RU2179862C1 - Medicinal preparation to prevent transplant detachment, monoclonal antibody to cd3 antigen of human t-lymphocytes, hybridome and method to treat patients suffering acute transplant detachment reaction following kidney transplantation - Google Patents
Medicinal preparation to prevent transplant detachment, monoclonal antibody to cd3 antigen of human t-lymphocytes, hybridome and method to treat patients suffering acute transplant detachment reaction following kidney transplantation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2179862C1 RU2179862C1 RU2000132445A RU2000132445A RU2179862C1 RU 2179862 C1 RU2179862 C1 RU 2179862C1 RU 2000132445 A RU2000132445 A RU 2000132445A RU 2000132445 A RU2000132445 A RU 2000132445A RU 2179862 C1 RU2179862 C1 RU 2179862C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lymphocytes
- cells
- human
- antigen
- ico
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и касается лекарственного средства для предотвращения отторжения трансплантата, моноклонального антитела к СВ3-антигену Т-лимфоцитов человека, гибридомы, продуцирующей эти антитела и способа лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки. The invention relates to medicine and relates to a medicament for preventing transplant rejection, a monoclonal antibody to the CB3 antigen of human T-lymphocytes, a hybridoma producing these antibodies and a method for treating patients having an acute transplant rejection reaction after a kidney transplant.
Предпосылки изобретения
Реакция острого отторжения трансплантата (РООТ) является серьезным послеоперационным осложнением у больных, подвергавшихся пересадке органов и тканей. В основе этого осложнения лежит иммунная реакция организма-хозяина против чужеродных антигенов трансплантата. Под антигенами в иммунологии понимают вещества или структуры, способные вызвать иммунную реакцию против них.BACKGROUND OF THE INVENTION
The acute transplant rejection (ROOT) reaction is a serious postoperative complication in patients undergoing organ and tissue transplantation. The basis of this complication is the immune response of the host organism against foreign transplant antigens. In immunology, antigens are understood to mean substances or structures capable of inducing an immune response against them.
Известно, что каждый человек характеризуется собственным набором антигенов на клетках различных органов и тканей. Этот набор определяется генетически и, соответственно, различие антигенов у разных людей (и животных) зависит от степени генетической близости между ними. При пересадке человеку донорского органа с иным набором тканевых антигенов в организме человека-реципиента развивается иммунная реакция на чужеродный антиген, приводящая в конечном итоге к отторжению трансплантата. It is known that each person is characterized by their own set of antigens on the cells of various organs and tissues. This set is determined genetically and, accordingly, the difference in antigens in different people (and animals) depends on the degree of genetic proximity between them. When a donor organ is transplanted to a person with a different set of tissue antigens, the immune response to a foreign antigen develops in the human recipient, which ultimately leads to transplant rejection.
Известно, что иммунная система человека и животных состоит из двух взаимодействующих частей, осуществляющих соответственно гуморальный и клеточный иммунитет. Гуморальный иммунитет осуществляется В-лимфоцитами, которые формируются и дифференцируются из стволовых клеток кроветворной системы в костном мозге, и связан с продукцией В-клетками антител к растворимым антигенам. Клеточный иммунитет осуществляется Т-клетками, которые формируются и дифференцируются из стволовых клеток кроветворной системы в тимусе. Находясь в тимусе, эти клетки называются тимоцитами, а после выхода в кровоток они называются Т-лимфоцитами. Для осуществления многих иммунных реакций требуется взаимодействие В- и Т-клеток. It is known that the immune system of humans and animals consists of two interacting parts that carry out humoral and cellular immunity, respectively. Humoral immunity is carried out by B-lymphocytes, which are formed and differentiated from stem cells of the hematopoietic system in the bone marrow, and is associated with the production of antibodies to soluble antigens by B-cells. Cellular immunity is carried out by T-cells, which are formed and differentiated from stem cells of the hematopoietic system in the thymus. Being in the thymus, these cells are called thymocytes, and after entering the bloodstream they are called T-lymphocytes. For the implementation of many immune reactions, the interaction of B and T cells is required.
РООТ осуществляется, в основном, по механизму клеточного иммунитета. Для подавления РООТ традиционно применяли препараты-иммуносупрессоры (азатиоприн, циклоспорин, преднизолон). Эти препараты неспецифично подавляют активность иммунной системы и вызывают целый ряд связанных с этим побочных эффектов (инфекции, опухолевый рост и т.д.). В связи с этим постоянно велся поиск препаратов, более селективно подавляющих активность клеточного иммунитета без торможения активности гуморального иммунитета. ROOT is carried out mainly by the mechanism of cellular immunity. To suppress ROOT, immunosuppressive drugs (azathioprine, cyclosporin, prednisolone) have traditionally been used. These drugs non-specifically inhibit the activity of the immune system and cause a number of related side effects (infections, tumor growth, etc.). In this regard, a search was constantly conducted for drugs that more selectively suppress the activity of cellular immunity without inhibiting the activity of humoral immunity.
Одним из перспективных направлений лекарственной терапии, в целом, является применение так называемых моноклональных антител (МКА) для разрушения или инактивация веществ и структур, участвующих в развитии заболеваний. One of the promising areas of drug therapy, in general, is the use of so-called monoclonal antibodies (MCAs) for the destruction or inactivation of substances and structures involved in the development of diseases.
МКА - это полученный по специальной технологии особо чистый препарат антител к определенному антигену. Вообще, антитела представляют собой иммуноглобулины, которые продуцируются В-лимфоцитами при попадании в организм чужеродного антигена. С помощью антител организм уничтожает или инактивирует те антигены, которые вызвали продукцию этих антител. MCA is an especially pure preparation of antibodies to a specific antigen obtained by special technology. In general, antibodies are immunoglobulins that are produced by B cells when a foreign antigen enters the body. Using antibodies, the body destroys or inactivates those antigens that caused the production of these antibodies.
Традиционно, препараты антител к тому или иному антигену получали путем иммунизации животных этим антигеном и последующего выделения антител из крови животных. Однако, поскольку организм животного постоянно подвергается воздействию внешней среды и различных внешних антигенов, то в его крови постоянно присутствует целый спектр антител, направленных против разных антигенов. Выделить из этой смеси антитела, направленные против какого-либо одного антигена, технически довольно сложно. Поэтому получаемые таким способом препараты антител к определенному антигену, как правило, имели примеси антител к другим антигенам и находили применение, в основном, для исследовательских целей. Техническая сложность получения чистого препарата антител, направленных только против одного антигена, долгое время являлась препятствием для их широко клинического применения. Traditionally, preparations of antibodies to a particular antigen were obtained by immunizing animals with this antigen and subsequent isolation of antibodies from the blood of animals. However, since the animal’s body is constantly exposed to the external environment and various external antigens, a whole spectrum of antibodies directed against different antigens is constantly present in its blood. It is technically quite difficult to isolate antibodies directed against any single antigen from this mixture. Therefore, preparations of antibodies to a specific antigen obtained in this way, as a rule, had impurities of antibodies to other antigens and were used mainly for research purposes. The technical complexity of obtaining a pure antibody preparation directed against only one antigen has long been an obstacle to their widespread clinical use.
В 1975 г. была разработана принципиально новая методика, позволяющая получать практически чистые препараты антител, направленных против того или иного антигена (см. Kohler et al., 1975). В основе методики лежит создание гибридных линий клеток, синтезирующих антитела только к одному определенному антигену. Как известно, антитела продуцируются В-лимфоцитами, но лимфоциты в клеточной культуре не поддерживаются и через несколько делений погибают. Суть идеи этих авторов заключалась в том, что В-лимфоциты гибридизировали с "бессмертной" культурой клеток миеломы, неограниченно поддерживающейся в культуре клеток. Таким образом, получающийся клеточный гибрид обладает способностью В-лимфоцитов продуцировать антитела и способностью клеток миеломы неограниченно поддерживаться в культуре. In 1975, a fundamentally new technique was developed, which allows one to obtain practically pure antibody preparations directed against a particular antigen (see Kohler et al., 1975). The methodology is based on the creation of hybrid cell lines synthesizing antibodies to only one specific antigen. As you know, antibodies are produced by B-lymphocytes, but lymphocytes in cell culture are not supported and die after a few divisions. The essence of the idea of these authors was that B-lymphocytes hybridized with the "immortal" culture of myeloma cells, which is unlimitedly supported in cell culture. Thus, the resulting cell hybrid has the ability of B-lymphocytes to produce antibodies and the ability of myeloma cells to be supported unlimitedly in culture.
Для получения гибридомы, продуцирующей антитела к определенному антигену, мышей иммунизируют данным антигеном, получают клетки селезенки и гибридизируют их с клетками миеломы мыши (обычно миеломы P3X63.Ag8.653). После слияния клетки рассеивают по одной и впоследствии отбирают те колонии, которые продуцируют антитела к исходному антигену. Отобранные колонии далее культивируют как клеточный штамм. Поскольку все клетки культуры-продуцента представляют собой клон потомков одной гибридной клетки, то синтезируемые ими антитела называют моноклональными. To obtain a hybridoma producing antibodies to a specific antigen, mice are immunized with this antigen, spleen cells are obtained and hybridized with mouse myeloma cells (usually myeloma P3X63.Ag8.653). After fusion, the cells scatter one at a time and subsequently select those colonies that produce antibodies to the parent antigen. Selected colonies are further cultured as a cell strain. Since all cells of the producer culture are a clone of the descendants of one hybrid cell, the antibodies they synthesize are called monoclonal.
С помощью гибридомной технологии к настоящему времени получены сотни МКА к самым разным антигенам человека и других организмов. Эти антитела широко применяются в экспериментальных исследованиях этиологии, патогенеза и способов лечения различных заболеваний, для иммуноферментной диагностики и контроля течения заболеваний, а также для оценки гормонального и иммунного статуса пациентов (см., например, обзоры Laurino с соавт., 1999 и Барышникова et al., 1996 и содержащиеся в них ссылки). With the help of hybridoma technology, hundreds of MCAs for a variety of antigens of humans and other organisms have been obtained to date. These antibodies are widely used in experimental studies of the etiology, pathogenesis and methods of treating various diseases, for enzyme-linked immunosorbent diagnosis and control of the course of diseases, as well as for assessing the hormonal and immune status of patients (see, for example, reviews by Laurino et al., 1999 and Baryshnikova et al. ., 1996 and the references contained therein).
Т-лимфоциты человека имеют характерный только для них антиген CD3, который представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярным весом около 20 кДа и присутствует на всех зрелых Т-лимфоцитах и тимоцитах. Связывание антител с этим антигеном приводит к резкому угнетению клеточного иммунитета, что может быть обусловлено следующими причинами:
1) связывание антитела с антигеном приводит к стерической модификации связанного с CD3-антигеном Т-клеточного рецептора антигенов (ТРА), в результате чего блокируется активация Т-лимфоцитов антигенами;
2) связывание антитела с антигеном способствует опсонизации циркулирующих Т-клеток и их захвату и разрушению в ретикулоэндотелиальной системе;
3) после связывания антитела с антигеном происходит кратковременная активация Т-лимфоцита, в результате которой из клетки выбрасываются цитокины, блокирующие пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников Т-лимфоцитов. К числу этих цитокинов относятся интерлейкины-2, -3, -6, -10, гамма-интерферон и фактор некроза опухоли;
4) связывание антитела с антигеном запускает процесс апоптоза (запрограммированной гибели) Т-лимфоцитов.Human T-lymphocytes have CD3 antigen characteristic of them, which is a transmembrane glycoprotein with a molecular weight of about 20 kDa and is present on all mature T-lymphocytes and thymocytes. The binding of antibodies to this antigen leads to a sharp inhibition of cellular immunity, which may be due to the following reasons:
1) the binding of the antibody to the antigen leads to steric modification of the T-cell antigen receptor (TPA) bound to the CD3 antigen, as a result of which the activation of T lymphocytes by antigens is blocked;
2) the binding of an antibody to an antigen promotes the opsonization of circulating T cells and their uptake and destruction in the reticuloendothelial system;
3) after binding of the antibody to the antigen, short-term activation of the T-lymphocyte occurs, as a result of which cytokines are released from the cell, which block the proliferation and differentiation of T-lymphocyte progenitor cells. These cytokines include interleukins-2, -3, -6, -10, gamma interferon, and tumor necrosis factor;
4) the binding of the antibody to the antigen starts the process of apoptosis (programmed death) of T-lymphocytes.
Кроме того, полагают, что связывание антитела с антигеном CD3 может вызывать следующее:
1) интернализация комплекса CD3-TPA из мембраны и, соответственно, снижение способности Т-лимфоцитов к активации антигенами;
2) усиление экспрессии в лимфоцитах молекул адгезии, что приводит к усилению адгезии лимфоцитов на эндотелии сосудов;
3) клеточно-опосредованный цитолиз Т-лимфоцитов.In addition, it is believed that binding of the antibody to the CD3 antigen may cause the following:
1) internalization of the CD3-TPA complex from the membrane and, accordingly, a decrease in the ability of T-lymphocytes to be activated by antigens;
2) increased expression of adhesion molecules in lymphocytes, which leads to increased lymphocyte adhesion on vascular endothelium;
3) cell-mediated cytolysis of T-lymphocytes.
В результате уже через 1 час после внутривенного введения антител к антигену CD3 из кровеносного русла исчезают почти все функционально-активные Т-лимфоциты. As a result, already 1 hour after the intravenous administration of antibodies to the CD3 antigen, almost all functionally active T-lymphocytes disappear from the bloodstream.
Уже в середине 1970-х г. было известно, что введение больным антител к поверхностным антигенам Т-лимфоцитов позволяет предотвратить или ослабить РООТ (Cosimi et al., 1976). В конце 1970-х г. методом гибридомной технологии были получены первые моноклональные антитела к антигену CD3 Т-лимфоцитов человека, и несколько позже была подтверждена их эффективность для предотвращения отторжения трансплантата (Cosimi et al., 1981 г.). Первым препаратом на основе моноклональных антител к антигену CD3 Т-лимфоцитов человека является препарат Ортоклон ОКТ3 компании Ortho Pharmaceuticals (США), который в 1986 г. был разрешен Управлением по контролю качества продуктов и лекарств США для предупреждения и лечения реакции острого отторжения трансплантата при пересадке почки. Already in the mid-1970s, it was known that the administration of antibodies to surface antigens of T-lymphocytes to patients can prevent or reduce POOT (Cosimi et al., 1976). In the late 1970s, the first monoclonal antibodies to the human CD3 T-lymphocyte antigen were obtained by hybridoma technology, and their effectiveness for preventing transplant rejection was confirmed a little later (Cosimi et al., 1981). The first drug based on monoclonal antibodies to the human CD3 T-lymphocyte antigen is Orthoclone OKT3 by Ortho Pharmaceuticals (USA), which in 1986 was approved by the US Food and Drug Administration for the prevention and treatment of acute transplant rejection during kidney transplants .
Моноклональные антитела ОКТ3 представляют собой иммуноглобулины класса IgG, подкласса IgG2, продуцируются гибридомой АТСС CRL8001, культивируемой в подходящей среде и полученной слиянием клеток миеломы Р3х63 Ag8Ul и клеток селезенки мышей CAF1, предварительно иммунизированных Т-клетками человека, очищенными методом розеткообразования (патент US 4361549).OCT3 monoclonal antibodies are immunoglobulins of the IgG class, subclass of IgG2, produced by ATCC CRL8001 hybridoma cultured in a suitable medium and obtained by fusion of P3x63 Ag8Ul myeloma cells and CAF 1 spleen cells previously immunized with human T cells 43 rosette6) (49 patent) .
В патенте US 4515893 этой же компании была запатентована гибридома, продуцирующая эти антитела, которые реагируют более чем с 95% Т-клеток периферической крови человека, но не реагируют с В-клетками. При этом в патенте обсуждается возможность терапевтического и диагностического применения ОКТ3. In the patent US 4,515,893 of the same company, a hybridoma was produced that produces these antibodies, which react with more than 95% of human peripheral blood T cells but do not react with B cells. Moreover, the patent discusses the possibility of therapeutic and diagnostic use of OCT3.
Терапевтический препарат ОКТ3 содержит смесь фармацевтически приемлемого носителя с терапевтически эффективным количеством Ортоклона ОКТ3, эффективно ослабляющим или подавляющим отторжение трасплантата у реципиента (патент US 654210). Моноклональное антитело фиксирует комплемент и связывается со всеми нормальными Т-клетками периферической крови человека и клетками кожной Т-клеточной лимфомы, но не связывается с В-клетками, нулевыми клетками и макрофагами. В процессе диагностики, например, Т-клеточного лимфобластного лейкоза смешивают эффективное количество препарата с лимфоцитами периферической крови, полученными от больного, и определяют долю лимфоцитов, взаимодействующих с антителами. В патенте также сообщается, что Ортоклон ОКТ3 ослабляет или предупреждает реакцию отторжения трансплантата, однако конкретных данных о клинической эффективности препарата не приводится. The therapeutic OCT3 preparation contains a mixture of a pharmaceutically acceptable carrier with a therapeutically effective amount of Orthoclone OKT3, which effectively attenuates or suppresses transplant rejection in the recipient (US Pat. No. 6,54210). A monoclonal antibody fixes complement and binds to all normal human peripheral blood T-cells and cutaneous T-cell lymphoma cells, but does not bind to B-cells, null cells and macrophages. In the diagnosis process, for example, T-cell lymphoblastic leukemia, an effective amount of the drug is mixed with peripheral blood lymphocytes obtained from the patient, and the proportion of lymphocytes interacting with antibodies is determined. The patent also states that Orthoclone OKT3 attenuates or prevents the transplant rejection reaction, but specific data on the clinical efficacy of the drug are not provided.
Несмотря на высокую эффективность подавления РООТ с помощью МКА ОКТ3, примерно у 6% больных применение Ортоклона ОКТ3 оказывается неэффективным, а у 66% больных в последующем наблюдается рецидив РООТ. У больных, не чувствительных к другим типам иммуносупрессоров, частота отсутствия эффекта Ортоклона ОКТ3 достигает 20-25% (Ponticelli et al., 1986, Monaco et al., 1987). Despite the high efficiency of suppressing ROOT using MCA OCT3, in about 6% of patients, the use of Orthoclone OKT3 is ineffective, and 66% of patients subsequently experience a relapse of ROOT. In patients not sensitive to other types of immunosuppressive agents, the frequency of the absence of the effect of Orthoclone OKT3 reaches 20-25% (Ponticelli et al., 1986, Monaco et al., 1987).
Препараты, аналогичные Ортоклону ОКТ3, были разработаны также рядом других стран: IORT-3 (Куба) и ICO-90 (Россия). В работах Иванова П.К. с соавт. (Иванов П. К. и др., 1998; Ivanov P.К. et al., 1998) описано их применение для лечения реакции острого отторжения трансплантата после пересадки почки, а также их биологическая активность. Preparations similar to Orthoclone OKT3 were also developed by a number of other countries: IORT-3 (Cuba) and ICO-90 (Russia). In the works of Ivanov P.K. et al. (Ivanov P.K. et al., 1998; Ivanov P.K. et al., 1998) describe their use for the treatment of acute transplant rejection after a kidney transplant, as well as their biological activity.
В связи с изложенным технический результат данного изобретения направлен на разработку лекарственного средства для предотвращения отторжения трансплантата на основе моноклональных антител ICO-90 и фармацевтически пригодного носителя, обеспечивающего стабильность препарата при длительном хранении, а также высокую эффективность при лечении больных с реакцией острого отторжения трансплантата после пересадки почки с минимальной аллергизацией организма и отсутствием последующих рецидивов, при использовании штамма-продуцента, производящего моноклональные антитела более широкого спектра действия и более высокой специфичности по сравнению с коммерческими препаратами. In connection with the foregoing, the technical result of the present invention is directed to the development of a medicament for preventing graft rejection based on ICO-90 monoclonal antibodies and a pharmaceutically acceptable carrier that ensures drug stability during long-term storage, as well as high efficiency in the treatment of patients with acute graft rejection after transplantation kidneys with minimal allergization of the body and the absence of subsequent relapses, using a producer strain, producing Monoclonal antibodies present a broader spectrum and a higher specificity compared to commercial preparations.
Сущность изобретения
Сущность изобретения включает лекарственное средство для предотвращения отторжения трансплантата на основе моноклонального антитела к CD3-антигену Т-лимфоцитов человека ICO-90, представляющее собой очищенный иммуноглобулин подкласса IgG2a, содержащего от 1 до 10 мг активного вещества в 1 мл фосфатно-солевого буфера с рН 7,2-7,6 и 1 0,01-0,02% Твина-80.SUMMARY OF THE INVENTION
The essence of the invention includes a medicine for preventing transplant rejection based on the monoclonal antibody to the CD3 antigen of human T-lymphocytes ICO-90, which is a purified immunoglobulin of the IgG2a subclass, containing from 1 to 10 mg of active substance in 1 ml of phosphate-salt buffer with pH 7 , 2-7.6 and 1 0.01-0.02% Tween-80.
Способ лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки, включает применение этого лекарственного средства. A method for treating patients having an acute transplant rejection reaction after a kidney transplant involves the use of this drug.
В варианте этого способа лекарственное средство вводят ежедневно в количестве от 1 до 5 мг. In an embodiment of this method, the drug is administered daily in an amount of from 1 to 5 mg.
В предпочтительном варианте осуществления способа лекарственное средство вводят в количестве 5 мг ежедневно. In a preferred embodiment of the method, the drug is administered in an amount of 5 mg daily.
В другом варианте этого способа введение лекарственного препарата осуществляют ежедневно в течение 7-14 дней. In another embodiment of this method, the drug is administered daily for 7-14 days.
Предпочтительно вводят лекарственный препарат ежедневно в течение 10 дней. Preferably, the drug is administered daily for 10 days.
Моноклональное антитело, на основе которого приготавливают лекарственное средство, представляет собой моноклональное антитело к CD3-антигену Т-лимфоцитов человека ICO-90, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., ICO-90, ВСКК (П) 368Д, связывающееся с 60,7% Т-лимфоцитов периферической крови и с 62,7% тимоцитов человека, а также с 97-98% клеток культур Т-лимфоцитов человека (NK1, B12b, Hball) и с 80% клеток линии Jurkat. The monoclonal antibody on the basis of which the drug is prepared is a monoclonal antibody to the ICO-90 human T-lymphocyte CD3 antigen produced by the strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus L., ICO-90, BCCK (P) 368D, which binds to 60 , 7% of peripheral blood T-lymphocytes and with 62.7% of human thymocytes, as well as with 97-98% of human T-lymphocyte culture cells (NK1, B12b, Hball) and with 80% of Jurkat cells.
В варианте этого изобретения указанное моноклональное антитело не связывается с лейкоцитами (моноцитами и гранулоцитами), эритроцитами и тромбоцитами периферической крови человека и с клетками культур В-лимфоцитов (JFP, JY, Raji, Namalva), пре-В-лимфоцитов (Reh), эритробластов (К562), миелоцитов (HL60) и монобластов (U937). In an embodiment of this invention, said monoclonal antibody does not bind to white blood cells (monocytes and granulocytes), erythrocytes and platelets of human peripheral blood, and to cells of cultures of B-lymphocytes (JFP, JY, Raji, Namalva), pre-B-lymphocytes (Reh), erythroblasts (K562), myelocytes (HL60) and monoblasts (U937).
Еще в одном варианте этого изобретения указанное антитело используется для диагностики заболеваний, связанных с уменьшением или увеличением продукции СD3+-Т-лимфоцитов.In yet another embodiment of this invention, said antibody is used to diagnose diseases associated with a decrease or increase in production of CD3 + T lymphocytes.
Указанное моноклональное антитело продуцируется штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., ICO-90, ВСКК (П) 368Д. The specified monoclonal antibody is produced by a strain of hybrid cultured animal cells of Mus musculus L., ICO-90, VSCK (P) 368D.
В варианте изобретения штамм гибридных культивируемых клеток получен слиянием клеток миеломы мыши штамма P3X63.Ag8.653 и клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных Т-лимфоцитами человека, очищенных путем реакции розеткообразования с эритроцитами барана. In an embodiment of the invention, the hybrid cultured cell strain was obtained by fusion of mouse P3X63.Ag8.653 mouse myeloma cells and spleen cells of BALB / c mice immunized with human T-lymphocytes, purified by rosette formation with sheep red blood cells.
Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевивных соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур. The strain is deposited in the Specialized collection of transplantable somatic cells of vertebrates of the All-Union collection of cell cultures.
Конкретные примеры выполнения
Пример 1. Получение гибридомы, продуцирующей МКА ICO-90
Гибридому получают путем слияния клеток миеломы мыши и клеток селезенки мыши, иммунизированной Т-лимфоцитами периферической крови человека.Specific Examples
Example 1. Obtaining a hybridoma producing ICA ICO-90
A hybridoma is obtained by fusion of mouse myeloma cells and mouse spleen cells immunized with human peripheral blood T-lymphocytes.
А) выделение Т-лимфоцитов периферической крови человека
Т-лимфоциты выделяют из пула мононуклеарных клеток на основе реакции розеткообразования с эритроцитами барана, обработанными нейраминидазой.A) the allocation of T-lymphocytes in human peripheral blood
T-lymphocytes are isolated from a pool of mononuclear cells based on the reaction of rosette formation with sheep erythrocytes treated with neuraminidase.
Кровь из локтевой вены здоровых доноров собирают в раствор гепарина (50 ед/мл). К цельной крови добавляют 10% раствор желатина до конечной концентрации 1%, перемешивают и инкубируют в течение 45 мин при 37oС. При этом осаждаются эритроциты. Плазму, содержащую взвесь лейкоцитов, отсасывают, и лейкоциты осаждают центрифугированием и трижды отмывают.Blood from the cubital vein of healthy donors is collected in a heparin solution (50 units / ml). To whole blood add 10% gelatin solution to a final concentration of 1%, mix and incubate for 45 min at 37 o C. In this case, red blood cells precipitate. Plasma containing a suspension of leukocytes is aspirated, and leukocytes are precipitated by centrifugation and washed three times.
Лейкоциты наслаивают на градиент плотности фиколл-верографин (9 объемов препарата лейкоцитов на 3 объема градиента) и центрифугируют в течение 40 мин при 300 g и комнатной температуре. Мононуклеарные клетки трижды отмывают средой 199, при этом первый раз центрифугируют в течение 20 мин при 200 g. White blood cells are layered on the density gradient of ficoll-verographin (9 volumes of the leukocyte preparation per 3 volumes of the gradient) and centrifuged for 40 min at 300 g and room temperature. Mononuclear cells are washed three times with medium 199, while the first time centrifuged for 20 min at 200 g.
Смешивают равные объемы взвеси мононуклеарных клеток (6•106/мл), эритроцитов барана и эмбриональной телячьей сыворотки, адсорбированной эритроцитами барана. Смесь инкубируют в течение 15 мин при 37oС, центрифугируют в течение 5 мин при 150 g и инкубируют в течение ночи при 4oС. Клетки осторожно суспензируют, наслаивают на градиент фиколл-верографин и центрифугируют в тех же условиях. Т-клетки, образовавшие розетки, осаждаются на дно пробирки. Розетки из осадка разрушают гипотоническим раствором.Equal volumes of suspension of mononuclear cells (6 • 10 6 / ml), ram erythrocytes and fetal calf serum adsorbed by ram erythrocytes are mixed. The mixture was incubated for 15 minutes at 37 ° C. , centrifuged for 5 minutes at 150 g and incubated overnight at 4 ° C. The cells were carefully suspended, layered on a ficoll-verographin gradient and centrifuged under the same conditions. T cells that formed rosettes are deposited on the bottom of the tube. Rosettes from the sediment are destroyed by a hypotonic solution.
Б) Иммунизация мышей Т-клетками
Мышам линии BALB/c в хвостовую вену вводят Т-клетки в количестве 2•107 клеток. Иммунизацию проводят 5 раз с интервалом в 2 недели. Последнюю иммунизацию проводят за 5 дней до проведения гибридизации.B) Immunization of mice with T cells
BALB / c mice were injected with 2 x 10 7 cells of T cells into the tail vein. Immunization is carried out 5 times with an interval of 2 weeks. The last immunization is carried out 5 days before the hybridization.
В) Получение клеток селезенки
Селезенку иммунизированных мышей извлекают в стерильных условиях и измельчают в гомогенизаторе Поттера. Взвесь клеток фильтруют через марлевый фильтр и дважды отмывают средой 199.C) Obtaining spleen cells
The spleen of immunized mice is recovered under sterile conditions and ground in a Potter homogenizer. A suspension of cells is filtered through a gauze filter and washed twice with medium 199.
Г) Линия миеломных клеток
Для получения гибридомы используют мышиную миелому P3X63.Ag8.653. Клетки миеломы поддерживают в среде ДМЕМ, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мкМ глютамина и 0,1 мг/мл гентамицина.D) Myeloma cell line
To obtain hybridomas, mouse myeloma P3X63.Ag8.653 is used. Myeloma cells are maintained in DMEM medium containing 15% fetal calf serum, 2 μM glutamine and 0.1 mg / ml gentamicin.
Д) Гибридизация клеток
Миеломные клетки дважды отмывают средой 199 и смешивают с клетками селезенки в соотношении 1:5-1:10. Смесь клеток отмывают средой 199 и помещают в объеме 20 мл среды 199 в 100-мл флакон, в котором ее центрифугируют в течение 3 мин при 300 g и инкубируют в течение 20 мин при 37oС. Затем среду отсасывают насухо и к клеткам добавляют 3 мл 50% полиэтиленгликоля. Через 75 с во флакон медленно вливают 20 мл среды 199. Клетки 3 раза отмывают, не встряхивая, и оставляют на 2-8 час. После этого клетки разливают по 0,2 мл в лунки 96-ячейковой микроплашки. На следующий день среду меняют на среду ГАТ (среда ДМЕМ, содержащая 13,6 мкг/мл гипоксантина, 191 нг/мл аминоптерина и 3,85 мкг/мл тимидина). Видимые колонии появляются через 10-14 дней.E) Cell Hybridization
Myeloma cells are washed twice with medium 199 and mixed with spleen cells in a ratio of 1: 5-1: 10. The mixture of cells is washed with medium 199 and placed in a volume of 20 ml of medium 199 in a 100-ml vial in which it is centrifuged for 3 min at 300 g and incubated for 20 min at 37 o C. Then the medium is suctioned dry and 3 are added to the cells ml of 50% polyethylene glycol. After 75 seconds, 20 ml of 199 medium is slowly poured into the vial. The cells are washed 3 times without shaking and left for 2-8 hours. After this, the cells are poured into 0.2 ml into the wells of a 96-cell microplate. The next day, the medium is changed to GAT medium (DMEM medium containing 13.6 μg / ml hypoxanthine, 191 ng / ml aminopterin and 3.85 μg / ml thymidine). Visible colonies appear in 10-14 days.
Е) Отбор штаммов-продуцентов
Отбор штаммов, продуцирующих МКА, осуществляют путем непрямого иммунофлуоресцентного анализа образцов культуральной жидкости с клетками, используемыми для иммунизации.E) Selection of producer strains
The selection of strains producing MCA is carried out by indirect immunofluorescence analysis of samples of the culture fluid with the cells used for immunization.
Клетки в количестве 500 тыс. инкубируют с 20 мкл супернатанта, разведенного 1:10 в физиологическом растворе с 0,1% азидом натрия. Инкубацию проводят при 4oС в течение 30 мин. После этого клетки дважды промывают фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с 2% эмбриональной телячьей сывороткой, 0,1% азидом натрия и 0,01 М HEPES (среда IFA) и инкубируют при 4oС в течение 30 мин с 20 мкл поликлональных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с ФИТЦ или пероксидазой хрена. После этого клетки вновь дважды отмывают средой IFA и ресуспензируют в физиологическом растворе с 1% формалина. В полученной суспензии анализируют флуоресценцию клеток на проточном цитофлуориметре.500 thousand cells are incubated with 20 μl of the supernatant diluted 1:10 in physiological saline with 0.1% sodium azide. Incubation is carried out at 4 o C for 30 minutes After this, the cells are washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) with 2% fetal calf serum, 0.1% sodium azide and 0.01 M HEPES (IFA medium) and incubated at 4 ° C. for 30 minutes with 20 μl of polyclonal rabbit rabbits antibodies against mouse immunoglobulins conjugated to FITC or horseradish peroxidase. After this, the cells are again washed twice with IFA medium and resuspended in physiological saline with 1% formalin. In the resulting suspension, the fluorescence of the cells is analyzed on a flow cytometer.
Для контроля специфичности окрашивания в качестве отрицательных контролей вместо первых антител используют буфер, а вместо вторых антител - буфер или меченные антитела другой специфичности. To control the specificity of staining, a buffer is used as negative controls instead of the first antibodies, and a buffer or labeled antibodies of another specificity instead of the second antibodies.
Штамм, отобранный для получения МКА, получил название ICO-90. The strain selected for the MCA was called ICO-90.
Ж) Клонирование и поддержание гибридомы
Продуцирующую гибридому дважды клонируют на фидере из клеток селезенки и тимуса мышей BALB/c. Для приготовления фидера кусочки тимуса и селезенки измельчают в гомогенизаторе Поттера, взвесь клеток фильтруют через марлевый фильтр и клетки разливают в среде роста по 0,1 мл в лунки 96-ячейковой микроплашки. Через 1-7 дней эти лунки используют как фидер. Клетки продуцирующего клона снимают нежным пипетированием, подсчитывают в камере Горяева и разводят в среде роста до конечной концентрации 50 клеток в 10 мл среды роста. Полученную взвесь клеток разливают по 0,1 мл в лунки фидера. При этом на 2 лунки приходилась 1 клетка. Видимые колонии появляются через 10-14 дней. Клонирование считалось эффективным, если колонии вырастали не более чем в 75% лунок.G) Cloning and maintenance of the hybridoma
The producing hybridoma was cloned twice on a feeder from BALB / c mouse spleen and thymus cells. To prepare the feeder, thymus and spleen pieces are crushed in a Potter homogenizer, the cell suspension is filtered through a gauze filter, and the cells are poured in 0.1 ml growth medium into 96-well microplate wells. After 1-7 days, these wells are used as a feeder. The cells of the producing clone are removed by gentle pipetting, counted in a Goryaev chamber and diluted in a growth medium to a final concentration of 50 cells in 10 ml of growth medium. The resulting suspension of cells is poured into 0.1 ml into the wells of the feeder. At the same time, 2 cells per 1 cell. Visible colonies appear in 10-14 days. Cloning was considered effective if the colonies grew in no more than 75% of the wells.
Культуру гибридомы поддерживают на самках мышей линии BALB/c путем серийного пассажа асцитической жидкости. The hybridoma culture is maintained on female BALB / c mice by serial passage of ascitic fluid.
Пример 2. Получение МКА ICO-90
МКА ICO-90 выделяют из асцитической жидкости мышей BALB/c, которым внутрибрюшинно инокулируют клетки продуцирующей гибридомы.Example 2. Obtaining ICA ICO-90
ICA ICO-90 was isolated from the ascitic fluid of BALB / c mice, which cells of the producing hybridoma were inoculated intraperitoneally.
А) Получение асцитической жидкости. A) Obtaining ascitic fluid.
За 3-10 дней до инокуляции клеток гибридомы мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл вазелинового масла или 3% пептона на вазелиновом масле для индукции роста гибридомы в асцитной форме. 107 клеток гибридомы ICO-90 инокулируют мышам внутрибрюшинно и через 7-8 дней, в зависимости от накопления асцита, собирают асцитическую жидкость. Асцитическую жидкость, полученную от разных мышей, объединяют и центрифугируют в течение 20 мин при 2,5 тыс. g и 4oС. Супернатант хранят при -50oС до дальнейшей обработки (до 3 месяцев).3-10 days before the inoculation of hybridoma cells, mice are injected intraperitoneally with 0.5 ml of liquid paraffin or 3% peptone in liquid paraffin to induce the growth of hybridoma in ascites form. 10 7 cells of ICO-90 hybridoma are inoculated intraperitoneally to mice and after 7-8 days, depending on ascites accumulation, ascites fluid is collected. The ascitic fluid obtained from different mice was combined and centrifuged for 20 min at 2.5 thousand g and 4 ° C. The supernatant was stored at -50 ° C until further processing (up to 3 months).
Б) Выделение и очистка МКА ICO-90
МКА ICO-90 выделяют путем аффинной хроматографии на сорбенте протеин А-сефароза (Pharmacia, Швеция). Асцитическую жидкость размораживают и центрифугируют в течение 20 мин при 2,5 тыс. g и 4oС. Супернатант диализируют против стартового буфера (0,1М натрий-фосфатный буфер, рН 8,0) в течение ночи. Полученный диализат наносят на колонку с протеин А-сефарозой, предварительно уравновешенную 0,1М натрий-фосфатным буфером (рН 8,0), и промывают стартовым буфером до отсутствия белка в выходящем растворе. После этого связавшиеся с сорбентом иммуноглобулины элюируют 0,1М натрий-цитратным буфером (рН 3,0). Полученный элюат концентрируют и используют как субстрат для дальнейшего приготовления лекарственного препарата.B) Isolation and purification of MCA ICO-90
MCA ICO-90 is isolated by protein A-Sepharose affinity chromatography on an adsorbent (Pharmacia, Sweden). The ascitic fluid is thawed and centrifuged for 20 min at 2.5 thousand g and 4 ° C. The supernatant is dialyzed against the starting buffer (0.1 M sodium phosphate buffer, pH 8.0) overnight. The resulting dialysate is applied to a protein A-Sepharose column, previously equilibrated with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 8.0), and washed with a starting buffer until there is no protein in the effluent. After that, the immunoglobulins bound to the sorbent are eluted with 0.1 M sodium citrate buffer (pH 3.0). The resulting eluate is concentrated and used as a substrate for further preparation of the drug.
Полученные МКА ICO-90 относятся к подтипу IgG2a при анализе методом иммунодиффузии по Оухтерлони. Чистоту полученных МКА ICO-90 оценивают методом вытеснительной ВЭЖХ на сорбенте Superose 12 с использованием в качестве подвижной фазы 0,6М калий-фосфатного буфера (рН 6,8) с 0,1М хлоридом калия. Пик МКА занимает не менее 95% общей площади хроматограммы, а площади индивидуальных пиков примесей не превышают 1% общей площади хроматограммы. Подлинность МКА ICO-90 оценивают методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия. МКА формируют 2 четкие полосы, соответствующие молекулярному весу 25 и 55 кДа. Специфическую активность МКА ICO-90 определяют методом проточной цитофлуориметрии в непрямой реакции иммунофлуоресценции с лимфоцитами человека (см. ниже). При этом на серийных разведениях антител определяют титр антител, соответствующий точке насыщения флуоресценции. Титр насыщения флуоресценции МКА ICO-90 составляет не менее 1:10 000. Received ICA ICO-90 belong to the IgG2a subtype when analyzed by Ouchterloni immunodiffusion method. The purity of the obtained ICA ICO-90 was assessed by HPLC displacement on a Superose 12 sorbent using 0.6 M potassium phosphate buffer (pH 6.8) with 0.1 M potassium chloride as the mobile phase. The MCA peak occupies at least 95% of the total chromatogram area, and the areas of individual impurity peaks do not exceed 1% of the total chromatogram area. The authenticity of ICA ICO-90 is evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate. MCAs form 2 distinct bands corresponding to molecular weights of 25 and 55 kDa. The specific activity of ICA ICO-90 is determined by flow cytofluorimetry in an indirect immunofluorescence reaction with human lymphocytes (see below). Moreover, the antibody titer corresponding to the saturation point of fluorescence is determined on serial dilutions of antibodies. The ICO-90 MCA fluorescence saturation titer is not less than 1:10 000.
В) Получение лекарственного средства на основе МКА ICO-90
Элюат с протеин А-Сефарозой диализируют в течение ночи против 0,01М натрий-фосфатного буфера (рН 7,5), приготовленного на стерильном физиологическом растворе. Диализат разбавляют до концентрации белка 1-10 мг/мл и к полученному раствору добавляют в качестве стабилизатора Твин-80 до конечной концентрации 0,01-0,02%. Полученный препарат стерилизуют путем фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,22 мк (Millipore, США) и разливают в стерильные флаконы по 5 мл. Готовый препарат хранят при +4oС.C) Preparation of a drug based on ICA ICO-90
The protein A Sepharose eluate is dialyzed overnight against 0.01 M sodium phosphate buffer (pH 7.5) prepared in sterile saline. The dialysate is diluted to a protein concentration of 1-10 mg / ml, and Tween-80 is added to the resulting solution as a stabilizer to a final concentration of 0.01-0.02%. The resulting preparation is sterilized by filtration through a filter with a pore diameter of 0.22 microns (Millipore, USA) and poured into sterile 5 ml vials. The finished drug is stored at + 4 o C.
Пример 3. Характеристика антигена, выявляемого МКА ICO-90
Лимфоциты периферической крови доноров выделяют как описано выше, инкубируют с 125I, лизировали и полученный раствор меченных 125I мембранных белков инкубируют с МКА ICO-90, иммобилизованными на гранулированной сефарозе. Затем связавшиеся белки элюируют и разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле. Антитела связываются с белком, имеющим молекулярную массу 25 кДа, что соответствует известной из литературы молекулярной массе антигена CD3 (Kung et al., 1979).Example 3. Characterization of antigen detected by ICA ICO-90
Donor peripheral blood lymphocytes were isolated as described above, incubated with 125 I, lysed, and the resulting solution of 125 I labeled membrane proteins was incubated with ICO-90 MCA immobilized on granular Sepharose. The bound proteins are then eluted and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Antibodies bind to a protein having a molecular weight of 25 kDa, which corresponds to the molecular weight of the CD3 antigen known from the literature (Kung et al., 1979).
Пример 4. Активность полученных антител в отношении Т-лимфоцитов in vitro
Известно, что связывание антител с антигеном CD3 вызывает временную активацию Т-лимфоцитов, ведущую к их пролиферации (Kaneoka et al., 1983). Нами исследована способность МКА ICO-90 вызывать пролиферацию Т-лимфоцитов человека.Example 4. The activity of the obtained antibodies against T-lymphocytes in vitro
It is known that the binding of antibodies to the CD3 antigen causes a temporary activation of T-lymphocytes, leading to their proliferation (Kaneoka et al., 1983). We studied the ability of ICA ICO-90 to cause the proliferation of human T-lymphocytes.
1•106 лимфоцитов человека, выделенных на градиенте плотности фиколл-верографин, инкубируют в течение 72 часов в 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в присутствии полученных антител в различных концентрациях. Степень пролиферации лимфоцитов оценивают по включению 3Н-тимидина. В интактных лимфоцитах (негативный контроль) включение 3Н-тимидина составило 1714±220 импульсов/мин. В лимфоцитах, инкубированных с полученными антителами в концентрациях 0,05-50 мкг/мл, включение 3Н-тимидина было увеличено в 15-20 раз, причем эффект антител слабо зависел от их концентрации.1 • 10 6 human lymphocytes isolated on a density gradient of ficoll-verographin are incubated for 72 hours in 1 ml of RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum in the presence of the obtained antibodies in various concentrations. The degree of lymphocyte proliferation is assessed by the inclusion of 3 N-thymidine. In intact lymphocytes (negative control), the inclusion of 3 N-thymidine was 1714 ± 220 pulses / min. In lymphocytes incubated with the obtained antibodies at concentrations of 0.05–50 μg / ml, the incorporation of 3 N-thymidine was increased by 15–20 times, and the effect of antibodies was weakly dependent on their concentration.
Пример 5. Связывание МКА ICO-90 с различными типами клеток крови человека и культурами клеток
Связывание МКА АТЭМА с клетками регистрируют в непрямой реакции иммунофлуоресценции, при этом клетки инкубируют сначала с МКА, а затем с меченными флуоресцентной меткой (флуоресцеинизотиоцитанатом, ФИТЦ) антителами барана против иммуноглобулинов мыши. Флуоресценцию клеток регистрируют на проточном цитофлуориметре.Example 5. The binding of ICA ICO-90 with various types of human blood cells and cell cultures
The binding of ATEMA MCA to cells is recorded in an indirect immunofluorescence reaction, with the cells being incubated first with MCA and then labeled with a fluorescent label (fluorescein isothiocytanate, FITC) of ram antibodies against mouse immunoglobulins. Cell fluorescence is recorded on a flow cytometer.
А) Получение различных фракций клеток крови
От доноров получают венозную кровь в гепаринизированные пробирки. До дальнейшей обработки кровь хранят при комнатной температуре не более 4 часов.A) Obtaining various fractions of blood cells
Venous blood is received from donors in heparinized tubes. Until further processing, the blood is stored at room temperature for no more than 4 hours.
К 9 мл цельной крови добавляют 1 мл 10% раствора желатина, перемешивают и инкубируют в течение 45 мин при 37oС. Отбирают надосадок, содержащий взвесь лейкоцитов. Лейкоциты осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 150 g и комнатной температуре и дважды промывают средой 199 путем ресуспендирования и центрифугирования в тех же условиях.To 9 ml of whole blood add 1 ml of a 10% solution of gelatin, mix and incubate for 45 min at 37 o C. Select the supernatant containing a suspension of leukocytes. White blood cells are precipitated by centrifugation for 10 min at 150 g and room temperature and washed twice with medium 199 by resuspension and centrifugation under the same conditions.
Полученные лейкоциты ресуспендируют в 6 мл среды 199 и наслаивают на 2 мл градиента плотности фиколл-верографин; центрифугируют в течение 40 мин при 300 g и комнатной температуре. Отбирают интерфазу, содержащую взвесь моноцитов. Моноциты осаждают центрифугированием в течение 20 мин при 150 g и комнатной температуре и дважды промывают средой 199 путем ресуспендирования и центрифугирования в течение 10 мин при 150 g. The resulting leukocytes are resuspended in 6 ml of medium 199 and layered on 2 ml of density gradient ficoll-verographin; centrifuged for 40 min at 300 g and room temperature. An interphase containing a suspension of monocytes is selected. Monocytes are precipitated by centrifugation for 20 min at 150 g and room temperature and washed twice with medium 199 by resuspension and centrifugation for 10 min at 150 g.
Для получения фракции Т-клеток смешивают равные объемы взвеси мононуклеарных клеток (6•106 мл), эритроцитов барана и эмбриональной телячьей сыворотки, адсорбированной эритроцитами барана. Смесь инкубируют в течение 15 мин при 37oС, центрифугируют в течение 5 мин при 150 g и инкубируют в течение ночи при 4oС. Клетки осторожно суспензируют, наслаивают на градиент фиколл-верографин и центрифугируют в тех же условиях. Т-клетки, образовавшие розетки, осаждаются на дно пробирки. Розетки из осадка разрушают гипотоническим раствором.To obtain a fraction of T cells, equal volumes of suspension of mononuclear cells (6 x 10 6 ml), ram erythrocytes and fetal calf serum adsorbed by ram erythrocytes are mixed. The mixture was incubated for 15 minutes at 37 ° C. , centrifuged for 5 minutes at 150 g and incubated overnight at 4 ° C. The cells were carefully suspended, layered on a ficoll-verographin gradient and centrifuged under the same conditions. T cells that formed rosettes are deposited on the bottom of the tube. Rosettes from the sediment are destroyed by a hypotonic solution.
В полученных фракциях клеток определяют концентрацию клеток с помощью камеры Горяева и, при необходимости, доводят эту концентрацию до 1 млн клеток/мл средой 199. In the obtained cell fractions, the cell concentration is determined using a Goryaev chamber and, if necessary, this concentration is adjusted to 1 million cells / ml with 199 medium.
Б) Культуры клеток
Используют культуры Т-лимфоцитов человека NK1, B12b, Hball, Jurkat, культуры В-лимфоцитов человека JFP, JY, Raji, Namalva, культуру пре-В-лимфоцитов человека Reh, культуру эритробластов человека К562, культуру миелоцитов человека HL-60 и культуру монобластов человека U937, поддерживаемые в Российском Онкологическом Научном Центре им. Н.Н. Блохина.B) Cell Culture
Use cultures of human T-lymphocytes NK1, B12b, Hball, Jurkat, cultures of human B-lymphocytes JFP, JY, Raji, Namalva, culture of human pre-B-lymphocytes Reh, culture of human erythroblasts K562, culture of human myelocytes HL-60 and culture of monoblasts U937, supported by the Russian Cancer Research Center. N.N. Flea.
В) Цитофлуориметрический анализ
Антитела в разведении 1:1000 смешивают в стеклянных пробирках с лимфоцитами периферической крови человека в соотношении 0,2 мл раствора антител: 0,5 мл суспензии клеток концентрацией 1 млн/мл. Полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре и дважды отмывают средой IFA (0,01М фосфатно-солевой буфер, содержащий 2% эмбриональной телячьей сыворотки) путем центрифугирования в течение 10 мин при 150 g и температуре 2-8oС и ресуспендирования.C) Cytofluorimetric analysis
Antibodies at a dilution of 1: 1000 are mixed in glass tubes with lymphocytes of human peripheral blood in the ratio of 0.2 ml of antibody solution: 0.5 ml of a suspension of cells with a concentration of 1 million / ml. The resulting mixture was incubated for 30 min at room temperature and washed twice with IFA medium (0.01 M phosphate-buffered saline containing 2% fetal calf serum) by centrifugation for 10 min at 150 g and a temperature of 2-8 o C and resuspension.
К 1 мл полученной суспензии клеток добавляют 0,1 мл разбавленного раствора меченных ФИТЦ антител барана против IgG мыши (этот раствор готовят в соответствии с индивидуальной инструкцией производителя, прилагающейся к каждой партии меченных антител). Полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при 4oС и дважды отмывают средой IFA путем центрифугирования в течение 10 мин при 150 g и температуре 2-8oС.0.1 ml of a diluted solution of FITC-labeled sheep anti-mouse IgG antibodies is added to 1 ml of the obtained cell suspension (this solution is prepared in accordance with the individual manufacturer's instructions attached to each batch of labeled antibodies). The resulting mixture was incubated for 30 min at 4 o C and washed twice with IFA medium by centrifugation for 10 min at 150 g and a temperature of 2-8 o C.
Полученный осадок ресуспендируют в 1 мл фиксирующего раствора (0,9% растворе хлорида натрия с 1% формалина) и хранят при 4oС до анализа на проточном цитофлуориметре.The resulting precipitate was resuspended in 1 ml of fixing solution (0.9% sodium chloride solution with 1% formalin) and stored at 4 ° C. until analysis on a flow cytometer.
Анализ на проточном цитофлуориметре Becton Dickenson FacScan проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора. Регистрируют гистограмму флуоресценции клеток. В качестве отрицательного контроля используют моноклональные антитела ИКО-109, направленные против иммуноглобулинов крысы. Analysis on a flow cytometer Becton Dickenson FacScan is carried out in accordance with the instructions for use of the device. A histogram of cell fluorescence is recorded. IKO-109 monoclonal antibodies directed against rat immunoglobulins are used as a negative control.
Г) Результаты
Процент клеток, связывающих полученные моноклональные антитела, приведен в таблице 1.D) Results
The percentage of cells that bind the obtained monoclonal antibodies are shown in table 1.
Таким образом, МКА ICO-90 связываются с 60,7% Т-лимфоцитов периферической крови и 62,7% тимоцитов человека и не связываются с другими типами клеток крови. МКА ICO-90 также связываются с культурами Т-клеток, но не с культурами других клеток крови и костного мозга. Thus, ICA ICO-90 binds to 60.7% of peripheral blood T-lymphocytes and 62.7% of human thymocytes and does not bind to other types of blood cells. ICA ICO-90 also bind to T-cell cultures, but not to cultures of other blood cells and bone marrow.
Пример 6. Сравнение аффинности МКА ICO-90 и МКА Ортоклон ОКТ-3 к СD3-антигенам Т-клеток
Аффинность МКА ICO-90 и Ортоклон ОКТ-3 к СD3-антигенам Т-клеток определяют в непрямой реакции иммунофлуоресценции с Т-лимфоцитами периферической крови человека. При этом на серийных разведениях антител определяют титр антител, соответствующий точке насыщения связывания. Лимфоциты периферической крови человека инкубируют сначала с исследуемым образцом, а затем с конъюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) поликлональными антителами барана против иммуноглобулинов мыши. Флуоресценцию клеток регистрировали на проточном цитофлуориметре Becton Dickenson FacScan.Example 6. Comparison of the affinity of ICA ICO-90 and MCA Orthoclone OKT-3 to CD3 antigens of T cells
The affinity of ICA ICO-90 and Orthoclone OKT-3 for CD3 antigens of T cells is determined in an indirect immunofluorescence reaction with T cells of human peripheral blood. Moreover, the antibody titer corresponding to the saturation point of binding is determined on serial dilutions of antibodies. Human peripheral blood lymphocytes are incubated first with the test sample, and then with ram polyclonal antibodies conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) against mouse immunoglobulins. Cell fluorescence was recorded on a Becton Dickenson FacScan flow cytometer.
Метод получения фракции Т-лимфоцитов периферической крови человека описан в примере 5. Цитофлуориметрический анализ проводят как описано в примере 5, за исключением того, что используют серийные разведения МКА (1:10, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:20000). The method for obtaining the fraction of T-lymphocytes of human peripheral blood is described in example 5. Cytofluorimetric analysis is carried out as described in example 5, except that serial dilutions of MCA are used (1:10, 1: 100, 1: 500, 1: 1000, 1 : 2000, 1: 5000, 1: 10000, 1: 20,000).
Полученные результаты представлены в таблице 2. The results are presented in table 2.
Таким образом, насыщение связывания МКА ICO-90 с Т-лимфоцитами периферической крови человека наблюдается при разведении МКА 1:1000, а МКА Ортоклон ОКТ-3 в разведении 1:10 000. 10-кратное отличие насыщающей концентрации этих МКА говорит о более высоком сродстве (аффинности) МКА Ортоклон ОКТ-3 к CD3-антигену Т-клеток по сравнению с МКА ICO-90. Из литературы известно, что МКА, имеющие средний уровень аффинности к CD3-антигену, могут неоднократно связываться с молекулами CD3/TCR комплекса в процессе Т-клеточной активации, индуцируя так называемую активационную гибель клетки (см. Orchansky P.L. et al. J. Immunol., 1994; 153:615, Hurdato J. et al. J. Immunol., 1997; 158(6): 2600, Radvanyi L. et al. J. Immunol., 1993; 150: 5704). Thus, saturation of the binding of ICA-90 MCA with human peripheral blood T-lymphocytes is observed at a dilution of 1: 1000 MCA, and Orthoclone OCT-3 MCA at a dilution of 1:10 000. A 10-fold difference in the saturation concentration of these MCA indicates a higher affinity (affinity) MCA Orthoclone OKT-3 to T3 CD3 antigen compared with ICO ICO-90. It is known from the literature that MCAs having an average level of affinity for the CD3 antigen can repeatedly bind to the molecules of the CD3 / TCR complex during T-cell activation, inducing the so-called activation cell death (see Orchansky PL et al. J. Immunol. 1994; 153: 615; Hurdato J. et al. J. Immunol. 1997; 158 (6): 2600; Radvanyi L. et al. J. Immunol. 1993; 150: 5704).
Пример 7. Терапевтический эффект лекарственного средства на основе МКА ICO-90
В марте 1997 года в отделение гемодиализа и трансплантации почки Московского областного научно-исследовательского клинического института (МОНИКИ) им. М.Ф. Владимирского была госпитализирована б-ная К., 20 лет, с клиническим диагнозом "хроническая почечная недостаточность". Последние два года больная находилась на постоянном гемодиализе, ожидая подходящего трансплантата для пересадки почки.Example 7. The therapeutic effect of the drug based on ICA ICO-90
In March 1997, in the Department of hemodialysis and kidney transplantation of the Moscow Regional Scientific Research Clinical Institute (MONIKI). M.F. Vladimirsky was hospitalized b-naya K., 20 years old, with a clinical diagnosis of "chronic renal failure." The last two years, the patient was on permanent hemodialysis, waiting for a suitable transplant for a kidney transplant.
Поводом для госпитализации послужило нахождение подходящего трансплантата. На третьи сутки после проведенной операции появились признаки острого отторжения трансплантата, диурез отсутствовал, креатинин плазмы нарастал. Появилась угроза потери трансплантата. The reason for hospitalization was the finding of a suitable transplant. On the third day after the operation, signs of acute transplant rejection appeared, diuresis was absent, and plasma creatinine increased. There was a threat of transplant loss.
По жизненным показаниям, с согласия пациентки и по предварительному согласованию директоров Научно-Исследовательского Института экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей Российского Онкологического Научного Центра (НИИ ЭДиТО РОНЦ) им. Н.Н. Блохина РАМН и МОНИКИ, К. был проведен курс лечения лекарственным средством на основе МКА ICO-90. Использовали следующий режим введения: ежедневно по 5 мг препарата внутривенно, на протяжении 10 дней. According to vital indications, with the consent of the patient and by prior agreement of the directors of the Research Institute of Experimental Diagnostics and Biotherapy of Tumors of the Russian Cancer Research Center (SRI EDiTO RONTS) them. N.N. Blokhin RAMS and MONIKI, K., a course of treatment with a drug based on ICA ICO-90 was carried out. The following administration regimen was used: daily, 5 mg of the drug intravenously for 10 days.
Уже к 6-му часу от начала введения антител количество Т-лимфоцитов (определяемое методом непрямого иммунофлуоресцентного анализа как количество клеток, несущих антиген CD3) в периферической крови снизилось практически до нуля. В дальнейшем наблюдалось постепенное увеличение количества этих клеток. By the 6th hour from the start of antibody administration, the number of T-lymphocytes (determined by the method of indirect immunofluorescence analysis as the number of cells carrying the CD3 antigen) in the peripheral blood decreased to almost zero. Subsequently, a gradual increase in the number of these cells was observed.
Характерно, что снижение, а затем повышение количества Т-лимфоцитов шло одновременно за счет и Т-хелперов (CD4+), и Т-супрессоров (CD8+). It is characteristic that the decrease, and then the increase in the number of T-lymphocytes, was simultaneously due to both T-helpers (CD4 +) and T-suppressors (CD8 +).
Доказательством того, что при введении МКА ICO-90 в первые часы происходит именно гибель Т-лимфоцитов, а не просто исчезновение антигена, является массовое появление в периферической крови кариоцитов с гиподиплоидным содержанием ДНК, что характерно для развития апоптоза (запрограммированной гибели клеток). The proof that with the introduction of ICA ICO-90 in the first hours, it is the death of T-lymphocytes, and not just the disappearance of the antigen, is a massive appearance in the peripheral blood of karyocytes with a hypodiploid content of DNA, which is typical for the development of apoptosis (programmed cell death).
Через 3 дня после начала терапии в результате проведенного лечения у К. появился диурез, креатиновый индекс понизился, была восстановлена функция трансплантированной почки, и через 4 недели больная была выписана домой в хорошем состоянии. В настоящее время ее самочувствие удовлетворительное. В течение срока наблюдения (3,5 года) рецидивов реакции отторжения трансплантата не происходило. С тем же техническим результатом лечение было проведено еще двум пациентам. 3 days after the start of therapy, K. developed diuresis, the creatine index decreased, the function of the transplanted kidney was restored, and after 4 weeks the patient was discharged home in good condition. At present, her condition is satisfactory. During the observation period (3.5 years), there was no relapse of the transplant rejection reaction. With the same technical result, two more patients were treated.
Указанное лекарственное средство аналогично другим коммерческим препаратам, может применяться для диагностики ряда заболеваний, связанных с уменьшением или увеличением количества СD3+-лимфоцитов, например, Т-клеточного хронического лимфобластного лейкоза и ревматоидного артрита.The specified drug, similar to other commercial drugs, can be used to diagnose a number of diseases associated with a decrease or increase in the number of CD3 + lymphocytes, for example, T-cell chronic lymphoblastic leukemia and rheumatoid arthritis.
Предлагаемое изобретение позволяет создать лекарственное средство на основе очищенных моноклональных антител к CD3-антигену Т-лимфоцитов человека ICO-90, которое сохраняет активность в процессе длительного хранения и не приводит к рецидиву реакции острого отторжения трансплантата после пересадки почки. Сами антитела IСО-90, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., ICO-90, ВСКК (П) 368Д, обладают широким спектром действия и высокой избирательностью в отношении различных культур Т-клеток человека. The present invention allows to create a drug based on purified monoclonal antibodies to the CD3 antigen of human T-lymphocytes ICO-90, which remains active during long-term storage and does not lead to a relapse of the acute transplant rejection reaction after a kidney transplant. The ISO-90 antibodies themselves, produced by the strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus L., ICO-90, BCCK (P) 368D, have a wide spectrum of action and high selectivity for various cultures of human T cells.
Таким образом, данное изобретение и предусмотренные им варианты хорошо применимы для достижения целей и результатов, изложенных вначале. В описанные способы и средства могут быть внесены изменения, не влияющие на характер и сферу действия данного изобретения. Предполагается, что каждый элемент или ступень, описанные в каждом из следующих далее пунктов формулы изобретения, следует относить ко всем эквивалентным элементам или ступеням для достижения тех же результатов теми же или равноценными способами. Предполагается расширение сферы действия данного изобретения в любой форме, в которой могут быть использованы его принципы. Thus, this invention and its options are well suited to achieve the goals and results set forth at the beginning. The described methods and means may be modified without affecting the nature and scope of the present invention. It is intended that each element or step described in each of the following claims should be assigned to all equivalent elements or steps in order to achieve the same results in the same or equivalent ways. It is intended to expand the scope of the invention in any form in which its principles may be used.
Список прилагаемой литературы
1. Kohler G., Milstein C. "Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity". "Nature", 1975; 256: 495-497.List of literature
1. Kohler G., Milstein C. "Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity". "Nature", 1975; 256: 495-497.
2. Laurino J.P., Shi Q., Ge J. "Monoclonal antibodies, antigens and molecular diagnostics: a practical overview". "Ann Clin Lab Sci", 1999; 29/3: 158-66. 2. Laurino J.P., Shi Q., Ge J. "Monoclonal antibodies, antigens and molecular diagnostics: a practical overview." "Ann Clin Lab Sci", 1999; 29/3: 158-66.
3. Барышников А. Ю. и др. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. Москва, 1996. 3. Baryshnikov A. Yu. Et al. Monoclonal antibodies in the laboratory and clinic. Moscow, 1996.
4. Cosimi A.B. et al. "Randomized clinical trial of ATG in cadaver renal allograft recipients: importance of T-cell monitoring". "Surgery", 1976; 40: 155-163. 4. Cosimi A.B. et al. "Randomized clinical trial of ATG in cadaver renal allograft recipients: importance of T-cell monitoring." "Surgery", 1976; 40: 155-163.
5. Cosimi A.B., Burton R.C., Colvin R.B. et al. "Treatment of acute renal allograft rejection with OKT3 monoclonal antibody". "Transplantation", 1981; 32: 535-539. 5. Cosimi A.B., Burton R.C., Colvin R.B. et al. "Treatment of acute renal allograft rejection with OKT3 monoclonal antibody." "Transplantation", 1981; 32: 535-539.
6. US патент N 4361549А, 30.11.82. 6. US patent N 4361549A, 11.30.82.
7. US патент N 4515893А, 07.05.85. 7. US patent N 4515893A, 07.05.85.
8. US патент N 4654210А, 31.03.87. 8. US patent N 4654210A, 03.31.87.
9. Ponticelli C., Rivolta E., Tarantino A. et al. "Clinical experience with OKT3 in renal transplantation". "Transplant Proc", 1986; 18: 942-948. 9. Ponticelli C., Rivolta E., Tarantino A. et al. "Clinical experience with OKT3 in renal transplantation." "Transplant Proc", 1986; 18: 942-948.
10. Monaco A., Goldstein G., Barnes L. "Use of OKT3 monoclonal antibody to reverse acute renal allograft rejection unresponsive to treatment with conventional immunosuppressive regimens". "Transplant Proc", 1987; 19: 28-31. 10. Monaco A., Goldstein G., Barnes L. "Use of OKT3 monoclonal antibody to reverse acute renal allograft rejection unresponsive to treatment with conventional immunosuppressive regimens." "Transplant Proc", 1987; 19: 28-31.
11. Иванов П. К. , Барышников А.Ю., Полосухина Е.Р. и др. "Создание и характеристика препарата моноклональных антител для предотвращения реакции острого отторжения трансплантата". Тез. докл. V Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 21-25 апреля 1998 г., с. 489. 11. Ivanov P.K., Baryshnikov A.Yu., Polosukhina E.R. et al. "Creation and characterization of a monoclonal antibody preparation to prevent acute graft rejection reaction." Thes. doc. V Russian National Congress "Man and Medicine", Moscow, April 21-25, 1998, p. 489.
12. Ivanov P.K., Polosukhina E.R., Zabotina T.N. et al. "Study of biological activity of anti-CDS monoclonal antibodies". Proc. 2nd World Meet. API/APV Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharm. Technology, Paris, 25-28 May, 1998, pp. 1189-1190.12. Ivanov PK, Polosukhina ER, Zabotina TN et al. "Study of biological activity of anti-CDS monoclonal antibodies." Proc. 2 nd World Meet. API / APV Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharm. Technology, Paris, 25-28 May, 1998, pp. 1189-1190.
13. Kung P.C., Goldstein G., Reinherz E.L., Schlossman S.F. "Monoclonal antibodies defining dictinctive T-cell surface antigens". "Science", 1979; 206: 347. 13. Kung P.C., Goldstein G., Reinherz E.L., Schlossman S.F. "Monoclonal antibodies defining dictinctive T-cell surface antigens." Science, 1979; 206: 347.
14. Kaneoka H. , Perez-Rojas G., Sasaki T. et al. "Human T-lymphocyte proliferation induced by a pan-T-monoclonal antibody (anti-Leu-4): heterogenicity of response is a function of monoculytes". "J. Immunol", 1983; 13/1: 158-164. 14. Kaneoka H., Perez-Rojas G., Sasaki T. et al. "Human T-lymphocyte proliferation induced by a pan-T-monoclonal antibody (anti-Leu-4): heterogenicity of response is a function of monoculytes." "J. Immunol", 1983; 13/1: 158-164.
Claims (11)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000132445A RU2179862C1 (en) | 2000-12-26 | 2000-12-26 | Medicinal preparation to prevent transplant detachment, monoclonal antibody to cd3 antigen of human t-lymphocytes, hybridome and method to treat patients suffering acute transplant detachment reaction following kidney transplantation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000132445A RU2179862C1 (en) | 2000-12-26 | 2000-12-26 | Medicinal preparation to prevent transplant detachment, monoclonal antibody to cd3 antigen of human t-lymphocytes, hybridome and method to treat patients suffering acute transplant detachment reaction following kidney transplantation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2179862C1 true RU2179862C1 (en) | 2002-02-27 |
Family
ID=20243902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000132445A RU2179862C1 (en) | 2000-12-26 | 2000-12-26 | Medicinal preparation to prevent transplant detachment, monoclonal antibody to cd3 antigen of human t-lymphocytes, hybridome and method to treat patients suffering acute transplant detachment reaction following kidney transplantation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2179862C1 (en) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7728114B2 (en) | 2004-06-03 | 2010-06-01 | Novimmune S.A. | Anti-CD3 antibodies and methods of use thereof |
| RU2456615C1 (en) * | 2011-03-25 | 2012-07-20 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method for preventing cadaver kidney graft rejection |
| RU2559531C2 (en) * | 2008-10-01 | 2015-08-10 | Эмджен Рисерч (Мьюник)ГмбХ | Psma×cd3 bispecific single-chain antibody having interspecies specificity |
| RU2561457C2 (en) * | 2007-04-03 | 2015-08-27 | Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх | Cd3-epsilon-binding domain having interspecies specificity |
| RU2617942C2 (en) * | 2010-04-01 | 2017-04-28 | Эмджин Рисеч (Мюних) ГмбХ | BISPECIFIC SINGLE-CHAIN ANTIBODY TO PSMAxCD3 WITH INTERSPECIES SPECIFICITY |
| RU2673153C2 (en) * | 2012-04-20 | 2018-11-22 | АПТЕВО РИСЁРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ ЭлЭлСи | Polypeptides binding to cd3 |
| RU2738802C1 (en) * | 2019-08-21 | 2020-12-17 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" | Complementarity-determining regions for binding cd3 and a bispecific antigen-binding molecule containing thereof |
| US11248053B2 (en) | 2007-09-26 | 2022-02-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR |
| RU2769948C2 (en) * | 2007-04-03 | 2022-04-11 | Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх | Cd3-epsilon-binding domain with interspecific specificity |
| US11352426B2 (en) | 2015-09-21 | 2022-06-07 | Aptevo Research And Development Llc | CD3 binding polypeptides |
| RU2812875C1 (en) * | 2014-09-26 | 2024-02-05 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Cytotoxicity-inducing therapeutic agent |
-
2000
- 2000-12-26 RU RU2000132445A patent/RU2179862C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10759858B2 (en) | 2004-06-03 | 2020-09-01 | Novimmune S.A. | Anti-CD3 antibodies and methods of use thereof |
| US8551478B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-10-08 | Novimmune S.A. | Anti-CD3 antibodies and methods of use thereof |
| US9850304B2 (en) | 2004-06-03 | 2017-12-26 | Novimmune S.A. | Anti-CD3 antibodies and methods of use thereof |
| US7728114B2 (en) | 2004-06-03 | 2010-06-01 | Novimmune S.A. | Anti-CD3 antibodies and methods of use thereof |
| RU2561457C2 (en) * | 2007-04-03 | 2015-08-27 | Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх | Cd3-epsilon-binding domain having interspecies specificity |
| RU2769948C2 (en) * | 2007-04-03 | 2022-04-11 | Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх | Cd3-epsilon-binding domain with interspecific specificity |
| US11248053B2 (en) | 2007-09-26 | 2022-02-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR |
| RU2559531C2 (en) * | 2008-10-01 | 2015-08-10 | Эмджен Рисерч (Мьюник)ГмбХ | Psma×cd3 bispecific single-chain antibody having interspecies specificity |
| RU2617942C2 (en) * | 2010-04-01 | 2017-04-28 | Эмджин Рисеч (Мюних) ГмбХ | BISPECIFIC SINGLE-CHAIN ANTIBODY TO PSMAxCD3 WITH INTERSPECIES SPECIFICITY |
| RU2456615C1 (en) * | 2011-03-25 | 2012-07-20 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method for preventing cadaver kidney graft rejection |
| US10202452B2 (en) | 2012-04-20 | 2019-02-12 | Aptevo Research And Development Llc | CD3 binding polypeptides |
| RU2673153C2 (en) * | 2012-04-20 | 2018-11-22 | АПТЕВО РИСЁРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ ЭлЭлСи | Polypeptides binding to cd3 |
| RU2812875C1 (en) * | 2014-09-26 | 2024-02-05 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Cytotoxicity-inducing therapeutic agent |
| US11352426B2 (en) | 2015-09-21 | 2022-06-07 | Aptevo Research And Development Llc | CD3 binding polypeptides |
| RU2738802C1 (en) * | 2019-08-21 | 2020-12-17 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" | Complementarity-determining regions for binding cd3 and a bispecific antigen-binding molecule containing thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kirkman et al. | A randomized prospective trial of anti-Tac monoclonal antibody in human renal transplantation | |
| JP5950824B2 (en) | Methods for enhancing anti-tumor antibody therapy | |
| US8133490B2 (en) | Method and system to remove cytokine inhibitors in patients | |
| JP5215723B2 (en) | Use of anti-CX3CR1 antibody, anti-fractalkine antibody and fractalkine | |
| JPH05268986A (en) | Monoclonal antibody and activation of lymphocyte | |
| JPH0159867B2 (en) | ||
| JPH0159868B2 (en) | ||
| JPH05504554A (en) | Methods and compositions for promoting immune enhancement | |
| US20120100156A1 (en) | Therapeutic Agent | |
| JP2979318B2 (en) | Immunotherapy of tumor with monoclonal antibody against 17-1A antigen | |
| RU2179862C1 (en) | Medicinal preparation to prevent transplant detachment, monoclonal antibody to cd3 antigen of human t-lymphocytes, hybridome and method to treat patients suffering acute transplant detachment reaction following kidney transplantation | |
| Ramalho‐Pinto et al. | Murine Schistosomiasis mansoni: anti‐schistosomula antibodies and the IgG subclasses involved in the complement‐and eosinophilmediated killing of schistosomula in vitro | |
| EP2601967A1 (en) | Drug and method for the prophylaxis of hiv infection and for the prophylaxis and treatment of diseases caused by or associated with hiv, including aids | |
| JP2013535483A (en) | Pharmaceutical compositions and methods that inhibit the production of P24 protein or promote elimination | |
| Groenewegen et al. | Supernatants of human leukocytes contain mediator, different from interferon gamma, which induces expression of MHC class II antigens. | |
| US5084391A (en) | Monoclonal antibody to the interleukin-2-receptor and its use | |
| US5643740A (en) | Monoclonal antibody specific for activated lymphocytes and monocytes | |
| Hutt-Fletcher et al. | Studies of the Epstein Barr virus receptor found on Raji cells. II. A comparison of lymphocyte binding sites for Epstein Barr virus and C3d. | |
| EP2087907B1 (en) | Method and system to remove cytokine inhibitor in patients | |
| US20110097314A1 (en) | Method for producing a composition for promoting survival of transplanted hematopoietic stem cell | |
| JP4263391B2 (en) | Use of anti-CX3CR1 antibody, anti-fractalkine antibody and fractalkine | |
| Goldstein | Monoclonal antibody specificity: Orthoclone OKT3 T-cell blocker | |
| US5330896A (en) | Monoclonal antibodies to an autocrine growth factor antigen that binds to activated lymphocytes and cancer cells | |
| JPS62205034A (en) | Tumor therapy by biological antitumor antibody | |
| KR870001375B1 (en) | Process for preparing glycosidic linkage related antigen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181227 |