RU2048522C1 - Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнология, молекулярная биология. Сущность изобретения: размножение и/или эксрессию нуклеиновых кислот осуществляют в среде, содержащей бесклеточную ферментную систему и субстраты, необходимые для экспоненциального размножения и/или экспрессии нуклеиновых кислот, жидкую фазу которой перед инкубацией иммобилизуют путем заключения ее в твердую основу органической или неорганической природы, имеющую пористую, волокнистую, сетчатую, капилярную, складчатую или слоистую структуру со средним размером пор от 100 мкм до 5 нм. 3 с. и 17 з.п.ф-лы, 2 ил.

Description

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к способам размножения и экспрессии нуклеиновых кислот в бесклеточных системах. Преимущественной областью использования являются синтез и экспрессия (транскрипция и трансляция) индивидуальных нуклеиновых кислот вне клетки.

Известен ряд способов экспоненциального размножения нуклеиновых кислот в бесклеточных системах, таких как размножение РНК вирусными РНК-зависимыми полимеразами (ВРП), размножение ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и изотермическая трехферментная система самоподдерживающегося размножения (ЗСР). В отличие от линейного размножения, происходящего, например, при синтезе РНК с помощью ДНК-зависимой РНК полимеразы, число молекул нуклеиновой кислоты в реакции экспоненциального размножения растет как экспоненциальная функция времени, что позволяет быстро получить большое количество нуклеиновой кислоты из небольшого числа исходных матриц. В настоящее время реакции экспоненциального размножения проводят в жидкой среде, содержащей компоненты бесклеточной ферментной системы, включающей реакционный буфер, соответствующие ферменты, нуклеотидные субстраты и, когда необходимо, полимеризационные затравки. В этом случае нуклеиновокислотные продукты, синтезируемые на отдельных матрицах, распространяются по всему реакционному объему.

В ВРП реакции экспоненциальный синтез достигается благодаря тому, что как матрица РНК, так и синтезированная РНК остаются однонитевыми, и обе служат одинаково эффективными матрицами в последующих циклах репликации. Эта реакция не требует затравок. Вирусные РНК полимеразы, такие как Qβ репликаза, демонстрируют узкую матричную специфичность, основанную на узнавании ферментом особых структур, которые присутствуют в специфических матричных РНК, но отсутствуют в других РНК, содержащие такие структуры, называют "реплицирующимися РНК". Другие РНК, не являющиеся реплицирующимися, могут быть размножены в ВРП реакции, если они встроены в цепочку реплицирующейся РНК. Такие рекомбинантные реплицирующиеся РНК были использованы в целях диагностики и для внеклеточного размножения мРНК, кодирующих белки.

ПЦР используют для внеклеточно размножения ДНК. Для осуществления этой реакции необходимы две олигонуклеотидные затравки, которые комплементарны участкам цепочек двунитевой ДНК, ограничивающим размножаемый фрагмент (мишень). Эти затравки отжигаются с ДНК и наращиваются во взаимно встречных направлениях ДНК полимеразой. В отличие от ВРП реакции матричная и синтезируемая цепочки ДНК оказываются в дуплексе, который необходимо расплавить при повышенной температуре, чтобы разрешить последующие циклы репликации, в которых каждая из цепочек служит матрицей. Процесс многократно повторяется путем циклической смены температур, при которых происходят отжиг затравки и плавление дуплекса ДНК, что приводит к экспоненциальному размножению ДНК-мишени. В настоящее время ПЦР проводят с использованием термоустойчивых ДНК-полимераз, которые выдерживают многократную смену температур без потери активности. Необходимость циклической смены температур требует наличия специального оборудования и делает ПЦР на порядок медленнее ВРП реакции. В то же время любая ДНК-мишень может быть размножена в ПЦР при наличии пары специфических затравок, без надобности в изготовлении рекомбинантной молекулы.

Способ размножения нуклеиновых кислот в трехферментной системе самоподдерживающегося размножения (ЗСР) соединяет преимущества ПЦР и ВРП реакции. ЗСР основана на совместном действии трех ферментов ДНК-зависимой РНК-полимеразы, обратной транскриптазы и РНКазы Н. В качестве стартовой матрицы может служить как фрагмент двунитевой ДНК, несущий на каждом конце промотор какой-либо РНК-полимеразы, так и однонитевая РНК. РНК-полимераза (например, РНК-полимераза фага Т7) использует двунитевую ДНК для синтеза многочисленных однонитевых РНК-транскриптов с последовательности ДНК, лежащей вслед за промотором на каждой цепочке ДНК. Обратная транскриптаза (например, обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц) синтезирует двунитевые кДНК-копии РНК-транскриптов, используя затравки, комплементарные 3'-концам транскриптов и содержащие последовательность промотора РНК-полимеразы для восстановления этой последовательности на каждом конце кДНК. РНКаза Н разрушает РНК-матрицу, вовлеченную в РНК-ДНК гетеродуплекс после синтеза первой цепи кДНК, тем самым позволяя синтезироваться второй цепи кДНК. Действие РНК-полимеразы и РНКазы Н приводит к образованию однонитевых матриц, что позволяет экспоненциально размножать нуклеиновые кислоты в отсутствие циклического изменения температуры. Скорость ЗСР сравнима со скоростью ВРП реакции, причем подобно ПЦР использование ЗСР не требует создания рекомбинантных нуклеиновых кислот. Продуктом ЗСР реакции является смесь молекул двунитевых ДНК и однонитевых РНК.

Известны также методы экспрессии нуклеиновых кислот in vitro. В процессе экспрессии генетическая информация, заключенная в последовательности нуклеотидов, транслируется в аминокислотную последовательность полипептидов. Трансляция происходит на рибосомах, которые используют в качестве непосредственного источника информации РНК, называемую мРНК. Трансляцию осуществляют в бесклеточной ферментной системе, включающей реакционный буфер, рибосомы, тРНК, аминокислоты, АТР, GТР и обслуживающие белки, такие как аминоацил-тРНК-синтетазы и факторы трансляции. Если в качестве источника генетической информации служит ДНК, ее сначала транскрибируют (переписывают) в РНК. В этом случае экспрессия включает две стадии транскрипцию ДНК и трансляцию РНК, и может быть осуществлена в сопряженной бесклеточной ферментной системе транскрипция/трансляции, включающей помимо компонентов трансляционной системы соответствующую ДНК-зависимую РНК-полимеразу и недостающие рибонуклеозидтрифосфаты. В известных методах экспрессии нуклеиновых кислот in vitrо используют жидкие среды, так что продукты экспрессии (белки, полипептиды) могут свободно распространяться по всему реакционному объему.

В качестве прототипа изобретения может быть взят любой известный способ экспоненциального размножения нуклеиновых кислот в жидкой среде, например размножения рекомбинантных РНК в ВРП реакции.

В отличие от известных способов экспоненциального размножения нуклеиновых кислот, включая указанный прототип, настоящим изобретением предлагается осуществлять размножение нуклеиновых кислот в иммобилизованной среде. Возможно использование любых бесклеточных систем экспоненциального размножения нуклеиновых кислот, таких как ВРП реакция, ПЦР или 3СР реакция. В отличие от ранее использовавшихся способов размножения нуклеиновых кислот в жидких средах потомство (клон) каждой одиночной молекулы нуклеиновой кислоты образует колонию молекул в ограниченной зоне вокруг родительской матрицы. Разные колонии занимают, как правило, разные зоны иммобилизованной среды, что позволяет наблюдать индивидуальные колонии и манипулировать с ними по отдельности. Это также существенно снижает конкуренцию между различными матрицами и тем самым подавляет помехи для размножения определенных нуклеиновых кислот со стороны примесных матриц.

Изобретение включает также способ экспрессии нуклеиновых кислот в иммобилизованной среде. Экспрессия нуклеиновых кислот может быть осуществлена в той же иммобилизованной среде, что и их размножение. Благодаря иммобилизации среды продукты экспрессии не распространяются по всему объему, а остаются вблизи экспрессируемых нуклеиновых кислот. Экспрессия в иммобилизованных средах может быть использована как для анализа колоний нуклеиновых кислот, полученных с помощью предлагаемого способа, так и для одновременного анализа больше числа образцов нуклеиновых кислот, полученных с помощью любого иного способа.

На фиг.1 схематически изображен рост колоний нуклеиновых кислот в иммобилизованной среде; на фиг.2 изображены колонии РНК, выросшие в тонком слое иммобилизованной среды, содержащей компоненты Qβ репликазной системы.

Иммобилизованная среда для размножения и/или экспрессии нуклеиновых кислот включает жидкую фазу, заключенную в твердой основе. Твердая основа иммобилизованной среды может иметь разнообразную структуру, например пористую, волокнистую, сетчатую, капиллярную, слоистую, складчатую. Основным требованием к твердой основе является наличие развитых поверхностей, пронизывающих жидкую фазу, среднее расстояние между которыми обеспечивает ту или иную степень иммобилизации жидкости за счет ее трения о поверхность и структурирования воды вблизи поверхности. Предпочтительно использовать твердую основу со средним расстоянием между поверхностями (размером "пор") от 100 мкм (крупнопористая основа) до 5 нм (мелкопористая основа). Верхний предел размера пор должен быть меньше расстояния, на которое размножаемые нуклеиновые кислоты способны диффундировать за время инкубации (порядка 1 мм за 1 ч инкубации при комнатной температуре для нуклеиновых кислот длиной около 100 нуклеотидов, ср. фиг. 2А-2В). Нижний предел размера пор должен быть несколько больше линейных размеров нуклеиновых кислот и/или ферментов, чтобы обеспечить их подвижность, необходимую для протекания реакции размножения и/или экспрессии. В качестве твердой основы может служить трехмерная сеть, образуемая отдельными молекулами полимеров или их агрегатами; склеенные, спеченные или спрессованные водонерастворимые порошки, мелкие гранулы или кристаллы; губчатые материалы; плотно упакованные волокна, капилляры или пленки (например, полимерная пленка или металлическая фольга). Основными требованиями к материалу, из которого изготавливают твердую основу, является его химическая инертность в условиях инкубации, гидрофильность формируемой им поверхности, а также отсутствие физических воздействий на ферменты (например, их необратимая сорбция на поверхности), влекущих их инактивацию. Подходящими материалами для изготовления твердой основы являются различные органические или неорганические носители, используемые в биотехнологии для хроматографии и электрофореза биополимеров, для иммобилизации ферментов, а также для выращивания микроорганизмов, клеток и вирусов. Примерами таких носителей являются агароза, полиакриламид, желатин, альгинат, карагеннан, целлюлоза, силикагель, губчатый титан, оксиапатит, химически сшитые агароза, декстран и полиэтиленгликоль, а также их комбинации и производные.

Согласно изобретению, иммобилизованная среда для размножения и/или экспрессии нуклеиновых кислот содержит также компоненты системы размножения и/или экспрессии, включающей бесклеточную ферментную систему, способную к экспоненциальному размножению и/или экспрессии нуклеиновых кислот соответственно. Примеры таких бесклеточных систем рассмотрены выше. Ферменты, входящие в состав бесклеточной системы, могут быть либо растворены в жидкой фазе, либо иммобилизованы на твердой основе. Реакционный буфер, размножаемые нуклеиновые кислоты, субстраты и (где необходимо) затравки вводят в жидкую фазу.

При размножении в иммобилизованной среде нуклеиновые кислоты образуют колонии, как схематически показано на фиг.1. На верхней диаграмме представлен фрагмент 1 иммобилизованной среды, образуемой сетью твердой основы 2 и водным раствором 3, содержащим молекулы 4, нуклеиновокислотные матрицы 5, а также субстраты и реакционный буфер. В результате инкубации иммобилизованной среды в течение определенного времени при температурном режиме, подходящем для размножения нуклеиновых кислот, образуются колонии 6 нуклеиновых кислот в зонах локализации родительских матриц. Подобным же образом при экспрессии нуклеиновых кислот в иммобилизованной среде продукты экспрессии концентрируются в тех местах, где находятся экспрессируемые матрицы.

Предпочтительно, чтобы твердая основа иммобилизованной среды, используемой для размножения, могла обратимо взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Это позволяет существенно подавить диффузию молекул нуклеиновых кислот и получить колонии меньшего размера, с более четкими краями и большей концентрацией нуклеиновых кислот; иными словами, значительно увеличить разрешающую способность метода. Большинство гидрофильных полимеров способно к взаимодействию с нуклеиновыми кислотами благодаря образованию водородных связей. Эта способность может быть усилена путем химической модификации твердой основы положительно заряженными группами, способными к ионным взаимодействиям с фосфатными остатками нуклеиновых кислот, и/или умеренно гидрофобными группами, способными к взаимодействиям с пуриновыми или пиримидиновыми кольцами. Например, твердая основа может быть модифицирована слабокатионными группами, такими как этиламиноэтильными или диэтиламиноэтильными, или интеркалирующими красителями, такими как этидиум или пропидиум. Интеркалирующие красители способны к гидрофобным взаимодействиям со стекингованными основаниями нуклеиновых кислот и при этом несут положительный заряд. Более того, присутствие интеркалирующих красителей в иммобилизованной среде позволяет обнаруживать колонии нуклеиновых кислот с помощью флуоресценции (см. ниже).

Чтобы предотвратить распространение нуклеиновых кислот в иммобилизованной среде в процессе роста колоний, очень важно не допускать наличия неиммобилизованной жидкости. В частности, нельзя допускать конденсации воды на поверхности иммобилизованной среды. В то же время, нельзя допускать и пересыхания иммобилизованной среды, что может приводить к инактивации ферментов. Пересыхание иммобилизованной среды можно предотвратить путем проведения инкубаций в плотно закрытой камере, кассете или запаянном пластиковом пакете, а также оборачиванием среды водонепроницаемой пленкой или наслаиванием минерального масла.

Предпочтительно, чтобы реакция размножения не начиналась до полной иммобилизации среды. Это условие легко выполнимо в случае ПЦР, так как в этом случае реакция запускается циклическим изменением температуры. В случае реакций экспрессии или изотермического размножения, таких как ВРП или ЗСР реакция, это условие выполняется либо путем приготовления среды при или около 0^оС, когда скорость реакции мала, либо путем помещения ферментов и субстратов в разные зоны иммобилизованной среды, после чего субстраты диффундируют в ферментную зону, либо путем использования защищенных субстратов (химически недоступных ферменту) с последующим удалением защиты и высвобождением нормального субстрата. Примером защищенного субстрата является светочувствительное производное АТР, в котором γ-фосфат модифицирован 1-(2-нитро)фенилэтильной группой, и которое может быть превращено в АТР фотолизом для запуска реакции размножения и/или экспрессии.

В зависимости от конкретной цели нуклеиновые кислоты можно размножать либо в толстом, либо в тонком слое иммобилизованной среды. Проведение реакции в толстом слое (упакованном в любом подходящем сосуде, таком как пробирка, колба, колонка или патрон) полезно, когда целью реакции является просто размножение нуклеиновых кислот, например, после их клонирования. В данном случае иммобилизация среды подавляет размножение посторонних нуклеиновых кислот, так как препятствует распространению их потомства по всему объему. Эффект иммобилизации среды особенно заметен, когда загрязняющие нуклеиновые кислоты являются более эффективными матрицами, чем те, которые желательно размножать. Применение иммобилизованной среды особенно важно, или размножение нуклеиновых кислот происходит в отсутствии затравок, как например в ВРП реакции. Предпочтительно, чтобы ферменты (вместе с другими высокомолекулярными компонентами, включая нуклеиновые кислоты, что подразумевается в нижеприведенных примерах) и субстраты присутствовали в перемежающихся зонах иммобилизованной среды, имеющих форму гранул, пластинок или волокон. В этом случае, ферменты и субстраты могут быть отделены друг от друга в процессе приготовления среды, и реакция может быть запущена одновременно по всему объему по мере проникновения субстратов в ферментсодержащие зоны. Например, нагруженные ферментами гранулы агарозы можно получить смешением ферментов с раствором агарозы при ≈ 40^оС и выливанием раствора по каплям в холодный буфер, или приготовлением агарозного слоя или блока, который затем измельчают. Сферические гранулы с ферментами можно также получить диспергированием в масле раствора, содержащего ферменты и агарозу. После удаления жидкости холодные гранулы засыпают в охлажденный раствор агарозы, содержащий субстраты, который затем помещают на лед для быстрого застывания. Нуклеиновые кислоты размножают путем инкубации полученной среды при подходящей температуре (например, при 20-37^оС), затем среду расплавляют нагреванием, и нуклеиновые кислоты выделяют с помощью фенольной экстракции и/или ионообменной хроматографии. Гранулы можно покрыть альгинатной коррагенановой, а также нитроцеллюлозной, нейлоновой и другими типами полупроницаемых мембран. Покрытие гранулы (капсулы) можно упаковать в колонку, через которую пропускают субстратный раствор. Мембрана не препятствует диффузии субстратов в гранулы, но подавляет утечку нуклеиновых кислот (и ферментов) из капсул и их миграцию между капсулами. Можно также использовать гранулы из агарозы или иного геля, твердая основа которого модифицирована положительно заряженными группами (например, диэтиламиноэтил-агарозы); в этом случае нуклеиновые кислоты удерживаются внутри гранул благодаря ионным взаимодействиям с твердой основой. Наконец, нагруженный ферментами и матрицами гель может быть залит в патрон и полых волокон между полыми волокнами или внутрь полых волокон с полупроницаемыми стенками, которые с другой стороны омываются субстратным раствором.

В большинстве приложений предпочтительно использовать иммобилизованную среду, приготовленную в виде тонкого слоя. В этом случае растущие колонии располагаются в двух измерениях, что облегчает их наблюдение, анализ и пересев, а также позволяет изготавливать реплики, например, путем частичного переноса колоний на мембранный фильтр. Реплики можно использовать для анализа колоний, для их пересева на новую среду, а также хранить в течение длительного времени. Тонкие слои также удобно использовать при экспрессии нуклеиновых кислот для анализа колоний и для анализа большого числа образцов, которые наносят на слой в виде точек. Малая толщина слоя уменьшает температурные градиенты в поперечном направлении (что особенно важно в случае ПЦР) и облегчает диффузию субстратов в ферментный слой при использовании сэндвичевых сред с раздельными ферментным и субстратным слоями (см. ниже). Предпочтительно, чтобы толщина слоя не превышала размера колоний (который определяется, главным образом, скоростью линейной диффузии нуклеиновых кислот), то есть была в пределах нескольких миллиметров. Наиболее предпочтительно использовать очень тонкие слои, так как это повышает разрешающую способность метода. Нижний предел толщины слоя зависит от механической прочности твердой основы, от способности предотвратить пересыхание слоя при манипуляциях и в процессе реакции размножения, а также от чувствительности метода, используемого для анализа колоний. На практике удовлетворительные результаты получаются при толщине слоя от 1 мм до 50 мкм. Конечно, могут быть использованы более толстые (например, 10 мм) и более тонкие (до 1 мкм) слои. Если используют более толстые слои, то предпочтительно помещать ферменты и субстраты в разные слои, которые накладывают друг на друга, и/или вводить нуклеиновокислотные матрицы на поверхность слоя или между слоями, чтобы ограничить реакцию размножения и/или экспрессии узкой зоной вблизи поверхностей слоев. Более тонкие слои предпочтительно иммобилизовывать на подложке, из прочного материала, такой как стеклянная, металлическая или пластиковая пластинка или пленка.

Выбор техники приготовления тонких слоев зависит от свойств твердой основы, от температурного режима реакции, от свойств ферментов, используемых для реакции (как например, их способность переносить условия формирования полимерной основы), а также от того, используют ли однослойную или многослойную иммобилизованную среду.

Однослойные среды удобно использовать, когда все компоненты ферментной системы могут быть смешаны без того, чтобы началась реакция (как в случае ПЦР). В то же время однослойные среды могут быть использованы и тогда, когда предпочтительно держать ферменты отдельно от субстратов до полной иммобилизации среды. В этом случае ферментный слой, содержащий также нуклеиновокислотные матрицы, приготавливают без субстратов и покрывают полупроницаемой (например, диализной) мембраной или же для приготовления ферментного слоя используют твердую основу, способную удерживать нуклеиновые кислоты и ферменты (например, модифицированную положительно заряженными группами). Для запуска реакции размножения такой слой приводят в контакт с субстратным раствором. Батарею из таких разделенных промежутками одиночных тонких слоев, омываемых субстратным раствором, можно использовать как альтернативу колонкам с гранулами или патронам из полых волокон при простом размножении нуклеиновых кислот (см. выше).

Во многих случаях предпочтительно использовать многослойные ("cэндвичевые") среды, в которых разные слои приводятся в непосредственный контакт друг с другом в нужный момент. Например, ферменты и субстраты могут быть разнесены в разные слои, и реакция запускаться путем соприкосновения слоев благодаря диффузии субстратов в ферментный слой. Использование сэндвичевых сред может быть предпочтительным и в том случае, если разносить ферменты и субстраты не требуется, как например в ПЦР. Например, вторым слоем может быть мембранный фильтр, используемый для анализа колоний, на который нуклеиновые кислоты переносятся одновременно с их синтезом. Второй слой может также содержать компоненты системы экспрессии нуклеиновых кислот и наслаиваться на первый слой по завершении ПЦР для анализа колоний по продукту экспрессии. В этом случае может быть использован в третий слой, в качестве которого может служить мембранный фильтр для переноса продуктов экспрессии или же мембранный фильтр, пропитанный субстратами ферментов, синтезируемых в результате экспрессии, для анализа колоний по активности кодируемых ферментов.

Тонкие слои могут быть изготовлены разными способами, такими как пропитывание сухой твердой основы растворами, содержащими ферменты и/или cубстраты, или включение ферментов и/или cубстратов в процессе гелеобразования или синтеза (полимеризации) твердой основы.

Гелеобразующие растворы, такие как основанные на агарозе, желатине, карагенане, смешивают с ферментами и/или cубстратами и заливают, например, в чашки Петри или между двумя ровными поверхностями. В последнем случае можно получить очень тонкие слои геля и избежать образования мениска. Ферменты и/или субстраты могут быть также включены в слой в процессе синтеза твердой основы, например в процессе полимеризации акриламида или фотоиндуцируемой полимеризации этиленгликоля. В тех случаях, когда формирование твердой основы происходит в условиях, слишком жестких для ферментов и/или субстратов, сначала приготавливают твердую основу, а затем пропитывают ее соответствующим раствором. Например, повысить термоустойчивость агарозного геля (чтобы его можно было использовать в ПЦР) можно путем сшивания агарозы эпихлоргидрином или 2,3-дибромпропанолом; термоустойчивый гель можно также получить путем сшивания эпихлоргидрином или N,N'-метиленбисакриламидом декстрана. Однако сшивание происходит в условиях, ведущих к инактивации ферментов и субстратов реакции размножения. Поэтому тонкий слой геля сначала формируют в отсутствие ферментов и субстратов и затем пропитывают раствором, содержащим ферменты и/или cубстраты. Таким же образом могут быть приготовлены слои из геля на основе полиакриламида или смеси полиакриламида и агарозы. Волокнистые слои (например, основанные на целлюлозе или нейлоне) или пористые слои (например, основанные на силикагеле или губчатом титане) могут быть приготовлены просто пропитыванием соответствующих сухих листов, мембранных фильтров или пластинок раствором, содержащим компоненты системы размножения и/или экспрессии.

Нуклеиновые кислоты, предназначенные для размножения и/или экспрессии, вводят (в жидкую фазу твердой среды путем включения) в ферментный и/или субстратный раствор перед его иммобилизацией, или путем нанесения на слой или между слоями, по всей поверхности или локально (в виде точек, штрихов, и т. п.).

Реакцию запускают помещением иммобилизованной среды в соответствующие условия: повышение температуры среды, циклическое изменение температуры, воздействие света, приведение в соприкосновение слоев, содержащих ферменты и субстраты. Среду инкубируют в течение промежутка времени, позволяющего продуктам синтеза накопиться до детектируемого уровня. Например, при размножении нуклеиновых кислот необходимо, чтобы в каждой колонии образовалось, по крайней мере, 106 копий нуклеиновой кислоты (то есть, должно произойти, по крайней мере, 20 циклов репликации при условии, что в каждом цикле число матриц удваивается), что соответствует нижнему пределу чувствительности существующих методов обнаружения нуклеиновых кислот.

По окончании реакции размножения колонии нуклеиновых кислот можно обнаружить различными способами, такими как окрашивание интеркалибрующими красителями (этидиум бромид, пропидиум йодид), авторадиографией (если для размножения использованы субстраты, меченые радиоизотопом), а также неизотопными методами, такими как использующими мечение субстратов флуоресцентными группами и их модификацию биотином или дигоксигенином. Колонии могут быть также анализированы на предмет обладания каким-либо признаком, таким как присутствие определенной нуклеотидной последовательности (путем гибридизации со специфическим меченым зондом) или способность кодировать определенный белок (путем внеклеточной экспрессии содержащихся в нуклеиновых кислотах генов). Часто обнаружение колоний удобно проводить после их частичного переноса на мембранный фильтр. В этом случае мембранный фильтр предпочтительно накладывать на растовый слой перед размножением, чтобы перенос происходил по мере роста колоний. Экспрессию нуклеиновых кислот с целью анализа колоний можно проводить в жидкой среде, однако предпочтительно осуществлять экспрессию в иммобилизованной среде, сформованной по крайней мере в один тонкий слой. Это позволяет параллельно анализировать большое число колоний в одной реакции. При экспрессии в иммобилизованной среде продукты экспрессии накапливаются в тех зонах, где присутствуют экспрессируемые нуклеиновые кислоты. При использовании изотермических реакций размножения (таких как ВРП или ЗСР), компоненты системы экспрессии могут быть введены в тот же слой (или те же слои), что и компоненты системы размножения. Если для размножения используют ПЦР, то система экспрессии может быть включена в ту же среду, но в отдельный слой, который наслаивают по завершении ПЦР, или же в отдельную среду. В последнем случае колонии ДНК переносят в экспрессирующую среду, например, с помощью мембранного фильтра. Для экспрессии нуклеиновые кислоты получают в форме РНК (так, как они образуются в реакциях ВРП или 3СР) и транслируют в белки в среде, содержащей бесклеточную систему трансляции. Если же нуклеиновые кислоты получены в форме ДНК (как при размножении в ПЦР), то экспрессию осуществляют в среде, включающей сопряженную бесклеточную систему транскрипции/трансляции. Синтезированные полипептиды можно идентифицировать in situ или на фильтре-реплике разнообразными способами, такими как использующими иммунохимические реакции, или способность синтезированных белков осуществлять специфические ферментативные реакции или связывать специфические лиганды.

Предложенный способ поясняется следующими примерами его осуществления.

П р и м е р 1. Выращивание колоний РНК с помощью ВРП реакции.

Этот пример иллюстрирует способ размножения РНК в тонком слое иммобилизованной среды на примере RQ-РНК, являющихся природными матрицами Qβ репликазы. Порошок низкотемпературной агарозы (ultrа-low gelling temperature agarose type IХ, Sigma Chemical Company) расплавляют нагреванием в автоклавированном буфере А (80 мМ трис-НСl рН 7,8, 2 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТА, 20% глицерин), охлаждают до ≈ 40^оС и тщательно перемешивают на роторном встряхивателе с концентрированным раствором Qβ репликазы, очищенной как описано Блюменталем. Конечные концентрации агарозы и Qβ репликазы 2% и 35 мкг/мл соответсвенно. Затем приготавливают сэндвичевую среду одним из нижеописанных способов. Когда необходимо, разведения матричной РНК вводят в субстратный слой или в промежуток между ферментным и субстратным слоями в виде небольшой аликвоты.

(а) 1,5 мл вышеуказанного раствора наслаивают на слой 1% агарозы, содержащий субстраты (по 1 мМ АТР, GТР, СТР и UТР) и буфер Б (80 мМ трис-HCl рН 7,8, 25 мМ MgCl₂, 2 мМ ЭДТА, 10% глицерин) и приготовленный в 35-мм пластиковых чашках Петри. После заливки каждого слоя чашку выдерживают на льду для застывания агарозы. Для размножения РНК чашку инкубируют при комнатной температуре или при 37^оС в течение 1 ч (на термостатированном столике). Колонии РНК проявляют окрашиванием раствором этидиум бромида, как показано на фиг. 2А и 2Б. На фиг. 2А показан "спонтанный" рост колоний РНК, наблюдаемый, когда верхний (ферментный) слой заливают сразу после застывания субстратного слоя. На фиг. 2Б видно большое число колоний, выросших после того, как чашка с субстратным слоем была оставлена в лаборатории открытой в течение 1 ч перед заливкой ферментного слоя. Этот эксперимент демонстрирует эффективность предложенного способа в предотвращении распространения "шумового" роста на весь реакционный объем, а также потенциальную опасность со стороны наружных (в частности, воздушных) загрязнений, если размножение нуклеиновых кислот проводится традиционным способом в жидкой среде. Краситель может быть включен в субстратный слой при его заливке в этом случае колонии РНК можно наблюдать в процессе их роста (фиг.2В).

(б) 130 мкл раствора, содержащего фермент и агарозу, заливают между покровным стеклом, используемым в микроскопии, и большей по размеру пластиковой пластинкой, между которыми имеется зазор 0,4 мм. Покровное стекло осторожно снимают, и на агарозу накладывают нейлоновый мембранный фильтр, пропитанный субстратным раствором (по 4 мМ АТР, GТР, СТР и UТР в буфере Б) и высушенный. Для обнаружения колоний РНК в субстратный раствор добавляют [α -³²Р]-меченый нуклеотид. После инкубации среды в течение 20-40 мин для размножения РНК мембранный фильтр снимают с агарозы и омывают от невключившихся субстратов. Если размножение проводили в присутствии меченого субстрата, делают радиоавтограф мембранного фильтра. На фиг. 2Г показан негатив радиоавтографа исходного (субстратного) мембранного фильтра, а на фиг. 2Д негатив радиоавтографа фильтра-реплики. Колонии на фиг. 2Г и 2Д значительно менее диффузные, чем на 2А 2В. Разница объясняется наличием в нейлоновом мембранном фильтре положительно заряженных и гидрофобных групп, способных к взаимодействию с РНК. В отсутствие меченого субстрата колонии можно обнаружить с помощью окрашивания агарозы этидиум бромидом, как описано выше, или с помощью гибридизации мембранного фильтра со специфическими зондами, как описано ниже.

РНК пришивают к мембранному фильтру под действием ультрафиолета и гибридизуют с радиоактивно-меченым зондом путем инкубации в запаянном пластиковом пакете между листами фильтровальной бумаги. Температуру гибридизации определяют по известной формуле и оптимизируют в предварительных экспериментах. После гибридизации мембранный фильтр отмывают от негибридизовавшегося зонда и делают радиоавтограф. Для повторной гибридизации того же мембранного фильтра с другим зондом первый зонд отмывают кипячением мембранного фильтра в 0,1% -ном растворе Na-додецилсульфата. На фиг. 2Е и 2Ж показаны негативы радиоавтографов, полученных в результате последовательной гибридизации одного и того же мембранного фильтра с радиоактивно-мечеными зондами, специфичными к RQ87-з PНК и RQ135-1 РНК была введена в субстратный слой в количестве около 100 копий каждой из них. Этот эксперимент демонстрирует, что разные колонии содержат разные виды РНК, и что число колоний соответствует количеству добавленных матриц. Иными словами, имеет место истинное клонирование молекул РНК.

П р и м е р 2. Выращивание колоний нуклеиновых кислот с помощью 3СР реакции.

Раствор низкотемпературной агарозы в буфере смешивают с ферментами и нуклеиновой кислотой, отожженной с олигонуклеотидными затравками при 65^оС, и заливают ферментный слой, как описано в примере 1(б). В качестве мишени используют РНК, ДНК или их смесь. Используют реакционный буфер, ферменты, затравки и условия инкубации согласно рекомендациям Гуателли и др. На ферментный слой наслаивают нейлоновый мембранный фильтр, пропитанный субстратным раствором, содержащим по 4 мМ dAТР, dGТР, dCТР, dТТР и по 16 мМ АТР, GТР, СТР, UТР в реакционном буфере. После инкубации колонии нуклеиновых кислот идентифицируют при помощи гибридизации мембранного фильтра с меченым зондом, комплементарным внутренней области мишени, как описано в примере 1.

П р и м е р 3. Выращивание колоний ДНК с помощью ПЦР.

Все компоненты реакции, включая буфер, термоустойчивую ДНК-полимеразу, образец ДНК, затравки и субстраты, смешивают с дегазированным раствором мономеров (смесь акриламида и N,N'-метиленбисакриламида) и катализаторами полимеризации (персульфат аммония и N,N,N',N'-тетраметилендиамин) и заливают тонкий слой геля. По завершении полимеризации на гель наслаивают нейлоновый мембранный фильтр, смоченный в реакционном буфере, оборачивают термостойкой пленкой и помещают гель на металлический термостатируемый столик, температура которого контролируется в требуемом для ПЦР диапазоне автоматическим устройством, включающим два или три водяных термостата, и соединенным шлангами с термостатируемым столиком. Используют реакционные компоненты и условия ПЦР, рекомендованные Сэйкай и др. После 20-35 температурных циклов колонии ДНКУ обнаруживают, как описано выше. Если в качестве образца используют РНК, ее сначала превращают в кДНК.

П р и м е р 4. Экспрессия нуклеиновых кислот в иммобилизованных средах.

В этом примере описана процедура для экспрессии ДНК, размноженной в помощью ПЦР. Конечно, для размножения нуклеиновых кислот могут быть использованы 3СР и ВРП реакции; в этом случае размножение и экуспрессия могут быть осуществлены в одной и той же среде, содержащей компоненты как бесклеточной системы размножения, так и бесклеточной системы экспрессии. Процедура также легко адаптируема для экспрессии уже готовых нуклеиновых кислот, независимо от способа их получения.

Последовательность промотора SP6 РНК-полимеразы включают в одну из двух олигонуклеотидных затравок, комплементарных участкам, ограничивающим ген апообелина (фотобелок гидроида Оbelia geniculata). В качестве источника гена используют кодирующую обелин плазмиду или ДНУ, выделенную из гидроида. После размножения фрагментов в тонком слое иммобилизованной среды для получения одиночных колоний как описано в примере 3, нейлоновый мембранный фильтр с выросшими колониями приводят в контакт с экспрессирующим слоем, залитым на прозрачной подложке и содержащим компоненты бесклеточной системы трансляции/транскрипции, включающей SP6 РНК-полимеразу и экстракт из ретикулоцитов кролика. В экспрессирующий слой также вводят простетическую группу обелина целентеразин. После инкубации в течение 1 ч при 37^оС продукты экспрессии идентифицируют in situ. Для этого экспрессирующий слой помещают подложкой на фотопленку, а с другой стороны на него наслаивают мембранный фильтр, смоченный раствором CaCl₂. Диффундируя в экспрессирующий слой и связываясь с обелином, ионы Са⁺⁺ индуцируют люминесценцию и, следовательно, засветку пленки в тех местах, где синтезировался апообелин.

Подобным же образом клонируют и идентифицируют ген щелочной фосфатазы из Е. coli. Клоны, несущие ген фосфатазы, экспрессируют в слое, содержащем бесклеточную систему транскрипции/трансляции из Е. соli, и обнаруживают с помощью мембранного фильтра, смоченного раствором 5-бром-4-хлор-3-эндолилфосфата и нитросинего тетразолиума. В тех местах, где синтезировалась фосфатаза, на фильтре появляется пурпурное окрашивание.

Можно также идентифицировать продукты экспрессии с помощью разнообразных иммунохимических методов. Наиболее предпочтительны очень чувствительные методы, основанные на хемилюминесцентных реакциях, катализируемых щелочной фосфатазой и пероксидазой хрена. Можно использовать соответствующие наборы, продаваемые соответственно фирмами United States Biochemical Corporation и Аmersham Internationаl plc.

Claims (20)

1. Способ размножения нуклеиновых кислот в среде, содержащей бесклеточную ферментную систему и субстраты, необходимые для экспоненциального размножения нуклеиновых кислот, включающий стадии перевода нуклеиновых кислот в форму, пригодную для их экспоненциального размножения, контактирования с компонентами среды, инкубации в условиях, обеспечивающих экспоненциальное размножение нуклеиновых кислот, и анализа конечного продукта, отличающийся тем, что до начала инкубации жидкую фазу среды иммобилизуют путем ее заключения в твердую основу, обладающую развитой поверхностью со средним размером пор от 100 мкм до 5 нм, и придают ей подходящую для последующего использования форму.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадии, предшествующие иммобилизации среды, осуществляют в условиях, предотвращающих размножение указанных нуклеиновых кислот.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что размножение нуклеиновых кислот предотвращают путем разнесения ферментов и субстратов, входящих в состав системы размножения, в разные зоны среды.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют бесклеточную систему размножения, включающую РНК-зависимую РНК-полимеразу и рибонуклеотидные субстраты, а нуклеиновую кислоту, предназначенную для размножения, получают в форме реплицирующейся РНК.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют бесклеточную систему размножения, включающую ДНК-зависимую РНК-полимеразу, обратную транскриптазу, РНКазу Н, рибонуклеотидные и дезоксирибонуклеотидные субстраты, а к нуклеиновой кислоте, предназначенной для размножения, добавляют затравки, комплементарные концевым участкам указанной нуклеиновой кислоты или ее фрагмента и включающие нуклеотидную последовательность промотора указанной РНК-полимеразы.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для приготовления среды используют термоустойчивую твердую основу и бесклеточную систему размножения, включающую термоустойчивую ДНК-зависимую ДНК-полимеразу и дезоксирибонуклеотидные субстраты, нуклеиновую кислоту, предназначенную для размножения, получают в форме ДНК, к которой добавляют затравки, комплементарные концевым участкам указанной ДНК или ее фрагмента, и для осуществления реакции размножения производят циклические изменения температуры среды между температурой плавления ДНК и температурой, способствующей отжигу указанных затравок с цепочками названной ДНК.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при иммобилизации жидкой фазы среде придают форму по крайней мере одного тонкого слоя.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что среде придают форму по крайней мере двух тонких слоев, наложенных друг на друга (форму сэндвича).

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что для приготовления по крайней мере одного тонкого слоя используют мембранный фильтр.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что анализ колоний осуществляют путем экспрессии нуклеиновых кислот в той же или другой среде и идентификации продуктов экспрессии.

11. Способ экспрессии нуклеиновых кислот в среде, содержащей бесклеточную ферментную систему и субстраты, необходимые для эксперсии нуклеиновых кислот, предусматривающий осуществление стадий перевода нуклеиновых кислот в форму, пригодную для экспрессии, контактирования нуклеиновых кислот с компонентами среды, инкубации в условиях, обеспечивающих экспрессию, и анализ конечного продукта, отличающийся тем, что до начала инкубации жидкую фазу среды иммобилизуют путем заключения ее в твердую основу, обладающую развитой поверхностью со средним размером пор от 100 мкм до 5 нм.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что осуществляют экспрессию нуклеиновых кислот, предварительно размноженных по п. 1. формулы.

13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что используют бесклеточную ферментную систему, обеспечивающую наряду с экспрессией экспоненциальное размножение нуклеиновых кислот, а экспрессию осуществляют в той же среде, что и их размножение.

14. Способ по п. 11, отличающийся тем, что продукты экспрессии анализируют с помощью реакции, выбранной из группы, включающей специфическую ферментативную реакцию, связывание специфического лиганда и специфическую иммунохимическую реакцию.

15. Среда для размножения и/или экспрессии нуклеиновых кислот, включающая бесклеточную ферментную систему и субстраты, необходимые для экспоненциального размножения и/или экспрессии нуклеиновых кислот, отличающаяся тем, что жидкая фаза среды иммобилизована путем заключения ее в твердую основу, обладающую развитой поверхностью и имеющую пористую, волокнистую, сетчатую, капиллярную, складчатую или слоистую структуру со средним размером пор от 100 мкм до 5 нм.

16. Среда по п. 15, отличающаяся тем, что по крайней мере один из ферментов, входящих в состав бесклеточной системы, ковалентно связан с твердой основой.

17. Среда по п. 15, отличающаяся тем, что твердая основа включает гелеобразующее полимерное вещество.

18. Среда по п. 17, отличающаяся тем, что гелеобразующее полимерное вещество вибирают из группы веществ, включающей агарозу, полиакриламид, их производные или смесь таковых.

19. Среда по п. 15, отличающаяся тем, что используют твердую основу, способную к обратимому взаимодействию с нуклеиновыми кислотами.

20. Среда по п. 19, отличающаяся тем, что используют твердую основу, химически модифицированную положительно заряженными и/или гидрофобными группами.

Images