PT2247602E - Derivados de adamantil o-glucuronido como inibidores da dipeptidilpeptidase iv para o tratamento de diabetes - Google Patents

Description

ΡΕ2247602 1 DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE ADAMANTIL O-GLUCURONIDO COMO INIBIDORES DA DIPEPTIDILPEPTIDASE IV PARA O TRATAMENTO DE DIABETES" A presente invenção providencia novos inibidores da dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV) que são eficazes no tratamento de estados mediados por DPP-IV. Foi descoberto que a DPP-IV é responsável pela inativação do péptido-1 tipo glucagon (GLP-1) . Uma vez que o GLP-1 é um importante estimulante da secreção pancreática de insulina e tem efeitos benéficos diretos sobre a eliminação de glucose, a inibição da DPP-IV parece representar uma abordagem atrativa para o tratamento de estados tais como a diabetes mellitus não insulino-dependente (NIDDM). A presente invenção refere-se a um composto de fórmulas (IA), (IB), (XA), (XB), (YA) ou (YB) (compostos da invenção)

2 ΡΕ2247602

(V A)

(Ϋ8) em que R' representa

e R" representa hidrogénio, hidroxi, Ci-C7alcoxi, Ci-Cs-alcanoiloxi, ou R5R4N-CO-O-, em que R4 e R5 são independentemente Ci-C7alquilo ou fenilo que é não substituido ou substituído por um substituinte selecionado a partir de Ci~ C7alquilo, Ci-C7alcoxi, halogéneo e trifluorometilo e em que R4 é adicionalmente hidrogénio, ou R4 e R5 em conjunto representam C3-C6alcileno, na forma livre ou na forma de um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável. A invenção também diz respeito a um composto de fórmulas (I A) , (I B) , (X A) , (X B) , (Y A) ou (Y B) como descrito aqui anteriormente, em que R" representa hidrogénio .

Numa forma de realização preferida, os compostos de fórmulas (I A) , (I B) , (X A) , (X B) , (Y A) ou (Y B) como aqui acima descritos estão numa forma substancialmente pura. 3 ΡΕ2247602

Os compostos da invenção podem existir na forma livre ou na forma de sal de adição de ácido. Os sais farma-ceuticamente aceitáveis (isto é, não-tóxicos, fisiologica-mente aceitáveis) são preferidos, embora outros sais sejam também úteis, e.g., no isolamento ou purificação dos compostos desta invenção. Embora os sais de adição de ácido preferidos sejam os cloridratos, os sais de ácido metanossulfónico, sulfúrico, fosfórico, cítrico, láctico e acético poderão ser igualmente utilizados.

Os compostos da invenção poderão existir na forma de isómeros oticamente ativos ou diastereoisómeros e podem ser separados e recuperados por técnicas convencionais, tais como a cromatografia.

Estão listadas abaixo as definições de vários termos usados para descrever esta invenção. Estas definições aplicam-se aos termos tal como são utilizados ao longo desta invenção, a menos que de outro modo limitado em casos específicos, quer individualmente ou como parte de um grupo maior. 0 termo "alquilo" refere-se a grupos de hidro-carbonetos de cadeia linear ou ramificada com 1 a 10 átomos de carbono, de preferência 1 a 7 átomos de carbono, mais preferencialmente 1 a 5 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquilo incluem metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, pentilo, hexilo e semelhantes. 4 ΡΕ2247602 0 termo "alcanoílo" refere-se a alquil-C(0)-. 0 termo "adamantilo substituído" refere-se a ada-mantilo, i.e., 1- ou 2-adamantilo, substituído por um ou mais, por exemplo dois, substituintes selecionados a partir de alquilo,-ORi, ou -NR2R3; em que Ri, R2 e R3 são independentemente hidrogénio, alquilo, (Ci-Cs-alcanoílo), car-bamilo, ou -CO-NR4R5; em que R4 e R5 são independentemente alquilo, arilo não substituído ou substituído e em que um de R4 e R5 é adicionalmente hidrogénio ou, R4 e R5 representam em conjunto C2-C7alcileno. 0 termo "arilo" representa preferencialmente fenilo. Fenilo substituído é de preferência fenilo substituído por um ou mais, e.g., dois, substituintes selecionados a partir de por exemplo, alquilo, alcoxi, halogéneo e trifluorometilo. 0 termo "alcoxi" refere-se a alquil-0-. 0 termo "halogéneo" ou "halogeno" refere-se a flúor, cloro, bromo e iodo. 0 termo "alquileno" refere-se a uma ponte de cadeia linear com 2 a 7 átomos de carbono, de preferência de 3 a 6 átomos de carbono, mais preferencialmente 5 átomos de carbono. 5 ΡΕ2247602 0 termo "substancialmente puro" é entendido no contexto da presente invenção significar substancialmente isento de material biológico, tal como é encontrado no sangue, especialmente menos que 10%, de preferência inferior a 1%, e ainda mais preferencialmente isento desse material biológico.

Os compostos da invenção podem ser preparados e.g., por um processo que compreende o acoplamento de um composto reativo (2-cianopirrolidino)carbonilmetileno com uma amina substituída apropriada, mais particularmente, para a preparação dos compostos de fórmula I, que compreende a reação de um composto de fórmula II

O

Y

U

em que Y é um grupo reativo (preferencialmente um halogéneo como bromo, cloro ou iodo) com um composto de fórmula III

NH2(CH2)n-R III na qual R é como acima definido, e recuperação do composto resultante de fórmula (I A), (I B) , (X A), (X B) , (Y A) ou (Y B) , na forma livre ou na forma de sal de adição de ácido. os

Os processos alternativos para preparar 6 ΡΕ2247602 precursores dos compostos de fórmula YA ou YB são descritos no pedido de patente WO 01/068603 ou WO 05/095339, para os compostos de fórmula geral XA ou XB. O processo descrito adiante pode ser utilizado para obter a forma S-glucuronido dos compostos descritos no pedido de patente WO 01/068603 ou WO 05/095339 e em que R' é -OH. A unidade R' pode estar ligada à estrutura química por qualquer um dos métodos bem conhecidos pela pessoa especialista na técnica ou pelo processo aqui descrito anteriormente para as estruturas da fórmula química IA ou IB. Através da conversão biológica preparativa utilizando homogeneizado de fígado de rato como o catalisador, o O-glucuronido de vildagliptina foi preparado tal como descrito daqui em diante.

A Vildagliptina (NVP-LAF237-NX ou Galvus®) é um novo fármaco hipoglicémico (anti-diabético) oral da classe de inibidores da dipeptidil peptidase-4 (DPP-4) atualmente em fase de revisão regulamentar pela FDA dos EUA. O candidato descobriu surpreendentemente que o O-glicuronido de vildagliptina (Figura AA) permanece tão ativo quanto a vildagliptina. O requerente descobriu surpreendentemente 7 ΡΕ2247602 que o O-glucuronido de vildagliptina par além de ser igualmente potente como a vildagliptina na inibição da enzima DPP-4, é menos potente na inibição das enzimas DPP-8 e DPP-9. É particularmente inesperado que a substituição do grupo adamantilo de uns inibidores da DPP-4 fosse providenciar um perfil farmacológico melhorado. 0 O-glicuronídeo de vildagliptina pode providenciar mais vantagens farma-cocinéticas ou farmacológicas e.g., menos efeitos colaterais, melhor disponibilidade biológica.

Numa forma de realização mais preferida, o 0-glucuronido de vildagliptina (Figura AA) está numa forma substancialmente pura.

Estão publicadas pedidos de patente WO 2005/ 012249 (ver reivindicação 2) e WO 00/34241 (ver reivindicação 2) derivados de adamantil-cianopirrolidina como inibidores de dipeptidilpeptidase IV, que são úteis para o tratamento da diabetes. O processo da invenção pode ser efetuado de modo ΡΕ2247602 convencional. Por exemplo, o composto de fórmula II é feito reagir com 1 a 3 equivalentes, preferencialmente 3 equivalentes de uma amina primária de fórmula III. A reação é convenientemente conduzida na presença de um solvente orgânico inerte tal como o cloreto de metileno ou de um éter ciclico tal como tetra-hidrofurano. A temperatura é de preferência de cerca de 0 ° até cerca de 35 °C, de preferência entre cerca de 0 ° e cerca de 25 °C.

Os compostos da invenção poderão ser isolados a partir da mistura reacional e purificados de maneira convencional, e.g., por cromatografia.

Os materiais de partida poderão também ser preparados de maneira convencional. Os compostos de fórmula II poderão ser preparados através do seguinte esquema reacional de dois passos: PAS SO i PASSO 2

0 passo 1 envolve a reação da pirrolidina de fórmula IV com um ligeiro excesso molar de um tal halogeneto de halogenoacetilo tal como brometo de bromoacetilo ou cloreto de cloroacetilo e uma base tal como carbonato de potássio ou trietilamina. A reação é convenientemente ΡΕ2247602 conduzida na presença de um solvente orgânico inerte tal como tetra-hidrofurano ou de um hidrocarboneto alifático clorado tal como cloreto de metileno, a uma temperatura de cerca de 0o até cerca de 25 °C, preferencialmente a uma temperatura entre cerca de 0 ° e cerca de 15 °C. O passo 2 diz respeito à desidratação do composto de fórmula V, preparado no Passo 1, com 1 a 2 equivalentes de anidrido trifluoroacético (TFAA). A desidratação é preferencialmente conduzida na presença de um solvente orgânico, inerte, tal como tetra-hidrofurano ou de um hidrocarboneto alifático clorado tal como cloreto de metileno, a uma temperatura de entre cerca de 0 ° e cerca de 25 °C, de preferência a uma temperatura compreendida entre cerca de 0 ° e cerca de 15 °C.

Na medida em que a sua preparação não é aqui particularmente descrita, um composto utilizado como material de partida é conhecido ou poderá ser preparado a partir de compostos conhecidos de uma maneira conhecida ou analogamente a métodos conhecidos ou analogamente a métodos descritos no Exemplo.

Por exemplo, os compostos de amina primária de fórmula III são conhecidos e poderão ser preparados através de procedimentos documentados na literatura, por exemplo, Khim. -Farm. Zh. (1986), 20 (7), 810 -15.

Finalmente, os compostos da invenção ou são quer 10 ΡΕ2247602 obtidos na forma livre, ou como um seu sal, se os grupos formadores de sal estiverem presentes.

Os compostos da invenção possuindo grupos básicos podem ser convertidos em sais de adição de ácido, sais de adição de ácido especialmente farmaceuticamente aceitáveis. Estes são formados, por exemplo, com ácidos inorgânicos, tais como ácidos minerais, por exemplo ácido sulfúrico, um ácido fosfórico ou halidrico, ou com ácidos carboxílicos orgânicos. São preferidos os sais formados com ácido clorídrico.

Em vista da relação estreita entre os compostos livres e os compostos na forma dos seus sais, sempre que um composto é referido neste contexto, um sal correspondente é também pretendido, desde que tal seja possível ou apropriado sob as circunstâncias.

Os compostos, incluindo os seus sais, podem também ser obtidos na forma dos seus hidratos, ou incluir outros solventes usados para a sua cristalização. A presente invenção também inclui composições farmacêuticas, por exemplo, úteis na inibição de DPP-IV, compreendendo um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I, ou um seu sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável. 11 ΡΕ2247602 A presente invenção também se relaciona com a utilização de um composto de acordo com a presente invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e.g., para o fabrico de um medicamento para a prevenção ou tratamento de doenças ou estados associados a niveis elevados de DPP-IV.

Como indicado acima, todos os compostos de fórmulas (I A) , (I B) , (X A) , (X B) , (Y A) ou (YB), e os seus correspondentes sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis, são úteis na inibição de DPP-IV. A capacidade dos compostos da invenção, e dos seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis correspondentes, para inibir a DPP-IV poderá ser demonstrada empregando o Ensaio de Caco-2 DPP-IV que mede a capacidade de testar dos compostos para inibir a atividade da DPP-IV a partir de extratos celulares de carcinoma do cólon humano. A linha celular de carcinoma do cólon humano Caco-2 foi obtido a partir da American Type Culture Collection (ATCC HTB 37). A diferenciação das células para induzir a expressão da DPP-IV foi conseguida como descrito por Reisher et ai. num artigo intitulado "Increased expression of intestinal cell line Caco-2" em Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 90, pgs. 5757-5761 (1993) . O extrato celular é preparado a partir de células solubilizadas em Tris HC1 10 mM, NaCl 0,15 M, 0,04 t.i.u. de aprotinina, 0,5% de nonidet-P40, pH 8,0, que é centrifugado a 35 000 g durante 30 min a 4 °C para remover os detritos celulares. O ensaio é realizado pela adição de 20 yg de proteína de Caco-2 solubilizada, diluída até um volume final de 125 yL em tampão de ensaio (25 mM de Tris 12 ΡΕ2247602 HC1 pH 7,4, 140 mM de NaCl, 10 mM de KC1, 1% de albumina de soro bovino) aos poços da placa de microtitulação. Após 60 min. de incubação à temperatura ambiente, a reação é iniciada pela adição de 25 pL de substrato 1 mM (H-Alanina-Prolina-pNA; pNA é p-nitroanilina). A reação é realizada à temperatura ambiente durante 10 minutos tempo após o qual é adicionado um volume de 19 pL de ácido acético glacial a 25% para parar a reação. Os compostos de teste são tipicamente adicionados como adições de 30 pL e o volume de tampão de ensaio é reduzido até 95 pL. Uma curva padrão de p-nitroanilina livre é gerada utilizando soluções 0-500 pM de pNA livre em tampão de ensaio. A curva gerada é linear e é utilizada para interpolação de consumo de substrato (atividade catalítica em nmoles de substrato clivado/min). O ponto final é determinado pela medição da absorvência a 405 nm num leitor de placas de microtitulação Molecular Devices UV Max. A potência dos compostos teste como inibidores de DPP-IV, expressa como IC5o, é calculada a partir de curvas dose-resposta de 8 pontos, utilizando uma função logística de 4 parâmetros. A capacidade dos compostos da invenção, e dos seus correspondentes sais de adição de ácido farmaceuti-camente aceitáveis, para inibir a DPP-IV pode ser igualmente demonstrada pela medição dos efeitos dos compostos de teste na atividade da DPP-IV em plasma humano e de rato utilizando uma versão modificada do ensaio descrito por 13 ΡΕ2247602

Kubota, et al. num artigo intitulado "Involvement of dipeptidylpeptidase IV in an in vivo imune response", em Clin. Exp. Immunol., Vol. 89, pgs. 192-197 (1992).

Resumidamente, 5 pL de plasma são adicionados a placas de microtitulação de fundo plano de 96 cavidades (Falcon), seguida pela adição de 5 pL de MgCl280 mM em tampão de incubação (HEPES 25 mM, NaCl 140 mM, 1 % de BSA de grau RIA, pH 7,8) . Depois de 60 min de incubação à temperatura ambiente, a reação é iniciada pela adição de 10 pL de tampão de incubação contendo 0,1 mM de substrato (H-Glicina-Prolina-AMC; AMC é 7-amino-4-metilcumarina). As placas são cobertas com folha de alumínio (ou mantidas no escuro) e incubadas à temperatura ambiente durante 20 min. Após os 20 min de reação, a fluorescência é medida utilizando um fluorímetro CytoFluor 2350 (Excitação 380 nm, Emissão 460nm; ajuste de sensibilidade 4). Os compostos de teste são tipicamente adicionados como adições de 2 pL e o volume do tampão de ensaio é reduzido até 13 pL. É gerada uma curva de concentração-fluorescência de AMC livre utilizando soluções de AMC 0-50 pM em tampão de ensaio. A curva gerada é linear e é utilizada para interpolação do consumo de substrato (atividade catalítica em nmoles de substrato clivado/min). Tal como no ensaio anterior, a potência dos compostos teste como inibidores de DPP-IV, expressa como IC50, é calculada a partir de curvas dose-resposta de 8 pontos, utilizando uma função logística de 4 parâmetros.

Em vista da sua capacidade para inibir a DPP-IV, os compostos da invenção, e os seus correspondentes sais de 14 ΡΕ2247602 adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis, são úteis no tratamento de estados mediados pela inibição da DPP-IV. Com base nos resultados acima e na literatura, é esperado que os compostos aqui revelados sejam úteis no tratamento de estados, tais como diabetes mellitus não insulino-dependente, artrite, obesidade, transplante de aloenxerto e calcitonina-osteoporose. Além disso, com base nos papéis dos péptidos tipo glucagon (tais como GLP-1 e GLP-2) e sua associação com a inibição de DPP-IV, é esperado que os compostos aqui revelados sejam úteis, por exemplo, para produzir um efeito sedativo ou ansiolitico, ou para atenuar as alterações catabólicas pós-cirúrgicas e as respostas hormonais à tensão, ou para reduzir a mortalidade e a morbilidade após enfarte do miocárdio ou no tratamento de estados relacionados com os efeitos acima que possam ser mediados por níveis de GLP-1 e/ou GLP -2.

Mais especificamente, por exemplo, os compostos da invenção, e os seus correspondentes sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis, melhoram a resposta precoce da insulina a um desafio de glucose oral e, portanto, são úteis no tratamento de diabetes mellitus não insu-lino-dependente. A capacidade dos compostos da invenção, e os seus correspondentes sais de adição de ácido farmaceuti-camente aceitáveis, para melhorar a resposta precoce da insulina a um desafio oral de glucose pode ser medida em ratos resistentes à insulina de acordo com o método seguinte: 15 ΡΕ2247602

Ratos Sprague-Dawley machos que foram alimentados com uma dieta rica em gordura (gordura saturada = 57% de calorias) durante 2-3 semanas foram sujeitos a jejum durante aproximadamente 2 horas no dia do teste, divididos em grupos de 8-10, e doseados oralmente com 10 ymol/kg dos compostos de teste em CMC. Um bolo de glucose oral de 1 g/kg foi administrado 30 minutos após o composto de teste diretamente no estômago dos animais de teste. As amostras de sangue, obtidas em vários pontos no tempo a partir de cateteres da veia jugular crónica, foram analisadas relativamente às concentrações de glucose plasmática e de insulina imunorreativa (IRI), e atividade DPP-IV do plasma. Os niveis de insulina no plasma foram ensaiados por um método de radioimunoensaio duplo de anticorpo (RIA) utilizando um anticorpo especifico de insulina anti-rato de Linco Research (St. Louis, MO) . O RIA tem um limite inferior de deteção de 0,5 yU/mL com variações intra- e inter-ensaio inferiores a 5%. Os dados estão expressos como % de aumento da média dos animais de controlo. Após administração oral, cada um dos compostos testados amplificou a resposta de insulina precoce que conduziu a uma melhoria na tolerância à glucose nos animais de teste resistentes à insulina. Foram obtidos os seguintes resultados: A dosagem precisa dos compostos da invenção, e dos seus correspondentes sais de adição de ácido farmaceu-ticamente aceitáveis, para serem empregues para tratamento de estados mediados pela inibição da DPP-IV depende de vários fatores, incluindo o hospedeiro, a natureza e a 16 ΡΕ2247602 gravidade do estado a ser tratado, o modo de administração e o composto particular empregue. No entanto, em geral, os estados mediados pela inibição da DPP-IV são eficazmente tratados quando um composto da invenção, ou um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável correspondente, é administrado por via entérica, e.g., por via oral, ou parentérica, e.g., por via intravenosa, de preferência por via oral, a uma dosagem diária de 0,002-5, preferencialmente 0,02-2,5 mg/kg de peso corporal ou, para a maioria dos primatas maiores, uma dosagem diária de 0,1-250, preferencialmente 1-100 mg. Uma unidade de dosagem oral tipica é 0,01-0,75 mg/kg, uma a três vezes por dia. Usualmente, é administrada uma pequena dose inicialmente e a dosagem é aumentada gradualmente até que a dosagem ótima para o hospedeiro em tratamento seja determinada. O limite superior de dosagem é aquele imposto por efeitos secundários e pode ser determinado por ensaio para o hospedeiro a ser tratado.

Os compostos da invenção, e os seus correspondentes sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis, poderão ser combinados com um ou mais veículos farmaceuti-camente aceitáveis e, opcionalmente, um ou mais outros adjuvantes farmacêuticos convencionais e administrados en-tericamente, por exemplo, por via oral, na forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos ovais, etc., ou parenterica-mente, por exemplo, por via intravenosa, na forma de soluções ou suspensões injetáveis estéreis. As composições entéricas e parentéricas poderão ser preparadas por meios 17 ΡΕ2247602 convencionais. Os exemplos de formulações adequadas que compreendem os compostos da invenção são descritos nos pedidos de patente WO 2005/067976 ou WO 2006/078593.

Assim, a invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou dos compostos aqui descritos, na forma livre ou na forma de sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável, em conjunto com pelo menos um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas de acordo com a invenção são aquelas adequadas para administração entérica, tal como oral ou retal, a administração transdérmica e parentérica a mamíferos, incluindo o homem, para o tratamento de patologias mediadas pela atividade de DPP4. Tais estados incluem a tolerância à glicose debilitada, diabetes Tipo 2 e obesidade.

Assim, os compostos farmacologicamente ativos da invenção podem ser empregues no fabrico de composições farmacêuticas compreendendo uma sua quantidade eficaz em conjunção ou mistura com excipientes ou veiculos adequados quer para aplicação entérica ou parentérica. São preferidos os comprimidos e as cápsulas de gelatina compreendendo o componente ativo juntamente com: a) diluentes, e.g., lactose, dextrose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina, 18 ΡΕ2247602 b) lubrificantes, e.g., silica, talco, ácido esteárico, o seu sal de magnésio ou de cálcio e/ou poli-etilenoglicol; para comprimidos também c) aglutinantes, e.g., silicato de magnésio e alumínio, pasta de amido, gelatina, tragacanta, metilcelu-lose, carboximetilcelulose de sódio e ou polivinilpirro-lidona; se desejado d) desintegrantes, por exemplo, amidos, ágar, ácido algínico ou seu sal de sódio, ou misturas efervescentes e/ou e) absorventes, corantes, aromatizantes e edul- corantes.

As composições injetáveis são de preferência soluções isotónicas aquosas ou suspensões, e os supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões gordas. As referidas composições podem ser esterilizadas e/ou conter adjuvantes, tais como agentes conservantes, estabilizantes, molhantes ou emulsionantes, promotores de solução, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Além disso, poderão também conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. As referidas composições são preparadas de acordo com métodos convencionais de mistura, granulação ou revestimento, respetivamente, e conter cerca de 0,1-75%, preferencialmente cerca de 1-50%, do componente ativo. As formulações adequadas para aplicação transdérmica incluem uma quantidade terapeuticamente 19 ΡΕ2247602 eficaz de um composto da invenção com veiculo. Os veículos vantajosos incluem solventes absorvíveis farmacologicamente aceitáveis para auxiliar a passagem através da pele do hospedeiro. Caracteristicamente, os dispositivos transdér-micos estão na forma de uma faixa compreendendo um membro de apoio, um reservatório contendo o composto opcionalmente com veículos, opcionalmente uma barreira controladora da velocidade para administrar o composto à pele do hospedeiro a uma taxa controlada e predeterminada durante um período prolongado de tempo, e meios para segurar o dispositivo à pele. Concordantemente, a presente invenção providencia composições farmacêuticas como descrito acima para o tratamento de estados mediados por inibição de dipeptidil-peptidase-IV, de preferência, tolerância à glicose debilitada, diabetes Tipo 2 e obesidade. A presente invenção também providencia a utilização de composições farmacêuticas tal como descrito acima para o tratamento de estados mediados pela inibição da enzima dipeptidil-peptidase-IV, de preferência, tolerância à glicose debilitada, diabetes Tipo 2 e obesidade, em que o composto da invenção (tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4) é administrado em combinação com outro agente terapêutico, e.g., um ou dois agentes adicionais, tal como a descrito daqui em diante. As composições farmacêuticas poderão conter uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção como aqui definido (e.g., nas reivindicações 1 a 4), quer isoladamente ou em combinação com outro agente terapêutico, e.g., cada um numa dose terapêutica eficaz como relatado na técnica. Tais agentes terapêuticos incluem: 20 ΡΕ2247602 a) agentes antidiabéticos, tais como insulina, derivados e mímicos de insulina; secretores de insulina tais como as sulfonilureias, por exemplo, Glipizida, gliburida e Amaryl; ligandos recetores de sulfonilureia insulinotrópica, tais como meglitinidas, e.g., nateglinida e repaglinida; inibidores de proteína tirosina fosfatase-lB (PTP-1 B) tais como de PTP-112; GSK3 (glicogénio-sintase-quinase-3) inibidores tais como SB-517955, SB-4195052, SB-216763, NN-57-05441 e NN-57-05445; ligandos de RXR tais como GW-0791 e AGN-194204; inibidores de co-transportador de glicose dependente de sódio, tais como T-1095, inibidores de glicogénio-fosforilase A tais como BAY R3401; biguanidas tais como metformina; inibidores de alfa-glucosidase tais como acarbose; GLP-1 (péptido 1 tipo glucagon), os análogos de GLP-1 tais como Exendina-4 e mímicos de GLP-1 e inibidores de DPPIV (dipeptidil-peptidase IV) tais como vildagliptina; b) agentes hipolipídicos tais como inibidores de 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase, e.g., lovastatina, pitavastatina, sinvastatina, pravasta-tina, cerivastatina, mevastatina, velostatina, fluvasta-tina, dalvastatina, atorvastatina, rosuvastatina e rivastatina, inibidores de esqualeno-sintase; FXR (recetor X de famesoid) e ligandos LXR (recetor X de fígado); colestiramina; fibratos; resinas de ligação a ácido biliar ácido nicotínico, tais como a colestiramina, fibratos, ácido nicotínico e os outros agonistas de GPR109; inibidores da absorção de colesterol, tais como ezetimibe; inibidores 21 ΡΕ2247602 de CETP (inibidores da proteína de transferência de colesterol-éster), e aspirina; c) agentes anti-obesidade, tais como orlistat, sibutramina e antagonistas de Recetor Canabinóide 1 (CB1), e.g., rimonabanto, e d) agentes anti-hipertensivos, e.g., diuréticos da ansa tais como ácido etacrínico, furosemida e torsemida; inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA) tais como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisino-pril, moexipril, perinodopril, quinapril, ramipril e tran-dolapril; inibidores da bomba da membrana de Na-K-ATPase tais como digoxina; inibidores de neutralendopeptidase (NEP), inibidores de ACE/NEP, tais como omapatrilat, sampa-trilat e fasidotril; antagonistas de angiotensina II tais como candesartan, eprosartan, irbesartan, losartan, valsar-tan telmisartan e, em particular, valsartan; inibidores da renina, como ditekireno, zankireno, terlakireno, o alisci-reno, RO 66-1132 e RO-66-1168; bloqueadores do receptor β-adrenérgico, tais como acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, metoprolol, nadolol, propranolol, sotalol e timolol; agentes inotrópicos tais como digoxina, dobutamina e milrinona; bloqueadores dos canais de cálcio, tais como amlodipina, bepridilo, diltiazem felodipina, nicardipina, nimodipina, nifedipina, nisoldipina e verapamil; antagonistas de receptor de aldosterona e inibidores de aldosterona sintase; 22 ΡΕ2247602 e) agonistas de recetores de proliferador-ativa-dor de peroxissoma, tais como fenofibrato, pioglitazona, rosiglitazona, tesaglitazar, BMS-298585, L-796449, os com postos especificamente descritos no pedido de patente WO 2004/103995 i.e., os compostos dos exemplos 1 a 35 ou os compostos especificamente listados na reivindicação 21, ou os compostos especificamente descritos no pedido de patente WO 03/043985 i.e., os compostos dos exemplos 1 a 7 ou os compostos especificamente listados na reivindicação 19 e especialmente, (R)—1 — {4 —[5-metil-2-(4-trifluorometil-fe- nil)-oxazol-4-ilmetoxi]-benzenossulfonil}-2,3-di-hidro-lH-indole-2-carboxílico ou um seu sal.

Assim, a invenção abrange composições farmacêuticas que compreendem: i) um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, e ii) pelo menos um composto selecionado de entre a) agentes antidiabéticos, b) agentes hipolipidicos, c) agentes anti-obesidade, d) anti agentes-hipertensivos, e) agonistas de recetores de proliferador-ativador de peroxissoma, iii) um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. 23 ΡΕ2247602

Outros compostos anti-diabéticos específicos são descritos por Patel Mona em Expert Opin Investig Drugs, 2003, 12 (4), 623-633, nas figuras 1 a 7. Um composto da presente invenção pode ser administrado quer simultaneamente, antes ou depois do outro componente ativo, quer separadamente pela mesma ou diferente via de administração ou em conjunto na mesma formulação farmacêutica. A estrutura dos agentes terapêuticos identificados por números de código, nomes genéricos ou comerciais pode ser tomada a partir da edição atual do compêndio padrão "The Merck índex" ou a partir de bases de dados, e.g., Patents Internacional (por exemplo, IMS World Publications). Concordantemente, a presente invenção providencia composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um composto da invenção em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um outro agente terapêutico, de preferência selecionado a partir de anti-diabéticos, agentes hipolipidémicos, agentes anti-obesidade ou agentes anti-hipertensivos, a maioria preferencialmente desde antidiabéticos ou agentes hipolipídicos como descrito acima. A presente invenção diz ainda respeito a composições farmacêuticas tal como descrito acima para utilização como um medicamento. A presente invenção refere-se ainda ao uso de composições ou combinações farmacêuticas como descrito acima para a preparação de um medicamento para o tratamento de estados mediados pela inibição da enzima dipeptidil-peptidase-IV, de preferência, deficiente tolerância à glicose, diabetes Tipo 2 e obesidade. 24 ΡΕ2247602

Os compostos da invenção, e os seus correspondentes sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis, poderão ser formulados em composições farmacêuticas entéricas e parentéricas contendo uma quantidade da substância ativa que é eficaz para tratar estados mediados por inibição de DPP-IV, tais composições na forma de dosaqem unitária e tais composições compreendendo um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Os compostos de acordo com a invenção (incluindo aqueles de cada um dos sub-âmbitos do mesmos e cada um dos exemplos) podem ser administrados em forma enantiome-ricamente pura (e.g., ee > 98%, de preferência > 99%) ou em conjunto com o enantiómero R, e.g., na forma racémica. As gamas de dosagem referidas acima baseiam-se nos compostos da invenção (excluindo a quantidade do enantiómero R).

Os exemplos seguintes mostram compostos representativos englobados por esta invenção e a sua síntese. No entanto, deve ser claramente compreendido que são apenas para fins de ilustração. I. Exemplo 1

Pirrolidina, 1-[(3-hidroxi-l-adamantil)amino]acetil-2-cia-no-, (S) (INN: vildagliptina) ou NVP-LAF237

25 ΡΕ2247602 A. l-aminopadamantano-3-ol:

Poderão ser utilizadas ligeiras modificações para a sintese encontrada em Khim. -Farm. Zh. (1986), 20(7), 810-15. A uma mistura, agitada rapidamente, transparente e incolor, arrefecida em de água gelada, de ácido sulfúrico concentrado a 96% (210 mL; 3,943 mmol) e ácido nitrico a 65% (21,0 mL; 217,0 mmol) são adicionados 21,0 g (112,0 mmol) de 1-adamantilamina HC1 (99%), em peguenas porções durante 30 minutos. Após a adição do cloridrato de adamantilamina, ocorre ligeira borbulhação e a reação é ligeiramente exotérmica. Esta borbulhação, a solução amarela é agitada à temperatura da água gelada durante cerca de 2 horas e seguidamente à temperatura ambiente durante 30 horas. Esta reação amarela clara é seguidamente vertida sobre 100 g de gelo e a solução limpida resultante é verde-azul. A solução é colocada num banho de água gelada e deixada a agitar durante 30 minutos. Aproximadamente 550 g de KOH puro a 89% (8,74 mol) são seguidamente adicionados em pequenas porções durante 45 minutos. Durante esta adição, a reação é exotérmica, chegando a 80 °C e produzindo grandes quantidades de gases castanhos de NO2. No final da adição, a reação é espessa com sólidos brancos (tanto o produto como os sais). A pasta branca resultante é ΡΕ2247602 seguidamente vertida para um funil de Buchner/camada de celite e lavada com 1,2 L de CH2CI2. A fase de CH2CI2 é seguidamente extraida da fase aquosa e seca sobre Na2S04. A solução é seguidamente filtrada e concentrada (evaporador rotativo/ bomba) para providenciar o l-aminoadamantano-3-ol como um sólido branco. B. l-Cloroacetil-2-cianopirrolidina A uma solução agitada mecanicamente de 20,0 g (180,0 mmol) de cloreto de cloroacetilo e 97 g (0,70 mmol) de carbonato de potássio em 150 mL de tetra-hidrofurano é adicionada uma solução de L-prolinamida 20,0 g (180,0 mmol) em 500 mL de tetra-hidrofurano gota a gota durante 45 minutos. Esta reação é seguidamente agitada mecanicamente durante duas horas adicionais à temperatura ambiente. A reação é seguidamente filtrada para remover os sais de potássio e o filtrado é seco sobre Na2SC>4. O Na2SC>4 é seguidamente removido através de filtração e a este filtrado incolor é adicionado anidrido trifluoroacético (25,0 mL, 0,180 mmol) numa porção. A reação é seguidamente agitada magneticamente durante 1 hora à temperatura ambiente e a solução limpida amarela/laranja resultante é concentrada através de evaporador rotativo. O excesso de anidrido trifluoroacético é removido por adição de acetato de etilo ao óleo concentrado e reconcentração através do evaporador rotativo. Esta operação de remoção é realizada três vezes. ΡΕ2247602 0 óleo resultante é repartido entre acetato de etilo e água. 0 produto é seguidamente extraído em acetato de etilo e a fase aquosa é seguidamente lavada duas vezes com acetato de etilo. As fases orgânicas combinadas são seguidamente lavadas sucessivamente com água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas para se obter a 1-cloro-acetil-2-cianopirrolidina como um sólido amarelo. C. Pirrolidina, 1-[(3-hidroxi-l-adamantil)amino]acetil-2-ciano-,(S) A uma solução heterogénea do composto intitulado A (l-aminoadamantano-3-ol (5,80 g, 34,7 mmol) em CH2CI2 (68,0 mL) são adicionados 9,6 g (69 mmol) de K2CO3. Esta mistura heterogénea é seguidamente arrefecida num banho de água gelada e é adicionada gota a gota uma solução de 3,0 g (17 mmol) do composto intitulado B (l-cloroacetil-2-cianopirrolidina) dissolvido em 25,0 mL de CH2CI2 durante um período de 30 minutos. A mistura resultante é agitada durante 2 horas a 0 °C e à temperatura ambiente durante 6 dias. A reação é seguidamente concentrada para se obter um material pastoso amarelo que é purificado em sílica gel utilizando um sistema de cromatografia flash SIMS/Vintage e uma solução de metanol a 7% em cloreto de metileno como eluente para originar o composto intitulado na forma de base livre como um sólido cristalino branco (ponto de fusão 138 °C-140 °C, 13C RMN (ppm) = 119,59). 28 ΡΕ2247602 A. D. Síntese biocatalítica de NVP-BQS867 (o O-qlucurónido de vildagliptina) e NVP-BRU563 (o O-qlucurónido de vildagliptina marcado). 0 esquema reacional da glucuronidação enzimática de NVP-LAF237 sob catálise de homogeneizado de fígado de rato é mostrada na Figura 4-1. (i) Figura 1-1 Biotransformação de NVP-LAF237

a 3.1. Preparação do homogeneizado de fígado de rato

Duas porções de 15 g, e uma de 11 g de fígado de rato congelado, foram descongeladas e cortadas em pedaços pequenos. Após adição de 0,5 volumes equivalentes de uma solução de NaCl a 0,9% arrefecida em gelo para cada porção de fígado e misturando, num misturador Dispomix, o tecido foi homogeneizado num homogeneizador de tecidos "Potter S" (Braun Biotech Inc., Melsungen, Alemanha) sob arrefecimento em água gelada, movendo o pistilo de teflon três vezes para cima e para baixo a uma velocidade de agitação de 100%. O homogeneizado foi preenchido até um peso final de 81 g e 29 ΡΕ2247602 centrifugado a 4-6 °C, durante 30 min a 10 000 rpm (= 17000 x g) numa centrífuga Beckmann Coulter (Fullerton, CA, EUA) tipo Avanti J-HC equipada com um rotor JA-10. O sobrenadante serviu como a fonte de enzima. 4.2. Bioconversão em escala preparativa

As condições para a glucuronidação de NVP—LAF237 (vildagliptina) na escala de 340 mg foram: NVP-LAF237 5 mM, UDP-glucuronato (Yamasa, Co., Tokyo, JP) 20 mM, MgCl2 20 mM, HEPES, pH 8,5, 160 mM, homogeneizado de fígado de rato a 20% v/v, o volume total de 224 mL, incubação durante 5 h, a 37 °C e 14 h adicionais a 30 °C. As reações foram realizadas em tubos Nunc de 50 mL, cada um cheio com 20 mL de mistura reacional, as quais foram agitadas a 170 rpm num agitador de laboratório microbiológico com um raio de agitação de 5 centímetros. A reação preparativa foi parada por adição de 224 mL de acetonitrilo e mistura durante 10 min a 20 °C. Após centrifugação durante 15 min a 8000 rpm (rotor JA-10), o sedimento foi suspenso em 50 mL de acetonitrilo em água desionizada a 50% v/v de e novamente centrifugado. Os sobrenadantes combinados foram concentrados até 50 mL sob pressão reduzida a 25 °C. O concentrado turvo foi centrifugado a 5000 rpm, e após a filtração do sobrenadante através de fibra de vidro foi submetido a HPLC preparativa. 30 ΡΕ2247602

Para a glucuronidação de NVP-LAF237 marcado [13Cs 15N] (e scala de 50 mg) , as condições de biotransformação foram as mesmas que para o NVP-LAF237 na escala de 340 mg, exceto que a concentração de UDP-glucuronato foi de 80 mM, homogeneizado de figado de rato a 30% v/v, o volume de enchimento dos tubos Nunc foi 16,5 mL, o volume total de 33 mL, o tempo reacional de 4 h e a velocidade de agitação 200 rpm. A reação foi parada por adição de 16,5 mL de acetonitrilo a cada tubo, incubação durante 15 min em gelo e mistura subsequente. Após centrifugação durante 15 min a 17 000 rpm (rotor JA-10), o sedimento foi ressuspenso em 20 mL de acetonitrilo a 50% v/v em água desionizada e novamente centrifugado. Os sobrenadantes combinados foram concentrados até 10 mL sob pressão reduzida a 30 °C, novamente diluídos até 25 mL do volume final e centrifugado para clarificação final. O sedimento foi ressuspenso em 5 mL de água desionizada, e após a centrifugação, os últimos dois sobrenadantes foram combinados e submetidos a HPLC preparativa .

Medição da conversão/HPLC-DAD analítico: 50 μί de

uma amostra 19 h do lote de 340 mg de NVP-LAF237 e 25 μί de uma amostra 4 h do lote com NVP-LAF237 marcado [13C5 15N] foram cada um misturados com 200 μL de acetonitrilo em água a 50% e centrifugados numa centrífuga refrigerada Sigma 4K15C. O sobrenadante foi analisado por RP18-HPLC-DAD 31 ΡΕ2247602 analítico (HPLC-DAD 1100 series da Agilent Technologies, Basel, Suíça, duas colunas ligadas do tipo Chromolith Performance RP-18e 100 x 4,6 mm com um Chromolith Guard Cartridge RP-18e 5 x 4,6 mm (Merck), caudal 2 mL/min; fase móvel A: H3P04 aquoso a 3 mM, fase móvel B: acetonitrilo, gradiente de 3% até 15% de B em 5 min, deteção DAD a 200-400 nm) . A conversão foi baseada nas áreas dos picos de absorção de UV a 205 nm do glucorónido e NVP-LAF237. 5. E. purificação dos metabolitos a) a) NVP-BQS8 67-NX-2

Uma parte (5 mL ou cerca de 10%) do material de partida bioconvertido foi utilizada para a preparação do lote de NVP-BQS867-NX-2. A este volume foram adicionados 35 mL de NH4Ac aquoso 10 mM e 8 mL de metanol. O pH foi ajustado até 7 com ácido acético diluído. Esta mistura foi seguidamente utilizada como solução de injeção para cromatografia líquida preparativa. 0 sistema de cromatografia líquida preparativa-espetrometria de massa consistiu num sistema Waters Autopurification (Waters Corp Milford, MA, EUA), com uma bomba 2525, gestor de amostras 2767, detetor de fotodíodos 2996, bomba de make-up 515, espetrómetro de massa ZQ2000 e o suporte lógico (software) MassLynx 4,0 e FractionLynx 4,0. 32 ΡΕ2247602

Foi empregue uma coluna Atlantis dC18, 5 μm, 19 mm x 100 mm (Waters) , caudal de 20 mL/min; fase móvel A: NH4Ac aquoso 10 mM, pH 7,0; fase móvel B: CH3CN/CH3OH 4:1, NH4Ac 10 mM; programa de gradiente: 0 min. 5% de B, 2 min. 5% B, 7 min. 20% de B, 7,1-12 min. 95% de B; 12,1-14 min 5% de B; volume de injeção 1-5 ml. 0 efluente da coluna foi dividido, uma parte muito pequena foi misturada em linha com o liquido de make-up 2-propanol/H20/HC00H 400:100:1 e introduzido na fonte iónica do espetrómetro de massa, o resto entrou no detetor DAD registando de 200-600 nm, e, posteriormente, o gestor da amostra para a recolha da fração. 0 espetrómetro de massa estava equipado com uma interface ESCi utilizado no modo de ESI positivo. Uma voltagem capilar de 3 kV e foi aplicado um cone de voltagem de 30 V; intervalo de massas 250-550 Da. A fração alvo foi recolhida com base no tempo 5,3-6,7 min. As frações alvo das 12 execuções de ensaio de HPLC foram combinadas, o solvente orgânico foi removido sob pressão reduzida a 30 °C, e a solução restante liofilizada a -80 °C e 0,2 mbar originando 15 mg de liofilizado quase incolor. A pureza foi determinada por HPLC-DAD e HPLC-MS (ver secção 2.2.2): Além dos sais (acetato de amónio) e água o lote NVP-BQS867-NX-2 tinha uma pureza > 97%. 33 ΡΕ2247602 b) b)NVP-BRU563-NX-1 (glucurónido marcado estável)

Um volume igual de solução de NH4Ac 20 mM foi adicionado ao extrato aquoso para formar uma concentração de 10 mM de NH4Ac. Esta mistura foi ajustada para pH 7,0 com ácido acético diluído e depois utilizada como uma solução injectável para cromatografia líquida preparativa. O sistema de cromatografia líquida - espectro-metria de massa preparativa foi descrito em 2.1.3.1.

Foi empregue uma coluna (Waters) Atlantis Prep dC18 OBD, 5 μιη, de 30 mm x 150 mm; caudal de 4 0 mL/min; fase móvel A: NH4Ac aquoso a 10 mM; fase móvel B: CH3CN/CH3OH 4:1 + NH4Ac a 10 mM, pH 7,0 ; programa de gradiente: 0 min. 5% de B; 2 min. 5% de B; 7 min. 20% de B; 7,1-12 min. 95% de B; 12,1-14 min 5% de B; volume de injeção 2-6 mL. O efluente da coluna foi dividido da mesma forma como descrito no 2.1.3.1. O espetrómetro de massa foi equipado com uma interface ESCi e utilizado em modo de ESI positivo. Foi aplicada uma tensão capilar de 3 kV e uma tensão de cone de 30 V; intervalo de massa 100-1000 Da. A fração alvo foi recolhida com base no tempo de 7,0-9,0 min. As frações alvo de 12 execuções de ensaio de 34 ΡΕ2247602 HPLC foram combinadas, o solvente orgânico foi removido sob pressão reduzida a 30 ° C, e a solução restante liofilizada a -80 °C e 0,2 mbar originando 63 mg de liofilizado quase incolor. A pureza foi determinada por HPLC-DAD e HPLC-MS (ver secção 2.2.2): Além de sais (acetato de amónio) e água o lote NVP-BRU563-NX-1 tinha uma pureza > 98%. B. F. Analítica para a identificação estrutural

1. Espectroscopia de RMN

Os compostos foram dissolvidos em 5 μ]1 de DMSO-dô e colocados num tubo de RMN de 1 mm de diâmetro. Foram obtidos de NVP-BQS867, um espetro 1D-1H e espetros 2D homo-e heteronuclear (COSY, HSQC, HMBC, ROESY). A partir de NVP-BRU563 foi medido um espetro de 1H. Todos os espetros foram registados a 300 °K num espetrómetro Bruker DRX600, utilizando uma sonda de microlitro 1H {13C, 15N} . A partir de NVP-BQS867 foi medido um espetro de 13C num espetrómetro BRUKER DRX600 utilizando uma criossonda de 5 mm 13C{1H}. 2. HPLC-espectrometria de massa O cromatógrafo líquido consistiu num Waters Acquity UPLC (Waters), equipado com um detetor 2996 PDA Waters Acquity. Coluna: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 μπι, 1,0 x 35 ΡΕ2247602 150 mm (Waters), caudal 0,1 mL/min, eluente A:. H2O/TFA 100:0,1; eluente B: acetonitrilo/TFA 100:0,1; gradiente: 0 min. 5% de B; 1 min. 5% de B; 11 min. 40% de B; 13-16 min. 95% B; 30 °C; deteção por UV: 200-350 nm, resolução a 2,4 nm, volume de injeção de 5 μΐι. A substância foi dissolvida em água/acetonitrilo 9:1 a uma concentração de aproximada-mente 0,3 mg/mL. A avaliação da pureza foi feita por UV a 210 nm como a % de área do pico pretendido. O efluente da coluna foi introduzido diretamente na fonte de iónica do MS.

Foi utilizado um espetrómetro de massa TSQ Quantum AM (Thermo, San Jose, CA, EUA), equipado com interface de electropulverização em modo positivo. Este foi operado com a versão 2.0 do suporte lógico (software) Xcalibur. Foi utilizado um ajuste de gás de bainha de 25 unidades e gás auxiliar de 5 unidades e aplicada uma voltagem de pulverização de 3 kV. A capilaridade do metal aquecido foi mantida a 300 °C, intervalo de massas 200 a 800 Da. Parâmetros MS/MS: gás de colisão de 1,5 mTorr de árgon; energia de colisão de 25 V. II. G. Resultados: A. 1. Sintese biocatalitica

Para as duas reações preparativas, o HPLC-DAD analítico originou os seguintes valores de conversão: 66% 36 ΡΕ2247602 para o lote com 340 mg de NVP-LAF237 e 94% para o lote com NVP-LAF237 [13C5 15N] marcado (50 mg) . 2. Purificação dos glucorónidos

Tal como descrito na secção anterior, foram obtidos 15 mg de O-glucurónido NVP-BQS867-NX-2 por HPLC-MS preparativa a partir de 5 mL de extrato de cultura aquoso obtido a partir da biotransformação. A partir da totalidade da reação preparativa com 340 mg de NVP-LAF237, foram isolados quatro lotes de NVP-BQS867-NX (NX-1 até NX-4) com uma quantidade total de 295 mg de O-glucurónido. 3. Elucidação estrutural O espetro de massa de NVP—BQS867—NX—2 mostra uma [M+H]+ de 480,1 sugerindo um peso molecular de 479. Isto é consistente com um glucurónido de NVP-LAF237. O espetro iónico do produto MS/MS de ião de mostra a perda de glucurónido (m/z 304), bem como o ácido glucurónico (m/z 286) . A estrutura de NVP-BQS867-NX-2 (Figura 3-1), foi inequivocamente elucidada com base na espetroscopia de RMN. As principais diferenças nos espetros de RMN de NVP-BQS867 em comparação com NVP-LAF237 são principalmente as ressonâncias obtidas a partir da unidade de glucurónido. Os desvios ΧΗ (4,42 ppm) e 13C (96,4 ppm) da ressonância 1' anomérica do ácido glucurónico indicou que este último está 37 ΡΕ2247602 ligado ao oxigénio e não ao nitrogénio. Uma correlação HMBC de H-l' para C-3 e as correlações de ROESY H-l' para H-2 e H-4, confirmaram inequivocamente a estrutura ilustrada na Figura 3-1. A interpretação de todos os dados de RMN e das correlações conduziram a só uma única estrutura que está de acordo com o resultado de MS (PM = 479, m/z MH+ = 480,1). Uma sintese de todos os desvios de 1R e 13C e correlações homo e heteronucleares relevantes é mostrada na Tabela 3-1. O composto NVP-BRU563-NX-3, biossintetizado a partir de NVP-LAF237 marcado [U-pirrolidin,ciano-13C5, pirrolidin-15N], mostrou propriedades espetrais idênticas a NVP-BQS867-NX, com as exceções esperadas para o marcado estável: A MH+ de 486,2 é 6 Da mais elevada que a de NVP-BQS867-NX e no espetro iónico de produto de MS/MS alguns fragmentos estão também desviados.

1

Figura II-l Estrutura de NVP-BQS867 com o esquema de numeração utilizada na Tabela 3-1 e espetro de ^ 38 ΡΕ2247602 (b) Tabela II-l atribuições 1H- e 13C para a estrutura de NVP-BQS867 Pos. Grupo Desvio Oí Desvio 13C Correlação HMBC Correlações NOE 1 Cq 53,6 H-10, H-2, H-5 2 ch2 1,74, 1,60 46,6 H-l' 3 Cq 75,4 H-l', H-2, H-4 4 2x 1,70, 1,67 41,9, 41,6 H-l' ch2 1,60 5 2x 1,55 41,4, 41,1 ch2 6 2 x CH 2,20 30,5, 30,6 7 ch2 1,48, 1,43 35,5 10 ch2 3,53, 3,49 43,5 11 CO 170,9 H-10 13 ch2 3,64, 3,46 45,7 14 ch2 2,06, 1,99 25,2 15 ch2 2,20, 2,13 30,0 16 CH 4,76 47,2 17 Cq 119,9 H-16, H-15 1' CH 4,42 96,4 H-2', H-5 H-2, H-4, H-2', H-3', H-5' 2' CH 2,89 73,8 3' CH 3,15 77,4 4' CH 3,18 72,7 5' CH 3,41 74,4 6' CO 172,6

Outro composto preferido é:

39 ΡΕ2247602

Numa concretização mais preferida, o composto da Figura BB está numa forma substancialmente pura.

Este composto O-glucurónido (Fig. BB) pode ser obtido pela adaptação do processo aqui descrito. 0 processo para se obter o composto de partida em que R' é -OH é descrito no pedido de patente WO 01/068603 ou WO 05/095339.

Um sal pode ser o sal de HC1. (HC1) = como cloridrato. Todos os sais de HC1 dos produtos finais são preparados através da passagem de HC1 gasoso através de uma solução 0,1 Molar da base livre em tetra-hidrofurano até que a solução esteja claramente acidica seguida de remoção do solvente (evaporador rotativo/bomba).

Os materiais de partida amino-adamantano são conhecidos na literatura ou podem ser preparados como se segue: A preparação de 3,5-dimetil-l-adamantilamina está descrita em J. Med. Chem, 25, 1; 1982, 51 -56. A preparação de 3-etil-l-adamantilamina está descrita em J. Med. Chem, 25, 1; 1982, 51-56. A 3-Metoxi-l-adamantilamina pode ser preparada como se segue: A uma suspensão agitada, arrefecida em água 40 ΡΕ2247602 gelada de hidreto de potássio (0,680 g, 5,95 mmol) em 15,0 mL de tetra-hidrofurano é adicionada uma mistura de l-aminoadamantano-3-ol (1,00 g, 5,95 mmol) e 15,0 mL de tetra-hidrofurano, gota a gota durante 30 minutos. A mistura resultante é seguidamente agitada durante 30 minutos adicionais e seguidamente é adicionado gota a gota iodometano (0,370 mL, 5,95 mmol) durante um minuto. A mistura reacional branca opaca resultante é seguidamente agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura é seguidamente diluída com 50 mL de cloreto de metileno e filtrada para remover as impurezas inorgânicas. O filtrado é seguidamente concentrado e purificado em sílica gel utilizando um aparelho SIMS /Biotage e metanol a 19% e hidróxido de amónio a 1% em cloreto de metileno como eluente para originar a 3-metoxi-l-adamantilamina como um óleo opaco. Síntese de 3- [ [ (te-rc-butilamino) carbonil] oxi] -1-aminoada- mantano: A uma mistura de l-aminoadamantano-3-ol (5,00 g, 30,0 mmol) e carbonato de potássio (6,20 g, 45 mmol) em 150 mL de tetra-hidrofurano é adicionado benzilcloroformato (4,70 g, 33,0 mmol) gota a gota durante um período de 10 minutos. A mistura é seguidamente agitada à temperatura ambiente durante 2 h e seguidamente repartida entre acetato 41 ΡΕ2247602 de etilo e água. 0 produto é seguidamente extraído em acetato de etilo e a fase aquosa é lavada duas vezes com acetato de etilo (100 mL) . As fases orgânicas combinadas são seguidamente lavadas sucessivamente com 100 mL de hidróxido de sódio aquoso 2 N, água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas (evaporador rotativo/bomba) para proporcionar l-benzilcarbamoiladamantano-3-ol como um sólido branco com 85% de rendimento. A uma solução límpida de l-benzilcarbamoiladamantano-3-ol (1,00 g 3,32 mmol) e terc-butilisocianato (380 μΕ, 3,32 mmol) em 30 mL de cloreto de metileno é adicionado cloreto de trimetilsililo através de seringa (20,0 μL, 0,17 mmol). Esta reação é seguidamente agitada à temperatura ambiente durante 18 horas, concentrada (evaporador rotativo) e purificada em sílica gel utilizando um aparelho SIMS/Biotage e 20% de acetato de etilo em hexano como eluente para originar o 3-[[(terc-butilamino)carbonil]-oxi]-1-benzilcarbamoiladaman-tano como um sólido branco com rendimento quantitativo. A uma mistura de 3-[[(terc-butilamino)carbonil] oxi]-1-benzilcarbamoiladamantano (1,50 g, 3,75 mmol) e 10% de paládio sobre carbono (400 mg) em etanol (150 mL) num balão de hidrogenação Parr de 1 litro é adicionado hidrogénio (50 psi). Esta mistura preta opaca é seguidamente agitada durante 24 h. A reação é seguidamente filtrada através de celite para remover o catalisador de paládio e concentrada (evaporador rotativo/bomba) para proporcionar 3-[[(terc-butilamino)carbonil]oxi]-1-aminoadamantano como um óleo incolor com 99% de rendimento. 42 ΡΕ2247602 0 procedimento para a síntese de 4- [[[(meto-xifenil)amino]carbonil]oxi]-1-aminoadamantano é essencialmente o procedimento do 3-[[(terc-butilamino) carbonil]-oxi]-1-aminoadamantano exceto no segundo passo em que um equivalente de 4-metoxifenilisocianato substitui o terc-butilisocianato, é utilizado 1,2-dicloroetano como solvente em vez de cloreto de metileno e a reação é agitada a 50 °C durante 18 horas. O intermediário amina final, é providenciado como um óleo. O procedimento para a síntese de 3- [ [ (fenilami-no)carbonil]oxi]-1-aminoadamantano é essencialmente o procedimento do 3-[[(terc-butilamino)carbonil]oxi]-1-aminoadamantano exceto no segundo passo em que um equivalente de isocianato de fenilo substitui o terc-butilisocianato, é utilizado 1,2-dicloroetano como solvente em vez de cloreto de metileno e a reação é agitada a 50 °C durante 18 horas. O intermediário amina final, é providenciado como um óleo límpido. O procedimento para preparar o 2-aminoadamantano-5-ol é o mesmo que no Exemplo 1, exceto que o material de partida é o 2-aminoadamantano em vez do 1-aminoadamantano. O procedimento para a síntese do nucleófilo 3-acetoxi-1-aminoadamantano é essencialmente o procedimento do 3-[[(terc-butilamino)carbonil]oxi]-1-aminoadamantano exceto para uma acilação padrão de 1-benzilcarbamoil-ada- 43 ΡΕ2247602 mantano-3-ol utilizando 1,2 eq de cloreto de acetilo, 3,0 eq. de piridina, 0,1 eq de 4-dimetilaminopiridina e 1,2 dicloroetano que são todos agitados à temperatura ambiente durante 24 horas. A amina final é providenciada como um óleo espesso. O procedimento para a sintese de 3-[[[(di-iso-propil)amino]carbonil]oxi]-1-aminoadamantano é essencialmente o procedimento do 3-[[(terc-butilamino) carbonil]-oxi]-1-aminoadamantano exceto no segundo passo em que um equivalente de cloreto de diisopropilcarbamoilo substitui o terc-butilisocianato, é utilizado 1,2-dicloroetano como solvente em vez de cloreto de metileno e a reação é agitada a 85 °C durante 18 horas. O intermediário amina final, é providenciado como um sólido cinzento. O procedimento para a sintese do 3-[[[ (ciclo-hexil)amino]carbonil]oxi]-1-aminoadamantano é essencialmente o procedimento do 3-[[(terc-butilamino)carbonil]oxi]-1-aminoadamantano exceto no segundo passo em que um equivalente de ciclo-hexilisocianato substitui o terc-butilisocianato, é utilizado 1,2-dicloroetano como solvente em vez de cloreto de metileno e a reação é agitada a 50 °C durante 18 horas. O intermediário amina final, é proporcionado como um óleo espesso limpido. O procedimento para preparar 3-etoxi-l-adamantil-amina (um óleo limpido) é o mesmo que para o 3- metoxi-1- 44 ΡΕ2247602 adamantilamina, exceto que é utilizado iodoetano (1,3 equivalentes) em vez de iodometano.

Exemplo de Formulação:

Comprimidos, cada um contendo 50 mq do componente ativo, NVP-BQS867, podem ser preparados como se seque:

Composição (para 10 000 comprimidos)

Componente ativo 500,0 q Lactose 500,0 q Amido de batata 352,0 q Gelatina 8,0 q Talco 60,0 q Estearato de magnésio 10,0 g Silica (altamente dispersa) 20,0 g Etanol q.b. O componente ativo é misturado com a lactose e 2 92 g de amido de batata, e a mistura é humedecida utilizando uma solução alcoólica de gelatina e granulada através de um peneiro. Após secagem, o remanescente do amido de batata, o talco, o estearato de magnésio e da silica altamente dispersa são misturados e a mistura é comprimida para originar comprimidos com um peso de 145,0 mg cada e teor de componente ativo 50,0 mg, que, se desejado, pode ser providenciado com sulcos para um ajuste mais fino da dose. 45 ΡΕ2247602 III. Exemplo 2: Experiência Biológica

Lista de abreviaturas

Abreviatura Descrição AMC aminometilcumarina BSA albumina de soro bovino CHAPS 3-((3-colamidopropil)-dimetilamino)-propanossulfonato DABCYL Ácido 4-((4-(dimetilamino)fenil)azo)benzóico DMSO Dimetilsulfóxido DPP-2 dipeptidil peptidase 2 DPP-8 dipeptidil-peptidase 8 DPP-9 dipeptidil-peptidase 9 DPP-IV dipeptidil-peptidase IV EDANS Ácido 5-[(2-aminoetil)amino]naftaleno-1-sulfónico FAP proteína de ativação de fibroblastos, alfa FI intensidade de fluorescência HC1 Ácido clorídrico HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazino etanossulfónico Mw eff. peso molecular eficiente Nle norleucina NVP-BQS867 NVP-BQS8 67-NX-2 PEP prolil-endopeptidase Prep. HPLC cromatografia líquida de alta eficiência preparativa RhllO rodamina-110 SD desvio padrão Tris tris-(hidroximetil)-aminometano 46 ΡΕ2247602 IV. Material e métodos A. A. Instrumentação

Todas as soluções contendo proteínas e peptideos foram tratadas em tubos siliconizados (Life Systems Design, Merenschwand, Suiça). As soluções do composto, bem como a enzima e as soluções de substrato foram transferidas para placas de 384 poços (black Cliniplate; . Cat n. 95040020 Labsystems Oy, Finlândia) por meio de uma pipetador de 96 canais CYBI-well (CyBio AG, Jena, Alemanha). 1. 1. Instrumentação para medições F1

Para medições de intensidade de fluorescência (Fl) com AMC como corante, foi utilizado um leitor de Ultra Evolution (TECAN, Maennedorf, Suiça). O instrumento foi equipado com uma combinação de um filtro de largura de banda de 350 nm (largura de banda de 20 nm) e de 500 nm (largura de banda de 25 nm) para excitação de fluorescência e aquisição de emissão, respetivamente. Para aumentar a razão sina/linha de base, foi empregue um espelho dicroico adequado. Todos os filtros e o espelho dicroico foram adquiridos a partir da TECAN.

As medições de Fl usando um corante RhllO foram feitas com um leitor Safire2 (TECAN, Maennedorf, Suiça). O Safire2 é um instrumento baseado num monocromador e comprimentos de onda de 485 nm e 535 nm foram tomados para 47 ΡΕ2247602 a excitação de fluorescência e aquisição de emissão, respetivamente. As bandas foram fixadas a 20 nm em ambos trajetos de excitação e de emissão.

Os fluoróforos em cada poço foram excitados por três flashes por medição. 2. Cálculo dos valores de IC50 a partir de dados médios

Foi feita a média dos dados das execuções do ensaio independente e representada graficamente utilizando o programa de Origin 7.5SR6 (OriginLab Corporation,

Northampton, MA, EUA). Foi utilizada em rotina a regressão não-linear embutido no Origin para ajustar os dados médios para a função de 'logístics' y = A2 + (Al—A2)/(l + (x/IC50) Ap) (Equação 1 ) em que y é a % de inibição na concentração de inibidor, x. Al é o menor valor de inibição, isto é, 0%, e A2 o valor máximo da inibição, isto é, 100%. O expoente p, é o coeficiente de Hill. B. Determinação dos valores de IC5q

Para a determinação dos valores de IC50, os ensaios foram realizados à temperatura ambiente em placas de 384 poços. Todos os volumes de ensaio final foram de 30 μ]7. Os compostos de teste foram dissolvidos em 90% (v/v) de 48 ΡΕ2247602 DMSO/água e diluídos em água (contendo 0,05% (p/v) de CHAPS) até três vezes a concentração de ensaio pretendida. Para cada ensaio, foram adicionados por poço 10 μΡ de água/ CHAPS (± composto de ensaio) , seguido por 10 μΡ solução de protease (diluído com tampão de ensaio, para concentração final do ensaio, Condições de ensaio cf. §). Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, a reação foi iniciada pela adição de 10 μΡ de solução de substrato (para concentrações finais, Condições de ensaio cf. §) . As onze concentrações finais de compostos foram quer 0,9 nM, 3 nm, 9 nM, 30 nM, 90 nM, 300 nM, 900 nM, 3 μΜ, 9 μΜ, 30 μΜ e 90 μΜ ou 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 μΜ, 3 μΜ, 10 μΜ, 3 0 μΜ, 100 μΜ e 300 μΜ. Ο efeito do composto sobre a atividade enzimática foi obtido a partir das curvas de progresso linear e determinado a partir de duas leituras, sendo a primeira tomada diretamente após a adição do substrato (t = 0 min) e a segunda 1 hora após (t = 60 min). O valor de IC50 foi calculado a partir do gráfico da percentagem de inibição vs concentração de inibidor usando o suporte lógico (software) de análise de regressão não-linear (XLfit, Vers. 4.0; ID Business Solution Ltd.,

Guildford, Surrey, Reino Unido). C. Condições de Ensaio

Todas as condições com respeito à enzima, substrato e tampão são listadas adiante para os ensaios individuais. 49 ΡΕ2247602 1. - A DPP-2 (dipeptidil peptidase 2) enzima: DPP-2 humano abrangendo aminoácido 30-492; expresso em e purificado a partir de células de insetos (sistema de expressão de baculovirus)

Substrato: Nle-Pro-AMC, adquirido à Biosyntan (www. biosyntan.de), número de produto 4572 concentração de enzima: 0,03 nM substrato de concentração: 2 μΜ

tampão de ensaio: 100 mM de citrato de sódio, pH 5,5, 0,05% (p/v) de CHAPS 2. - A DPP-IV (dipeptidil-peptidase IV) enzima: DPP-IV humana, que abrange os aminoácidos 39-766; expressos em e purificados a partir de células de insetos (sistema de expressão de baculovirus): substrato: Gli-Pro-AMC, adquirido à Bachem (www. bachem.com), número de catálogo 1-1225 concentração de enzima: 0,01 nM concentração do substrato: 10 μΜ tampão de ensaio: 25 mM de Tris, pH 7,4, 140 mM de

NaCl, 10 mM de KC1, 0,05% (p/v) de CHAPS 3. - DPP-IV de plasma humano (dipeptidil peptidase IV endógena no plasma de sangue humano) enzima: DPP-IV humana endógena a partir da amostra de plasma, dadores machos substrato: (H-Ala-Pro2-Rhll0), na sintese doméstica concentração da enzima: aprox. 5 nM concentração do substrato: 10 μΜ 50 ΡΕ2247602

Solução de ensaio: plasma de sangue humano, diluído para um teor de plasma de 50% com tampão (25 mM de Tris, pH 7,4, 140 mM de NaCl, 10 mM de KC1, 0,05% (p/v) de CHAPS) 4. - A DPP-8 (dipeptidil-peptidase 8) enzima: DPP-8 humana abrangendo aminoácidos de 1-882; expressos em e purificados a partir de células de insetos (sistema de expressão de baculovírus)

Substrato: Gly-Pro-AMC, da Bachem (www.bachem.com), número de catálogo 1-1225 concentração de enzima: 0,05 nM substrato de concentração de: 10 μΜ

tampão de ensaio: 25 mM de Tris, pH 7,4, 140 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 0,05% (p/v) de CHAPS 5. - A DPP-9 (dipeptidil-peptidase 9) enzima: DPP-9 humana abrangendo os aminoácidos 1-863; expressos em e purificados a partir do substrato de Pichia pastoris: Gli-Pro-AMC, da Bachem (www.bachem. com), número de catálogo 1-1225 concentração da enzima: 1 nM concentração do substrato: 10 μΜ

tampão de ensaio: 25 mM de Tris, pH 7,4, 140 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 0,05% (p/v) de CHAPS 6. - FAP (proteína de ativação de fibroblasto, alfa) enzima: FAPa humana cobrindo os aminoácidos 27-760 51 ΡΕ2247602 excluindo os domínios citoplásmicos e trans-membrana; expressos em e purificados a partir de células de insetos (sistema de expressão de baculovírus) substrato de Z-Gly-Pro-AMC, da Bachem (www.bachem. com), número de catálogo 1-1145 concentração de enzima: 0,1 nM substrato de concentração: 8 μΜ tampão de ensaio: 100 mM de Tris, pH 7,4, 100 mM de

NaCl, 1 mM de EDTA, 0,05% (p/v) de CHAPS 7. - PEP (prolil-endopeptidase) enzima: PEP humana abrangendo os aminoácidos 1-710; expressos em e purificados a partir de Pichia pastoris substrato de Z-Gly-Pro-AMC, adquirido à Bachem (www. bachem.com), número de catálogo 1-1145 concentrações de enzima: 0,03 nM substrato de concentração de: 10 μΜ tampão de ensaio: 100 mM de Tris, pH 7,4, 100 mM de

NaCl, 1 mM de EDTA, 0,05% (p/v) de CHAPS, 0,1% (p/v) de BSA. V. D. Resultados

Os resultados de todas as medições de IC5o para o composto NVP-BQS867 estão resumidos nas Tabelas 3-1 até 3-7 abaixo. Para hDPP-IV, DPP-IV endógena no plasma de sangue humano, hDPP-8, hDPP-9, hFAP e hPEP. 52 ΡΕ2247602 (a) Tabela V-l Potência de NVP-BQS867-NX-2 na DPP-2 humana. Experi- valor de IC5o coeficiente de Valor de IC5o ência [μΜ] Hill médio ± DP [μΜ] 1 > 300 - > 90 2 > 300 - 3 > 90 - 4 > 90 - (b) Tabela V-2 Potência de NVP-BQS867-NX-2 na DPP-IV humana Experi- valor de IC5o coeficiente de Valor de IC5o ência [μΜ] Hill médio ± DP [μΜ] 1 0,004 0,7 0,006 ± 0,001 2 0,006 0, 9 3 0,007 1,3 4 0,005 1,1 (c) Tabela V-3 Potência de NVP-BQS867 -NX -2 no DPP-IV do plasma humano. Experiênc valor de IC5o coeficiente de Valor de IC5o ia [μΜ] Hill médio ± DP [μΜ] 1 0,003 1,4 0,004 ± 0,001 2 0,004 1,4 3 0,004 1,2 4 0,004 1,2 53 ΡΕ2247602 (d) Tabela V-4 Potência de NVP-BQS867-NX-2 na DPP-8 humana.

Experi- valor de ICso coeficiente de Valor de IC50 ência [μΜ] Hill médio ± DP [μΜ] 1 8,3 1,2 8,0 ± 0,3 2 8,0 1,3 3 8,1 1,2 4 7, 6 1,2 (e) Tabela V-5 Potência de NVP-BQS867-NX-2 na DPP-9 humana. Experi- valor de ICso coeficiente de Valor de IC50 ência [μΜ] Hill médio ± DP [μΜ] 1 0,7 1,0 0,5 ± 0,2 2 0,4 0, 9 3 0, 6 1,0 4 0,4 0, 9 (f) Tabela V-6 potência de NVP-BQS867-NX-2 na FAP humana. Experiênc valor de IC50 coeficiente de Valor de IC50 ia [μΜ] Hill médio ± DP [μΜ] 1 43 1,3 24 ± 13 2 16 0,8 3 19 0,7 4 19 0,8 54 ΡΕ2247602 (g) Tabela V-7 Potência de NVP-BQS867-NX-2 na PEP humana. Experi- valor de IC5o coeficiente de Valor de IC5o ência [μΜ] Hill médio ± DP [μΜ] 1 52 0,7 25 ± 18 2 15 1,2 3 18 O co 1 1 4 14 1 o

Lisboa, 2 de julho de 2013

Claims (13)

1. ΡΕ2247602 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de fórmula (I A), (I B), (X A), (X B) , (Y A) ou (Y B)

   em que R' representa

   e R" representa hidrogénio, hidroxi, C1-C7 alcoxi, Ci-Cs-alcanoiloxi, ou R5R4N-COO-, em que R4 e R5 são independentemente Ci-C7alquilo ou fenilo que é não substituído ou substituído por um substituinte selecionado a partir de Ci-C7alquilo, C1-C7 alcoxi, halogéneo e trifluorometilo e em que R4 é adicionalmente hidrogénio, ou R4 e R5 em conjunto representam C3_C6alquileno; 2 ΡΕ2247602 na forma livre ou na forma de um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Um composto das fórmulas (I A), (I B) , (X A), (X B) , (Y A) ou (Y B) , de acordo com a reivindicação 1, em que R representa hidrogen
3. 3. Um composto de selecionado a partir do grupo 10 . acordo com a reivindicação 1, que consiste de:

   ou, em cada caso, um s farmaceuticamente aceitável. sal de adição de ácido
4. 4. Um composto de acordo com a reivindicação 1, que é:

   H ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 3 ΡΕ2247602
5. 5. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, na forma livre ou na forma de sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável, em conjunto com pelo menos um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
6. 6. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou um seu sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para inibir a enzima dipeptidil-pepti-dase-IV, num mamífero com sua necessidade por aplicação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, ou um seu sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Utilização de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5 para o fabrico de um medicamento para inibir a dipeptidil peptidase-IV, num mamífero com sua necessidade por aplicação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica de acordo a reivindicação 5.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, em que o medicamento é utilizado para o tratamento de estados mediados pela inibição da enzima dipeptidil peptidase-IV.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8 em 4 ΡΕ2247602 que o estado tratado é diabetes mellitus não dependente de insulina.
10. 10. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5 para utilização no tratamento de estados mediados pela inibição da dipeptidil peptidase-IV.
11. 11. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10 em que o estado tratado é a diabetes mellitus não dependente de insulina.
12. 12. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para utilização no tratamento de estados mediados pela inibição da dipeptidil peptidase-IV.
13. 13. Um composto de acordo com a reivindicação 12, em que o estado tratado é a diabetes mellitus não dependente de insulina. Lisboa, 2 de julho de 2013 ΡΕ2247602 1 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e ο IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * M3Q1668803 Â - WG08SS533SA * WO 2368612249 A * WG 00342:41 A V¥D 2065087876 A WQ280S078583A WO 2064163805 A WO 05043885 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição « Kftiitt. -Rum. a, 1SSS, vsí. 20 (7^.819-1S » RE&HER aí st ínereassd aspf»ssíem c# Atestei ceBlà>®Ca»-2. Pbm. AM. Acsd. Sei. 1993, *οϊ.9θ, 57S7-S781 ♦ KUBQTA «t at fcwateTísrS of JV a srs fei vivo íRunaos response. Cíkt. Exp. tosm?-?x4. 1992, wot 83,. 1:82-197 PA7EL MONA. Expeft Opiff m&es vd. 12(4),823-633 p «Mn. -Asm?. Zh, 1988, vot 20 J, Afeãb Chsm, 1982, íío12S {1K Si-5®