же линии. Костный мозг забирали у животного, находящегося под общим эфирным наркозом, из бедренной кости, пунктируя кость и промывая ее раствором Хенкса. Эритроциты удаляли, добавляя к полученной суспензии лизирующий раствор в соотношении 1:10. После добавления лизирующего раствора клетки центрифугировали и полученный осадок ресуспендировали раствором Хенкса.Stem cells and progenitor cells were obtained from an intact animal of the same line. Bone marrow was taken from an animal under general ether anesthesia from the femur, puncturing the bone and washing it with Hanks solution. Red blood cells were removed by adding to the resulting suspension a lysing solution in a ratio of 1:10. After adding the lysis solution, the cells were centrifuged and the resulting pellet was resuspended in Hanks solution.
б) Лейкоциты периферической крови получали: 2 мл гепаринизированной крови смешивают с 1 мл подогретого до 37°С 3% раствора желатина и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 мин. После оседания эритроцитов слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, отбирают в пластиковые пробирки и отмывали 10-кратным объемом фосфатно-солевого буфера (рН=7,4). Затем лейкоциты после центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин ресуспендируют в растворе Хенкса без Са2+ и Mg2+. После подсчета числа лейкоцитов концентрацию клеток доводят до 106 кл.b) The peripheral blood leukocytes received: 2 ml of heparinized blood is mixed with 1 ml of a 3% gelatin solution heated to 37 ° C and incubated in an incubator at 37 ° C for 30 minutes. After erythrocyte sedimentation, the plasma layer enriched in leukocytes was taken into plastic tubes and washed with a 10-fold volume of phosphate-saline buffer (pH = 7.4). Then, the leukocytes after centrifugation for 10 min at 1000 rpm are resuspended in a Hanks solution without Ca 2+ and Mg 2+ . After counting the number of leukocytes, the cell concentration was adjusted to 10 6 cells.
в) Получение тканеспецифического антигена (ТА):c) Obtaining tissue-specific antigen (TA):
ТА получали из сердца интактных крыс. Ткань сердца массой 500 мг тщательно механически измельчали ножницами (размер отдельных фрагментов не превышал 0,5 мм) при температуре 4°С. Затем ткань заливали раствором Хенкса в соотношении 1:1 и помещали в морозильную камеру на 1 час, затем ткань размораживали, данный цикл повторяли 3 раза. Гомогенат ткани сердца центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант отбирают и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм для обеспечения стерильности раствора. Концентрация белка в растворе находилась в диапазоне от 0,5 до 1 мг/мл (по методу Лоури).TA was obtained from the heart of intact rats. A 500 mg heart tissue was thoroughly mechanically crushed with scissors (the size of individual fragments did not exceed 0.5 mm) at a temperature of 4 ° C. Then the fabric was poured with Hanks' solution in a ratio of 1: 1 and placed in the freezer for 1 hour, then the fabric was thawed, this cycle was repeated 3 times. The homogenate of the heart tissue is centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes. The supernatant is collected and filtered through a filter with a pore diameter of 0.22 μm to ensure sterility of the solution. The concentration of protein in the solution was in the range from 0.5 to 1 mg / ml (according to the Lowry method).
г) Полученные стволовые клетки и прогениторные клетки, а также лейкоциты периферической крови помещали в культуральную среду, состоящую из среды культивирования DMEM, 10% бычьей фетальной сыворотки. Одновременно с внесением клеток в культуральную среду вносили супернатант, содержащий тканеспецифический антиген. Супернатант тканеспецифического антигена добавлялся в культуральную среду в соотношении в среднем 1:30. Клетки культивировали в среднем в течение 7 суток (от 1 до 15 суток) при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 и при 95% влажности.d) The resulting stem cells and progenitor cells, as well as peripheral blood leukocytes, were placed in a culture medium consisting of DMEM culture medium, 10% bovine fetal serum. Simultaneously with the introduction of cells into the culture medium, a supernatant containing a tissue-specific antigen was introduced. The tissue-specific antigen supernatant was added to the culture medium in an average ratio of 1:30. Cells were cultured on average for 7 days (1 to 15 days) at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and at 95% humidity.
В состав культивированных клеток входили: стволовые мезенхимальные клетки (подтверждено культивированием), гемопоэтические прогениторные клетки (CD34+) и лимфоидные клетки.The composition of the cultured cells included: stem mesenchymal cells (confirmed by cultivation), hematopoietic progenitor cells (CD34 +) and lymphoid cells.
д) Разрушение культивируемых клеток в культуральной среде после их культивирования.e) Destruction of cultured cells in the culture medium after their cultivation.
После культивирования клетки в культуральной среде подвергали разрушению - 2 цикла замораживания-оттаивания и обработка ультразвуком.After cultivation, the cells in the culture medium were destroyed - 2 cycles of freezing and thawing and sonication.
е) Из полученной композиции готовили инъекционные препараты, которые вводили животному внутрибрюшинно в течение 7 дней (опытная группа). В качестве 1-го контроля использовали композицию, состоящую из культуральной среды и разрушенных культивированных клеток, которые культивировались без добавления тканеспецифичного антигена. В качестве 1-й дозы принимали количества белка получаемое из 106 клеток, которые культивировались в 10 мл культуральной среды. В качестве 2-го контроля использовали композицию, состоящую из культуральной среды и разрушенных клеток, которые не культивировались (106 клеток и 10 мл культуральной среды).f) Injection preparations were prepared from the obtained composition, which were administered intraperitoneally to the animal for 7 days (experimental group). As the 1st control, a composition consisting of culture medium and destroyed cultured cells that were cultured without the addition of tissue-specific antigen was used. The amount of protein obtained from 10 6 cells, which were cultured in 10 ml of culture medium, was taken as the first dose. As the 2nd control, a composition consisting of culture medium and destroyed cells that were not cultured (10 6 cells and 10 ml of culture medium) was used.
При введении животным с криодеструкцией (КД) контрольной (2-я контрольная группа) композиции, которая получалась из некультивированных клеток, нами было отмечено увеличение массы миокарда, улучшение сократительной способности сердца, однако ни в одном из проведенных опытов не было получено полного восстановления сердечной мышцы. В 1-й контрольной группе животных с КД, которым вводили композицию, которая получалась из культивированных клеток, но без добавления тканеспецифичного антигена, нами была отмечена достоверно более полная регенерация поврежденного органа. Следует отметить, что масса левого желудочка у крыс (опытная группа) с КД, которым в композицию, получаемую из культивированных клеток, к которым в процессе культивации был добавлен тканеспецифический антиген, достоверно не отличалась от массы миокарда интактных животных (таблица 2) и была достоверно выше по сравнению с 1-м и 2-м контролем. Уровень митозов в опытной группе был достоверно выше по сравнению с 1-й и 2-й группой.When the control (2nd control group) composition, which was obtained from uncultured cells, was introduced to animals with cryodestruction (CD), we noted an increase in myocardial mass, an improvement in the contractility of the heart, however, in none of the experiments we obtained a complete restoration of the heart muscle . In the 1st control group of animals with CD, which was administered a composition that was obtained from cultured cells, but without the addition of tissue-specific antigen, we noted a significantly more complete regeneration of the damaged organ. It should be noted that the mass of the left ventricle in rats (experimental group) with CD, which did not significantly differ from the myocardial mass of intact animals in the composition obtained from cultured cells to which tissue-specific antigen was added during cultivation (table 2) and was significantly higher compared to the 1st and 2nd control. The mitosis level in the experimental group was significantly higher compared with the 1st and 2nd group.
Пример 3.Example 3
Эффективность применения композиции, полученной из лимфоидных, стволовых и прогениторных клеток, полученных из периферической крови животных, для лечения острого токсического гепатита.The effectiveness of the use of compositions obtained from lymphoid, stem and progenitor cells obtained from the peripheral blood of animals for the treatment of acute toxic hepatitis.
В работе использовали крыс с моделью острого токсического гепатита (введение п/кожно 0,1 мл 40% масляного раствора CCL4 в течение 14 дней).Rats with a model of acute toxic hepatitis were used in the study (administration of subcutaneous 0.1 ml of a 40% CCL 4 oil solution for 14 days).
Фармакологическую композицию готовили из культивированных лимфоидных, стволовых и прогениторных клеток, полученных из периферической крови. Для повышения числа стволовых и прогениторных клеток в периферической крови животному перед забором клеток вводили в течение 2 дней в/в Г-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). Ведение препарата позволило повысить уровень гемопоэтических стволовых клеток с 0,5% (контроль) до 3,5% от общего количества мононуклеарных клеток в периферической крови. В состав полученных из периферической крови клеток входили: гемопоэтические прогениторные клетки (CD34+) и лимфоидные клетки. Среди полученных для дальнейшего культивирования клеток отсутствовали мезенхимальные стволовые клетки, что было подтверждено в процессе культивирования.The pharmacological composition was prepared from cultured lymphoid, stem and progenitor cells obtained from peripheral blood. To increase the number of stem and progenitor cells in peripheral blood, an animal was injected with G-CSF (granulocyte colony stimulating factor) for 2 days before taking the cells. Administration of the drug allowed to increase the level of hematopoietic stem cells from 0.5% (control) to 3.5% of the total number of mononuclear cells in peripheral blood. The cells obtained from peripheral blood included hematopoietic progenitor cells (CD34 +) and lymphoid cells. Among the cells obtained for further cultivation, there were no mesenchymal stem cells, which was confirmed during cultivation.
а) Получение прогениторных клеток и лейкоцитов из периферической крови.a) Obtaining progenitor cells and white blood cells from peripheral blood.
2 мл гепаринизированной крови смешивали с 1 мл подогретого до 37°С 3% раствора желатина и инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин. После оседания эритроцитов слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, отбирали в пластиковые пробирки и отмывали 10-кратным объемом фосфатно-солевого буфера (рН=7,4). Затем лейкоциты после центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин ресуспендировали в растворе Хенкса без Са2+ и Mg2+ После подсчета числа лейкоцитов концентрацию клеток доводили до 106 кл. Присутствие среди выделенных лейкоцитов гемопоэтических прогениторных клеток (CD34+) подтверждено с использованием проточного цитофлюориметра.2 ml of heparinized blood was mixed with 1 ml of a 3% gelatin solution heated to 37 ° C and incubated in an incubator at 37 ° C for 30 minutes. After erythrocyte sedimentation, the plasma layer enriched in leukocytes was taken into plastic tubes and washed with a 10-fold volume of phosphate-saline buffer (pH = 7.4). Then, the leukocytes after centrifugation for 10 min at 1000 rpm were resuspended in a Hanks solution without Ca 2+ and Mg 2+. After counting the number of leukocytes, the cell concentration was adjusted to 10 6 cells. The presence of hematopoietic progenitor cells (CD34 +) among the isolated leukocytes was confirmed using a flow cytometer.
б) Тканеспецифичесий антиген (ТА) получали из печени интактных крыс. Ткань печени массой 500 мг тщательно механически измельчали ножницами (размер отдельных фрагментов не превышал 0,5 мм) при температуре 4°С. Затем ткань заливали раствором Хенкса в соотношении 1:1 и помещали в морозильную камеру на 1 час, затем ткань размораживали, данный цикл повторяли 3 раза. Полученный гомогенат подвергали обработке ультразвуком. Гомогенат ткани печени центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант отбирали и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм для обеспечения стерильности раствора. Концентрация белка в растворе находилась в диапазоне от 0,5 до 1 мг/мл (по методу Лоури).b) Tissue-specific antigen (TA) was obtained from the liver of intact rats. Liver tissue weighing 500 mg was carefully mechanically crushed with scissors (the size of individual fragments did not exceed 0.5 mm) at a temperature of 4 ° C. Then the fabric was poured with Hanks' solution in a ratio of 1: 1 and placed in the freezer for 1 hour, then the fabric was thawed, this cycle was repeated 3 times. The resulting homogenate was subjected to sonication. Liver tissue homogenate was centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes. The supernatant was collected and filtered through a filter with a pore diameter of 0.22 μm to ensure sterility of the solution. The concentration of protein in the solution was in the range from 0.5 to 1 mg / ml (according to the Lowry method).
в) Полученные прогениторные клетки, а также лейкоциты помещали в культуральную среду, состоящую из среды культивирования DMEM, 10% бычьей фетальной сыворотки. Одновременно с внесением клеток в культуральную среду вносили супернатант, содержащий тканеспецифический антиген. Супернатант тканеспецифического антигена добавлялся в культуральную среду в соотношении в среднем 1:30. Клетки культивировали в среднем в течение 10 суток (от 5 до 30 суток) при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 и при 95% влажности.c) The obtained progenitor cells, as well as leukocytes, were placed in a culture medium consisting of DMEM cultivation medium, 10% bovine fetal serum. Simultaneously with the introduction of cells into the culture medium, a supernatant containing a tissue-specific antigen was introduced. The tissue-specific antigen supernatant was added to the culture medium in an average ratio of 1:30. Cells were cultured on average for 10 days (5 to 30 days) at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and at 95% humidity.
В состав культивированных клеток входили: гемопоэтические прогениторные клетки (CD34+) и лимфоидные клетки.The composition of the cultured cells included: hematopoietic progenitor cells (CD34 +) and lymphoid cells.
г) Культивированные клетки вместе с культуральной средой разрушали (механически истирались, озвучивались ультразвуком, подвергались нескольким циклам замораживания-оттаивания).d) The cultured cells together with the culture medium were destroyed (mechanically abraded, sonicated by ultrasound, subjected to several cycles of freezing and thawing).
За дозу вводимой композиции принимали количество белка, получаемого при разрушении 106 клеток, а также белок, содержащийся в 5 мл куьтуральной среды, в которой содержались эти клетки в течение 5 суток. В качестве контроля использовали разрушенные некультивированные клетки периферической крови и культуральную среду, в которой клетки не культивировали.The dose of the injected composition was taken as the amount of protein obtained by the destruction of 10 6 cells, as well as the protein contained in 5 ml of culture medium in which these cells were kept for 5 days. Destroyed uncultured peripheral blood cells and a culture medium in which the cells were not cultured were used as a control.
Полученную композицию вводили животным подкожно ежедневно в течение 7 дней.The resulting composition was administered to animals subcutaneously daily for 7 days.
Эффективность лечения оценивали по данным биохимии крови.The effectiveness of the treatment was evaluated according to blood biochemistry.
Как видно из данных, представленных чертеже, через 1 неделю после начала введения CCL4 в крови животных наблюдается резкий (в 2,5 раза) подъем уровня трансаминаз (АсТ), что свидетельствует о цитолитическом действии токсина. Ведение композиции, полученной из разрушенных, культивированных клеток периферической крови и культуральной среды, в которой эти клетки культивировались, приводит к выраженному и достоверному лечебному эффекту, который проявляется нормализацией уровня трансаминаз. (За 100% процентов принят уровень фермента в крови интактных крыс.)As can be seen from the data presented in the drawing, 1 week after the start of CCL4 administration in the blood of animals, a sharp (2.5-fold) increase in the level of transaminases (AcT) is observed, which indicates the cytolytic effect of the toxin. The administration of a composition obtained from destroyed, cultured peripheral blood cells and the culture medium in which these cells were cultured leads to a pronounced and reliable therapeutic effect, which is manifested by the normalization of transaminases. (The enzyme level in the blood of intact rats was taken as 100%.)
Проведенные нами эксперименты на животных продемонстрировали, что композиция, полученная из кондиционированной культуральной среды и разрушенных культивированных клеток, увеличивает процесс регенерации клеток в поврежденном органе. Композиция, состоящая из кондиционированной культуральной среды и разрушенных культивированных клеток, которые были культивированы с добавлением в культуральную среду тканеспецифичного антигена, также достоверно повышает процесс регенерации в поврежденном органе и может быть использована для лечения острых и хронических воспалительных и дегенеративных заболеваний внутренних органов и кожных покровов.Our experiments on animals have demonstrated that the composition obtained from the conditioned culture medium and destroyed cultured cells increases the cell regeneration process in the damaged organ. The composition, consisting of conditioned culture medium and destroyed cultured cells, which were cultured with the addition of tissue-specific antigen to the culture medium, also significantly increases the regeneration process in the damaged organ and can be used to treat acute and chronic inflammatory and degenerative diseases of internal organs and skin integuments.
Claims (20)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006146795/15A RU2341270C2 (en) | 2006-12-28 | 2006-12-28 | Composition for stimulation of cell growth and regeneration, and methods of production thereof |
| PCT/RU2007/000717 WO2008082323A1 (en) | 2006-12-28 | 2007-12-19 | Growth stimulating and cell regenerating composition and a method for the production thereof. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006146795/15A RU2341270C2 (en) | 2006-12-28 | 2006-12-28 | Composition for stimulation of cell growth and regeneration, and methods of production thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006146795A RU2006146795A (en) | 2008-07-10 |
| RU2341270C2 true RU2341270C2 (en) | 2008-12-20 |
Family
ID=39588851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006146795/15A RU2341270C2 (en) | 2006-12-28 | 2006-12-28 | Composition for stimulation of cell growth and regeneration, and methods of production thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2341270C2 (en) |
| WO (1) | WO2008082323A1 (en) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2455354C1 (en) * | 2010-12-29 | 2012-07-10 | Антонина Ивановна Колесникова | Skin and mucosa cell renewal composition |
| RU2512681C2 (en) * | 2012-08-22 | 2014-04-10 | Антонина Ивановна Колесникова | Chronic wound and/or wound chamber healing technique |
| RU2574017C1 (en) * | 2014-09-30 | 2016-01-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Medication for treating burns and wounds based on cytokines and growth factors, secreted by mesenchymal human cells, method for thereof obtaining and method for treating burns and wounds |
| US9289459B2 (en) | 2009-03-27 | 2016-03-22 | Moleac Pte. Ltd. | Therapy for promoting cell growth |
| RU2620167C1 (en) * | 2015-12-21 | 2017-05-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method for obtaining preparation for stimulation of regeneration based on products of secretion of human multipotent mesenchymal stromal cells |
| RU2620342C1 (en) * | 2016-05-11 | 2017-05-24 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Генная И Клеточная Терапия" (Ооо "Генная И Клеточная Терапия") | Cosmetic means on the basis of secrection products of mesenchemical stem/stormal cells of fatty fabric of human and the method of its production |
| RU2621867C1 (en) * | 2016-04-27 | 2017-06-07 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Инновационные клеточные технологии" | Composition for skin and mucous membranes regeneration |
| RU2637407C1 (en) * | 2016-06-01 | 2017-12-04 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" (НИИФКИ) | Method of obtaining conditioned media with regenerative potential for intranasal introduction in treatment of diseases of central nervous system |
| WO2017209658A1 (en) * | 2016-05-31 | 2017-12-07 | T-Helper Cell Technologies, Llc | Stem cell material, compositions, and methods of use |
| RU2646791C1 (en) * | 2016-12-13 | 2018-03-07 | Акаев Ислам Умарович | Remedy for cats with regenerative activity |
| RU2646792C1 (en) * | 2016-12-13 | 2018-03-07 | Акаев Ислам Умарович | Horse remedy with regenerative activity |
| RU2646793C1 (en) * | 2016-12-13 | 2018-03-07 | Акаев Ислам Умарович | Dog remedy regenerative activity |
| RU2662172C2 (en) * | 2016-12-13 | 2018-07-24 | Акаев Ислам Умарович | Method for producing regenerative veterinary preparation based on extract of mesenchimal stem cells and conditioned medium |
| EA032369B1 (en) * | 2016-07-11 | 2019-05-31 | Махир Мамед оглы Алиев | Method for treating inflammatory diseases of the oral mucosa associated with concomitant chronic pathology |
| US10744160B2 (en) | 2014-12-01 | 2020-08-18 | T-Helper Cell Technologies, Llc | Stem cell material and method of manufacturing |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60243018A (en) * | 1984-05-17 | 1985-12-03 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | Endogeneous human carcinostatic factor |
| US6372494B1 (en) * | 1999-05-14 | 2002-04-16 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Methods of making conditioned cell culture medium compositions |
| US20060234375A1 (en) * | 2004-09-30 | 2006-10-19 | Doronin Sergey V | Use of human stem cells and/or factors they produce to promote adult mammalian cardiac repair through cardiomyocyte cell division |
-
2006
- 2006-12-28 RU RU2006146795/15A patent/RU2341270C2/en not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-12-19 WO PCT/RU2007/000717 patent/WO2008082323A1/en active Application Filing
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10188688B2 (en) | 2009-03-27 | 2019-01-29 | Moleac Pte. Ltd. | Therapy for promoting cell growth |
| US9289459B2 (en) | 2009-03-27 | 2016-03-22 | Moleac Pte. Ltd. | Therapy for promoting cell growth |
| RU2455354C1 (en) * | 2010-12-29 | 2012-07-10 | Антонина Ивановна Колесникова | Skin and mucosa cell renewal composition |
| RU2512681C2 (en) * | 2012-08-22 | 2014-04-10 | Антонина Ивановна Колесникова | Chronic wound and/or wound chamber healing technique |
| RU2574017C1 (en) * | 2014-09-30 | 2016-01-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Medication for treating burns and wounds based on cytokines and growth factors, secreted by mesenchymal human cells, method for thereof obtaining and method for treating burns and wounds |
| US10744160B2 (en) | 2014-12-01 | 2020-08-18 | T-Helper Cell Technologies, Llc | Stem cell material and method of manufacturing |
| RU2620167C1 (en) * | 2015-12-21 | 2017-05-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method for obtaining preparation for stimulation of regeneration based on products of secretion of human multipotent mesenchymal stromal cells |
| RU2621867C1 (en) * | 2016-04-27 | 2017-06-07 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Инновационные клеточные технологии" | Composition for skin and mucous membranes regeneration |
| RU2620342C1 (en) * | 2016-05-11 | 2017-05-24 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Генная И Клеточная Терапия" (Ооо "Генная И Клеточная Терапия") | Cosmetic means on the basis of secrection products of mesenchemical stem/stormal cells of fatty fabric of human and the method of its production |
| WO2017209658A1 (en) * | 2016-05-31 | 2017-12-07 | T-Helper Cell Technologies, Llc | Stem cell material, compositions, and methods of use |
| RU2708329C2 (en) * | 2016-05-31 | 2019-12-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Т-Хелпер Клеточные Технологии" | Stem cell material, compositions and methods of use |
| US11376283B2 (en) | 2016-05-31 | 2022-07-05 | T-Helper Cell Technologies, Llc | Stem cell material, compositions, and methods of use |
| RU2637407C1 (en) * | 2016-06-01 | 2017-12-04 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" (НИИФКИ) | Method of obtaining conditioned media with regenerative potential for intranasal introduction in treatment of diseases of central nervous system |
| EA032369B1 (en) * | 2016-07-11 | 2019-05-31 | Махир Мамед оглы Алиев | Method for treating inflammatory diseases of the oral mucosa associated with concomitant chronic pathology |
| RU2646792C1 (en) * | 2016-12-13 | 2018-03-07 | Акаев Ислам Умарович | Horse remedy with regenerative activity |
| RU2646793C1 (en) * | 2016-12-13 | 2018-03-07 | Акаев Ислам Умарович | Dog remedy regenerative activity |
| RU2662172C2 (en) * | 2016-12-13 | 2018-07-24 | Акаев Ислам Умарович | Method for producing regenerative veterinary preparation based on extract of mesenchimal stem cells and conditioned medium |
| RU2646791C1 (en) * | 2016-12-13 | 2018-03-07 | Акаев Ислам Умарович | Remedy for cats with regenerative activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008082323A1 (en) | 2008-07-10 |
| RU2006146795A (en) | 2008-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2341270C2 (en) | Composition for stimulation of cell growth and regeneration, and methods of production thereof | |
| Liu et al. | Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway | |
| AU2015206236B2 (en) | Method for inducing angiogenesis | |
| KR101629151B1 (en) | Composition including stem cell-derived exosome for inducing adipogenic differentiation and adipose tissue regeneration | |
| CN104324053B (en) | A kind of dog stem cell secretion factor reparation liquid of quick healing dog wound tissue | |
| CN101020715B (en) | Process of extracting and preparing deer nerve growth factor (DEER NGF) | |
| CN115025137A (en) | External traditional Chinese medicine extract for promoting wound healing and extraction method and application thereof | |
| RU2391990C1 (en) | Composition for stimulation of cells' growth and regeneration (versions) and method of composition's manufacture (versions) | |
| CN114652703A (en) | Application of aerosol inhalation functional extracellular vesicles in improvement of acute lung injury | |
| US4728637A (en) | Complex of macromolecules extracted from mesenchymal cells for treating chronic degenerative disease | |
| EP4248964A1 (en) | Pharmaceutical composition for treating sepsis, and use thereof | |
| CN111265550A (en) | Stem cell factor liposome for repairing damaged tissues and preparation method thereof | |
| KR101336386B1 (en) | Revellent lymph blood vessel | |
| EP0142109B1 (en) | Macromolecules extracted from cultured mesenchymal cells for the treatment of degenerative diseases | |
| CN115315265B (en) | Use of mitochondria for promoting wound repair and/or wound healing | |
| Araújo et al. | Mesenchymal Stem Cell Secretome: A Potential Biopharmaceutical Component to Regenerative Medicine? | |
| US20230042445A1 (en) | Use of mitochondria to promote wound repair and/or wound healing | |
| JPH03505200A (en) | Processes for the production of therapeutically active agents, especially for use in wound care or geriatrics, and preparations containing such agents. | |
| WO2008121027A1 (en) | Growth stimulating and cell regenerating composition and a method for carrying out said method | |
| CN110448682B (en) | External medicine for treating eczema and preparation method and application thereof | |
| US20020114846A1 (en) | Amniotic apoptosis modulating substances | |
| Ji et al. | Platelet-rich plasma enhanced MSCs repair for glycerin-induced acute kidney injury via AKT/Rab27 paracrine pathway | |
| CN116396935A (en) | M2 type macrophage exosome and application thereof | |
| CN110974942A (en) | Pharmaceutical composition, pharmaceutical bag, human-derived composite growth factor composite preparation, and preparation method and application thereof | |
| CN114209840A (en) | Application of MIF inhibitor in preparation of medicine for treating osteoarthritis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171229 |