PT92499A - Processo para a preparacao de antigenes sinteticos - Google Patents

Description

Descrição referente ã patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg; Alemanha Ocidental, (inventores:Dr.Her-mann Pelzer, Dr.Werner Stube e Dr. Klaus-Dister Hungerer, residentes na Alemanha Ocidental) para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANTIGENES SINTÉTICOS".

DESCRIÇÃO A invenção refere-se a antigenes sintéticos constituídos por um péptido e por uma proteína de membrana de Neisseria meningitidis como molécula antigenisante, a um processo para a sua preparação, à sua utilização para a preparação de anticorpos, bem como ã utilização dos antigenes ou dos anticorpos como medicamentos e dos anticorpos como meios de dia gnóstico.

Na EP-A-0 161 188 encontra-se descrito que as proteínas de membrana da Neisseria meningitidis se podem ligar a polissacaridos, de modo a melhorar a sua antigenidade.

De acordo com o estado da técnica, os péptddos que não são antigenes (haptenos) e contra os quais se quer preparar um anticorpo, ligam-se a uma molécula de elevado peso 1 ·? ·?

- * molecular, de preferencia solúvel, obtendo-se assim os chamados conjugados, com os quais se podem imunizar animais, por exemplo coelhos ou ratos. Após um tempo de quarentena de alguns dias ou semanas tiram-se amostras de sangue aos animais, após eventuais reforços, para se obterem os anticorpos.

Como moléculas de alto peso molecular usam-se na maior parte dos casos proteínas, referindo-se em particular a hemocianina ”Keyhole Limpet” e a albumina.

Os conjugados de hemocianina ”Keyhole Limpet" têm as desvantagens de serem pouco solúveis e de se induzirem anticorpos contra a hemocianina "Keyhole Limpet’·.

Estas desvantagens foram surpreendentemente ul_ trapassadas pela presente invenção, utilizando-se como proteína antigenizante para póptidos nao antigénicos, de preferência pa ra oligo-ou poli-péptidos com até 100 aminoácidos, uma proteína de membrana de Neisseria meningitidis. 0 objetivo da invenção são por isso conjugados de uma proteína de membrana de Ueisseria meningitidis e de um péptido.

Utiliza-se de preferência a proteína Bg -menin· gococcus. A preparação dos conjugados de péptido-proteína efectua-se de acordo com métodos em si conhecidos, por exemplo por acoplamento por meio de diglutaraldeído ou por introdução de grupos maleimido na proteína seguida da ligação de um péptido através da respectiva função sulfidrilo livre. A preparação dos conjugados de péptido-proteína através do diglutaraldeído, dissolve-se por exemplo a proteína B-meningococcus num tampao, de preferencia Img de proteína em . 1 ml de PBS (solução salina tamponizada com fosfato), adiciona-\ -se o péptido, de preferência 1 - 2 mg de péptido por mg de - 2 -

> proteína, e adiciona-se, por mg de proteína 5 - 20 μΐ, de prefe rencia 10 /il, de uma solução aquosa a 25% de diglutaraldeído. Agita-se a solução à temperatura ambiente durante 30 minutos a 5 horas, de preferência durante 1 hora, e adicionam-se, por mg de proteína, 40 mg de lisina, para bloquear os grupos aldeído reactivos. Decorridos mais 10 minutos dializa-se contra água destilada e recupera-se o conjugado de preferência por liofili-zação.

Para a ligação de péptidos contendo grupos tiol à proteína podem ligar-se os grupos tiol através de pontes di--sulfureto ou tioéter à proteína B-meningoeoccus, efectuando-se de preferência a preparação do conjugado através da ligação de tiolteres.

Numa forma de execução preferencial para a conjugação derivatiza-se em primeiro lugar a proteína de modo a permitir a ligação directa dos grupos tiol à proteína. Para tal dissolve-se a proteína num tampão de pH 7 - 9» de preferência num tampão de hidrogerocarbonato ou de fosfato de sódio, e faz--se reagir com uma substância contendo grupos N-maleimido, de preferência com éster hidroxisuccinimídico do ácido H-maleimi-dobutírico. Após separação da proteína assim ”activadau, por exemplo por meio de permeação de gel em Sephadex ' -G 50» adi ciona-se, por mg de proteína, 1 - 3 mg de péptido contendo grupos tiol e deixa-se reagir a mistura durante 0,5 - 10 horas,de preferência durante 1 hora. 0 conjugado de proteína-péptido pode recuperar-se depois como habitualmente, de preferência por meio de diálise e liofilização.

Com um conjugado assim preparado efectua-se a imunização de animais apropriados, formamdo-se anticorpos contra o péptido sintético. A espécie animal preferida para a imunização e obtenção de anticorpos é, neste caso, o coelho. 0 anti-gene sintético pode também utilizar-se para a imunização de ratos e para a preparação de anticorpos monoclonais utilizando a * técnica do hibridoma. - 3 -

r 0 antisoro obtido pela imunização com o conjuga do reage especificamente com a proteína da qual deriva a sequen cia peptídica utilizada para a imunização.

Para além da boa solubilidade do conjugado veri ficou-se surpreendentemente que o antisoro dirigido contra o péptido não apresenta, na difusão imunológica dupla, qualquer reactividade preponderante com a proteína meningococcus. Isto é tanto mais surpreendente quanto na utilização de outras proteínas antigenizantes ocorre logo a indução de anticorpos contra elas dirigidos.

Os anticorpos obtidos de acordo com a invenção podem utilizar-se para uma série de vários tipos de testes imu-nologicos.

Os exemplos destinam-se a ilustrar a invenção. Nestes exemplos utilizam-se as seguintes abreviaturas: GMBS éster N-hidroxisuccinimídico do acido gama-maléimidobutí-rico,

Cys L-cisteína

Leu L-leucina

Phe L-fenilalanina

Ser L-serina

Pro L-prolina G-lu L-ácido L-glutânico

Lys L-lieina

Gly glicina

Vai L-valina

Ala L-alanina

Arg L-arginina

Asp áciÃo L-asparagénico

Tyr L-tirosina

Asn L-asparagina ICLH hemocianina "Keyhole Limpet»

AT III antitrombina III - 4 -

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Exemplos

Exemplo 1 a) Derivatização da proteína B-meningococcus com grupos malei mido

Dissolverara-se 40rag de proteína B-meningococcus em tampão de fosfato de sódio 0,05 mM, pll 8,0, e activaram -se com 5 mg de G-MBS durante 1 hora. Gromatografou-se o prò (τ>) “ duto bruto numa coluna de Sephadex -G 50 (2 x 30 cm) em fosfato de sódio 0,1 M/EDTA 0,5 mM, pH 6,0. Recolhe-se a fraeção contendo a proteína e concentra-se até ao volume de 8 ml. b) Preparação do conjugado de péptido-proteína: proteína B--meningocoecus- (AT III 343-363) À. fraeção contendo a proteína (vide exemplo la) adicionaram-se 40mg de péptido com a estrutura Gys-Leu-Phe-Ser-Pro-Glu-Lys-Ser-Lys-Leu-Pro-G-lu-Ile-Val-Ala-Ala-Glu-GIy-Arg-Asp-Asp-Leu-Tyr (AT III 343-363), preparado pelo método da síntese peptídica em fase sólida, e agitou--se a mistura durante 1 hora na ausência de oxigénio. Após diálise e liofilização obtiveram-se 43 mg de conjugado péptido proteína.

Exemplo 2 a) Derivatização de Hemocianina "Keyhole Limpet» com grupos maleimido.

De modo análogo ao do exemplo la), derivatiza-ram-se 40 mg de IÍLH. b) Preparação de KLH~(AT III 343-363)

De modo análogo ao do exemplo lb,) acoplaram-se 40 mg do péptido AT III 343-363 á KLH derivatizada de - 5 - acordo com o exemplo 2a). Rendimento: 45 mg

Exemplo 5

Preparação de Proteína B-meningococcus-(AT III 129-140)

Acoplaram-se 40mg do plptido Cys-Arg-Leu-Tyr-Arg-Lys-Ala-Asn-Lys-Ser-Ser-Lys-Leu (AT III 129-140) à pro teína B-meningococcus “activada" de acordo com o exemplo 1. Rendimento: 47mg.

Exemplo 4

Preparação de KLH-(AT III 129-140)

De modo análogo ao do exemplo 3, acoplou-se o plptido AT III 129-140 à KLH derivatizada com (MBS . Rendimento: 49mg.

Exemplo 5

Imunização de coelhos e teste dos antisoros

Imunizaram-se 5 coelhos com 2 mg de antigene cada um durante um período de 8 semanas, efectuando-se em seguida a aplicação dos conjugados de modo subcutâneo e intravenoso. Recolheram-se em seguida amostras de sangue dos animais, reuniram-se os antisoros obtidos e estabilizaram-se com conservantes.

Exemplo 6 a) Teste dos antisoros por meio da técnica de ensaio imunolo-gico enzimático (ELISA) 0 teste da reacção imunológica dos antisoros obtidos efectuou-se por meio da técnica ELISA. Diluiu-se - 6 -

antigene -AT III de elevado grau de pureza com uma solução Tris (0,025mol/l) até uma concentração de 10 jug/ml e imobi-lizou-se por meio de adsorpção em tubos de poliestireno ♦ Diluiu-se o antissoro a testar com tampão de incubação (0,01 mol/1 Ttis; 0,05% Tween; pH 7,6) na proporção de 1:1,colocou -se 200 jal desta solução em cada tubo e incubou-se durante 30 minutos a 37° C. Removeu-se em seguida a solução de incu bação e lavaram-se 2 vezes com 500 de solução de lavagem (0,02 mol/1 de fosfato de sódio; 0,05% Tween; pH 7,6) de cada vez. Adicionaram-se então 200 μΐ de conjugado de pero-xidase-anticorpos antigomoglobulina de coelho e incubaram-se os tubos durante 30 minutos a 37°C· Após remoção da solução de conjugado e duas lavagens adicionaram-se 200 /il de solução de substrato-cromogene (peróxido de hidrogénio, o feni-lenodiamina) e incubaram-se os tubos a 18-220ύί Passados 30 minutos inactivou-se a peroxidase com ácido sulfúrico e me-diu-se a adsorpção da solução reaccional a 492 nm.

Utilizou-se a técnica ELISA para testar todos os antissoros que se obtiveram a partir dos conjugados péptido--proteína descritos nas alíneas lb), 2b), 3) e 4)* Aplica-ram-se nestes testes os antissoros em várias diluições (1: 101 -1:105).

Na tabela seguinte apresentam-se os valores de absorpção a 492 nm em função da diluição de antissoro em re lação à absorpção de um tubo com solução tampão. A semelhança dos valores de absorpção medidos para cada um dos graus de diluição demonstra que tanto a KLH como a proteína meningococcus são igualmente apropriadas como proteína antigenizante de alto peso molecular, embora o antissoro obtido com o conjugado de proteína meningococcus não reaja com a proteína meningococcus na difusão imunoló-gica dupla (vide b)). b) Teste dos antissoros pela técnica da difusão imunológica dupla. - 7 -

fc

Os antissoros descritos na alínea 6a) testaram--se pela técnica da difusão imunológica dupla por formação de precipitado em relação ã proteína de suporte*

Os antissoros obtidos com o conjugado de IÍLH--péptido mostraram, em diluições de 1:16, em relação ao anti-gene de KLH, uma linha de precipitado evidente em gel de aga-rose. Pelo contrário, os antissoros,obtidos com o conjugado de meningococcus-péptido não deram qualquer precipitado imunológico com proteína B-meningococcus.

Tabela 1

Antissoro contra Grau de diluição OD 492 nm/30 min

Conjugado de pé- 1 10 2,0 ptido-proteína 1 100 1,68 B meningococcus 1 1000 1,30 (AT III 343-363) 1 :.10000 8,77 1 100000 0,63 Conjugado de pl- 1 10 1,28 ptido-proteína 1 100 0,83 B meningococcus 1 1000 0,26 (AT III 129-140) 1 10000 0,09 Conjugado de pé- 1 10 2,0 ptido-KLH 1 100 1,76 (AT III 343-363) 1 1000 1,32 1 10000 0,79 1 100000 0,72 Conjugado de pé- 1 10 1,03 ptido-KLH 1 100 0,84 (AT III 129-140) 1 1000 0,34 1 10000 0,14 Valor em branco do tampão 0,03 - 8 -

Claims (1)

1. +* * RSIVIIDICACOSS - 1§ - Processo para a preparação de tira conjugado de proteína de membrana de Keisseria meningitidis e de um péptido caracterizado por se efectuar a ligaçao entre a proteína e o pe ptido por meio de um processo da química peptídica, por exemplo através do acoplamento de diglutaraldeído ou por introdução de grupos maleimido na proteína seguido da ligação do péptido atra vés das suas funções sulfidrilo. - 2§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, cara cterizado por a proteína ser a proteína Meningococcus B?. - 3* - Processo de acordo com a reivindicação 1, cara cterizado por o péptido ser um péptido da antitrombina III, A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 7 de Dezembro de 1988, sob o número P 38 41 091.5. Lisboa, 6 de Dezembro de 1989 (Q) AGffiSITE iii (C/ΠΙ)AJlt' 13 I^iIííííSaIíMAííj

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