RU2323252C1 - Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo - Google Patents
Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo Download PDFInfo
- Publication number
- RU2323252C1 RU2323252C1 RU2006137581/13A RU2006137581A RU2323252C1 RU 2323252 C1 RU2323252 C1 RU 2323252C1 RU 2006137581/13 A RU2006137581/13 A RU 2006137581/13A RU 2006137581 A RU2006137581 A RU 2006137581A RU 2323252 C1 RU2323252 C1 RU 2323252C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- growth medium
- mesenchymal stem
- stem cells
- cycle
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Заявляемое изобретение относится к биотехнологии, точнее к клеточной технологии, и касается способа культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ех vivo.The claimed invention relates to biotechnology, more specifically to cell technology, and relates to a method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo.
В настоящее время одним из перспективных путей внедрения в медицинскую практику достижений молекулярной и клеточной биологии является трансплантация стволовых клеток с целью замещения в организме поврежденных и изношенных клеток и тканей.At present, one of the promising ways of introducing the achievements of molecular and cellular biology into medical practice is stem cell transplantation in order to replace damaged and worn cells and tissues in the body.
Накопленные экспериментальные данные и начальный опыт клинических испытаний позволяют считать, что клеточные культуры, получаемые из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, имеют хорошие перспективы для использования в разрабатываемых методах трансплантации стволовых клеток при лечении различных заболеваний, связанных с повреждением и потерей клеток в жизненно важных органах.The accumulated experimental data and the initial experience of clinical trials suggest that cell cultures derived from human bone marrow mesenchymal stem cells have good prospects for use in the developed methods of stem cell transplantation in the treatment of various diseases associated with cell damage and loss in vital organs .
Выявлено, что мезенхимальные стволовые клетки обладают иммуномодулирующим эффектом, ингибируют пролиферацию Т-клеток и снижают вероятность возникновения и степень выраженности РТПХ при совместной трансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками. При этом они существенно ускоряют восстановление поврежденного гемопоэза. Полученные данные о том, что мезенхимальные стволовые клетки не содержат мембранных маркеров, характерных для гемопоэтических клеток, а также антигенов гистосовместимости позволяют рассматривать мезенхимальные стволовые клетки как кандидаты не только для аутологичной, но и для аллогенной клеточной терапии.It was revealed that mesenchymal stem cells have an immunomodulatory effect, inhibit T-cell proliferation and reduce the likelihood and severity of GVHD during joint transplantation with hematopoietic stem cells. Moreover, they significantly accelerate the restoration of damaged hematopoiesis. The data obtained that mesenchymal stem cells do not contain membrane markers characteristic of hematopoietic cells, as well as histocompatibility antigens, allow mesenchymal stem cells to be considered as candidates not only for autologous, but also for allogeneic cell therapy.
Результатом трансплантации больным мезенхимальных стволовых клеток костного мозга может быть восстановление популяции стромальных клеток в различных органах. Стромальные клетки являются источником важных цитокинов и ростовых факторов, которые способствуют активированию и нормализации иммунного ответа, сниженного в результате болезни, а также развитию регенеративных процессов в поврежденных тканях и органах.The transplantation of patients with bone marrow mesenchymal stem cells may result in the restoration of the stromal cell population in various organs. Stromal cells are a source of important cytokines and growth factors that contribute to the activation and normalization of the immune response, reduced as a result of the disease, as well as the development of regenerative processes in damaged tissues and organs.
Мезенхимальные стволовые клетки обнаружены в костном мозге, селезенке, тимусе, лимфатических узлах, плевральной и перитонеальной полостях. Наибольшая их концентрация (10-4) обнаружена в костном мозге; в селезенке их примерно на порядок меньше. При этом в костном мозге здоровых доноров их концентрация мала (10-4), поэтому их трудно изолировать, очистить и размножить в культуре до необходимого для эффективной трансплантации количества.Mesenchymal stem cells are found in the bone marrow, spleen, thymus, lymph nodes, pleural and peritoneal cavities. Their highest concentration (10 -4 ) was found in bone marrow; in the spleen, they are about an order of magnitude smaller. Moreover, their concentration in the bone marrow of healthy donors is low (10 -4 ), so it is difficult to isolate, purify and propagate them in culture to the amount necessary for effective transplantation.
В патенте США №5486359, патенте РФ №2164240, патенте РФ №2272839 описаны способы культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ех vivo, осуществляемые в жидкой культуральной среде. Так в патенте РФ №2272839 описан способ пролиферации мезенхимальных стволовых клеток человека, предназначенных для реконструкции костных и хрящевых сегментов, например в травматологической хирургии. В соответствии с этим патентом образец костного мозга человека промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером. Клетки с ядрами подсчитывают с использованием красителя и в среде F12, включающей 10% сыворотки и 1 нг/мг FGF -2, высевают на дно культурального сосуда в количестве 5×106 клеток в виде нефракционированного костного мозга на 10 кв.см сосуда для культуры ткани. Через 48 часов эту среду удаляют, клетки промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером и выдерживают 24-48 часов в среде F12 без каких-либо добавок. Для поддержания остеохондрогенного потенциала в мезенхимальных стволовых клетках и способствования пролиферации клеток в среду добавляют определенную смесь факторов. Полученные клетки использовали в эксперименте на бестимусных мышах для образования кости in vivo.US Pat. No. 5,486,359, RF Patent No. 2164240, RF Patent No. 2272839 describe methods for cultivating ex vivo human mesenchymal stem cells carried out in a liquid culture medium. So in the patent of the Russian Federation No. 2272839 a method for the proliferation of human mesenchymal stem cells is described, intended for the reconstruction of bone and cartilage segments, for example, in trauma surgery. According to this patent, a human bone marrow sample is washed in physiological saline with phosphate buffer. Cells with nuclei were counted using a dye and in F12 medium containing 10% serum and 1 ng / mg FGF -2, seeded on the bottom of the culture vessel in the amount of 5 × 10 6 cells in the form of unfractionated bone marrow per 10 cm2 of culture vessel tissue. After 48 hours, this medium is removed, the cells are washed in physiological saline with phosphate buffer and incubated for 24-48 hours in F12 medium without any additives. To maintain osteochondrogenic potential in mesenchymal stem cells and to promote cell proliferation, a certain mixture of factors is added to the medium. The obtained cells were used in an experiment in nude mice for in vivo bone formation.
Известен способ культивирования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, предназначенных для восстановления сократительной функции миокарда (Шумаков В.И. и соавт. «Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда». Российский кардиологический журнал. Том 43, 2003 г., стр.42-50, №5). В соответствии с этим способом из пунктата аутологичных клеток костного мозга, взятого из гребня подвздошной кости больного в количестве 150-300 мл, лизировали гипотоническим раствором эритроциты и тромбоциты. Гемолизированный супернатант полностью удаляли, а ядросодержащие клетки суспендировали в ростовой среде Iscove's (Gibco, Grand Island) и высаживали в чашки Петри диаметром 150 кв.мм. Чашки помещали в CO2-инкубатор в атмосферу газовой смеси, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха, при 95% влажности и 37°С. В конце вторых суток в среду на 72 часа вводили деметилирующий агент 5-азацитидин в концентрации 6 мкМ для индукции процесса дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в направлении кардиомиоцитов. За 2-3 месяца культивирования в ростовой среде с добавлением различных факторов роста производных мезенхимальных стволовых клеток - кардиомиоцитов удалось вырастить 15-50 млн клеток, которые снимали со дна чашки Петри с использованием трипсина.A known method of cultivating autologous mesenchymal stem cells of the bone marrow designed to restore contractile function of the myocardium (V. Shumakov et al. "The first experience of the clinical use of autologous mesenchymal stem cells of the bone marrow to restore contractile function of the myocardium." Russian Journal of Cardiology. Volume 43, 2003, pp. 42-50, No. 5). In accordance with this method, from a puncture of autologous bone marrow cells taken from the iliac crest of the patient in an amount of 150-300 ml, red blood cells and platelets were lysed with a hypotonic solution. The hemolyzed supernatant was completely removed, and the nucleated cells were suspended in Iscove's growth medium (Gibco, Grand Island) and planted in 150 mm square Petri dishes. The cups were placed in a CO 2 incubator in an atmosphere of a gas mixture containing 5% CO 2 and 95% air, at 95% humidity and 37 ° C. At the end of the second day, on Wednesday, a demethylating agent 5-azacytidine was introduced at a concentration of 6 μM for 72 hours to induce the process of differentiation of mesenchymal stem cells in the direction of cardiomyocytes. Over 2-3 months of cultivation in a growth medium with the addition of various growth factors of mesenchymal stem cell derivatives, cardiomyocytes, 15-50 million cells were grown that were removed from the bottom of a Petri dish using trypsin.
Указанная технология позволяет вырастить производные мезенхимальных стволовых клеток - кардиомиоциты в количестве, достаточном для восстановления сократительной функции миокард, только из 150-300 мл костного мозга, взятого у больного. При использовании столь большого количества костного мозга в процессе указанного метода культивирования наблюдают повреждение и потерю клеток, в том числе при приготовлении клеточной суспензии, что не обеспечивает условий для умножения популяции кардиомиоцитов и использования указанного способа в терапии для лечения кардиомиопатий различной этиологии.This technology allows you to grow derivatives of mesenchymal stem cells - cardiomyocytes in an amount sufficient to restore contractile function of the myocardium, only from 150-300 ml of bone marrow taken from a patient. When using such a large amount of bone marrow during the indicated cultivation method, cell damage and loss are observed, including in the preparation of a cell suspension, which does not provide conditions for the multiplication of the cardiomyocyte population and the use of this method in therapy for the treatment of cardiomyopathies of various etiologies.
В качестве прототипа выбран способ культивирования из клеток костного мозга таких производных мезенхимальных стволовых клеток, как стромальные фибробласты (патент РФ №2142285, МКИ А61К 35/28, публ. 10.12.97). В соответствии с описанным способом образец костного мозга кролика калифорнийской породы суспендировали в питательной среде L-MEM, затем фильтровали и ядросодержащие клетки высевали в культуральный сосуд из расчета 104-105 на 1 кв.см дна сосуда. Культивирование проводили на синтетических средах L-MEM и Фишера, содержащих 20% сыворотки эмбрионов коров и антибиотиков - по 100 ед.пенициллина и стрептомицина в 1 мл среды, в атмосфере, содержащей углекислый газ и воздух, при температуре 37°С. По достижении сплошного монослоя колоний стромальных фибробластов на дне культурального сосуда в сосуд вводили 0,25%-ный раствор трипсина, с помощью которого слой клеток отделяли от дна сосуда и переносили в культуральный сосуд, имеющий большую площадь дна. После проведения 4-5 пассажей число выросших in vitro стромальных клеток во много раз превышает их содержание среди первично эксплантированной суспензии клеток костного мозга.As a prototype, a method of culturing from bone marrow cells such derivatives of mesenchymal stem cells as stromal fibroblasts (RF patent No. 2142285, MKI AK61K 35/28, publ. 10.12.97) was selected. In accordance with the described method, a bone marrow sample of a Californian rabbit was suspended in L-MEM nutrient medium, then filtered and nucleated cells were plated in a culture vessel at a rate of 10 4 -10 5 per 1 cm 2 of the vessel bottom. Cultivation was carried out on synthetic L-MEM and Fisher media containing 20% serum of cow embryos and antibiotics - 100 units of penicillin and streptomycin in 1 ml of medium in an atmosphere containing carbon dioxide and air at a temperature of 37 ° C. Upon reaching a continuous monolayer of stromal fibroblast colonies at the bottom of the culture vessel, a 0.25% trypsin solution was introduced into the vessel, with which the cell layer was separated from the vessel bottom and transferred to a culture vessel with a large bottom area. After 4-5 passages, the number of stromal cells grown in vitro is many times higher than their content among the initially explanted suspension of bone marrow cells.
Однако указанный способ культивирования разработан применительно к костному мозгу животных, кроме того указанная методика не обеспечивает возможности получения из малого количества материала, содержащего ядросодержащие клетки, получить достаточное для лечебных целей количество производных мезенхимальных стволовых клеток, в частности, из-за повреждения значительной части клеток при обработке их раствором трипсина и нарушения их пролиферативного потенциала.However, this method of cultivation was developed in relation to the bone marrow of animals; moreover, this method does not provide the possibility of obtaining from a small amount of material containing nucleated cells, to obtain a sufficient number of derivatives of mesenchymal stem cells for therapeutic purposes, in particular, due to damage to a significant part of the cells during processing them with trypsin solution and violation of their proliferative potential.
В основу заявляемого изобретения положена задача путем создания и поддержания условий, необходимых для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток, разработать способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo, позволяющий из малого исходного количества костного мозга получать в культуре мезенхимальные стволовые клетки в количестве, достаточном для проведения эффективной их трансплантации в терапевтических целях.The basis of the claimed invention is the task, by creating and maintaining the conditions necessary for the vital activity of mesenchymal stem cells, to develop a method of cultivating human mesenchymal stem cells ex vivo, which allows to obtain mesenchymal stem cells in a culture from a small initial amount of bone marrow in an amount sufficient to conduct effective transplantation for therapeutic purposes.
Эта задача решается при разработке способа культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ех vivo, включающего выделение из костного мозга ядросодержащих костномозговых клеток и осуществление по меньшей мере двух циклов их культивирования в ростовой среде до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток, в процессе каждого из которых высевают выделенные клетки в соответствующий культуральный сосуд, в котором в ростовой среде увеличивают популяцию мезенхимальных стволовых клеток до образования из нее сплошного монослоя, который извлекают из культурального сосуда путем обработки монослоя мезенхимальных стволовых клеток раствором трипсина, при этом в процессе каждого последующего цикла культивирования в качестве выделенных клеток используют мезенхимальные стволовые клетки, извлеченные из культурального сосуда предыдущего цикла культивирования, в котором, согласно изобретению, в процессе каждого цикла культивирования регулярно определяют рН ростовой среды и заменяют ростовую среду, рН которой менее 6,0 или более 8,0, на ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0, при этом регулярно элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а для обработки монослоя мезенхимальных стволовых клеток используют 0,03-0,1%-ный раствор трипсина, причем перед и после указанной обработки мезенхимальные стволовые клетки отмывают в изотоническом растворе от следов ростовой среды и следов трипсина соответственно.This problem is solved when developing a method for cultivating ex-vivo human mesenchymal stem cells, which involves the extraction of nucleated bone marrow cells from the bone marrow and the implementation of at least two cycles of their cultivation in a growth medium until a predetermined number of mesenchymal stem cells is obtained, during which each cell is seeded into an appropriate culture vessel, in which a population of mesenchymal stem cells is increased in a growth medium until it forms completely monolayer, which is removed from the culture vessel by treating the monolayer of mesenchymal stem cells with a trypsin solution, and during each subsequent culture cycle, mesenchymal stem cells extracted from the culture vessel of the previous culture cycle, in which, according to the invention, during of each cultivation cycle, the pH of the growth medium is regularly determined and the growth medium, the pH of which is less than 6.0 or more than 8.0, is replaced with a growth medium, pH which ranges from 6.0 to 8.0, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are regularly eliminated, and a 0.03-0.1% trypsin solution is used to process the monolayer of mesenchymal stem cells, and before and after this treatment, mesenchymal stem cells are washed in isotonic solution from traces of the growth medium and traces of trypsin, respectively.
Благодаря изобретению стало возможно получить в культуре 100-500 млн мезенхимальных стволовых клеток из 0,5-1,0 мл исходного количества костного мозга человека, забираемого для диагностических целей при пункции костного мозга из грудины или подвздошной кости пациентов любого возраста.Thanks to the invention, it has become possible to obtain 100-500 million mesenchymal stem cells in a culture from 0.5-1.0 ml of the initial amount of human bone marrow taken for diagnostic purposes by bone marrow puncture from the sternum or ilium of patients of any age.
Согласно изобретению полезно, чтобы в процессе осуществления первого цикла культивирования в культуральный сосуд высевали выделенные ядросодержащие клетки в количестве 5×104-5×105 клеток на 1 кв.см дна сосуда, что обеспечивает достоверную вероятность увеличения из указанного количества клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток.According to the invention, it is useful that, during the first cultivation cycle, 5 × 10 4 -5 × 10 5 cells per 1 cm 2 of the bottom of the vessel are sown in a culture vessel, which provides a reliable probability of an increase in the population of mesenchymal stem cells from the specified number of cells cells.
Согласно изобретению целесообразно увеличение популяции мезенхимальных стволовых клеток в ростовой среде осуществлять в физиологически приемлемых условиях, необходимых для жизнедеятельности этих клеток.According to the invention, it is advisable to increase the population of mesenchymal stem cells in the growth medium under physiologically acceptable conditions necessary for the vital activity of these cells.
Чтобы создать условия для увеличения популяции мезенхимальных стволовых клеток в процессе осуществления каждого последующего цикла культивирования целесообразно использовать культуральный сосуд, площадь дна которого больше площади дна культурального сосула, используемого в процессе осуществления предыдущего цикла культивирования.In order to create conditions for increasing the population of mesenchymal stem cells during each subsequent cultivation cycle, it is advisable to use a culture vessel whose bottom area is larger than the bottom area of the culture vial used in the previous cultivation cycle.
Согласно изобретению полезно в качестве ростовой среды использовать минерально-солевой раствор, содержащий аминокислоты, антибиотики, L-глютамин и эмбриональную телячью сыворотку, в том числе среду RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащую пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).According to the invention, it is useful to use a mineral-salt solution containing amino acids, antibiotics, L-glutamine and fetal calf serum as a growth medium, including RPMI-1640 medium (Sigma, USA) containing penicillin (100 PIECES / ml), streptomycin (100 μg / ml), amphotericin (100 ng / ml), L-glutamine 2 mM (Sigma, USA), 15% fetal calf serum (Sigma, USA).
Согласно изобретению полезно увеличение популяции мезенхимальных стволовых клеток осуществлять в атмосфере, содержащей от 4 до 7,5% углекислого газа, остальное - воздух, и при температуре в интервале от 33 до 38°С, что полностью соответствует физиологически приемлемым условиям, необходимым для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток.According to the invention, it is useful to increase the population of mesenchymal stem cells in an atmosphere containing from 4 to 7.5% carbon dioxide, the rest is air, and at a temperature in the range from 33 to 38 ° C, which fully corresponds to physiologically acceptable conditions necessary for the functioning of mesenchymal stem cells.
Согласно изобретению целесообразно в качестве изотонического раствора использовать физиологический раствор или раствор Хэнкса, не содержащий солей кальция и магния.According to the invention, it is advisable to use a saline solution or Hanks solution that does not contain calcium and magnesium salts as an isotonic solution.
Согласно изобретению полезно в качестве культурального сосуда использовать пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA).According to the invention, it is useful to use a plastic bottle of Carrel ("Sigma", USA) as a culture vessel.
Другие цели и преимущества заявляемого изобретения станут ясны из последующего подробного описания способа культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo и конкретных примеров выполнения этого способа.Other objectives and advantages of the claimed invention will become apparent from the following detailed description of a method for cultivating human mesenchymal stem cells ex vivo and specific examples of this method.
В заявляемой технологии культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ех vivo источником клеток костного мозга служат пунктаты из грудины или подвздошной кости человека. Как правило, пункцию костного мозга проводят в строго стерильных условиях, пунктат в количестве 0,5-1,0 мл, включающий от (15-50)·102 до (30-100)·102 соответственно мезенхимальных стволовых клеток (такое количество костномозгового пунктата обычно используется для диагностических целей), помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA) или буферным раствором, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим получение суспензии осадка в ростовой среде. Далее обычными методами, например, с использованием красителя метилфиолетового, подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии и разбавляют ростовую среду до концентрации, обеспечивающей содержание (1-2)×106 ядросодержащих клеток в 1 мл ростовой среды.In the claimed technology for the cultivation of human mesenchymal stem cells ex vivo, bone marrow cell sources are punctate from the sternum or ilium of a person. As a rule, bone marrow puncture is carried out under strictly sterile conditions, punctate in an amount of 0.5-1.0 ml, including from (15-50) · 10 2 to (30-100) · 10 2 respectively of mesenchymal stem cells (this number bone marrow punctate is usually used for diagnostic purposes), placed in a test tube with heparin (100 IU / ml of punctate). After erythrocyte sedimentation is maintained for 1-2 hours at room temperature, the supernatant is aspirated with a Pasteur pipette, the isolated cells are washed with 199 medium (Sigma, USA) or buffer solution, centrifuged at 1000 rpm for 10 min, followed by a suspension of the sediment in growth environment. Further, by the usual methods, for example, using methyl violet dye, the number of nucleated bone marrow cells in suspension is counted and the growth medium is diluted to a concentration that provides a content of (1-2) × 10 6 nucleated cells in 1 ml of growth medium.
В качестве ростовой среды используют, например, среду RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащую пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).As the growth medium, for example, RPMI-1640 medium (Sigma, USA) containing penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 μg / ml), amphotericin (100 ng / ml), L-glutamine 2 mM ("Sigma", USA), 15% fetal calf serum ("Sigma", USA).
Согласно изобретению культивирование осуществляют по меньшей мере в два цикла, при этом в процессе первого цикла высевают 5×104-5×105 выделенных клеток на 1 кв.см дна первого культурального сосуда. При посеве менее 5×104 клеток на 1 кв.см возможен очень скудный рост мезенхимальных стволовых клеток или даже отсутствие их роста, а при посеве более 5×105 клеток на 1 кв.см наблюдают эффект контактного ингибирования, что также негативно влияет на последующую пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток.According to the invention, the cultivation is carried out in at least two cycles, with 5 × 10 4 -5 × 10 5 isolated cells per 1 cm 2 of the bottom of the first culture vessel being sown during the first cycle. When sowing less than 5 × 10 4 cells per 1 cm 2, very poor growth of mesenchymal stem cells or even the absence of their growth is possible, and when plating more than 5 × 10 5 cells per 1 cm 2 see the effect of contact inhibition, which also negatively affects subsequent proliferation of mesenchymal stem cells.
Культивирование проводят, например, в таких культуральных сосудах, как пластиковые флаконы Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см2.Cultivation is carried out, for example, in such culture vessels as plastic bottles of Carrel ("Sigma", USA) with a bottom area of 25 cm 2 .
В процессе культивирования осуществляют увеличение популяции мезенхимальных стволовых клеток в физиологически приемлемых условиях, необходимых для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток. Согласно изобретению полезно увеличение популяции мезенхимальных стволовых клеток осуществлять в атмосфере, содержащей от 4 до 7,5% углекислого газа, остальное - воздух, и при температуре, исключающей появление повреждающего эффекта, то есть при температуре в интервале от 33 до 38°С, что полностью соответствует физиологически приемлемым условиям, необходимым для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток. Практически это осуществляют путем продувания культурального сосуда газовой смесью, содержащей от 4 до 7,5% углекислого газа, остальное - воздух.During the cultivation process, an increase in the population of mesenchymal stem cells is carried out under physiologically acceptable conditions necessary for the vital activity of mesenchymal stem cells. According to the invention, it is useful to increase the population of mesenchymal stem cells in an atmosphere containing from 4 to 7.5% carbon dioxide, the rest is air, and at a temperature that excludes the appearance of a damaging effect, that is, at a temperature in the range from 33 to 38 ° C, which fully corresponds to physiologically acceptable conditions necessary for the vital activity of mesenchymal stem cells. In practice, this is carried out by blowing the culture vessel with a gas mixture containing from 4 to 7.5% carbon dioxide, the rest is air.
Согласно изобретению в процессе каждого цикла культивирования и увеличения популяции мезенхимальных стволовых клеток регулярно определяют рН ростовой среды и, в том случае, когда в процессе культивирования регистрируют изменение рН среды (вследствие, в том числе, метаболизма клеток) до значения менее 6,0 или более 8,0, осуществляют удаление такой ростовой среды, а в культуральный сосуд сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0. При этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток.According to the invention, during each cultivation cycle and an increase in the population of mesenchymal stem cells, the pH of the growth medium is regularly determined and, in the case when, during the cultivation, a change in the pH of the medium (due to, inter alia, cell metabolism) is recorded to a value of less than 6.0 or more 8.0, this growth medium is removed, and a fresh growth medium is introduced into the culture vessel immediately after removal of the medium with the products of cell metabolism, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0. At the same time, cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated.
Регулярное элиминирование клеток, не относящихся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, обеспечивает условия, необходимые для жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток, благоприятствует их росту, а также способствует образованию в процессе культивирования более чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток.Regular elimination of cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells provides the conditions necessary for the vital activity of mesenchymal stem cells, favors their growth, and also promotes the formation of a cleaner population of mesenchymal stem cells during cultivation.
После образования на дне первого культурального сосуда сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно культурального сосуда, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток в другой культуральный сосуд, как правило, с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из культурального сосуда собственно ростовой среды, затем, согласно изобретению, монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в изотоническом растворе (например, физиологическом растворе или растворе Хэнкса, не содержащем солей кальция и магния) и удаляют следы ростовой среды. Затем в культуральный сосуд вводят, согласно изобретению, 0,03 - 0,1%-ный раствор трипсина для разрушения межклеточных связей в сплошном слое мезенхимальных стволовых клеток и отделения клеток от дна культурального сосуда.After the formation of a continuous monolayer of mesenchymal stem cells at the bottom of the first culture vessel covering the entire bottom of the culture vessel, preparations are made to transfer the grown cell population to another culture vessel, usually with a larger bottom area. To do this, first, the growth medium itself is removed from the culture vessel, then, according to the invention, the monolayer of mesenchymal stem cells is washed in an isotonic solution (for example, physiological saline or Hanks solution that does not contain calcium and magnesium salts) and traces of the growth medium are removed. Then, according to the invention, a 0.03 - 0.1% trypsin solution is introduced into the culture vessel to break down the intercellular connections in a continuous layer of mesenchymal stem cells and separate the cells from the bottom of the culture vessel.
Было найдено, что при использовании 0,03-0,1%-ного раствора трипсина разрушению подвергаются только межклеточные связи в слое мезенхимальных стволовых клеток, при этом не наблюдают повреждений самих мезенхимальных стволовых клеток и, значит, не происходит снижения их пролиферативного потенциала.It was found that when using a 0.03-0.1% trypsin solution, only intercellular bonds in the layer of mesenchymal stem cells are destroyed, while no damage to the mesenchymal stem cells is observed and, therefore, their proliferative potential does not decrease.
Затем раствор трипсина удаляют и вводят, согласно изобретению, в культуральный сосуд изотонический раствор, содержащий сыворотку, например физиологический раствор или раствор Хэнкса, не содержащий солей кальция и магния, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.Then, the trypsin solution is removed and, according to the invention, isotonic solution containing serum, for example, physiological saline or Hanks solution containing no calcium and magnesium salts, is introduced into the culture vessel, and traces of trypsin are inactivated and the prolongation of its action is excluded and, therefore, cell damage.
В изотоническом растворе мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна культурального сосуда, отмывают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин и суспендируют либо в ростовой среде (для последующего пересева), либо в фармакопейном физиологическом растворе, содержащем 10 МЕ/мл гепарина (для последующего использования в терапевтических целях путем трансплантации пациенту мезенхимальных стволовых клеток).In an isotonic solution, mesenchymal stem cells are removed from the bottom of the culture vessel, washed by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes, and suspended either in growth medium (for subsequent reseeding) or in pharmacopoeial physiological solution containing 10 IU / ml heparin (for subsequent therapeutic use by transplantation of mesenchymal stem cells to a patient).
Далее осуществляют высевание взятых в виде суспензии в ростовой среде мезенхимальных стволовых клеток, полученных и выделенных в процессе первого цикла культивирования, во второй культуральный сосуд, площадь дна которого превосходит площадь дна культурального сосуда, используемого на предыдущем цикле культивирования.Then, the mesenchymal stem cells taken as a suspension in the growth medium, obtained and isolated during the first cultivation cycle, are sown in the second culture vessel, the bottom area of which exceeds the bottom area of the culture vessel used in the previous culture cycle.
Необходимо отметить, что каждый раз при замене ростовой среды или пересеве клеточной популяции в новый культуральный сосуд по мере нарастания клеточной массы, осуществляют продувание культурального сосуда газовой смесью, содержащей от 4 до 7,5% углекислого газа, остальное - воздух.It should be noted that each time when the growth medium is replaced or the cell population is reseeded into a new culture vessel as the cell mass increases, the culture vessel is purged with a gas mixture containing from 4 to 7.5% carbon dioxide, the rest is air.
Согласно изобретению второй цикл культивирования, как и каждый возможный последующий цикл культивирования, осуществляют в условиях, аналогичных названным в первом цикле культивирования, с получением заданного количества чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток.According to the invention, the second cultivation cycle, like every possible subsequent cultivation cycle, is carried out under conditions similar to those mentioned in the first cultivation cycle, to obtain a given amount of a pure population of mesenchymal stem cells.
Благодаря заявляемому способу культивирования необходимое для трансплантации количество клеток порядка (2-5)×108 может быть выращено из (15-100)·102 клеток за 35-40 суток культивирования.Thanks to the claimed method of cultivation, the number of cells of the order of (2-5) × 10 8 necessary for transplantation can be grown from (15-100) · 10 2 cells in 35-40 days of cultivation.
Пример 1Example 1
Забор аутологичных клеток костного мозга проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 1,0 мл (такое количество костномозгового пунктата обычно используется для диагностических целей).Autologous bone marrow cells are harvested under local anesthesia under operating conditions by puncture of the donor iliac crest in an amount of 1.0 ml (this amount of bone marrow punctate is usually used for diagnostic purposes).
Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1 часа при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA). Далее обычными методами подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет (1-2)×106.Bone marrow punctate was placed in a test tube with heparin (100 U / ml punctate). After erythrocyte sedimentation was maintained for 1 hour at room temperature, the supernatant was aspirated with a Pasteur pipette, the isolated cells were washed with 199 medium (Sigma, USA), centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, followed by suspension in the growth medium RPMI-1640 (" Sigma ", USA) containing penicillin (100 IU / ml), streptomycin (100 μg / ml), amphotericin (100 ng / ml), L-glutamine 2 mM (" Sigma ", USA), 15% fetal calf serum ( "Sigma", USA). Next, by the usual methods, the number of nucleated bone marrow cells in suspension is calculated, followed by dilution with growth medium to a concentration at which the amount of nucleated cells in 1 ml of growth medium is (1-2) × 10 6 .
Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см2 высевают взятые в виде полученной суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×104 клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона. Флакон продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают в обычный термостат при 37°С.Carry out the first cycle of cultivation. To do this, in a plastic bottle of Carrel (Sigma, USA) with a bottom area of 25 cm 2, the selected bone marrow cells taken as a suspension are sown at the rate of 5 × 10 4 cells per 1 cm 2 of the bottom of the plastic bottle. The bottle is purged with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air, and placed in a conventional thermostat at 37 ° C.
В процессе культивирования регулярно определяют рН ростовой среды. Регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.During the cultivation process, the pH of the growth medium is regularly determined. The change in pH to a value of less than 6.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and fresh growth medium is introduced into the plastic bottle of Carrel immediately after removal of the contaminated medium, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0.
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения более 8,0.After 5 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of more than 8.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh growth medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with cell metabolic products, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
По истечении 4 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения более 8,0.After 4 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of more than 8.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh growth medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with cell metabolic products, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
После образования на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток в другой флакон с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно ростовой среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в физиологическом растворе и удаляют следы ростовой среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,03%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.After the formation of a continuous monolayer of mesenchymal stem cells at the bottom of the Carrel plastic bottle, which covers the entire bottom of the bottle, preparations are made to transfer the grown cell population to another bottle with a larger bottom area. To do this, first, the growth medium itself is removed from the Carrel plastic bottle, then the mesenchymal stem cell monolayer is washed in physiological saline and traces of the growth medium are removed. After that, a 0.03% trypsin solution is introduced into the Carrel plastic bottle and the cell population grown as a monolayer is separated from the bottom of the bottle.
Затем раствор трипсина удаляют и вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, не содержащий солей кальция и магния, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.Then the trypsin solution is removed and Hanks solution containing no salts of calcium and magnesium is introduced into the plastic bottle of Carrel, while traces of trypsin are inactivated and the prolongation of its action and, therefore, cell damage are excluded.
В растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).In the Hanks solution, the mesenchymal stem cells are removed from the bottom of the Carrel plastic bottle, centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, the Hanks solution is removed and suspended in RPMI-1640 growth medium (Sigma, USA).
Далее осуществляют второй, третий и четвертый циклы культивирования. В каждом цикле культивирования используют флаконы Карреля, площадь дна которых превосходит площадь дна флакона Карреля, используемого на предыдущем цикле культивирования. Во каждый флакон Карреля последующего цикла высевают взятые в виде суспензии в указанной ростовой среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе предыдущего цикла культивирования.Next, carry out the second, third and fourth cycles of cultivation. In each cultivation cycle, Carrel bottles are used, the bottom area of which exceeds the bottom area of the Carrel bottle used in the previous cultivation cycle. In each Carrel vial of the subsequent cycle, mesenchymal stem cells obtained and isolated during the previous culture cycle, taken as a suspension in the specified growth medium, are seeded.
При каждом пересеве клеток в новый культуральный флакон осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа и остальное - воздух.At each transplant of cells into a new culture vial, the vial is flushed with a gas mixture containing 4% carbon dioxide and the rest is air.
Циклы культивирования осуществляют до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.Cultivation cycles are carried out until a given number of mesenchymal stem cells is obtained in the form of a pure population.
Необходимое для трансплантации количество клеток порядка (2-5)×108 выращено за 35 суток культивирования.The number of cells required for transplantation of the order of (2-5) × 10 8 was grown during 35 days of cultivation.
Пример 2Example 2
Забор аутологичных клеток костного мозга проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 0,5 мл.Autologous bone marrow cells are harvested under local anesthesia under operating conditions by puncture of the donor iliac crest in an amount of 0.5 ml.
Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата).Bone marrow punctate was placed in a test tube with heparin (100 U / ml punctate).
После отстаивания эритроцитов в течение 2 часов при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA). Далее обычными методами подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет (1-2)×106.After erythrocyte sedimentation was maintained for 2 hours at room temperature, the supernatant was aspirated with a Pasteur pipette, the isolated cells were washed with 199 medium (Sigma, USA), centrifuged at 1000 rpm for 10 min, followed by suspension in the growth medium RPMI-1640 (" Sigma ", USA) containing penicillin (100 IU / ml), streptomycin (100 μg / ml), amphotericin (100 ng / ml), L-glutamine 2 mM (" Sigma ", USA), 15% fetal calf serum ( "Sigma", USA). Next, by the usual methods, the number of nucleated bone marrow cells in suspension is calculated, followed by dilution with growth medium to a concentration at which the amount of nucleated cells in 1 ml of growth medium is (1-2) × 10 6 .
Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см2 высевают взятые в виде полученной суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×105 клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона. Флакон продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают в обычный термостат при 37°С.Carry out the first cycle of cultivation. To do this, in a plastic bottle of Carrel ("Sigma", USA) with a bottom area of 25 cm 2, the selected bone marrow cells taken as a suspension are sown at the rate of 5 × 10 5 cells per 1 cm 2 of the bottom of the plastic bottle. The bottle is purged with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air, and placed in a conventional thermostat at 37 ° C.
При определении изменения рН среды до значения менее 6,0 осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.When determining the change in pH of the medium to a value of less than 6.0, such a growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and fresh growth medium is introduced into the Carrel plastic bottle immediately after removal of the contaminated medium, the pH of which lies within from 6.0 to 8.0.
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
По истечении 4 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения более 8,0.After 4 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of more than 8.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh growth medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with cell metabolic products, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения более 8,0.After 5 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of more than 8.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh growth medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with cell metabolic products, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
После образования на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток в другой флакон с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно ростовой среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в растворе Хэнкса, не содержащем солей кальция и магния, и удаляют следы ростовой среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,1%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.After the formation of a continuous monolayer of mesenchymal stem cells at the bottom of the Carrel plastic bottle, which covers the entire bottom of the bottle, preparations are made to transfer the grown cell population to another bottle with a larger bottom area. To do this, first, the growth medium itself is removed from the Carrel plastic bottle, then the monolayer of mesenchymal stem cells is washed in a Hanks solution that does not contain calcium and magnesium salts, and traces of the growth medium are removed. After that, a 0.1% trypsin solution is introduced into the Carrel plastic bottle and the cell population grown as a monolayer is separated from the bottom of the bottle.
Затем раствор трипсина удаляют и вновь вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.Then the trypsin solution is removed and Hanks solution is again introduced into the plastic bottle of Carrel, while traces of trypsin are inactivated and the prolongation of its action and, therefore, cell damage are excluded.
В растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).In the Hanks solution, the mesenchymal stem cells are removed from the bottom of the Carrel plastic bottle, centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, the Hanks solution is removed and suspended in RPMI-1640 growth medium (Sigma, USA).
Далее осуществляют второй, третий, четвертый и пятый циклы культивирования. В каждом цикле культивирования используют флаконы Карреля, площадь дна которых превосходит площадь дна флакона Карреля, используемого на предыдущем цикле культивирования. В каждый флакон Карреля последующего цикла высевают взятые в виде суспензии в указанной ростовой среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе предыдущего цикла культивирования.Next, carry out the second, third, fourth and fifth cycles of cultivation. In each culture cycle, Carrel bottles are used, the bottom area of which exceeds the bottom area of the Carrel bottle used in the previous culture cycle. In each Carrel vial of the subsequent cycle, mesenchymal stem cells obtained and isolated during the previous cultivation cycle taken as a suspension in the indicated growth medium are seeded.
При каждом пересеве клеток в новый культуральный флакон осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа и остальное - воздух.At each transplant of cells into a new culture vial, the vial is flushed with a gas mixture containing 4% carbon dioxide and the rest is air.
Циклы культивирования осуществляют до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.Cultivation cycles are carried out until a given number of mesenchymal stem cells is obtained in the form of a pure population.
Необходимое для трансплантации количество клеток порядка (2-5)×108 было выращено за 40 суток культивирования.The number of cells needed for transplantation of the order of (2-5) × 10 8 was grown after 40 days of cultivation.
Пример 3Example 3
Забор аутологичных клеток костного мозга проводят у донора, имеющего возраст 7 лет.Autologous bone marrow cells are harvested from a donor who is 7 years old.
Забор клеток проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 1,0 мл.Cell sampling is carried out under local anesthesia in the operating room by puncture the donor ileum crest in an amount of 1.0 ml.
Пунктат костного мозга содержит только чистые клетки костного мозга, незагрязненные клетками перефирической крови.Bone marrow punctate contains only pure bone marrow cells that are not contaminated with peripheral blood cells.
Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата).Bone marrow punctate was placed in a test tube with heparin (100 U / ml punctate).
После отстаивания эритроцитов в течение 1 часа при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).After erythrocyte sedimentation was maintained for 1 hour at room temperature, the supernatant was aspirated with a Pasteur pipette, the isolated cells were washed with 199 medium (Sigma, USA), centrifuged at 1000 rpm for 10 min, followed by suspension in the growth medium RPMI-1640 (" Sigma ", USA) containing penicillin (100 IU / ml), streptomycin (100 μg / ml), amphotericin (100 ng / ml), L-glutamine 2 mM (" Sigma ", USA), 15% fetal calf serum ( "Sigma", USA).
Далее обычными методами подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет примерно 5×107 (при этом содержание МСК составляет 5×103).Next, by the usual methods, the number of nucleated bone marrow cells in suspension is calculated, followed by dilution with growth medium to a concentration at which in 1 ml of growth medium the number of nucleated cells is approximately 5 × 10 7 (the content of MSC is 5 × 10 3 ).
Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см высевают взятые в виде полученной суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×104 клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона. Флакон продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают в обычный термостат при 37°С.Carry out the first cycle of cultivation. To do this, in a plastic bottle of Carrel (Sigma, USA) with a bottom area of 25 cm, the selected bone marrow cells taken as a suspension are sown at the rate of 5 × 10 4 cells per 1 cm2 of the bottom of the plastic bottle. The bottle is purged with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air, and placed in a conventional thermostat at 37 ° C.
В процессе культивирования регулярно определяют рН ростовой среды. Регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.During the cultivation process, the pH of the growth medium is regularly determined. The change in pH to a value of less than 6.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and fresh growth medium is introduced into the plastic bottle of Carrel immediately after removal of the contaminated medium, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0.
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.After 5 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of less than 6.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh growth medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with cell metabolic products, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
По истечении 4 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.After 4 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of less than 6.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh growth medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with cell metabolic products, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
После образования (на 10 день культивирования) на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток в другой флакон с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно ростовой среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в физиологическом растворе и удаляют следы ростовой среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,03%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.After the formation (on the 10th day of cultivation) at the bottom of the Carrel plastic vial, a continuous monolayer of mesenchymal stem cells covering the entire bottom of the vial is prepared to transfer the grown cell population to another vial with a larger bottom area. To do this, first, the growth medium itself is removed from the plastic bottle of Carrel, then the monolayer of mesenchymal stem cells is washed in physiological saline and traces of the growth medium are removed. After that, a 0.03% trypsin solution is introduced into the Carrel plastic bottle and the cell population grown as a monolayer is separated from the bottom of the bottle.
Затем раствор трипсина удаляют и вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.Then the trypsin solution is removed and Hanks solution containing 5% fetal calf serum is introduced into the plastic bottle of Carrel, while traces of trypsin are inactivated and the prolongation of its action and, therefore, cell damage are excluded.
В аналогичном растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).In a similar Hanks solution, mesenchymal stem cells are removed from the bottom of a Carrel plastic vial, centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, the Hanks solution is removed and suspended in RPMI-1640 growth medium (Sigma, USA).
Далее осуществляют второй цикл культивирования, в процессе которого во флаконы Карреля высевают взятые в виде суспензии в указанной ростовой среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе первого цикла культивирования.Next, a second cultivation cycle is carried out, during which mesenchymal stem cells obtained and isolated during the first cultivation cycle, taken as a suspension in the specified growth medium, are seeded into Carrel vials.
При этом посев осуществляют с плотностью 103-104 мезенхимальных стволовых клеток на 1 кв.см дна флакона Карреля.In this case, sowing is carried out with a density of 10 3 -10 4 mesenchymal stem cells per 1 cm 2 of the bottom of the Carrel vial.
При пересеве клеток в новые культуральные флаконы осуществляют продувание флаконов газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа и остальное - воздух.When cells are re-plated into new culture bottles, the bottles are blown with a gas mixture containing 4% carbon dioxide and the rest is air.
Второй цикл культивирования клеток молодого донора, которые обладают отличной способностью к пролиферации, позволил по истечении 10 дня получить с использованных флаконов Карреля 5·107-108 мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции, что является минимальной эффективной терапевтической дозой.The second cycle of cultivation of young donor cells, which have excellent proliferation ability, made it possible to obtain 5 × 10 7 -10 8 mesenchymal stem cells from the used Carrel vials in the form of a pure population, which is the minimum effective therapeutic dose.
Пример 4Example 4
Забор аутологичных клеток костного мозга проводят у донора, предварительно индуцированного препаратами, усиливающими пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток.Autologous bone marrow cells are harvested from a donor previously induced with drugs that enhance the proliferation of mesenchymal stem cells.
Забор клеток проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 1,0 мл.Cell sampling is carried out under local anesthesia in the operating room by puncture the donor ileum crest in an amount of 1.0 ml.
Пунктат костного мозга содержит только чистые клетки костного мозга, незагрязненные клетками перефирической крови.Bone marrow punctate contains only pure bone marrow cells that are not contaminated with peripheral blood cells.
Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата).Bone marrow punctate was placed in a test tube with heparin (100 U / ml punctate).
После отстаивания эритроцитов в течение 2 часов при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).After erythrocyte sedimentation was maintained for 2 hours at room temperature, the supernatant was aspirated with a Pasteur pipette, the isolated cells were washed with 199 medium (Sigma, USA), centrifuged at 1000 rpm for 10 min, followed by suspension in the growth medium RPMI-1640 (" Sigma ", USA) containing penicillin (100 IU / ml), streptomycin (100 μg / ml), amphotericin (100 ng / ml), L-glutamine 2 mM (" Sigma ", USA), 15% fetal calf serum ( "Sigma", USA).
Далее обычными методами подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет (2-5)×107.Next, by the usual methods, the number of nucleated bone marrow cells in suspension is calculated, followed by dilution with growth medium to a concentration at which the amount of nucleated cells in 1 ml of growth medium is (2-5) × 10 7 .
Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см2 высевают взятые в виде полученной суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×105 клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона. Флакон продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают в обычный термостат при 37°С.Carry out the first cycle of cultivation. To do this, in a plastic bottle of Carrel ("Sigma", USA) with a bottom area of 25 cm 2, the selected bone marrow cells taken as a suspension are sown at the rate of 5 × 10 5 cells per 1 cm 2 of the bottom of the plastic bottle. The bottle is purged with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air, and placed in a conventional thermostat at 37 ° C.
При определении изменения рН среды до значения менее 6,0 осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.When determining the change in pH of the medium to a value of less than 6.0, such a growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and fresh growth medium is introduced into the Carrel plastic bottle immediately after removal of the contaminated medium, the pH of which lies within from 6.0 to 8.0.
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
По истечении 4 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.After 4 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of less than 6.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh growth medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with cell metabolism products, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.After 5 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of less than 6.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh growth medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with cell metabolism products, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
На 10-й день культивирования после образования на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для пересева выращенной популяции клеток в другой флакон с большей площадью дна.On the 10th day of cultivation, after the formation of a continuous monolayer of mesenchymal stem cells on the bottom of the Carrel plastic vial, which covers the entire bottom of the vial, preparations are made for reseeding the grown cell population into another vial with a larger bottom area.
Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно ростовой среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в растворе Хэнкса, не содержащем солей кальция и магния, и удаляют следы ростовой среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,1%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.To do this, first, the growth medium itself is removed from the Carrel plastic bottle, then the monolayer of mesenchymal stem cells is washed in a Hanks solution that does not contain calcium and magnesium salts, and traces of the growth medium are removed. After that, a 0.1% trypsin solution is introduced into the Carrel plastic bottle and the cell population grown as a monolayer is separated from the bottom of the bottle.
Затем раствор трипсина удаляют и вновь вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.Then the trypsin solution is removed and Hanks solution containing 5% fetal calf serum is introduced into the plastic bottle of Carrel, while traces of trypsin are inactivated and the prolongation of its action and, therefore, cell damage are excluded.
В растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).In the Hanks solution, the mesenchymal stem cells are removed from the bottom of the Carrel plastic bottle, centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, the Hanks solution is removed and suspended in RPMI-1640 growth medium (Sigma, USA).
Далее осуществляют второй и третий циклы культивирования. В каждом цикле культивирования используют флаконы Карреля, суммарная площадь дна которых превосходит суммарную площадь дна флаконов Карреля, используемых на предыдущем цикле культивирования. В каждый флакон Карреля последующего цикла высевают взятые в виде суспензии в указанной ростовой среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе предыдущего цикла культивирования. Высевают клетки с плотностью 103-104 мезенхимальных стволовых клеток на 1 кв.см дна флакона.Next, carry out the second and third cycles of cultivation. In each cultivation cycle, Carrel bottles are used, the total bottom area of which exceeds the total bottom area of the Carrel bottles used in the previous cultivation cycle. In each Carrel vial of the subsequent cycle, mesenchymal stem cells obtained and isolated during the previous cultivation cycle taken as a suspension in the indicated growth medium are seeded. Sow cells with a density of 10 3 -10 4 mesenchymal stem cells per 1 cm2 of the bottom of the bottle.
При каждом пересеве клеток в новый культуральный флакон осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа и остальное - воздух.At each transplant of cells into a new culture vial, the vial is flushed with a gas mixture containing 4% carbon dioxide and the rest is air.
Второй цикл культивирования осуществляют примерно 10 дней с получением 5·107-108 мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.The second culture cycle is carried out for approximately 10 days to obtain 5 · 10 7 -10 8 mesenchymal stem cells in the form of a pure population.
Третий цикл культивирования осуществляют примерно 10 дней с получением 3·109 мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.The third cultivation cycle is carried out for approximately 10 days to obtain 3 · 10 9 mesenchymal stem cells in the form of a pure population.
Пример 5Example 5
Забор аутологичных клеток костного мозга проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 1,0 мл.Autologous bone marrow cells are harvested under local anesthesia under operating conditions by puncture of the donor iliac crest in an amount of 1.0 ml.
Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата).Bone marrow punctate was placed in a test tube with heparin (100 U / ml punctate).
После отстаивания эритроцитов в течение 1 часа при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 ("Sigma", USA), центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).After erythrocyte sedimentation was maintained for 1 hour at room temperature, the supernatant was aspirated with a Pasteur pipette, the isolated cells were washed with 199 medium (Sigma, USA), centrifuged at 1000 rpm for 10 min, followed by suspension in the growth medium RPMI-1640 (" Sigma ", USA) containing penicillin (100 IU / ml), streptomycin (100 μg / ml), amphotericin (100 ng / ml), L-glutamine 2 mM (" Sigma ", USA), 15% fetal calf serum ( "Sigma", USA).
Далее обычными методами подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет (1-2)×106.Next, by the usual methods, the number of nucleated bone marrow cells in suspension is calculated, followed by dilution with growth medium to a concentration at which the amount of nucleated cells in 1 ml of growth medium is (1-2) × 10 6 .
Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см2 высевают взятые в виде суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×103 клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона. При этом используют фактор роста - инсулиноподобный фактор.Carry out the first cycle of cultivation. To do this, in a plastic bottle of Carrel (Sigma, USA) with a bottom area of 25 cm 2, the selected bone marrow cells taken as a suspension are seeded at the rate of 5 × 10 3 cells per 1 cm 2 of the bottom of the plastic bottle. In this case, a growth factor is used - an insulin-like factor.
Флакон продувают газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещают в обычный термостат при 37°С.The bottle is purged with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air, and placed in a conventional thermostat at 37 ° C.
В процессе культивирования регулярно определяют рН ростовой среды. Регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.During the cultivation process, the pH of the growth medium is regularly determined. The change in pH to a value of less than 6.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and fresh growth medium is introduced into the plastic bottle of Carrel immediately after removal of the contaminated medium, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0.
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.After 5 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of less than 6.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh growth medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with cell metabolism products, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
По истечении 4 суток культивирования регистрируют изменение рН среды до значения менее 6,0.After 4 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of less than 6.0 is recorded.
Осуществляют удаление такой ростовой среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This growth medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh growth medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with cell metabolism products, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .
После введения в пластиковый флакон Карреля свежей ростовой среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh growth medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is flushed with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.
На 10-й день после образования на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток в флакон с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно ростовой среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в физиологическом растворе и удаляют следы ростовой среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,03%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.On the 10th day after the formation of a continuous monolayer of mesenchymal stem cells at the bottom of the Carrel plastic vial covering the entire bottom of the vial, preparations are made to transfer the grown cell population to the vial with a larger bottom area. To do this, first, the growth medium itself is removed from the Carrel plastic bottle, then the mesenchymal stem cell monolayer is washed in physiological saline and traces of the growth medium are removed. After that, a 0.03% trypsin solution is introduced into the Carrel plastic bottle and the cell population grown as a monolayer is separated from the bottom of the bottle.
Затем раствор трипсина удаляют и вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.Then the trypsin solution is removed and Hanks solution containing 5% fetal calf serum is introduced into the plastic bottle of Carrel, while traces of trypsin are inactivated and the prolongation of its action and, therefore, cell damage are excluded.
В аналогичном растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают с дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).In a similar Hanks solution, mesenchymal stem cells are removed from the bottom of a Carrel plastic vial, centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, the Hanks solution is removed and suspended in RPMI-1640 growth medium (Sigma, USA).
Далее осуществляют второй, третий и четвертый циклы культивирования. В каждом цикле культивирования используют флаконы Карреля, суммарная площадь дна которых превосходит суммарную площадь дна флаконов Карреля, используемых на предыдущем цикле культивирования. В каждый флакон Карреля последующего цикла высевают взятые в виде суспензии в указанной ростовой среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе предыдущего цикла культивирования.Next, carry out the second, third and fourth cycles of cultivation. In each cultivation cycle, Carrel bottles are used, the total bottom area of which exceeds the total bottom area of the Carrel bottles used in the previous cultivation cycle. In each Carrel vial of the subsequent cycle, mesenchymal stem cells obtained and isolated during the previous culture cycle, taken as a suspension in the indicated growth medium, are seeded.
При этом посев осуществляют с плотностью 103-104 мезенхимальных стволовых клеток на 1 кв.см дна флакона Карреля.In this case, sowing is carried out with a density of 10 3 -10 4 mesenchymal stem cells per 1 cm 2 of the bottom of the Carrel vial.
При каждом пересеве клеток в новый культуральный флакон осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа и остальное - воздух.At each transplant of cells into a new culture vial, the vial is flushed with a gas mixture containing 4% carbon dioxide and the rest is air.
Каждый цикл культивирования осуществляют примерно 10 дней до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.Each cultivation cycle is carried out for approximately 10 days until a given number of mesenchymal stem cells is obtained in the form of a pure population.
Необходимое для трансплантации количество клеток порядка (2-5)×108 выращено за 40 суток культивирования.The number of cells required for transplantation of the order of (2-5) × 10 8 was grown in 40 days of cultivation.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006137581/13A RU2323252C1 (en) | 2006-10-25 | 2006-10-25 | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006137581/13A RU2323252C1 (en) | 2006-10-25 | 2006-10-25 | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2323252C1 true RU2323252C1 (en) | 2008-04-27 |
Family
ID=39453119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006137581/13A RU2323252C1 (en) | 2006-10-25 | 2006-10-25 | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2323252C1 (en) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2455354C1 (en) * | 2010-12-29 | 2012-07-10 | Антонина Ивановна Колесникова | Skin and mucosa cell renewal composition |
| RU2484133C1 (en) * | 2012-06-08 | 2013-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук | Ex vivo METHOD TO INCREASE QUALITY OF PRECURSOR CELLS FROM AGE DONORS |
| RU2490722C1 (en) * | 2012-04-24 | 2013-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Method for experimental establishment of thrombosed vein flow |
| RU2547925C2 (en) * | 2008-11-20 | 2015-04-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Methods and compositions for cell fixation and culture on flat carriers |
| RU2551772C2 (en) * | 2008-02-21 | 2015-05-27 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Methods, surface-modified carriers and compositions for immobilisation, cultivation and cell detachment |
| RU2555538C2 (en) * | 2008-11-20 | 2015-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Culture of pluripotent stem cells on microcarriers |
| RU2588376C2 (en) * | 2011-03-03 | 2016-06-27 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Plate configured for turning to form hanging droplets for cell culture |
| RU2618871C2 (en) * | 2011-06-09 | 2017-05-11 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Method for pluripotent stem cells differentiation into vascular bed cells |
| RU2707281C1 (en) * | 2018-09-17 | 2019-11-26 | Гордейчук Владимир Евгеньевич | Cancer immunotherapy method |
| RU2714256C2 (en) * | 2011-06-10 | 2020-02-13 | Конинклейке Недерландсе Академи Ван Ветенсаппен (Кнав) | Culture medium for stem cells |
| US10947510B2 (en) | 2009-02-03 | 2021-03-16 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising the stem cells |
| US11034935B2 (en) | 2010-07-29 | 2021-06-15 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them |
| US20220072056A1 (en) * | 2008-12-05 | 2022-03-10 | Regenerative Sciences, Llc | Methods and compositions to facilitate repair of avascular tissue |
-
2006
- 2006-10-25 RU RU2006137581/13A patent/RU2323252C1/en active IP Right Revival
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| АДАМС P. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: МИР, 1983, с.22-25. ФРЕШНИ Р. Культура животных клеток. Методы. - М.: МИР, 1989, с.74-94. * |
| Методы культивирования клеток. / Под ред. Г.П. ПИНАЕВА. - Л.: НАУКА, 1988, с.276-279. KULEZ M.M.F. et al. Steady-state cultures of human skin, Exp. Cell-Biol., 1982, n.50, p.195-206. * |
| УОСЛИ ДЖ. Новые методы культуры животных тканей. - М.: МИР, 1976, с.208, 245-249. * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2551772C2 (en) * | 2008-02-21 | 2015-05-27 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Methods, surface-modified carriers and compositions for immobilisation, cultivation and cell detachment |
| RU2547925C2 (en) * | 2008-11-20 | 2015-04-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Methods and compositions for cell fixation and culture on flat carriers |
| RU2555538C2 (en) * | 2008-11-20 | 2015-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Culture of pluripotent stem cells on microcarriers |
| US20220072059A1 (en) * | 2008-12-05 | 2022-03-10 | Regenerative Sciences, Llc | Methods and compositions to facilitate repair of avascular tissue |
| US20220072056A1 (en) * | 2008-12-05 | 2022-03-10 | Regenerative Sciences, Llc | Methods and compositions to facilitate repair of avascular tissue |
| US10947510B2 (en) | 2009-02-03 | 2021-03-16 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising the stem cells |
| US11034935B2 (en) | 2010-07-29 | 2021-06-15 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them |
| RU2455354C1 (en) * | 2010-12-29 | 2012-07-10 | Антонина Ивановна Колесникова | Skin and mucosa cell renewal composition |
| RU2588376C2 (en) * | 2011-03-03 | 2016-06-27 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Plate configured for turning to form hanging droplets for cell culture |
| RU2618871C2 (en) * | 2011-06-09 | 2017-05-11 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Method for pluripotent stem cells differentiation into vascular bed cells |
| RU2714256C2 (en) * | 2011-06-10 | 2020-02-13 | Конинклейке Недерландсе Академи Ван Ветенсаппен (Кнав) | Culture medium for stem cells |
| RU2490722C1 (en) * | 2012-04-24 | 2013-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Method for experimental establishment of thrombosed vein flow |
| RU2484133C1 (en) * | 2012-06-08 | 2013-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук | Ex vivo METHOD TO INCREASE QUALITY OF PRECURSOR CELLS FROM AGE DONORS |
| RU2707281C1 (en) * | 2018-09-17 | 2019-11-26 | Гордейчук Владимир Евгеньевич | Cancer immunotherapy method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2323252C1 (en) | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo | |
| Hawrot et al. | [53] Long-term culture of dissociated sympathetic neurons | |
| US7060494B2 (en) | Growth of human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) using umbilical cord blood serum and the method for the preparation thereof | |
| CN106754674A (en) | Method and its application of amnion mesenchymal stem cell are prepared from Human plactnta amnion | |
| JP6241819B2 (en) | Sperm activation method and use thereof | |
| CA2669304A1 (en) | Use of a composition contaning human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells | |
| CN108865986B (en) | Mesenchymal stem cell preparation for repairing articular cartilage damage/defect and preparation method and application thereof | |
| KR101697141B1 (en) | Cellular therapeutic agents for cartilage regeneration | |
| KR20120095022A (en) | Cell therapy composition for preventing or treating graft-versus-host disease comprising mesenchymal stem cell and regulatory t cell | |
| KR100959995B1 (en) | Composition for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells, comprising a human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell as an active ingredient | |
| CN106434557A (en) | Method for preparing CD34 positive cells from umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| CN102643784A (en) | Expansion system in vitro for hematopoietic stem/progenitor cell | |
| CN109893541B (en) | Application of exosome derived from menstrual blood stem cells in preparation of medicine for treating intrauterine adhesion | |
| KR20090055691A (en) | Composition for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells, comprising a human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell as an active ingredient | |
| BRPI0708039A2 (en) | feeder cells derived from tissue stem cells | |
| CN105238740A (en) | In-vitro screening and culturing method for tissue engineering skin seed epidermal keratinocyte high-simulation in-vivo cell extracellular matrix attachment | |
| RU2645255C1 (en) | Method for obtaining of biosafe culture of mesenchimal stem cells from human chorionic villae | |
| CN102119936B (en) | Method for preparing injection for treating ischemic brain damage by using human amniotic mesenchymal cells and injection | |
| CN107058225A (en) | A kind of co-induction culture medium and using the culture medium inducing umbilical cord mesenchymal stem into neuron cell method | |
| RU2272638C1 (en) | Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) | |
| RU2674344C2 (en) | Method for obtaining biosafe culture of mesenchymal stem cells from gelatin of wharton of human umbilical cord | |
| CN101139573A (en) | Method for forming pancreatic islet like structure by external evoked stem cell differentiation pancreatic islet cell | |
| Miller et al. | 114. Selective Surface-Induced Osteogenic Differentiation of Stromal Vascular Fraction on Fluorapatite Scaffolds | |
| CN102732478A (en) | Inducer for inducing directional differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into bladder smooth muscle cells, and preparation and application thereof | |
| CN110840914B (en) | Method for alleviating or improving vascular disorders using cell therapeutic agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20131213 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141026 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20160410 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171026 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20181022 |