NO309798B1

NO309798B1 - Peptide composition, as well as pharmaceutical composition and cancer vaccine including the peptide composition

Info

Publication number: NO309798B1
Application number: NO19992102A
Authority: NO
Inventors: Jon Amund Eriksen; Marianne Klemp Gjertsen; Gustav Gaudernack; Mona Moller
Original assignee: Targovax As
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 1999-04-30
Publication date: 2001-04-02
Also published as: AU4438900A; AR023806A1; WO2000066153A1; JP2002543149A; EP1173199A1; CA2372187A1; NO992102D0; NO992102L

Description

Denne oppfinnelsen vedrører peptidblandinger, samt farmasøytiske sammensetninger og kreftvaksine som innbefatter en slik peptidblanding. This invention relates to peptide mixtures, as well as pharmaceutical compositions and cancer vaccines which include such a peptide mixture.

Den genetiske bakgrunnen for at det oppstår kreft er endringer i proto-onkogener og onkogener og tumorsupressorgener. Proto-onkogener er normale gener i cellen som har potensiale for å bli til onkogener. Alle onkogener koder for og virker gjennom et protein. I et flertall av tilfellene er det påvist at de er komponenter av signaloverføringsbaner. Onkogener oppstår i naturen utfra proto-onkogener ved punktmutasjoner eller translokasjoner som fører til en omdannet tilstand av cellen som mutasjonen er oppstått i. Kreften utvikler seg gjennom en flertrinnsprosess som involverer flere mutasjonsbegivenheter i onkogener og tumorsupressorgener. The genetic background for the occurrence of cancer is changes in proto-oncogenes and oncogenes and tumor suppressor genes. Proto-oncogenes are normal genes in the cell that have the potential to become oncogenes. All oncogenes code for and act through a protein. In a majority of cases, they have been shown to be components of signal transduction pathways. Oncogenes arise in nature from proto-oncogenes by point mutations or translocations that lead to a transformed state of the cell in which the mutation originated. Cancer develops through a multi-step process involving several mutational events in oncogenes and tumor suppressor genes.

I sin enkleste form kan utbytting av en enkelt base i et proto-onkogen føre til at produktet av genet blir forskjellig i en enkel aminosyre. In its simplest form, substitution of a single base in a proto-oncogene can cause the product of the gene to differ in a single amino acid.

I eksperimentelle modeller med svulster på mus er det påvist at punktmutasjoner i identitetsproteiner inne i cellen kan føre til at det oppstår antigener for tumoravvisning som består av peptider som er en eneste aminosyre forskjellig fra et normalt peptid. T-cellene som gjenkjenner disse peptidene i sammenheng med hovedhistokompatibilitetsmolekylene (MHC) på overflaten av tumorcellene, kan drepe tumorcellene og dermed avvise svulsten fra verten. (Boon, T. et al., Cell, 1989, Vol. 58, s. 293-303). In experimental models with tumors on mice, it has been demonstrated that point mutations in identity proteins inside the cell can lead to the emergence of antigens for tumor rejection consisting of peptides that are a single amino acid different from a normal peptide. The T cells that recognize these peptides in conjunction with the major histocompatibility molecules (MHC) on the surface of the tumor cells can kill the tumor cells and thus reject the tumor from the host. (Boon, T. et al., Cell, 1989, Vol. 58, pp. 293-303).

I den humane kreftimmunologien er det de siste 20 årene gjort intense forsøk på å karakterisere ekte kreftspesifikke antigener. In human cancer immunology, intense efforts have been made in the last 20 years to characterize true cancer-specific antigens.

I begynnelsen ble det gjort mye arbeid med å analysere antistoffene til de menneskelige tumorantigenene. I henhold til teknikkens stand kan slike antistoffer brukes både for diagnostiske og terapeutiske formål, for eksempel som et middel mot kreft. Et problem er at antistoffer bare kan binde seg til tumorantigener som eksponeres på overflaten av tumorceller. Derfor har forsøkene på å lage en kreftbehandling som baserer seg på immunsystemet i kroppen vært mindre vellykket enn forventet. In the beginning, much work was done to analyze the antibodies to the human tumor antigens. According to the state of the art, such antibodies can be used both for diagnostic and therapeutic purposes, for example as an anti-cancer agent. One problem is that antibodies can only bind to tumor antigens that are exposed on the surface of tumor cells. Therefore, attempts to create a cancer treatment based on the body's immune system have been less successful than expected.

Antistoffer gjenkjenner til vanlig frie antigener i naturlig konformasjon og kan potensielt gjenkjenne nesten alle posisjoner som eksponeres på overflaten av antigenet. I motsetning til antistoffene som dannes av B-cellene, gjenkjenner T-cellene antigener bare når de er forbundet med MHC-molekyler, som betegnes HLA (humant leukocyttantigen) i mennesket, og bare etter en egnet behandling av antigenet. Denne er vanligvis en proteolytisk fragmentering av proteinet, som resulterer i peptider som passer inn i kløften i MHC-molekylene. Dette gjør det mulig for T-cellene å gjenkjenne også peptider som stammer fra proteiner inne i cellen. T-cellene kan dermed gjenkjenne avvikende peptider som stammer fra hvor som helst i tumorcellen, når de er forbundet med MHC-molekyler på overflaten av tumorcellen, og kan deretter aktiveres for å eliminere den tumorcellen som inneholder dette avvikende peptidet. Antibodies usually recognize free antigens in native conformation and can potentially recognize almost any position exposed on the surface of the antigen. In contrast to the antibodies formed by the B cells, the T cells recognize antigens only when they are associated with MHC molecules, which are designated HLA (human leukocyte antigen) in humans, and only after a suitable treatment of the antigen. This is usually a proteolytic fragmentation of the protein, resulting in peptides that fit into the cleft of the MHC molecules. This makes it possible for the T cells to also recognize peptides that originate from proteins inside the cell. The T cells can thus recognize aberrant peptides originating anywhere in the tumor cell, when associated with MHC molecules on the surface of the tumor cell, and can then be activated to eliminate the tumor cell containing this aberrant peptide.

HLA-molekylene kodes av HLA-regionen på det 6. menneskelige kromosomet. Klasse I-molekylene kodes av sublokasjonene HLA A, B og C og klasse II molekylene kodes av DR, DP og DQ sublokasj onene. Alle genproduktene er sterkt forskjelligartede. Forskjellige individer uttrykker altså distinkte HLA-molekyler som skiller seg fra HLA-molekylene til andre individer. Dette er bakgrunnen for vanskelighetene med å finne HLA-matchende organdonorer ved transplantasjoner. Den genetiske variasjonen i HLA-molekylene er spesielt viktig i immunobiologien på grunn av den rollen de spiller som immunresponsgener. Nærværet eller fraværet av visse HLA-molekyler bestemmer hvilken evne et individ har til å reagere på peptid-epitoper, på grunn av HLA-molekylenes evne til å binde peptider. HLA-molekylene avgjør altså om individet har motstandskraft eller er utsatt for sykdom. The HLA molecules are encoded by the HLA region on the 6th human chromosome. The class I molecules are encoded by the HLA A, B and C sublocations and the class II molecules are encoded by the DR, DP and DQ sublocations. All the gene products are highly diverse. Different individuals thus express distinct HLA molecules that differ from the HLA molecules of other individuals. This is the background for the difficulties in finding HLA-matched organ donors for transplants. The genetic variation in the HLA molecules is particularly important in immunobiology because of the role they play as immune response genes. The presence or absence of certain HLA molecules determines the ability of an individual to respond to peptide epitopes, due to the ability of HLA molecules to bind peptides. The HLA molecules thus determine whether the individual has resistance or is exposed to disease.

T-cellene kan kontrollere utvikling og vekst av kreft gjennom en rekke mekanismer. Cytotoksiske T-celler, både HLA klasse I restrikte CD8+ og HLA klasse II restrikte CD4+, kan direkte drepe de tumorcellene som har de riktige tumorantigenene. CD4+-hjelper-T-celler er nødvendige både for å fremstimulere og vedlikeholde reaksjonen fra cytotoksiske T-celler og fra antistoffreaksjonen, samt for å stimulere frem makrofag- og LAK-celle-dreping. The T cells can control the development and growth of cancer through a number of mechanisms. Cytotoxic T cells, both HLA class I restricted CD8+ and HLA class II restricted CD4+, can directly kill those tumor cells that have the correct tumor antigens. CD4+ helper T cells are necessary both to stimulate and maintain the reaction from cytotoxic T cells and from the antibody reaction, as well as to stimulate macrophage and LAK cell killing.

Selv om det i henhold til teknikkens stand (d.v.s. den teknikkens stand som søkeren av den foreliggende patentsøknaden henviser til i W092/14756) er identifisert mange onkogener og deres proteinprodukter , og en nylig publisert undersøkelse har vist at T-cellerepertoaret til en frisk person inkluderer T-celler som er spesifikke for et syntetisk peptidfragment fra et p21 ras onkogenprodukt, er det ingen undersøkelser før W092/14756 som har definert de korrekte antigenene eller antigenposisjonene som gir tumorspesifikk T-celleimmunitet. Although according to the prior art (i.e. the prior art to which the applicant of the present patent application refers in WO92/14756) many oncogenes and their protein products have been identified, and a recently published study has shown that the T cell repertoire of a healthy individual includes T cells specific for a synthetic peptide fragment from a p21 ras oncogene product, there are no studies prior to WO92/14756 that have defined the correct antigens or antigen positions that confer tumor specific T cell immunity.

W092/14756 er basert på tanken om at en mulig alternativ tilnærmingsmåte for bekjempelse av kreft er å bruke kroppens eget immunsystem ved å aktivere og styrke immunreaksjonen fra spesifikke T-celler. I W092/14756 fremlegges syntetiske peptider og fragmenter av onkogenproteinprodukter som fremstimulerer T-celleimmunitet, og kreftvaksiner og sammensetninger for behandling mot kreft som innbefatter de nevnte peptidene eller peptidfragmentene. Til tross for denne tidligere oppfinnelsen er det fortsatt behov for mer effektive produkter for kreftbekjempelse. W092/14756 is based on the idea that a possible alternative approach for fighting cancer is to use the body's own immune system by activating and strengthening the immune reaction from specific T cells. WO92/14756 discloses synthetic peptides and fragments of oncogene protein products which stimulate T-cell immunity, and cancer vaccines and compositions for treatment against cancer which include said peptides or peptide fragments. Despite this earlier invention, there is still a need for more effective anti-cancer products.

Det har vært store betenkeligheter mot å bruke peptidblandinger til å vaksinere pasienter på grunn av den overhengende faren for at noen av peptidene i blandingen blir immunodominante og dermed undertrykker de andre peptidenes HLA-presentasjon. (Pion S, Christianson GJ, Fontaine P, Roopenian DC, Perreault C, Blood 1999 feb 1;93(3):952-62, Shaping the repertoire of cytotoxic T-lymphocyte responses: explanation for the immunodominance effect whereby cytotoxic T lymphocytes specific for immunodominant antigens prevent recognition of nondominant antigens.) There have been major concerns about using peptide mixtures to vaccinate patients because of the imminent danger of some of the peptides in the mixture becoming immunodominant and thereby suppressing the HLA presentation of the other peptides. (Pion S, Christianson GJ, Fontaine P, Roopenian DC, Perreault C, Blood 1999 Feb 1;93(3):952-62, Shaping the repertoire of cytotoxic T-lymphocyte responses: explanation for the immunodominance effect whereby cytotoxic T lymphocytes specific for immunodominant antigens prevent recognition of nondominant antigens.)

Utfra eksperimenter som er utført in vitro er det kjent at forskjellige muterte ras-peptider kan konkurrere om bindingen til HLA-molekylet som er ansvarlig for presentasjon til de relevante T-cellene (W092/14756, figur 4, 5 og 7) og at peptider av samme lengde, men som representerer forskjellige mutasjoner kan hemme bindingen og gjenkjennelsen av et peptid som representerer en annen mutasjon med forskjellig grad av effektivitet (T. Gedde-Dahl III et al., Human Immunol. 33, 266-274,1992 og B.H. Johanssen et al., Scand. J. Immunol. 33, 607-612, 1994). På grunn av dette har immunodominansen vært ansett som et problem når det gjelder vaksiner laget av mutert ras-peptid. From experiments performed in vitro, it is known that different mutated ras peptides can compete for binding to the HLA molecule responsible for presentation to the relevant T cells (W092/14756, Figures 4, 5 and 7) and that peptides of the same length but representing different mutations can inhibit the binding and recognition of a peptide representing a different mutation with different degrees of efficiency (T. Gedde-Dahl III et al., Human Immunol. 33, 266-274, 1992 and B.H. Johanssen et al., Scand. J. Immunol. 33, 607-612, 1994). Because of this, immunodominance has been considered a problem with vaccines made from mutated ras peptide.

Imidlertid ble alle disse observasjonene gjort under slike eksperimentelle betingelser som kan oppnås utenfor kroppen. I en vaksinert pasient kan flere andre forhold bidra til funksjonell immunodominans for et visst peptid i en blanding av andre peptider. Spesielt interessant kan motstanden mot nedbrytning av proteolytiske enzymer i vevet være hvor antigenet injiseres, noe som kan influere halveringstiden for peptidene i kroppen, og videre forskjeller i hydrofobi som kan ha en innflytelse på hastigheten som peptidene opptas med av de relevante antigenpresenterende cellene i vevet. I motsetning til hva man ville forvente utfra eksperimentene utenfor kroppen fant oppfinnerne til sin overraskelse at immunresponsen var betydelig høyere hos de gruppene av pasienter med kolorektal kreft og kreft i bukspyttkjertelen som var behandlet med en cocktail av muterte ras-peptider enn ved behandling med enkeltvis ras-peptider som beskrevet i W092/14756. Disse resultatene viser at i stedet for å konkurrere med de andre peptidene og dermed gi opphav til immunodominans, kan et peptid gi opphav til en immunreaksjon som kommer i tillegg til reaksjonen mot de andre peptidene i blandingen. Dette fenomenet kan best forklares ved en positiv tilbakekoblingsløkke som oppstår ved kaskaden av T-hjelperrelaterte kjemokiner og cytokiner som vil bli frigjort i starten etter at T-cellen er aktivert av en peptidspesifikk T-celle. Disse faktorene vil rekruttere flere profesjonelle antigenpresenterende celler og T-celler til lymfeknuten hvor aktiveringen finner sted og deretter også til vaksinestedet, og vil også gi opphav til en forsterkning av produksjonen av de vekst- og modningsfaktorene som kreves for vellykket T-celleformering. Det logiske grunnlaget for den forsterkende tilbakekoblingseffekten er at antallet T-celler som har potensiale for å gjenkjenne alle peptidene i blandingen er mye større enn antallet T-celler som er spesifikke for et enkelt peptid. I samspill vil aktiveringen av flere T-celler som er spesifikke for individuelle peptider som finnes i peptidblandingen øke graden av reaksjon også mot enkelte peptider i blandingen. However, all these observations were made under such experimental conditions as can be obtained outside the body. In a vaccinated patient, several other conditions may contribute to functional immunodominance for a certain peptide in a mixture of other peptides. Particularly interesting may be the resistance to degradation by proteolytic enzymes in the tissue where the antigen is injected, which may influence the half-life of the peptides in the body, and further differences in hydrophobicity which may have an influence on the rate at which the peptides are taken up by the relevant antigen-presenting cells in the tissue. Contrary to what would be expected from the experiments outside the body, the inventors found to their surprise that the immune response was significantly higher in the groups of patients with colorectal cancer and pancreatic cancer that were treated with a cocktail of mutated ras peptides than when treated with individual ras -peptides as described in WO92/14756. These results show that instead of competing with the other peptides and thus giving rise to immunodominance, a peptide can give rise to an immune reaction that is in addition to the reaction against the other peptides in the mixture. This phenomenon can best be explained by a positive feedback loop arising from the cascade of T helper-related chemokines and cytokines that will be released initially after the T cell is activated by a peptide-specific T cell. These factors will recruit more professional antigen-presenting cells and T cells to the lymph node where activation takes place and then also to the site of vaccination, and will also give rise to an increase in the production of the growth and maturation factors required for successful T cell proliferation. The rationale for the reinforcing feedback effect is that the number of T cells that have the potential to recognize all the peptides in the mixture is much greater than the number of T cells that are specific for a single peptide. In interaction, the activation of several T cells that are specific for individual peptides found in the peptide mixture will increase the degree of reaction also against individual peptides in the mixture.

i Videre ble det overraskende funnet at ras-peptider i de innsprøytede cocktailene som ikke svarer til den ras-mutasjonen som faktisk fantes i svulsten til pasienten, også dannet T-celler som var klinisk relevante på grunn av en kryss reaktivitet med peptider som svarer til den faktiske mutasjonen. Virkningen av å bruke en blanding av ras-peptider er derfor Furthermore, it was surprisingly found that ras peptides in the injected cocktails that do not correspond to the ras mutation actually present in the patient's tumor also generated T cells that were clinically relevant due to a cross-reactivity with peptides that correspond to the actual mutation. The effect of using a mixture of ras peptides is therefore

dobbelt, den forsterker de T-cellene som er spesifikke for et enkelt peptid og gir i tillegg en andre komponent som består av T-cellekloner som er spesifikke for et annet peptid, men som samtidig reagerer med den tumorrelevante mutasjonen. Slike T-cellekloner kan ellers ikke fås ved vaksinasjon med enkeltpeptider, da de ikke ble observert hos pasienter som ble behandlet med en enkeltpeptidvaksinasjon. doubly, it enhances those T cells specific for a single peptide and additionally provides a second component consisting of T cell clones specific for another peptide but which simultaneously react with the tumor relevant mutation. Such T cell clones cannot otherwise be obtained by vaccination with single peptides, as they were not observed in patients treated with a single peptide vaccination.

Det er altså et hovedformål ved oppfinnelsen å fremskaffe mer effektive behandlingsmidler, vaksiner og farmasøytiske sammensetninger enn de som fremlegges i W092/14756 for forebyggelse og/eller behandling av kreft. It is thus a main purpose of the invention to provide more effective treatment agents, vaccines and pharmaceutical compositions than those presented in WO92/14756 for the prevention and/or treatment of cancer.

Et annet formål ved oppfinnelsen er å fremskaffe et behandlingsmiddel, en vaksine og en farmasøytisk sammensetning som stimulerer frem immunreaksjoner og aktivering av T-celler. Another object of the invention is to provide a treatment agent, a vaccine and a pharmaceutical composition which stimulates immune reactions and activation of T cells.

Disse og andre formål ved oppfinnelsen oppnås ved de vedlagte patentkravene. These and other objects of the invention are achieved by the attached patent claims.

Peptidene som brukes i peptidblandingene i denne oppfinnelsen utgjøres av peptidene og peptidfragmentene som fremlegges i W092/14756. Det henvises derfor til beskrivelsen av W092/14756. The peptides used in the peptide mixtures in this invention are made up of the peptides and peptide fragments presented in WO92/14756. Reference is therefore made to the description of W092/14756.

Oppfinnelsen forklares i mer detalj ved de følgende eksemplene og de vedlagte figurene. The invention is explained in more detail by the following examples and the attached figures.

Beskrivelse av figurene Description of the figures

Betegnelsen "sekvens-id. nr." er i figurene forkortet med "s. id." The term "sequence ID no." is abbreviated in the figures with "s. id."

Fig. 1: Fig. 1:

I figur 1 sammenliknes resultatene fra to kliniske tester med vaksinasjon med posisjon 12-og/eller posisjon 13-muterte ras-peptider av pasienter med kolorektal kreft. Figure 1 compares the results from two clinical tests with vaccination with position 12- and/or position 13-mutated ras peptides of patients with colorectal cancer.

Fig. 2: Fig. 2:

I figur 1 sammenliknes resultatene fra to kliniske tester med vaksinasjon av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen med posisjon 12- og/eller posisjon 13-muterte ras-peptider. Figure 1 compares the results from two clinical tests with vaccination of patients with pancreatic cancer with position 12- and/or position 13-mutated ras peptides.

Fig. 3: Fig. 3:

Figur 3 viser forskjellige reaksjonsmønstre for fire pasienter med kolorektal adenokarsinom som ble vaksinerte med en cocktail av fem forskjellige posisjon 12- og posisjon 13-muterte ras-peptider, sekvens-id. nr. 2, 3,4, 6 og 7. Figure 3 shows different response patterns for four patients with colorectal adenocarcinoma who were vaccinated with a cocktail of five different position 12- and position 13-mutated ras peptides, SEQ ID NO. No. 2, 3, 4, 6 and 7.

Fig. 4: Fig. 4:

Figur 4 viser forskjellige T-cellereaksjoner mot individuelle muterte ras-peptider for to reagerende pasienter. Figure 4 shows different T cell responses to individual mutated ras peptides for two responding patients.

Fig. 5: Fig. 5:

Figur 5 viser reaktiviteten av perifere T-celler fra en pasient med kolorektal adenokarsinom etter vaksinasjonen. Figure 5 shows the reactivity of peripheral T cells from a patient with colorectal adenocarcinoma after vaccination.

Fig. 6: Fig. 6:

Figur 6 viser reaktiviteten av tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) fra en pasient med fremskreden kreft i bukspyttkjertelen etter vaksinasjonen. Figure 6 shows the reactivity of tumor infiltrating lymphocytes (TIL) from a patient with advanced pancreatic cancer after vaccination.

Fig. 7: Fig. 7:

Den sterke kryss reaktiviteten til ras-spesifikke T-celler som var dannet ved vaksinasjon med en blanding av ras-peptider med forskjellige ras-mutasjoner ble også demonstrert på klonenivå. Dette vises på figur 7. The strong cross-reactivity of ras-specific T cells generated by vaccination with a mixture of ras peptides with different ras mutations was also demonstrated at the clonal level. This is shown in Figure 7.

Fig. 8: Fig. 8:

Figur 8 viser hvor spesifikke T-cellekloner fra pasienter med malignt melanom blir etter vaksinasjon med en cocktail av fire forskjellige posisjon 61-muterte ras-peptider, sekvens-id. nr. 9, 10,11 og 10. Figure 8 shows how specific T-cell clones from patients with malignant melanoma become after vaccination with a cocktail of four different position 61-mutated ras peptides, sequence ID. No. 9, 10, 11 and 10.

Eksempler Examples

Syntesen av peptidene: The synthesis of the peptides:

Peptidene ble fremstilt ved peptidsyntese i fast fase. Det ble brukt N-a-Fmoc-aminosyrer med egnet sidegrenbeskyttelse ( Ser(tBu), Thr(tBu), Lys(Boc), His(Trt), Arg(Pmc), Cys(Trt), Asp(O-tBu), Glu(O-tNu)). Fmoc-aminosyrene ble aktivert med TBTU før bindingen. 20 % piperidin i DMF ble brukt for å fjerne Fmoc selektivt etter hvert bindingstrinn. Løsgjøring fra resinet og endelig fjerning av sidegrenbeskyttelsen ble gjort med en 95 % TFA(aq) som inneholdt egnede skavenger. Peptidene ble renset og analysert med omvendt fase. Peptidene ble analysert og karakterisert med standardmetoder for peptider. The peptides were prepared by peptide synthesis in solid phase. N-α-Fmoc amino acids with suitable side branch protection were used ( Ser(tBu), Thr(tBu), Lys(Boc), His(Trt), Arg(Pmc), Cys(Trt), Asp(O-tBu), Glu (O-tNu)). The Fmoc amino acids were activated with TBTU prior to binding. 20% piperidine in DMF was used to selectively remove Fmoc after each binding step. Release from the resin and final removal of the side branch protection was done with a 95% TFA(aq) containing suitable scavengers. The peptides were purified and analyzed by reverse phase. The peptides were analyzed and characterized using standard methods for peptides.

Følgende ras-peptider ble fremstilt med denne metoden: The following ras peptides were prepared by this method:

Tabell 1. RAS-peptider med mutasjon i posisjon 12 og 13 og den tilsvarende normale p21-sekvensen. Table 1. RAS peptides with mutation in positions 12 and 13 and the corresponding normal p21 sequence.

8 8

Tabell 2. RAS-peptider med mutasjon i posisjon 61 og den tilsvarende normale p21-sekvensen. Table 2. RAS peptides with mutation in position 61 and the corresponding normal p21 sequence.

Biologiske eksperimenter: Biological experiments:

Vaksinasjon med en cocktail av ras-peptider i stedet for enkeltvis peptider øker effektiviteten av vaksinasjonen. Ved å sammenlikne de to typene vaksinasjonsregimer i grupper av kreftpasienter med kreft i bukspyttkjertelen eller kolorektal kreft, fant vi at andelen av pasientene som fikk en immunreaksjon er vesentlig høyere i grupper av kreftpasienter som vaksineres med en cocktail av muterte ras-peptider enn ved vaksinasjon med enkelte ras-peptider. Dette vises for pasienter med kolorektal kreft og kreft i bukspyttkjertelen henholdsvis i figur 1 og 2. Vaccination with a cocktail of ras peptides instead of individual peptides increases the effectiveness of vaccination. By comparing the two types of vaccination regimens in groups of cancer patients with pancreatic cancer or colorectal cancer, we found that the proportion of patients who received an immune reaction is significantly higher in groups of cancer patients vaccinated with a cocktail of mutated ras peptides than when vaccinated with certain ras peptides. This is shown for patients with colorectal cancer and pancreatic cancer respectively in figures 1 and 2.

I figur 1 sammenliknes resultatene fra to kliniske tester med vaksinasjon av kolorektale kreftpasienter med ras-peptider mutert i posisjon 12 og/eller posisjon 13.1 den ene testen ble pasientene vaksinert med et eneste mutert ras-peptid, enten sekvens-id. nr. 2, 3,4, 6 eller 7, og i den andre testen ble en cocktail av alle de fem muterte ras-peptidene brukt til vaksinasjonen. Av pasientene som ble vaksinert med et eneste peptid fikk 52% (14 av 27 vaksinerte pasienter) en immunreaksjon, og av pasientene som fikk cocktailen av de fem peptidene var andelen som fikk en immunreaksjon 67% (18 av de 23 vaksinerte pasientene). Det ene peptidet ble innsprøytet under huden til Dukes B- og C-pasienter sammen med GM-CSF (30 mg) i to serier, først 4 injeksjoner av 100 mg peptid med en ukes mellomrom mellom hver dose, og så, fire uker etter den siste injeksjonen ble det gitt 4 x 300 mg, igjen med en uke mellom hver dose på 300 mg. Cocktailen med de fem peptidene ble gitt til Dukes C- og D-pasienter sammen med GM-CSF (30 mg) som fire injeksjoner av 500 mg cocktail (100 mg av hver peptid) med en uke mellom hver injeksjon for 15 av pasientene, og som fire injeksjoner med 2000 mg cocktail (400 mg av hvert peptid) for 12 av pasientene. Antall pasienter som fikk reaksjoner var 10 i gruppen som fikk den lave dosen (67%) og 8 i gruppen som fikk høy dose (67%). Det må bemerkes at pasientgruppen som fikk vaksinasjon med et eneste peptid overveiende besto av pasienter som var i bedre klinisk tilstand (hovedsakelig opererte kreftpasienter i Dukes trinn B og C), mens pasientgruppen som fikk vaksinecocktailen hovedsakelig inneholdt pasienter med fremskreden sykdom (Dukes trinn D, med levermetastaser, som ikke reagerte på kjemoterapi/strålebehandling). Det er tenkelig at tilstanden av immunsystemet i den sistnevnte gruppen var dårligere enn i den første, siden både forutgående behandling (cytostatika og stråling) og stor svulstbyrde kan hemme immunfunksjonene betydelig. Derfor var det svært uventet for oss at antallet som fikk reaksjoner på vaksinen var høyere i gruppen med fremskreden sykdom. Figure 1 compares the results from two clinical tests with vaccination of colorectal cancer patients with ras peptides mutated in position 12 and/or position 13. In one test, the patients were vaccinated with a single mutated ras peptide, either sequence ID. No. 2, 3,4, 6 or 7, and in the second test a cocktail of all five mutated ras peptides was used for the vaccination. Of the patients who were vaccinated with a single peptide, 52% (14 of 27 vaccinated patients) had an immune reaction, and of the patients who received the cocktail of the five peptides, the proportion who got an immune reaction was 67% (18 of the 23 vaccinated patients). One peptide was injected subcutaneously in Duke's B and C patients together with GM-CSF (30 mg) in two series, first 4 injections of 100 mg peptide with a week interval between each dose, and then, four weeks after the the last injection was given 4 x 300 mg, again with a week between each dose of 300 mg. The cocktail of the five peptides was given to Duke's C and D patients together with GM-CSF (30 mg) as four injections of 500 mg cocktail (100 mg of each peptide) with one week between each injection for 15 of the patients, and as four injections of 2000 mg cocktail (400 mg of each peptide) for 12 of the patients. The number of patients who experienced reactions was 10 in the group receiving the low dose (67%) and 8 in the group receiving the high dose (67%). It should be noted that the group of patients receiving vaccination with a single peptide consisted predominantly of patients in better clinical condition (mainly operated cancer patients in Duke's stages B and C), while the group of patients receiving the vaccine cocktail mainly contained patients with advanced disease (Duke's stage D, with liver metastases, which did not respond to chemotherapy/radiotherapy). It is conceivable that the state of the immune system in the latter group was worse than in the first, since both prior treatment (cytostatics and radiation) and a large tumor burden can significantly inhibit immune functions. It was therefore very unexpected for us that the number who had reactions to the vaccine was higher in the group with advanced disease.

Økte doser førte ikke til noe høyere antall pasienter som reagerte, liksom økte doser av enkeltpeptidvaksinene for de samme pasientene heller ikke økte antallet pasienter som reagerte, og i to grupper med høy og lav dose av peptidcocktail var også andelen som reagerte den samme. Increased doses did not lead to any higher number of patients who responded, just as increased doses of the single peptide vaccines for the same patients did not increase the number of patients who responded either, and in two groups with high and low dose of peptide cocktail the proportion who responded was also the same.

I figur 2 sammenliknes resultatene fra to kliniske tester av vaksinasjon av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen med ras-peptider med mutasjon i posisjon 12.1 den ene testen ble pasienter som var operert for kreft i bukspyttkjertelen (Whippel-operasjon) vaksinert med et eneste mutert ras-peptid, enten sekvens-id. nr. 2, 3, 4 eller 6, og i den andre testen på pasienter med ikke-opererbar (terminal) kreft i bukspyttkjertelen ble en cocktail som inneholdt alle de fire muterte ras-peptidene brukt til vaksinasjonen. Igjen observerte vi at de pasientene med fremskreden sykdom som fikk vaksinecocktailen var i stand til å reagere på vaksinen til tross for sin svekkede kliniske tilstand, og overraskende fant vi at antall Figure 2 compares the results from two clinical tests of vaccination of patients with pancreatic cancer with ras peptides with mutation in position 12.1 In one test, patients who had surgery for pancreatic cancer (Whippel operation) were vaccinated with a single mutated ras- peptide, either sequence id. No. 2, 3, 4 or 6, and in the second test in patients with inoperable (terminal) pancreatic cancer, a cocktail containing all four mutated ras peptides was used for vaccination. Again, we observed that those patients with advanced disease who received the vaccine cocktail were able to respond to the vaccine despite their weakened clinical condition, and surprisingly, we found that the number

pasienter som reagerte var høyere i denne gruppen av pasienter med uopererte svulster enn hos de opererte i den andre gruppen som fikk enkeltpeptidvaksiner. Hos pasientene som ble patients who responded were higher in this group of patients with unoperated tumors than in those operated on in the other group that received single peptide vaccines. In the patients who stayed

vaksinert med et eneste peptid fikk 42% (5 av 12 vaksinerte pasienter) en immunreaksjon, og hos pasientene som fikk cocktailen med de fire peptidene var andelen med immunreaksjon 56% (19 av de 34 vaksinerte pasientene). Enkeltpeptidet ble sprøytet inn under huden på de tumoropererte pasientene sammen med GM-CSF (30 (ig) i seks injeksjoner på 100 (lg peptid med en uke mellom de første fire dosene, to uker mellom dose fire og fem og fire uker mellom dose fem og seks. Cocktailen på fire peptider ble gitt til ikke-opererbare pasienter sammen med GM-CSF (30 jig) i seks injeksjoner på 400 ug (100 [ Lg av hvert peptid) etter samme skjema som for enkeltpeptidene. vaccinated with a single peptide, 42% (5 of 12 vaccinated patients) had an immune reaction, and in the patients who received the cocktail with the four peptides, the proportion with an immune reaction was 56% (19 of the 34 vaccinated patients). The single peptide was injected under the skin of the tumor operated patients together with GM-CSF (30 (ig) in six injections of 100 (lg peptide with one week between the first four doses, two weeks between doses four and five and four weeks between dose five and six The cocktail of four peptides was given to inoperable patients together with GM-CSF (30 µg) in six 400 µg injections (100 µg of each peptide) following the same schedule as for the individual peptides.

Igjen observerte vi at de pasientene med fremskreden sykdom som fikk cocktailen var i stand til å reagere på vaksinen til tross for sin svekkede kliniske tilstand, og overraskende fant vi at andelen som reagerte også var høyere i pasientgruppen med uopererte svulster som fikk vaksinecocktail. Again, we observed that those patients with advanced disease who received the cocktail were able to respond to the vaccine despite their weakened clinical condition, and surprisingly, we found that the proportion who responded was also higher in the group of patients with unresectable tumors who received the vaccine cocktail.

De kombinerte resultatene som er gjengitt i figur 1 og 2 viser at vaksinecocktailen er bedre enn enkeltpeptidvaksiner og er svært effektiv også under kliniske forhold som ikke er gunstige for en immunreaksjon. The combined results presented in Figures 1 and 2 show that the vaccine cocktail is superior to single peptide vaccines and is highly effective even under clinical conditions that are not favorable for an immune response.

Dessuten viser figur 3 og 4 at ved å vaksinere med blandinger av ras-peptider er det mulig å stimulere T-celler til å reagere mot alle de forskjellige peptidene i blandingen. Furthermore, Figures 3 and 4 show that by vaccinating with mixtures of ras peptides it is possible to stimulate T cells to react against all the different peptides in the mixture.

Figur 3 viser forskjellige reaksjonsmønstre hos fire pasienter med kolorektalt adenokarsinom som var vaksinert med en cocktail av fem forskjellige ras-peptider mutert i posisjon 12 og 13, sekvens-id. nr. 2, 3, 4, 6 og 7. Peptidcocktailen ble sprøytet inn under huden på pasienter med kolorektalt adenokarsinom sammen med GM-CSF (30 (xg) i fire ukentlige injeksjoner på 0,5 mg peptidcocktail. T-cellereaksjonene ble testet i prøver fra før og etter vaksinasjonene etter en stimulering utenfor kroppen. Alle fire pasientene viste også utvikling av en positiv DTH-reaksjon på vaksinecocktailen. Resultatene i figur 3 ble Figure 3 shows different reaction patterns in four patients with colorectal adenocarcinoma who were vaccinated with a cocktail of five different ras peptides mutated in positions 12 and 13, sequence ID. Nos. 2, 3, 4, 6 and 7. The peptide cocktail was injected subcutaneously in patients with colorectal adenocarcinoma together with GM-CSF (30 (xg) in four weekly injections of 0.5 mg peptide cocktail. The T-cell responses were tested in samples from before and after the vaccinations after an extracorporeal stimulation. All four patients also showed the development of a positive DTH reaction to the vaccine cocktail. The results in Figure 3 were

oppnådd ved hjelp av standard proliferasjonsassays og peptider med sekvens-id. nr. 2, 3,4, 6, 7 og 8 (normaltypen). Resultatene viser at en pasient fikk en immunreaksjon mot alle de fem peptidene i cocktailen, mens de tre andre pasientene fikk en immunreaksjon mot fire av de fem peptidene som ble brukt i vaksinen. obtained using standard proliferation assays and peptides with sequence id. no. 2, 3,4, 6, 7 and 8 (the normal type). The results show that one patient had an immune reaction against all five peptides in the cocktail, while the other three patients had an immune reaction against four of the five peptides used in the vaccine.

Siden reaktiviteten med normaltypepeptidet ikke ble observert i blodprøvene som ble tatt før vaksinasjonen, men bare i prøver fra etter vaksinasjonen (pasient 2 og 3), og siden peptidet med sekvens-id. nr. 8 ikke var med i vaksineblandingen må denne reaktiviteten stamme fra stimulering av kloner av T-celler med evne til å reagere både med den normale ras-sekvensen og sekvenser som inneholder noen av de aminosyresubstitusjonene som ble innført ved mutasjonen. Ikke i noe tilfelle ble sidereaksjoner som tydet på en autoimmun reaksjon observert hos pasienter som viste en slik kryss reaktivitet. Dette kan ha forbindelse med det faktum at nivået av uttrykkingen av p21 ras i svulster er høyere enn i tilsvarende ikke-omdannet vev. Since the reactivity with the normal-type peptide was not observed in the blood samples taken before vaccination, but only in samples from after vaccination (patients 2 and 3), and since the peptide with sequence id. no. 8 was not included in the vaccine mixture, this reactivity must originate from stimulation of clones of T cells with the ability to react both with the normal ras sequence and sequences containing some of the amino acid substitutions introduced by the mutation. In no case were side reactions suggestive of an autoimmune reaction observed in patients who showed such cross-reactivity. This may be related to the fact that the level of expression of p21 ras in tumors is higher than in corresponding non-transformed tissues.

I figur 4 vises de forskjellige T-cellereaksjonene mot individuelle muterte ras-peptider med sekvens-id. nr. 2, 3,4 og 6 for to uopererte pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. T-cellereaksjonene ble undersøkt utenfor kroppen i perifere mononukleære blodceller (PBMC). Her ble PBMC fra de to pasientene testet mot de 4 enkelte mutantpeptidene (sekvens-id. nr. 2, 3, 4 og 6) og det normale ras-peptidet (sekvens-id. nr. 8) etter en stimulering utenfor kroppen. PBMC ble i kort tid utsådd med lx IO6 pr. brønn i 24-brønnersplater (Costar) med 25 \ iM av det enkelte muterte ras-peptidet eller blandingen av muterte ras-peptider i 1 ml RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) substituert med 15% varmeinaktivert humant serum. Etter tre dagers kultur ble mediene supplementert med 10 U/ml IL-2 (Amersham). Kulturcellene (5xl0<4> / brønn) ble testet etter 9 - 12 dager for spesifikk proliferasjonskapasitet mot enkelte muterte ras-peptider/peptidblanding og normalt ras-peptid ved en konsentrasjon på 25 |iM, med eller uten IL-2 (1 U/ml), ved å bruke autologisk, bestrålt (30 Gy) PMBC (5xl0<4> celler brønn) som APC. Formeringen ble målt dag 3 etter inkubasjon over natten med <3>H-tymidin 3,7xl0<4> Bq/brønn (Amersham). Verdiene er gitt som gjennomsnittlige tellinger pr. minutt (cpm) fra triplikater. En antigenspesifikk reaksjon ble ansett for positiv hvis stimuleringsindeksen (SI) (reaksjon med antigen dividert med reaksjon uten antigen) var over 2. Begge pasientene fikk en immunreaksjon mot alle underkomponentene av vaksinen (sekvens-id. nr. 2, 3, 4 og 6). Figure 4 shows the different T-cell reactions against individual mutated ras peptides with sequence ID. Nos. 2, 3, 4 and 6 for two unoperated patients with pancreatic cancer. The T cell responses were examined outside the body in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Here, PBMC from the two patients were tested against the 4 individual mutant peptides (sequence ID no. 2, 3, 4 and 6) and the normal ras peptide (sequence ID no. 8) after stimulation outside the body. PBMC were briefly seeded with lx IO6 per well in 24-well plates (Costar) with 25 µM of the individual mutated ras peptide or the mixture of mutated ras peptides in 1 ml of RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) substituted with 15% heat-inactivated human serum. After three days of culture, the media were supplemented with 10 U/ml IL-2 (Amersham). The cultured cells (5x10<4> / well) were tested after 9 - 12 days for specific proliferation capacity against individual mutated ras peptides/peptide mixture and normal ras peptide at a concentration of 25 µM, with or without IL-2 (1 U/ ml), using autologous, irradiated (30 Gy) PMBC (5xl0<4> cells well) as APC. Proliferation was measured on day 3 after overnight incubation with <3>H-thymidine 3.7x10<4> Bq/well (Amersham). The values are given as average counts per minute (cpm) from triplicates. An antigen-specific reaction was considered positive if the stimulation index (SI) (reaction with antigen divided by reaction without antigen) was above 2. Both patients developed an immune reaction against all subcomponents of the vaccine (Sequence ID no. 2, 3, 4 and 6 ).

Figur 5 viser reaktiviteten av perifere T-celler fra en pasient med kolorektal adenokarsinom etter vaksinasjon. Pasienten fikk en vaksinasjon med en cocktail av syv forskjellige ras-peptider med mutasjoner i posisjon 12 og 13, sekvens-id. nr. 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7. Peptidcocktailen ble sprøytet inn under huden til en pasient med fremskreden kolorektal kreft (Dukes D) sammen med GM-CSF (30 ug) i fire ukentlige injeksjoner av 0,7 mg peptidcocktail på fire forskjellige steder. Resultatene viser at det er dannet T-celler som reagerer med fem av de forskjellige ras-mutasjonene, men det er ikke noen felles reaktivitet overfor normalt ras. T-cellereaksjonene ble undersøkt som beskrevet ovenfor. PBMC ble testet i kort tid etter en stimulering in vitro i standard proliferasjonsassays med peptider som hadde sekvens-id. nr. 1, 2, 3,4, 5, 6, 7 og 8 (normaltypen). Figure 5 shows the reactivity of peripheral T cells from a patient with colorectal adenocarcinoma after vaccination. The patient received a vaccination with a cocktail of seven different ras peptides with mutations in positions 12 and 13, sequence ID. Nos. 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7. The peptide cocktail was injected subcutaneously into a patient with advanced colorectal cancer (Dukes D) together with GM-CSF (30 µg) in four weekly injections of 0.7 mg peptide cocktail at four different sites. The results show that T cells have been formed that react with five of the different ras mutations, but there is no common reactivity towards normal ras. The T cell responses were examined as described above. PBMC were tested shortly after stimulation in vitro in standard proliferation assays with peptides having sequence ID. Nos. 1, 2, 3,4, 5, 6, 7 and 8 (the normal type).

Videre er det påvist at vaksinasjon med cocktails av ras-peptider gir T-celler som er kryss reaktive for de forskjellige ras-mutasjonene. Dette er påvist i figurene 6,7 og 8. Furthermore, it has been demonstrated that vaccination with cocktails of ras peptides produces T cells that are cross-reactive for the various ras mutations. This is demonstrated in Figures 6, 7 and 8.

Figur 6 viser reaktiviteten av tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) etter vaksinasjon av en pasient med fremskreden kreft i bukspyttkjertelen. Pasienten fikk en vaksinasjon med en cocktail som besto av fire forskjellige ras-peptider mutert i posisjon 12, sekvens-id. nr. 2, 3, 4 og 6. Peptidcocktailen ble sprøytet inn under huden til en pasient med fremskreden kreft i bukspyttkjertelen sammen med GM-CSF (30 |j,g) i seks injeksjoner på 0,4 mg peptidcocktail med en uke mellom de første fire dosene, to uker mellom dose fire og fem og fire uker mellom dose fem og seks. T-cellene stammet fra en tumorbiopsi tatt etter at pasienten var vellykket immunisert med peptidvaksinasjonen (positiv DTH-test). TIL-cellene ble ekspandert en hel del utenfor kroppen ved samkultur i rekombinant humant interleukin 2 (rIL2) og det ble påvist at de homogent uttrykte den samme T-cellereseptorkjeden Vp ved analyse med monoklonale antistoffer, noe som tydet på en den TIL-cellelinjen som var dannet var av monoklont opphav. Resultatene i figur 6 viser at TIL-cellelinjen reagerer med alle de fire forskjellige muterte ras-peptidene som fantes i vaksinecocktailen. TIL ble testet i standard proliferasjons assays med peptider av sekvens-id. nr. 2, 3, 4 og 6. Figure 6 shows the reactivity of tumor infiltrating lymphocytes (TIL) after vaccination of a patient with advanced pancreatic cancer. The patient received a vaccination with a cocktail consisting of four different ras peptides mutated at position 12, SEQ ID NO. Nos. 2, 3, 4 and 6. The peptide cocktail was injected subcutaneously into a patient with advanced pancreatic cancer along with GM-CSF (30 µg), in six injections of 0.4 mg peptide cocktail with one week between the first four doses, two weeks between dose four and five and four weeks between dose five and six. The T cells originated from a tumor biopsy taken after the patient had been successfully immunized with the peptide vaccination (positive DTH test). The TIL cells were extensively expanded outside the body by co-culture in recombinant human interleukin 2 (rIL2) and were shown to homogeneously express the same T-cell receptor chain Vp by analysis with monoclonal antibodies, suggesting a TIL cell line that was formed was of monoclonal origin. The results in Figure 6 show that the TIL cell line reacts with all four different mutated ras peptides that were present in the vaccine cocktail. TIL were tested in standard proliferation assays with peptides of sequence ID. no. 2, 3, 4 and 6.

Den brede kryss reaktiviteten med forskjellige ras-mutasjoner for ras-spesifikke T-celler som var dannet ved vaksinasjon med en blanding av ras-peptider, ble også påvist på et klonalt nivå. Figur 7 summerer opp spesifisiteten til fem T-cellekloner etter vaksinasjon av en pasient med fremskreden kreft i bukspyttkjertelen med en cocktail av fire forskjellige ras-peptider som var mutert i 12-posisjonen, sekvens-id. nr. 2, 3,4 og 6. Resultatene viser at T-celleklonene enten kan være strengt spesifikke for en enkelt ras-mutasjon som beskrevet før (TLC1, TLC2 og TLC4) eller reaktive for to eller flere forskjellige ras-mutasjoner (TLC4 og TLC5). Det var ikke noen TLC fra denne pasienten som viste tegn til kryss reaktivitet med normaltype-ras (sekv.-id. nr. 8). Peptidcocktailen ble gitt som beskrevet for figur 6. T-celleklonen kom fra blodprøver av pasienter som fikk en immunreaksjon til vaksinen ifølge en positiv forsinket overfølsomhetstest (DTH), ved kloning under begrensende fortynningsbetingelser. Resultatene i figur 7 ble oppnådd med standard proliferasjons assays og peptider med sekvens-id. nr. 2, 3, 4, 6 og 8 (normal). The broad cross-reactivity with different ras mutations for ras-specific T cells generated by vaccination with a mixture of ras peptides was also demonstrated at a clonal level. Figure 7 summarizes the specificity of five T cell clones after vaccination of a patient with advanced pancreatic cancer with a cocktail of four different ras peptides that were mutated at the 12 position, SEQ ID NO. Nos. 2, 3, 4 and 6. The results show that the T-cell clones can either be strictly specific for a single ras mutation as described before (TLC1, TLC2 and TLC4) or reactive for two or more different ras mutations (TLC4 and TLC5). There was no TLC from this patient that showed signs of cross-reactivity with normal-type ras (SEQ ID NO: 8). The peptide cocktail was provided as described for Figure 6. The T-cell clone came from blood samples of patients who had an immune reaction to the vaccine according to a positive delayed hypersensitivity (DTH) test, by cloning under limiting dilution conditions. The results in Figure 7 were obtained with standard proliferation assays and peptides with sequence ID. No. 2, 3, 4, 6 and 8 (normal).

Figur 8 viser hvor spesifikke T-cellekloner fra det perifere blodet blir etter vaksinasjon av melanom-pasienter med en cocktail av fire forskjellige ras-peptider med mutasjon i posisjon 61, sekvens-id. nr. 9, 10, 11 og 10. Resultatene viser at det dannes både T-celler som er strengt spesifikke for enkelte ras-mutasjoner og T-celler som er reaktive for to, tre eller fire forskjellige ras-mutasjoner ved vaksinasjon med denne peptidcocktailen. Ingen av de undersøkte T-celleklonene viste noen tegn til kryss reaktivitet med normalt ras. Peptidcocktailen ble innsprøytet under huden på tumoropererte pasienter sammen med GM-CSF (30 LLg) i seks injeksjoner på 0,32 mg peptidcocktail med en uke mellom de første fire dosene, to uker mellom dose fire og fem og fire uker mellom dose fem og seks. T-celleklonene kom fra blodprøver av pasienter som viste en immunreaksjon på vaksinen ifølge en positiv forsinket overfølsomhetstest (DTH), etter kultur av T-celler under begrensende fortynningsbetingelser. Resultatene i figur 8 ble oppnådd med standard proliferasjonsassays og peptider med sekvens-id. nr. 13, 14, 15, 16 og 17 (normaltype). Figure 8 shows how specific T-cell clones from the peripheral blood become after vaccination of melanoma patients with a cocktail of four different ras peptides with mutation in position 61, sequence ID. nos. 9, 10, 11 and 10. The results show that both T cells that are strictly specific for certain ras mutations and T cells that are reactive for two, three or four different ras mutations are formed when vaccinated with this peptide cocktail . None of the examined T-cell clones showed any signs of cross-reactivity with normal ras. The peptide cocktail was injected under the skin of tumor operated patients together with GM-CSF (30 LLg) in six injections of 0.32 mg peptide cocktail with one week between the first four doses, two weeks between doses four and five and four weeks between doses five and six . The T cell clones came from blood samples of patients who showed an immune reaction to the vaccine according to a positive delayed hypersensitivity (DTH) test, after culture of T cells under limiting dilution conditions. The results in Figure 8 were obtained with standard proliferation assays and peptides with sequence ID. No. 13, 14, 15, 16 and 17 (normal type).

Det som følger av dette er at også de ras-peptidene i de innsprøytede cocktailene som ikke svarte til den ras-mutasjonen som faktisk eksisterte i svulsten til pasientene, også danner T-celler som er klinisk relevante på grunn av kryss reaktiviteten. Kryss reaktive T-celler observeres aldri etter enkeltpeptidvaksinasjoner og ras-peptidcocktailer er en ny måte å ytterlig styrke en immunreaksjon mot ras-mutasjoner som er forbundet med kreft. Dataene våre viser at et flertall av pasientene som fikk en cocktail av muterte ras-peptider viser immunreaksjoner mot de fleste av subkomponentene i vaksinepreparatet. Dette er av meget stor betydning, og viser at det ikke er noen immunodominans mellom de forskjellige muterte ras-peptidene og at peptidene presenteres for T-celler av de fleste vanlige HLA-molekylene. Dermed kan kreftvaksiner som består av forskjellige muterte ras-peptider brukes kliniske med stor bredde uten at det er nødvendig å bestemme HLA-typen og ras-mutasjonen på forhånd. Hvis man bruker en cocktail av muterte peptider vil faktisk alle de klinisk relevante allment reaktive T-cellene dannes i pasienten. Resultatene i figur 6 som viser reaktivitet mot mutert ras hos tumorinfiltrerende lymfocytter som observeres i biopsiprøver etter peptid vaksinasjon er av stor betydning fordi de viser at allment reaktive T-celler er i stand til å lokalisere svulstområdet på stedet. What follows from this is that even the ras peptides in the injected cocktails that did not respond to the ras mutation that actually existed in the tumor of the patients also form T cells that are clinically relevant due to the cross-reactivity. Cross-reactive T cells are never observed after single peptide vaccinations and ras peptide cocktails are a new way to further enhance an immune response to ras mutations associated with cancer. Our data show that a majority of patients who received a cocktail of mutated ras peptides show immune reactions against most of the subcomponents of the vaccine preparation. This is of great importance, and shows that there is no immunodominance between the different mutated ras peptides and that the peptides are presented to T cells by most of the normal HLA molecules. Thus, cancer vaccines consisting of different mutated ras peptides can be used clinically with great breadth without it being necessary to determine the HLA type and the ras mutation in advance. If one uses a cocktail of mutated peptides, all the clinically relevant generally reactive T cells will actually be formed in the patient. The results in Figure 6 which show reactivity against mutated ras in tumor infiltrating lymphocytes observed in biopsy samples after peptide vaccination are of great importance because they show that generally reactive T cells are able to localize the tumor area on the spot.

Innsprøytning Injection

Peptidblandingen i henhold til denne oppfinnelsen kan gis til pasienten på den måten som beskrives i W092/14756. The peptide mixture according to this invention can be given to the patient in the manner described in WO92/14756.

Peptidblandingene i henhold til denne oppfinnelsen kan gis i en mengde som ligger i området fra 1 nanogram (1 ng) til 1 gram (1 g) til humane gjennomsnitts-pasienter eller individer som skal vaksineres. Det foretrekkes å bruke en dose i området 1 mikrogram (1 [ lg) til 1 milligram (1 mg) til hver innsprøytning. The peptide mixtures according to this invention can be administered in an amount ranging from 1 nanogram (1 ng) to 1 gram (1 g) to average human patients or individuals to be vaccinated. It is preferred to use a dose in the range of 1 microgram (1 µg) to 1 milligram (1 mg) for each injection.

Claims

1. Peptide mixture characterized in that it comprises at least two different peptides, where each peptide a) has an amino acid sequence like the natural p21 ras protein or is a fragment thereof except that the amino acid Gly in position 12 and/or 13, and/or the amino acid Gin in position 61 is replaced by any other amino acid; b) corresponds to, fully covers, or is a fragment of a processed fragment of an oncogene protein presented by a cancer cell or other antigen-presenting cells (APC); and c) induces specific T-cell responses against the actual oncogene protein fragment produced by the cell upon processing and which is presented in the HLA molecule.

2. Peptide mixture according to claim 1, characterized in that the peptides are selected independently from a group consisting of A and B: A) peptides which have sequence identity no. 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7 or fragments thereof, B) peptides having sequence identity no. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 and 16 or fragments thereof.

3. Peptide mixture according to any one of claims 1 or 2, characterized in that it comprises 4 different peptides.

4. Peptide mixture according to any one of claims 1 or 2, characterized in that it comprises 5 different peptides.

5. Peptide mixture according to any one of claims 1 or 2, characterized in that it comprises 7 different peptides.

6. A pharmaceutical composition comprising a peptide mixture as defined in claims 1-5, alone or together with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient and/or GM-CSF.

7. A cancer vaccine comprising a peptide mixture as defined in claims 1-5, alone or together with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient and/or GM-CSF.