RU2303634C2 - Method for analysis of genetic polymorphysm, defining predisposition to tumor diseases and individual sensitivity to pharmaceutical agents by using olygonucleotide biological microarray (bioarray) - Google Patents
Method for analysis of genetic polymorphysm, defining predisposition to tumor diseases and individual sensitivity to pharmaceutical agents by using olygonucleotide biological microarray (bioarray) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2303634C2 RU2303634C2 RU2005131568/13A RU2005131568A RU2303634C2 RU 2303634 C2 RU2303634 C2 RU 2303634C2 RU 2005131568/13 A RU2005131568/13 A RU 2005131568/13A RU 2005131568 A RU2005131568 A RU 2005131568A RU 2303634 C2 RU2303634 C2 RU 2303634C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hybridization
- biochip
- primers
- seq
- carried out
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к молекулярной биологии, клинической генетике и фармакогеномике и обеспечивает способ диагностики генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям и индивидуальной чувствительности к фармацевтическим препаратам непосредственно в клиническом образце с использованием дифференцирующего олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа).The invention relates to molecular biology, clinical genetics and pharmacogenomics and provides a method for diagnosing a genetic predisposition to cancer and individual sensitivity to pharmaceuticals directly in a clinical sample using a differentiating oligonucleotide biological microchip (biochip).
Уровень техникиState of the art
Для анализа генетического полиморфизма в клинической практике применяют чаще всего метод, сочетающий полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).To analyze genetic polymorphism in clinical practice, the most commonly used method is a combination of polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP).
Существует огромное количество методов анализа генетического полиморфизма. Условно можно выделить шесть групп:There are a huge number of methods for analyzing genetic polymorphism. Conventionally, there are six groups:
1) Ферментативные подходы:1) Enzymatic approaches:
полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP);restriction fragment length polymorphism (RFLP);
полиморфизм длин аплифицированных фрагментов (AFLP);length fragment polymorphism (AFLP);
расщепление эндонуклеазой Cleavase I (CFLP);Cleavase I endonuclease cleavage (CFLP);
расщепление резольвазой (EMD);resolvase cleavage (EMD);
анализы, основанные на лигазной реакции (LDR, LCR, Padlock);analyzes based on ligase reaction (LDR, LCR, Padlock);
инвазивное расщепление олигонуклеотидов (Invader);invasive cleavage of oligonucleotides (Invader);
случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD, AP-PCR);random amplification of polymorphic DNA (RAPD, AP-PCR);
ПЦР с прямой терминацией синтеза (DT-PCR);PCR with direct synthesis termination (DT-PCR);
аллель-специфический ПЦР (AS-PCR).allele-specific PCR (AS-PCR).
2) Химические методы;2) Chemical methods;
химическое расщепление гетеродуплексов;chemical splitting of heteroduplexes;
химическое лигирование.chemical ligation.
3) Методы, основанные на различной электрофоретической подвижности полиморфных участков ДНК:3) Methods based on different electrophoretic mobility of polymorphic DNA sections:
анализ конформации одноцепочечных фрагментов (SSCP);single chain fragment conformation analysis (SSCP);
гетеродуплексный анализ;heteroduplex analysis;
секвенирование ДНК.DNA sequencing.
4) Детекция на твердой фазе:4) Solid phase detection:
гибридизация на олигонуклеотидных матрицах;hybridization on oligonucleotide matrices;
оптиковолоконный ДНК-гибридизационный анализ;fiber optic DNA hybridization analysis;
элонгация иммобилизованных праймеров (минисеквенирование);elongation of immobilized primers (minisequencing);
пиросиквенс.pyrosequence.
5) Хроматографические методы:5) Chromatographic methods:
денатурирующая ВЭЖХ.denaturing HPLC.
6) Физические методы:6) Physical methods:
масс-спектрометрия;mass spectrometry;
резонансное тушение флуоресценции (FRET);resonance fluorescence quenching (FRET);
люминесценция, зависящая от локального окружения.luminescence, depending on the local environment.
Однако наиболее распространенными из них являются:However, the most common of them are:
1. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP).1. Polymorphism of the lengths of restriction fragments (RFLP).
Joseph Т, Kusumakumary P, Chacko P, Abraham A, Radhakrishna Pillai M. Genetic polymorphism of CYP1A1, CYP2D6, GSTM1 and GSTT1 and susceptibility to acute lymphoblastic leukaemia in Indian children. Pediatr Blood Cancer. 2004 Oct; 43(5): 539-41.Joseph T, Kusumakumary P, Chacko P, Abraham A, Radhakrishna Pillai M. Genetic polymorphism of CYP1A1, CYP2D6, GSTM1 and GSTT1 and susceptibility to acute lymphoblastic leukaemia in Indian children. Pediatr Blood Cancer. 2004 Oct; 43 (5): 539-41.
Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов заключается в ПЦР-амплификации интересующего фрагмента и его последующем расщеплении соответствующей рестриктазой. Благодаря простоте и надежности метод получил широкое распространение и до сих пор популярен, хотя и имеет некоторые ограничения - во-первых, он позволяет детектировать только SNPs, расположенные в сайтах рестрикции, во-вторых, годится лишь для детекции уже известных мутаций и, в-третьих, не может выявлять более одного-двух SNP одновременно. Кроме того, анализ является трудоемкой процедурой и занимает в среднем от 5 до 24 часов.Polymorphism of the lengths of restriction fragments consists in PCR amplification of the fragment of interest and its subsequent cleavage with the corresponding restriction enzyme. Due to its simplicity and reliability, the method has become widespread and is still popular, although it has some limitations - firstly, it only allows detection of SNPs located in restriction sites, secondly, it is suitable only for the detection of already known mutations and, in- third, it cannot detect more than one or two SNPs at a time. In addition, the analysis is a time-consuming procedure and takes an average of 5 to 24 hours.
2. Аллель-специфическая ПЦР (AS-PCR).2. Allele-specific PCR (AS-PCR).
Murata M, Shiraishi Т, Fukutome К, Watanabe M, Nagao M, Kubota Y, Ito H, Kawamura J, Yatani R. Cytochrome P4501A1 and glutathione S-transferase M1 genotypes as risk factors for prostate cancer in Japan. Jpn J Clin Oncol. 1998 Nov; 28(11): 657-60.Murata M, Shiraishi T, Fukutome K, Watanabe M, Nagao M, Kubota Y, Ito H, Kawamura J, Yatani R. Cytochrome P4501A1 and glutathione S-transferase M1 genotypes as risk factors for prostate cancer in Japan. Jpn J Clin Oncol. 1998 Nov; 28 (11): 657-60.
Аллельные варианты различаются за счет того, что 3'-концевой нуклеотид одного из праймеров в процессе ПЦР гибридизуется непосредственно с позицией SNP (т.е. если этот праймер комплементарен последовательности ДНК, то происходит наработка продукта). Метод достаточно сложен, т.к. в большой степени зависит от условий реакции и правильно выбранной последовательности праймера. Велико количество ложноположительных результатов. Кроме того, невозможно данным методом анализировать более 3-5 мутаций в одном анализе. Несмотря на все приведенные недостатки, при грамотно подобранных условиях, анализ SNP занимает всего 3-4 часа.Allelic variants differ due to the fact that the 3'-terminal nucleotide of one of the primers in the PCR process hybridizes directly with the SNP position (i.e. if this primer is complementary to the DNA sequence, then the product is produced). The method is quite complicated, because to a large extent depends on the reaction conditions and the correct primer sequence. A large number of false positive results. In addition, it is impossible with this method to analyze more than 3-5 mutations in one analysis. Despite all the above disadvantages, under well-chosen conditions, SNP analysis takes only 3-4 hours.
3. Анализ конформации одноцепочечных фрагментов (SSCP).3. Conformational analysis of single chain fragments (SSCP).
Broly F, Marez D, Sabbagh N, Legrand M, Millecamps S, Lo Guidice JM, Boone P, Meyer UA. An efficient strategy for detection of known and new mutations of the CYP2D6 gene using single strand conformation polymorphism analysis. Pharmacogenetics. 1995 Dec; 5(6): 373-84.Broly F, Marez D, Sabbagh N, Legrand M, Millecamps S, Lo Guidice JM, Boone P, Meyer UA. An efficient strategy for detection of known and new mutations of the CYP2D6 gene using single strand conformation polymorphism analysis. Pharmacogenetics 1995 Dec; 5 (6): 373-84.
SSCP анализ включает денатурацию ПЦР-продуктов и разделение их в неденатурирующем геле. Электрофоретическая подвижность одноцепочечных фрагментов зависит от их нуклеотидной последовательности, определяющей характер вторичных и третичных структур, и меняется даже при отличии в один нуклеотид. Простота метода, умеренная стоимость и возможность использования флуоресцентной метки и капиллярного электрофореза позволяет легко автоматизировать процесс и анализировать одновременно большое количество локусов. Однако данным методом можно анализировать далеко не все SNP, особенно группы полиморфных замен, расположенные на близком расстоянии друг от друга. Кроме того, метод обладает невысокой воспроизводимостью результатов, особенно, при обнаружении de novo мутаций.SSCP analysis involves denaturing PCR products and separating them in a non-denaturing gel. The electrophoretic mobility of single-stranded fragments depends on their nucleotide sequence, which determines the nature of secondary and tertiary structures, and changes even with a difference of one nucleotide. The simplicity of the method, reasonable cost and the possibility of using a fluorescent label and capillary electrophoresis makes it easy to automate the process and analyze at the same time a large number of loci. However, not all SNPs can be analyzed using this method, especially groups of polymorphic substitutions located at close distances from each other. In addition, the method has a low reproducibility of the results, especially when de novo mutations are detected.
4. Macc-спектрометрия.4. Macc spectrometry.
Nakai К, Habano W, Nakai К, Fukushima N, Fujita T, Gurwitz D. Ethnic differences of coronary artery disease-associated SNPs in two Israeli healthy populations using MALDI-TOF mass spectrometry. Life Sci. 2004 Jul 9; 75(8): 1003-10.Nakai K, Habano W, Nakai K, Fukushima N, Fujita T, Gurwitz D. Ethnic differences of coronary artery disease-associated SNPs in two Israeli healthy populations using MALDI-TOF mass spectrometry. Life Sci. 2004 Jul 9; 75 (8): 1003-10.
Метод заключается в том, что ионизированные молекулы ДНК (чаще всего специально подготовленные продукты ПЦР) отрываются от подложки методами MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionisation) и ESI (electrospray ionisation). Они разгоняются в электрическом поле и направляются через вакуумную камеру к детектору. Время движения регистрируется. Время обратно пропорционально скорости молекулы, которая, в свою очередь, прямо пропорциональна отношению массы летящей молекулы к ее заряду. Эти параметры (отношение массы к заряду) уникальны для каждой молекулы и определяются исключительно ее нуклеотидной последовательностью, поэтому чувствительность метода чрезвычайно высока. Метод позволяет работать с нанолитрами образца. При всей привлекательности метода он является достаточно трудоемкой и дорогой процедурой (в основном из-за высокой стоимости оборудования), требует высокой квалификации сотрудников и не может быть применен далеко за пределами крупных медицинских центров мегаполисов.The method consists in the fact that ionized DNA molecules (most often specially prepared PCR products) are detached from the substrate by the methods of MALDI (matrix-assisted laser desorption / ionization) and ESI (electrospray ionization). They are accelerated in an electric field and sent through a vacuum chamber to the detector. Motion time is recorded. Time is inversely proportional to the speed of the molecule, which, in turn, is directly proportional to the ratio of the mass of the flying molecule to its charge. These parameters (mass to charge ratio) are unique for each molecule and are determined exclusively by its nucleotide sequence, therefore the sensitivity of the method is extremely high. The method allows you to work with nanoliters of the sample. Despite the attractiveness of the method, it is a rather time-consuming and expensive procedure (mainly due to the high cost of equipment), requires highly qualified employees, and cannot be applied far beyond the large medical centers of megacities.
5. Резонансный перенос энергии флуоресценции.5. Resonance transfer of fluorescence energy.
Schaeffeler E, Schwab M, Eichelbaum M, Zanger UM. CYP2D6 genotyping strategy based on gene copy number determination by TaqMan real-time PCR. Hum Mutat. 2003 Dec; 22(6): 476-85.Schaeffeler E, Schwab M, Eichelbaum M, Zanger UM. CYP2D6 genotyping strategy based on gene copy number determination by TaqMan real-time PCR. Hum mutat. 2003 Dec; 22 (6): 476-85.
Данный метод позволяет следить за состоянием молекулы зонда в пробирке оптическими методами непосредственно в ходе реакции. Принцип явления заключается в том, что для детекции используют не способный удлиняться зонд, несущий флуорофор и тушитель и комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда Taq полимераза разрушает его в ходе ПЦР реакции за счет экзонуклеазной активности, сопряженной с синтезом ДНК, флуоресцентная группа переходит в раствор и отдаляется от тушителя. Используя два аллель-специфических зонда с различными флуоресцентными метками, можно надежно различать гомо- и гетерозиготы. Основной привлекательностью метода является работа с закрытыми системами, исключающими контаминацию, и высокая скорость анализа (около 2-х часов). Минусы: высокая стоимость и невозможность анализа более 5 локусов у одного человека одновременно.This method allows you to monitor the state of the probe molecule in vitro by optical methods directly during the reaction. The principle of the phenomenon lies in the fact that a probe that is not able to extend and uses a fluorophore and quencher and is complementary to the middle part of the amplified fragment is used for detection. When Taq polymerase destroys it during the PCR reaction due to exonuclease activity coupled with DNA synthesis, the fluorescent group goes into solution and moves away from the quencher. Using two allele-specific probes with different fluorescent labels, it is possible to reliably distinguish between homo and heterozygotes. The main attractiveness of the method is the work with closed systems that exclude contamination, and a high analysis speed (about 2 hours). Cons: high cost and the inability to analyze more than 5 loci in one person at a time.
6. Мультиплексная ПЦР с последующим анализом на олигонуклеотидном микрочипе.6. Multiplex PCR followed by analysis on an oligonucleotide microchip.
Wen SY, Wang H, Sun OJ, Wang SQ. Rapid detection of the known SNPs of CYP2C9 using oligonucleotide microarray. World J Gastroenterol. 2003 Jun; 9(6): 1342-6.Wen SY, Wang H, Sun OJ, Wang SQ. Rapid detection of the known SNPs of CYP2C9 using oligonucleotide microarray. World J Gastroenterol. 2003 Jun; 9 (6): 1342-6.
Данный метод предполагает предварительную мультиплексную амплификацию исследуемых фрагментов ДНК с использованием флуоресцентно меченных праймеров. В результате добавления избытка меченого праймера ПЦР достигается образование большого количества преимущественно меченого одноцепочечного продукта. Этот продукт добавляют на биочип, где происходит его гибридизация с иммобилизованными в геле олигонуклеотидными зондами. Если последовательность анализируемой ДНК полностью комплементарна последовательности зонда, то образуется стабильный дуплекс (детектируют сигнал флуоресценции), если искомого фрагмента нет, или же в нем находится некомплементарное основание, то стабильного дуплекса не образуется (сигнала флуоресценции нет). Простота метода, низкая стоимость и возможность использования флуоресцентной метки позволяет легко автоматизировать процесс. Однако данным методом можно анализировать далеко не все SNP (только точечные замены). Кроме того, метод не позволяет анализировать множество SNP одновременно.This method involves preliminary multiplex amplification of the studied DNA fragments using fluorescently labeled primers. The addition of excess labeled PCR primer results in the formation of a large amount of a predominantly labeled single chain product. This product is added to the biochip, where it hybridizes with oligonucleotide probes immobilized in a gel. If the sequence of the analyzed DNA is completely complementary to the probe sequence, then a stable duplex is formed (a fluorescence signal is detected), if the desired fragment is not found, or if there is an incomplete base in it, then no stable duplex is formed (there is no fluorescence signal). The simplicity of the method, low cost and the possibility of using a fluorescent label makes it easy to automate the process. However, not all SNPs (only point substitutions) can be analyzed with this method. In addition, the method does not allow the analysis of multiple SNPs simultaneously.
7. Минисеквенирование на олигонуклеотидном микрочипе.7. Mini-sequencing on an oligonucleotide microchip.
http://www.jurilab.com/default.asp?toc=66 DrugMEtTM microarray-based pharmacogenetic test processes 16 samples on one slide and includes 27 variations (SNPs) in 8 genes that code for major drug metabolising enzymes (DME).http://www.jurilab.com/default.asp?toc=66 DrugMEtTM microarray-based pharmacogenetic test processes 16 samples on one slide and includes 27 variations (SNPs) in 8 genes that code for major drug metabolizing enzymes (DME).
При подготовке проб для этого метода используют предварительную амплификацию исследуемого фрагмента ДНК, содержащего SNP, и последующую гибридизацию его с зондом на биочипе. Последовательность зонда должна быть комплементарна последовательности исследуемой ДНК, причем последнее основание на 3'-конце зонда должно быть комплементарно основанию в ДНК, после которого следует вариабельный нуклеотид. Принцип детекции заключается в следующем: после гибридизации зонда с образцом в реакцию добавляют меченые дидезоксинуклеотиды и ДНК-полимеразу. Возможно присоединение только одного единственного нуклеотида к 3'-концу иммобилизованного зонда, поскольку дидезоксинуклеотиды не содержат на 3'-конце гидроксильной группы, с которой соединяется 5'-фосфатный остаток следующего нуклеотида. После отмывки чипа флуоресценция его ячеек определяется именно этим меченым дидезоксинуклеотидом. Метод позволяет с высокой степенью достоверности выявлять генотипы и анализировать более 20 мутаций одновременно, однако он достаточно дорог в настоящее время и не годится для анализа повторов и некартированных делеций и дупликаций.When preparing samples for this method, preliminary amplification of the studied DNA fragment containing SNP is used and its subsequent hybridization with a probe on a biochip. The sequence of the probe should be complementary to the sequence of the studied DNA, with the last base at the 3'-end of the probe should be complementary to the base in the DNA, followed by a variable nucleotide. The principle of detection is as follows: after hybridization of the probe with the sample, labeled dideoxynucleotides and DNA polymerase are added to the reaction. It is possible to attach only one single nucleotide to the 3'-end of the immobilized probe, since dideoxynucleotides do not contain at the 3'-end of the hydroxyl group to which the 5'-phosphate residue of the next nucleotide is connected. After washing the chip, the fluorescence of its cells is determined precisely by this labeled dideoxynucleotide. The method allows to identify genotypes with a high degree of reliability and analyze more than 20 mutations at the same time, however, it is quite expensive at present and is not suitable for analysis of repeats and unmapped deletions and duplications.
Ближайшим аналогом настоящего изобретения является способ, описанный в (6). К существенным недостаткам способа можно отнести то, что не был разработан определенный подход, позволяющий "наращивать" число анализируемых генов.The closest analogue of the present invention is the method described in (6). Significant disadvantages of the method include the fact that a specific approach has not been developed that allows you to "increase" the number of analyzed genes.
Таким образом, все имеющиеся в настоящее время способы обладают теми или иными недостатками, и существует потребность в создании простого, недорогого, специфичного метода, позволяющего выявлять функционально-значимые полиморфные локусы, а также "наращивать" число анализируемых генов с целью дальнейшего внедрения в любую стандартную клиническую лабораторию.Thus, all currently available methods have one or another disadvantage, and there is a need to create a simple, inexpensive, specific method that allows identifying functionally significant polymorphic loci, as well as "increasing" the number of analyzed genes with the aim of further implementation in any standard clinical laboratory.
Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.Such a method is provided by the present invention.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Сущность изобретения заключается в обеспечении способа экспресс-анализа генетического полиморфизма для определения фармакогенетического статуса человека и выявления генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям. Способ основан на проведении оригинального варианта мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в две стадии с последующей гибридизацией флуоресцентно меченного фрагмента ДНК на биологическом микрочипе, содержащем оригинальный набор дифференцирующих олигонуклеотидов, а также процедуры регистрации и интерпретации результатов.The essence of the invention is to provide a method for the rapid analysis of genetic polymorphism to determine the pharmacogenetic status of a person and identify a genetic predisposition to cancer. The method is based on carrying out an original version of a multiplex polymerase chain reaction (PCR) in two stages, followed by hybridization of a fluorescently labeled DNA fragment on a biological microchip containing an original set of differentiating oligonucleotides, as well as registration and interpretation of the results.
Комбинированное использование блочного подхода при размещении и группировании генов, применение двухэтапной мультиплексной ПЦР и метода гибридизации на биочипах выгодно отличается от способов из уровня техники возможностью определения многих полиморфных вариантов с наименьшими затратами и наиболее специфичным способом за короткое время. Способ экономичен, не требует дорогостоящего оборудования и может быть введен в повсеместную клиническую практику. Данные, полученные с помощью способа настоящего изобретения, могут быть использованы, например, для определения генетической предрасположенности к раку легкого, раку молочной железы, раку мочевого пузыря, раку кожи, раку толстой и прямой кишки, аденоме прямой кишки, апластической анемии, лейкозам (у детей), алкогольному циррозу, бронхиальной астме, бронхиту, псориазу, мигрени. Кроме того, результаты исследования могут быть использованы для коррекции доз таких лекарственных препаратов, как, например: бета-адреноблокаторы, антидепрессанты, антипсихотропные, антиаритмические, антигипертензивные препараты, нейролептики, производные морфина, нейротрансмиттеры (допамины), анальгетики, опиаты (CYP2D6 обусловленные); антикоагулянты (варфарин), антигипертензивные препараты (лозартан), сахароснижающие препараты (глипизид), противосудорожные препараты (фенитоин, диазепам), антидепрессанты (амитриптилин, кломипрамин, имипрамин), ингибиторы протонных помп (омепразол), нестероидные противовоспалительные препараты (диклофенак, ибупрофен, пироксикам), толбутамин (CYP2C9 обусловленные); противосудорожные препараты, ингибиторы протонных помп (омепразол, лансопразол, пантопразол, эзомепразол и рабепразол), используемые при лечении кислотно-зависимых заболеваний, прогуанил и барбитураты (CYP2C19 обусловленные); бусульфан (GSTM1 и GSTT1 обусловленные); 2-аминофлюорен, р-анизид, изониазид, прокаинамид, амонафид (NAT2 обусловленные).The combined use of the block approach for the placement and grouping of genes, the use of two-stage multiplex PCR and the hybridization method on biochips compares favorably with the prior art methods for the ability to determine many polymorphic variants with the least cost and the most specific way in a short time. The method is economical, does not require expensive equipment, and can be introduced into widespread clinical practice. The data obtained using the method of the present invention can be used, for example, to determine the genetic predisposition to lung cancer, breast cancer, bladder cancer, skin cancer, colon and rectal cancer, rectal adenoma, aplastic anemia, leukemia (in children), alcoholic cirrhosis, bronchial asthma, bronchitis, psoriasis, migraine. In addition, the results of the study can be used to adjust the doses of such drugs as, for example: beta-blockers, antidepressants, antipsychotropic, antiarrhythmic, antihypertensive drugs, antipsychotics, morphine derivatives, neurotransmitters (dopamines), analgesics, opiates (CYP2D6-mediated); anticoagulants (warfarin), antihypertensive drugs (losartan), hypoglycemic drugs (glipizide), anticonvulsants (phenytoin, diazepam), antidepressants (amitriptyline, clomipramine, imipramine), proton pump inhibitors (omeprazole antiforpofenoxifrofenofiperfenoprofenoprofenoxifrofenofiperfenoprofenoprofenoxifrofenofiperfenoprofenoxifrofenoxifrofen ), tolbutamine (CYP2C9-mediated); anticonvulsants, proton pump inhibitors (omeprazole, lansoprazole, pantoprazole, esomeprazole and rabeprazole), used in the treatment of acid-dependent diseases, proguanil and barbiturates (CYP2C19 caused); busulfan (GSTM1 and GSTT1 conditioned); 2-aminofluorene, p-aniside, isoniazid, procainamide, amonafide (NAT2-mediated).
Важной особенностью изобретения является то, что последовательности праймеров 1-го этапа подобраны как в интронах, так и в экзонах для того, чтобы избежать амплификации других возможных гомологичных последовательностей в геноме человека. При этом флуоресцентное мечение фрагмента гена осуществляют одновременно с амплификацией при проведении второго этапа ПЦР.An important feature of the invention is that the sequences of the primers of the 1st stage are selected both in introns and exons in order to avoid amplification of other possible homologous sequences in the human genome. Moreover, fluorescence labeling of a gene fragment is carried out simultaneously with amplification during the second stage of PCR.
Следующей особенностью изобретения является то, что идентификацию амплифицированных последовательностей осуществляют путем гибридизации полученного флуоресцентно меченного продукта амплификации с набором оригинальных олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на биочипе.Another feature of the invention is that the identification of amplified sequences is carried out by hybridization of the obtained fluorescently labeled amplification product with a set of original oligonucleotide probes immobilized on a biochip.
Одним из аспектов настоящего изобретения является способ экспресс-анализа генетического полиморфизма для определения фармакогенетического статуса человека и выявления генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям, включающий верификацию полиморфных вариантов последовательности в клиническом образце ДНК, предусматривающий следующие стадии:One aspect of the present invention is a method for the rapid analysis of genetic polymorphism to determine the pharmacogenetic status of a person and identify a genetic predisposition to cancer, including verification of polymorphic sequence variants in a clinical DNA sample, comprising the following steps:
(а) - мультиплексная «гнездовая» (nested) двухэтапная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием набора праймеров, являющегося одним из отдельных аспектов данного изобретения, для амплификации фрагментов ДНК и мечения ПЦР-продукта на втором этапе ПЦР;(a) a multiplex “nested” two-stage polymerase chain reaction (PCR) using a set of primers, which is one of the separate aspects of the present invention, for amplification of DNA fragments and labeling of the PCR product at the second stage of PCR;
(б) - обеспечение биочипа, являющегося одним из отдельных аспектов данного изобретения, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов, являющийся одним из отдельных аспектов данного изобретения, для проведения гибридизации;(b) - providing a biochip, which is one of the separate aspects of the present invention, containing a set of immobilized oligonucleotides, which is one of the separate aspects of the present invention, for carrying out hybridization;
(в) - гибридизация амплифицированного меченого продукта на биочипе;(c) - hybridization of the amplified labeled product on a biochip;
(г) - регистрация и интерпретация результатов гибридизации.(d) - registration and interpretation of hybridization results.
В одном из воплощений настоящего изобретения в качестве клинического образца используют образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови, клеток буккального эпителия и других материалов, полученных от обследуемого индивидуума.In one embodiment of the present invention, DNA samples isolated from peripheral blood lymphocytes, buccal epithelial cells, and other materials obtained from the subject being examined are used as a clinical sample.
В другом воплощении изобретения на втором этапе ПЦР на стадии (а) для флуоресцентного мечения фрагментов генов используют флуоресцентно меченные по 5'-концу праймеры.In another embodiment of the invention, in a second PCR step in step (a), fluorescently labeled 5 ′ end primers are used to fluorescently label gene fragments.
В другом воплощении изобретения для обеспечения биочипа настоящего изобретения, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов настоящего изобретения, на стадии (б) используют метод фотоиндуцируемой сополимеризации в акриламидном геле.In another embodiment of the invention, to provide a biochip of the present invention comprising a set of immobilized oligonucleotides of the present invention, a photoinduced acrylamide gel copolymerization method is used in step (b).
В одном из воплощений изобретения используют условия гибридизации на стадии (в), обеспечивающие высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами.In one embodiment of the invention, hybridization conditions are used in step (c), providing a high degree of differentiation between perfect and imperfect hybridization duplexes.
В еще одном из воплощений регистрацию результатов гибридизации на стадии (г) проводят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой.In yet another embodiment, the registration of hybridization results in step (d) is carried out using a portable biochip analyzer equipped with a CCD camera.
В другом воплощении изобретения регистрацию результатов гибридизации на стадии (г) проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного ПЗС-камерой.In another embodiment of the invention, the hybridization results in step (d) are recorded using a fluorescence microscope equipped with a CCD camera.
В другом воплощении изобретения интерпретацию результатов на стадии (г) проводят визуально.In another embodiment of the invention, the interpretation of the results in step (d) is carried out visually.
В еще одном воплощении изобретения интерпретацию результатов на стадии (г) проводят с использованием программы автоматического анализа изображения.In yet another embodiment of the invention, the interpretation of the results in step (d) is carried out using an automatic image analysis program.
Наконец, в еще одном воплощении интерпретированные результаты используют для целей медицинской диагностики, определения предрасположенности к различным заболеваниям и коррекции доз лекарственных препаратов.Finally, in yet another embodiment, the interpreted results are used for the purposes of medical diagnosis, determining a predisposition to various diseases, and adjusting doses of drugs.
Следующим аспектом изобретения является набор праймеров для амплификации полиморфных фрагментов генов, используемый в способе экспресс-анализа генетического полиморфизма настоящего изобретения. Последовательности праймеров приведены в Перечне последовательностей (SEQ ID NO:1-44).Another aspect of the invention is a set of primers for amplification of polymorphic gene fragments used in the method for rapid analysis of genetic polymorphism of the present invention. The primer sequences are listed in the Sequence Listing (SEQ ID NO: 1-44).
Еще одним аспектом изобретения является набор олигонуклеотидов, иммобилизованных на биочипе, используемый в способе экспресс-анализа генетического полиморфизма настоящего изобретения для определения фармакогенетического статуса человека и выявления генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям. Последовательности олигонуклеотидов приведены в Перечне последовательностей (SEQ ID NO:45-72).Another aspect of the invention is a set of oligonucleotides immobilized on a biochip, used in the method of rapid analysis of the genetic polymorphism of the present invention to determine the pharmacogenetic status of a person and to identify a genetic predisposition to cancer. Oligonucleotide sequences are listed in the Sequence Listing (SEQ ID NO: 45-72).
Наконец, еще одним аспектом изобретения является биочип, представляющий собой подложку с набором иммобилизованных на ней олигонуклеотидов настоящего изобретения и используемый в способе экспресс-анализа генетического полиморфизма настоящего изобретения.Finally, another aspect of the invention is a biochip, which is a substrate with a set of oligonucleotides immobilized on it of the present invention and used in the method of rapid analysis of genetic polymorphism of the present invention.
Перечень чертежейList of drawings
Фигура 1. Схема биологического микрочипа. Ячейки темно-серого цвета соответствуют олигонуклеотидам, комплементарным последовательностям "дикого типа", черного цвета - последовательностям "мутантного типа". Ячейки светло-серого цвета соответствуют олигонуклеотидам, комплементарным последовательностям гена CYP1A1 с одной мутацией, а белого цвета - с двумя мутациями. Каждый олигонуклеотид на биочипе продублирован и имеет следующее диагностическое значение: 1 - Гаплотип 4887CYP1A1*C+4889CYP1A1*A; 2 - Гаплотип 4887CYP1A1*C+4889CYP1A1*G; 3 - Гаплотип 4887CYP1A1*A+4889CYP1A1*C; 4 - Гаплотип 4887CYP1A1*A+4889CYP1A1*G; 5 - Аллель 6235CYP1A1*T; 6 - Аллель 6235CYP1A1*C; 1 - Аллель 1934CYP2D6*G; 8 - Аллель 1934CYP2D6*A; 9 - Аллель 2637CYP2D6*A; 10 - Аллель 2637CYP2D6delA; 11 - Наличие гена GSTT1; 12 - Отсутствие гена GSTT1; 13 - Наличие гена GSTM1; 14 - Отсутствие гена GSTM1, 15 - Аллель 481NAT2*T; 16 - Аллель 481NAT2*C; 17 - Аллель 590NAT2*A; 18 - Аллель 590NAT2*G; 19 - Аллель 857NAT2*A; 20 - Аллель 857NAT2*G; 21 - Аллель 667MTHFR*C, 22 - Аллель 667MTHFR*T; 23 - Аллель 430CYP2C9*C; 24 - Аллель 430CYP2C9*T; 25 - Аллель 1075CYP2C9*A; 26 - Аллель 1075CYP2C9*C; 27 - Аллель 681CYP2C19*G; 28 - Аллель 681CYP2C19*A.Figure 1. Scheme of a biological microchip. Dark gray cells correspond to oligonucleotides complementary to the "wild type" sequences, black to "mutant type" sequences. Light gray cells correspond to oligonucleotides complementary to the CYP1A1 gene sequence with one mutation, and white color with two mutations. Each oligonucleotide on the biochip is duplicated and has the following diagnostic value: 1 - Haplotype 4887CYP1A1 * C + 4889CYP1A1 * A; 2 - Haplotype 4887CYP1A1 * C + 4889CYP1A1 * G; 3 - Haplotype 4887CYP1A1 * A + 4889CYP1A1 * C; 4 - Haplotype 4887CYP1A1 * A + 4889CYP1A1 * G; 5 - Allele 6235CYP1A1 * T; 6 - Allele 6235CYP1A1 * C; 1 - Allele 1934CYP2D6 * G; 8 - Allele 1934CYP2D6 * A; 9 - Allele 2637CYP2D6 * A; 10 - Allele 2637CYP2D6delA; 11 - The presence of the GSTT1 gene; 12 - The absence of the GSTT1 gene; 13 - The presence of the GSTM1 gene; 14 - Lack of the GSTM1 gene; 15 - Allele 481NAT2 * T; 16 - Allele 481NAT2 * C; 17 - Allele 590NAT2 * A; 18 - Allele 590NAT2 * G; 19 - Allele 857NAT2 * A; 20 - Allele 857NAT2 * G; 21 - Allele 667MTHFR * C, 22 - Allele 667MTHFR * T; 23 - Allele 430CYP2C9 * C; 24 - Allele 430CYP2C9 * T; 25 - Allele 1075CYP2C9 * A; 26 - Allele 1075CYP2C9 * C; 27 - Allele 681CYP2C19 * G; 28 - Allele 681CYP2C19 * A.
Фигура 2. Блок биочипа для выявления полиморфизма в генах CYP1A1 и CYP2D6. А - Схема и принцип расположения олигонуклеотидных зондов (указаны только вариабельные позиции). В двух верхних и двух нижних строках содержится идентичная информация (для продублированных на биочипе зондов). Б - Пример гибридизационной картины для образца с генотипом CYP1A1*2A/*1, CYP2D6*1/*1. Стрелками указан обнаруженный "мутантный" вариант. В - Диаграмма сравнения относительных сигналов флуоресценции. Значения сигналов в ячейках биочипа, содержащих С в позиции 4887 и А в позиции 4889 (первый столбец, две верхние строки), более чем в 2 раза превышают значения сигналов в ячейках, содержащих А в обеих позициях или С в позиции 4887 и G в позиции 4889 (верхние ячейки второго столбца и нижние ячейки первого столбца соответственно), а также в ячейках, содержащих двойную замену в позициях 4887 и 4889 (нижние ячейки второго столбца). Значения сигналов в верхних и нижних ячейках в третьем столбце (полиморфизм Т6235С) находятся на одном уровне, что свидетельствует о гетерозиготном состоянии этого локуса и наличии в искомой ДНК также аллеля *2А гена CYP1A1. Значения сигналов в верхних ячейках как четвертого, так и пятого столбца более чем в 2 раза превышают значения таковых в нижних ячейках, что свидетельствует об отсутствии в образце ДНК аллелей *4 и *3 гена CYP2D6.Figure 2. Block biochip to detect polymorphism in the genes CYP1A1 and CYP2D6. A - Scheme and principle of arrangement of oligonucleotide probes (only variable positions are indicated). The upper two and lower two lines contain identical information (for probes duplicated on the biochip). B - An example of a hybridization pattern for a sample with the genotype CYP1A1 * 2A / * 1, CYP2D6 * 1 / * 1. The arrows indicate the detected "mutant" option. B - Comparison chart of relative fluorescence signals. The values of the signals in the cells of the biochip containing C at position 4887 and A at position 4889 (the first column, the top two rows) are more than 2 times higher than the values of signals in cells containing A at both positions or C at positions 4887 and G at 4889 (upper cells of the second column and lower cells of the first column, respectively), as well as in cells containing double substitutions at positions 4887 and 4889 (lower cells of the second column). The values of the signals in the upper and lower cells in the third column (T6235C polymorphism) are at the same level, which indicates the heterozygous state of this locus and the presence of the * 2A allele of the CYP1A1 gene in the desired DNA. The signal values in the upper cells of both the fourth and fifth columns are more than 2 times higher than those in the lower cells, which indicates the absence of the * 4 and * 3 alleles in the DNA sample of the CYP2D6 gene.
Фигура 3. Блок биочипа для выявления полиморфизма в генах GSTT1 и GSTM1. А-В названия подпунктов как на Фиг.2. На диаграмме (В) видно, что есть сигналы в верхних ячейках данного блока, и они превышают более чем в 2 раза сигналы в нижних ячейках, что свидетельствует о присутствии в образце хотя бы одной копии как гена GSTT1, так и гена GSTM1.Figure 3. A biochip block for detecting polymorphism in the GSTT1 and GSTM1 genes. A-B, the names of the subitems as in FIG. 2. Diagram (B) shows that there are signals in the upper cells of this block, and they are more than 2 times higher than the signals in the lower cells, which indicates the presence in the sample of at least one copy of both the GSTT1 gene and the GSTM1 gene.
Фигура 4. Блок биочипа для выявления полиморфизма в генах NAT2 и MTHFR. А-В названия подпунктов как на Фиг.2. Сравнение значений сигналов ячеек проводили так же, как при выявлении мутаций в гене CYP2D6 блока №1.Figure 4. Block biochip to detect polymorphism in the genes NAT2 and MTHFR. A-B, the names of the subitems as in FIG. 2. Comparison of cell signal values was carried out in the same way as when mutations were detected in the CYP2D6 gene of block No. 1.
Фигура 5. Блок биочипа для выявления полиморфизма в генах CYP2C9 и CYP2C19. А-В названия подпунктов как на Фиг.2. Сравнение значений сигналов ячеек проводили так же, как при выявлении мутаций в гене CYP2D6 блока №1.Figure 5. A biochip block for detecting polymorphism in the CYP2C9 and CYP2C19 genes. A-B, the names of the subitems as in FIG. Comparison of cell signal values was carried out in the same way as when mutations were detected in the CYP2D6 gene of block No. 1.
Фигура 6. Гибридизационная картина, полученная на биочипе для анализа полиморфизма по генам CYP1A1, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, NAT2, MTHFR, CYP2C9 и CYP2C19. Стрелками указаны обнаруженные "мутантные" варианты.Figure 6. Hybridization pattern obtained on a biochip for analysis of polymorphisms for the genes CYP1A1, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, NAT2, MTHFR, CYP2C9 and CYP2C19. The arrows indicate the detected "mutant" variants.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении способа экспресс-анализа генетического полиморфизма для определения фармакогенетического статуса человека и выявления генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям в образцах ДНК, полученных от пациентов, с использованием олигонуклеотидного биочипа.The objective of the present invention is to provide a method for the rapid analysis of genetic polymorphism to determine the pharmacogenetic status of a person and to identify a genetic predisposition to cancer in DNA samples obtained from patients using an oligonucleotide biochip.
Образец ДНК используют как матрицу в мультиплексной «гнездовой» двухэтапной ПЦР. На втором этапе ПЦР получают флуоресцентно меченный амплифицированный фрагмент. Меченый ПЦР-продукт используют для дальнейшей гибридизации на биочипе, содержащем иммобилизованные олигонуклеотиды, представляющие собой участки последовательностей генов, комплементарных как последовательности "дикого типа", так и вариабельной последовательности. Анализируемый фрагмент ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы только с соответствующими полностью комплементарными ему олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами анализируемый фрагмент ДНК будет образовывать несовершенные дуплексы, стабильность которых существенно ниже стабильности совершенных дуплексов. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят после отмывки биочипа, сравнивая интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек биочипа. Интенсивность сигнала в случае образования совершенного дуплекса выше, чем в случае несовершенного. Используя схему расположения олигонуклеотидов на биочипе, определяют, какие варианты присутствуют в том или ином образце.A DNA sample is used as a template in a multiplex “nested” two-stage PCR. In a second step, PCR produces a fluorescently labeled amplified fragment. Labeled PCR product is used for further hybridization on a biochip containing immobilized oligonucleotides, which are portions of gene sequences that are complementary to both the wild-type sequence and the variable sequence. The analyzed DNA fragment forms perfect hybridization duplexes only with the corresponding oligonucleotides fully complementary to it. With all other oligonucleotides, the analyzed DNA fragment will form imperfect duplexes, the stability of which is significantly lower than the stability of perfect duplexes. Discrimination of perfect and imperfect duplexes is carried out after washing the biochip, comparing the fluorescence intensities of the corresponding cells of the biochip. The signal intensity in the case of the formation of perfect duplex is higher than in the case of imperfect. Using the arrangement of oligonucleotides on the biochip, determine which options are present in a particular sample.
В предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения, обеспечивающем удобство клинического применения, наличие альтернативных генетических вариантов определяют, используя образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови, полученных от пациента.In a preferred embodiment of the method of the present invention, providing clinical convenience, the availability of alternative genetic variants is determined using DNA samples isolated from peripheral blood lymphocytes obtained from a patient.
Полимеразная цепная реакция может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (например, Taq-полимеразы, фрагмента Стоффеля, Tth-полимеразы, Tfl-полимеразы, Pfu-полимеразы, Vent-полимеразы, DeepVent-полимеразы и т.п., которые коммерчески доступны от большого числа производителей), работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) в принятых концентрациях, но вместо дТТФ может быть использован дУТФ. Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров.The polymerase chain reaction can be carried out using any type of thermostable polymerase (e.g., Taq polymerase, Stoffel fragment, Tth polymerase, Tfl polymerase, Pfu polymerase, Vent polymerase, DeepVent polymerase and the like, which are commercially available from a large number of manufacturers) working in the corresponding buffer. To build a new chain, a mixture of dNTPs (dATP, dGTF, dTTP, dTTP) at the accepted concentrations is added to the buffer, but dUTP can be used instead of dTTP. For PCR, ready-made commercially available kits containing all the necessary components except primers can be used.
В качестве праймеров для проведения мультиплексной «гнездовой» двухстадийной полимеразной цепной реакции используют праймеры SEQ ID NO:1-44, приведенные в Перечне последовательностей, а также в таблице 1. При этом проводят на первом этапе раздельную амплификацию с использованием праймеров с последовательностью SEQ ID NO:1-8, праймеров с последовательностью SEQ ID NO:9-12 и праймеров с последовательностью SEQ ID NO:13-18. На втором этапе раздельно проводят амплификацию с использованием праймеров с последовательностью SEQ ID NO:19-26, праймеров с последовательностью SEQ ID NO:27-30, праймеров с последовательностью SEQ ID NO:31-38 и праймеров с последовательностью SEQ ID NO:39-44. Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидных праймеров, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез праймеров осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например (без ограничения) производства фирмы Applied Biosystems (США).As primers for conducting the multiplex "nested" two-stage polymerase chain reaction, primers SEQ ID NO: 1-44 are used, which are shown in the List of sequences, as well as in table 1. At the same time, separate amplification is carried out at the first stage using primers with the sequence SEQ ID NO : 1-8, primers with the sequence of SEQ ID NO: 9-12 and primers with the sequence of SEQ ID NO: 13-18. In the second step, amplification is carried out separately using primers with the sequence SEQ ID NO: 19-26, primers with the sequence SEQ ID NO: 27-30, primers with the sequence SEQ ID NO: 31-38, and primers with the sequence SEQ ID NO: 39- 44. There are various chemical approaches to the synthesis of oligonucleotide primers, for example, the phosphodiester method, the hydrophosphoryl method, etc., but the phosphoramidite method is currently the most widely used. The primers are synthesized using automatic DNA / RNA synthesizers, for example (without limitation) manufactured by Applied Biosystems (USA).
Последовательности праймеров, участвующих в мультиплексной ПЦР.Table 1.
The sequence of primers involved in multiplex PCR.
В одном из воплощений мечение ПЦР-продукта на втором этапе ПЦР проводят с помощью праймеров, несущих флуоресцентную метку на 5'-конце.In one embodiment, the labeling of the PCR product in the second step of the PCR is carried out using primers carrying a fluorescent label at the 5'-end.
В качестве флуоресцентной метки может быть использован любой флуорохром (например, без ограничения, FITC, Texas red, Су-3, Су-5 и т.д.), а также биотин.Any fluorochrome can be used as a fluorescent label (for example, without limitation, FITC, Texas red, Su-3, Su-5, etc.), as well as biotin.
На второй стадии мультиплексной «гнездовой» двухэтапной ПЦР праймеры, входящие в состав одной пары, могут использоваться в эквимолярных количествах. Специалисту понятно, что образующийся при этом продукт амплификации будет по существу двухцепочечным, и для его эффективной гибридизации с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе, проводят предварительную денатурацию. Обычно денатурацию проводят непосредственно перед проведением гибридизации путем прогрева готовой гибридизационной смеси при 95°С в течение 5 мин с последующим быстрым охлаждением во льду. В предпочтительном воплощении изобретения вторую стадию мультиплексной «гнездовой» двухэтапной ПЦР проводят в асимметричном формате, т.е. флуоресцентно меченный праймер используют в молярном избытке по отношению к немеченому праймеру, например, при молярном соотношении около 10:1, соответственно. Специалисту понятно, что образующийся при этом продукт амплификации будет представлен преимущественно одноцепочечной флуоресцентно меченной ДНК. С учетом возможности образования вторичных структур для эффективной гибридизации такого продукта с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе, при необходимости также проводится его предварительная денатурация.In the second stage of the multiplex "nested" two-stage PCR primers that are part of one pair can be used in equimolar amounts. One skilled in the art will recognize that the amplification product resulting from this will be essentially double-stranded, and to pre-hybridize it with oligonucleotides immobilized on a biochip, preliminary denaturation is carried out. Typically, denaturation is carried out immediately prior to hybridization by heating the finished hybridization mixture at 95 ° C for 5 minutes, followed by rapid cooling in ice. In a preferred embodiment of the invention, the second step of the multiplex “nested” two-step PCR is carried out in an asymmetric format, i.e. fluorescently labeled primer is used in molar excess relative to unlabeled primer, for example, at a molar ratio of about 10: 1, respectively. One skilled in the art will appreciate that the amplification product resulting from this will be predominantly single stranded fluorescently labeled DNA. Given the possibility of the formation of secondary structures for effective hybridization of such a product with oligonucleotides immobilized on a biochip, preliminary denaturation is also carried out if necessary.
При подборе условий гибридизации создают условия, обеспечивающие наибольшую интенсивность флуоресценции совершенных дуплексов, специфичность взаимодействия и максимальную разницу в стабильности между совершенными и несовершенными дуплексами. Гибридизация может быть проведена в любом известном специалисту в данной области гибридизационном буфере, при необходимости содержащем реагенты, понижающие температуру плавления образуемых дуплексов и обеспечивающие специфичность взаимодействия между олигонуклеотидным зондом и ДНК-мишенью в диапазоне температур около 37°С. Это обеспечивает дополнительное удобство в использовании способа настоящего изобретения в случае клинической лаборатории, в комплект стандартного оборудования которой обычно входит термостат, установленный на температуру, например, 37°С. К таким реагентам относятся формамид, гуанидин гидрохлорид, гуанидин изотиоцианат и др. Гибридизация может проводиться и в отсутствии таких реагентов, но при более высоких температурах, соответствующих температурам плавления олигонуклеотидных зондов в используемом буфере. При подборе условий гибридизации и отмывки основное внимание должно быть обращено на специфичность прохождения гибридизации. Отмывка может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (например, SSC, SSPE и т.п.) или в деионизованной воде, но за более короткое время (J.F.Sambrook and D.W.Russell, 2001, "Molecular cloning: a laboratory manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, v.l, p.6.50-6.62 (Protocol 10)).When selecting hybridization conditions, conditions are created that provide the highest fluorescence intensity of perfect duplexes, the specificity of the interaction, and the maximum difference in stability between perfect and imperfect duplexes. Hybridization can be carried out in any hybridization buffer known to a person skilled in the art, optionally containing reagents that lower the melting point of the formed duplexes and ensure the specificity of the interaction between the oligonucleotide probe and the target DNA in a temperature range of about 37 ° C. This provides additional convenience in using the method of the present invention in the case of a clinical laboratory, the standard equipment of which usually includes a thermostat set to a temperature of, for example, 37 ° C. Such reagents include formamide, guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, etc. Hybridization can be carried out in the absence of such reagents, but at higher temperatures corresponding to the melting points of the oligonucleotide probes in the buffer used. When selecting the conditions of hybridization and washing, the main attention should be paid to the specificity of the passage of hybridization. The washing can be carried out in any buffer known in the art with the addition of salt (for example, SSC, SSPE, etc.) or in deionized water, but in a shorter time (JFSambrook and DWRussell, 2001, "Molecular cloning: a laboratory manual "Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, vl, p.6.50-6.62 (Protocol 10)).
Регистрация гибридизационной картины может быть произведена с помощью любой детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал (например, флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой, лазерный сканер или портативный анализатор биочипов, доступные коммерчески от большого числа производителей, например портативный анализатор биочипов, производимый серийно ООО «Биочип-ИМБ», и снабженной регистрирующим устройством (например, ПЗС-камерой, видеокамерой, фотокамерой)). Анализ изображения может быть произведен как визуально, так и в автоматическом режиме с использованием специальной программы.The hybridization pattern can be recorded using any detecting system that recognizes a fluorescent signal (for example, a fluorescence microscope with a CCD camera, a laser scanner or a portable biochip analyzer, available commercially from a large number of manufacturers, for example, a portable biochip analyzer, produced commercially by Biochip- IMB ”, and equipped with a recording device (for example, a CCD camera, video camera, camera)). Image analysis can be done both visually and automatically using a special program.
При изготовлении микрочипа могут быть использованы олигонуклеотиды, несущие по 5'- или 3'-концу активную группу, обеспечивающую иммобилизацию, существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидов, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез олигонуклеотидов осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например производства фирмы Applied Biosystems (США). Возможно использование широкого спектра групп для модификации иммобилизуемых олигонуклеотидов, таких как аминогруппа, тиол, гидразид, акриламидная группа, бензальдегид, тиофосфат и т.п. (Seliger H., Hinz М., Нарр Е. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395). Модификация олигонуклеотида, имеющая целью введение активной группы, пригодной для последующей иммобилизации олигонуклеотида на биочипе, может быть осуществлена как в автоматическом режиме при синтезе с использованием широкого спектра модификаторов, которые коммерчески доступны, например, от Glen Research (USA), так и постсинтетически в ручном режиме.In the manufacture of a microchip, oligonucleotides can be used that carry an active group that provides immobilization at the 5'- or 3'-end; there are various chemical approaches to the synthesis of oligonucleotides, for example, the phosphodiester method, hydrophosphoryl method, etc., but the most prevalent currently has a phosphoramidite method. The synthesis of oligonucleotides is carried out using automatic DNA / RNA synthesizers, for example, manufactured by Applied Biosystems (USA). A wide range of groups can be used to modify immobilized oligonucleotides, such as an amino group, thiol, hydrazide, acrylamide group, benzaldehyde, thiophosphate, and the like. (Seliger H., Hinz M., Narr E. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395). Modification of the oligonucleotide, with the aim of introducing an active group suitable for subsequent immobilization of the oligonucleotide on a biochip, can be carried out both automatically in the synthesis using a wide range of modifiers that are commercially available, for example, from Glen Research (USA), and postsynthetically in manual mode.
Биочипы могут быть изготовлены путем создания на поверхности стеклянной подложки матрицы из ячеек полиакриламидного геля, активации ячеек и ковалентной иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов, несущих активные группы (Mirzabekov А. & Kolchinsky A. MAGIChip: Properties and applications in genomic studies. (2002) In Genomic Technologies: Present and Future. Eds. Galas D.J., S.J.McCormack. Caister Academic Press, pp.163-196). Также биочипы могут быть изготовлены методом химически индуцируемой или фотоиндуцируемой сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Vasiliskov V., Timofeev E., Surzhikov S., Drobyshev A., Shick V. & Mirzabekov A. 1999. Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. BioTechnique, 27, 592-606; Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С. В., Чернов Б.К. Патент на изобретение N 2175972 «Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа». Приоритет от 28.12.1999). Также биочипы могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами (Seliger H., Hinz М., Нарр Е. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395), а в качестве подложки, помимо стекла, может быть использован другой материал (пластик, металл, гибкие мембраны и т.д.). Также для изготовления микрочипов могут быть использованы активированные подложки, коммерчески доступные от различных производителей (см., например, Ramakrishnan R, Dorris D, Lublinsky A, Nguyen A, Domanus M, Prokhorova A, Gieser L, Touma E, Lockner R, Tata M, Zhu X, Patterson M, Shippy R, Sendera TJ, Mazumder A. 2002. An assessment of Motorola CodeLink microarray performance for gene expression profiling applications. Nucleic Acids Res. 30: e30).Biochips can be made by creating on the glass substrate surface a matrix of polyacrylamide gel cells, activating the cells and covalently immobilizing the modified oligonucleotides in the cells carrying active groups (Mirzabekov A. & Kolchinsky A. MAGIChip: Properties and applications in genomic studies. (2002) In Genomic Technologies: Present and Future. Eds. Galas DJ, SJMcCormack. Caister Academic Press, pp. 163-196). Biochips can also be made by chemically-induced or photo-induced copolymerization of an oligonucleotide in an acrylamide gel, as described previously (Vasiliskov V., Timofeev E., Surzhikov S., Drobyshev A., Shick V. & Mirzabekov A. 1999. Fabrication of microarray of gel -immobilized compounds on a chip by copolymerization. BioTechnique, 27, 592-606; Mirzabekov A.D., Rubina A.Yu., Pankov S.V., Chernov B.K. Patent for invention N 2175972 "Method for the immobilization of oligonucleotides, containing unsaturated groups in polymer hydrogels during microchip formation. ”Priority dated 12/28/1999). Biochips can also be made by any other methods known to a person skilled in the art (Seliger H., Hinz M., Narr E. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395), and as a substrate, in addition to glass, another material can be used (plastic, metal, flexible membranes, etc.). Also, activated substrates commercially available from various manufacturers can be used to make microchips (see, for example, Ramakrishnan R, Dorris D, Lublinsky A, Nguyen A, Domanus M, Prokhorova A, Gieser L, Touma E, Lockner R, Tata M , Zhu X, Patterson M, Shippy R, Sendera TJ, Mazumder A. 2002. An assessment of Motorola CodeLink microarray performance for gene expression profiling applications. Nucleic Acids Res. 30: e30).
Для изготовления биочипа настоящего изобретения используют набор олигонуклеотидов SEQ ID NO:45-72, приведенных в Перечне последовательностей, а также таблице 2. В качестве контроля прохождения гибридизации в настоящем изобретении используют образец контрольной ДНК. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьировать и определяется только удобством для интерпретации результатов гибридизации.For the manufacture of the biochip of the present invention, the set of oligonucleotides SEQ ID NO: 45-72 shown in the Sequence Listing and Table 2 are used. As a control of the passage of hybridization, a control DNA sample is used in the present invention. The location of specific oligonucleotide probes on the biochip can vary and is determined only by the convenience for interpreting the results of hybridization.
Список олигонуклеотидов, иммобилизованных на микрочипе.Table 2.
List of oligonucleotides immobilized on a microchip.
Ранняя диагностика и своевременная профилактика рака являются одними из самых актуальных проблем современной медицины. В структуре смертности на долю онкозаболеваний приходится около 17-20% всех случаев, и эта доля продолжает увеличиваться. Наиболее распространенными видами рака являются рак молочной железы у женщин (встречается у 5-10% всех женщин), рак легкого (встречается чаще у мужчин, от него умирают 3-4% населения) и рак прямой кишки (4-15% онкологических больных). Создание и внедрение в клиническую практику тестов на основе биочипов для определения генетической предрасположенности к развитию раков молочной железы, легкого и прямой кишки позволит разработать и внедрить комплекс профилактических мер, направленных на предотвращение этих заболеваний, а также повысить эффективность ранней, досимптоматической диагностики у лиц, выделенных в группы повышенного риска, скорректировать фармакотерапию заболеваний.Early diagnosis and timely cancer prevention are some of the most pressing problems of modern medicine. In the mortality structure, cancer accounts for about 17-20% of all cases, and this proportion continues to increase. The most common types of cancer are breast cancer in women (found in 5-10% of all women), lung cancer (more common in men, 3-4% of the population die from it) and colon cancer (4-15% of cancer patients) . The creation and implementation in clinical practice of tests based on biochips to determine the genetic predisposition to the development of breast, lung and rectal cancers will allow developing and implementing a set of preventive measures aimed at preventing these diseases, as well as increasing the effectiveness of early, pre-symptomatic diagnosis in individuals identified in high-risk groups, adjust the pharmacotherapy of diseases.
Биочип настоящего изобретения позволяет определять генетическую предрасположенность не только к раку легкого, раку молочной железы, раку мочевого пузыря, но и раку кожи, раку толстой и прямой кишки, аденоме прямой кишки, апластической анемии, лейкозам (у детей), алкогольному циррозу, бронхиальной астме, бронхиту, псориазу, мигрени.The biochip of the present invention allows to determine the genetic predisposition not only to lung cancer, breast cancer, bladder cancer, but also skin cancer, colon and rectal cancer, rectal adenoma, aplastic anemia, leukemia (in children), alcoholic cirrhosis, bronchial asthma , bronchitis, psoriasis, migraine.
Кроме того, результаты исследования на биочипе могут быть использованы для коррекции доз таких лекарственных препаратов, как, например: бета-адреноблокаторы, антидепрессанты, антипсихотропные, антиаритмические, нейролептики, антигипертензивные препараты, производные морфина, нейротрансмитеры (допамины), анальгетики, опиаты (CYP2D6 обусловленные); антикоагулянты (варфарин), антигипертензивные препараты (лозартан), сахароснижающие препараты (глипизид), противосудорожные препараты (фенитоин, диазепам), антидепрессанты (амитриптилин, кломипрамин, имипрамин), ингибиторы протонных помп (омепразол), нестероидные противовоспалительные препараты (диклофенак, ибупрофен, пироксикам), толбутамин (CYP2C9 обусловленные); противосудорожные препараты, ингибиторы протонных помп (омепразол, лансопразол, пантопразол, эзомепразол и рабепразол), используемые при лечении кислотно-зависимых заболеваний, прогуанил и барбитураты (CYP2C19 обусловленные); бусульфан (GSTM1 и GSTT1 обусловленные); 2-аминофлюорен, р-анизид, изониазид, прокаинамид, амонафид (NAT2 обусловленные).In addition, the results of the biochip study can be used to adjust the doses of such drugs as, for example: beta-blockers, antidepressants, antipsychotropic, antiarrhythmic, antipsychotics, antihypertensive drugs, morphine derivatives, neurotransmitters (dopamines), analgesics, opiates (CYP2D6 ); anticoagulants (warfarin), antihypertensive drugs (losartan), hypoglycemic drugs (glipizide), anticonvulsants (phenytoin, diazepam), antidepressants (amitriptyline, clomipramine, imipramine), proton pump inhibitors (omeprazole antiforpofenoxifrofenofiperfenoprofenoprofenoxifrofenofiperfenoprofenoprofenoxifrofenofiperfenoprofenoxifrofenoxifrofen ), tolbutamine (CYP2C9-mediated); anticonvulsants, proton pump inhibitors (omeprazole, lansoprazole, pantoprazole, esomeprazole and rabeprazole), used in the treatment of acid-dependent diseases, proguanil and barbiturates (CYP2C19 caused); busulfan (GSTM1 and GSTT1 conditioned); 2-aminofluorene, p-aniside, isoniazid, procainamide, amonafide (NAT2-mediated).
Далее изобретение иллюстрируется примерами, которые демонстрируют применение способа экспресс-анализа генетического полиморфизма для определения фармакогенетического статуса человека и выявления генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям. Следует, однако, понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, который определяется формулой изобретения.The invention is further illustrated by examples that demonstrate the use of the method of rapid analysis of genetic polymorphism to determine the pharmacogenetic status of a person and to identify a genetic predisposition to cancer. It should be understood, however, that the examples cited are for illustration only and are not intended to limit the scope of the claims as defined by the claims.
Пример 1. Амплификация фрагментов генов методом двухэтапной «гнездовой» мультиплексной ПЦР с целью наработки флуоресцентно меченного фрагмента гибридного гена, специфичного для каждого полиморфного варианта.Example 1. Amplification of gene fragments by the method of two-stage "nested" multiplex PCR in order to produce a fluorescently labeled fragment of a hybrid gene specific for each polymorphic variant.
1. Для проведения первого этапа готовят ПЦР смеси в трех пробирках объемом 25 мкл. Состав ПЦР-смеси: 67 мМ Трис-HCl, рН 8.6, 166 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Тритон Х-100, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из дНТФ (Силекс, Россия), 1,5 единицы фермента Taq-полимераза фирмы «Силекс» (Россия), смесь праймеров первого раунда по 10 пмоль каждого: для пробирки №1 - SEQ ID NO:1-8, для пробирки №3 - SEQ ID NO: 9-12 и для пробирки №4 - SEQ ID NO:13-18. В каждую пробирку вносят 1 мкл образца ДНК. Всю смесь нагревают при 94°С в течение 5 мин, затем проводят 35 циклов амплификации по следующей схеме: 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 1 мин. Завершающая инкубация: 72°С - 5 мин.1. For the first stage, PCR mixtures are prepared in three test tubes with a volume of 25 μl. Composition of the PCR mixture: 67 mM Tris-HCl, pH 8.6, 166 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.01% Triton X-100, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM each of dNTPs (Silex, Russia), 1.5 units of Taq polymerase enzyme from Sileks company (Russia), a mixture of primers of the first round of 10 pmol each: for tube No. 1 - SEQ ID NO: 1-8, for tube No. 3 - SEQ ID NO: 9-12 and for test tube No. 4 - SEQ ID NO: 13-18. 1 μl of DNA sample was added to each tube. The whole mixture is heated at 94 ° C for 5 min, then 35 cycles of amplification are carried out according to the following scheme: 94 ° C - 30 s, 60 ° C - 30 s, 72 ° C - 1 min. Final incubation: 72 ° C - 5 min.
2. Для проведения второго этапа готовят ПЦР смеси в четырех пробирках объемом 25 мкл. На втором этапе проводят асимметричную ПЦР с праймерами второго этапа: для пробирки №1 - SEQ ID NO:19-26, для пробирки №2 - SEQ ID NO:27-30, для пробирки №3 - SEQ ID NO:31-38, для пробирки №4 - SEQ ID NO:39-44. В пробирку №2 вносят 1 мкл образца ДНК, в пробирки №1, 3 и 4 - по 1 мкл ПЦР-продукта первого этапа, соответственно. Для каждого фрагмента в реакции участвуют праймеры, меченные флуоресцентным красителем Су-5, по 50 пмоль каждого (SEQ ID NO:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44) и немеченые праймеры по 5 пмоль каждого (SEQ ID NO:19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43), подобранные так, чтобы в каждой паре «верхний и нижний праймеры» один был меченым, а другой немеченым. Последовательности праймеров первого и второго этапа приведены также в таблице 1. Всю смесь нагревают при 94°С в течение 5 мин, затем проводят 35 циклов амплификации по следующей схеме: 94°С - 30 с, 62°С - 30 с, 72°С - 1 мин. Завершающая инкубация: 72°С - 5 мин. В результате реакции для каждого фрагмента нарабатывают преимущественно цепь одного знака (смысловая или антисмысловая), содержащую на 5'-конце флуоресцентную метку. ПЦР-анализ на наличие полиморфных вариантов проводят как несколько параллельных мультиплексных реакций.2. For the second stage, PCR mixtures are prepared in four test tubes with a volume of 25 μl. At the second stage, asymmetric PCR is carried out with primers of the second stage: for tube No. 1 - SEQ ID NO: 19-26, for tube No. 2 - SEQ ID NO: 27-30, for tube No. 3 - SEQ ID NO: 31-38, for test tube No. 4 - SEQ ID NO: 39-44. 1 μl of DNA sample was added to test tube No. 2, and 1 μl of 1-st stage PCR product, respectively, to test tubes No. 1, 3. For each fragment, primers labeled with a Su-5 fluorescent dye participate in the reaction, 50 pmol each (SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44) and unlabeled primers of 5 pmol each (SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43), selected so that in each pair "upper and lower primers ”one was labeled and the other unlabeled. The primer sequences of the first and second stages are also shown in table 1. The whole mixture is heated at 94 ° C for 5 min, then 35 amplification cycles are carried out according to the following scheme: 94 ° C - 30 s, 62 ° C - 30 s, 72 ° C - 1 min. Final incubation: 72 ° C - 5 min. As a result of the reaction, a chain of the same sign (semantic or antisense) containing a fluorescent label at the 5'-end is produced predominantly for each fragment. PCR analysis for the presence of polymorphic variants is carried out as several parallel multiplex reactions.
Пример 2. Олигонуклеотидный биочип для определения фармакогенетического статуса человека и выявления генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям.Example 2. Oligonucleotide biochip to determine the pharmacogenetic status of a person and identify a genetic predisposition to cancer.
3. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 5'- или 3'-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводят в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования 3'-Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research, USA). Присоединение флуоресцентной метки к олигонуклеотидам по свободной аминогруппе осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя. Олигонуклеотиды, меченные цианиновым красителем Су-5, очищают ВЭЖХ от олигонуклеотидов, не включивших флуоресцентный краситель, на колонке «Hypersil ODS 5 мкм, 4,6×250 мм» («Thermo Hypersil», США).3. Oligonucleotides for immobilization on a microchip are synthesized on a 394 DNA / RNA Synthesizer (Applied Biosystems, USA) using a standard phosphoamidite procedure. The 5 ′ or 3 ′ end of the oligonucleotides contains a free amino group spacer, which is introduced into the oligonucleotide by synthesis using the 3′-Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research, USA). The addition of a fluorescent label to the free amino group oligonucleotides is carried out in accordance with the manufacturer's recommendations. Oligonucleotides labeled with cyanine dye Su-5 purified HPLC from oligonucleotides that did not include a fluorescent dye on a Hypersil ODS 5 μm, 4.6 × 250 mm column (Thermo Hypersil, USA).
4. Биочип изготовляют методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Патент на изобретение N 2175972 «Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа» Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К. Приоритет от 28.12.1999). Биочип содержит 28 типов иммобилизованных олигонуклеотидов (SEQ ID NO:45-72), список которых представлен также в Таблице 2. На Фиг.1 представлена схема биочипа для определения фармакогенетического статуса человека и выявления генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям. Олигонуклеотидные пробы в составе биочипа сгруппированы в блоки. Блок №1 предназначен для выявления полиморфных вариантов генов CYP1A1 и CYP2D6 (фиг.2). В гене CYP1A1 с помощью биочипа можно анализировать полиморфные участки С4887А, A4889G и Т6235С, что позволяет выявлять две мутантные аллели этого гена: *2А (гаплотип 6235CYP1A1*C) и *4 (4887CYP1APA), а также мутантный гаплотип (аллель*2В) (4889CYP1A1*G+6235CYP1A1*C) и гаплотип дикого типа (аллель*1) (4887CYP1A1*C+4889CYP1A1*A+6235CYP1A1*T). В гене CYP2D6 можно идентифицировать полиморфные варианты G1934A и delA2637. Их определение позволяет выявлять две мутантные аллели этого гена: *4 (1934CYP2D6*A), *3 (2637CYP2D6de1A) и аллель дикого типа (*1) (1934CYP2D6*G+2637CYP2D6*A). Анализ результатов гибридизации на микрочипе и определение генотипа проводится следующим образом. При выявлении флуоресцентного сигнала во всех ячейках двух верхних строк (кроме ячеек второго столбца) считают, что образец содержит только аллели дикого типа генов CYP1A1 и CYP2D6. Аллели *2А гена CYP1A1 соответствует сигнал с двух нижних ячеек третьего столбца, аллели *4 - сигнал с двух верхних ячеек второго столбца, а аллель *2В определяют при наличии сигнала в двух нижних ячейках первого и третьего столбцов. Аллели *4 и *3 гена CYP2D6 определяют по появлению сигнала в двух нижних ячейках четвертого и пятого столбцов соответственно. На фиг.2 показан пример гибридизационной картины для образца, гетерозиготного по мутации Т6235С в гене CYP1A1 (*2А/*1) и гомозиготного по аллели дикого типа гена CYP2D6 (*1/*1). Блок №2 предназначен для обнаружения полиморфных вариантов генов GSTT1 и GSTM1 (фиг.3). С помощью чипа можно анализировать протяженные внутригенные делеции, что позволяет выявлять нуль-аллели этих генов (делеции в гомозиготе), а также находить образцы, в которых есть хотя бы одна копия гена GSTT1 или гена GSTM1 (делеции в гетерозиготе и гомозиготы дикого типа). Специфичность гибридизации ПЦР продукта с пробой подтверждают, используя в качестве пробы для сравнения олигонуклеотид с искусственно введенной заменой одного основания в центре пробы (фиг.3). В качестве внешнего контроля (прохождение ПЦР) используют сравнение с положительными контрольными образцами. На фиг.3 показаны гибридизационные картины образца, содержащего хотя бы одну копию как гена GSTT1, так и гена GSTM1 (в случае делеции в любом из генов сигнала нет как в верхних, так и в нижних ячейках). Блок №3 предназначен для выявления полиморфизма по генам NAT2 (С481Т, G590A и G857A) и MTHFR (C677T) (фиг.4). Обнаружение полиморфных участков С481Т, G590A и G857A позволяет выявлять четыре аллеля гена NAT2: S1 (481NAT2*G), S2 (590NAT2*G), S3 (857NAT2*G) и аллель дикого типа - N (481NAT2*T+590NAT2*A+857NAT2*A). В гене MTHFR анализируют полиморфный участок С667Т, что позволяет определять два аллели этого гена: аллель дикого типа 667MTHFR*C и мутантная аллель 667MTHFR*T. Сравнение значений сигналов ячеек проводят так же, как при выявлении мутаций в гене CYP2D6 блока №1. На фиг.4 приведена гибридизационная картина образца, гетерозиготного по мутации С481Т в гене NAT2 (S1/N) и C677T в гене MTHFR (С/Т). Блок №4 предназначен для обнаружения полиморфизма по генам CYP2C9 и CYP2C19 (фиг.5). Использование микрочипов позволяет анализировать полиморфные участки С430Т и А1075С в гене CYP2C9 и выявлять две мутантные аллели этого гена: *2 (430CYP2C9*T) и *3 (1075CYP2C9*C), а также аллель дикого типа, или *1 (430CYP2C9*C+1075CYP2C9*A). В гене CYP2C19 можно анализировать мутацию G681A, что позволяет определять аллель дикого типа, или *1 (681CYP2C19*G) и мутантная аллель *2 (681CYP2C19*A). Сравнение значений сигналов ячеек проводят так же, как при выявлении мутаций в гене CYP2D6 блока №1. На фиг.5 приведена гибридизационная картина образца "дикого типа", у которого не найдено соответствующих мутаций в генах CYP2C9 и CYP2C19. Разработанный биочип позволяет анализировать 14 мутаций в восьми различных генах. На фиг.6 приведен пример гибридизационной картины, включающей все блоки биочипа для образца со следующим генотипом: CYP1A1 (*2В/*1), CYP2D6 (*4/*4), GSTM1 (+/+), GSTT1 (+/+), NAT2 (S2/N), MTHFR (С/С), CYP2C9 (*1/*1), CYP2C19 (*2/*1).4. The biochip is made by copolymerization of an oligonucleotide in an acrylamide gel, as described previously (Patent for invention N 2175972 "Method for immobilizing oligonucleotides containing unsaturated groups in polymer hydrogels during microchip formation" Mirzabekov AD, Rubina A.Yu., Pankov S .V., Chernov B.K. Priority dated 12/28/1999). The biochip contains 28 types of immobilized oligonucleotides (SEQ ID NO: 45-72), a list of which is also presented in Table 2. Figure 1 shows a biochip scheme for determining the pharmacogenetic status of a person and revealing a genetic predisposition to cancer. Oligonucleotide samples in the biochip are grouped into blocks. Block No. 1 is designed to identify polymorphic variants of the genes CYP1A1 and CYP2D6 (figure 2). In the CYP1A1 gene, a biochip can be used to analyze the polymorphic regions of C4887A, A4889G, and T6235C, which makes it possible to identify two mutant alleles of this gene: * 2A (haplotype 6235CYP1A1 * C) and * 4 (4887CYP1APA), as well as mutant (
Пример 3. Гибридизация меченого продукта на биочипеExample 3. Hybridization of a labeled product on a biochip
5. Содержимое всех пробирок, полученных на стадии 2 Примера 1, используют для гибридизации на биочипе в буфере следующего состава: 25% формамид (Gibco BRL), 5×SSPE. Готовую гибридизационную смесь перед гибридизацией денатурируют при 95°С в течение 5 мин, охлаждают во льду и наносят на биочип под гибридизационную камеру объемом 20 мкл (Sigma, USA). Гибридизацию проводят в течение ночи (16-18 ч) при температуре 37°С. Отмывку проводят в буфере 1×SSPE при комнатной температуре в течение 10 мин.5. The contents of all the tubes obtained in
Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации.Example 4. Registration and interpretation of the results of hybridization.
6. Регистрацию гибридизационной картины производят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО «Биочип-ИМБ». При визуальном анализе изображения интерпретацию результатов проводят как в примере 2. Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программы ImageWare™ выходит за рамки настоящего изобретения.6. Registration of the hybridization pattern is carried out using a portable biochip analyzer equipped with a CCD camera manufactured by Biochip-IMB LLC. When visual analysis of the image, the interpretation of the results is carried out as in example 2. The description of the algorithm for automatic image analysis using the ImageWare ™ program is beyond the scope of the present invention.
На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от изложенной выше общей концепции и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения, который определяется приводимой ниже формулой изобретения.Based on the present description, a person skilled in the art will be able to easily propose their variants and modifications of the invention, without departing from the general concept set forth above and without involving one's own inventive activity, so it should be understood that such variants and modifications will also be included in the scope of the present invention, which is defined by the following claims.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005131568/13A RU2303634C2 (en) | 2005-10-11 | 2005-10-11 | Method for analysis of genetic polymorphysm, defining predisposition to tumor diseases and individual sensitivity to pharmaceutical agents by using olygonucleotide biological microarray (bioarray) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005131568/13A RU2303634C2 (en) | 2005-10-11 | 2005-10-11 | Method for analysis of genetic polymorphysm, defining predisposition to tumor diseases and individual sensitivity to pharmaceutical agents by using olygonucleotide biological microarray (bioarray) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005131568A RU2005131568A (en) | 2007-04-20 |
| RU2303634C2 true RU2303634C2 (en) | 2007-07-27 |
Family
ID=38036638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005131568/13A RU2303634C2 (en) | 2005-10-11 | 2005-10-11 | Method for analysis of genetic polymorphysm, defining predisposition to tumor diseases and individual sensitivity to pharmaceutical agents by using olygonucleotide biological microarray (bioarray) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2303634C2 (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2582216C2 (en) * | 2014-03-13 | 2016-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) | Biological microchip with primer set for analysis of polymorphism in ab0, hla-dqa1, amel, darc, nat2 genes |
| RU2600874C2 (en) * | 2014-04-09 | 2016-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) | Set of oligonucleotide primers and probes for genetic typing of polymorphous dna loci associated with a risk of progression of sporadic form of alzheimer's disease in russian populations |
| RU2607031C1 (en) * | 2015-10-07 | 2017-01-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Method of detecting candidate genes for population research of genetic polymorphism in children dwelling in strontium geochemical province environment |
| RU2617936C2 (en) * | 2014-12-01 | 2017-04-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Таргетные медицинские технологии" | Method for genetic polymorphism rapid analysis for detection of genetic predisposition to breast cancer |
| RU2716589C1 (en) * | 2018-12-28 | 2020-03-12 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method of determining polymorphic markers in cyp2c19 and cyp2d6 genes for determining individual sensitivity to antidepressants |
| RU197681U1 (en) * | 2018-04-27 | 2020-05-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Производственное Предприятие "Биочип" | Biochip for multiplex analysis |
-
2005
- 2005-10-11 RU RU2005131568/13A patent/RU2303634C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2582216C2 (en) * | 2014-03-13 | 2016-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) | Biological microchip with primer set for analysis of polymorphism in ab0, hla-dqa1, amel, darc, nat2 genes |
| RU2600874C2 (en) * | 2014-04-09 | 2016-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) | Set of oligonucleotide primers and probes for genetic typing of polymorphous dna loci associated with a risk of progression of sporadic form of alzheimer's disease in russian populations |
| RU2617936C2 (en) * | 2014-12-01 | 2017-04-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Таргетные медицинские технологии" | Method for genetic polymorphism rapid analysis for detection of genetic predisposition to breast cancer |
| RU2607031C1 (en) * | 2015-10-07 | 2017-01-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Method of detecting candidate genes for population research of genetic polymorphism in children dwelling in strontium geochemical province environment |
| RU197681U1 (en) * | 2018-04-27 | 2020-05-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Производственное Предприятие "Биочип" | Biochip for multiplex analysis |
| RU2716589C1 (en) * | 2018-12-28 | 2020-03-12 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method of determining polymorphic markers in cyp2c19 and cyp2d6 genes for determining individual sensitivity to antidepressants |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005131568A (en) | 2007-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10407718B2 (en) | Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes | |
| US6703228B1 (en) | Methods and products related to genotyping and DNA analysis | |
| Hacia et al. | Mutational analysis using oligonucleotide microarrays | |
| Hacia | Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays | |
| CA2310384C (en) | Method for the preparation of complex dna methylation fingerprints | |
| US7892731B2 (en) | System and method for inhibiting the decryption of a nucleic acid probe sequence used for the detection of a specific nucleic acid | |
| US6368799B1 (en) | Method to detect gene polymorphisms and monitor allelic expression employing a probe array | |
| JP4377689B2 (en) | Combined analysis of polymorphic loci with simultaneous interrogation and enzyme-mediated detection | |
| US7138506B2 (en) | Universal microarray system | |
| US20060263807A1 (en) | Methods for polymorphism identification and profiling | |
| EP1056889B1 (en) | Methods related to genotyping and dna analysis | |
| EP1612282B1 (en) | Probe set and substrate for detecting nucleic acid | |
| RU2303634C2 (en) | Method for analysis of genetic polymorphysm, defining predisposition to tumor diseases and individual sensitivity to pharmaceutical agents by using olygonucleotide biological microarray (bioarray) | |
| JPWO2007055255A1 (en) | Method for amplifying a plurality of nucleic acid sequences for identification | |
| US20040132047A1 (en) | Methods for detection of genetic alterations associated with cancer | |
| RU2729360C1 (en) | Method of analyzing terminal mutations in brca1, brca2, atm and palb2 genes using multiplex pcr and subsequent hybridisation with an oligonucleotide biological microchip (biochip) | |
| RU2539733C2 (en) | Set of differentiating nucleotides and biochip applicable in method for genetic typing of human y-chromosomes haplogroup markers: m130 (c), m145 (de) | |
| WO1999058721A1 (en) | Multiplex dna amplification using chimeric primers | |
| WO2008088236A1 (en) | Method for genetically identifying a person according to the analysis of the single nucleotide polymorphism of a human genom by means of a oligonucleotide biological microchip (biochip) | |
| RU2582216C2 (en) | Biological microchip with primer set for analysis of polymorphism in ab0, hla-dqa1, amel, darc, nat2 genes | |
| RU2674687C1 (en) | Method for analysis of somatic mutations in gnaq and gna11 genes using lna-blocking multiplex pcr and subsequent hybridization with oligonucleotide biological microchip (biochip) | |
| US20060127932A1 (en) | Method for the SNP analysis on biochips having oligonucleotide areas | |
| Dobrin et al. | Integrating microarrays into disease-gene identification strategies | |
| JPWO2005090565A1 (en) | DNA array and single nucleotide polymorphism detection method | |
| RU2600874C2 (en) | Set of oligonucleotide primers and probes for genetic typing of polymorphous dna loci associated with a risk of progression of sporadic form of alzheimer's disease in russian populations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20080909 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20100210 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20100212 |
|
| QZ4A | Changes in the licence of a patent |
Effective date: 20100210 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20100210 Effective date: 20110202 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111012 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20140110 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181012 |