PT1960434E - Anticorpos monoclonais humanos para fucosil-gm1 e métodos para a utilização de anti-fucosil-gm1 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS PARA FUCOSIL-GMl E MÉTODOS PARA A UTILIZAÇÃO DE ΑΝΤΙ-FUCOSIL-GMl"

Antecedentes 0 fucosil-GMl é um monossialogangliósido esfingolípido constituído por um componente lípido ceramida, que fixa a molécula na membrana celular, e um componente hidrato de carbono que se encontra exposto na superfície celular. Os antigénios de hidrato de carbono são os antigénios mais abundantemente expressos sobre a superfície celular em cancros (Feizi T. (1985) Nature 314: 53-7). Em alguns tipos de tumores, tais como o cancro do pulmão de pequenas células (CPPC), as respostas iniciais à quimioterapia são impressionantes, mas são seguidas por rápidas recaídas quimio-refratárias. A intervenção com novos imunoterapêuticos pode apresentar êxito em ultrapassar recaídas resistentes a fármacos (Johnson DH. (1995) Lung Câncer 12 Supl. 3: S71-5). Diversos antigénios de hidratos de carbono, tais como gangliósidos GD3 e GD2, têm demonstrado actuar como alvos eficazes para imunoterapia passiva com MAbs (Irie RF e Morton DL. (1986) PNAS 83: 8694-8698; Houghton AN et al. (1985) PNAS 82: 1242-1246).

Os antigénios de gangliósido também têm demonstrado ser alvos eficazes para imunoterapia activa com vacinas em ensaios clínicos (Krug LM et al. (2004) Clinicai Câncer Research 10: 6094-6100; Dickler MN et al. (1999) Clinicai

Câncer Research 5: 2773-2779; Livingston PO et al. (1994) J

Clin Oncol. 12: 1036-44). De facto, o soro proveniente de pacientes com CPPC que desenvolveram títulos de anticorpos 2 para fucosil-GMl após vacinação com antigénio conjugado com KLH, demonstrou uma ligação especifica a células tumorais e uma citotoxicidade dependente de complementos específicos do tumor (CDC). As toxicidades associadas aos títulos de anti-fucosil-GMl foram ligeiras e transitórias e três pacientes com CPPC estadiados como doença local ou regional mantiveram-se livres de recaídas durante 18, 24 e 30 meses (Krug et al., supra; Dickler et al., supra). A expressão de fucosil-GMl tem surgido numa elevada percentagem de casos de CPPC e, ao contrário de outros antigénios de gangliósido, o fucosil-GMl possui pouca ou nenhuma expressão em tecidos normais (Nilsson et al. (1984) Glycocon jugate J 1: 43-9; Krug et al., supra; Brezicka et al. (1989) Câncer Res 49: 1300-5; Zhangyi et al. (1997) Int J Câncer 73: 42-49; Brezicka et al. (2000) Lung Câncer 28: 29-36; Fredman et al. (1986) Biochim Biophys Acta 875: 316-23; Brezicka et al. (1991) APMIS 99: 797-802; Nilsson et al. (1986) Câncer Res 46: 1403-7). A presença de fucosil-GMl foi demonstrada em meio de cultura a partir de linhas celulares de CPPC, em extractos tumorais e no soro de xenoenxertos de murganho nude e no soro de pacientes de CPPC com doença em estádio extenso (Vangsted et al. (1991) Câncer Res 51: 2879-84; Vangsted et al. (1994) Câncer Detect Prev 18: 221-9). Estes documentos proporcionam provas convincentes quanto a fucosil-GMl enquanto antigénio tumoral bastante específico, o qual pode constituir um alvo para um imunoterapêutico.

Assim sendo, são desejados agentes que reconheçam fucosiil-GMl e métodos de utilização de tais agentes. 3

Descrição abreviada

Constitui um objecto da presente invenção proporcionar anticorpos monoclonais isolados, em particular anticorpos monoclonais humanos, que se liguem a fucosil-GMl e que exibam diversas propriedades desejáveis. Tal objecto pode ser alcançado pelas características definidas nas reivindicações anexas. Outras melhorias encontram-se caracterizadas nas reivindicações anexas. Tais propriedades podem compreender uma afinidade elevada de ligação a fucosil-GMl e ligação à linha celular do cancro do pulmão de pequenas células humano, DMS-79 (CPPC humano n° ATCC CRL-2049). A invenção proporciona ainda métodos para o tratamento de diversas doenças mediadas por fucosil-GMl, utilizando os anticorpos e composições da presente memória descritiva.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente memória descritiva diz respeito a um anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, em que o anticorpo se liga especificamente a fucosil-GMl; e compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve que compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3, em que (a) a região variável de cadeia pesada CDR1 compreende a SEQ ID NO: 16; (b) a região variável da cadeia pesada CDR2 compreende a SEQ ID NO:22; (c) a região variável da cadeia pesada CDR3 compreende a SEQ ID NO:28; (d) a região variável da cadeia leve CDR1 compreende a SEQ ID NO:34; (e) a região variável da cadeia leve CDR2 compreende a SEQ ID NO:40 e (f) a região variável da cadeia leve CDR3 compreende a SEQ ID NO:46. 4

De acordo com uma outra variante, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, em que o anticorpo inter-compete para a ligação a fucosil-GMl com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência é um anticorpo de acordo com o primeiro aspecto supramencionado da presente memória descritiva.

De acordo com determinadas variantes, o anticorpo de referência compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e (b) uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10.

De acordo com um aspecto, o anticorpo monoclonal isolado da presente memória descritiva, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, compreende uma região variável da cadeia pesada que é o produto ou é obtida a partir de um gene VH 3-48 humano, em que o anticorpo se liga especificamente a fucosil-GMl. O anticorpo monoclonal isolado da presente memória descritiva, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, pode compreender uma região variável de cadeia leve que é o produto ou que é obtida a partir de um gene VK L15 humano, em que o anticorpo se liga especificamente a fucosil-GMl.

Uma combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO:13; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO:19; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO:25; 5 (d) uma região variável de cadeia leve CDRl gue compreende a SEQ ID NO:31; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 gue compreende a SEQ ID NO:37 e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 gue compreende a SEQ ID NO:43. Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDRl que compreende a SEQ ID NO:14; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO:20; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO:26; (d) uma região variável de cadeia leve CDRl que compreende a SEQ ID NO:32; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO:38 e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO:44. Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDRl que compreende a SEQ ID NO:15; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO:21; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO:2 7; (d) uma região variável de cadeia leve CDRl que compreende a SEQ ID NO:33; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO:39 e 6 (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO:45. Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO:16; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO:22; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO:28; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende a SEQ ID NO:34; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO:40 e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO:46. Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO:17; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO:23; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO:29; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende a SEQ ID NO:35; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO:41 e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO:47. Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO:18; 7 (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO:24; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO:30; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende a SEQ ID NO:36; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO:42 e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO:48. Outros anticorpos preferidos da presente memória descritiva, ou porções de ligação ao antigénio, compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N0:1 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7.

Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8.

Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9.

Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10.

Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11.

Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12.

Os anticorpos da presente memória descritiva podem ser, por exemplo, anticorpos de comprimento completo, por exemplo, de um isotipo IgGl oi IgG4. Em alternativa, os anticorpos podem ser fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos Fab ou Fab'2, ou anticorpos de cadeia individual. A presente memória descritiva também proporciona um imunoconjugado que compreende um anticorpo de acordo com a presente memória descritiva, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, ligado a um agente terapêutico, tal como uma citotoxina ou um isótopo radioactivo. A presente memória descritiva também proporciona uma molécula bi-especifica que compreende um anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, de acordo com a presente memória descritiva, ligado a um segundo radical funcional que possui uma especificidade de ligação diferente do referido anticorpo, ou da sua porção de ligação ao antigénio. A invenção também diz respeito a composições que compreendem um anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao 9 antigénio, ou imunoconjugados ou uma molécula bi-específica da presente memória descritiva e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

As moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos, ou as suas porções de ligação ao antigénio, da presente memória descritiva também estão abrangidas pela presente memória descritiva, bem como vectores de expressão que compreendem tais ácidos nucleicos e células hospedeiras que compreendem tais vectores de expressão. Além disso, a presente memória descritiva proporciona um murganho transgénico que compreende transgenes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana, em que o murganho expressa um anticorpo da presente memória descritiva, bem como hibridomas preparados a partir de um tal murganho, em que o hibridoma produz o anticorpo da presente memória descritiva.

Ainda de acordo com outro aspecto, a presente memória descritiva proporciona o anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, da presente memória descritiva para utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença caracterizada pelo crescimento de células tumorais que expressam fucosil-GMl. Tal doença pode ser, por exemplo, cancro, v.g., cancro do pulmão (incluindo cancro do pulmão de pequenas células).

De acordo com uma variante preferida, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo anti-fucosil-GM1 para utilização no tratamento de cancro in vivo. Como exemplos de outros cancros que é possível tratar utilizando os métodos da presente memória descritiva refere-se cancro do pulmão, incluindo cancro no pulmão de pequenas células e cancro do pulmão de não pequenas células, cancro renal 10 (v.g., carcinoma de células renais), glioblastoma, tumores cerebrais, leucemias crónicas ou agudas, incluindo leucemia linfocitica aguda (LLA), leucemia de células T em adultos (T-ALL), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocitica crónica, linfomas (v.g., linfoma de Hodgkin e de não Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma do SNC primário, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfomas de grandes células anaplásicos (ALCL), linfomas de células T cutâneos, linfomas de células clivadas em pequenos nódulos, linfomas de células T periféricos, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, leucemia/linfornas de células T (ATLL), cancros de linfomas foliculares entroblásticos/centrociticos (cb/cc), linhagem B de linfomas de grandes células difusos, linfoma de células T do tipo linfadenopatia angio-imunoblástic (AILD) e VIH associado a linfomas com base em cavidades corporais, carcinomas embrionais, carcinomas indiferenciados rino-faringicos (v.g., doenças, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrome outros linfomas de células B), carcinomas nasofarangeais, cancro dos ossos, cancro da pele, cancro da cabeça ou do pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, cancro uterino, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro do testículo, cancro uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro da glândula tiróide, cancro da glândula paratiróide, cancro da glândula adrenal, sarcoma dos tecidos moles, cancro da uretra, cancro do pénis, tumores sólidos de infância, cancro da bexiga, cancro do rim ou 11 uréter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), angiogénese tumoral, tumor do eixo espinal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, cancro epidermóide, cancro das células escamosas, cancros induzidos pelo meio ambiente, incluindo os induzidos por asbestos, v.g., mesotelioma, e combinações dos referidos cancros.

Outras caracteristicas e vantagens da presente memória descritiva serão evidentes a partir da descrição minuciosa e exemplos seguintes.

Descrição abreviada das figuras A figura IA mostra a sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 3C4. As regiões CDR1, CDR2 e CDR3 encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V, D e J. A figura 1B mostra a sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 3C4. As regiões CDR1, CDR2 e CDR3 encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V e J. A figura 2A mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:49) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID N0:1) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 5B1. As regiões CDR1 (SEQ ID N0:13), CDR2 (SEQ ID NO:19) e CDR3 (SEQ ID NO:25) encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V, D e J. A figura 2B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:55) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:7) da região 12 variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 5B1. As regiões CDR1 (SEQ ID N0:31), CDR2 (SEQ ID NO:37) e CDR3 (SEQ ID NO:43) encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V e J. A figura 3A mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:50) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:2) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 5Bla. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:20) e CDR3 (SEQ ID NO:26) encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V, D e J. A figure 3B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:56) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:8) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 5Bla. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:32), CDR2 (SEQ ID NO:38) e CDR3 (SEQ ID NO:44) encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V e J. A figura 4A mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:51) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:3) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 7D4. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:15), CDR2 (SEQ ID NO:21) e CDR3 (SEQ ID NO: 27) encontram-se deli neadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V, D e J. A figura 4B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:57) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:9) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 7D4. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:33), CDR2 (SEQ ID NO:39) e CDR3 (SEQ ID NO:45) encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V e J. 13 A figure 5A mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:52) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:4) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 7E4. As regiões CDR1 (SEQ ID N0:16), CDR2 (SEQ ID NO:22) e CDR3 (SEQ ID NO:28) encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V, D e J. A figura 5B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:58) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:10) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 7E4. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:34), CDR2 (SEQ ID NO:40) e CDR3 (SEQ ID NO:46) encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V e J. A figura 6A mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:53) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:5) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 13B8. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:17), CDR2 (SEQ ID NO:23) e CDR3 (SEQ ID NO:29) encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas V, D e J. A figura 6B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:59) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:ll) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 13B8. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:35), CDR2 (SEQ ID NO:41) e CDR3 (SEQ ID NO:47) encontram-se delineadas, estando indicadas as transformações de linhas germinativas v e J. A figura 7 mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada de SB1, SBla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 com a sequência de aminoácidos VH 3-48 de linha germinativa humana (SEQ ID NO:61). 14 A figura 8 mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 com a sequência de aminoácidos de Vk L15 de linha germinativa humana amino (SEQ ID NO:62).

As figuras 9 A-C mostram os resultados de experiências ELISA que demonstram que os anticorpos monoclonais humanos contra fucosil-GMl se ligam especificamente a fucosil-GMl.

As figuras 10 A-C mostram os resultados de experiências ELISA com a totalidade de células que demonstram que os anticorpos monoclonais humanos contra fucosil-GMl se ligam especificamente a células que expressam fucosil-GMl.

As figuras 11 A-C mostram os resultados de experiências por citometria de fluxo que demonstram que (A e B) os anticorpos monoclonais humanos contra fucosil-GMl se ligam à superfície celular de linhas de células DMS79 e H-4-II-E que expressam fucosil-GMl, e (C) se concluiu que as células DMS79 continuam a expressar fucosil-GMl in vivo (isto é, após implante num murganho).

As figuras 12A e B mostram os resultados de experiências de internalização Hum-Zap que demonstram que os anticorpos monoclonais humanos contra fucosil-GMl podem ser internalizados em fucosil-GMl + células.

As figuras Figures 13A e B mostram os resultados de um ensaio de proliferação de células de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) que demonstram que os anticorpos monoclonais anti-fucosil-GMl humanos matam linhagens celulares (A) DMS79 e (B) H-4-II-E que expressam fucosil-GMl.

As figuras 14A e B mostram os resultados de um ensaio de proliferação celular de citotoxicidade dependente do 15 anticorpo (ADCC) que demonstram que os anticorpos monoclonais anti-fucosil-GMl humanos matam as linhaqens celulares que expressam fucosil-GMl na ausência do bloqueio CD16. 0 anticorpo monoclonal contra fucosil-GMl 5B1 numa concentração de 10 mq/kq por murganho; (D) o anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl 5B1 numa concentração de 30 mg/kg por murganho; (E) o anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl 7E4 numa concentração de 10 mg/kg por murganho ou (F) o anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl 7E4 numa concentração de 30 mg/kg por murganho. O volume de tumor no primeiro dia de tratamento era de cerca de 200 mm3.

As figuras 16A e B mostram a média e a mediana do volume de tumor, respectivamente, do murganho apresentado na figura 15. A figura 17 mostra o peso médio do grupo de murganhos apresentados na figura 15.

Descrição minuciosa

De acordo com um aspecto, a presente memória descritiva diz respeito, de um modo geral, a anticorpos monoclonais isolados, em particular a anticorpos monoclonais humanos, que se ligam especificamente a fucosil-GMl. De acordo com determinadas variantes, os anticorpos da presente memória descritiva exibem uma ou várias propriedades funcionais desejáveis, tais como uma elevada afinidade de ligação a fucosil-GMl e/ou a aptidão para inibir o crescimento de células tumorais in vitro ou in vivo. De acordo com determinadas variantes, os anticorpos da presente memória descritiva são obtidos a partir de sequências de linhas germinativas de cadeia pesada e leve particulares e/ou compreendem características 16 estruturais particulares, tais como regiões CDR que compreendem sequências de aminoácidos particulares. A presente memória descritiva proporciona anticorpos isolados, métodos para a preparação de tais anticorpos, imunoconjugados e moléculas bi-especificas que compreendem tais anticorpos e composições que contêm os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas bi-especificas da presente memória descritiva. A presente memória descritiva também diz respeito a métodos para a utilização dos anticorpos, tais como para o tratamento de doenças, tais como o cancro.

Para que a presente memória descritiva seja mais facilmente entendida, são aqui definidos, em primeiro lugar, alguns termos. Outras definições são apresentadas ao longo da descrição minuciosa. 0 termo "resposta imune" designa a acção, por exemplo, linfócitos, células apresentadoras de antigénios, células fagociticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células referidas antes ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citoquinas e complementos), que resulte em danos selectivos contra, destruição de ou eliminação a partir do corpo humano de patogénicos invasores, células ou tecidos infectados com patogénicos, células cancerígenas ou, nos casos de auto-imunidade ou de inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais. 0 termo "via de transdução do sinal" designa a relação bioquímica entre diversas moléculas de transdução do sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. Tal como aqui utilizada, a expressão "receptor de superfície celular" compreende, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receberem um sinal e de transmitirem 17 esse sinal através da membrana de plasma de uma célula. Um exemplo de um "receptor de superfície celular" da presente memória descritiva é o receptor de fucosil-GMl. 0 termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, compreende anticorpos totais e qualquer fragmento de ligação ao antigénio (isto é, "porção de ligação ao antigénio") ou suas cadeias simples. Um "anticorpo" designa uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves inter-ligadas por meio de pontes dissulfureto, ou uma sua porção de ligação ao antigénio. Cada cadeia pesada é constituída por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é constituída por três domínios, CHi, CH2 e CH3 · Cada cadeia leve é constituída por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é constituída por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas por regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões mais conservadas, designadas por regiões de estrutura (FR) . Cada VH e VL é constituída por três CDR e quatro FR, arranjadas desde o terminal amino até ao terminal carboxi de acordo com a ordem seguinte: FR1 , CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interactua com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação de imunoglobulina a tecidos ou factores hospedeiros, incluindo diversas células do sistema imune (v.g., células efectoras) 18 e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. 0 termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), tal como aqui utilizado, designa um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a aptidão para se ligarem especificamente a um antigénio (v.g., fucosil-GMl).

Demonstrou-se que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser efectuada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Como exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo refere-se (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente constituído pelos domínios VL, VH, CL e CHi ; (ii) um fragmento F(ab')2 , um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por meio de uma ponte dissulfureto à região charneira; (iii) um fragmento Fd constituído pelos domínios VH e CHi; (iv) um fragmento Fv constituído pelos domínios VL e VH de um ramo individual de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), o qual é constituído pelo domínio VH ; e (vi) uma região de determinação de complementaridade (CDR). Além do mais, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, estes podem ser unidos utilizando métodos recombinantes, por meio de um ligador sintético que permite que estes sejam produzidos como uma cadeia de proteína individual em que as regiões VL e VH são emparelhadas para formar moléculas monovalentes (designados por Fv de cadeia individual (scFv); ver, v.g., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883). Também se pretende que tais anticorpos 19 de cadeia individual estejam abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas na matéria, e os fragmentos são pesquisados quanto à sua utilidade de um modo idêntico ao utilizado para os anticorpos intactos. 0 termo "anticorpo isolado", tal como aqui utilizado, pretende designar um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos que possuam especificidades antigénicas diferentes (v.g., um anticorpo isolado que se ligue especificamente a fucosil-GMl está substancialmente livre de anticorpos que se liguem especificamente a antigénios diferentes de fucosil-GMl). Além do mais, um anticorpo isolado pode estar substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composições de anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizados, designam uma preparação de moléculas de anticorpos com uma composição molecular individual. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade e afinidade de ligação únicas para um epítopo particular. 0 termo "anticorpos humano", tal como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos que possuem regiões variáveis em que as regiões de estrutura e as regiões CDR são obtidas a partir de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Além do mais, no caso de o anticorpo conter uma região constante, então a região constante também é obtida a partir de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da presente memória descritiva podem compreender resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linha 20 germinativa humana (v.g., mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou especifica do local in vitro ou por mutagénese somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", tal como aqui utilizado, não pretende incluir anticorpos em que as sequências CDR provenientes de linhas germinativas de outras espécies de mamíferos, tais como de murganho, foram enxertadas nas sequências de estrutura humanas. O termo "anticorpo monoclonal humano" designa anticorpos que apresentam uma especificidade de ligação individual e que possuem regiões variáveis em que as regiões de estrutura e as regiões CDR são provenientes de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. De acordo com uma variante, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que compreende uma célula B obtida a partir de animais transgénicos não humanos, v.g., um murganho transgénico, que possui um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana e uma cadeia leve fundida a uma célula imortalizada. 0 termo "anticorpo humano recombinante", tal como aqui utilizado, inclui todos os anticorpos humanos que sejam preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados a partir de um animal (v.g., um murganho) que é transgénico ou transcromossómico para os genes de imunoglobulina humanos ou um hibridoma preparado a partir destes (descrito mais minuciosamente infra) , (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, v. 9- f a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de um banco de dados de anticorpos humanos combinatórios, recombinantes, e (d) 21 anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros métodos que envolvam a montagem de sequências de genes de imunoglobulina humana em outras sequências de ADN. Tais anticorpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis em que as regiões de estrutura e as regiões CDR são provenientes de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. No entanto, de acordo com determinadas variantes, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagénese in vitro (ou, no caso de se utilizar um animal transgénico para sequências de Ig humanas, mutagénese somática in vivo ) e, assim, as sequências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivados a partir de e associadas a sequências VH e VL de linha germinativa humana, podem não existir naturalmente no reportório de linha germinativa de anticorpo humano in vi vo.

Tal como aqui utilizado, o termo "isotipo" designa a classe de anticorpo (v.g., IgM ou IgGI) que é codificada pelos genes da região constante de cadeia pesada.

As expressões "um anticorpo que reconhece um antigénio" e "um anticorpo especifico para um antigénio" são aqui utilizadas de um modo permutável com a expressão "um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio". 0 termo "derivados de anticorpo humano" designa qualquer forma modificada de um anticorpo humano, v.g., um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo. 0 termo "anticorpo humanizado" pretende designar anticorpos em que as sequências CDR provenientes da linha germinativa de outro mamífero, tal como um murganho, foram enxertadas em sequências de estrutura humanas. Modificações 22 suplementares na região de estrutura podem ser efectuadas dentro das sequências de estrutura humanas. 0 termo "anticorpo quimérico" pretende designar anticorpos em que as sequências da região variável são obtidas a partir de uma espécie e as sequências da região constante são obtidas a partir de outra espécie, tais como um anticorpo em que as sequências da região variável são obtidas a partir de um anticorpo de murganho e as sequências da região constante são obtidas a partir de um anticorpo humano.

Tal como aqui utilizado, um anticorpo que "se liga especificamente a fucosil-GMl" pretende designar um anticorpo que se liga a fucosil-GMl com uma KD de 1 x IO'7 M ou inferior, mais preferencialmente 5 χ 10'8 M ou inferior, ainda mais preferencialmente 1 χ 10'8 M ou inferior e muito mais preferencialmente 5 χ 10'9 M ou inferior. 0 termo "KasSoc" ou "Ka", tal como aqui utilizado, pretende designar a taxa de associação de uma interacção anticorpo-antigénio particular, ao passo que o termo "Kdis" ou "Kd", tal como aqui utilizado, pretende designar a taxa de dissociação de uma interacção anticorpo-antigénio particular. 0 termo "KD", tal como aqui utilizado, pretende designar a constante de dissociação, a qual é obtida pela proporção entre Kd e Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M) . os valores de KD para os anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Um método preferido para a determinação de KD de um anticorpo consiste na utilização de ressonância de plasmão na superfície, preferencialmente utilizando um sistema biossensor, tal como um sistema Biacore®. 23

Tal como aqui utilizado, o termo "afinidade elevada" para um anticorpo igG designa um anticorpo que possui um valor de KD de 1CT8 M ou inferior, mais preferencialmente IO-9 M ou inferior e ainda mais preferencialmente IO-10 M ou inferior para um antigénio alvo. No entanto, o termo "elevada afinidade" de ligação pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, uma "elevada afinidade" de ligação para um isotipo IgM designa um anticorpo que possui um KD de 1CT7 M ou inferior, mais preferencialmente IO-8 M ou inferior e ainda mais preferencialmente IO-9 M ou inferior.

Tal como aqui utilizado, o termo "sujeito" compreende qualquer ser humano ou animal não humano. 0 termo "animal não humano" compreende todos os vertebrados, v.g., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc..

Diversos aspectos da presente memória descritiva são descritos mais minuciosamente nas subsecções seguintes.

Anticorpos anti-fucosil-GMl

Os anticorpos da presente memória descritiva são caracterizados por características ou propriedades funcionais particulares dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos que se ligam especificamente a fucosil-GMl, de preferência fucosil-GMl. De preferência, um anticorpo da presente memória descritiva liga-se a fucosil-GMl com uma afinidade elevada, por exemplo, com um KD de 1 x 1CT7 M ou inferior. Os anticorpos anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva exibem preferencialmente uma ou várias das características seguintes: 24 (a) ligam-se especificamente a fucosil-GMl e (b) ligam-se à linhagem celular de cancro do pulmão de pequenas células DMS-79 (CPPC, n° ATCC CRL-2049).

De preferência, o anticorpo liga-se a fucosil-GMl com um valor de KD de 5 x 10 8 M ou inferior, liga-se a fucosil-GMl com um valor de KD de 1 x 10“8 M ou inferior, liga-se a fucosil-GMl com um valor de KD de 5 x 10”9 M ou inferior ou liga-se a fucosil-GMl com um valor de KD compreendido entre 1 x 10 8 M e 1 x 10~10 M ou inferior. Os ensaios convencionais para avaliar a aptidão de ligação dos anticorpos a fucosil-GMl são conhecidos na especialidade, incluindo, por exemplo, ensaios ELISA, Western blot e RIA. As cinéticas de ligação (v.g., afinidade de ligação) dos anticorpos também podem ser avaliadas por meio de ensaios convencionais conhecidos na especialidade, tais como por meio de análise de ELISA, Scatchard e Biacore.

Anticorpos monoclonais 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5

Como anticorpos preferidos da presente memória descritiva refere-se os anticorpos monoclonais humanos SB1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5, os quais são isolados e estruturalmente caracterizados conforme descrito nos exemplos 1 e 2. As sequências de aminoácido da VH de SB1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 são apresentadas nas SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6, respectivamente. As sequências de aminoácido da VL de SB1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 são apresentadas nas SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 e 12, respectivamente.

Uma vez que cada um destes anticorpos pode ligar-se a fucosil-GMl, as sequências de VH e VL podem ser "misturadas e emparelhadas" para criar outras moléculas de ligação 25 anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva. A ligação a fucosil-GMl de tais anticorpos "misturados e emparelhados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos antes e descritos nos exemplos (v.g.r ELISA). De preferência, no caso das cadeias de VH e VL serem misturadas e emparelhadas, então a sequência de VH proveniente de um emparelhamento VH/VL particular é substituída com uma sequência VH estruturalmente semelhante. De preferência, de igual modo, uma sequência de VL proveniente de um emparelhamento VH/VL particular é substituída com uma sequência VL de estruturalmente semelhante.

Assim sendo, de acordo com um aspecto, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 e 12; em que o anticorpo se liga especificamente a fucosil-GMl, de preferência fucosil-GMl.

Como combinações de cadeias pesada e leve preferidas refere-se: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:l e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:7 ou 26 (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:2 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8 ou (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:3 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 ou (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:4 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 ou (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:5 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 11 ou (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:6 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12. De acordo com outro aspecto, a presente memória descritiva proporciona anticorpos que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeias pesada e leve de 5B1, 5Bla, 7D4, 7Ε4, 13Β8 e 18D5, ou suas combinações. As sequências de aminoácido de DR1 de VH de 5B1, 5bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 são apresentadas nas SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR2 de VH CDR2s de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 são apresentadas nas SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 e 24, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR3 de VH de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 são apresentadas nas 27 SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR1 de Vk de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 são apresentadas nas SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35 e 36, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR2 de Vk de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 são apresentadas nas SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR3 de Vk de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 são apresentadas nas SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47 e 48, respectivamente. As regiões CDR são delineadas utilizando o sistema Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

Uma vez que cada um destes anticorpos pode ligar-se a fucosil-GMl e que a especificidade de ligação ao antigénio é principalmente proporcionada pelas regiões CDR1, CDR2 e CDR3, as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de Vk podem ser "misturadas e emparelhadas" (isto é, as CDR de anticorpos diferentes podem ser misturadas e emparelhadas, embora cada anticorpo tenha de conter uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de Vk) para criar outras moléculas de ligação anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva. A ligação a fucosil-GMl de tais anticorpos "misturados e emparelhados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos antes ou descritos nos exemplos (v.g., análise por ELISA, Biacore) . De preferência, no caso das sequências CDR de VH serem misturadas e emparelhadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 proveniente de uma sequência de VH particular é substituída com uma(s) sequência(s) de CDR estruturalmente semelhante. De igual 28 modo, no caso das sequências de CDR de Vk serem misturadas e emparelhadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 proveniente de uma sequência Vk particular é preferencialmente substituída com uma(s) sequência(s) de CDR estruturalmente semelhante. será evidente para o especialista na matéria que as novas sequências de VH e VL podem ser criadas por substituição de uma ou várias sequências da região CDR de VH e/ou VL com sequências estruturalmente semelhantes provenientes das sequências de CDR aqui descritas para os anticorpos monoclonais SBl, SBla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5.

Assim sendo, de acordo com outro aspecto, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que compreende: (a) uma região variável CDR1 de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 e 18; (b) uma região variável CDR2 de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 e 24; (c) uma região variável CDR3 de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 e 30; (d) uma região variável CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35 e 36; 29 (e) uma região variável CDR2 de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42 e (f) uma região variável CDR3 de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47 e 48; em que o anticorpo se liga especificamente a fucosil-GMl, de preferência a fucosil-GMl.

De acordo com uma variante compreende: preferida, o anticorpo (a) uma região variável compreende a SEQ ID NO: 13; de cadeia pesada CDR1 que (b) uma região variável compreende a SEQ ID NO: 19; de cadeia pesada CDR2 que (c) uma região variável compreende a SEQ ID NO: 25; de cadeia pesada CDR3 que (d) uma região variável compreende a SEQ ID NO: 31; de cadeia leve CDR1 que (e) uma região variável compreende a SEQ ID NO: 37 e de cadeia leve CDR2 que (f) uma região variável compreende a SEQ ID NO: 43. de cadeia leve CDR3 que De acordo com outra variante compreende: preferida, o anticorpo (a) uma região variável compreende a SEQ ID NO: 14; de cadeia pesada CDR1 que (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 20; 30 (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 26; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 32; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 38 e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 44. De acordo com outra variante preferida, o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 15; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 21; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 27; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 33; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 39 e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 45. De acordo com outra variante preferida, o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 16; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 22; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 28; 31 (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 34; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 40 e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 46. De acordo com outra variante preferida, o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 17; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 23; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 29; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 35; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 41 e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 47. De acordo com outra variante preferida, o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 18; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 24; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 30; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 36; 32 (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 42 e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 48. É bem conhecido na especialidade que o domínio CDR3 por si só, independentemente dos domínios CDR1 e/ou CDR2, pode determinar a especificidade de ligação de um anticorpo para um antigénio relacionado e que múltiplos anticorpos podem previsivelmente ser gerados que possuem a mesma especificidade de ligação com base numa sequência de CDR3 comum. Ver, por exemplo, Klimka et al., British J. of Câncer 83 (2) : 252-260 (2000) (que descreve a produção de um anticorpo anti-CD30 humanizado utilizando apenas o domínio CDR3 variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CD30 de murino Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296: 833-849 (2000) (que descreve anticorpos de glicoproteína-2 epitelial (EGP-2) recombinante utilizando apenas a sequência de CDR3 de cadeia pesada do anticorpo anti-EGP-2-MOC-31 de murino congénere); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95: 8910-8915 (1998) (que descreve um conjunto de anticorpos ανβ3 anti-integrina humanizados utilizando um domínio CDR3 variável de cadeia pesada e leve de um anticorpo ανβ3 anti-integrina de murino LM609, em que cada membro do anticorpo compreende uma sequência distinta de fora do domínio CDR3 e é capaz de ligar o mesmo epítopo tal como o anticorpo de murino congénere com afinidades tão elevadas ou superiores à do anticorpo de murino congénere); Barbas et ai., J. Am. Chem. Soc. 116: 2161-2162 (1994) (que descreve que o domínio CDR3 proporciona a contribuição mais significativa para a ligação ao antigénio); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 33 92: 2529-2533 (1995) (que descreve o enxerto de sequências de CDR3 de cadeia pesada de três Fabs (SI-1, SI-40 e SI-32) contra ADN de placenta humano na cadeia pesada de um Fab toxoide anti-tétano, substituindo assim o CDR3 de cadeia pesada existente e demonstrando que o domínio CDR3 por si só confere a especificidade de ligação); e Ditzel et al., J. Immunol. 157: 739-749 (1996) (que descreve estudos sobre enxerto, em que a transferência apenas do CDR3 de cadeia pesada de LNA3 Fab poliespecífico congénere para uma cadeia pesada de um anticorpo p313 Fab de ligação a toxoide do tétano IgG monoespecífico é suficiente para se manter a especificidade de ligação do Fab congénere).

Anticorpos que possuem sequências de linha germinativa particulares

De acordo com determinadas variantes, um anticorpo da presente memória descritiva compreende uma região variável de cadeia pesada proveniente de um gene de imunoglobulina cadeia pesada da linha germinativa particular e/ou uma região variável de cadeia leve proveniente de um gene de imunoglobulina cadeia leve da linha germinativa particular.

Por exemplo, de acordo com uma variante preferida, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que compreende uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou é transformada a partir de um gene VH 3-48 humano, em que o anticorpo se liga especificamente a fucosil-GMl, e de preferência fucosil-GM1. De acordo com outra variante preferida, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que 34 compreende uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou é transformada a partir de um gene Vk L15 humano, em que o anticorpo se liga especificamente a fucosil-GMl, e de preferência fucosil-GMl. Ainda de acordo com outra variante preferida, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, em que o anticorpo: (a) compreende uma região variável de cadeia pesada que é produto de ou que é transformada a partir de um gene VH 3-48 humano (gene esse que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 61); (b) compreende uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou que é transformada a partir de um gene VK L15 humano (gene esse que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 62) e (c) se liga especificamente a fucosil-GMl.

Como exemplos de anticorpos que possuem a VH e VK de VH 3-48 e VK L15, respectivamente, refere-se 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5. uma

Tal como aqui utilizado, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve que é "o produto de" ou que é "transformado a partir de" uma sequência de linha germinativa particular se as regiões variáveis do anticorpo são obtidas a partir de um sistema que utiliza genes de imunoglobulina de linha germinativa humanos. Tais sistemas compreendem a imunização de um murganho transgénico que suporte genes de imunoglobulina humanos com o antigénio relevante ou a pesquisa de um banco de dados de genes de imunoglobulina humanos apresentados em fagos com o antigénio relevante. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou que é "transformado a partir de" 35 sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana pode ser identificado como tal por comparação da sequência de aminoácido do anticorpo humano com as sequências d aminoácido de imunoglobulinas de linha germinativa humanas e por selecção da sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana que é mais próxima em termos de sequência (isto é, a % de identidade mais elevada) em relação à sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "produto de" ou que é "transformado a partir de" uma sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana particular pode conter diferenças nos aminoácidos em quando comparada com a sequência de linha germinativa, por exemplo, devido a mutações somáticas que ocorrem naturalmente ou à introdução intencional de mutação dirigida ao local. No entanto, um anticorpo humano seleccionado é, tipicamente, pelo menos 90% idêntico na sequência de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina de linha germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com as sequências de aminoácido de imunoglobulina de linha germinativa de outras espécies (v.g., sequências de linha germinativa de murganho). Em alguns casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em termos da sequência de aminoácido em relação à sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa.

Tipicamente, um anticorpo humano transformado a partir de uma sequência de linha germinativa humana particular irá apresentar menos de 10 aminoácidos diferentes em relação à 36 sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa humano. Em alguns casos, o anticorpo humano pode apresentar menos de 5 ou mesmo menos de 4, 3, 2 ou 1 aminoácido diferentes em relação à sequência de aminoácido amino codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa.

Anticorpos homólogos

De acordo com uma outra variante, um anticorpo da presente memória descritiva compreende regiões variáveis de cadeias pesada e leve que compreendem as sequências de aminoácido que são homólogas às sequências de aminoácidos dos anticorpos preferidos aqui descritos e em que os anticorpos mantêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva.

Por exemplo, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que: (a) a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga em relação a uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6; (b) a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga em relação a uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 e 12 e o anticorpo exibe uma ou várias das propriedades seguintes: (c) o anticorpo liga-se a fucosil-GMl com um valor de KD de 1 x 10~7 M ou inferior; 37 (d) o anticorpo liga-se à linhagem celular de cancro do pulmão de pequenas células humana DMS-79 (CPPC humano, n° ATCC CRL-2049).

De acordo com outras variantes, as sequências de aminoácido de VH e/ou VL podem ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas em relação às sequências apresentadas antes. Um anticorpo que possui regiões VH e VL que possuem uma homologia elevada (isto é, 80% ou superior) em relação às regiões VH e VL das sequências apresentadas antes, pode ser obtido por mutagénese (v.g., mutagénese dirigida ao local ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codificam as SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 e 60, seguindo-se o teste do anticorpo alterado codificado quanto à função retida (isto é, as funções apresentadas nas alíneas (c) e (d) anteriores), utilizando os ensaios funcionais aqui descritos.

Tal como aqui utilizada, a percentagem de homologia entre duas sequências de aminoácido é equivalente à percentagem de identidade entre as duas sequências. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (isto é, % homologia = n° de posições idênticas/ /n° total de posições x 100), tomando em consideração o número de espaços em branco e o comprimento de cada espaço em branco, que deverão ser introduzidos para um alinhamento óptimo das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da percentagem de identidade entre as duas sequências podem ser realizadas utilizando um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limitativos infra. 38 A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), o qual foi incorporado na aplicação informática ALIGN (versão 2.0), utilizando o quadro de peso de resíduos PAM120, uma penalização devido ao comprimento dos espaços em branco de 12 e uma penalização devido aos espaços em branco de 4. Além disso, a percentagem de identidade entre as duas sequências de aminoácido pode ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)), o qual foi incorporado no programa GAP no pacote de aplicações informáticas GCG (disponível em www.gcg.com), utilizando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso dos espaços vazios de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e peso do comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

De um modo adicional ou alternativo, as sequências de proteína da presente memória descritiva podem ainda ser utilizadas como "sequência de inquérito" para a realização de uma procura contra bancos de dados públicos, por exemplo, para identificar sequências associadas. Tais pesquisas podem ser realizadas utilizando a aplicação XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. As pesquisas de proteínas BLAST podem ser realizadas com a aplicação XBLAST, resultado = 50, comprimento de palavra = 3, para se obter sequências de aminoácido homólogas às moléculas de anticorpo da presente memória descritiva. Para se obter alinhamentos com espaços em branco para fins de comparação, é possível utilizar 'Gapped BLAST' conforme descrito por Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Durante a utilização das aplicações BLAST e Gapped BLAST, é possível 39 utilizar os parâmetros por defeitos das aplicações respectivas (v.g., XBLAST e NBLAST). (Ver www.ncbi.nlm.nih.gov).

Anticorpos com modificações conservadoras

De acordo com determinadas variantes, um anticorpo da presente memória descritiva compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve que compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou várias destas sequências de CDR compreende sequências de aminoácido especificadas com base nos anticorpos preferidos aqui descritos (v.g., 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5), ou suas modificações conservadoras, em que o anticorpo mantém as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva. Assim sendo, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências de CDR1,CDR2 e CDR3, em que: (a) a sequência de CDR3 da região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas sequências de aminoácido das SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, e suas modificações conservadoras; (b) a sequência de CDR3 da região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pela sequência de aminoácido 40 das SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47 e 48, e suas modificações conservadoras e o anticorpos exibe uma ou várias das propriedades seguintes: (c) liga-se especificamente a fucosil-GMl e (d) o anticorpo liga-se à linhagem celular do cancro do pulmão de pequenas células DMS-79 (CPPC humano, n° ATCC CRL-2049) .

De acordo com uma variante preferida, a sequência CDR2 da região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas sequências de aminoácido das SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 e 24, e suas modificações conservadoras; e a sequência CDR2 da região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas sequências de aminoácido das SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42, e suas modificações conservadoras. De acordo com outra variante preferida, a sequência CDR1 da região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas sequências de aminoácido SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, e suas modificações conservadoras; e a sequência CDR1 da região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas sequências de aminoácido das SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35 e 36, e suas modificações conservadoras.

Tal como aqui utilizado, o termo "modificações conservadoras de sequência" pretende designar modificações de aminoácidos que não afectam ou alteram significativamente as características de ligação do 41 anticorpo que contém a sequência de aminoácido. Tais modificações conservadoras compreendem substituições, adições ou deleções de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas num anticorpo da presente memória descritiva por meio de técnicas convencionais conhecidas na especialidade, tais como mutagénese dirigida ao local ou mutagénese mediada por PCR. As substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácido que possuem cadeia laterais semelhantes são conhecidas na especialidade. Estas famílias compreendem aminoácidos cadeias laterais básicas (v.g., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (v.g., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (v.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramifiçadas (v.g., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (v.g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou vários resíduos de aminoácido nas regiões de CDR de um anticorpo da presente memória descritiva pode ser substituído com outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeia lateral, sendo testado o anticorpo alterado quanto às funções mantidas (isto é, as funções apresentadas nas alineas (c) e (d) anteriores) utilizando os ensaios funcionais aqui descritos. 42

Anticorpo que se ligam ao mesmo epítopo tal como anticorpos anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva

De acordo com outra variante, a presente memória descritiva proporciona anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo em fucosil-GMl tal como qualquer um dos anticorpos monoclonais fucosil-GMl da presente memória descritiva, em que (a) o CDR1 da região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 16; (b) o CDR2 da região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 22; (c) o CDR3 da região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 28; (d) o CDR1 da região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 34; (e) o CDR2 da região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 40 e (f) o CDR1 da região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 46, (isto é, anticorpos que possuem a aptidão de inter-competir para ligação a um fucosil-GMl com qualquer um dos referidos anticorpos monoclonais da presente memória descritiva). De acordo com variantes preferidas, o anticorpo de referência para estudos de inter-competição pode ser o anticorpo monoclonal 7E4 (que possui sequências de VH e VL conforme ilustrado nas SEQ ID NO: 4 e 10, respectivamente) . Tais anticorpos para inter-competição podem ser identificados com base na sua aptidão ara inter-compterirem com 7E4 em ensaios convencionais de ligação a fucosil-GMl. Por exemplo, é possível utilizar análise BIAcore, ensaios ELISA ou citometria de fluxo para demonstrar a inter-competição com os anticorpos da presente memória descritiva. A aptidão de um anticorpo de teste para inibir a ligação, por exemplo, de 7E4, a fucosil-GMl demonstra que o anticorpo de teste pode competir com 7E4 para ligação a fucosil-GMl e, assim, liga-se ao mesmo epítopo em fucosil-GMl do que 7E4. 43

De acordo com uma variante preferida, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em fucosil-GMl como ο 7E4 é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados conforme descrito nos exemplos.

Anticorpos manipulados e modificados

Um anticorpo da presente memória descritiva pode ser preparado utilizando um anticorpo que possui uma ou várias das sequências de VH e/ou VL, aqui descritas, como material de partida para manipular um anticorpo modificado, em que o anticorpo modificado pode possuir propriedades alteradas a em relação ao anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser manipulado por modificação de um ou vários resíduos de uma ou de ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL) , por exemplo, numa ou várias regiões de CDR e/ou numa ou várias regiões de estrutura. De um modo adicional ou alternativo, um anticorpo pode ser manipulado por modificação dos resíduos na(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar as funções efectoras do anticorpo.

Um tipo de manipulação da região variável que é possível realizar é o enxerto de CDR. Os anticorpos interagem com os antigénios alvo predominantemente através de resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis regiões de determinação de complementaridade de cadeias pesada e leve (CDR) . Por tal motivo, as sequências de aminoácido nas CDR são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências de fora das CRD. Visto que as sequências de CDR são responsáveis pela maior parte das interacções anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de 44 anticorpos específicos que ocorrem naturalmente por meio da construção de vectores de expressão que compreendem as sequências de CDR provenientes do anticorpo específico que ocorre naturalmente enxertado em sequências de estrutura provenientes de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, v.g., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et ai. (1986) Nature 321: 522- 525; Queen, C. et ai. (1989) Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86: 10029-10033; patente de invenção norte-americana n° 5 225 539 de e patentes de invenção norte-americanas nos 5 530 101; 5 585 089; 5 693 762 e 6 180 370 de Queen et al).

Assim sendo, de acordo com outra variante, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 e 24 e SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28,

29 e 30, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve que compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 que compreendem uma sequência seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35 e 36, SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42 e SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47 e 48, respectivamente. Assim, tais anticorpos contêm as sequências de CDR de VH e VL dos anticorpos monoclonais 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5 embora possam conter sequências de estrutura diferentes em relação a estes anticorpos.

Tais sequências de estrutura podem ser obtidas a partir de bases de dados públicas de ADN ou a partir de 45 referências publicadas que incluam as sequências de gene de anticorpo de linha germinativa. Por exemplo, as sequências de ADN de linha germinativa para genes de região variável de cadeias pesada e leve podem ser encontradas em bases de dados de sequências de linha germinativa humanas "VBase" (disponíveis na internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como por Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quita edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227: 776-798; e Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24: 827-836; cujo conteúdo de cada é aqui expressamente incorporado por referência. Como outro exemplo, as sequências de ADN de linha germinativa para genes da região variável de cadeias pesada e leve podem ser encontradas no banco de dados Genbank. Por exemplo, as seguintes sequências de linha germinativa de cadeia pesada encontradas em HuMAb HCo7 de murganhos encontram-se disponíveis nos seguintes números de adesão ao Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 3-33 (NG_0 01010 9 e NT_024637) e 3-7 (NG_0010109 e NT_024637). Como outro exemplo, as seguintes sequências de linha germinativa de cadeia pesada encontradas no HuMAb HCol2 de murganho encontram-se disponíveis nos seguintes números de adesão ao Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 5-51 (NG_0010109 e NT_024637), 4-34 (NG_0010109 e NT_024637), 3-30.3 (?) e 3-23 (AJ406678). 46

Como sequências de estrutura preferidas para utilização nos anticorpos da presente memória descritiva refere-se aquelas que são estruturalmente semelhantes às sequências de estrutura utilizadas pelos anticorpos seleccionados da presente memória descritiva, v.g., semelhantes às sequências de estrutura VH 3-48 (SEQ ID N0:61) e/ou às sequências de estrutura Vk L15 (SEQ ID NO:62) utilizadas pelos anticorpos monoclonais preferidos da presente memória descritiva. As sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VK, podem ser enxertadas em regiões de estrutura que possuem uma sequência idêntica à encontrada no gene de imunoglobulina de linha germinativa a partir do qual a sequência de estrutura é proveniente ou então a sequência de CDR pode ser enxertada nas regiões de estrutura que contêm uma ou mais mutações comparativamente com as sequências de linha germinativa. Por exemplo, concluiu-se que em determinados casos é benéfico mutar resíduos nas regiões de estrutura para manter ou aumentar a aptidão de ligação ao antigénio do anticorpo (ver, v.g., patentes de invenção norte-americanas nos 5 530 101; 5 585 089; 5 693 762 e 6 180 370 de Queen et al) .

Um outro tipo de modificações da região variável consiste em mutar os resíduos de aminoácido nas regiões de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VK para assim melhorar um ou várias propriedades de ligação (v.g., afinidade) do anticorpo relevante. É possível efectuar mutagénese dirigida ou mutagénese mediada por PCR para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre a ligação do anticorpo, ou outra propriedades funcional relevante, pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo conforme aqui descritos e 47 apresentados nos exemplos. De preferência, são introduzidas modificações conservadoras (conforme descritas antes). as mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos, sendo preferencialmente substituições. Além do mais, tipicamente não são alterados mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos numa região de CDR.

Assim sendo, de acordo com outra variante, a presente memória descritiva proporciona anticorpos monoclonais anti- fucosil-GMl isolados, ou suas porçoes de ligação ao antigénio, que compreendem uma região variável de cadeia pesada que compreende: (a) uma região de CDR1 de VH que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, ou uma sequência de aminoácido que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 e 18; (b) uma região CDR2 de VH que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 e 24, ou uma sequência de aminoácido que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 e 24; (c) a região CDR3 de VH que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, ou uma sequência de aminoácido que possui uma, duas , três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 e 30; (d) uma região CDR1 de Vk CDR1 que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35 e 36, ou 48 uma sequência de aminoácido que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35 e 36; (e) uma região de CDR2 de Vk que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42, ou uma sequência de aminoácido que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42; e (f) uma região de CDR3 de Vk que compreende uma sequência de aminoácido seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47 e 48, ou uma sequência de aminoácido que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47 e 48.

Os anticorpos manipulados da presente memória descritiva compreendem aqueles nas quais foram realizadas modificações nos resíduos da estrutura de VH e/ou Vk, v.g.r para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações na estrutura são efectuadas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem consiste em "mutar novamente" um ou vários resíduos da estrutura para os da sequência de linha germinativa correspondentes. De um modo mais específico, um anticorpo que sofreu uma mutação somática pode conter resíduos de estrutura que são diferentes da sequência de linha germinativa a partir da qual os anticorpos são obtidos. Tais resíduos podem ser identificados por comparação das sequências de estrutura do anticorpo com as sequências de linha germinativa a partir das quais o anticorpo é obtido. 49

Por exemplo, para ο 7E4, o resíduo de aminoácido n° 11 (no FR1) de VH é uma serina ao passo que este resíduo na sequência de linha germinativa de VH 3-48 correspondente é uma leucina. Para fazer regressar as sequências da região de estrutura à sua configuração de linha germinativa, as mutações somáticas podem ser "novamente mutadas" para a sequência de linha germinativa, por exemplo, por mutagénese dirigida ao local ou por mutagénese mediada por PCR (v.g., resíduo n° 11 de FR1 de VH do 7E4 pode ser "novamente mutado" de serina para leucina).

Como outro exemplo, para 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5, o resíduo de aminoácido n° 16 (no FR1) de VH é um ácido glutâmico ao passo que este resíduo na sequência de linha germinativa de VH 3-48 correspondente é uma glicina. Para se fazer regressar as sequências da região de estrutura à sua configuração de linha germinativa, por exemplo, o resíduo n° 16 de VH de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 pode ser "novamente mutado" de ácido glutâmico para glicina. Tais anticorpos "novamente mutados" também estão abrangidos pela presente memória descritiva.

Como outro exemplo, para 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5, o resíduo de aminoácido n° 23 (em FR1) de VH é uma valina ao passo que este resíduo na sequência de linha germinativa VH 3-48 correspondente é uma alanina. Para se fazer regressar as sequências da região de estrutura para a sua configuração de linha germinativa, por exemplo, o resíduo n° 23 de VH de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 pode ser "novamente mutado" de valina para alanina. Tais anticorpos "novamente mutados" também estão abrangidos pela presente memória descritiva. 50

Como outro exemplo, para 7D4, o resíduo de aminoácido n° 24 (no FR1) de VH é uma valina ao passo que este resíduo na sequência de linha qerminativa de VH 3-48 correspondente é uma alanina. Para se fazer regressar as sequências da região de estrutura para a sua configuração de linha germinativa, por exemplo, o resíduo n° 24 de VH de 7D4 pode ser "novamente mutado" de valina para alanina. Tais anticorpos "novamente mutados" também estão abrangidos pela presente memória descritiva.

Como outro exemplo, para 13B8, o resíduo de aminoácido n° 29 (no FR1) de VH é uma leucina ao passo que este resíduo na sequência de linha germinativa de VH correspondente é uma fenilalanina. Para se fazer regressar as sequências da região de estrutura para a sua configuração de linha germinativa, por exemplo, o resíduo n° 29 de VH de 13B8 pode ser "novamente mutado" de leucina para fenilalanina. Tais anticorpos "novamente mutados" também estão abrangidos pela presente memória descritiva.

Como outro exemplo, para 7D4, 13B8 e 18D5, o resíduo de aminoácido n° 48 (no FR2) de VH é uma isoleucina ao passo que este resíduo na sequência de linha germinativa de VH 3-48 correspondente é uma valina. Para se fazer regressar as sequências da região de estrutura para a sua configuração de linha germinativa, por exemplo, o resíduo n° 48 (resíduo n° 13 no FR2) de VH de 7D4, 13B8 e 18D5 pode ser "novamente mutado" de isoleucina para valina. Tais anticorpos "novamente mutados" também estão abrangidos pela presente memória descritiva.

Como outro exemplo, para 7D4 e 18D5, o resíduo de aminoácido n° 84 (no FR3) de VH é uma serina ao passo que este resíduo na sequência de linha germinativa de VH 3-48 51 correspondente é uma asparagina. Para se fazer regressar as sequências da região de estrutura para a sua configuração de linha germinativa, por exemplo, o resíduo n° 84 (resíduo n° 18 no FR3) de VH de 7D4 e 18D5 pode ser "novamente mutado" de serina para asparagina. Tais anticorpos "novamente mutados" também estão abrangidos pela presente memória descritiva.

Um outro tipo de modificação na estrutura implica a mutação de um ou mais resíduos na região da estrutura ou mesmo numa ou várias regiões de CDR, para remover os epítopos de células T, reduzindo assim o potencial de imunogenicidade do anticorpo. Esta abordagem também é designada como "desimunização" e encontra-se descrita mais minuciosamente na publicação de patente de invenção norte-americana n° 20030153043 de Carr et ai.

De um modo adicional ou alternativo às modificações efectuadas nas regiões da estrutura ou de CDR, os anticorpos da presente memória descritiva podem ser manipulados de modo a incluírem modificações na região de Fc, tipicamente para alterar uma ou várias propriedades funcionais do anticorpo, tais como o período de semi-vida no soro, a fixação de complemento, a ligação ao receptor de Fc e/ou a citotoxicidade celular dependente do antigénio. Além do mais, um anticorpo da presente memória descritiva pode ser quimicamente modificado (v.g., um ou vários radicais químicos podem ser ligados ao anticorpo) ou pode ser modificado de modo a alterar a sua glicosilação, novamente para alterar uma ou várias propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas variantes é descrita mais minuciosamente infra. A numeração dos 52 resíduos na região de Fc está de acordo com o índice EU de Kabat.

De acordo com uma variante, a região de charneira de CHI é modificada de um modo tal que o número de resíduos cisteína na região de charneira é alterado, v.g., aumentado ou diminuído. Esta abordagem encontra-se descrita mais minuciosamente na patente de invenção norte-americana n° 5 677 425 de Bodmer et al. 0 número de resíduos cisteína na região de charneira de CHI é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

De acordo com outra variante, a região de charneira FC de um anticorpo é mutada para diminuir o período de semi-vida biológico do anticorpo. De um modo mais específico, são introduzidas uma ou mais mutações de aminoácidos na região de interface dos domínios CH2-CH3 do fragmento Fc-charneira, de um modo tal que o anticorpo possua uma ligação a estafilococil-proteína A (SpA) em comparação com a ligação a Spa do domínio Fc-charneira nativo. Estas abordagem encontra-se descrita mais minuciosamente na patente de invenção norte-americana n° 6 165 745 de Ward et al.

De acordo com outra variante, o anticorpo é modificado para aumentar o seu período de semi-vida biológico. São possíveis diversas abordagens. Por exemplo, é possível introduzir uma ou várias das mutações seguintes: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 6 277 375 de Ward. Em alternativa, para aumentar o período de semi-vida biológico, o anticorpo pode ser alterado na região CHI ou CL de modo a conter um epítopo de ligação a um receptor de resgate retirado de 53 suas espiras de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 869 046 e 6 121 022 de Presta et al.

Ainda de acordo com outra variante, a região Fc é alterada por substituição pelo menos de um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função(ões) efectoras(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou vários aminoácidos seleccionados entre os resíduos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente, de um modo tal que o anticorpo apresente uma afinidade alterada para um ligando efector mas mantenha a aptidão de ligação ao antigénio do anticorpo original. O ligando efector para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente Cl do complemento. Esta abordagem encontra-se descrita mais minuciosamente nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 624 821 e 5 648 260 ambas de Winter et al.

Num outro exemplo, um ou mais aminoácidos seleccionados entre os resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente, de um modo tal que o anticorpo possua uma ligação a Clq alterada e/ou uma citotoxicidade dependente do complemento (CDC) reduzida ou suprimida (CDC). Esta abordagem encontra-se descrita mais minuciosamente na patente de invenção norte-americana n° 6 194 551 de

Idusogie et al.

Num outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido nas posições de aminoácido 231 e 239 são alteradas, para assim alterar a aptidão do anticorpo para se fixar ao complemento. Esta abordagem encontra-se descrita mais 54 minuciosamente na publicação do pedido de patente de invenção PCT n° WO 94/29351 de Bodmer et ai.

Ainda de acordo com um outro exemplo, a região Fc é modificada para aumentar a aptidão do anticorpo para mediar a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fcy modificando um ou vários aminoácidos nas posições seguintes: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419 , 430, , 434 , 435 , 437, 438 ou 439.

Esta abordagem encontra-se ainda descrita na publicação de patente de invenção PCT n° WO 00/42072 de Presta. Além do mais, os locais de ligação em IgGl humana para FcyRl, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e variantes com uma ligação melhorada foram descritos (ver, Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591-6604). As mutações especificas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 demonstraram melhorar a ligação a FcyRIII. Além do mais, os mutantes de combinação seguintes demonstraram melhorar a ligação a FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.

Ainda de acordo com outra variante, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser preparado (isto é, ao anticorpo falta a glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo para o antigénio. Tais modificações de hidratos de carbono podem ser efectuadas, por exemplo, por meio da alteração de um ou 55 vários locais de glicosilação na sequência do anticorpo. Por exemplo, é possível efectuar uma ou várias substituições de aminoácido que resultem na eliminação de um ou vários locais de glicosilação da estrutura da região variável, eliminado assim a glicosilação nesse local. Tal glicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antigénio. Tal abordagem encontra-se descrita mais minuciosamente nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 714 350 e 6 350 861 de Co et al.

De um modo adicional ou alternativo, é possível preparar um anticorpo que possua um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado que possui quantidades reduzidas de resíduos fucosilo ou um anticorpo que possui estruturas GlcNac bi-sectadas aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados demonstraram aumentar a aptidão de ADCC dos anticorpos. Tais modificações de hidratos de carbono podem ser efectuadas, por exemplo, por expressão do anticorpo numa célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. As células com uma maquinaria de glicosilação alterada forma descritas na especialidade e podem ser utilizadas como células hospedeiras para expressar anticorpos recombinantes da presente memória descritiva, produzindo assim um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, às linhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 falta o gene fucosil-transferase, FUT8 (alfa-(1,6)-fucosil-transferase), de um modo tal que nos anticorpos expressos nas linhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 falta fucose nos seus hidratos de carbono. As linhagens celulares Ms704, Ms705, e Ms709 FUT8 / foram criadas pelo fraccionamento dirigido do gene FUT8 em células CHO/DG44, utilizando dois vectores de 56 substituição (ver, a publicação de patente norte-americana n° 20040110704 de Yamane et al. e Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22). Como outro exemplo, no documento EP 1 176 195 de Hanai et al. encontra-se descrita uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente fraccionado, que codifica uma fucosil-transferase, de um modo tal que os anticorpos expressos em tal linhagem celular exibem hipofucosilação por redução ou eliminação da enzima associada à ligação alfa-1,6. Hanai et al. também descrevem linhagens celulares que possuem uma actividade enzimática baixa para a adição de fucose a N-acetilglucosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou que não possui a actividade enzimática, por exemplo, a linhagem celular de mieloma de ratos, YB2/0 (ATCC CRL 1662) . Na publicação de patente de invenção PCT n° WO 03/035835 de Presta encontra-se descrita uma linhagem celular da variante de CHO, células Lecl3, com uma aptidão reduzida para ligar fucose a hidratos de carbono ligados a Asn(297), resultando também a hipofucosilação de anticorpos expressos nessa célula hospedeira (ver também Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). Na publicação de patente de invenção PCT n° WO 99/54342 de Umana et al. encontram-se descritas linhagens celulares manipuladas de modo a expressarem glicosil-transferases modificadoras de glicoproteína (v.g., beta-(1,4)-N-acetil-glucosaminiltransferase III (GnTIII)), de um modo tal que os anticorpos expressos nas linhagens celulares manipuladas exibem estruturas GlcNac bi-sectadas aumentadas que resultam numa actividade de ADCC aumentada dos anticorpos (ver também Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180). Em alternativa, os resíduos fucose dos anticorpos 57 podem ser removidos por clivagem utilizando uma enzima fucosidase. Por exemplo, a fucosidase alfa-L-fucosidase remove os residuos fucosilo a partir dos anticorpos (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14: 5516-23).

Uma outra modificação dos anticorpos que é aqui contemplada na presente memória descritiva é a peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, para aumentar o periodo de semi-vida biológico (v.g., soro) do anticorpo. Para se efectuar a peguilação de um anticorpo, faz-se reagir tipicamente o anticorpo, ou um seu fragmento, com polietileno-glicol (PEG), tal como um derivado reactivo éster ou aldeído de PEG, sob condições em que um ou mais grupos PEG ficam ligados ao anticorpo ou ao fragmento do anticorpo. De preferência, a peguilação é efectuada por meio de uma reacção de alquilação com uma molécula reactiva de PEG (ou um polímero análogo reactivo solúvel em água). Tal como aqui utilizado, o termo "polietileno-glicol" pretende abranger quaisquer formas de PEG que sejam utilizadas para transformar outras proteínas, tais como mono-alcoxi(C1-C10)- ou ariloxi-polietileno-glicol ou polietileno-glicol-maleimida. De acordo com determinada variantes, o anticorpo que se pretende peguilar é um anticorpo aglicosilado. Os métodos para a peguilação de proteínas são conhecidos na especialidade e podem ser aplicados aos anticorpos da presente memória descritiva. Ver, por exemplo, os documentos EP 0 154 316 de Nishimura et al e EP 0 401 384 de Ishikawa et al. Métodos de manipulação de anticorpos 58 58 sendo então preparada e

Conforme descrito antes, os anticorpos anti-fucosil-GM1 que possuem sequências de VH e VK aqui descritos podem ser utilizados para criar novos anticorpos anti-fucosil-GMl por modificação das sequências de VH e/ou VK , ou da(s) região(ões) constantes a elas ligadas. Assim, de acordo com outro aspecto da presente memória descritiva, as caracteristicas estruturais de um anticorpo anti-fucosil-GM1 da presente memória descritiva, v.g., 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5, são utilizadas para criar anticorpos anti-fucosil-GMl estruturalmente associados que mantêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da presente memória descritiva, tal como a ligação a fucosil-GMl. Por exemplo, uma ou mais regiões de CDR de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5, ou suas mutações, podem ser combinadas recombinantemente com regiões de estrutura conhecidas e/ou com outros CDR para criar anticorpos anti-fucosil-GMl, recombinantemente manipulados, suplementares da presente memória descritiva, conforme descrito antes. Como outros tipos de modificações refere-se aqueles descritos na secção anterior. 0 material de partida para o método de manipulação é uma ou várias das sequências de VH e/ou VK aqui descritas, ou uma ou várias suas regiões CDR. Para se criar o anticorpo manipulado, não é necessário preparar realmente (isto é, expressar sob a forma de uma proteína) um anticorpo que possui uma ou mais das sequências de VH e/ou VK aqui descritas, ou uma ou mais das suas regiões CDR. Em vez disso, a informação contida na(s) sequência(s) é utilizada como material de partida para criar uma sequência(s) de "segunda geração" proveniente da(s) sequência(s) original(ais), 59 expressa a(s) sequência(s) de "segunda geração" sob a forma de uma proteína.

Assim sendo, de acordo com outra variante, a presente memória descritiva proporciona um método para a preparação de um anticorpo anti-fucosil-GMl que consiste em: (a) proporcionar: (i) uma sequência do anticorpo da região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de CDR1 seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, uma sequência de CDR2 seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 e 24, e/ou uma sequência de CDR3 seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 e 30; e/ou (ii) uma sequência do anticorpo da região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de CDR1 seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35 e 36, uma sequência de CDR2 seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42, e/ou uma sequência de CDR3 seleccionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47 e 48; (b) alterar pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência do anticorpo da região variável de cadeia pesada e/ou na sequência do anticorpo da região variável de cadeia leve para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada e (c) expressar a sequência de anticorpo alterada sob a forma de uma proteína. É possível utilizar técnicas de biologia molecular convencionais para preparar e para expressar a sequência de anticorpos alterada. 60

De preferência, o anticorpo codificado pela sequência de anticorpo alterada, ou sequências, é um anticorpo que retenha uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos anti-fucosil-GMl aqui descritos, em que as propriedades funcionais compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação: (a) o anticorpo liga-se a fucosil-GMl com um valor de KD de 1 x 10~7 M ou inferior; (b) liga-se à linhagem celular de cancro do pulmão de pequenas células humana DMS-79 (CPPC humana, n° ATCC CRL-2049) .

As propriedades funcionais dos anticorpos alterados pode ser avaliada utilizando ensaios convencionais disponíveis na especialidade e/ou aqui descritos, tais como os apresentados nos exemplos (v.g., citometria de fluxo, ensaios de ligação).

De acordo com determinadas variantes dos métodos de manipulação de anticorpos da presente memória descritiva, as mutações podem ser introduzidas de um modo aleatório ou selectivo ao longo da totalidade ou de uma parte de uma sequência que codifica um anticorpo anti-fucosil-GMl, em que os anticorpos anti-fucosil-GMl modificados resultantes podem ser pesquisados quanto à sua actividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais, conforme aqui descrito. Os métodos mutacionais foram já descritos na especialidade. Por exemplo, na publicação da patente de invenção PCT n° WO 02/092780 de Short, encontram-se descritos métodos para a criação e pesquisa de mutações no anticorpo utilizando mutagénese de saturação, montagem de ligação sintética ou uma sua combinação. Em alternativa, na publicação de patente de invenção PCT n° WO 03/074679 de 61

Lazar et al., encontram-se descritos métodos para a utilização de métodos de pesquisa computacional para optimizar as propriedades fisico-quimicas dos anticorpos.

Moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos da presente memória descritiva

Um outro aspecto da presente memória descritiva diz respeito a moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos da presente memória descritiva. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células totais, num lisado de células ou sob uma forma substancialmente pura ou parcialmente purificada. Um ácido nucleico é "isolado" ou "apresentado substancialmente puro" quando é purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, v.g., outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por meio de técnicas convencionais, incluindo tratamento alcalino/SDS, formação de bandas com CsCl, cromatoqrafia em coluna, electroforese em gel de agarose e outros técnicas bem conhecidas na especialidade. Ver, F. Ausubel, et ai., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Um ácido nucleico da presente memória descritiva pode ser, por exemplo, ADN ou ARN e pode ou não conter sequências intrónicas. De acordo com uma variante preferida, o ácido nucleico é uma molécula de ADNc.

Os ácidos nucleicos da presente memória descritiva podem ser obtidos utilizando técnicas convencionais de biologia molecular. Para anticorpos expressos por hibridomas (v.g., hibridomas preparados a partir de murganhos transgénicos que suportam genes de imunoglobulina humana conforme a seguir se descreve), os ADNc que 62 codificam as cadeias leve e pesadas do anticorpo preparado pelo hibridoma podem ser obtidos por técnicas de ampliação de PCR convencionais ou técnicas de clonagem de ADNc. Para os anticorpos obtidos a partir de bancos de dados de genes de imunoglobulina (v.g., utilizando técnicas de apresentação de fagos), o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado a parir do banco de dados.

Como moléculas de ácidos nucleicos preferidas da presente memória descritiva refere-se aquelas que codificam as sequências de VH e VL dos anticorpos monoclonais 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 ou 3C4, . As sequências de ADN que codificam as sequências de VH de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 3C4 são apresentadas nas SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53 e 54, respectivamente. As sequências de ADN que codificam as sequências de VL de 5B1, 5bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 3C4 são apresentadas nas SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59 e 60, respectivamente.

Após serem obtidos fragmentos de ADN que codificam os segmentos de VH e VL, estes fragmentos de ADN podem ainda ser manipulados por técnicas recombinantes de ADN convencionais, por exemplo, para converter os genes de região variável em genes do anticorpo de cadeia completa, em genes do fragmento Fab ou num gene scFv. Em tais manipulações, um fragmento de ADN que codifica uma VL ou VH é operacionalmente ligado a um outro fragmento de ADN que codifica uma outra proteína, tal como uma região constante do anticorpo ou um ligador flexível. O termo "operacionalmente ligado", tal como utilizado neste contexto, pretende designar que os dois fragmentos de ADN estão unidos de um modo tal que as sequências de aminoácido 63 codificadas pelos dois fragmentos de ADN permanecem concatenadas. 0 ADN isolado que codifica a região VH pode ser convertido num gene de cadeia pesada de comprimento completo por ligação operacional do ADN que codifica o VH a outra molécula de ADN que codifica as regiões constantes de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As sequências de genes de região constante de cadeia pesada são conhecidas na especialidade (ver, v.g., Kabat, E. A., et ai. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e os fragmentos de ADN que compreendem estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR convencional. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, igA, IgE, IgM ou IgD, mas preferencialmente é uma região constante de IgGl ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de um fragmento Fab, o ADN que codifica o VH pode ser operacionalmente ligado a uma outra molécula de ADN que codifica apenas a região constante de cadeia pesada CHI. 0 ADN isolado que codifica a região de VL pode ser convertido num gene de cadeia leve de comprimento completo (bem como um gene de cadeia leve Fab) por ligação operacional do ADN que codifica o VL a uma outra molécula de ADN que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências de genes da região constante de cadeia leve humana são conhecidas na especialidade (ver, v.g., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e os 64 fragmentos de ADN que compreendem estas regiões podem ser obtidos por ampliação por PCR convencional. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda, embora seja preferencialmente uma região constante kappa.

Para se criar um gene scFv, os fragmentos de ADN que codificam o VH e VL são operacionalmente ligados a outro fragmento que codifica um ligador flexível, v.g., que codifica a sequência de aminoácido (Gly4-Ser)3, de um modo tal que as sequências de VH e VL possam ser expressas sob a forma de uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo ligador flexível (ver, v.g., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554).

Produção de anticorpos monoclonais da presente memória descritiva

Os anticorpos monoclonais (mAbs) da presente memória descritiva podem ser produzidos por meio de diversas técnicas, incluindo metodologias convencionais de anticorpo monoclonal, v.g., a técnica de hibridação de células somáticas convencional de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Embora os procedimentos de hibridação de células somáticas sejam preferidos, em princípio, também é possível utilizar outras técnicas para a produção de anticorpos monoclonais, v.g., transformação virai ou oncogénica de linfócitos B. O sistema animal preferido para a preparação de hibridomas é o sistema de murganhos. A produção de hibridomas em murganhos é um procedimento muito bem 65 estabelecido. Os protocolos de imunização e técnicas para o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na especialidade. Os parceiros de fusão (v.g., células de mieloma de murino) e os procedimentos de fusão também são conhecidos.

De acordo com uma variante preferida, os anticorpos da presente memória descritiva são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra fucosil-GMl podem ser gerados utilizando murganhos transgénicos ou transcromossómicos que suportem partes do sistema imune humano em vez do sistema de murganho. Estes murganhos transgénicos ou transcromossómicos compreendem murganhos aqui referidos como murganhos HuMAb e murganhos KM™, respectivamente, e são colectivamente aqui designados como "murganhos com Ig humana".

Os murganhos HuMAb® (Medarex, Inc.) contêm minilocais do gene de imunoglobulina humana que codifica as sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e γ) e de cadeia leve κ não arranjadas, em conjunto com mutações dirigidas que inactivam os locais de cadeia μ e κ endógenos (ver, v.g., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Assim sendo, os murganhos exibem uma expressão reduzida de IgM de murganho ou κ e, em resposta a imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos sofrem uma alteração de classe e uma mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgGx humanos de afinidade elevada (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto por Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sei. 764: 536-546). A preparação e utilização de 66 murganhos HuMab, bem como as modificações genómicas suportadas pelo murganho são ainda descritas por Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 3720-3724; Choi et ai. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; e Fishwild, D. et ai. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, cujo seu conteúdo se considera aqui incorporado por referência na sua totalidade. Veja-se ainda as patentes de invenção norte-americanas nos 5 545 806; 5 569 825; 5 625 126; 5 633 425; 5 789 650; 5 877 397; 5 661 016; 5 814 318; 5 874 299 e 5 770 429; todas de Lonberg e Kay; a patente de invenção norte-americana n° 5 545 807 de Surani et ai.; as publicações das patentes de invenção PCT nos WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas de Lonberg e Kay; e a publicação da patente de invenção PCT n° WO 01/14424 de Korman et al.

De acordo com outra variante, os anticorpos humanos da presente memória descritiva podem ser criados utilizando um murganho que suporte sequências de imunoglobulina humana em transgenes ou transcromossomas, tal como um murganho que suporte um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossoma de cadeia leve humano. Tais murganhos, aqui designados como "murganhos KM™", são descritos mais minuciosamente na publicação da patente de invenção PCT n° WO 02/43478 de Ishida et al.

Além disso, na especialidade encontram-se disponíveis sistemas alternativos de animais transgénicos que expressam 67 genes de imunoglobulina humana, os quais podem ser utilizados para criar anticorpos anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva. Por exemplo, é possível utilizar um sistema transgénico alternativo, designado por Xenomouse (Abgenix, Inc.); tais murganhos encontram-se descritos, por exemplo, nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 939 598; 6 075 181; 6 114 598; 6 150 584 e 6 162 963 de Kucherlapati et al.

Além do mais, na especialidade encontram-se disponíveis sistemas alternativos de animais transcromossómicos, os quais podem ser utilizados para criar anticorpos anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva. Por exemplo, é possível utilizar murganhos que suportam um transcromossoma de cadeia pesada humano e um transcromossoma de cadeia leve humano, designados por "murganhos TC"; tais murganhos encontram-se descritos por Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 722-727. Além disso, foram já descritas na especialidade vacas que suportam transcromossomas de cadeia pesada e de cadeia leve humanos (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894), as quais podem ser utilizadas para criar anticorpos anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva.

Os anticorpos monoclonais humanos da presente memória descritiva também podem ser preparados utilizando métodos de apresentação de fagos para a pesquisa de bases de dados de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de apresentação de fagos para o isolamento de anticorpos humanos são conhecidos na especialidade. Veja-se, por exemplo: as patentes de invenção norte-americanas nos 5 223 409; 5 403 484 e 5 571 698 de Ladner et al.; as patentes de invenção norte-americanas nos 5 427 908 e 5 580 717 de 68

Dower et al.; as patentes de invenção norte-americanas nos 5 969 108 e 6 172 197 de McCafferty et al. e as patentes de invenção norte-americanas nos 5 885 793; 6 521 404; 6 544 731; 6 555 313; 6 582 915 e 6 593 081 de Griffiths et al.

Os anticorpos monoclonais humanos da presente memória descritiva também podem ser preparados utilizando murganhos SCID, nos quais foram reconstituídas células imunes humanas de um modo tal que seja possível gerar uma resposta de anticorpo humano durante a imunização. , Tais murganhos encontram- -se descritos, por exemplo, nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 476 996 e 5 698 767 de

Wilson et al.

Imunização de murganhos com Ig humana

No caso de se utilizar murganhos com Ig humana para desenvolver anticorpos humanos da presente memória descritiva, tais murganhos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio fucosil-GM1 e/ou fucosil-GMl recombinante, ou uma proteína de fusão de fucosil-GMl, conforme descrito por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; e nas publicações das patentes de invenção PCT nos WO 98/24884 e WO 01/14424. De preferência, os murganhos irão ter 6 a 16 semanas de idade aquando da primeira infusão. Por exemplo, é possível utilizar uma preparação purificada ou recombinante (5-50 pg) do antigénio de fucosil-GMl para imunizar os murganhos com Ig humana por via intraperitoneal.

Os procedimentos detalhados para se gerar anticorpos monoclonais humanos completos contra fucosil-GMl encontram-se descritos no exemplo 1 seguinte. As experiências 69 cumulativas com diversos antigénios demonstrou que o murganho transgénico responde quando inicialmente imunizado por via intraperitoneal (IP) com o antigénio em adjuvante completo de Freund, seguindo-se imunizações IP a cada duas semanas (até um total de 6) com antigénio em meio incompleto de Freund. No entanto, também são eficazes outros adjuvantes para além do adjuvante de Freund. Além disso, concluiu-se que células totais, na ausência de adjuvantes, são bastante imunogénicas. A resposta imune pode ser monitorizada ao longo do decurso do protocolo de imunização, sendo as amostras de plasma obtidas por sangramentos retro-orbitais. 0 plasma pode ser pesquisado por ELISA (conforme a seguir descrito), e os murganhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-fucosil-GM1 podem ser utilizados para fusões. Os murganhos podem ser reforçados com antigénio por via intravenosa 3 dias antes do seu sacrifício e remoção do baço. É esperado que seja necessário realizar 2 a 3 fusões para cada imunização. Tipicamente, são imunizados entre 6 e 24 murganhos para cada antigénio. Normalmente, são utilizadas as estirpes HCo7 e HCol2. Além disso, os transgenes HCo7 e HCol2 podem ser recriados em conjunto num murganho único que possua dois transgenes de cadeia pesada humanos diferentes (HCo7/HCol2) . Em alternativa ou adicionalmente, é possível utilizar a estirpe de murganho KM™, tal como descrito no exemplo 1.

Geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos da presente memória descritiva

Para gerar híbridos que produzam anticorpos monoclonais humanos da presente memória descritiva, é 70 possível isolar esplenócitos e/ou células de nódulos linfáticos provenientes de murganhos imunizados e fundi-los numa linhagem celular imortalizada adequada, tal como uma linhagem celular de mieloma de murganho. Os hibridomas resultantes podem ser pesquisados quanto à produção de anticorpos específicos para o antigénio. Por exemplo, as suspensões de células individuais de linfócitos do baço provenientes de murganhos imunizados podem ser fundidas a um sexto do número de células de murganho que não segreguem P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com 50% de PEG. Em alternativa, as suspensões de células individuais de linfócitos do baço provenientes de murganhos imunizados podem ser fundidas utilizando um campo eléctrico com base no método de electrofusão, usando um electroporador de fusão de células de câmara grande 'Cyto Pulse' (Cyto Pulse

Sciences, Inc., Glen Burnie, MD ) . Coloca-se as células em placas aproximadamente a 2 x 105 numa placa de microtitulação de fundo liso, seguindo-se uma semana de incubação em meio de glicose elevada DMEM com L-glutamina e piruvato de sódio (Mediatech, Inc., Herndon, VA), que contém ainda 20% de soro fetal de bovino (Hyclone, Logan, UT), 18% de meio condicional P388DI, 5% de factor de clonagem de hibridoma 'Origen' (BioVeris, Gaithersburg, VA), L-glutamina 4 mM, HEPES 5 mM, β-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/mL de penicilina, 50 mg/mL de estreptomicina e IX meio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas após a fusão). Decorrida uma semana, as células desenvolvidas em cultura no meio em que o HAT utilizado foi substituído com HT. As cavidades individuais foram então pesquisadas por ELISA quanto a anticorpos IgM e IgG monoclonais humanos. 71

Após a ocorrência de crescimento extensivo de hibridoma, é possivel observar o meio, normalmente decorridos 10 a 14 dias. Os hibridomas que segregam o anticorpo podem ser novamente colocados em placas, pesquisados novamente e, caso sejam ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser desenvolvidos em cultura in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo, em meio de cultura de tecidos, para caracterização.

Para purificas os anticorpos monoclonais humanos, os hibridomas seleccionados podem ser deixados desenvolver em frascos de agitação de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes de cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG proveniente de eluição podem ser controlada por electroforese em gel e por cromatografia líquida de elevado rendimento para garantir a pureza. A solução de tampão pode ser permutada para PBS e a concentração pode ser determinada por DO28CU utilizando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser separados em aliquotas e armazenados a -80°C.

Geração de transfectomas que produzam anticorpos monoclonais da presente memória descritiva

Os anticorpos da presente memória descritiva também podem ser produzidos num transfectoma de célula hospedeira, utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas recombinantes de ADN e métodos de transfecção de genes, 72 conforme são bem conhecidos na especialidade (v.g., Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou seus fragmentos de anticorpo, os ADN que codificam cadeias leves e pesadas de comprimento completo ou parcial podem ser obtidos por meio de técnicas de biologia molecular convencionais (v.g., ampliação por PCR ou clonagem de ADNc utilizando um hibridoma que expresse o anticorpo relevante) e os ADNc podem ser inseridos em vectores de expressão de um modo tal que os genes de operacionalmente ligados a sequências de controlo de transcrição e tradução. Neste contexto, o termo "operacionalmente ligado" pretende designar que um gene de anticorpo está ligado a um vector de um modo tal que as sequências de controlo de transcrição e tradução no vector sirvam a sua função pretendida de regulação da transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vector de expressão e as sequências de controlo da expressão são seleccionados de modo a serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vectores separados ou, tipicamente, os genes são inseridos no mesmo vector de expressão. Os genes de anticorpos são inseridos no vector de expressão por métodos convencionais (v.g., ligação de locais de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vector ou ligação de extremidades planas no caso de não estarem presentes locais de restrição). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas para criar genes de anticorpo de comprimento completo de qualquer isotipo de anticorpo por meio da sua inserção em vectores de expressão 73 que codifiquem há as regiões constante de cadeia pesada e constante de cadeia leve do isotipo desejado, de um modo tal que o segmento VH esteja operacionalmente ligado ao(s) segmento (s) CH no vector e que o segmento VK esteja operacionalmente ligado ao segmento CL no vector. De um modo adicional ou alternativo, o vector de expressão recombinante pode codificar um péptido de sinal que facilite a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene de cadeia do anticorpo pode ser clonado no vector de um modo tal que o péptido de sinal esteja concatenadamente ligado ao terminal amino do gene de cadeia do anticorpo. 0 péptido de sinal pode ser um péptido de sinal de imunoglobulina ou um péptido de sinal heterólogo (isto é, um péptido de sinal proveniente de uma proteína não imunoglobulina).

Para além dos genes de cadeia do anticorpo, os vectores de expressão recombinantes da presente memória descritiva possuem sequências regulatórias que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo numa célula hospedeira. 0 termo "sequência regulatória" pretende compreender promotores, potenciadores e outros elementos de controlo da expressão (v.g., sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição e tradução dos genes da cadeia de anticorpo. Tais sequências regulatórias encontram-se descritas, por exemplo, por Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será apreciado pelos especialistas na matéria que a concepção do vector de expressão, incluindo a selecção de sequências regulatórias, possa depender de factores tais como a escolha da célula hospedeira que se pretende transformar, do nível de expressão da proteína 74 desejada, etc.. Como sequências regulatórias preferidas para a expressão de células hospedeiras de mamíferos refere-se elementos virais que regulam níveis elevados de expressão de proteína em células de mamíferos, tais como promotores e/ou potenciadores provenientes de citomegalo-vírus (CMV), vírus 40 d exímios (SV40), adenovírus (v.g., o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Em alternativa, é possível utilizar sequências regulatórias não virais, tais como o promotor de ubiquitina ou o promotor de β-globina. É ainda possível referir elementos regulatórios constituídos por sequências de fontes diferentes, tais como o sistema promotor SRa, o qual contém sequências do promotor inicial de SV40 e a repetição do terminal longo do vírus de tipo 1 de leucemia de células T humano (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472) .

Para além dos genes da cadeia de anticorpo e das sequências regulatórias, os vectores de expressão recombinantes da presente memória descritiva podem conter sequências suplementares, tais como sequências que regulam a replicação do vector em células hospedeiras (v.g., origens de replicação) e genes marcadores seleccionáveis. O gene marcador seleccionável facilita a selecção de células hospedeiras nas quais o vector foi introduzido (ver, e.g., patentes de invenção norte-americanas nos 4 399 216, 4 634 665 e 5 179 017, de Axel et al.) . Por exemplo, de um modo ti+ico, o gene marcador seleccionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira, na qual o vector tenha sido introduzido. Como genes marcadores seleccionáveis preferidos refere-se o gene di-hidrofolato-reductase (DHFR) (para utilização em 75 células hospedeiras dhfr com selecção/ampliação com metotrexato) e o gene neo (para selecção de G418).

Para a expressão das cadeias leve e pesada, o vector de expressão, ou vectores, que codifica as cadeias leve e pesada é transfectado numa célula hospedeira por meio de técnicas convencionais. As várias formas do termo "transfecção" pretendem incluir diversas técnicas habitualmente utilizadas para a introdução de ADN exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, v.g., electroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com base em DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da presente memória descritiva em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas, a expressão dos anticorpos em células eucarióticas, e mais preferencialmente em células hospedeiras de mamíferos, é mais preferida, uma vez que tais células eucarióticas, e em particular as células de mamíferos, são mais propensas do que as células procarióticas à montagem e secreção de um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente activo. A expressão procariótica de genes de anticorpo foi descrita como sendo ineficaz para a produção em rendimentos elevados do anticorpo activo (Boss, Μ. A. e Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).

Como células hospedeiras de mamíferos preferidas para a expressão dos anticorpos recombinantes da presente memória descritiva refere-se células de ovários de hamster chinês (células CHO) (incluindo células CHO-dhfr, descritas por Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216-4220, utilizadas com um marcador seleccionável DHFR, v.g., conforme descrito por R. J. Kaufman e P. A. 76

Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para a utilização com células de mieloma NSO, um outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão de gene GEL DE SÍLICA, descrito nos documentos WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338841. No caso dos vectores de expressão recombinante que codificam os genes de anticorpo serem introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, então os anticorpos são produzidos por cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que são desenvolvidas as células hospedeiras. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos de purificação de proteínas convencionais.

Caracterização da ligação de anticorpo ao antigénio

Os anticorpos da presente memória descritiva podem ser testados quanto à ligação a fucosil-GMl, por exemplo, por ELISA convencional. Resumidamente, reveste-se placas de microtitulação com fucosil-GMl purificado a 0,25 pg/mL em PBS e depois bloqueia-se com 5% de albumina do soro de bovino em PBS. Adiciona-se diluições do anticorpo (v.g., diluições de plasma provenientes de murganhos imunizados a com fucosil-GMl) a cada cavidade e mantém-se a incubar durante 1 a 2 horas a 37°C. Lava-se as placas com PBS/Tween e depois mantém-se a incubar com um reagente secundário (v.g., para anticorpos humanos, um reagente policlonal específico de Fc de anti-IgG humana de cabra) conjugado para fosfatase alcalina durante 1 hora a 37°C. Após lavagem, revela-se as placas com substrato de pNPP (1 77 mg/ml) e analisa-se a DO de 405-650. De preferência, os murganhos que apresentem os títulos mais elevados serão utilizados para fusões.

Também é possível utilizar um ensaio ELISA, conforme descrito antes, para pesquisar hibridomas que apresentem uma reactividde positiva com o imunogénio fucosil-GMl. Os hibridomas que se ligam com uma elevada avidez a fucosil-GMl são subclonados e novamente caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que mantenha a reactividade das células originais (por ELISA), pode ser seleccionado para a preparação de um banco de células em 5 a 10 frascos armazenado a -140°C e para purificação do anticorpo.

Para purificar anticorpos anti-fucosil-GMl, os hibridomas seleccionados podem ser desenvolvidos em frascos de agitação de dois litros para purificação do anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes de serem submetidos a cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . As IgG provenientes de eluição podem ser controladas por electroforese em gel e por cromatografia líquida de elevado rendimento para garantir a pureza. A solução tampão pode ser permutada em PBS e a concentração pode ser determinada por DO280, utilizando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser distribuídos em aliquotas e armazenados a -80°C.

Para se determinar se os anticorpos monoclonais anti-fucosil-GMl seleccionados se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado utilizando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL) . É possível efectuar estudos de competição com anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos monoclonais 78 biotinilados, utilizando placas ELISA revestidas com fucosil-GMl, conforme descrito antes, a ligação de mAb biotinilados pode ser detectada com uma sonda de estrepavidina-fosfatase alcalina.

Para se determinar o isotipo dos anticorpos purificados, é possível realizar ELISA de isotipos utilizando reagentes específicos para os anticorpos de um isotipo particular. Por exemplo, para se determinar o isotipo de um anticorpo monoclonal humano, é possível revestir cavidades de placas de microtitulação com 1 pg/mL de imunoglobulina anti-humana de um dia para o outro a 4°C. Após o bloqueio com 1% de BSA, faz-se reagir as placas com 1 pg/mL ou uma quantidade inferior dos anticorpos monoclonais em teste ou dos controlos de isotipo purificados, à temperatura ambiente durante uma a duas horas. Faz-se então reagir as cavidades com igGl humana ou com sondas conjugadas de IgM humana-fosfatase alcalina específica. Revela-se as placas e analisa-se conforme descrito antes.

As IgG humanas anti-fucosil-GMl podem ser ainda testadas quanto à reactividade com o antigénio fucosil-GMl por análise de Western blotting. Resumidamente, prepara-se fucosil-GMl e submete-se a electrofores em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida. Após a electroforese, transfere-se os antigénios separados para membranas de nitro-celulose, bloqueia-se com 10% de soro fetal de vitelo e sonda-se com os anticorpos monoclonais que se pretende testar. A ligação a IgG humana pode ser detectada utilizando fosfatase alcalina de IgG anti-humana e revelada com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.). 79

Imunoconjugados

De acordo com outro aspecto, a presente memória descritiva diz respeito a um anticorpo anti-fucosil-GMl, ou a um seu fragmento, conjugado num radical terapêutico, tal como uma citotoxina, um fármaco (v.g., um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Tais conjugados são aqui designados como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou várias citotoxinas são designados como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico compreende qualquer agente é prejudicial (v.g., mata) para as células. Como exemplos refere-se taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colcicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidro-testosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaina, lidocaina, propranolol e puromicina e seus análogos ou homólogos. Como agentes terapêuticos também é possível referir, por exemplo, antimetabolitos (v.g., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil-decarbazina), agentes de alquilação (v.g., mecloretamina, tioepa-clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromo-manitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina de platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (v.g., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (v.g., dactino-micina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (v.g., vincristina e vinblastina). 80

Como outros exemplos de citotoxinas terapêuticas que é possível conjugar com um anticorpo da presente memória descritiva refere-se duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas, e seus derivados. Um exemplo de um conjugado de anticorpo de caliqueamicina está comercialmente disponível (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst). Os exemplos de citotoxinas terapêuticas podem ser consultados, por exemplo, nas patentes de invenção norte-americanas nos 6548530 e 6281354 e no pedido de patente de invenção norte-americana nos: US 2003/0064984, US 2003/0073852 e US 2003/0050331.

As citotoxinas podem ser conjugadas em anticorpos da presente memória descritiva utilizando a tecnologia de ligadores disponível na especialidade. Como exemplos de tipos de ligador que podem ser utilizados para conjugar uma citotoxina num anticorpo refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfuretos e ligadores que contêm péptidos. Um ligador pode ser seleccionado que seja, por exemplo, susceptível a clivagem por pH baixo no compartimento lisossómico ou susceptível a clivagem por proteases, tais como proteases preferencialmente expressas em tecidos tumorais, tais como catepsinas (v.g., catepsinas B, C, D).

Para outras descrições de tipos de citotoxinas, ligadores e métodos para a conjugação de agentes terapêuticos em anticorpos, ver também Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Câncer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Câncer Cell 3: 207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Câncer 2: 750-763; Pastan, I. e Kreitman, R. J. (2002) 81

Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.

Os anticorpos da presente memória descritiva também podem ser conjugados num isótopo radioactivo para gerar radiofarmacêuticos citotóxicos, também designados como radioimunoconjugados. Como exemplos de isótopos radioactivos que podem ser conjugados em anticorpos para utilização como meios de diagnóstico ou como terapêuticos refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, iodo131, indío111, ítrio90 e lutétio177. Os métodos para a preparação de radioimunoconjugados são bem conhecidos na especialidade. Como exemplos de radioimunoconjugados refere-se os comercialmente disponíveis, incluindo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), sendo possível utilizar métodos semelhantes para a preparação de radioimunoconjugados utilizando os anticorpos da presente memória descritiva.

Os conjugados de anticorpos da presente memória descritiva podem ser utilizados para modificar uma determinada resposta biológica e o radical de fármaco não deverá ser entendido como limitado pelos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, o radical de fármaco pode ser uma proteína ou um polipeptido que possui uma actividade biológica desejada. Tais proteínas podem compreender, por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa, ou um seu fragmento activo, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina de difteria; um proteína tal como um factor de necrose tumoral ou interferão-γ; ou modificadores da resposta biológica, tais como, por exemplo, linfoquinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor 82 estimulador da colónia de granulócitos-macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulador da colónia de granulócitos ("G-CSF") ou outros factores de crescimento.

As técnicas para a conjugação de tais radicais terapêuticos em anticorpos são bem conhecidas, ver, v.g., Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

Moléculas bi-específicas

De acordo com outro aspecto, a presente memória descritiva diz respeito a moléculas bi-específicas que compreendem um anticorpo anti-fucosil-GMl, ou um seu fragmento, da presente memória descritiva. Um anticorpo da presente memória descritiva, ou suas porções de ligação ao antigénio, podem ser transformadas ou ligadas a outra molécula funcional, v.g., um outro péptido ou proteína (v.g., outro anticorpo ou ligando para um receptor) para 83 gerar uma molécula bi-específica que se ligue pelo menos a dois locais de ligação diferentes ou moléculas alvo. 0 anticorpo da presente memória descritiva pode, de facto, ser transformado ou ligado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculas bi-específicas que se ligam a dois locais de ligação diferentes e/ou moléculas alvo; tais moléculas bi-específicas também deverão ser abrangidas pelo termo "molécula bi-específica", conforme aqui utilizado. Para criar uma molécula bi-específica da presente memória descritiva, um anticorpo da presente memória descritiva pode ser funcionalmente ligado (v.g., por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de um outro modo) a uma ou várias moléculas de ligação, tais como um outro anticorpo, um fragmento de anticorpo, um péptido ou mimético de ligação, de um modo tal que a molécula bi-específica resulte.

Assim sendo, a presente memória descritiva inclui moléculas bi-específicas que compreendem pelo menos uma primeira especificidade de ligação para fucosil-GMl e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. De acordo com uma variante particular da presente memória descritiva, o segundo epítopo alvo é um receptor Fc, v.g., um receptor FcyRI humano (CD64) ou um receptor Fca humano (CD89). Assim, a presente memória descritiva inclui moléculas bi-específicas que são capazes de se ligar a ambas as células efectoras que expressam FcyR ou FcaR (v.g., monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMN)), e a células alvo que expressem fucosil-GMl. Estas moléculas bi-específicas dirigem células que expressam fucosil-GMl para células efectoras e desencadeiam actividades das células efectoras mediadas pelo receptor de 84

Fc, tais como fagocitose de células que expressam fucosil-GM1, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), libertação de citoquina ou criação de um anião superóxido.

De acordo com uma variante da presente memória descritiva em que a molécula bi-especifica é multi-específica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, para além de uma especificidade de ligação a anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-fucosil-GMl. De acordo com uma variante, a terceira especificidade de ligação é uma porção do factor anti-aumento (EF), v.g., uma molécula que se liga a uma proteína de superfície que está implicada na actividade citotóxica, aumentando assim a resposta imune contra a célula alvo. A "porção do factor anti-aumento" pode ser um anticorpo, um fragmento funcional de anticorpo ou um ligando que se liga a uma determinada molécula, v.g., um antigénio ou um receptor, resultando assim num aumento do efeito dos determinantes de ligação para o receptor de Fc ou o antigénio da célula alvo. A "porção do factor anti-aumento" pode ligar-se a um receptor de Fc ou a um antigénio da célula alvo. Em alternativa, a porção do factor anti-aumento pode ligar-se a uma entidade que é diferente da entidade à qual se ligam a primeira e segunda especificidades de ligação. Por exemplo, a porção do factor anti-aumento pode ligar-se a uma célula T citotóxica (v.g., por via de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imune que proporcione uma resposta imune aumentada contra a célula alvo).

De acordo com outra variante, as moléculas bi-específicas da presente memória descritiva compreendem uma 85 especificidade de ligação pelo menos a um anticorpo, ou um seu fragmento de anticorpo, incluindo, v.g., um Fab, Fab', F(ab')2r Fv ou Fv de cadeia individual. 0 anticorpo também pode ser um dimero de cadeia leve ou de cadeia pesada ou um qualquer seu fragmento mínimo, tal como um Fv ou uma construção de cadeia individual, conforme descrito por Ladner et al. na patente de invenção norte-americana n° 4 946 778, cujo conteúdo se considera expressamente incorporado por referência.

De acordo com uma variante, a especificidade de ligação para um receptor de Fcy é proporcionada por um anticorpo monoclonal, em que a sua ligação não é bloqueada pOela imunoglobulina G humana (IgG). Tal como aqui utilizado, o termo "receptor de IgG" designa qualquer um dos oitos genes de cadeia γ localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas transmembranares ou isoformas solúveis do receptor que são agrupadas em três classes de receptores de Fcy: FcyRI (CD64), Fcy RII (CD32) e FcyRIII (CD16). De acordo com uma variante preferida, o receptor de Fcy é um FcyRI humano de elevada afinidade. 0 FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa, que apresenta uma afinidade elevada para IgG monomérica ( 108 - 109 M 1) . A produção e caracterização de determinados anticorpos monoclonais anti-FcY preferidos encontram-se descritas por Fanger et al. na publicação de patente de invenção PCT n° WO 88/00052 e na patente de invenção norte-americana n° 4 954 617, cujos ensinamentos são aqui totalmente incorporados por referência. Estes anticorpos ligam-se a um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII num local distinto do local de ligação a Fcy do receptor, pelo que a sua ligação 86 não é bloqueada substancialmente por níveis fisiológicos de IgG. Como anticorpos anti-FcYRI específicos úteis na presente memória descritiva refere-se mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. 0 hibridoma que produz o mAb 32 é disponibilizado pela empresa American Type Culture

Collection, n° de adesão ATCC HB9469. De acordo com outras variantes, o anticorpo do receptor anti-FcY consiste numa forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 encontram-se descritas por Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 e pela publicação de patente de invenção PCT n° WO 94/10332. A linhagem celular que produz o anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection sob a designação HA022CL1 e possui o n° de adesão CRL 11177.

Ainda de acordo com outras variantes preferidas, a especificidade de ligação para um receptor de Fc é proporcionada por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humana, v.g., um receptor de Fc-alfa receptor (Fca RI (CD 89)), cuja ligação é preferencialmente não bloqueada pela imunoglobulina A humana (IgA). O termo "receptor de IgA" pretende abranger o produto génico de um α-gene (Fca RI) localizado no cromossoma 19. Sabe-se que este gene codifica diversas isoformas transmembranares alternativamente cortadas de 55 a 110 kDa. O FcaRI (CD89) é constitutivamente expresso em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinófílicos e neutrofílicos, mas não em populações de células não efectoras. O FcaRI possui uma afinidade no meio (~ 5 χ 107 M_1) para IgAl e IgA2, que é aumentada quando exposto a citoquinas, tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Criticai Reviews in 87

Immunology 16: 423-440). Quatro anticorpos monoclonais específicos para FcaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que ligam FcaRI no exterior do domínio de ligação do ligando IgA, foram descritos (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764) .

Os FcaRI e FcyRI são receptores de desencadeamento preferidos para utilização nas moléculas bi-específicas da presente memória descritiva visto que (1) são expressos principalmente por células efectoras imunes, v.g., monócitos, PMN, macrófagos e células dendríticas; (2) são expressos em níveis elevados (v.g., 5000-100000 por célula); (3) são mediadores das actividades citotóxicas (v.g., ADCC, fagocitose); (4) medeiam a apresentação de antigénio aumentada de antigénios, incluindo auto-antigénios dirigidos a estes.

Embora os anticorpos monoclonais humanos sejam preferidos, como outros anticorpos que podem ser utilizados nas moléculas bi-específicas da presente memória descritiva refere-se anticorpos de murino, anticorpos quiméricos e anticorpos monoclonais humanizados.

As moléculas bi-específicas da presente memória descritiva podem ser preparadas por conjugação das especificidades de ligação constituintes, v.g., especificidades de ligação a anti-FcR e a anti-fucosil-GMl, utilizando métodos conhecidos na especialidade. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula bi-específica pode ser gerada em separado e depois conjugada com as outras. No caso das especificidades de ligação serem proteínas ou péptidos, então é possível utilizar diversos agentes de acoplamento ou de reticulação para a conjugação covalente. Como exemplos de agentes de reticulação refere- 88 se proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) e ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfo-succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (sulfo-SMCC) (ver, v.g., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8648). Como outros métodos refere-se os descritos por Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229: 81-83), e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Como agentes de conjugação preferidos refere-se SATA e sulfo-SMCC, ambos comercializados pela empresa Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) .

No caso das especificidades de ligação serem anticorpos, então podem ser conjugados por meio de ligação sulfidrilo das regiões de charneira do terminal C das duas cadeias pesadas. De acordo com uma variante particularmente preferida, a região de charneira é modificada de modo a conter um número ímpar de resíduos sulfidrilo, preferencialmente um, antes da conjugação.

Em alternativa, as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vector e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula bi-específica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligando x Fab. Uma molécula bi-específica da presente memória descritiva pode ser uma molécula de cadeia individual que compreende um anticorpo de cadeia individual e um determinante de ligação ou uma molécula bi-específica de cadeia individual que compreende dois determinantes de ligação. As moléculas bi- 89 específicas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeias individuais. Os métodos para a preparação de moléculas bi-específicas encontram-se descritos, por exemplo, na patente de invenção norte-americana n° 5 260 203; na patente de invenção norte-americana n° 5 455 030; na patente de invenção norte-americana n° 4 881 175; na patente de invenção norte-americana n° 5 132 405; na patente de invenção norte-americana n° 5 091 513; na patente de invenção norte-americana n° 5 476 786; na patente de invenção norte-americana n° 5 013 653; na patente de invenção norte-americana n° 5 258 498 e na patente de invenção norte-americana n° 5 482 858. A ligação das moléculas bi-especificas aos seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (v.g., inibição de crescimento) ou ensaio por Western Blot. De um modo geral, cada um destes ensaios detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo com uma relevância particular, utilizando um reagente marcado (v.g., um anticorpo) específico para o complexo relevante. Por exemplo, os complexos de FcR-anticorpo podem ser detectados, v.g., utilizando um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado a enzima que reconheça e se ligue especificamente aos complexos de anticorpo-FcR. Em alternativa, os complexos podem ser detectados utilizando qualquer um dos diversos outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioactivamente e utilizado num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Março, 1986, o 90 qual é aqui incorporado por referência) . O isótopo radioactivo pode ser detectado utilizando meios, tais como um contador γ ou um contador de cintilações ou por autoradioqrafia.

Composições farmacêuticas

De acordo com outro aspecto, a presente memória descritiva proporciona uma composição, v.g., uma composição farmacêutica, que contém um anticorpo monoclonal ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou suas porções de ligação ao antigénio, da presente memória descritiva, formulada em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de anticorpos (v.g., dois ou mais anticorpos diferentes), ou imunoconjugados ou moléculas bi-específicas da presente memória descritiva. Por exemplo, uma composição farmacêutica da presente memória descritiva pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou moléculas bi-específicas) que se ligam a epítopos diferentes no antigénio alvo ou que possuem actividades complementares.

As composições farmacêuticas da presente memória descritiva também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode compreender um anticorpo anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva combinado pelo menos com um outro agente anti-inflamatório ou imunossupressor. Como exemplos de agentes terapêuticos que é possível utilizar em terapia de combinação refere-se os a seguir descritos mais minuciosamente na secção sobre 91 as utilizações dos anticorpos da presente memória descritiva.

Tal como aqui utilizada, a expressão "veiculo farmaceuticamente aceitável" compreende todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti-bacterianos e anti-fúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção e semelhantes, que sejam fisiologicamente compatíveis. De preferência, o veículo é adequado para administração por via intravenosa, intramuscular, subcutâneas, parentérica, espinal ou epidérmica (v.g.f por injecção ou infusão). Em função da via de administração, o composto activo, isto é, o anticorpo, imunoconjugado ou molécula bi-específica, pode ser revestido com um material para proteger o composto da acção de ácidos e de outras condições naturais que possam inactivar o composto.

Os compostos farmacêuticos da presente memória descritiva podem compreender um ou vários sais farmaceuticamente aceitáveis. A expressão "sal farmaceuticamente aceitável" designa um sal que mantém a actividade biológica desejada do composto original e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver, v.g., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66: 1-19). Como exemplos de tais sais refere-se sais de adição de ácidos e sais de adição de bases. Como sais de adição de ácido refere-se aqueles obtidos a partir de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como os ácidos clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e semelhantes, bem como a partir de ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos mono- e di-carboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos substituídos com 92 fenilo, ácidos hidroxi-alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Como sais de adição de base refere-se aqueles obtidos a partir de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenzil-etilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.

Uma composição farmacêutica da presente memória descritiva pode ainda incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Como exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis refere-se: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina-tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.

Como exemplos de veículos aquosos e não aquosos que é possível utilizar nas composições farmacêuticas da presente memória descritiva refere-se água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno-glicol, polietileno-glicol e semelhantes), e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo. É possível manter uma fluidez adequada, por exemplo, por meio da utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, mantendo o tamanho de 93 partícula necessário no caso de dispersões, e por meio da utilização de agentes tensioactivos.

Estas composições também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser garantida por procedimentos de esterilização, supra, e por meio da inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol-sorbico e semelhantes. Também poderá ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e semelhantes, na composição. Além disso, é possível obter uma absorção prolongada da forma farmacêutica injectável por meio da inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

Como veículos farmaceuticamente aceitáveis refere-se soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é conhecida na especialidade. Com a excepção de qualquer meio ou agente convencional ser incompatível com o composto activo, a sua utilização nas composições farmacêuticas da presente memória descritiva é contemplada. Nas composições, também é possível incorporar outros compostos activos suplementares.

Tipicamente, as composições terapêuticas deverão ser estéreis e estáveis sob as condições de preparação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para uma concentração elevada de fármaco. 0 veículo poderá ser um solvente ou um meio de dispersão 94 que contenha, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno-glicol e polietileno-glicol líquido, e semelhantes), e suas misturas adequadas. É possível manter uma fluidez adequada, por exemplo, por meio da utilização de um revestimento, tal como lecitina, mantendo o tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e por meio da utilização de agentes tensioactivos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio, na composição. É possível obter uma absorção prolongada das composições injectáveis por meio da inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

As soluções estéreis injectáveis podem ser preparadas pela incorporação do composto activo na quantidade necessária num solvente adequado com um ou com uma combinação dos ingredientes enumerados antes, consoante necessário, seguindo-se a esterilização por microfiltração. De um modo geral, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto activo num veículo estéril que contém o meio básico de dispersão e os outros ingredientes necessários dos enumerados antes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis injectáveis, os métodos preferidos de preparação são a secagem sob vácuo e a secagem por congelamento (liofilização) que proporcionem um pó do ingrediente activo em conjunto com qualquer ingrediente desejado suplementar, a partir de uma sua solução estéril previamente filtrada. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um veículo para produzir uma forma de dosagem 95 individual irá variar em função do sujeito que se pretende tratar e da via particular de administração. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um veiculo para produzir uma forma de dosagem individual irá normalmente ser aquela quantidade da composição que produza um efeito terapêutico. De um modo geral, em termos de cem por cento, esta quantidade irá estar compreendida entre cerca de 0,01 por cento e cerca de noventa e nove por cento de ingrediente activo, de preferência entre cerca de 0,1 por cento e cerca de 70 por cento e mais preferencialmente entre cerca de 1 por cento e cerca de 30 por cento de ingrediente activo em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Os regimes de dosagem são ajustados de modo a proporcionar a resposta óptima pretendida (v.g., uma resposta terapêutica). Por exemplo, é possível administrar um bolo individual, é possível administrar diversas doses divididas ao longo do tempo ou então a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada consoante indicados pelas exigências da situação terapêutica. É particularmente vantajoso formular composições parentéricas sob uma forma de dosagem unitária para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. Uma forma de dosagem unitária, tal como aqui utilizada, designa unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos que se pretende tratar; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto activo calculada de modo a proporcionar o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo farmaceuticamente necessário. A especificação das formas de dosagem unitárias da presente memória são ditadas e são directamente dependentes (a) das 96 características individuais do compostos activo e do efeito terapêutico particular que se pretende alcançar e (b) das limitações inerentes na especialidade de preparação de compostos de um tal composto activo para o tratamento de sensibilidade nos indivíduos.

Para a administração do anticorpo, a dosagem está compreendida entre cerca de 0,0001 e 100 mg/kg e mais habitualmente entre 0,01 e 5 mg/kg do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou no intervalo compreendido entre 1 e 10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplificativo compreende uma administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Como regimes de dosagem preferidos para um anticorpo anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva refere-se 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal por administração por via intravenosa, em que o anticorpo é administrado utilizando um dos seguintes calendários de dosagem: (i) uma vez a cada quatro semanas durante seis dosagens e depois uma vez a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez e depois 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.

De acordo com alguns métodos, são administrados em simultâneo dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes, caso esse em que a dosagem de cada anticorpo administrado está compreendida nos intervalos indicados. O anticorpo é normalmente 97 administrado em ocasiões múltiplas. Os intervalos entre dosagens individuais podem ser, por exemplo, semanais, mensais, a cada três meses ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares, conforme indicado por medições dos níveis no sangue do anticorpo para o antigénio alvo no paciente. De acordo com alguns métodos, a dosagem é ajustada de modo a alcançar uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1 a 1000 pg/mL e, em alguns métodos, de cerca de 25 a 300 pg/mL.

Em alternativa, o anticorpo pode ser administrado sob a forma de uma formulação de libertação prolongada, caso esse em que é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e a frequência variam em função do período de semi-vida do anticorpo no paciente. De um modo geral, os anticorpos humanos apresentam o período de semi-vida mais longo, seguidos pelos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência de administração podem variar em função do tratamento ser profiláctico ou terapêutico. Em aplicações profilácticas, é administrada uma dose relativamente reduzida em intervalos relativamente infrequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento até ao fim das suas vidas. Em aplicações terapêuticas, é por vezes necessária a administração de uma dosagem relativamente elevada em intervalos relativamente curtos até a progressão da doença ser reduzida ou terminada e, preferencialmente, até o paciente apresentar uma melhoria parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, pode ser administrado ao paciente um regime profiláctico. 98

Os níveis actuais de dosagem dos ingredientes activos nas composições farmacêuticas da presente memória descritiva podem ser variados de modo a obter uma quantidade de ingrediente activo que seja eficaz para se alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e via de administração particulares, sem que estes sejam tóxicos para o paciente. 0 nível de dosagem seleccionado irá depender de diversos factores farmacocinéticos, incluindo a actividade das composições particulares da presente memória descritiva utilizadas, ou do seu éster, sal ou amida, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular utilizado, da duração do tratamento, de outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados na combinação com as composições particulares utilizadas, da idade, do sexo, do peso, da condição, do estado geral de saúde e do antecedentes médicos anteriores do paciente que se pretende tratar e de factores semelhantes bem conhecidos na especialidade médica.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de uma anticorpo anti-fucosil-GMl da presente memória descritiva resulta preferencialmente numa diminuição na gravidade dos sintomas da doença, num aumento na frequência e na duração de períodos livres de sintomas da doença ou na prevenção de deficiências ou incapacidade devido a complicações provocadas pela doença. Por exemplo, para o tratamento de tumores, uma "dosagem terapeuticamente eficaz" inibe preferencialmente o crescimento celular ou o crescimento tumoral pelo menos em cerca de 20%, mais preferencialmente pelo menos em cerca de 40%, ainda mais preferencialmente pelo menos em cerca de 60% e muito mais preferencialmente 99 pelo menos em cerca de 80% em relação a sujeitos não tratados. A aptidão de um composto para inibir o crescimento tumoral pode ser avaliada num sistema de modelo animal que preveja a eficácia em tumores humanos. Em alternativa, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada por meio do exame da aptidão do composto em inibir, tal como inibição in vitro, por meio de ensaios conhecidos pelos especialistas na matéria. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou então melhorar os sintomas num sujeito. Será fácil para um especialista na matéria determinar tais quantidades com base em factores, tais como o tamanho do paciente, a gravidade dos sintomas do sujeito e da composição ou via de administração particulares seleccionadas.

Uma composição da presente memória descritiva pode ser administrada por meio de uma ou várias vias de administração, utilizando um ou mais dos diversos métodos conhecidos na especialidade. Como será apreciado por um especialista na matéria, a via e/ou o modo de administração irá variar em função dos resultados pretendidos. Como vias de administração preferidas para os anticorpos da presente memória descritiva refere-se as vias de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinal ou outra parentérica, por exemplo, por injecção ou infusão. A expressão "administração parentérica", tal como aqui utilizada, designa modos de administração para além da administração entérica ou tópica, usualmente por injecção, e compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, injecção ou infusão por via intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, 100 intra-capsular, intra-orbital, intra-cardíaca, intradérmica, intra-peritoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinal, epidural e intra-external.

Em alternativa, um anticorpo da presente memória descritiva pode ser administrado por uma via não parentérica, tal como uma administração por via tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual ou tópica.

Os compostos activos podem ser preparados com veículos que irão proteger o composto contra uma libertação rápida, tais como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de administração microencapsulados. É possível utilizar polímeros biocompatíveis e biodegradáveis, tais como acetato de etileno-vinilo, poli-anidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações estão patenteados ou são normalmente conhecidos pelos especialistas na matéria. Ver, v.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.

As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na especialidade, por exemplo, de acordo com uma variante preferida, uma composição terapêutica da presente memória descritiva pode ser administrada com um dispositivo de injecção hipodérmico sem agulha, tal como os dispositivos descritos nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 399 163; 5 383 851; 5 312 335; 5 064 413; 4 941 880; 4 790 824 ou 4 596 556. Como exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na 101 presente memória descritiva refere-se: a patente de invenção norte-americana n° 4 487 603, que diz respeito a uma bomba de micro-infusão implantável para a libertação de medição numa taxa controlada; a patente de invenção norte-americana n° 4 486 194, que diz respeito a um dispositivo terapêutico para a administração de medicamentos através da pele; a patente de invenção norte-americana n° 4 447 233, que diz respeito a uma bomba de infusão de medicamentos para a administração de medicação numa taxa de infusão precisa; a patente de invenção norte-americana n° 4 447 224, que diz respeito a um dispositivo de infusão implantável com fluxo variável para uma administração continua de fármaco; a patente de invenção norte-americana n° 4,439,196, que diz respeito um sistema de administração osmótico de fármaco que possui compartimentos multi-camaras e a patente de invenção norte-americana n° 4 475 196, que diz respeito a um sistema de administração osmótico de fármaco. São conhecidos pelos especialistas na matéria muitos outros implantes, sistemas de administração e módulos.

De acordo com determinadas variantes, os anticorpos monoclonais humanos da presente memória descritiva podem ser formulados de modo a garantir uma distribuição correcta in vivo. Por exemplo, a barreira hemato-encefálica (BBB) exclui muitos compostos bastante hidrofilicos. Para garantir que os compostos terapêuticos da presente memória descritiva atravessam a BBB (se desejado), estes podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de produção de lipossomas, veja-se, v.g., as patentes de invenção norte-americanas nos 4 522 811; 5 374 548 e 5 399 331. Os lipossomas podem compreender um ou vários radicais 102 que são selectivamente transportados para células ou órgãos específicos, aumentando assim a administração dirigida de fármaco ('ver, v.g., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Como exemplos de radicais dirigidos refere-se folato ou biotina (ver, v.g., a patente de invenção norte-americana n° 5 416 016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor tensioactivo de proteína A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et ai. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

Utilizações e métodos da presente memória descritiva

Os anticorpos, as composições de anticorpo e os métodos da presente memória descritiva possuem diversas utilizadas de diagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo, as quais envolvem o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados por fucosil-GMl. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a sujeitos humanos, v.g., in vivo, para tratar, prevenir e diagnosticar diversos distúrbios. Tal como aqui utilizado, o termo "sujeito" pretende incluir seres humanos e animais não humanos. Como animais não humanos refere-se todos os vertebrados, v.g., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e répteis. Como sujeitos preferidos refere-se os pacientes humanos que padecem de distúrbios mediados pela actividade 103 de fucosil-GMl ou que padecem de distúrbios coincidentes com uma actividade mediada por fucosil-GMl. Os métodos são particularmente adequados para o tratamento de pacientes humanos que padecem de um distúrbio associado à expressão aberrante de fucosil-GMl ou à presença aumentada de fucosil-GMl. No caso de anticorpos para fucosil-GMl serem administrados em conjunto com um outro agente, então os dois podem ser administrados por uma ordem qualquer ou em simultâneo.

Devido à ligação específica dos anticorpos da presente memória descritiva para fucosil-GMl, os anticorpos da presente memória descritiva podem ser utilizados para detectar especificamente a expressão de fucosil-GMl na superfície de células e, além disso, podem ser utilizados para purificar fucosil-GMl via purificação por imunoafinidade. A presente memória descritiva proporciona ainda métodos para a detecção da presença do antigénio de fucosil-GMl numa amostra ou para a medição da quantidade de antigénio de fucosil-GMl, a qual compreende o contacto da amostra e de uma amostra de controlo com um anticorpo monoclonal humano, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que se ligue especificamente a fucosil-GMl, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo, ou uma sua porção, e fucosil-GMl. A formação do complexo é então detectada, em que uma diferença entre a formação de complexo na amostra em comparação com a amostra de controlo constitui uma indicação da presença de antigénio de fucosil-GMl na amostra. O fucosil-GMl é expresso no cancro do pulmão de pequenas células, mas não é detectado em tecidos de pulmão 104 normais ou em outros tecidos (Nilsson et al. (1984) Glycoconjugate J 1: 43-9; Krug et al. (2004) Clin Câncer Res 10: 6094-100). Um anticorpo anti-fucosil-GMl pode ser utilizado por si só para inibir o crescimento de tumores cancerígenos. Em alternativa, um anticorpo anti-fucosil-GMl pode ser utilizado em conjunto com outros agentes imunogénicos, outros tratamentos convencionais contra o cancro ou outros anticorpos, conforme a seguir descrito.

Os anticorpos monoclonais anti-fucosil-GMl demonstraram mediar CDC potentes dirigidos contra linhagens celulares positivas em fucosil-GMl (Livingston PO et al. (1994) J Clin Oncol. 12: 1036-44; Brezicka et al. (2000) Câncer Immunol Immunother 49: 235-42). Além disso, foi já descrito que a activação do complemento, induzida pelos anticorpos monoclonais específicos para fucosil-GMl, em combinação com fármacos citostáticos proporcionam efeitos citotóxicos sinérgicos sobre linhagens celulares que expressam fucosil-GMl (Brezicka e Einbeigi (2001) Tumour Biol 22: 97-103) . Por último, foi também já descrito que os anticorpos monoclonais anti-fucosil-GMl inibem o enxerto de células tumorais que expressam fucosil-GMl em murganhos "nus" (Brezicka et al. (1991) Int J Câncer 49: 911-8). Estes dados suportam o desenvolvimento de um anticorpo monoclonal totalmente humano para fucosil-GMl como imunoterapêutico para o tratamento de CPPC por si só ou em combinação com outros agentes quimioterapêuticos.

Como cancros preferidos cujo crescimento pode ser inibido por meio da utilização dos anticorpos da presente memória descritiva refere-se os cancros normalmente responsivos a imunoterapia. Como exemplos não limitativos de cancros preferidos para tratamento refere-se o cancro do 105 pulmão (incluindo cancro do pulmão de pequenas células e cancro do pulmão de não pequenas células). Como exemplos de outros cancros que é possível tratar utilizando os métodos da presente memória descritiva refere-se o cancro do cólon (incluindo cancro do intestino delgado), o cancro do pulmão, o cancro da mama, o cancro do pâncreas, melanoma (v.g.; melanoma maligno metastático) , leucemia mieloide aguda, cancro do rim, cancro da bexiga, cancro do ovário e cancro da próstata, cancro renal (v.g., carcinoma de células renais), glioblastoma, tumores cerebrais, leucemias crónicas ou agudas, incluindo leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia de células T em adultos (T-ALL), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfornas (v.g., linforna de Hodgkin e não Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma do SNC primário, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfomas de células grandes anaplásicos (ALCL), linfomas de células T cutâneos, linfomas de células pequenas nodulares clivadas, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, leucemia/linfornas de células T (ATLL), cancros de linfomas foliculares entroblásticos/ /centrocíticos (cb/cc), linfomas difusos de células grandes de linhagem B, linfoma de células T de tipo linfadenopatia angioimmunoblástica (AILD) e linfomas com base nas cavidades corporais associados a VIH), carcinomas embrionais, carcinomas não diferenciados da rino-faringe (v.g., tumor de Schmincke), doença de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de células B, carcinomas nasofaríngicos, cancro ósseo, cancro da pele, cancro da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, cancro do útero, 106 cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro do testículo, cancro uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro da glândula tiroide, cancro da glândula paratiroide, cancro da glândula adrenal, sarcoma dos tecidos moles, cancro da uretra, cancro do pénis, tumores sólidos na infância, cancro da bexiga, cancro do rim ou uréter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), angiogénese tumoral, tumor do eixo espinal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, cancro epidermoide, cancro das células escamosas, cancros induzidos pelo meio ambiente, incluindo os induzidos por asbestos, v.g., mesotelioma, e combinações dos referidos cancros.

Além disso, devido à expressão de fucosil-GMl em diversas células tumorais, os anticorpos humanos, as composições de anticorpos e os métodos da presente memória descritiva podem ser utilizados para tratar um sujeito com um distúrbio tumorigénico, v.g., um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorais que expressam fucosil-GMl, incluído, por exemplo, o cancro do pulmão (incluindo cancro do pulmão de pequenas células e cancro do pulmão de não pequenas células), o cancro do cólon (incluindo cancro do intestino delgado), melanoma {v.g.; melanoma maligno metastático), leucemia mieloide aguda, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro da bexiga, cancro do pâncreas, cancro do ovário e cancro da próstata. Como exemplos de outros sujeitos com um distúrbio tumorigénico refere-se sujeitos que padecem de cancro renal {v.g., carcinoma de 107 células renais), glioblastoma, tumores cerebrais, leucemias crónicas ou agudas, incluindo leucemia linfocitica aguda (ALL), leucemia de células T em adultos (T-ALL), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocitica crónica, linfornas (v.g., linforna de Hodgkin e não Hodgkin, linfoma linfocitico, linfoma do SNC primário, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfomas de células grandes anaplásicos (ALCL), linfomas de células T cutâneos, linfomas de células pequenas nodulares clivadas, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, leucemia/linfornas de células T (ATLL), cancros de linfomas foliculares entroblásticos/ /centrocíticos (cb/cc), linfomas difusos de células grandes de linhagem B, linfoma de células T de tipo linfadenopatia angioimmunoblástica (AILD) e linfomas com base nas cavidades corporais associados a VIH), carcinomas embrionais, carcinomas não diferenciados da rino-faringe (v.g., tumor de Schmincke), doença de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de células B, carcinomas nasofaringicos, cancro ósseo, cancro da pele, cancro da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, cancro do útero, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro do testículo, cancro uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro da glândula tiroide, cancro da glândula paratiroide, cancro da glândula adrenal, sarcoma dos tecidos moles, cancro da uretra, cancro do pénis, tumores sólidos na infância, cancro da bexiga, cancro do rim ou 108 uréter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), angiogénese tumoral, tumor do eixo espinal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, cancro epidermoide, cancro das células escamosas, cancros induzidos pelo meio ambiente, incluindo os induzidos por asbestos, v.g., mesotelioma, e combinações dos referidos cancros.

Assim sendo, de acordo com uma variante, a presente memória descritiva proporciona um anticorpo anti-fucosil-GM1 humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti-fucosil-GMl humanos aqui descritos), ou uma sua porção de ligação ao antigénio, para utilização num método de inibição do crescimento de células tumorais num sujeito.

De acordo com uma variante, os anticorpos (v.g., anticorpos monoclonais humanos, moléculas bi-especificas ou multi-especificas e composições) da presente memória descritiva podem ser utilizados para detectar níveis de fucosil-GMl ou níveis de células que contenham fucosil-GMl na sua superfície membranar, níveis esses que podem então ser associados a determinados sintomas de doenças. Em alternativa, os anticorpos podem ser utilizados para inibir ou para bloquear a função de fucosil-GMl, as quais, por sua vez, podem ser associadas à prevenção ou à melhoria de determinados sintomas de doenças, envolvendo assim o fucosil-GMl como mediador da doença. Tal pode ser efectuado fazendo contactar uma amostra experimental e uma amostra de controlo com o anticorpo anti-fucosil-GMl, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e fucosil-GMl. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e fucosil-GMl são detectados e comparados na amostra experimental e na amostra de controlo. 109

De acordo com outra variante, os anticorpos (v.g., anticorpos humanos, moléculas bi-especificas ou multi-especificas e composições) da presente memória descritiva podem ser inicialmente testadas quanto à actividade de ligação associada a uma utilização para fins terapêuticos ou de diagnóstico in vitro. Por exemplo, as composições da presente memória descritiva podem ser testadas utilizando os ensaios de citometria de fluxo descritos nos exemplos infra.

Os anticorpos (v.g., anticorpos humanos, moléculas bi-específicas ou multi-especificas, imunoconjugados e composições) da presente memória descritiva possuem uma utilidade suplementar na terapia e no diagnóstico de doenças associadas a fucosil-GMl. Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos, as moléculas bi-especificas ou multi-especificas e os imunoconjugados podem ser utilizados para promover, in vivo ou in vitro, uma ou várias das actividades biológicas seguintes: inibir o crescimento e/ou matar uma célula que expresse fucosil-GMl; mediar a fagocitose ou a ADCC de uma célula que expresse fucosil-GMl na presença de células efectoras humanas ou bloquear a ligação do ligando de fucosil-GMl a fucosil-GMl.

De acordo com uma variante particular, os anticorpos (v.g., anticorpos humanos, moléculas bi-especificas ou multi-especificas e composições) são utilizados in vivo para tratar, prevenir ou diagnosticar diversas doenças associadas a fucosil-GMl. Como exemplos de doenças associadas a fucosil-GMl refere-se, entre outras, cancro do pulmão (incluindo cancro do pulmão de pequenas células e cancro do pulmão de não pequenas células). 110

As vias adequadas para administração, in vivo e in vitro, das composições de anticorpo (v.g., anticorpos monoclonais humanos, moléculas bi-especificas ou multi-específicas e imunoconjugados) da presente memória descritiva são bem conhecidas na especialidade e podem ser seleccionados pelos especialistas na matéria. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas por injecção {v.g., por via intravenosa ou subcutânea). As dosagens adequadas das moléculas utilizadas irão depender da idade e do peso do sujeito e da concentração e/ou formulação da composições de anticorpo.

Conforme descrito antes, os anticorpos anti-fucosil-GM1 humanos da presente memória descritiva podem ser co-administrados com um ou vários outros agentes terapêuticos, v.g., um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor. O anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado em separado do agente. Neste último caso (administração em separado), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou em simultâneo com o agente ou então pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, v.g., uma terapia anti-cancro, v.g., radiação. Como tais agentes terapêuticos refere-se, entre outros, agentes anti-neoplásicos, tais como doxorrubicina (adriamicina), bleomicina-sulfato de cisplatina, carmustina, clorambucilo e ciclofosfamida de hidroiureia, os quais, por si sós, são apenas eficazes em níveis tóxicos ou subtóxicos para o paciente. A cisplatina é administrada por via intravenosa como 100 mg/dose uma vez a cada quatro semanas e a adriamicina é administrada por via intravenosa como uma dose de 60-75 mg/mL uma vez a cada 21 dias. A co- 111 administração dos anticorpos anti-fucosil-GMl humanos, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, da presente memória descritiva com os agentes terapêuticos proporciona dois agentes anti-cancro que actuam por meio de mecanismos diferentes, proporcionando um efeito citotóxico para células tumorais humanas. Uma tal co-administração pode solucionar problemas associados ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou uma alteração na antigenicidade das células tumorais, que as tornaria não reactivas com o anticorpo.

De acordo com uma variante, os imunoconjugados da presente invenção podem ser utilizados para dirigir compostos (v.g., agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.) a células que possuem receptores de superfície de fucosil-GM1, por meio da ligação desses compostos ao anticorpo. Por exemplo, um anticorpo anti-fucosil-GMl pode ser conjugado para qualquer um dos compostos de toxina descritos nas patentes de invenção norte-americanas nos 6 281 354 e 6 548 530, nas publicações de patentes de invenção norte-americanas nos 20030050331, 20030064984, 20030073852 e 20040087497 ou publicados no documento WO 03/022806. Assim, a presente memória descritiva também proporciona métodos para a localização ex vivo ou in vivo de células que expressem fucosil-GMl (v.g., com um marcador detectável, tal como um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-factor de enzima). Em alternativa, os imunoconjugados podem ser utilizados para matar células que possuem receptores de superfície celular de fucosil-GMl dirigindo as citotoxinas ou radiotoxinas contra fucosil- GMl . 112

As células efectoras específicas para alvos, v.g., células efectoras ligadas a composições (v.g., anticorpos humanos, moléculas bi-específicas e multi-específicas) da presente memória descritiva também podem ser utilizadas como agentes terapêuticos. As células efectoras para alvejamento podem ser leucócitos humanos, tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Como outras células refere-se eosinófilos, células assassinas naturais e outras células que suportem outros receptores de IgG ou de IgA. Se desejado, as células efectoras podem ser obtidas a partir do sujeito submetido a tratamento. As células efectoras específicas para alvos podem ser administradas sob a forma de uma suspensão de células numa solução fisiologicamente aceitável. 0 número de células administradas pode ser da ordem de 108-109, mas irá normalmente variar em função do propósito terapêutico. De um modo geral, a quantidade deverá ser suficiente para se obter uma localização na célula alvo, v.g., uma célula tumoral que expresse fucosil-GM1 e para matar a célula, v.g., por fagocitose. As vias de administração também podem variar. A terapia com células efectoras específicas para alvos podem ser efectuada em conjunto com outras técnicas para a remoção de células alvo. Por exemplo, a terapia anti-tumor utilizando as composições (v.g., anticorpos monoclonais, moléculas bi-específicas ou multi-específicas) da presente memória descritiva e/ou células efectoras armadas com estas composições podem ser utilizadas em combinação com quimioterapia. Além disso, é possível utilizar imunoterapia de combinação para dirigir duas populações efectoras citotóxicas distintas contra rejeição de células tumorais. Por exemplo, é possível utilizar 113 anticorpos anti-fucosil-GMl ligados a anti-Fc-gama RI ou anti-CD3 em conjunto com outros agentes de ligação específicos para o receptor de IgG ou IgA.

As moléculas bi-específicas e multi-específicas da presente memória descritiva também podem ser utilizadas para modular os níveis de FcyR ou FcyR em células efectoras, tais como por selagem e eliminação dos receptores sobre a superfície celular. Também é possível utilizar mistura de receptores anti-Fc para este propósito.

As composições (v.g., anticorpos humanos, moléculas bi-específicas e multi-específicas e imunoconjugados) da presente memória descritiva que possuem locais de ligação de complementos, tais como porções provenientes de IgGl, IgG2 ou IgG3 ou IgM que ligam o complemento, também podem ser utilizadas na presença do complemento. De acordo com uma variante, o tratamento ex vivo de uma população de células que compreende células alvo com um agente de ligação da presente memória descritiva e células efectoras adequadas pode ser suplementado pela adição de complemento ou de soro que contém o complemento. A fagocitose de células alvo revestidas com um agente de ligação da presente memória descritiva pode ser melhorada por ligação de proteínas de complemento. De acordo com outra variante, células alvo revestidas com as composições (e.g., anticorpos humanos, moléculas bi-específicas e multi-específ icas) da presente memória descritiva também podem ser lisadas pelo complemento. Ainda de acordo com outra variante, as composições da presente memória descritiva não activam o complemento.

As composições (v.g., anticorpos humanos, moléculas bi-específicas e multi-específicas e imunoconjugados) da 114 presente memória descritiva também podem ser administradas em conjunto com o complemento. Assim sendo, também pertencem ao âmbito da presente memória descritiva as composições que compreendem anticorpos humanos, moléculas bi-especificas ou multi-especificas e soro ou complemento. Estas composições são vantajosas pelo facto do complemento estar localizado numa vizinhança próxima em relação aos anticorpos humanos, moléculas bi-especificas ou multi-específicas. Em alternativa, os anticorpos humanos, moléculas bi-especificas ou multi-especificas da presente memória descritiva e o complemento ou soro podem ser administrados em separado.

Assim sendo, aos pacientes tratados com composições de anticorpo da presente memória descritiva pode ainda ser administrado (antes, em simultâneo ou após a administração de um anticorpo humano da presente memória descritiva) um outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que potencie ou aumente o efeito terapêutico dos anticorpos humanos.

De acordo com outras variantes, o sujeito pode ainda ser tratado com um agente que module, v.g., aumente ou iniba, a expressão ou actividade dos receptores de Fcy ou Fcy, por exemplo, por meio do tratamento do sujeito com uma citoquina. Como citoquinas preferidas para administração durante o tratamento com a molécula multi-especifica refere-se o factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF), o factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferão-γ (IFN-y) e factor da necrose tumoral (TNF).

As composições (v.g., anticorpos humanos, moléculas bi-especificas ou multi-especificas) da presente memória 115 descritiva também podem ser utilizadas para alvejar células que expressem FcyR ou fucosil-GMl, por exemplo, para marcar tais células. Para uma tal utilização, o agente de ligação pode ser ligado a uma molécula que possa ser detectada. Assim, a presente memória descritiva proporciona métodos para localizar, ex vivo ou in vitro, células que expressem receptores de Fc, tais como FcyR ou fucosil-GMl. 0 marcador detectável pode ser, v.g., um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-factor de enzima.

Também estão abrangidos pelo âmbito da presente memória descritiva estojos que compreendem as composições de anticorpo da presente memória descritiva (v.g., anticorpos humanos, moléculas bi-especificas ou multi-específicas ou imunoconjugados) e instruções para a sua utilização. 0 estojo pode ainda conter um ou vários reagentes suplementares, tais como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico ou então um ou vários anticorpos humanos suplementares da presente memória descritiva (v.g., um anticorpo humano que possua uma actividade complementar que se ligue a um epítopo no antigénio fucosil-GMl diferente do primeiro anticorpo humano). Tipicamente, os estojos incluem uma etiqueta que indica a utilização pretendida do conteúdo do estojo. 0 termo etiqueta compreende qualquer escrito ou material registado fornecido no estojo ou com este, ou que de qualquer outro modo acompanhe o estojo. A presente memória descritiva é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes. 116

Exemplos

Exemplo 1: geração de anticorpos monoclonais humanos contra fucosil-GMl

Antigénio

Nos protocolos de imunização utilizou-se, como antigénio, fucosil-GMl adsorvido em Salmonella minnesota (Northwest Biotherapeutics, Inc.)·

Murganhos transgénicos HuMab e KM™

Preparou-se anticorpos humanos completos contra fucosil-GMl utilizando as estirpes HCo7, HCol2, HCo7 + HCol2 de murganhos transgénicos HuMab e a estirpe KM de murganhos transcromossómicos transgénicos, cada uma das quais expressa genes de anticorpo humanos. Em cada uma destas estirpes de murganho, o gene de cadeia leve kappa de murganho endógeno sofre disrupção de um modo homozigótico conforme descrito por Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 811-

820 e o gene de cadeia pesada de murganho endógeno sofre disrupção um modo homozigótico conforme descrito no exemplo 1 da publicação de patente de invenção PCT n° WO 01/09187. Cada uma destas estirpes de murganho possui um transgene de cadeia leve kappa humano, KCo5, conforme descrito por Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. A estirpe HCo7 possui o transgene de cadeia pesada humano HCo7, conforme descrito nas patentes de invenção norte- americanas nos 5 770 429; 5 545 806; 5 625 825 e 5 545 807. A estirpe HCol2 possui o transgene de cadeia pesada humano

HCol2, conforme descrito no exemplo 2 do documento WO 01/09187 ou no exemplo 2 do documento WO 01/14424. A estirpe HCo7+HCol2 possui ambos os transgenes de cadeia pesada HCo7 e HCol2. A estirpe KM contém o transcromossoma 117 SC20, conforme descrito na publicação de patente de invenção PCT n° WO 02/43478. Todas estas estirpes são aqui referidas como murganhos HuMAb.

Imunizações HuMab e KM

Para se criar anticorpos monoclonais humanos completos para fucosil-GMl, efectua-se a imunização de murganhos HuMab e de murganhos KM™ com fucosil-GMl adsorvido por liofilização sobre a superfície de Salmonella Minnesota tratada com ácido (Northwest Biotherapeutics, Inc.) . Esquemas gerais de imunização para murganhos HuMab são descritos por Lonberg, N. et al (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e na publicação da patente de invenção PCT n° WO 98/24884. Os murganhos tinham 6 a 16 semanas de idade durante a primeira infusão de antigénio.

Submete-se murganhos transgénicos a imunização por via intraperitoneal (IP) ou por via subcutânea (Sc) com antigénio em adjuvante completo de Freund, duas vezes, seguindo-se imunização durante 2 a 4 semanas por via IP (até um total de 8 imunizações) com o antigénio em adjuvante incompleto de Freund. Monitorizou-se a resposta imune por ELISA (descrito infra) do soro obtido a partir de sangramentos retro-orbitais. Utilizou-se os murganhos com títulos suficientes em imunoglobulina humana anti-fucosil-GM1 para as fusões. Administrou-se um reforço aos murganhos com antigénio 3 e 2 dias antes do sacrifício e remoção do baço. 118

Selecção de murganhos HuMab ou KM™ que produzem anticorpos anti-fucosil-GMl

Para se seleccionar murganhos HuMab ou KM™ que produzem anticorpos que se ligam a fucosil-GMl, testou-se o soro proveniente de murganhos imunizados por ELISA, conforme descrito por Fishwild, D. et al. (1996).

Resumidamente, solubilizou-se fucosil-GMl natural purificado a partir de linhas celulares transfectantes de fucosil-transferase (Northwest Biotherapeutics, Inc.) ou a partir de cérebro de bovino (Matreya, Inc) em metanol numa concentração de 1 mg/mL e deixou-se adsorver passivamente sobre placas de microtitulação de polipropileno, 50 uL/cavidade, por secagem ao ar à temperatura ambiente durante 1 a 2 horas. De igual modo, preparou-se placas revestidas com antigénios de controlo associados, tais como GM1, como contra-medidas para anticorpos inter-reactivos. Bloqueou-se então as placas de ensaio com 250 yL/cavidade de 1% de ovalbumina em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Adicionou-se diluições de plasma provenientes de murganhos imunizados com fucosil-GMl a cada cavidade e manteve-se a incubar durante 1 a 2 horas à temperatura ambiente. Lavou-se as placas com PBS e depois manteve-se a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpos policlonais de Fc de IgG anti-humana de cabra ou com anticorpos policlonais de Fc de IgM anti-humana de cabra, cada um deles conjugado com peroxidase de rábano (HRP). Após lavagem, revelou-se as placas com substrato de TMB e analisou-se com um espectrofotómetro a uma DO de 450 nm.

Os murganhos que apresentaram os títulos mais elevados de anticorpos anti-fucosil-GMl foram utilizados para 119 fusões. As fusões foram realizadas conforme a seguir descrito e os hibridomas sobrenadantes foram testados quanto à actividade anti-fucosil-GMl por ELISA.

Geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos para fucosil-GMl

Isolou-se esplenócitos a partir de murganhos HuMab® e de murganhos KM™ e fundiu-se numa linhagem celular de mieloma de murganho utilizando PEG com base em protocolos convencionais ou electrofusão com base em campos eléctricos usando o electroporador de fusão celular de câmara grande 'Cyto Pulse' (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Os hibridomas resultantes foram então pesquisados quanto a produção de anticorpos específicos para o antigénio.

Fundiu-se suspensões de células individuais de linfócitos do baço provenientes de murganhos imunizados com uma quarto do número de células de mieloma de murganho que não segregam P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) ou células de mieloma de murganho que não segregam SP2/0 (ATCC, CRL 1581) utilizando 50% de PEG.

Fundiu-se suspensões de células individuais de linfócitos do baço provenientes de murganhos imunizados com um quarto do número de células de mieloma de murganho que não secretam P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) ou células de mieloma de murganho que não secretam SP2/0 (ATCC, CRL 1581), utilizando 50% de PEG (Sigma). Colocou-se as células em placas com uma densidade de cerca de 1 x 105/cavidade em placas de microtitulação de fundo liso e manteve-se a incubar aproximadamente durante 2 semanas em meio selectivo que continha 10% de soro fetal de bovino, 10% de P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) meio condicionado, 3-5% de origen (IGEN) 120 em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com glicose elevada, L-glutamina e piruvato de sódio) mais HEPES 5 mM, 2-mercapto-etanol 0,055 mM, 50 mg/mL de gentamicina e lx HAT (Sigma, CRL P-7185) . Decorridas 1 a 2 semanas, deixou-se as células em cultura em meio, no qual o HAT foi substituído por HT. Pesquisou-se então as cavidades individuais por ELISA (descrito antes) quanto a anticorpos IgG e IgM anti-fucosil-GMl humanos.

Os hibridomas com uma actividade de ligação específica no ensaio de pesquisa ELISA foram novamente testados por FACS (descrito infra) quanto à ligação específica a fucosil-GMl adsorvido em células de mamíferos. Os hibridomas que exibem a ligação específica mais elevada de acordo com os ensaios ELISA e FACS foram suclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante. Desenvolveu-se então em cultura in vitro os sub-clones estáveis resultantes para se criar pequenas quantidades de anticorpo monoclonal em meio de cultura de tecidos. Repetiu-se o ensaio de pesquisa ELISA para confirmar a actividade dos sub-clones. Os sub-clones com a actividade mais elevada no ensaio ELISA foram aproveitados para produzir meio condicionado suficiente (tipicamente 1 L) para a purificação do anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl para nova caracterização.

Os clones de hibridoma 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8, 13B8a e 18D5 foram seleccionados para nova análise. 2: caracterização estrutural dos anticorpos monoclonais humanos 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 As sequências de ADNc que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos 121 monoclonais 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 foram obtidas a partir dos hibridomas 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5, respectivamente, utilizando técnicas convencionais de PCR e foram sequenciadas utilizando técnicas convencionais de sequenciação de ADN.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 5B1 são apresentadas na figura 2A e na SEQ ID NO: 49 e 1, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 5B1 são apresentadas na figura 2B e na SEQ ID NO: 55 e 7, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de 5B1 com as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia pesada de 5B1 utiliza um segmento de VH proveniente da linha germinativa humana VH 3-48, um segmento D provenientes da linha germinativa humana 1-1 e um segmento JH proveniente da linha germinativa humana JH 6b. 0 alinhamento da sequência de VH de 5B1 com a sequência de linha germinativa VH 3-48 é apresentado na figura 7. Uma nova análise da sequência VH de 5B1 utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada, conforme ilustrado nas figuras 2A e 7 e nas SEQ ID NO: 13, 19 e 25, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de 5B1 com as sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia leve de 5B1 utiliza um segmento VL proveniente da linha germinativa humana VK LI5 e um segmento JK proveniente da linha germinativa JK 4. 0 122 alinhamento da sequência de VL de 5B1 com a sequência de linha germinativa VK L15 é apresentado na figura 8. Uma nova análise da sequência de VL de 5B1 utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve, conforme ilustrado nas figuras 2B e 8 e nas SEQ ID NO: 31, 37 e 43, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 5Bla são apresentadas na figura 3A e na SEQ ID NO: 50 e 2, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 5Bla são apresentadas na figura 3B e na SEQ ID NO: 56 e 8, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de 5Bla com as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia pesada de 5Bla utiliza um segmento de VH proveniente da linha germinativa humana VH 3-48, um segmento D provenientes da linha germinativa humana 1-1 e um segmento JH proveniente da linha germinativa humana JH 6b. 0 alinhamento da sequência de VH de 5Bla com a sequência de linha germinativa VH 3-48 é apresentado na figura 7. Uma nova análise da sequência VH de 5Bla utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada, conforme ilustrado nas figuras 3A e 7 e nas SEQ ID NO: 14, 20 e 26, respectivamente.

A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de 5Bla com as sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia leve de 5Bla utiliza um segmento VL 123 proveniente da linha germinativa humana VK L15 e um segmento JK proveniente da linha germinativa JK 4. 0 alinhamento da sequência de VL de 5Bla com a sequência de linha germinativa VK L15 é apresentado na figura 8. Uma nova análise da sequência de VL de 5Bla utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve, conforme ilustrado nas figuras 3B e 8 e nas SEQ ID NO: 32, 38 e 44, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 7D4 são apresentadas na figura 4A e na SEQ ID NO: 51 e 3, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 7D4 são apresentadas na figura 4B e na SEQ ID NO: 57 e 9, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de 7D4 com as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia pesada de 7D4 utiliza um segmento de VH proveniente da linha germinativa humana VH 3-48, um segmento D provenientes da linha germinativa humana 1-1 e um segmento JH proveniente da linha germinativa humana JH 6b. 0 alinhamento da sequência de VH de 7D4 com a sequência de linha germinativa VH 3-48 é apresentado na figura 7. Uma nova análise da sequência VH de 7D4 utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada, conforme ilustrado nas figuras 4A e 7 e nas SEQ ID NO: 15, 21 e 27, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de 7D4 com as sequências de cadeia leve de 124 imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia leve de 7D4 utiliza um segmento VL proveniente da linha germinativa humana VK LI5 e um segmento JK proveniente da linha germinativa JK 4. 0 alinhamento da sequência de VL de 7D4 com a sequência de linha germinativa VK L15 é apresentado na figura 8. Uma nova análise da sequência de VL de 7D4 utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve, conforme ilustrado nas figuras 4B e 8 e nas SEQ ID NO: 33, 39 e 45, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 7E4 são apresentadas na figura 5A e na SEQ ID NO: 52 e 4, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 7E4 são apresentadas na figura 5B e na SEQ ID NO: 58 e 10, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de 7E4 com as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia pesada de 7E4 utiliza um segmento de VH proveniente da linha germinativa humana VH 3-48, um segmento D provenientes da linha germinativa humana 1-1 e um segmento JH proveniente da linha germinativa humana JH 6b. O alinhamento da sequência de VH de 7E4 com a sequência de linha germinativa VH 3-48 é apresentado na figura 7. Uma nova análise da sequência VH de 7E4 utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada, conforme ilustrado nas figuras 5A e 7 e nas SEQ ID NO: 16, 22 e 28, respectivamente. 125 A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de 7E4 com as sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia leve de 7E4 utiliza um segmento VL proveniente da linha germinativa humana VK L15 e um segmento JK proveniente da linha germinativa JK 4. 0 alinhamento da sequência de VL de 7E4 com a sequência de linha germinativa VK L15 é apresentado na figura 8. Uma nova análise da sequência de VL de 7E4 utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve, conforme ilustrado nas figuras 5B e 8 e nas SEQ ID NO: 34, 40 e 46, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 13B8 são apresentadas na figura 6A e na SEQ ID NO: 53 e 5, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 13B8 são apresentadas na figura 6B e na SEQ ID NO: 59 e 11, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de 13B8 com as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia pesada de 13B8 utiliza um segmento de VH proveniente da linha germinativa humana VH 3-48, um segmento D provenientes da linha germinativa humana 1-1 e um segmento JH proveniente da linha germinativa humana JH 6b. O alinhamento da sequência de VH de 13B8 com a sequência de linha germinativa VH 3-48 é apresentado na figura 7. Uma nova análise da sequência VH de 13B8 utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de 126 cadeia pesada, conforme ilustrado nas figuras 6A e 7 e nas SEQ ID NO: 11, 17 e 23, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de 13B8 com as sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia leve de 13B8 utiliza um segmento VL proveniente da linha germinativa humana VK L15 e um segmento JK proveniente da linha germinativa JK 4. 0 alinhamento da sequência de VL de 13B8 com a sequência de linha germinativa VK L15 é apresentado na figura 8. Uma nova análise da sequência de VL de 13B8 utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve, conforme ilustrado nas figuras 6B e 8 e nas SEQ ID NO: 35, 41 e 47, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de 18D5 com as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia pesada de 18D5 utiliza um segmento de VH proveniente da linha germinativa humana VH 3-48, um segmento D provenientes da linha germinativa humana 1-1 e um segmento JH proveniente da linha germinativa humana JH 6b. 0 alinhamento da sequência de VH de 18D5 com a sequência de linha germinativa VH 3-48 é apresentado na figura 7. Uma nova análise da sequência VH de 18D5 utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada, conforme ilustrado na figura 7 e nas SEQ ID NO: 18, 24 e 30, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de 18D5 com as sequências de cadeia leve de 127 imunoglobulina de linha germinativa humana conhecidas mostrou que a cadeia leve de 18D5 utiliza um segmento VL proveniente da linha germinativa humana VK LI5 e um segmento JK proveniente da linha germinativa JK 4. 0 alinhamento da sequência de VL de 18D5 com a sequência de linha germinativa VK L15 é apresentado na figura 8. Uma nova análise da sequência de VL de 18D5 utilizando o sistema Kabat de determinação da região de CDR permitiu a delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve, conforme ilustrado na figura 8 e nas SEQ ID NO: 36, 42 e 48, respectivamente.

Exemplo 3. Preparação de células dopadas com fucosil-GMl

Preparou-se células que continham fucosil-GMl embebido na membrana de plasma para utilização em ensaios de ligação. Efectuou-se a solubilização de fucosil-GMl purificado numa mistura a 1:1 de clorofórmio:metanol num tubo de vidro e evaporou-se até à secura, em ambiente de azoto. Adicionou-se PBS sem Ca ou Mg ao fucosil-GMl seco de um modo tal que a concentração de antigénio foi 200 pg/mL; criou-se uma emulsão por mistura num vórtice durante 5 minutos e depois submeteu-se a ultra-sons durante 5 minutos. Preparou-se uma suspensão de células alvo, tipicamente HEK 293 (rim humano, ATCC n° CRL-1573) ou Daudi (linfoma de Burkitt humano, ATCC n° CCL-213) em PBS com uma concentração de 2 x 106 células/mL. Misturou-se volumes iguais da emulsão de fucosil-GMl e da suspensão de células até uma concentração final de 100 pg de antigénio/ /106 células/mL. Manteve-se a incubar as células mais antigénio para permitir fucosil-GMl. 128

Exemplo 4. Caracterização da especificidade de ligação e da cinética de ligação de anticorpos monoclonais anti-fucosil-GMl humanos

Especificidade de ligação por ELISA

Testou-se anticorpos monoclonais humanos anti-fucosil-GMl purificados quanto à ligação especifica a fucosil-GMl purificado por ELISA, em antigénio recombinante de células dopadas. Todos os procedimentos foram efectuados sobre gelo. Misturou-se meio condicionado proveniente de culturas de hibridomas positivas por ELISA com antigénio ou com células em placas com o fundo em "V" e manteve-se a incubar durante 1 hora. Lavou-se as células e detectou-se o anticorpo ligado utilizando um anticorpo secundário de Fc IgG humana anti-murganho conjugado com HRP. Após lavagem, revelou-se as placas com um substrato colorimétrico, preparou-se aglomerados por centrifugação e transferiu-se o sobrenadante para uma placa de microtitulação de fundo liso para análise num espectrofotómetro. Os resultados são apresentados nas figuras 9 (antigénio, ELISA) e 10 (célula total, ELISA). Os anticorpos anti-fucosil-GMl demonstraram ligar-se especificamente a fucosil-GMl.

Especificidade de ligação por citometria de fluxo

Utilizou-se linhagens celulares positivas que expressem naturalmente fucosil-GMl, tais como H-4-II-E (hepatoma de rato, ATCC n° CRL-1548) ou DMS-79 (CPPC humano, ATCC n° CRL-2049) para se determinar a especificidade de anticorpos monoclonais humanos fucosil-GMl por citometria de fluxo. Todos os procedimentos de coloração foram efectuados sobre gelo. Avaliou-se a ligação 129 de um anticorpo monoclonal humano anti-fucosil-GMl por incubação de células transfectadas com o anticorpo monoclonal humano anti-fucosil-GMl numa concentração de 10 pg/mL. Lavou-se as células e detectou-se a ligação com um Ab de IgG anti-humano marcado com FITC. Efectuou-se as análises citométricas utilizando um dispositivo de citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Os resultados são apresentados na figura 11. O anticorpo monoclonal humano anti-fucosil-GMl ligou-se às linhagens celulares H-4-II-E e DMS-79. Estes dados mostram a especificidade dos anticorpos monoclonais humanos anti-fucosil-GMl para fucosil-GMl.

Exemplo 5. Internalização do anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl

Testou-se HuMAbs anti-fucosil-GMl guanto à aptidão de internalização em linhagens celulares que expressem fucosil-GMl, utilizando o ensaio de internalização Hum-Zap. O ensaio Hum-Zap testa a internalização de um anticorpo humano primário através da ligação de um anticorpo secundário com afinidade para IgG humana conjugada com a toxina saporina.

Colocou-se em suspensão linhagens celulares que expressam fucosil-GMl (H-4-II-E ou DMS 79) em meio de cultura e transferiu-se para placas de microtitulação de cultura de células numa concentração de 7500 células/ /cavidade. Preparou-se um conjunto de diluições dos anticorpos de teste e de controlos de isotipo em meio de cultura e misturou-se com um excesso molar de 2:1 de anticorpos secundário conjugado com saporina (Hum-Zap™, Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25) 130 durante 1 hora sobre gelo. As misturas de conjugado de anticorpo mais saporina são então misturadas com as células e mantidas a incubar a 37°C, durante 48 a 72 horas. Mediu-se a viabilidade das células por adição de MTS (Promega), Leu-se a D.O. após mais 4 horas de incubação, com a absorvência inversamente proporcional à internalização. Os resultados são apresentados na figura 12. Estes dados mostram que os anticorpos humanos anti-fucosil-GMl podem ser internalizados em linhas celulares que expressem fucosil-GMl.

Exemplo 6. Efeito de citotoxicidade dependente do complemento de anticorpos anti-fucosil-GMl

Colocou-se em suspensão células alvo, linhagens celulares "dopadas" ou que expressem naturalmente, até 106/mL em tampão de CDC (RPMI1640). Diluiu-se complemento humano (HC) a 1:3 em meio de crescimento de linhagem de células. Preparou-se um conjunto de diluições dos anticorpos de teste e de controlos de isotipos. Misturou-se as células, o complemento e os anticorpos em volumes iguais numa placa de microtitulação de ensaio e manteve-se a incubar a 37°C durante 2 horas. Adicionou-se azul de Alamar a cada cavidade e manteve-se as placas a incubar durante mais 21 horas a 37°C. Leu-se as placas num leitor de placas fluorescente, utilizando um perfil de absorção a 530 nm/emissão a 590 nm, em que a viabilidade das células é proporcional às unidades de fluorescência. Os resultados são apresentados na figura 13. Os anticorpos de controlo humanos e de murganho exibiram uma actividade de CDC robusta e dependente da dose em ambas as células DMS 79 e H-4-II-E. os anticorpos de controlo de isotipo não 131 mostraram uma citotoxicidade significativa. A actividade de CDC sobre linhagens celulares negativas a fucosil-GMl, tais como Ramos e ARH77, é negligenciável.

Exemplo 7. Avaliação da actividade de ADCC de anticorpos anti-fucosil-GMl

Neste exemplo, testou-se os anticorpos monoclonais anti-fucosil-GMl quanto à aptidão para matar linhagens celulares que expressam fucosil-GMl na presença de células efectoras através da citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) num ensaio de citotoxicidade de fluorescência. A actividade de ADCC é medida utilizando o sistema Delfia (Perkin-Elmer). Resumidamente, desenvolve-se em cultura células efectoras provenientes de células mononucleares de sangue periférico humanas (PBMC) por estimulação, de um dia para o outro, com 200 u/mL de IL-2 e coloca-se novamente em suspensão até 2 x 107/mL. Diluiu-se as células alvo até 106/mL, carrega-se com um ligando de aumento de fluorescência (BATDA) por incubação durante 20 minutos e dilui-se até 2 x 107 células/mL. Combina-se as células efectoras e as células alvo numa proporção de 100:1 numa placa de microtitulação de ensaio e mistura-se com um conjunto de diluições do anticorpo de teste e do controlo de isotipo. Mantém-se as placas a incubar durante 1 hora a 37°C, centrifuga-se para se formar aglomerados de células, remove-se 20 uL de sobrenadante e mistura-se com uma solução Eu (Perkin-Elmer). A fluorescência proveniente da libertação do ligando combinado com solução Eu é medida num leitor de placas Fusion (Perkin-Elmer), sendo proporcional à lise celular. As cavidades de ensaio com células 132 efectoras na ausência de anticorpo e com controlo de detergente para a lise de base e lise completa, respectivamente, permitem que a lise especifica do anticorpo seja calculada. Os resultados são apresentados na figura 14. Estes dados mostram que os anticorpos anti-fucosil GM1 são citotóxicos para células que expressam fucosil-GMl na superfície das células.

Exemplo 8. Imuno-histoquímica do carcinoma do pulmão A aptidão do HuMAb anti-fucosil-GMl 7E4 para reconhecer fucosil-GMl por IHC foi examinada utilizando biópsias clínicas de carcinoma do pulmão de pequenas células (CPPC) e de carcinoma do pulmão de não pequenas células (CPNPC).

Para a imuno-histoquímica, preparou-se secções congeladas com 5 mm (Ardais Inc, USA) provenientes de biópsias clínicas de carcinoma do pulmão de pequenas células (CPPC) e de carcinoma do pulmão de não pequenas células (CPNPC). Após secagem durante 30 minutos, fixou-se as secções com metanol (à temperatura ambiente durante 10 minutos) e secou-se ao ar durante 5 minutos. Enxaguou-se lamelas em PBS, depois submeteu-se a pré-incubação com 10% de soro normal de cabra em PBS durante 20 minutos e subsequentemente manteve-se a incubar com 10 mg/mL de 7E4 biotinilado em PBS com 10% de soro normal de cabra durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lavou-se as lamelas três vezes com PBS e depois manteve-se a incubar durante 30 minutos com estreptavidina-FITC (DAKO) à temperatura ambiente. Lavou-se novamente as lamelas com PBS e manteve-se a incubar anti-FITC de cabra conjugado com HRP (DAKO) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lavou-se 133 novamente as lamelas 3x com PBS. Utilizou-se diaminobenzidina (Sigma) como substrato da HRP, obtendo-se uma coloração castanha nos tecidos positivos para ligação a 7E4. Após lavagem com água destilada, submeteu-se as lamelas a contra-coloração com hematoxilina durante 1 minuto para mostrar a estrutura do tecido. Subsequentemente, lavou-se as lamelas durante 10 segundos com água destilada abundante e montou-se em glicergel (DAKO). A coloração imuno-histoquímica da biópsia clinica apresentou uma coloração nas secções de CPPC e de CPNCP. Apenas as células malignas foram positivas para cada caso, o tecido normal de pulmão adjacente não foi colorido. A prevalência global no carcinoma do pulmão foi de 5/13 para as amostras testadas (2/6 para CPPC e 3/7 para CPNPC) . O IHC foi negativo para a ligação de 7E4 a tecido normal de pulmão.

Exemplo 9. Produção de HuMAb não fucosilados

Os anticorpos com quantidades reduzidas de resíduos fucosilo mostraram aumentar a aptidão de ADCC do anticorpo. Neste exemplo, produz-se um HuMAb anti-fucosil GM1, ao qual faltam resíduos fucosilo. A linhagem celular de CHO Ms704-PF, a qual falta o gene fucosil-transferase, FUT 8 (Biowa, Inc., Princeton, NJ) é submetida a electroporação com um vector que expressa as cadeias pesada e leve de um HuMAb anti-fucosil GM1. Clones resistentes a fármacos são seleccionados por crescimento em meio de CHO 325-PF Ex-Cell (JRH Biosciences, Lenexa, KS), com L-glutamina 6 mM e 500 pg/mL de G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os clones são pesquisados 134 quanto à expressão de IgG por meio de um ensaio ELISA convencional.

Exemplo 10. Eficácia in vivo de anticorpos monoclonais humanos anti-fucosil-GMl Células de cancro do pulmão de pequenas células DMS79 (fucosil-GMl+) foram implantadas subcutaneamente em murganhos machos SCID (5 x 106 células/murganho) durante um tempo suficiente (cerca de 8 dias) para permitir a formação de tumores. No dia 8 após o implante, foram realizadas medições do tumor e os murganhos foram distribuídos aleatoriamente com base no volume tumoral médio (cerca de 200 mm3) em seis grupos de oito murganhos cada, para subsequente terapia com anticorpo. Nos dias 8, 11, 15, 18 e 22 após o implante, injectou-se os murganhos por via intraperitoneal (i.p.) consoante os grupos seguintes: (A) PBS (controlo com veículo); (B) IgGl humana (controlo de isotipo) a 30 mg/kg por murganho; (C) anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl 5B1 a 10 mg/kg por murganho; (D) anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl 5B1 a 30 mg/kg por murganho; (E) anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl 7E4 a 10 mg/kg por murganho ou (F) anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl 7E4 a 30 mg/kg por murganho. As composições de anticorpo monoclonal utilizadas nestas experiências tinham níveis reduzidos de endotoxina e não agregavam significativamente. Utilizando um calibrador de precisão electrónico, os tumores foram medidos tridimensionalmente (altura x largura x comprimento) e o volume tumoral foi calculado. As medições ao tumor foram realizadas duas vezes por semana ao longo da duração da experiência (61 dias). Os murganhos foram submetidos a eutanásia quando os tumores atingiram um 135 determinado ponto final tumoral (um volume tumoral particular, tal como 1500 mm3 e/ou quando os murganhos apresentaram sinais de desconforto ou uma perda de peso superior a cerca de 15%).

Para se examinar se os anticorpos monoclonais anti-fucosil-GMl retardaram o crescimento do tumor, controlou-se o dia em que o tumor atingiu um volume de 1000 mm3. Os anticorpos monoclonais anti-fucosil-GMl 7E4 e 5B1 retardaram significativamente o crescimento do tumor em comparação com os controlos com veiculo ou de isotipo (ver o quadro 1). A eficácia do anticorpo aparenta ser dependente da dose, visto que os grupos de tratamento com 30 mg/kg apresentam uma resposta superior em cada caso. Além do mais, os volumes do tumor nos murganhos tratados com o anticorpo 7E4 a 30 mg/kg nunca atingiram 1000 mm3 e apresentaram um volume médio de tumor de 600 mm3 no final do estudo no dia 61.

Quadro 1

Tratamento Dia para um volume tumoral de 1000 mm3 PBS (controlo com veiculo) 34 h-IgGI (controlo com isotipo) 32 Anti-5B1 (10 mg/kg) 56 Anti-5B1 (30 mg/kg) 60 Anti-7E4 (10 mg/kg) 57 Anti-7E4 (30 mg/kg) > 61

Para se examinar se fucosil-GMl continuava a ser expresso pelas células DMS79 in vivo, analisou-se a ligação dos anticorpos monoclonais 7E4 e 5B1 a células DMS79 por 136 FACS, antes do implante e após a recuperação de células DMS79 de tumores não tratados. Os anticorpos ligados, antes e após o implante de células DMS79, demonstraram que os niveis de expressão foram mantidos in vivo (figura 11C). A figura 15A mostra que todos os murganhos de controlo (grupos A e B) , com a excepção de um, atingiram o ponto final tumoral bem antes do dia 61. A figura 15B mostra que o grupo tratado com 10 mg/kg de anticorpo anti-fucosil-GMl 5B1 (grupo C) tinha dois murganhos que atingiram o ponto final tumoral e seis murganhos com tumores com um volume compreendido entre cerca de 600 mm3 e 1000 mm3, ao passo que nenhum dos oito murganhos no grupo tratado com 30 mg/kg de anticorpo anti-fucosil-GMl 5B1 (grupo D) atingiu o ponto final tumoral no dia 61 (apresentando um volume de 1000 mm3 ou inferior) . A figura 15C mostra que nenhum dos oito murganhos no grupo tratado com 10 mg/kg de anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl 7E4 (grupo E) atingiu o ponto final tumoral ao dia 61 (apresentando um volume de cerca de 1200 mm3 ou inferior, estando um murganho livre de tumor). A figura 15C também mostra que nenhum dos oito murganhos do grupo tratado com 30 mg/kg de anticorpo monoclonal anti-fucosil-GMl 7E4 (grupo F) atingiu o ponto final tumoral ao dia 61 (apresentando um volume de cerca de 800 mm3 ou inferior, estando dois murganhos livres de tumor). A figura 16 mostra (A) a média e (B) a mediana dos volumes de tumor medidos no dia 61. A eficácia do anticorpo aparenta ser dependente da dose, visto que os grupos de tratamento com 30 mg/kg apresentam uma resposta superior em cada caso em comparação com os controlos. 137

Quadro 2

Grupo Inibição do crescimento tumoral (TGI) (dia 32) Livre de tumor, dia 40 % (n2/total) Volume médio* o 0 Volume mediano* o O PBS 897 - 882 - - h-IgGl 1189 - 1066 - - AntÍ-5B1 (1Omg/kg) 227 81 201 81 Anti-5B1 (30mg/kg) 174 85 172 84 Anti-7E4 (1Omg/kg) 177 85 175 84 12,5 % (1/8) Anti-7E4 (30mg/kg) 116 90 141 87 25 % (2/8)

Este estudo indica que, em modelos de tumor em murinos, o tratamento com anticorpos anti-fucosil-GMl actua de um modo dependente da dose e apresenta um efeito significativamente superior sobre o crescimento tumoral em comparação com os controlos com veiculo ou com isotipo. 0 tratamento com anticorpo anti-fucosil-GMl também não provocou uma perda de peso nos murganhos ou quaisquer outros efeitos secundários significativos, o que indica que estes anticorpos são seguros e bem tolerados (figura 17) . De facto, os anticorpos anti-fucosil-GMl mostraram uma percentagem de inibição do crescimento do tumor (% de ICT) compreendida entre 81% e 90% no dia 32 (quadro 2) . Além disso, o tratamento com o anticorpo 7E4 numa dose de 30 mg/kg resultou em 25% dos murganhos livres de tumor. 138 A presente memória descritiva não deverá ser limitada no seu âmbito pelas variantes especificas aqui descritas, de facto, várias modificações da presente memória descritiva, para além das

Este estudo indica que, em modelos de tumor em murinos, o tratamento com anticorpos anti-fucosil-GMl actua de um modo dependente da dose e apresenta um efeito significativamente superior sobre o crescimento tumoral em comparação com os controlos com veiculo ou com isotipo. 0 tratamento com anticorpo anti-fucosil-GMl também não provocou uma perda de peso nos murganhos ou quaisquer outros efeitos secundários significativos, o que indica que estes anticorpos são seguros e bem tolerados (figura 17) . De facto, os anticorpos anti-fucosil-GMl mostraram uma percentagem de inibição do crescimento do tumor (% de ICT) compreendida entre 81% e 90% no dia 32 (quadro 2) . Além disso, o tratamento com o anticorpo 7E4 numa dose de 30 mg/kg resultou em 25% dos murganhos livres de tumor.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: SEQUÊNCIA SEQ ID NO: SEQUÊNCIA 1 VH a.a. 5B1 32 VK CDR1 a.a. 5Bla 2 VB a.a. 5Bla 33 VK CDR1 a.a. 7D4 3 VH a.a. 7D4 34 VK CDR1 a.a. 7E4 4 VH a.a. 7E4 35 VK CDR1 a.a. 13B8 5 VH a.a. 13B8 36 VK CDR1 a.a. 18D5 6 VH a.a. 18D5 37 VK CDR2 a.a. 5B1 7 VK a.a. 5B1 38 VK CDR2 a.a. 5Bla 8 VK a.a. 5Bla 39 VK CDR2 a.a. 7D4 9 VK a.a. 7D4 40 VK CDR2 a.a. 7E4 10 VK a.a. 7E4 41 VK CDR2 a.a. 13B8 139 SEQ ID NO: SEQUÊNCIA SEQ ID NO: SEQUÊNCIA 11 VK a. a. 13B8 42 VK CDR2 a.a. 18D5 12 VK a. a. 18D5 43 VK CDR3 a.a. 5B1 13 VH CDR1 a. a. 5B1 44 VK CDR3 a.a. 5Bla 14 VH CDR1 a. a. 5Bla 45 VK CDR3 a.a. 7D4 15 VH CDR1 a. a. 7D4 46 VK CDR3 a.a. 7E4 16 VH CDR1 a. a. 7E4 47 VK CDR3 a.a. 13B8 17 VH CDR1 a. a. 13B8 48 VK CDR3 a.a. 18D5 18 VH CDR1 a. a. 18D5 49 VHn n.t. 5B1 19 VH CDR2 a. a. 5B1 50 VH n.t. 5Bla 20 VH CDR2 a. a. 5Bla 51 VH n.t. 7D4 21 VH CDR2 a. a. 7D4 52 VH n.t. 7E4 22 VH CDR2 a. a. 7E4 53 VH n.t. 13B8 23 VH CDR2 a. a. 13B8 54 VH n.t. 3C4 24 VH CDR2 a. a. 18D5 55 VK n.t. 5B1 25 VH CDR3 a. a. 5B1 56 VK n.t. 5Bla 26 VH CDR3 a. a. 5Bla 57 VK n.t. 7D4 27 VH CDR3 a. a. 7D4 58 VK n.t. 7E4 28 VH CDR3 a. a. 7E4 59 VK n.t. 13B8 29 VH CDR3 a. a. 13B8 60 VK n.t. 3C4 30 VH CDR3 a. a. 18D5 61 Linha germinativa de VH 3-48 a.a. 31 VK CDR1 a. a. 5B1 62 Linha germinativa de VK L15 a.a. 140

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição US 5225539 A, Winter [0082] US 5530101 A [0082] [0085] US 5585089 A [0082] [0085] US 5693762 A [0082] [0085] US 6180370 A, Queen [0082] [0085] US 20030153043 A, Carr [0096] US 5677425 A, Bodmer [0098] US 6165745 A, Ward [0099] US 6277375 B, Ward [0100] US 5869046 A [0100] US 6121022 A, Presta [0100] US 5624821 A [0101] US 5648260 A, Winter [0101] US 6194551 B, Idusogie [0102] WO 9429351 A, Bodmer [0103] WO 0042072 A, Presta [0104] US 5714350 A [0105] US 6350861 A, Co [0105] US 20040110704 A, Yamane [0106] EP 1176195 A, Hanai [0106] WO 03035835 A, Presta [0106] 141 wo 9954342 A, Umana [0106] EP 0154316 A, Nishimura [0107] EP 0401384 A, Ishikawa [0107] WO 02092780 A , Short [0113] WO 03074679 A , Lazar [0113] US 5545806 A [0124] [0215] US 5569825 A [0124] US 5625126 A [0124] US 5633425 A [0124] US 5789650 A [0124] US 5877397 A [0124] US 5661016 A [0124] US 5814318 A [0124] US 5874299 A [0124] US 5770429 A [0124] [0215] US 5545807 A, Surani [0124] [0215] wo 9203918 A [0124] wo 9312227 A [0124] wo 9425585 A [0124] wo 9713852 A [0124] wo 9824884 A [0124] [0130] [0216] wo 9945962 A [0124] wo 0114424 A, Korman [0124] [0130] wo 0243478 A, Ishida [0125] [0215] US 5939598 A [0126] US 6075181 A [0126] US 6114598 A [0126] US 6150584 A [0126] US 6162963 A, Kucherlapati [0126] US 5223409 A [0128] US 5403484 A [0128] [0215] 142 us 5571698 A, Ladner [0128] us 5427908 A [0128] us 5580717 A, Dower [0128] us 5969108 A [0128] us 6172197 A, McCafferty [0128] us 5885793 A [0128] us 6521404 A [0128] us 6544731 A [0128] us 6555313 A [0128] us 6582915 A [0128] us 6593081 A, Griffiths [0128] us 5476996 A [0129] us 5698767 A, Wilson [0129] us 4399216 A [0137] us 4634665 A [0137] wo 8704462 A [0139] wo 8901036 A [0139] EP 338841 A [0139] us 6548530 B [0147] [0203] us 6281354 B [0147] [0203] us 20030064984 A [0147] [0203] us 20030073852 A [0147] [0203] us 20030050331 A [0147] [0203] us 4946778 A, Ladner [0156] wo 8800052 A, Fanger [0158] us 4954617 A [0158] wo 9410332 A [0158] us 5260203 A [0164] us 5455030 A [0164] us 4881175 A [0164] us 5132405 A [0164] 143 us 5091513 A [0164] us 5476786 A [0164] us 5013653 A [0164] us 5258498 A [0164] us 5482858 A [0164] us 5399163 A [0186] us 5383851 A [0186] us 5312335 A [0186] us 5064413 A [0186] us 4941880 A [0186] us 4790824 A [0186] us 4596556 A [0186] us 4487603 A [0186] us 4486194 A [0186] us 4447233 A [0186] us 4447224 A [0186] us 4439196 A [0186] us 4475196 A [0186] us 4522811 A [0188] us 5374548 A [0188] us 5399331 A [0188] us 5416016 A, Low [0188] us 2004008 7497 A [0203] wo 03022806 A [0203] wo 0109187 A [0215] us 5625825 A [0215]

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Claims (19)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3; e uma região variável de cadeia leve que compreende os domínios ( 3DR1, CDR2 e CDR3, em que: (a) a CDR1 da região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 16; (b) a CDR2 da região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 22; (c) a CDR3 da região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 28; (d) a CDR1 da região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 34; (e) a CDR2 da região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 40 e (f) a CDR3 da região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 46, em que o anticorpo se liga especificamente a fucosil-GMl.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo se liga à linha celular de cancro do pulmão de pequenas células humano DMS-79 (CPPC humano, ATCC n° CRL-2049) .

3. Anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 e/ou 2 uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62.

4. Anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que: (a) a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e (b) a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

5. Anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, em que o anticorpo apresenta competição cruzada pela ligação a fucosil-GMl com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência é um anticorpo monoclonal humano isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, que é um anticorpo de comprimento completo de um isotipo IgGl ou IgG4.

7. Anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, que é um fragmento Fab ou Fab'2 ou um anticorpo de cadeia única.

8. Anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o referido anticorpo é um anticorpo hipofucosilado. 3

9. Composição que compreende o anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

10. Imunoconjugado que compreende o anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ligado a um agente terapêutico, tal como uma citotoxina ou um isótopo radioactivo.

11. Composição que compreende o imunoconjugado de acordo com a reivindicação 10 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

12. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica o anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

13. Vector de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12.

14. Célula hospedeira que compreende o vector de expressão de acordo com a reivindicação 13.

15. Método para a preparação de um anticorpo anti-fucosil-GM1 que compreende a expressão do anticorpo numa célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14 e o isolamento do anticorpo a partir da célula hospedeira.

16. Anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para 4 utilização no tratamento de uma doença caracterizada pelo crescimento de células tumorais que expressam fucosil-GMl.

17. Anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que a doença é cancro.

18. Anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, para utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o cancro é o cancro do pulmão.

19. Anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, para utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o cancro do pulmão é o cancro do pulmão de pequenas células.