RU2301667C1 - Method for treating the diseases of different etiology and traumas of different organs - Google Patents
Method for treating the diseases of different etiology and traumas of different organs Download PDFInfo
- Publication number
- RU2301667C1 RU2301667C1 RU2005140427/14A RU2005140427A RU2301667C1 RU 2301667 C1 RU2301667 C1 RU 2301667C1 RU 2005140427/14 A RU2005140427/14 A RU 2005140427/14A RU 2005140427 A RU2005140427 A RU 2005140427A RU 2301667 C1 RU2301667 C1 RU 2301667C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- metaprogerol
- autologous
- cells
- mscs
- affected
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения заболеваний различной этиологии и травм различных органов с применением мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в сочетании с фармакологическими препаратами.The invention relates to medicine and can be used to treat diseases of various etiologies and injuries of various organs using mesenchymal stem cells (MSCs) in combination with pharmacological preparations.
Известен способ лечения, в котором используют МСК, полученные из костного мозга человека, которые являются аллогенными для реципиента. Клетки костного мозга могут быть получены из подвздошного гребня, ребра или других медуллярных мест (US 20020064519 [1]). В предпочтительных вариантах реализации данный метод используется для ускорения регенерации поврежденных тканей скелета и соединительных тканей.A known treatment method in which MSCs obtained from human bone marrow are used, which are allogeneic for the recipient. Bone marrow cells can be obtained from the iliac crest, ribs, or other medullary sites (US 20020064519 [1]). In preferred embodiments, this method is used to accelerate the regeneration of damaged skeletal tissue and connective tissue.
Недостатком известного способа является ограниченная сфера применения и относительно невысокая эффективность.The disadvantage of this method is the limited scope and relatively low efficiency.
Известен способ лечения сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз, ишемия, артериальная гипертензия, рестеноз, стенокардия, врожденные сердечно-сосудистые дефекты, воспаления артерий и капилляров, при котором используются стволовые клетки (US 20020098167 [2]). При этом стволовые клетки используются не в чистом виде, а путем приготовления лекарственного средства, которое кроме стволовых клеток содержит цитокины или цитокины с фармацевтически приемлемым носителем, а также с разбавителем или наполнителем. Использование цитокинов позволяет активизировать лечебное воздействие стволовых клеток. Приготовленное лекарственное средство может быть введено в мышечную ткань сердца или в кровеносные сосуды - вены или артерии.A known method of treating cardiovascular diseases such as atherosclerosis, ischemia, arterial hypertension, restenosis, angina pectoris, congenital cardiovascular defects, inflammation of the arteries and capillaries, which uses stem cells (US 20020098167 [2]). In this case, stem cells are not used in pure form, but by preparing a medicinal product that, in addition to stem cells, contains cytokines or cytokines with a pharmaceutically acceptable carrier, as well as with a diluent or excipient. The use of cytokines allows you to activate the therapeutic effect of stem cells. The prepared drug can be introduced into the muscle tissue of the heart or into the blood vessels - veins or arteries.
Недостатком данного способа лечения является ограниченность применения, поскольку способ используется для лечения только сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, эффективность стимулирования стволовых клеток цитокинами не очень высока, что снижает, соответственно, и эффективность лечения.The disadvantage of this method of treatment is the limited use, since the method is used to treat only cardiovascular diseases. In addition, the effectiveness of stimulating stem cells with cytokines is not very high, which reduces, accordingly, the effectiveness of treatment.
Наиболее близким к заявляемому способу является известный способ лечения, в котором используются стволовые клетки в сочетании с фармацевтическими препаратами - гликоконъюгатами или гликопротеидами, которые направляют стволовые клетки в нужное место. Стволовые клетки получают из костного мозга или из крови. При этом стволовые клетки и гликоконъюгаты могут вводиться либо одновременно, либо в любой последовательности, т.е. стволовые клетки могут быть введены до введения гликоконъюгатов или после их введения (US 20040180040 [3]). С помощью этого способа можно лечить сердечные заболевания, болезни легких, почек, печени.Closest to the claimed method is a known treatment method in which stem cells are used in combination with pharmaceutical preparations - glycoconjugates or glycoproteins that direct stem cells to the desired location. Stem cells are obtained from bone marrow or from blood. In this case, stem cells and glycoconjugates can be introduced either simultaneously or in any sequence, i.e. stem cells can be introduced before the introduction of glycoconjugates or after their introduction (US 20040180040 [3]). Using this method, it is possible to treat heart diseases, diseases of the lungs, kidneys, liver.
Недостатком данного способа является его относительно невысокая эффективность, что можно объяснить недостаточной стимуляцией стволовых клеток вводимыми гликоконъюгатами.The disadvantage of this method is its relatively low efficiency, which can be explained by insufficient stem cell stimulation by the introduced glycoconjugates.
Заявляемый способ направлен на повышение эффективности лечения за счет сокращения сроков его проведения и расширения перечня заболеваний и травм, к которым может быть применен способ.The inventive method is aimed at improving the effectiveness of treatment by reducing the time of its implementation and expanding the list of diseases and injuries to which the method can be applied.
Указанный результат достигается тем, что способ лечения заболеваний различной этиологии и травм различных органов включает введение пациенту стабильных культур МСК, полученных из аутологичных или неаутологичных тканей человека, или введение дифференцированного потомства МСК внутривенно или непосредственно внутрь пораженного органа или на его поверхность, после чего пациенту вводят внутримышечно или на пораженную поверхность препарат метапрогерол или лекарственные формы его химических аналогов.This result is achieved by the fact that the method of treating diseases of various etiologies and injuries of various organs includes the introduction of stable MSC cultures to the patient, obtained from autologous or non-autologous human tissues, or the introduction of differentiated offspring of MSCs intravenously or directly into the affected organ or on its surface, after which intramuscularly or on the affected surface, metaprogerol drug or dosage forms of its chemical analogues.
Указанный результат достигается также тем, что для получения культур МСК в качестве аутологичных или неаутологичных тканей человека используют костный мозг.This result is also achieved by the fact that bone marrow is used as an autologous or non-autologous human tissue to obtain MSC cultures.
Указанный результат достигается также тем, что метапрогерол или лекарственные формы его химических аналогов вводят через 15-60 минут после введения культур мезенхимальных стволовых клетокThe indicated result is also achieved by the fact that metaprogerol or dosage forms of its chemical analogues are administered 15-60 minutes after the introduction of mesenchymal stem cell cultures
Указанный результат достигается также тем, что метапрогерол или его аналоги вводят не менее трех раз с интервалом 48 часов.The indicated result is also achieved by the fact that metaprogerol or its analogues are administered at least three times with an interval of 48 hours.
Указанный результат достигается также тем, что разовая доза метапрогерола или его аналогов содержит не менее 50 мг активного вещества.The specified result is also achieved by the fact that a single dose of metaprogerol or its analogues contains at least 50 mg of the active substance.
Введение пациенту стабильных культур аутологичных или неаутологичных МСК человека для лечения заболеваний различной этиологии и травм различных органов позволяет повысить эффективность лечения, заключающуюся в ускорении сроков выздоровления. В ряде случаев целесообразно введение дифференцированного потомства стабильных культур МСК аутологичных или неаутологичных тканей человека, поскольку дифференцированные в определенном направлении МСК обладают более выраженным лечебным эффектом, например МСК, дифференцированные в направлении кардиомиобластов, обладают большим лечебным эффектом при заболеваниях, связанных с поражением сердечной мышцы человека. Культуры упомянутых клеток можно вводить внутривенно, непосредственно внутрь пораженного органа или на его поверхность в зависимости от характера заболевания или травмы. Например, внутривенное введение целесообразно осуществлять при таких заболеваниях, как диллятационная кардиомиопатия, травмы головного мозга, устойчивые к существующим методам лечения формы туберкулеза и др. Если в качестве пораженного органа выступает сердечная мышца, особенно при проведении операций на выключенном сердце (например, во время операции аортокоронарного шунтирования), кишечник со свищями (после оперативного лечения или при болезни Крона), то целесообразно вводить стволовые клетки путем инъекций в соответствующие участки поврежденного органа. Если же пораженными оказываются кожные или слизистые покровы (например, вследствие развития трофических язв, при диабетических язвах и др.), то целесообразно стволовые клетки наносить на пораженную поверхность (иногда совместно с проведением терапии теми же клетками, вводимыми внутривенно). Как установлено экспериментально, использование для лечения упомянутых выше МСК и последующего введения метапрогерола или его аналогов пациенту существенно ускоряет процесс выздоровления. В качестве аналогов метапрогерола можно использовать 2-(3'-диметиламинопропил)-5-метилгексен-4-овую кислоту (соединение М1) и 2-(3'-диметиламинопропил)-5,9,13-триметилтетрадекадиен-4,8,12-овую кислоту (соединение М2). По-видимому, это можно объяснить тем, что эти соединения, как и метапрогерол, имеют следующие ключевые группы в своей молекуле: пренильную (пренильные), карбоксильную и диалкиламиногруппу. Наличие этих групп свидетельствует о структурном сходстве этих соединений с природными веществами, в частности, с производными аминокислот и витаминами групп А, Е и К, и, вероятно, обусловливает фармакологическую активность этих соединений. Также в зависимости от характера заболевания или травмы раствор метапрогерола можно вводить внутримышечно или же на поверхность поражения. Как установлено экспериментально, можно применять не только метапрогерол, но и его аналоги, отличающиеся друг от друга числом пренильных групп, типом углеводородного спейсера, разделяющего карбоксильную и диалкиламино-группы и строением алкильных групп, связанных с атомом азота.Introduction to the patient of stable cultures of autologous or non-autologous human MSCs for the treatment of diseases of various etiologies and injuries of various organs can increase the effectiveness of treatment, which consists in accelerating the time of recovery. In some cases, it is advisable to introduce differentiated offspring of stable cultures of MSCs of autologous or non-autologous human tissues, since MSCs differentiated in a certain direction have a more pronounced therapeutic effect, for example, MSCs differentiated in the direction of cardiomyoblasts have a greater therapeutic effect in diseases associated with damage to the human heart muscle. The cultures of these cells can be administered intravenously, directly into the affected organ or onto its surface, depending on the nature of the disease or injury. For example, intravenous administration is advisable for diseases such as dilated cardiomyopathy, brain injuries that are resistant to existing methods of treatment for tuberculosis, etc. If the heart muscle acts as an affected organ, especially during operations with the heart turned off (for example, during surgery coronary artery bypass grafting), intestines with fistulas (after surgical treatment or with Crohn’s disease), it is advisable to introduce stem cells by injection into the appropriate area Ki damaged organ. If the skin or mucous membranes are affected (for example, due to the development of trophic ulcers, with diabetic ulcers, etc.), it is advisable to apply stem cells to the affected surface (sometimes in conjunction with therapy with the same cells administered intravenously). As established experimentally, the use of MSCs for the treatment of the above and the subsequent administration of metaprogerol or its analogues to the patient significantly accelerates the healing process. As analogues of metaprogerol, 2- (3'-dimethylaminopropyl) -5-methylhexene-4-hydroxy acid (compound M1) and 2- (3'-dimethylaminopropyl) -5,9,13-trimethyltetradecadiene-4,8,12 can be used -acid acid (compound M2). Apparently, this can be explained by the fact that these compounds, like metaprogerol, have the following key groups in their molecule: prenyl (prenyl), carboxyl, and dialkylamino groups. The presence of these groups indicates the structural similarity of these compounds with natural substances, in particular, with derivatives of amino acids and vitamins of groups A, E and K, and probably determines the pharmacological activity of these compounds. Also, depending on the nature of the disease or injury, the metaprogerol solution can be administered intramuscularly or on the surface of the lesion. As experimentally established, not only metaprogerol can be used, but also its analogues, which differ from each other in the number of prenyl groups, the type of hydrocarbon spacer separating the carboxyl and dialkylamino groups, and the structure of the alkyl groups bonded to the nitrogen atom.
Наиболее целесообразно в качестве аутологичных или неаутологичных тканей человека, применяемых для получения культур МСК или их дифференцированных потомков, использовать костный мозг, хотя можно использовать и жировую ткань, в которой также содержатся МСК. Некоторым недостатком жировой ткани для получения культур МСК является относительная трудность разделения этой ткани для получения клеточной суспензии, которая высаживается в культуру, а также большая склонность полученных таким образом культур к дифференцировке в костную ткань.It is most advisable to use bone marrow as autologous or non-autologous human tissues used to obtain cultures of MSCs or their differentiated descendants, although adipose tissue, which also contains MSCs, can be used. A certain disadvantage of adipose tissue for obtaining MSC cultures is the relative difficulty in separating this tissue to obtain a cell suspension that is planted in the culture, as well as the greater tendency of the cultures thus obtained to differentiate into bone tissue.
Введение метапрогерола наиболее целесообразно осуществлять через 15-60 минут после введения культур мезенхимальных стволовых клеток, так как в этом случае трансплантированные клетки практически к моменту завершения процесса "хоминга" (поступление в ткани, где они выполняют репаративные функции) попадают в условия "активированного микроокружения" и могут участвовать в процессах пролиферации и дифференцировки.The introduction of metaprogerol is most expedient to be carried out 15-60 minutes after the introduction of mesenchymal stem cell cultures, since in this case the transplanted cells almost by the time the “homing” process is completed (entering the tissues where they perform reparative functions) fall into the conditions of the “activated microenvironment” and can participate in the processes of proliferation and differentiation.
Как показывает практика, для того чтобы обеспечить достаточно высокий лечебный эффект, можно ограничиться и одной инъекцией метапрогерола или его аналогов, но наиболее целесообразно осуществить не менее трех инъекций (или орошений) с интервалом 48 часов. Если интервал между инъекциями будет менее или более 48 часов, то из-за особенностей фармакокинетики препарата и обмена производимых им цитокинов и ростовых факторов стимулирующий эффект препарата на трансплантированные или резидентные МСК будет слабее выражен, чем при введении препарата через каждые 48 часов.As practice shows, in order to ensure a sufficiently high therapeutic effect, you can limit yourself to one injection of metaprogerol or its analogues, but it is most advisable to carry out at least three injections (or irrigation) with an interval of 48 hours. If the interval between injections is less than or more than 48 hours, then, due to the pharmacokinetics of the drug and the exchange of cytokines and growth factors produced by it, the stimulating effect of the drug on transplanted or resident MSCs will be less pronounced than with the introduction of the drug every 48 hours.
Разовая доза метапрогерола или его аналогов для "среднего" человека (массой 70 кг, что соответствует разовой дозе, составляющей примерно 0,7 мг/кг массы пациента) должна содержать не менее 50 мг активного вещества. Если количество активного вещества будет менее 50 мг, то это снижает эффективность лечения, хотя установлено, что ускорение процесса выздоровления имеет место при использовании стабильных культур МСК аутологичных или неаутологичных тканей человека или их дифференцированного потомства даже при использовании минимальных доз метапрогерола или его аналогов (на порядок ниже рекомендованных в качестве оптимальных) по сравнению с использованием только одних стволовых клеток.A single dose of metaprogerol or its analogues for the "average" person (weighing 70 kg, which corresponds to a single dose of approximately 0.7 mg / kg of patient weight) should contain at least 50 mg of the active substance. If the amount of the active substance is less than 50 mg, this reduces the effectiveness of the treatment, although it is established that the healing process is accelerated when stable cultures of MSCs of autologous or non-autologous human tissues or their differentiated offspring are used, even with minimal doses of metaprogerol or its analogues (by an order of magnitude lower than recommended as optimal) compared to using only stem cells.
Сущность заявляемого способа лечения заболеваний различной этиологии и травм различных органов поясняется примерами его реализации.The essence of the proposed method for the treatment of diseases of various etiologies and injuries of various organs is illustrated by examples of its implementation.
Пример 1. В самом общем случае предлагаемый способ реализуется следующим образом. Сначала у пациента забирают некоторое количество ткани, необходимой для культивирования стволовых клеток. Например, в случае использования костного мозга у пациента методом пункции из грудины или из подвздошной кости забирают примерно 1 мл костного мозга, в котором общая клеточность составляет примерно 107 костномозговых клеток, среди которых 103 клеток относятся к субпопуляции МСК. Извлеченную ткань культивируют общепринятыми методами получения МСК. Кратко, это заключается в помещении взятого в строго стерильных условиях, образца костного мозга объемом 0,5-1,0 мл в пробирки с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатой температуре супернатант отсасывается пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмываются в среде 199 (производитель - фирма "Sigma", USA), центрифугируются при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируется в ростовой среде. В качестве ростовой среды служит среда RPMI-1640 (продукт фирмы "Sigma", USA), содержащая пенициллин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ (продукт фирмы "Sigma", USA), 20% эмбриональной телячей сыворотки ("Sigma", USA). Культивирование проводится в пластиковых флаконах Карреля (производства фирмы "Sigma", USA) с площадью дна 25 см2, в которые вносится 5×106-107 клеток исходного костного мозга в 8 мл ростовой среды. Флаконы продуваются газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещаются в обычный термостат, поддерживающий температуру в 37°С. Продувание флаконов такой газовой смесью проводится каждый раз, когда сменяется ростовая среда в данном флаконе или когда клетки пересеваются в новые культуральные флаконы. Для перевода МСК в дифференцировку в направлении кардиомиобластов используется известный метод воздействия деметилирующим агентом - 5-азацитидином в следующей модификации. К концу 3-х суток от начала культивирования клеток костного мозга во флаконы с клетками вносится 5-азацитидин ("Sigma", USA) в конечной концентрации 3 мМ на 24 часа, после чего среда заменяется на свежую, которая не содержит данный дифференцирующий агент, и продолжается культивирование со сменой среды, которую проводят через каждые 4-5 суток. При достижении сливного (конфлюентного) монослоя клетки пересеваются с использованием 0,25% раствора трипсина ("Sigma", USA) в новые флаконы, вначале с той же площадью дна (25 см2), а впоследствии при нарастании клеточной массы - в большие культуральные флаконы с площадью дна 175 см2 ("Sigma", USA). Такой метод позволяет к концу 5-6 недели добиться получения популяции МСК или популяции кардиомиобластов человека в количестве (2-3)×108 клеток, необходимых для трансплантации в организм донора исходного костного мозга (трансплантация аутологичных клеток) или в организм другого пациента (трансплантация неаутологичных клеток). В случае использования жировых тканей у пациента хирургическим путем стерильно извлекают из подкожной жировой прослойки примерно 1 г ткани, которую сначала разобщают механическим, а затем ферментативным путем, а затем культивируют тем же путем, как и описано выше для клеток костного мозга. Подготовленную культуру клеток вводят внутривенно, или внутрь пораженного органа, или на его поверхность. Спустя некоторое время (обычно не позднее, чем через 15-60 минут после трансплантации клеток) пациенту вводят внутримышечно некоторое количество метапрогерола или его аналога. Это может быть разовое введение с содержанием не менее 50 мг активного вещества или неоднократное, не менее трех, с интервалом приблизительно 48 часов.Example 1. In the most general case, the proposed method is implemented as follows. First, a certain amount of tissue necessary for the cultivation of stem cells is taken from the patient. For example, in the case of using the bone marrow from a patient by puncture method from the sternum or ilium, approximately 1 ml of bone marrow is taken, in which the total cellularity is approximately 10 7 bone marrow cells, among which 10 3 cells belong to a subpopulation of MSCs. The recovered tissue is cultured by conventional methods for producing MSCs. Briefly, this consists in placing a bone marrow sample of 0.5-1.0 ml in heparin tubes (100 U / ml punctate) taken under strictly sterile conditions. After erythrocyte sedimentation is maintained for 1-2 hours at room temperature, the supernatant is aspirated with a Pasteur pipette, the selected cells are washed in 199 medium (manufacturer - Sigma, USA), centrifuged at 1000 rpm for 10 min, and the precipitate is resuspended in growth medium . As the growth medium, RPMI-1640 medium (product of Sigma, USA) containing penicillin (100 U / ml), amphotericin (100 ng / ml), L-glutamine 2 mM (product of Sigma, USA) is used , 20% fetal calf serum ("Sigma", USA). Cultivation is carried out in plastic bottles of Carrel (manufactured by Sigma, USA) with a bottom area of 25 cm 2 , into which 5 × 10 6 -10 7 cells of the original bone marrow are introduced into 8 ml of growth medium. The bottles are purged with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air, and placed in a conventional thermostat, maintaining a temperature of 37 ° C. Blowing the bottles with such a gas mixture is carried out every time when the growth medium in this bottle is replaced or when the cells are reseeded into new culture bottles. To transfer MSCs to differentiation in the direction of cardiomyoblasts, the known method of exposure to a demethylating agent, 5-azacytidine, is used in the following modification. Toward the end of 3 days from the start of bone marrow cell cultivation, 5-azacytidine (Sigma, USA) is introduced into vials with cells at a final concentration of 3 mM for 24 hours, after which the medium is replaced with fresh one that does not contain this differentiating agent, and cultivation continues with a change of medium, which is carried out every 4-5 days. Upon reaching the confluent monolayer, the cells are reseeded using 0.25% trypsin solution ("Sigma", USA) into new bottles, first with the same bottom area (25 cm 2 ), and subsequently, with increasing cell mass, into large culture bottles with a bottom area of 175 cm 2 ("Sigma", USA). This method allows by the end of 5-6 weeks to obtain a population of MSCs or a population of human cardiomyoblasts in the amount of (2-3) × 10 8 cells necessary for transplantation into the body of the donor of the original bone marrow (transplantation of autologous cells) or into the body of another patient (transplantation non-autologous cells). In the case of using adipose tissue in a patient, approximately 1 g of tissue is sterilely removed from the subcutaneous fat layer of the patient, which is first dissociated mechanically and then enzymatically, and then cultivated in the same way as described above for bone marrow cells. The prepared cell culture is administered intravenously, either inside the affected organ or on its surface. After some time (usually no later than 15-60 minutes after cell transplantation), a certain amount of metaprogerol or its analogue is administered intramuscularly to the patient. This can be a single injection with a content of at least 50 mg of the active substance or repeated, at least three, with an interval of approximately 48 hours.
Пример 2. У пациентки Р., 46 лет, страдающей трофическими язвами кожных покровов нижних конечностей, проводили орошение поверхности язв с последующим наложением стерильных салфеток, смоченные суспензией культуры МСК (всего на одно, ежедневно проводившееся орошение трофических язв применялось около 50 миллионов клеток, приготовленных культивированием ее собственного костного мозга, всего было проведено 5 орошений). Спустя 15 минут больной внутримышечно был введен 1 мл 5% водного раствора метапрогерола с содержанием активного вещества 50 мг. Следующие инъекции были проведены через 48 и 96 часов, соответственно, каждый раз после проведения процедуры орошения пораженной ткани. В результате наблюдалось быстрое (через 1 сутки от начала лечения) появление грануляций на поверхности трофической язвы и ее быстрое (на второй неделе от начала лечения) заживление. Больная наблюдается более полутора лет без рецидива заболевания.Example 2. Patient R., 46 years old, suffering from trophic ulcers of the skin of the lower extremities, was irrigated with the surface of the ulcers, followed by sterile wipes moistened with a suspension of MSC culture (about 50 million cells were used for irrigating trophic ulcers every day cultivation of her own bone marrow, a total of 5 irrigation was carried out). After 15 minutes, the patient was injected intramuscularly with 1 ml of a 5% aqueous solution of metaprogerol with an active substance content of 50 mg. The following injections were performed after 48 and 96 hours, respectively, each time after the irrigation of the affected tissue. As a result, there was a rapid (1 day after the start of treatment) appearance of granulations on the surface of the trophic ulcer and its rapid healing (in the second week from the start of treatment). The patient is observed for more than a year and a half without a relapse of the disease.
Пример 3. В опытах на крысах линии Вистар, самцах, в возрасте 3 месяцев и массой 160-170 г в сравнительном аспекте изучался лечебный эффект внутривенной трансплантации аутологичных кардиобластов, полученных из МСК, и короткого курса метапрогерола и 2-х его аналогов - препаратов М1 и М2 (3 в/м инъекции соответствующего препарата в дозе 0,7 мг/кг сразу после трансплантации клеток и через 2 и 4 суток после первой инъекции) у животных, которым путем введения препарата антрациклинового ряда - адриамицина (суммарная доза 10 мг/кг) вызывали развитие кардиомиодистрофии. Согласно данным литературы введение адриамицина в использованной дозе приводит к гибели большого количества кардиомиоцитов по апоптотическому и некротическому типу и развитию кардиомиодистрофии, что использовалось уже в ряде исследований для изучения лечебного эффекта различных типов стволовых клеток. Через неделю после завершения введения крысам адриамицина (5 внутрибрюшинных введений по 2 мг/кг) их разделяли на 1 контрольную (интактные животные того же возраста) и 8 опытных групп, в каждой из которых было по 12 крыс, которых лечили трансплантацией аутологичными кардиомиобластами (по 2×106 клеток в/в) с последующим введением метапрогерола или препаратов М1 и М2 троекратно по описанной выше схеме (три группы были с введением кардиомиобластов и одного из препаратов, а три другие - только с введением одного из препаратов; кроме того, дополнительно были сформированы 2 группы крыс, получивших или только воздействие адриамицина, без последующей терапии, или воздействие адриамицина с трансплантацией кардиомиоцитов без введения препаратов). Через 2 и 4 недели после трансплантации кардиомиобластов или начала терапии препаратами по 6 крыс в каждой группе забивали для количественного морфологического изучения состояния миокарда на продольных и поперечных срезах препаратов сердца животных (общая гистологическая и функциональная морфология миокарда), окрашенных гематоксилином и эозином, иммуноокрашенных на PCNA (индекс PCNA отражает фракцию пролиферирующих клеток) и импрегнированных методом AgNOR (метод оценки функциональной активности клеток путем определения зон ядрышковых организаторов). Морфометрические исследования были выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений IMSTAR (Франция) с применением программ Morphostar-2 и Colquant-2 и их данные частично (только по данным забоя через 4 недели после трансплантации кардиомиобластов) представлены в таблице 1.Example 3. In experiments on Wistar rats, males, 3 months old and weighing 160-170 g, the therapeutic effect of intravenous transplantation of autologous cardioblasts obtained from MSCs and a short course of metaprogerol and 2 of its analogues, M1 preparations, was studied in comparative aspect and M2 (3 i / m injections of the corresponding drug at a dose of 0.7 mg / kg immediately after cell transplantation and 2 and 4 days after the first injection) in animals who, by administering an anthracycline, adriamycin (total dose of 10 mg / kg ) caused the development of cardiomyo istrofii. According to the literature, the administration of adriamycin in the used dose leads to the death of a large number of cardiomyocytes in the apoptotic and necrotic type and the development of cardiomyodystrophy, which has already been used in several studies to study the therapeutic effect of various types of stem cells. One week after completion of administration of rats with adriamycin (5 intraperitoneal administrations of 2 mg / kg), they were divided into 1 control (intact animals of the same age) and 8 experimental groups, each of which had 12 rats that were treated with autologous cardiomyoblast transplantation (according to 2 × 10 6 iv cells) with the subsequent administration of metaprogerol or M1 and M2 preparations three times as described above (the three groups were with the introduction of cardiomyoblasts and one of the drugs, and the other three only with the introduction of one of the drugs; in addition, additional o 2 groups of rats were formed that received either only exposure to adriamycin, without subsequent therapy, or exposure to adriamycin with transplantation of cardiomyocytes without drug administration). After 2 and 4 weeks after cardiomyoblast transplantation or initiation of drug therapy, 6 rats in each group were killed for quantitative morphological study of the myocardial state in longitudinal and transverse sections of animal heart preparations (general histological and functional myocardial morphology) stained with hematoxylin and eosin immunostained with PCNA (PCNA index reflects the fraction of proliferating cells) and impregnated using the AgNOR method (a method for assessing the functional activity of cells by determining the areas of the nucleolar organ lowers). Morphometric studies were performed using the IMSTAR computer-aided microscopic image analysis system (France) using Morphostar-2 and Colquant-2 programs and their data are partially (only according to the face data 4 weeks after cardiomyoblast transplantation) are presented in Table 1.
Ранее нами было обнаружено, а в данном опыте было подтверждено то, что через две недели после окончания введения адриамицина в миокарде подопытных крыс выявляются морфологические признаки токсико-дистрофических изменений. Эти изменения охватывают практически все клеточные элементы миокарда. Определяется отек интерстициальной ткани и нарушение правильной ориентации мышечных волокон, практически во всех зонах миокарда периваскулярно и/или интерстициально определяются небольшие локальные пролифераты из стромальных клеток; миоциты с пикнотичными или лизированными ядрами диффузно рассеяны по миокарду, однако более часто такие гибнущие клетки выявляются в зоне межжелудочковой перегородки, наблюдается некроз кардиомиоцитов. На препаратах, иммуноокрашенных на PCNA, регистрируется угнетение пролиферации кардиомиоцитов и соединительнотканных элементов. Через две недели после введения кардиомиоцитов крысам, которые получили введение адриамицина, гистопатологический рисунок миокарда крыс мало отличается от наблюдаемого при действии одного только адриамицина. На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, отчетливо просматриваются очаговые дистрофические изменения со стороны кардиомиоцитов. Вместе с тем, у животных этих групп в субэпикардиальных зонах левого и правого желудочков определяются изменения со стороны микроциркуляторного русла и в периваскулярной строме. В просвете капилляров и периваскулярно появляются небольшие группы клеток с ярко выраженной реакцией на PCNA (т.е. делящиеся клетки). Для миокарда животных группы, получивших вместе с трансплантацией кардиомиобластов дополнительную терапию всех трех исследованных препаратов, в этот период характерно более "диффузное" распространение в тканях интенсивно пролиферирующих клеток. Вокруг капилляров отмечается повышенное содержание перицитов. При изучении препаратов сердца этих групп крыс обращало внимание то, что в ядрах кардиомиоцитов увеличиваются размеры ядрышек и усиливается базофилия саркоплазмы. В зонах миокарда, пораженных адриамицином, визуализировалось частичное восстановление поперечной исчерченности и миофибриллярной структуры мышечных волокон. В те же сроки эффект только одной терапии одним из трех использованных препаратов без введения кардиомиобластов был мало выражен и большинство использованных количественных показателей были близкими к таковым при действии одного только адриамицина. Можно только отметить, что визуально интерстициальное пространство в этих трех группах было более густо заполнено клетками соединительнотканной стромы и отек стромы был выражен менее интенсивно, кроме того, в достаточно большой мере выявлялись клетки, которые давали реакцию на PCNA. Через 4 недели после начала опыта при введении одного только адриамицина в сердце подопытных животных определялись морфологические признаки как токсико-дистрофических изменений, так и начинающейся репаративной регенерации миокарда (см. таблицу 1). По данным иммуногистохимии, резко усиливалось число PCNA-позитивных ядер клеток стромы, и чаще визуализировались меченые на PCNA ядра кардиомиоцитов. Репаративные процессы в миокарде были усилены в значительно большей степени через 4 недели от начала опыта, если проводилось введение аутологичных кардиомиоцитов отдельно или на фоне дополнительных курсов кратковременной терапии метапрогеролом или его аналогами (таблица 1). Подтверждением этому служит статистически достоверное увеличение размеров кардиомиоцитов и рост их пролиферативной и/или репаративной активности, а также частичное восстановление исходной гистологической картины сердечной мышцы при сравнении с нелеченным контролем (животными, которые подвергались только воздействию адриамицина). Одновременно лечебный эффект трансплантации кардиомиобластов отдельно или в сочетании с введением метапрогерола или его аналогов регистрировался и по такому простому и интегральному тесту, которым являлся средний вес сердца крыс в каждой группе (таблица 1).We previously discovered, and in this experiment, it was confirmed that two weeks after the end of the administration of adriamycin in the myocardium of experimental rats, morphological signs of toxic-dystrophic changes were revealed. These changes cover almost all cellular elements of the myocardium. Edema of the interstitial tissue and violation of the correct orientation of muscle fibers are determined, small local proliferates from stromal cells are determined perivascularly and / or interstitially in almost all areas of the myocardium; myocytes with pycnotic or lysed nuclei are diffusely scattered over the myocardium, however, more often such dying cells are detected in the area of the interventricular septum, cardiomyocyte necrosis is observed. On preparations immunostained with PCNA, inhibition of proliferation of cardiomyocytes and connective tissue elements is recorded. Two weeks after the administration of cardiomyocytes to rats that received adriamycin, the histopathological pattern of rat myocardium differs little from that observed with adriamycin alone. On preparations stained with hematoxylin and eosin, focal dystrophic changes on the part of cardiomyocytes are clearly visible. At the same time, in animals of these groups in the subepicardial zones of the left and right ventricles, changes in the microvasculature and in the perivascular stroma are determined. Small groups of cells with a pronounced response to PCNA (i.e., dividing cells) appear in the lumen of the capillaries and perivascularly. For the myocardium of animals of the group that received, together with cardiomyoblast transplantation, additional therapy for all three studied drugs, a more "diffuse" spread of intensely proliferating cells in the tissues is characteristic of this period. Around the capillaries there is an increased content of pericytes. When studying the preparations of the heart of these groups of rats, attention was drawn to the fact that in the nuclei of cardiomyocytes the sizes of the nucleoli increase and the basophilia of the sarcoplasm increases. In the myocardial zones affected by adriamycin, a partial restoration of the transverse striation and myofibrillar structure of muscle fibers was visualized. At the same time, the effect of only one therapy with one of the three drugs used without the introduction of cardiomyoblasts was not very pronounced and most of the quantitative indicators used were close to those with the action of adriamycin alone. It can only be noted that visually the interstitial space in these three groups was more densely filled with connective tissue stroma cells and stromal edema was less pronounced, in addition, cells that responded to PCNA were detected to a rather large extent. 4 weeks after the start of the experiment, with the administration of adriamycin alone in the heart of experimental animals, morphological signs of both toxic-dystrophic changes and the beginning of myocardial reparative regeneration were determined (see table 1). According to immunohistochemistry, the number of PCNA-positive stromal cell nuclei sharply increased, and more often PCNA-labeled cardiomyocyte nuclei were visualized. Reparative processes in the myocardium were intensified to a much greater extent after 4 weeks from the start of the experiment, if autologous cardiomyocytes were administered alone or against the background of additional courses of short-term therapy with metaprogerol or its analogues (table 1). This is confirmed by a statistically significant increase in the size of cardiomyocytes and an increase in their proliferative and / or reparative activity, as well as a partial restoration of the initial histological picture of the heart muscle when compared with untreated control (animals that were exposed only to adriamycin). At the same time, the therapeutic effect of transplantation of cardiomyoblasts separately or in combination with the introduction of metaprogerol or its analogues was also recorded using such a simple and integral test, which was the average heart weight of rats in each group (table 1).
Таким образом, в этих опытах, в эксперименте на лабораторных животных, был выявлен достоверный лечебный эффект трансплантации полученных из МСК кардиомиоцитов, примененных отдельно или совместно с введением метапрогерола и его аналогов, который превышает лечебное действие терапии одними только препаратами метапрогерола и его аналогов.Thus, in these experiments, in an experiment on laboratory animals, a reliable therapeutic effect of the transplantation of cardiomyocytes obtained from MSCs, used separately or together with the administration of metaprogerol and its analogues, was revealed, which exceeds the therapeutic effect of the therapy with metaprogerol and its analogues alone.
Пример 4. Пациент Г., 55 лет, перенесший ранее инфаркт миокарда, который привел к образованию сердечной аневризмы, продолжавший болеть ишемической болезнью сердца с повреждением как мышечной ткани, так и венечных сосудов, в плановом порядке подвергся хирургическому лечению - операции аортокоронарного шунтирования, а также иссечению аневризмы. Во время операции в зону иссеченной аневризмы и окружавших ее участков было введено путем 50 уколов объемом 0,1 мл на глубину не более 5 мм 2×108 клеток - аутологичных кардиомиобластов, полученных из МСК собственного костного мозга. Одновременно на первый, третий и пятый день после операции пациенту ввели в/м по 1,0 мл 5% раствора метапрогерола. Состояние пациента значительно улучшилось (в течение первых 6 месяцев после операции с трансплантацией полученных из аутологичных МСК кардиомиоцитов фракция сердечного выброса возросла с 28% до 43%) и в течение более 1,5 лет он наблюдается без возобновления сердечного заболевания. У большинства аналогичных больных с ИБС и сердечной аневризмой, прооперированных в данной клинике, лечебный эффект операции аортокоронарного шунтирования был выражен слабее, чем у данного пациента (возрастание фракции выброса на 6-8%).Example 4. Patient G., 55 years old, who had previously had myocardial infarction, which led to the formation of cardiac aneurysm, continued to suffer from coronary heart disease with damage to both muscle tissue and coronary vessels, underwent planned surgical treatment - aortocoronary bypass surgery, and also excision of the aneurysm. During the operation, 50 injections with a volume of 0.1 ml to a depth of not more than 5 mm 2 × 10 8 cells, autologous cardiomyoblasts obtained from MSCs of their own bone marrow, were introduced into the area of excised aneurysm and surrounding areas. At the same time, on the first, third and fifth day after the operation, the patient was given i / m 1.0 ml of a 5% metaprogerol solution. The patient's condition improved significantly (during the first 6 months after surgery with transplantation of cardiomyocytes obtained from autologous MSCs, the cardiac output fraction increased from 28% to 43%) and for more than 1.5 years it was observed without a resumption of heart disease. In the majority of similar patients with coronary heart disease and cardiac aneurysm operated on in this clinic, the therapeutic effect of coronary artery bypass surgery was less pronounced than in this patient (increase in ejection fraction by 6-8%).
Пример 5. В опытах на крысах линии Вистар самцах, в возрасте 3 месяцев и массой 160-170 г в сравнительном аспекте изучался лечебный эффект местного применения аутологичных МСК и короткого курса метапрогерола (3 в/м инъекции препарата в дозе 0,7 мг/кг сразу после трансплантации клеток и через 2 и 4 суток после первой инъекции) у животных с травмой - тепловым ожогом кожи спины площадью около 3 см2, нанесенным за 1 сутки до начала терапии местной аппликацией 106 МСК однократно и 3-кратного введения метапрогерола. Кроме того, были сформированы группы (численностью 12 животных в каждой группе) одного только ожога, а также ожога, леченного или только применением МСК, или введением метапрогерола. Полное заживление кожной травмы в группе только одного ожога наблюдалось в течение 23±4 суток, при дополнительной терапии одним метапрогеролом или аппликацией МСК в течение 18±3 и 15±4 суток, соответственно, а при использовании двух лечебных воздействий совместно в течение 9±2 суток, т.е., в данном случае наблюдался эффект синергизма двух лечебных мероприятий.Example 5. In experiments on rats of the Wistar male strain, 3 months old and weighing 160-170 g, the therapeutic effect of topical application of autologous MSCs and a short course of metaprogerol (3 v / m injection of the drug at a dose of 0.7 mg / kg was studied in comparative aspect) immediately after cell transplantation and after 2 and 4 days after the first injection) in animals with an injury - a thermal burn of the skin of the back with an area of about 3 cm 2 applied 1 day before the start of therapy with local application of 10 6 MSC once and 3 times the administration of metaprogerol. In addition, groups were formed (numbering 12 animals in each group) of a single burn, as well as a burn treated either with MSC alone or with metaprogerol. Complete healing of skin injury in the group of only one burn was observed within 23 ± 4 days, with additional therapy with one metaprogerol or MSC application for 18 ± 3 and 15 ± 4 days, respectively, and when using two therapeutic effects together for 9 ± 2 days, i.e., in this case, the effect of synergism of two therapeutic measures was observed.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005140427/14A RU2301667C1 (en) | 2005-12-26 | 2005-12-26 | Method for treating the diseases of different etiology and traumas of different organs |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005140427/14A RU2301667C1 (en) | 2005-12-26 | 2005-12-26 | Method for treating the diseases of different etiology and traumas of different organs |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2301667C1 true RU2301667C1 (en) | 2007-06-27 |
Family
ID=38315448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005140427/14A RU2301667C1 (en) | 2005-12-26 | 2005-12-26 | Method for treating the diseases of different etiology and traumas of different organs |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2301667C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2515156C2 (en) * | 2008-05-27 | 2014-05-10 | Плуристем Лтд. | Methods of treating inflammatory diseases of colon |
| RU2528973C1 (en) * | 2013-05-14 | 2014-09-20 | Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства Здравоохранения Российской Федерации" | Method of treating trophic ulcers |
-
2005
- 2005-12-26 RU RU2005140427/14A patent/RU2301667C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Потапов И.В. Трансплантация фетальных кардиомиоцитов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в криоповрежденный миокард, диссертация к.м.н. - М., 2003, с.29, 34, 35, 40, 42, 57, 58, 88, 91, 98, 99. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2515156C2 (en) * | 2008-05-27 | 2014-05-10 | Плуристем Лтд. | Methods of treating inflammatory diseases of colon |
| US9393273B2 (en) | 2008-05-27 | 2016-07-19 | Pluristem Ltd. | Methods of treating inflammatory colon diseases |
| RU2528973C1 (en) * | 2013-05-14 | 2014-09-20 | Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства Здравоохранения Российской Федерации" | Method of treating trophic ulcers |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jakob et al. | Demonstration of angiogenesis-activity in the corpus luteum of cattle | |
| Lückhoff et al. | Characterization of vascular relaxant factor released from cultured endothelial cells. | |
| WO2008082323A1 (en) | Growth stimulating and cell regenerating composition and a method for the production thereof. | |
| WO2013142192A1 (en) | Methods and compositions for regenerating and repairing damaged tissue using nonviable irradiated or lyophilized pluripotent stem cells | |
| JP2003535025A (en) | How to induce angiogenesis in micro-organs | |
| US11622964B2 (en) | Method for destroying cellular mechanical homeostasis and promoting regeneration and repair of tissues and organs, and use thereof | |
| RU2301667C1 (en) | Method for treating the diseases of different etiology and traumas of different organs | |
| JPH05500045A (en) | Use of calcium antagonists for scar treatment | |
| CN112566646A (en) | Medicine for treating tissue necrosis or improving cardiac function | |
| CN115475282A (en) | Alginate-collagen injectable composite hydrogel and preparation method thereof | |
| RU2498809C2 (en) | Using stem cells of hair roots and progenitor (prodormal) keratinocyte cells for aged skin recovery | |
| EP1318829B1 (en) | Angiogenic tri- or tetrapeptides derived from AcSDKP | |
| JP7442624B2 (en) | Activated mesenchymal stem cells to treat limb ischemia | |
| KR20160000030A (en) | Pharmaceutical adjuvant composition for treating damages of skin or blood vessel tissue | |
| Vidová Uğurbaş et al. | Stimulation of the liver regeneration with bone marrow mesenchymal stem cells | |
| Wang et al. | PEP-1-SOD1 improves the therapeutic potential of transplanted adipose-derived mesenchymal stem cells in spinal cord injury | |
| CN112675294B (en) | Preparation of fibroblast and application of fibroblast in plastic surgery repair | |
| RU2720451C1 (en) | Method of stimulating postresection proliferation of hepatocytes by intrahepatic introduction of cyanocobalamin | |
| EP0142109B1 (en) | Macromolecules extracted from cultured mesenchymal cells for the treatment of degenerative diseases | |
| CN114984023A (en) | Application of crocetin in preparation of antiallergic drugs | |
| Vidal et al. | GABA stimulates the rabbit corneal endothelial fluid pump | |
| CN117442610A (en) | Application of compound 8519-0065 in preparation of medicine for promoting skin wound healing | |
| Olsson | Treatment of leukoderma by transplantation of basal cell layer suspension | |
| RU2161036C2 (en) | Method for treating chronic diffuse liver diseases | |
| CN116999434A (en) | Application of HDAC5 activator Gbox in preparation of medicine for promoting skin wound healing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181227 |