RU2102988C1

RU2102988C1 - Preparation showing immunomodulating activity

Info

Publication number: RU2102988C1
Application number: RU95101728A
Authority: RU
Inventors: Е.В. Зинченко; А.Н. Панин; В.Б. Зинченко; В.А. Шмелев; В.М. Колышкин
Original assignee: Зинченко Елена Вениаминовна
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1995-02-10
Publication date: 1998-01-27
Also published as: RU95101728A

Abstract

FIELD: biotechnology, veterinary science. SUBSTANCE: invention proposes medicinal form of highly purified immunologically active preparation based on hybrid protein T-TNF-T. Hybrid protein T-TNF-T is isolated from microorganism where recombinant plasmid pThy325 encoding protein biosynthesis is inserted. Preparation has the following components, wt.-%: hybrid protein 0.0008-0.0015; stabilizing additions 10-20, saline buffer system at pH = 7.0-7.2 1.03-1.06, and water - the rest. Polyglucine, gelatinol, sucrose were used as stabilizing additions and buffered sodium chloride physiological solution - as saline buffer system. Preparation can be used for nonspecific prophylaxis and treatment of infectious diseases. EFFECT: enhanced effectiveness of preparation. 3 cl, 6 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии, а именно к получению лиофилизированных лекарственных форм, обладающих иммуномодулирующей активностью, и может быть использовано для неспецифической профилактики и лечения инфекционных заболеваний. The invention relates to biotechnology and veterinary medicine, in particular to the production of lyophilized dosage forms having immunomodulatory activity, and can be used for non-specific prophylaxis and treatment of infectious diseases.

Известен препарат на основе тимозина α₁-пептидного гормона вилочковой железы [1]. В организме животных N-концевой аминокислотный остаток тимозина ацетилирован. Дезацетилтимозин сохраняет биологическую активность, присущую α₁-тимозину [2] . Тимозин α₁ играет одну из ключевых ролей в становлении и развитии иммунного ответа, обусловливая созревание, дифференцировку и функционирование Т-лимфоцитов, индуцируя появление Т-клеточных поверхностных антигенов, выработку лимфокинов, усиливая противоопухолевый, противоинфекционный иммунитет и эффективность вакцинации, способствуя развитию адекватного вакцинного процесса [3 - 5]. Основным недостатком тимозина фракции [5], выделяемой из гомогенатов тимуса животных, является содержание в готовом препарате большого числа балластных полипептидов, не обладающих полезной биологической активностью, но увеличивающих иммунную нагрузку на организм [5]. Рекомбинантный дезацетилтимозин α, получаемый генноинженерными методами из E. coli, является дорогостоящим продуктом, требующим сложных методов выделения и очистки, таких как жидкостная хроматография высокого давления.Known drug based on thymosin α ₁ -peptide hormone of the thymus gland [1]. In animals, the N-terminal amino acid residue of thymosin is acetylated. Desacetylthymosin retains the biological activity inherent in α ₁ -thymosin [2]. Thymosin α ₁ plays a key role in the formation and development of the immune response, causing the maturation, differentiation and functioning of T-lymphocytes, inducing the appearance of T-cell surface antigens, the production of lymphokines, enhancing anti-tumor, anti-infection immunity and vaccination effectiveness, contributing to the development of an adequate vaccine process [3 - 5]. The main disadvantage of thymosin fraction [5], isolated from animal thymus homogenates, is the content of a large number of ballast polypeptides in the finished preparation that do not have useful biological activity, but increase the immune load on the body [5]. Recombinant deacetylthymosin α, obtained by genetic engineering methods from E. coli, is an expensive product that requires sophisticated isolation and purification methods, such as high pressure liquid chromatography.

Известен также препарат на основе фактора некроза опухолей α₁ (ФНО), обладающий широким спектром биологической активности, однако имеющий существенный недостаток при использовании в качестве терапевтического средства - побочные токсические эффекты [6]. Это обстоятельство ограничивает клиническое применение ФНО.Also known is a preparation based on tumor necrosis factor α ₁ (TNF), which has a wide spectrum of biological activity, but which has a significant drawback when used as a therapeutic agent is toxic side effects [6]. This circumstance limits the clinical use of TNF.

Сконструирована плазмида pThy325, кодирующая субстанцию гибридного белка на основе α₁-тимозина и ФНО (Т-ФНО-Т) [7]. Однако не отработана технология получения полупромышленных количеств хроматографически чистого белка из биомассы микроорганизмов, получение лекарственной формы препарата на основе Т-ФНО-Т, не определены условия, обеспечивающие стабильность белка в составе готовой лекарственной формы, и эффективность его иммунобиологических свойств на животных.Plasmid pThy325 was constructed that encodes a substance of a hybrid protein based on α ₁ -thymosin and TNF (T-TNF-T) [7]. However, the technology for producing semi-industrial amounts of chromatographically pure protein from the biomass of microorganisms has not been worked out, the preparation of the dosage form of the drug based on T-TNF-T has not been determined, the conditions ensuring the stability of the protein in the composition of the finished dosage form and the effectiveness of its immunobiological properties in animals have not been determined.

Задача изобретения - разработка лекарственной формы высокоочищенного иммунобиологически активного препарата на основе гибридного белка Т-ФНО-Т, не имеющего побочных токсических эффектов. The objective of the invention is the development of the dosage form of a highly purified immunobiologically active drug based on the hybrid protein T-TNF-T, which does not have toxic side effects.

Поставленная задача решается тем, что предложен препарат с иммуномодулирующими свойствами, содержащий гибридный белок Т-ФНО-Т, выделенный из микроорганизма, в который введена рекомбинантная плазмида pThy 325, кодирующая синтез белка, стабилизирующие добавки и солевую буферную систему при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Гибридный белок - 0,0008 - 0,0015
Стабилизирующие добавки - 10 - 20
Солевая буферная система pH 7,0 - 7,2 - 1,03-1,06
Вода - Остальное
В качестве стабилизирующих добавок используют полиглюкин, желатиноль, сахарозу, а в качестве солевой буферной системы - физиологический раствор хлорида натрия.The problem is solved by the fact that the proposed drug with immunomodulating properties, containing a hybrid protein T-TNF-T isolated from a microorganism, into which a recombinant plasmid pThy 325 was introduced, encoding protein synthesis, stabilizing additives and salt buffering system in the following ratio of components, wt. %:
Hybrid Protein - 0.0008 - 0.0015
Stabilizing Additives - 10 - 20
Salt buffer system pH 7.0 - 7.2 - 1.03-1.06
Water - Else
Polyglucin, gelatinol, sucrose are used as stabilizing additives, and physiological sodium chloride solution is used as a salt buffer system.

Предложенный препарат получил название НЕОТИМ NC. The proposed drug was called NEOTIM NC.

Пример 1. Способ получения белка Т-ФНО-Т и препарата на его основе. Для получения гибридного белка Т-ФНО-Т используют культуру Escherichia coli, несущую рекомбинантную плазмидную ДНК pThy 325, кодирующую синтез белка α-α₁-тимозин - фактор некроза опухолей α₁-тимозин.Example 1. A method of obtaining a protein T-TNF-T and a drug based on it. To obtain the T-TNF-T fusion protein, an Escherichia coli culture is used, carrying the recombinant plasmid DNA pThy 325 encoding the synthesis of α-α ₁ -thymosin protein - tumor necrosis factor α ₁ -thymosin.

Штамм E.coli SG20050 трансформируют плазмидной pThy 325 следующим образом. Культуру E.coli SG20050, полученную после хранения на косяках в полужидком агаре под вазелиновым маслом, засевают в 5 мл LB-больона, содержащего 0,5% триптона, 1% дрожжевого экстракта, 1% NaCl при pH 7,2 и температуре 37^oC. Полученной культурой засевают колбы с LB-бульоном объемом 250 - 500 мл и термостатируют на качалке при температуре 37^oC до оптической плотности суспензии 0,3 при длине волны 590 нм по фотоэлектроколориметру. Из полученной суспензии отбирают 100 мл культуры и центрифугируют при 300 g и температуре 4^oC в течение 10 мин. Клеточный осадок суспендируют в 50 мл 0,1 М раствора CaCl₂, охлажденного до 0^oC. Приготовленные таким образом компетентные клетки в количестве 0,2 мл смешивают 2 мгк плазмидной ДНК pThy325 и инкубируют при температуре 0^oC в течение 1 ч, затем 5 мин при температуре 42^oC. Трансформированную культуру вносят в 100 мл нагретого до температуры 37^oC LB-бульона и инкубируют при указанной температуре 1,0 - 1,5 ч. Приготовленной посевной культурой свежеполученного трансформанта в количестве 100 мл засевают ферментер вместимостью 10 л в объем среды (LB-бульон с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл) 7 л и культивируют при температуре 37^oC, частоте перемешивания 250 - 300 мин^-1 и аэрировании среды с расходом воздуха 0,5 л/мин на 1 л среды до выхода культуры на стационарную фазу роста. По окончании культивирования берут пробу суспензии для определения уровня синтеза гибридного белка методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле в системе диск-фореза (ДСН-ПААГ).The E. coli strain SG20050 was transformed with plasmid pThy 325 as follows. The culture of E. coli SG20050, obtained after storage on jambs in semi-liquid agar under liquid paraffin, is seeded in 5 ml of LB-Bologna containing 0.5% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl at pH 7.2 and a temperature of 37 ^o C. The resulting culture inoculated flasks with LB-broth with a volume of 250 - 500 ml and thermostat on a shaker at a temperature of 37 ^o C to an optical density of suspension of 0.3 at a wavelength of 590 nm according to a photoelectric colorimeter. 100 ml of culture are taken from the resulting suspension and centrifuged at 300 g and a temperature of 4 ^° C for 10 minutes. The cell pellet is suspended in 50 ml of a 0.1 M CaCl ₂ solution cooled to 0 ^° C. The thus prepared competent cells in an amount of 0.2 ml are mixed with 2 μg of pThy325 plasmid DNA and incubated at 0 ^° C. for 1 hour, then 5 min at a temperature of 42 ^o C. The transformed culture is introduced into 100 ml of LB broth heated to a temperature of 37 ^o C and incubated at the indicated temperature for 1.0-1.5 hours. A fermenter with a capacity of 10 ml is sown with 100 ml of freshly prepared transformant seeded. L per volume of medium (LB broth with ampicillino m at a concentration of 50 μg / ml) 7 l and cultivated at a temperature of 37 ^o C, a stirring frequency of 250 - 300 min ^-1 and aerating the medium with an air flow rate of 0.5 l / min per 1 l of medium until the culture reaches the stationary growth phase. At the end of cultivation, a suspension sample is taken to determine the level of synthesis of the hybrid protein by electrophoresis in a 15% polyacrylamide gel in a disc phoresis system (SDS-PAGE).

Полученную трансформированную культуру осаждают центрифугированием (можно использовать сепарирование, микрофильтрацию) и полученный концентрат суспендируют в лизирующем буфере следующего состава: 20 мМ трис-HCl pH 7,5; 5 мМ Na-ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторида из расчета 1 г сырой клеточной биомассы в 10 мл буфера. Клетки в лизирующем буфере разрушают также одним из принятых методов, например, замораживанием до температуры -70^oC и оттаиванием до температуры 4^oC. Лизат центрифугируют в течение 10 мин при температуре 4^oC и 5000 g, затем надосадочную жидкость сливают, а осадок повторно ресуспендируют в лизирующем буфере в указанном выше соотношении - 1 г осадка на 10 мл буфера - и повторяют центрифугирование по приведенному ранее режиму. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют при соотношении 1 : 10 в 6 М растворе мочевины и еще раз центрифугируют. Полученная таким образом надосадочная жидкость представляет собой раствор гибридного белка Т-ФНО-Т 60 - 70%-ной электрофоретической чистоты.The resulting transformed culture is precipitated by centrifugation (separation, microfiltration can be used) and the resulting concentrate is suspended in a lysis buffer of the following composition: 20 mM Tris-HCl pH 7.5; 5 mM Na-EDTA and 1 mM phenoxymethylsulfonyl fluoride based on 1 g of crude cell biomass in 10 ml of buffer. Cells in the lysis buffer are also destroyed by one of the accepted methods, for example, by freezing to a temperature of -70 ^o C and thawing to a temperature of 4 ^o C. The lysate is centrifuged for 10 min at a temperature of 4 ^o C and 5000 g, then the supernatant is drained and the precipitate re-resuspended in lysis buffer in the above ratio - 1 g of sediment per 10 ml of buffer - and centrifugation is repeated according to the previously described mode. The supernatant is drained, the precipitate is resuspended at a ratio of 1: 10 in a 6 M urea solution and centrifuged again. The supernatant thus obtained is a solution of the T-TNF-T 60 fusion protein of 70% electrophoretic purity.

Характеристика белка:
1 Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys
16 Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asp Pro
31 Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
46 Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg
61 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln
76 Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val
91 Leu Phe Val Gly Gln Glu Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
106 His Thr Lys Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
121 Leu Leu Ile Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu
136 Gly Ala Ser Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly
151 Val Phe Glu Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn
166 Arg Pro Gln Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe
181 Gly Ile Asp Ala Leu Ile Fsp Met Ser Asp Ala Ala Val Asn Thr
196 Ser Ser Ile Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lus Lys Glu Val
211 Val Glu Glu Ala Glu Asn
Количество аминокислотных остатков 216. Молекулярный вес 23783D. Изоэлектрическая точка 4,46.Protein Characteristic:
1 Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys
16 Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asp Pro
31 Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
46 Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg
61 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln
76 Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val
91 Leu Phe Val Gly Gln Glu Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
106 His Thr Lys Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
121 Leu Leu Ile Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu
136 Gly Ala Ser Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly
151 Val Phe Glu Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn
166 Arg Pro Gln Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe
181 Gly Ile Asp Ala Leu Ile Fsp Met Ser Asp Ala Ala Val Asn Thr
196 Ser Ser Ile Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lus Lys Glu Val
211 Val Glu Glu Ala Glu Asn
The number of amino acid residues is 216. The molecular weight is 23783D. Isoelectric point 4.46.

Способ хроматографической очистки белка является предметом "ноу-хау". The method of chromatographic purification of protein is the subject of know-how.

Хроматографически чистый белок, диализованный против солевой буферной системы с pH 7,0 - 7,2 с десятикратным количеством буфера против раствора белка с содержанием целевого белка не менее 95% от общего белка и с концентрацией не менее 300±10 мкг/мл смешивают с раствором стабилизатора и солевой буферной системы в соотношении, обеспечивающем расчетное содержание белка 11±1 мкг/мл или 105±2 мкг/мл при следующем соотношении веществ в растворе, мас.%:
Гибридный белок - 0,001
Полиглюкин - 15
Забуференный физиологический раствор (ЗФР) - 1,03
Вода - Остальное
Рабочий раствор белка с концентрацией 10 мкг/мл или 100 мкг/мл в стабилизирующей солевой системе разливают в ампулы или пенициллиновые флаконы соответственно по 1 мл, замораживают и лиофилизируют до остаточной влажности не выше 5%, после чего флаконы закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, а ампулы запаивают по общепринятой технологии.Chromatographically pure protein dialyzed against a salt buffer system with a pH of 7.0 - 7.2 with ten times the amount of buffer against a protein solution with a target protein content of at least 95% of the total protein and with a concentration of at least 300 ± 10 μg / ml is mixed with a solution stabilizer and saline buffer system in a ratio that provides a calculated protein content of 11 ± 1 μg / ml or 105 ± 2 μg / ml in the following ratio of substances in solution, wt.%:
Hybrid Protein - 0.001
Polyglukin - 15
Buffered saline (PBS) - 1.03
Water - Else
A working protein solution with a concentration of 10 μg / ml or 100 μg / ml in a stabilizing salt system is poured into ampoules or penicillin vials, respectively, 1 ml each, frozen and lyophilized to a residual moisture content of not more than 5%, after which the vials are closed with rubber stoppers and wrapped in aluminum caps , and the ampoules are sealed using conventional technology.

Пример 2. Способ получения белка Т-ФНО-Т и препарата на его основе. Для получения гибридного белка Т-ФНО-Т используют культуру Salmonella dublin S. 6, несущую рекомбинантную плазмиду ДНК pTh325, кодирующую синтез белка α-α₁-тимозин - фактор некроза опухолей α₁-тимозин.Example 2. A method of obtaining a protein T-TNF-T and a drug based on it. To obtain the T-TNF-T fusion protein, a Salmonella dublin S. 6 culture is used that carries the recombinant plasmid pTh325 DNA encoding the synthesis of protein α-α ₁ -thymosin - tumor necrosis factor α ₁ -thymosin.

Остальное приготовление препарата выполняется в соответствии с примером 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Гибридный белок - 0,0008
Желатиноль - 10
ЗФР - 1,06
Вода - Остальное
По указанной схеме можно получать гибридный белок и препарат на его основе, используя любой микроорганизм, в котором экспрессируется рекомбинантная ДНК, кодирующая синтез белка α-α₁-тимозин - фактор некроза опухолей α₁-тимозин.The rest of the preparation is carried out in accordance with example 1 in the following ratio of components, wt.%:
Hybrid Protein - 0.0008
Gelatinol - 10
SFR - 1.06
Water - Else
According to this scheme, it is possible to obtain a hybrid protein and a preparation based on it using any microorganism in which recombinant DNA is expressed that encodes the synthesis of protein α-α ₁ -thymosin - tumor necrosis factor α ₁ -thymosin.

Пример 3. Проверка стабильности и активности препарата при хранении в лиофилизированном состоянии. В качестве контроля взят 15%-ный полиглюкин. Образцы препаратов 1-3 и контроля готовят и высушивают как в примере 1. Стабильность препаратов и активность иммунобиологической субстанции оценивают до и после хранения при температуре 4±2^oC и при 25±2^oC в течение 18 - 24 мес. После регидратации препарата в 1,0 мл воды для инъекций измеряют стабильность гибридного белка электрофоретическим методом в системе 15%-ной ПААГ-ДСН, определяя долю сохранившегося нативного мономера с молекулярной массой 24 кД по отношению к исходному количеству белка. Активность препарата определяют по индексу стимуляции антителопродукции. Для анализа интенсивности антителопродукции на тимусзависимые антигены мышей внутрибрюшинно иммунизируют эритроцитами барана в дозе 5•10⁷ клеток и одновременно вводят исследуемый препарат в дозах 3•10^-7 М. После иммунизации определяют количество антителообразующих клеток (АОК) среди 10⁶ клеток селезенки с помощью теста гемолиза эритроцитов. Результаты представляют в виде индекса стимуляции как отношение количества АОК в опыте к контрольному (контроль - АОК мыши, которой не вводился препарат). Индекс стимуляции должен составлять около 2.Example 3. Checking the stability and activity of the drug during storage in a lyophilized state. As a control taken 15% polyglucin. Samples of preparations 1-3 and control are prepared and dried as in example 1. The stability of the preparations and the activity of the immunobiological substance are evaluated before and after storage at a temperature of 4 ± 2 ^o C and at 25 ± 2 ^o C for 18 to 24 months. After rehydration of the drug in 1.0 ml of water for injection, the stability of the hybrid protein is measured by electrophoretic method in a 15% SDS page-SDS system, determining the fraction of the preserved native monomer with a molecular weight of 24 kD relative to the initial amount of protein. The activity of the drug is determined by the stimulation index of antibody production. To analyze the intensity of antibody production for thymus-dependent antigens, mice are immunized intraperitoneally with sheep erythrocytes at a dose of 5 • 10 ⁷ cells and the test drug is administered at doses of 3 • 10 ^-7 M. at the same time. After immunization, the number of antibody-forming cells (AOKs) among 10 ⁶ spleen cells is determined using a test erythrocyte hemolysis. The results are presented in the form of a stimulation index as the ratio of the amount of AOK in the experiment to the control (control - AOK of the mouse, which was not administered the drug). The stimulation index should be around 2.

Полученные данные приведены в табл. 1, где прослежено влияние стабилизирующих веществ на стабильность и активность гибридного белка Т-ФНО-Т при хранении в лиофилизированном состоянии
Из табл. 1 следует, что максимальная стабилизация белка в составе препарата обеспечивается при использовании полиглюкина и желатиноля, позволяя сохранить активность белка на исходном уровне в течение двух лет при температуре хранения 4±2^oC. При температуре 25±2^oC препарат может храниться не более 1- 2 мес., что дает возможность транспортировки препарата при обычных условиях в указанные сроки без потери активности.The data obtained are given in table. 1, where the effect of stabilizing substances on the stability and activity of the T-TNF-T fusion protein during storage in a lyophilized state is traced
From the table. 1 it follows that the maximum stabilization of the protein in the composition of the drug is provided when using polyglucin and gelatin, allowing you to maintain the protein activity at the initial level for two years at a storage temperature of 4 ± 2 ^o C. At a temperature of 25 ± 2 ^o C, the drug can be stored no more than 1 - 2 months, which makes it possible to transport the drug under normal conditions at the indicated times without loss of activity.

Пример 4. Проверка стабильности и активности препарата при хранении в регидратированном состоянии. Предлагаемый препарат готовят, как в примере 1, с концентрацией гибридного белка перед сушкой 10 мкг/мл и после лиофилизации рабочего раствора, разлитого по 1 мл, препарат регидратируют соответственно в 1,0 мл (образец 1) и 10 мл (образец 2) воды для инъекций, а затем проверяют сохранение активности гибридного белка Т-ФНО-Т в процессе хранения при температуре 4±2 и 20±2^oC в течение 20 суток (табл.2) в полученных растворах с физиологической концентрацией солей.Example 4. Verification of the stability and activity of the drug during storage in a rehydrated state. The proposed drug is prepared, as in example 1, with a concentration of the hybrid protein before drying 10 μg / ml and after lyophilization of the working solution spilled in 1 ml, the drug is rehydrated in 1.0 ml (sample 1) and 10 ml (sample 2) of water, respectively for injection, and then check the preservation of the activity of the T-TNF-T fusion protein during storage at a temperature of 4 ± 2 and 20 ± 2 ^o C for 20 days (table 2) in the obtained solutions with physiological salt concentration.

Из представленных данных в табл. 2 следует, что предложенный комплекс веществ, входящий в состав препарата, обеспечивает сохранение исходных свойств белка Т-ФНО-Т в регидратированном состоянии в течение 10 суток при температуре 4±2^oC.From the data presented in table. 2 it follows that the proposed complex of substances, which is part of the drug, ensures the preservation of the initial properties of the protein T-TNF-T in a rehydrated state for 10 days at a temperature of 4 ± 2 ^o C.

Пример 5. Влияние препарата НЕОТИМ NC на развитие гуморального иммунитета при вакцинации против бактериальных инфекций. Установлено, что становление и развитие противоинфекционного иммунитета к заболеванию, вызываемому Yersinia pestis, в организме животного связано прежде всего с выработкой специфических иммуноглобулинов класса M (IgM) [8]. Влияние препарата на эффективность вакцинации проверяют с использованием беспородных белых мышей массой 18 - 20 г и морских свинок массой 250 - 300 г. Препарат после регидратации в воде для инъекций вводят в дозе 10 мкг на одно животное подкожно в одну заднюю лапу, а вакцину - в другую. Вакцинацию проводят живым штаммом Y. pestis EV76 в дозе (1,0 - 2,0)•10⁵ микробных клеток. Последующее заражение проводят вирулентным штаммом Y.pestis 231 в дозах от 10² до 10⁵ микробных клеток в группах по шести животных на дозу. Морских свинок заражают подкожно и интратрахеально (табл. 3), а белых мышей - внутрибрюшинно (табл. 4). Наблюдения ведут в течение 21 суток, определяют величину LD₅₀ и среднюю продолжительность жизни павших животных (Т_ж).Example 5. The effect of the NEOTIM NC preparation on the development of humoral immunity during vaccination against bacterial infections. It has been established that the formation and development of anti-infectious immunity to the disease caused by Yersinia pestis in the animal’s body is primarily associated with the production of specific class M immunoglobulins (IgM) [8]. The effect of the drug on the effectiveness of vaccination is checked using outbred white mice weighing 18 - 20 g and guinea pigs weighing 250 - 300 g. After rehydration in water for injection, the drug is administered at a dose of 10 μg per animal subcutaneously in one hind paw, and the vaccine in another one. Vaccination is carried out with a live strain of Y. pestis EV76 at a dose of (1.0 - 2.0) • 10 ⁵ microbial cells. Subsequent infection is carried out with a virulent strain of Y. pestis 231 in doses of 10 ² to 10 ⁵ microbial cells in groups of six animals per dose. Guinea pigs are infected subcutaneously and intratracheally (Table 3), and for white mice intraperitoneally (Table 4). Observations are carried out for 21 days, determine the value of LD ₅₀ and the average life expectancy of dead animals (T _g ).

Результаты вакцинации (табл. 3 и 4) сравнивают с аналогичными данными, полученными при использовании в качестве адъюванта тимозин α и вакцинации без адъюванта (контроль). The vaccination results (Tables 3 and 4) are compared with similar data obtained using thymosin α as an adjuvant and vaccination without adjuvant (control).

Сравнение результатов, полученных на белых мышах и морских свинках, показывают, что использование препарата гибридного белка Т-ФНО-Т в качестве адъюванта при вакцинации против чумы обеспечивает снижение LD₅₀ в 50 - 100 раз по сравнению с контролем и сохранение этих показателей примерно на том же уровне по сравнению с применением в качестве адъюванта тимозина α₁.A comparison of the results obtained in white mice and guinea pigs shows that the use of the preparation of the hybrid protein T-TNF-T as an adjuvant for vaccination against plague provides a reduction in LD _{50 by} 50-100 times compared with the control and the preservation of these indicators approximately the same level as compared with thymosin α ₁ as adjuvant.

В табл. 5 представлены данные по влиянию разовых доз (0,8; 4,0 и 20,0 мкг) препарата НЕОТИМ NC, вводимого морским свинкам при экспериментальном интратрахеальном заражении вакцинированных животных вирулентным штаммом Y. pestis на устойчивость животных к инфекции. In the table. Figure 5 presents data on the effect of single doses (0.8, 4.0, and 20.0 μg) of NEOTIM NC, administered to guinea pigs during experimental intratracheal infection of vaccinated animals with a virulent Y. pestis strain on animal resistance to infection.

Полученные данные показывают, что максимальный эффект достоверного увеличения LD₅₀ и Т_ж соблюдается при однократном введении 4 - 20 мкг препарата в расчете по действующему веществу (Т-ФНО-Т).The data obtained show that the maximum effect of a significant increase in LD ₅₀ and T _g is observed with a single injection of 4 - 20 μg of the drug, calculated on the active substance (T-TNF-T).

Пример 6. Применение препарата в качестве адъюванта при вакцинации птицы против вирусных инфекций. Известно, что становление и развитие адекватного напряженного иммунного процесса при вирусных инфекциях связано с кооперативным функционированием как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета при активном участии в нем макрофагов [9]. Example 6. The use of the drug as an adjuvant in vaccination of birds against viral infections. It is known that the formation and development of an adequate intense immune process in viral infections is associated with the cooperative functioning of both cellular and humoral immunity with the active participation of macrophages [9].

Препарат НЕОТИМ NC используют в качестве адъюванта при интраназальной вакцинации молодняка кур-несушек в возрасте 45 суток в количестве 50000 голов против инфекционного ларинготрахеита и ньюкастлской болезни птиц совместно с вакцинами из штаммов "ВНИИБП" и "Бор-74 ВГНКИ" соответственно. Доза препарата в расчете на одну голову 2,0 - 2,5 мкг по гибридному белку Т-ФНО-Т. Эффективность вакцинации оценивают путем определения титра специфических антител в крови птицы по реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в опытной и контрольной (без применения НЕОТИМА NC) и по сохраняемости поголовья. The drug NEOTIM NC is used as an adjuvant for intranasal vaccination of young laying hens at the age of 45 days in the amount of 50,000 heads against infectious laryngotracheitis and Newcastle disease of birds in conjunction with vaccines from the VNIIBP and Bor-74 VGNKI strains, respectively. The dose of the drug per head 2.0 - 2.5 μg for the hybrid protein T-TNF-T. Vaccination efficacy is assessed by determining the titer of specific antibodies in the blood of a bird by the hemagglutination inhibition test (RTGA) in the experimental and control (without the use of NEOTIMA NC) and by the liveability of the livestock.

Показатели эффективности вакцинации молодняка кур несушек с применением и без применения НЕОТИМА NC приведены в табл. 6. The efficacy indicators of vaccination of young laying hens with and without NEOTIMA NC are given in table. 6.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что использование в качестве адъюванта препарата НЕОТИМ NC привело к 100%-ной отвечаемости опытного стада на вакцинацию, при этом 80% из них имели средний титр 1/8 - 1/32, в то время как в контрольном стаде наблюдались как полная неотвечаемость на вакцинацию, так и разброс по титрам антител, что свидетельствует о иммуномодулирующих свойствах предлагаемого белка. Показатели выживаемости птицы также свидетельствуют о целесообразности использования иммуномодулятора при вакцинации, так как в опытном стаде она составила на 98-е сутки жизни птицы 86,5%, в то время как в опытной на 73-и сутки этот показатель составил 83,1%. An analysis of the obtained data allows us to conclude that the use of NEOTIM NC as an adjuvant led to a 100% response rate of the experimental herd to vaccination, with 80% of them having an average titer of 1/8 - 1/32, while in the control the herd was observed as complete non-response to vaccination, as well as a spread in antibody titers, which indicates the immunomodulating properties of the proposed protein. Poultry survival rates also indicate the advisability of using an immunomodulator in vaccination, since in the experimental herd it amounted to 86.5% on the 98th day of life of the bird, while in the experimental herd on the 73rd day this indicator was 83.1%.

Пример 7. Применение препарата НЕОТИМ NC в качестве адъюванта при вакцинации собак против вирусных инфекций. Препарат получают как в примере 1. Оценивается эффективность вакцинации собак против чумы плотоядных, парвовирусного энтерита и аденовирусных инфекций при применении в дозах 10 мкг Т-ФНО-Т при первичной вакцинации и 20 мкг - при вторичной независимо от веса прививаемого животного (для собак весом до 5 кг доза препарата уменьшается в два раза). При вакцинациях применялись вакцины отечественного производства, выпускаемые без адъювантов: вакцина из штамма ЭПМ против чумы собак сухая; вакцина против аденовирусных инфекций и парвовирусного энтерита собак (Триовак), Мультикан II и Мультикан IV. Проведена вакцинация 63 собак различных пород: шнауцеры, овчарки, ротвейлеры, пудели, доберманы-пинчеры, боксеры, пекинесы и т.д. по схемам и в сроки, рекомендуемые в наставлении по применению вакцин. В качестве контроля использовали данные по вакцинации собак указанными вакцинами без применения препарата. Всего было привито 102 животных. Из общего числа животных, прививаемых с адъювантом, у 10 - 15 на вторые или третьи сутки отмечалось незначительное снижение аппетита, которое восстанавливалось на следующие сутки. Других побочных действий отмечено не было. Подобная реакция на вакцинацию отмечалась и у животных, вакцинированных без применения НЕОТИМА NC. В течение срока наблюдения за привитыми животными (1 год) случаев заболевания инфекциями, против которых делались прививки, не отмечалось. Все собаки развивались без отклонений от нормы, отличались хорошим аппетитом и нормальным половым созреванием. Example 7. The use of the drug NEOTIM NC as an adjuvant in vaccinating dogs against viral infections. The preparation is obtained as in example 1. The effectiveness of vaccinating dogs against plague of carnivores, parvovirus enteritis and adenovirus infections is evaluated when used in doses of 10 μg T-TNF-T for primary vaccination and 20 μg for secondary, regardless of the weight of the vaccinated animal (for dogs weighing up to 5 kg dose is halved). When vaccinations were used, domestic vaccines produced without adjuvants: the vaccine from the strain of EPM against dog plague is dry; Dog vaccine against adenovirus infections and parvovirus enteritis (Triovac), Multican II and Multican IV. Vaccination of 63 dogs of various breeds was carried out: schnauzers, shepherd dogs, rottweilers, poodles, Dobermann pinschers, boxers, Pekingese, etc. according to the schemes and terms recommended in the manual for the use of vaccines. As a control, we used data on vaccination of dogs with these vaccines without the use of the drug. A total of 102 animals were vaccinated. Of the total number of animals vaccinated with adjuvant, 10-15 on the second or third day showed a slight decrease in appetite, which was restored on the next day. No other side effects were noted. A similar reaction to vaccination was observed in animals vaccinated without NEOTIMA NC. During the period of observation of vaccinated animals (1 year), there were no cases of infections against which vaccinations were given. All dogs developed without deviations from the norm, had a good appetite and normal puberty.

Среди собак, привитых без применения НЕОТИМА NC, было зарегистрировано 5 случаев заболевания чумой, 7 случаев заболевания вирусным энтеритом и 3 случая заболевания аденовирусной инфекцией, протекающей по типу инфекционного гепатита. Данные получены в Новгородском совхозе-техникуме, о чем составлен акт испытаний. Among dogs vaccinated without the use of NEOTIMA NC, 5 cases of plague, 7 cases of viral enteritis and 3 cases of adenovirus infection proceeding as an infectious hepatitis were registered. The data were obtained at the Novgorod state farm technical school, about which a test report was drawn up.

Пример 8. Применение препарата НЕОТИМ NC в качестве терапевтического средства при лечении вирусных заболеваний собак. Препарат получают как в примере 1. Оценивается эффективность препарата при лечении вирусных заболеваний собак: чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, инфекционного гепатита, аденовирусной инфекции верхних дыхательных путей. Препарат используется в дозах 10 мкг на 10 кг массы животного, но не более 100 мкг на один прием. Вводится внутримышечно или перорально в растворе по пункту 2. Example 8. The use of the drug NEOTIM NC as a therapeutic agent in the treatment of viral diseases of dogs. The drug is obtained as in example 1. The effectiveness of the drug in the treatment of dog viral diseases is evaluated: carnivorous plague, parvovirus enteritis, infectious hepatitis, adenovirus infection of the upper respiratory tract. The drug is used in doses of 10 μg per 10 kg of animal weight, but not more than 100 μg at a time. It is administered intramuscularly or orally in the solution according to paragraph 2.

1. Чума плотоядных. Пролечено 53 собаки различных пород. Диагноз ставился на основании клинических признаков и серологических данных с использованием метода ИФА со специфическим антигенами (Санкт-Петербург, биоцентр Чин). При лечении начальной формы заболевания на 1 - 3 сутки проявления клинических признаков НЕОТИМ NC применяли совместно с препаратами традиционной терапии по следующей схеме: в течение 3 дней по 1 инъекции в дозе 10 мкг в 1 мл на животное весом более 5 кг и 0,5 мл этого раствора при меньшем весе собаки. Одновременно препарат дается перорально в указанной дозировке в течение 7 - 14 дней. Из 24 животных все выжили без признаков каких-либо осложнений. При лечении в поздние сроки обращения на фоне развившейся легочной и нервной форм схема лечения оставалась аналогичной, однако курс инъекций повторяли через 3 дня. Из 29 собак 10 погибли, так как животные были в терминальном состоянии и на момент начала лечения развилась острая легочная и сердечная недостаточность. Остальные 19 животных выздоровели без признаков осложнений (тики, парезы). 1. Plague of carnivores. 53 dogs of various breeds were treated. The diagnosis was made on the basis of clinical signs and serological data using the ELISA method with specific antigens (St. Petersburg, Chin Biocenter). When treating the initial form of the disease on days 1-3, the clinical signs of NEOTIM NC were used in conjunction with traditional therapy drugs according to the following scheme: for 3 days, 1 injection at a dose of 10 μg in 1 ml per animal weighing more than 5 kg and 0.5 ml this solution with less dog weight. At the same time, the drug is given orally at the indicated dosage for 7-14 days. Of the 24 animals, all survived without signs of any complications. When treating in the later stages of treatment against the background of developed pulmonary and nervous forms, the treatment regimen remained similar, however, the injection course was repeated after 3 days. Of 29 dogs, 10 died because the animals were in a terminal state and, at the time of treatment, acute pulmonary and heart failure developed. The remaining 19 animals recovered without signs of complications (tics, paresis).

2. Инфекционный гепатит. Схема лечения как при чуме плотоядных. Пролечено 14 собак, эффективность лечения составила 100%. Особенно отмечено благотворное влияние препарата на восстановление функций печени. Все собаки выздоровели без необходимости соблюдения профилактической диеты. 2. Infectious hepatitis. The treatment regimen as with carnivore plague. 14 dogs were treated, the treatment efficiency was 100%. Especially noted the beneficial effect of the drug on the restoration of liver function. All dogs recovered without the need for a preventive diet.

3. Аденовирусные инфекции с поражением подчелюстных лимфоузлов и верхних дыхательных путей. Лечение по схеме начальной стадии чумы, особо указано на нецелесообразность применения препарата более 3 сут. Эффективность лечения составила 100%, всего было пролечено 70 собак. 3. Adenoviral infections with damage to the submandibular lymph nodes and upper respiratory tract. Treatment according to the scheme of the initial stage of the plague, specifically indicated on the inappropriateness of using the drug for more than 3 days. The treatment efficiency was 100%, in total 70 dogs were treated.

4. Энтериты вирусной природы. При лечении этой группы заболеваний показана наибольшая эффективность препарата с выраженным действием уже через 5 - 6 ч после применения. При этом отмечается прекращение рвоты и диарейного синдрома, даже в случае кровавого профузного поноса. Препарат применяют по схеме лечения чумы в начальной стадии заболевания в сочетании с препаратами, восстанавливающими водно-солевой баланс. При лечении энтеритов вирусной природы особое внимание необходимо уделять восстановлению нормального функционирования сердечно-сосудистой системы, так как препарат может приводить к ее повышению. Всего было пролечено 70 собак, из которых 12 погибло, так как на момент лечения они находились в коматозном терминальной состоянии. 4. Enteritis of viral nature. In the treatment of this group of diseases, the greatest effectiveness of the drug with a pronounced effect is shown after 5-6 hours after application. At the same time, cessation of vomiting and diarrheal syndrome is noted, even in the case of bloody profuse diarrhea. The drug is used according to the treatment plan for plague in the initial stage of the disease in combination with drugs that restore the water-salt balance. In the treatment of enteritis of viral nature, special attention must be paid to restoring the normal functioning of the cardiovascular system, since the drug can lead to its increase. A total of 70 dogs were treated, of which 12 died, because at the time of treatment they were in a coma terminal state.

Таким образом, разработан новый иммунологический препарат НЕОТИМ NC, содержащий в качестве действующего начала рекомбинантный гибридный полипептид, состоящий из фактора некроза опухолей α₁ и тимозина- α-α₁ в следующем сочетании компонентов: α₁ -тимозин - фактор некроза опухолей α₁ -тимозин. Препарат обладает выраженным действием на B- и T-звенья иммунной системы, стимулируя развитие адекватного напряженного иммунного ответа при вакцинации от бактериальных вирусных инфекций и повышая неспецифическую резистентность организма при применении для лечения вирусных заболеваний. Препарат не имеет побочных токсических эффектов.Thus, a new immunological preparation, NEOTIM NC, was developed, containing, as an active principle, a recombinant hybrid polypeptide consisting of tumor necrosis factor α ₁ and thymosin-α-α ₁ in the following combination of components: α ₁ -thymosin - tumor necrosis factor α ₁ -thymosin . The drug has a pronounced effect on the B- and T-links of the immune system, stimulating the development of an adequate tense immune response during vaccination against bacterial viral infections and increasing the nonspecific resistance of the body when used to treat viral diseases. The drug has no toxic side effects.

Источники информации
1. Яковлев Г. М. , Новиков В.С., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Механизмы биорегуляции. - СПб.: Наука, 1992, 40 с.(Биорегуляция).Sources of information
1. Yakovlev G. M., Novikov V. S., Havinson V. Kh., Morozov V. G. The mechanisms of bioregulation. - St. Petersburg: Nauka, 1992, 40 pp. (Bioregulation).

2. Bistoni F., Baccarini M., Blasi E., at al. Thymus, 1985, v.7, N 2, р. 69 - 84. 2. Bistoni F., Baccarini M., Blasi E., at al. Thymus, 1985, v. 7, N 2, p. 69 - 84.

3. Goldstein A.L., Low T.L.K. Prog. Immunolog, v. 5, р. 1417 - 1427. 3. Goldstein A.L., Low T.L.K. Prog. Immunolog, v. 5, p. 1417 - 1427.

4. Low T. L.K., Goldatein A.L. Thymic Hornones Limphokines. Bas. Chem. Clin. Appl. Ed A. Goldstein.-plenum Press.: New York, 1988, р. 21 - 35. 4. Low T. L.K., Goldatein A.L. Thymic Hornones Limphokines. Bas. Chem. Clin. Appl. Ed A. Goldstein.-plenum Press .: New York, 1988, p. 21 - 35.

5. Арион В.Я., Санита И.В., Бреус Ю.П. и др. Химия и биология иммунорегуляторов. - Рига: Зинатне, 1985, с. 39 - 52
6. Beutler B. , Cerami A. Biochemistry, 1988, v. 27, N 20, р. 7575 - 7582.5. Arion V.Ya., Sanita I.V., Breus Yu.P. and others. Chemistry and biology of immunoregulators. - Riga: Zinatne, 1985, p. 39 - 52
6. Beutler B., Cerami A. Biochemistry, 1988, v. 27, N 20, p. 7575 - 7582.

7. Шмелев В.А. и др. Вестник Российской Академии Медицинских наук. 1994, N 6, с. 55 - 61. 7. Shmelev V.A. and other Bulletin of the Russian Academy of Medical Sciences. 1994, N 6, p. 55 - 61.

8. Клеточная иммунология и аллергология. - М.: Медицина, 1986, 446с. 8. Cellular immunology and allergology. - M .: Medicine, 1986, 446 p.

9. Косякова П.Н., Ровнова З.И. Противовирусный иммунитет. - М.: Медицина, 1972, 295 с. 9. Kosyakova P.N., Rovnova Z.I. Antiviral immunity. - M.: Medicine, 1972, 295 p.

Claims

1. A drug with immunomodulatory properties based on cytokines, characterized in that it contains a hybrid protein alpha-1-thymosin tumor necrosis factor alpha-thymosin-alpha-1 isolated from a microorganism into which a recombinant plasmid pThy 325 encoding protein synthesis has been introduced, stabilizing additives and salt buffering system in the following ratio of components, wt.

Hybrid Protein 0.0008 0.0015
Stabilizing additives 10 20
Salt buffer system pH 7.0 7.2 1.03 1.06
Water Else
2. The drug according to claim 1, characterized in that polyglucin, gelatinol, and sucrose are used as stabilizing additives.

3. The drug according to claim 1, characterized in that a buffered physiological solution of sodium chloride is used as the salt buffer system.