RU2099081C1

RU2099081C1 - Method of preparing the vaccine for streptococcosis prophylaxis in nutria

Info

Publication number: RU2099081C1
Application number: RU94036645A
Authority: RU
Inventors: Виктор Арсеньтьевич Есепенок; Анатолий Акимович Конопаткин; Александр Николаевич Панин; Хелена Станиславовна Горбатова
Original assignee: Виктор Арсеньтьевич Есепенок; Анатолий Акимович Конопаткин; Александр Николаевич Панин; Хелена Станиславовна Горбатова
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1994-09-30
Publication date: 1997-12-20
Also published as: RU94036645A

Abstract

FIELD: veterinary microbiology, biotechnology. SUBSTANCE: method involves the use of the strain Str. zooepidemicus VGNKI N K-DEP that is cultured on beef-extract broth with 1% glucose solution at 37-38 C for 18-24 h. To this time concentration of bacterial mass must be 4 x 10⁹mk/1 ml, not less. The obtained cultural fluid is subjected for freezing-thawing, liquid fractions were separated and inactivated with 0.3-0.4% formalin solution. Sterile adjuvant (3% solution of aluminium hydroxide) is added to bacterial mass after inactivation. The obtained formol-aluminium hydroxide vaccine provides the formation of stable lasting immunity. Its epizootic effectiveness is up to 98.4% of all vaccinated animals. EFFECT: improved method of preparing, enhanced effectiveness of vaccine. 1 tbl

Description

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно к конструированию бактериальных вакцин для профилактики стрептококкоза нутрий. The invention relates to veterinary microbiology, namely to the design of bacterial vaccines for the prevention of streptococcosis of nutria.

Стрептококкоз наносит огромный ущерб нутриеводческим хозяйствам: погибает молодняк после отсадки (до 60%), самки абортируют во второй половине беременности (до 80%). При этом большие затраты дополняются нарушением технологии выращивания животных, а также за счет проведения ветеринарно-санитарных мероприятий при ликвидации болезни. Streptococcosis causes enormous damage to nutriza farms: young growth dies after precipitation (up to 60%), females abort in the second half of pregnancy (up to 80%). At the same time, high costs are supplemented by a violation of animal breeding technology, as well as through veterinary and sanitary measures to eliminate the disease.

От павших нутрий в хозяйствах с массовым падежом нами был выделен патогенный стрептококк серогруппы C. Были изучены его морфологические, биологические свойства, чувствительность к антибиотикам, что вошло в основу разработанной нами "Временной инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации стрептококкоза нутрий" (1). The pathogenic streptococcus of serogroup C was isolated from fallen nutria in farms with a mass mortality. We studied its morphological, biological properties, and sensitivity to antibiotics, which became the basis of the “Interim Instructions for the Prevention and Elimination of Nutria Streptococcosis” developed by us (1).

Известный способ профилактики и лечения стрептококкоза нутрий, в основу которого положены санитарно-технологические и лечебные мероприятия, позволяет осуществлять эпизоотологическиий контроль за болезнью на экономически доступном уровне (2). Но вместе с тем неблагополучные хозяйства продолжают нести большие убытки. A known method for the prevention and treatment of nutria streptococcosis, which is based on sanitary-technological and therapeutic measures, allows epizootological control of the disease at an economically affordable level (2). But at the same time, dysfunctional farms continue to suffer large losses.

В настоящее время не существует специфических средств профилактики стрептококкоза нутрий ни в нашей стране, ни за рубежом. Однако известны способы получения вакцин против стрептококкоза свиней, энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят, которые заключается в основном в получении большого количества токсинов стрептококков при выращивании микробов в течение 6 8 сут. Для изготовления вакцины берут 12 штаммов: 4 выделенных из труппов телят, 4 от ягнят и 4 от поросят. Технология изготовления усложняется многочисленными высевами, требует больших затрат времени, а также сложным контролем на иммуногенность (3). Эти препараты не эффективны в экспериментальных условиях для профилактики стрептококкоза нутрий. Поэтому целью настоящего изобретения является конструирование иммуногенной вакцины против стрептококкоза нутрий, чтобы существующую систему профилактических и оздоровительных мероприятий дополнить вакцинацией поголовья и добиться более эффективного эпизоотологического контроля стрептококкоза нутрий. Currently, there are no specific means of preventing streptococcosis of nutria in our country or abroad. However, there are known methods for producing vaccines against pig streptococcosis, enterococcal infection of calves, lambs and piglets, which consists mainly in obtaining a large number of streptococcal toxins when growing microbes for 6-8 days. For the manufacture of the vaccine, 12 strains are taken: 4 calves isolated from troupes, 4 from lambs and 4 from piglets. Manufacturing technology is complicated by numerous seeding, requires a lot of time, as well as complex control of immunogenicity (3). These drugs are not effective in experimental conditions for the prevention of streptococcosis of nutria. Therefore, the aim of the present invention is the construction of an immunogenic vaccine against streptococcosis of nutria, so that the existing system of preventive and recreational measures is supplemented by vaccination of livestock and to achieve more effective epizootological control of streptococcosis of nutria.

Вакцину для профилактики стрептококкоза нутрий готовили на основе штамма стрептококкоза серогруппы C К-ДЕП, который выделен нами от павших нутрий и депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. The vaccine for the prevention of nutria streptococcosis was prepared on the basis of the serogroup C streptococcosis strain C K-DEPT, which we isolated from fallen nutria and deposited in the collection of microorganism strains of the All-Russian State Research Institute for Control, Standardization and Certification of Veterinary Medicines.

Пример. Для изготовления опытной серии вакцины против стрептококкоза нутрий использовали отдельную ампулу с лиофилизированной культурой стрептококка серологической группы C штамма К-ДЕП. Содержимое ампулы на МПА с 1% глюкозы в 3 4 чашки Петри по следующей методике: 0,1 0,2 мл суспензии культуры штамма вносят на поверхность агара и стеклянным стерильным шпателем распределяют ее по поверхности агара. Этим же шпателем проводят по поверхности агара последовательно еще трех чашек. Посевы на МПА инкубируют 48 ч при 37 37,5^oC. Одновременно делают высевы на МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро по две пробирки с каждой средой и инкубируют при тех же температурных режимах (на среде Сабуро при 20 24^oC) посевы на МППБ и на среде Сабуро 10 сут. а на МПБ 3 сут.Example. For the preparation of the experimental series of vaccines against streptococcosis nutria, a separate ampoule with a lyophilized culture of streptococcus serological group C strain K-DEPT was used. The contents of the ampoule on MPA with 1% glucose in 3 4 Petri dishes according to the following procedure: 0.1 0.2 ml of a suspension of strain culture is applied to the surface of the agar and spread with a glass sterile spatula on the surface of the agar. The same spatula is carried out on the surface of the agar sequentially three more cups. Inoculations on MPA are incubated for 48 hours at 37 37.5 ^o C. At the same time, inoculations on MPB, MPPB under vaseline oil and Saburo medium are two test tubes with each medium and incubated at the same temperature conditions (on Saburo medium at 20 24 ^o C) Crops on MPPB and on the Saburo environment 10 days. and on the BCH 3 days.

По истечении срока инкубации культуры в каждой питательной среде в отдельности проверяют на чистоту и характер роста визуальным просмотром, а также просмотром мазков, окрашенных по Граму. Рост культур на питательных средах должен быть характерным для возбудителя стрептококкоза. After the incubation period, the cultures in each culture medium are individually checked for purity and growth by visual inspection, as well as viewing smears stained by Gram. The growth of cultures on nutrient media should be characteristic of the causative agent of streptococcosis.

Из культуры, выросшей на чашках Петри, отбирают 2 3 колонии стрептококков и высевают в МПБ с добавлением 1% глюкозы и инкубируют при температуре 37 37,5^oC 18 22 ч. Проверяют чистоту роста просмотром мазков, окрашенных по Граму, и высевают на МПБ с глюкозой (1%) во флаконы в соотношении 1: 100.From a culture grown on Petri dishes, 2 3 colonies of streptococci were selected and plated in BCH with 1% glucose added and incubated at 37 37.5 ^° C for 22 22 hours. Growth was checked for purity by viewing Gram stained smears and plated on BCH with glucose (1%) in vials in a ratio of 1: 100.

Для приготовления маточной раскладки из флаконов или колб суточную бульонную культуру пересевают в подогретый до температуры 37 37,5^oC МПБ с глюкозой (1%) в 2,5-литровых баллонах из расчета 80 100 мл на 10 л. Посевы культивируют при температуре 37 37,5^oC в течение 18 24 ч.To prepare the uterine layout from vials or flasks, the daily broth culture is subcultured into a MPB with glucose (1%) heated to a temperature of 37 37.5 ^o C in 2.5-liter cylinders at the rate of 80 100 ml per 10 l. Crops are cultivated at a temperature of 37 37.5 ^o C for 18 24 hours

При удовлетворительных показателях чистоты, pH и оптической концентрации производственную культуру в баллонах замораживают при температуре минус 20^oC в течение 2 сут. Затем культуру оттаивают при комнатной температуре (16 18^oC). При расслоении твердой и жидкой фазы в отношении 1:1 ледяную массу удаляют. К жидкому концентрату разрушенных бактерий вносят 0,3% коммерческого формалина. Инактивацию культур проводят в течение 48 ч при температуре 16 18^oC, подвергая взбалтыванию каждый баллон до 3 4 раз в течение 2 мин.With satisfactory purity, pH and optical concentration, the industrial culture in the cylinders is frozen at a temperature of minus 20 ^o C for 2 days. Then the culture is thawed at room temperature (16-18 ^o C). When the separation of the solid and liquid phases in a ratio of 1: 1, the ice mass is removed. 0.3% of commercial formalin is added to the liquid concentrate of destroyed bacteria. Inactivation of the cultures is carried out for 48 hours at a temperature of 16-18 ^o C, subjecting to agitation each cylinder up to 3 4 times for 2 minutes

После инактивации отбирают пробы культур из каждого баллона в отдельности для контроля полноты инактивации и определения концентрации микробных клеток. Для этого проводят посевы в пробирки на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом. Посевы не должны иметь роста в течение 10 дней наблюдения. Концентрацию микробных клеток определяют по оптическому стандарту мутности, и которая должна быть 3 ± 0,1 млрд. микробных клеток в 1 мл, а несвязанного формалина должно быть не более 0,095%
По истечении срока инактивации и получения требуемых результатов контроля чистоты (полноты инактивации) и концентрации в бактериальную массу вносят стерильный адъювант 3% -ный раствор гидроокиси алюминия (ГОСТ 1828-81) из расчета 10% к объему культуры. Адъювант вносят при непрерывном помешивании культуры.After inactivation, culture samples are taken from each balloon individually to control the completeness of inactivation and determine the concentration of microbial cells. For this, inoculations are carried out in test tubes on MPA, MPB, MPPB under vaseline oil. Crops should not have growth within 10 days of observation. The concentration of microbial cells is determined by the optical turbidity standard, which should be 3 ± 0.1 billion microbial cells in 1 ml, and unbound formalin should be no more than 0.095%
After the inactivation period has expired and the required results of purity control (inactivation completeness) and concentration are obtained, a sterile adjuvant 3% aluminum hydroxide solution (GOST 1828-81) is added to the bacterial mass at the rate of 10% of the culture volume. Adjuvant is added with continuous stirring of the culture.

Примечание: 3% раствор гидроокиси алюминия на физиологическом растворе стерилизуют в автоклаве при температуре 120^oC в течение 30 мин.Note: a 3% solution of aluminum hydroxide in physiological saline is sterilized in an autoclave at a temperature of 120 ^o C for 30 minutes

Через 3 сут. после внесения адъюванта формируют серию вакцины, pH готовой вакцины должен быть в пределах 7,0 7,2. After 3 days. after the adjuvant is introduced, a series of vaccines is formed, the pH of the finished vaccine should be within 7.0 7.2.

Расфасовку вакцины производят по 20, 100, 200 мл в стерильные флаконы, которые закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками, обеспечивая герметичность укупорки содержимого флаконов. The vaccine is packaged in 20, 100, 200 ml in sterile bottles, which are closed with rubber stoppers and sealed with aluminum caps, ensuring tightness of the corking of the contents of the bottles.

Полученная вакцина имеет следующий состав, об. The resulting vaccine has the following composition, vol.

а) свободный антиген стрептококков, выращенных в течение 18 22 ч, в концентрации (5 6) • 10⁹ микробных клеток/см³ 88,5
б) глюкоза 1,0
в) формалин 0,3
г) гидроокись алюминия до 100
Для определения качества формолгидроокисьалюминиевой вакцины государственный контролер делает выборку из разных мест серии в количестве 10 флаконов, из которых 5 используют для проведения испытаний, а 5 флаконов хранят в архиве государственного контролера в течение 18 месяцев.a) free antigen of streptococci grown for 18 22 hours at a concentration of (5 6) • 10 ⁹ microbial cells / cm ³ 88.5
b) glucose 1.0
c) formalin 0.3
d) aluminum hydroxide up to 100
To determine the quality of the aluminum formaldehyde vaccine, the state inspector makes a sample of 10 bottles from different places of the series, of which 5 are used for testing, and 5 bottles are stored in the archives of the state controller for 18 months.

Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонней примеси, хлопьев, плесени, неразбивающегося осадка флаконы с вакциной тщательно встряхивают и просматривают визуально в проходящем свете. Одновременно флаконы проверяют на герметичность укупорки и правильность этикетирования. To determine the appearance, color, presence of impurities, flakes, mold, non-breaking sediment, the vaccine vials are thoroughly shaken and viewed visually in transmitted light. At the same time, the bottles are checked for tightness of the cork and the correct labeling.

Концентрацию водородных ионов определяют электрометрическим методом, используя потенциометр марки ЛПУ-01 или другой прибор того же класса точности. Для испытания используют 3 флакона с вакциной. Содержимое каждого флакона испытывают отдельно. Определение pH вакцины проводят по инструкции, приложенной к потенциометру. Вакцина должна иметь pH в пределах 7,0 7,2. The concentration of hydrogen ions is determined by the electrometric method using a LPU-01 brand potentiometer or another device of the same accuracy class. For testing, use 3 bottles of vaccine. The contents of each vial are tested separately. Determination of the pH of the vaccine is carried out according to the instructions attached to the potentiometer. The vaccine should have a pH between 7.0 and 7.2.

Для проведения испытания на стерильность используют 5 флаконов с вакциной. Посевы проводят из каждого флакона в две пробирки с МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. Посевы проводят в объеме 0,2 0,3 мл вакцины. Питательные среды с посевами выдерживают в течение 10 дней, роста микрофлоры быть не должно. To carry out a sterility test, 5 vaccine bottles are used. Crops are carried out from each bottle in two test tubes with MPA, MPB, MPPB and Saburo medium. Crops are carried out in a volume of 0.2 to 0.3 ml of vaccine. Culture media with crops can withstand for 10 days, the growth of microflora should not be.

Безвредность вакцины проверяют на морских свинках массой 300 350 г и на белых мышах 16 18 г. Три флакона с вакциной встряхивают и из каждого флакона с вакциной с соблюдением стерильности отбирают 20 30 мл препарата, переносят в стерильный флакон, общую пробу используют для определения безвредности и иммуногенности. The safety of the vaccine is checked on guinea pigs weighing 300 350 g and on white mice 16-18 g. Three vials of the vaccine are shaken and 20-30 ml of the drug are taken from each vaccine vial with sterility, transferred to a sterile vial, the general sample is used to determine the safety and immunogenicity.

Для определения безвредности содержимое флакона тщательно встряхивают и вводят пяти морским свинкам подкожно в области спины в объеме 2 мл и десяти белым мышам подкожно в области спины в объеме 0,5 мл. Вакцина не должна вызывать заболевания и гибели морских свинок и белых мышей в течение 10-дневного срока наблюдения. To determine the safety, the contents of the vial are thoroughly shaken and five guinea pigs are injected subcutaneously in the back in a volume of 2 ml and ten white mice subcutaneously in the back in a volume of 0.5 ml. The vaccine should not cause disease and death of guinea pigs and white mice during the 10-day observation period.

Для определения иммуногенной активности общую пробу вакцины во флаконе встряхивают и вводят 20 белым мышам массой 16 18 г подкожно с наружной стороны бедра в дозе 0,2 мл. Через 14 дней после иммунизации 20 вакцинированных и 20 контрольных белых мышей аналогичной массы заражают подкожно в области бедра подтитрованной смертельной дозой вакцинного штамма. Срок наблюдения 10 дней. To determine the immunogenic activity, the total sample of the vaccine in the vial is shaken and administered to 20 white mice weighing 16 18 g subcutaneously from the outside of the thigh at a dose of 0.2 ml. 14 days after immunization, 20 vaccinated and 20 control white mice of the same mass were infected subcutaneously in the thigh with a lethal dose of a vaccine strain. The observation period is 10 days.

Вакцину считают иммуногенной, если она предохраняет от заболевания и гибели не менее 18 иммунизированных мышей в каждой опытной группе, при заболевании всех и гибели не менее 18 белых мышей в контрольных группах в течение 10 дней. A vaccine is considered immunogenic if it protects against disease and death of at least 18 immunized mice in each experimental group, with all diseases and the death of at least 18 white mice in the control groups within 10 days.

Полученные нами две серии вакцин против стрептококкоза нутрий и известную вакцину против диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят мы испытали в производственных условиях (см. таблицу 1). Анализ полученных данных, представленных в таблице 1, достоверно доказывает эффективность вакцины серии N 2 по сравнению с известной вакциной и вакциной серии N 1. Вакцины вводили внутримышечно в области бедра с внутренней стороны в дозах 1,0 и 1,5 с интервалом 7 10 дней. Вакцина серии N 2 безвредна, не вызывает осложнений у вакцинированных нутрий, обладает высокой активностью и профилактирует развитие клинических признаков стрептококкоза и гибель животных от болезни до 98,4%
Источники информации
1. Временная инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации стрептококкоза нутрий. Утверждена ГУВ Госагропрома СССР от 21 апреля 1988 г.We received two series of vaccines against streptococcosis of nutria and the known vaccine against diplococcal septicemia of calves, lambs and piglets, we tested in production conditions (see table 1). Analysis of the data presented in table 1, reliably proves the effectiveness of the vaccine series N 2 compared with the known vaccine and vaccine series N 1. The vaccines were administered intramuscularly in the thigh from the inside at doses of 1.0 and 1.5 with an interval of 7 10 days . The vaccine of series N 2 is harmless, does not cause complications in vaccinated nutria, has high activity and prevents the development of clinical signs of streptococcosis and death of animals from the disease up to 98.4%
Sources of information
1. Temporary instruction on measures for the prevention and elimination of streptococcosis of nutria. Approved by the GUV Gosagroprom of the USSR on April 21, 1988

2. Стрептококкоз нутрий. Конопаткин А.А. и др. Звероводство и кролиководство, N 1, 1990. 2. Streptococcosis nutria. Konopatkin A.A. and other Breeding and rabbit breeding, N 1, 1990.

3. Диагностика и профилактика диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят. Чепуров В.И. 1956. 3. Diagnosis and prevention of diplococcal septicemia of calves, lambs and piglets. Chepurov V.I. 1956.

Claims

A method of obtaining a vaccine for the prevention of streptococcosis nutria, characterized in that they use a strain of Streptococcus zooepidemicus VGNKI N K-DEPT, its cultivation is carried out in a liquid nutrient medium with the addition of glucose to achieve a concentration of 4 • 10 ⁹ 6 • 10 ⁹ cells / ml, the obtained culture medium subjected to freezing and thawing, the liquid fraction is separated, 0.3 0.4% formalin solution is added to it, it is left to stand for 44-50 hours and a 3% solution of aluminum hydroxide is added in an amount of 10% by volume of the culture.