RU2138162C1

RU2138162C1 - Method of cryoconservation of platelet-riched plasma

Info

Publication number: RU2138162C1
Application number: RU97106292A
Authority: RU
Inventors: В.А. Суханов; И.М. Трофимов; А.Л. Левит
Original assignee: Суханов Владимир Александрович
Priority date: 1997-04-17
Filing date: 1997-04-17
Publication date: 1999-09-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: plasma is placed into plastic container and disposed its between two metallic plates. Then this plasma is subjected for successive stages of freezing, storage and defrosting. Process of plasma freezing is carried out at the rate 2-3 C/s, defrosting - at the rate 1.5-2 C/s up to onset of thawing followed by plasma heating at 37 C. Method ensures to retain up to 98% of functionally active platelets. EFFECT: improved method of plasma cryoconservation. 1 cl, 2 tbl, 1 ex

Description

Заявляемое изобретение относится к области медицины, в частности к способам хранения тромбоцитов путем криоконсервирования, т.е. замораживания в жидком азоте, и может применяться в отделениях реанимации, гематологии, в онкологических клиниках и т.д. The claimed invention relates to medicine, in particular to methods for storing platelets by cryopreservation, i.e. freezing in liquid nitrogen, and can be used in intensive care units, hematology, oncology clinics, etc.

Известны способы криоконсервирования богатой тромбоцитами плазмы, заключающиеся в том, что плазму помещают в пластиковый контейнер, располагают этот контейнер между двумя металлическими пластинами и замораживают в жидком азоте или его парах. Перед замораживанием в плазму вводят криоконсервант, который предупреждает разрушение клеток и утрату их функциональной активности в процессах замораживания, хранения и размораживания. В качестве криоконсерванта обычно используют диметил сульфоксид (ДМСО). Однако после размораживания лишь 40-60% тромбоцитов сохраняют функциональную активность. Это является причиной низкой клинической эффективности плазмы, что естественно не отвечает запросам практической медицины. Кроме того, присутствие криоконсерванта вызывает тяжелые осложнения у больных. Known methods for cryopreservation of platelet-rich plasma, namely, that the plasma is placed in a plastic container, this container is placed between two metal plates and frozen in liquid nitrogen or its vapor. Before freezing, a cryopreservative is introduced into the plasma, which prevents the destruction of cells and the loss of their functional activity in the processes of freezing, storage, and thawing. Dimethyl sulfoxide (DMSO) is usually used as a cryopreservative. However, after thawing, only 40-60% of platelets retain functional activity. This is the reason for the low clinical efficacy of plasma, which naturally does not meet the needs of practical medicine. In addition, the presence of a cryopreservative causes severe complications in patients.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ криоконсервирования богатой тромбоцитами плазмы, заключающийся в том, что плазму, в которую добавляют криоконсервант ДМСО, помещают в пластиковый контейнер. Контейнер располагают между двумя металлическими пластинами и заливают жидким азотом. При этом температура охлаждения составляет -120^oC, а скорость охлаждения 8-10^oC/мин. Время замораживания составляет от 45 мин до 1 часа. Плазму хранят при -120^oC до трех лет. Плазму размораживают, используя водяную баню при температуре 37^oC. Время размораживания занимает от 30 до 45 минут.Closest to the claimed invention is a method of cryopreservation of platelet-rich plasma, which consists in the fact that the plasma into which the cryopreservative DMSO is added is placed in a plastic container. The container is placed between two metal plates and filled with liquid nitrogen. The cooling temperature is -120 ^o C, and the cooling rate of 8-10 ^o C / min. The freezing time is from 45 minutes to 1 hour. Plasma is stored at -120 ^o C for up to three years. Plasma is thawed using a water bath at a temperature of 37 ^o C. Defrosting time takes from 30 to 45 minutes.

В результате способа удается сохранить лишь 40-60% функционально активных тромбоцитов, что делает способ недостаточно эффективным. Другим серьезным недостатком способа является использование криоконсерванта ДМСО. По сведениям ряда авторов использование ДМСО вызывает такие осложнения, как флебиты, поражения печени, помутнение хрусталика глаза. As a result of the method, it is possible to save only 40-60% of functionally active platelets, which makes the method not effective enough. Another serious disadvantage of this method is the use of the cryopreservative DMSO. According to some authors, the use of DMSO causes complications such as phlebitis, liver damage, and clouding of the lens of the eye.

Указанные недостатки известного способа существенно снижают его клинический эффект. These disadvantages of the known method significantly reduce its clinical effect.

Таким образом, основная задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, - это повышение эффективности способа. Thus, the main task to be solved by the claimed invention is directed is to increase the efficiency of the method.

Технический результат выражается в том, что предлагаемые режимы ведения процессов замораживания и размораживания плазмы позволяют сохранить 74-98%, т. е. в среднем 92% функционально активных тромбоцитов. Другим техническим результатом является устранение токсичности плазмы, т.к. предлагаемые режимы способа позволяют сохранить вышеуказанное количество полноценных тромбоцитов без использования токсичных криоконсервантов. The technical result is expressed in the fact that the proposed modes of conducting processes of freezing and thawing plasma allow you to save 74-98%, i.e., an average of 92% of functionally active platelets. Another technical result is the elimination of plasma toxicity, because the proposed modes of the method allow you to save the above number of full platelets without the use of toxic cryopreservatives.

Указанный технический результат обеспечивается всей совокупностью заявляемых признаков. Поставленная задача достигается тем, что в известном способе криоконсервирования богатой тромбоцитами плазмы, заключающемся в том, что плазму помещают в контейнер, располагают его между двумя металлическими пластинами, после чего последовательно подвергают процессам замораживания, хранения и размораживания, новым является то, что процесс замораживания плазмы ведут при скорости 2-3^oC/сек.The specified technical result is provided by the totality of the claimed features. The problem is achieved in that in the known method of cryopreservation of platelet-rich plasma, which consists in placing the plasma in a container, placing it between two metal plates, after which it is subsequently subjected to freezing, storage and defrosting processes, it is new that the plasma freezing process lead at a speed of 2-3 ^o C / sec.

Новым также является то, что процесс размораживания плазмы ведут при скорости 1,5-2^oC/сек до начала таяния, а затем нагревают при температуре 37^oC.Also new is that the process of thawing the plasma is carried out at a speed of 1.5-2 ^o C / sec before melting, and then heated at a temperature of 37 ^o C.

Сравнение заявленной совокупности признаков с известными техническими решениями на момент подачи заявки на изобретение позволило установить, что данная совокупность признаков не известна из уровня техники и, следовательно, является новой. Comparison of the claimed combination of features with known technical solutions at the time of filing the application for the invention made it possible to establish that this set of features is not known from the prior art and, therefore, is new.

Сравнение отличительных признаков заявляемого изобретения с прототипом, а также с другими техническими решениями не выявила из уровня техники решений, совпадающих с заявленными отличительными признаками, что позволяет считать предлагаемое изобретение имеющим изобретательский уровень. Comparison of the distinguishing features of the claimed invention with the prototype, as well as with other technical solutions, did not reveal from the prior art solutions that match the claimed distinctive features, which allows us to consider the present invention as an inventive step.

Заявляемые режимы замораживания и размораживания были получены опытным путем. При этом скорость замораживания примерно равнялась скорости размораживания. После этих процедур проводили исследования сохранения количества тромбоцитов в плазме. Было выявлено, что наибольшее число клеток сохраняется при скорости замораживания 2-3^oC/сек и при скорости размораживания 1,5-2^oC/сек (см. таблицу 1).The inventive modes of freezing and thawing were obtained experimentally. In this case, the speed of freezing was approximately equal to the speed of defrosting. After these procedures, studies were conducted to maintain platelet count in plasma. It was found that the largest number of cells is preserved at a freezing rate of 2-3 ^o C / sec and at a defrosting rate of 1.5-2 ^o C / sec (see table 1).

При этом при замораживании в заявляемом интервале свыше 90% клеток от исходного уровня сохранялось в 22 случаях (61%), свыше 80% - в 12 случаях (33%), а свыше 70% - в 2 случаях (6%). Ниже 70% от исходного уровня не обнаруживали ни в одном из случаев. Moreover, when freezing in the claimed range, over 90% of the cells from the initial level remained in 22 cases (61%), over 80% in 12 cases (33%), and over 70% in 2 cases (6%). Below 70% of the initial level was not detected in any of the cases.

Было установлено, что при замедлении скорости замораживания сохранялось менее 90% тромбоцитов от исходного уровня; при этом в 6 случаях зафиксировали уменьшение числа тромбоцитов ниже 70% от исходного уровня. It was found that when the freezing rate slowed down, less than 90% of platelets from the initial level remained; in 6 cases, a decrease in the number of platelets below 70% of the initial level was recorded.

Таким образом, с замедлением скорости замораживания количество тромбоцитов в плазме значительно и достоверно уменьшается. Thus, with a slowdown in the rate of freezing, the platelet count in the plasma significantly and significantly decreases.

Для изучения влияния найденных опытным путем режимов замораживания и размораживания на функциональную активность тромбоцитов были проведены следующие исследования. Брали две пробы крови от одного донора. Путем центрифугирования крови получали богатую тромбоцитами плазму. Плазму 1-ой пробы помещали на хранение в водяной термостат при температуре 37^oC (контрольная проба). Плазму 2-ой пробы (исследуемая проба) замораживали и размораживали по предлагаемому способу. После размораживания плазму вновь смешивали с эритроцитами (то же самое делали с контрольной пробой) и проводили сравнительные исследования 1-ой и 2-ой проб на функциональную активность тромбоцитов. Результаты исследования представлены в таблице 2.To study the effect of empirically found freezing and thawing regimes on the functional activity of platelets, the following studies were carried out. Two blood samples were taken from one donor. Platelet rich plasma was obtained by centrifuging blood. The plasma of the first sample was placed in storage in a water thermostat at a temperature of 37 ^o C (control sample). Plasma of the 2nd sample (test sample) was frozen and thawed by the proposed method. After thawing, the plasma was again mixed with red blood cells (the same was done with the control sample) and comparative studies of the first and second samples were performed on the functional activity of platelets. The results of the study are presented in table 2.

Как видно из таблицы, снижение количества тромбоцитов в исследуемой пробе по сравнению с контрольной было незначительным. Функция же тромбоцитов в исследуемой пробе после замораживания и размораживания, наоборот, активировалась почти по всем исследуемым параметрам (кроме чувствительности к адреналину). As can be seen from the table, the decrease in platelet count in the test sample compared with the control was insignificant. The platelet function in the test sample after freezing and thawing, on the contrary, was activated in almost all of the studied parameters (except for sensitivity to adrenaline).

Таким образом, связь между заявленными режимами процессов замораживания и размораживания и увеличением эффективности, выражающейся в увеличении количества функционально активных тромбоцитов в плазме, очевидна. Thus, the relationship between the declared modes of the processes of freezing and thawing and an increase in efficiency, expressed in an increase in the number of functionally active platelets in the plasma, is obvious.

Пример. Выполняли замораживание богатой тромбоцитами плазмы. Для этого пластикатный контейнер "Blood Bag CPD 450", содержащий донорскую богатую тромбоцитами плазму (число тромбоцитов в ней 432 • 10⁹/л) поместили между двумя металлическими пластинами. Таким образом обеспечивали ровность слоя плазмы при замораживании. После этого контейнер помещали в емкость и заливали жидким азотом. Температура жидкого азота составляла -196^oC, скорость замораживания ≈2,2^oC/сек. Контейнер с плазмой находился в среде жидкого азота в течение 20 суток. На 20-е сутки произвели размораживание плазмы. Для этого контейнер поместили в водяной термостат, в котором температура была на уровне 90-100^oC. При этой температуре плазма находилась в течение 62 сек до начала ее таяния. Скорость размораживания составляла ≈2^oC/сек. Затем контейнер погружали в другой водяной термостат, температура которого была 37^oC, и выдерживали в нем плазму до полного размораживания. Количество тромбоцитов в плазме после размораживания составило 417 • 10⁹/л, т.е. 97% от исходного. Функциональная активность тромбоцитов, т.е. их прокоагулянтная функция, активировалась по сравнению с исходной (после предварительной инкубации с каолином время свертывания плазмы укоротилось на 19% исходного).Example. Platelet rich plasma was frozen. For this, the plastic bag "Blood Bag CPD 450" containing donor plasma rich in platelets (platelet count 432 • 10 ⁹ / l) was placed between two metal plates. Thus, the plasma layer was even during freezing. After that, the container was placed in a container and filled with liquid nitrogen. The temperature of liquid nitrogen was -196 ^o C, the freezing rate ≈2.2 ^o C / sec. The plasma container was in liquid nitrogen for 20 days. On the 20th day, the plasma was thawed. For this, the container was placed in a water thermostat, in which the temperature was at the level of 90-100 ^o C. At this temperature, the plasma was for 62 seconds before it began to melt. The defrost rate was ≈2 ^o C / sec. Then the container was immersed in another water thermostat, the temperature of which was 37 ^o C, and the plasma was kept in it until completely defrosted. The number of platelets in the plasma after thawing was 417 • 10 ⁹ / l, i.e. 97% of the original. Functional activity of platelets, i.e. their procoagulant function was activated compared to the initial one (after preliminary incubation with kaolin, the plasma coagulation time was shortened by 19% of the initial one).

Представленный материал показывает, что заявляемый способ обладает по сравнению с прототипом следующими преимуществами. The presented material shows that the inventive method has the following advantages in comparison with the prototype.

1. Разработанный способ позволяет сохранить в среднем ≈90% исходного количества тромбоцитов (по прототипу ≈55%). 1. The developed method allows you to save on average ≈90% of the initial number of platelets (prototype ≈55%).

2. Показатели функциональной активности тромбоцитов почти полностью сохраняются. 2. Indicators of the functional activity of platelets are almost completely preserved.

3. Вышеуказанные высокие результаты получены без применения криопротекторов, вызывающих серьезные осложнения у реципиентов. 3. The above high results were obtained without the use of cryoprotectants, causing serious complications in recipients.

Claims

The method of cryopreservation of platelet-rich plasma, namely, that the plasma is placed in a container with liquid nitrogen, a container is placed between two metal plates, after which they are subjected to successive freezing, storage and thawing processes, characterized in that the plasma freezing process is carried out at a speed of 2-3 ^o C / s, the process of thawing - at a speed of 1.5-2 ^o C / s, before melting, and then the plasma is heated at a temperature of 37 ^o C.