NL9002696A

NL9002696A - METHOD AND KIT FOR PROVE MICRO-ORGANISMS.

Info

Publication number: NL9002696A
Application number: NL9002696A
Authority: NL
Original assignee: U Gene Research Bv
Priority date: 1990-11-15
Filing date: 1990-12-07
Publication date: 1992-06-01
Also published as: CA2095843A1; EP0630413A1; WO1992008805A1; JPH06502534A

Description

Titel: Werkwijze en kit voor het aantonen van microorganismenTitle: Method and kit for detecting microorganisms

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze en een kit voor het aantonen van microorganismen in een monster.The invention relates to a method and a kit for detecting microorganisms in a sample.

In klinische monsters (zoals urine, faeces, speeksel, sputum, serum, bloed, biopten, e.d.) of in voedingsmiddelen kunnen potentieel pathogene soorten bacteriën in geringe aantallen tussen grote aantallen van contaminerende andere soorten microorganismen aanwezig zijn. Voor het aantonen van deze potentieel pathogene bacteriën worden selectieve media gebruikt. Zo bestaat de klassieke methode voor het aantonen van Salmonella uit een kweken op Salmonella/Shiaella agar en verrijken in seleniet agar, gevolgd door een biochemische en serologische identificatie. Deze klassieke methode heeft belangrijke tekortkomingen, met name het feit dat hij veel tijd vraagt en arbeidsintensief is.In clinical samples (such as urine, faeces, saliva, sputum, serum, blood, biopsies, etc.) or in food, potentially pathogenic species of bacteria may be present in small numbers between large numbers of contaminating other types of microorganisms. Selective media are used to detect these potentially pathogenic bacteria. For example, the classic method of detecting Salmonella consists of growing on Salmonella / Shiaella agar and enriching it in selenite agar, followed by a biochemical and serological identification. This classic method has important shortcomings, in particular the fact that it takes a lot of time and is labor intensive.

In het Amerikaanse octrooischrift 4,677,055 wordt een variant van deze klassieke methode beschreven waarbij de te bepalen microorganismen eerst uit het monster worden geïsoleerd. Volgens deze variant wordt een biologisch medium waarin zich pathogene microorganismen met een specifieke antigene determinant bevinden, in contact gebracht met een magnetische gel waaraan tegen deze determinant gerichte antilichamen zijn gekoppeld. De magnetische partikels worden vervolgens met een magneetstaaf opgepikt en op een agar plaat geïnoculeerd waarbij een afdruk van ongeveer 1 cm doorsnede ontstaat. De agar plaat wordt geïncubeerd, zodat zich kolonies (even groot als de afdruk) kunnen vormen. Daarna kan bijv. een klassieke bacteriologische methode worden toegepast voor het identificeren van de bacteriën in de kolonie.United States Patent 4,677,055 describes a variant of this classic method in which the microorganisms to be determined are first isolated from the sample. According to this variant, a biological medium containing pathogenic microorganisms with a specific antigenic determinant is contacted with a magnetic gel to which antibodies directed against this determinant are coupled. The magnetic particles are then picked up with a magnetic rod and inoculated on an agar plate to produce a print of approximately 1 cm in diameter. The agar plate is incubated to allow colonies (the size of the print) to form. For example, a classical bacteriological method can then be used to identify the bacteria in the colony.

Inmiddels zijn ook bepalingsmethoden ontwikkeld waarbij met een enzyme immunoassay of een enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) gebruikmakend van polyklonale of monoklonale antilichamen de aanwezigheid van een bepaald type bacteriën, bijv. Salmonella, in klinische monsters of voedingsmiddelen wordt aangetoond. Dergelijke bepalingen nemen één a twee dagen minder in beslag, maar de te onderzoeken monsters moeten toch nog eerst in een groeimedium worden verrijkt voordat de feitelijke assay kan worden uitgevoerd. Daarnaast zijn aan de immunochemische detectie nog deze nadelen verbonden, dat verwante microorganismen moeilijk met antisera kunnen worden onderscheiden en dat een gevoeligheid van niet beter dan 106 cellen/ml kan worden gerealiseerd.Determination methods have also been developed in which an enzyme immunoassay or an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using polyclonal or monoclonal antibodies demonstrates the presence of a particular type of bacteria, eg Salmonella, in clinical samples or foods. Such assays take one to two days less, but the samples to be tested still need to be enriched in a growth medium before the actual assay can be performed. In addition, these disadvantages are associated with immunochemical detection, that related microorganisms are difficult to distinguish with antisera and that a sensitivity of no better than 106 cells / ml can be realized.

Ook in het hierboven genoemde Amerikaanse octrooischrift 4,677,055 wordt een immunologische techniek voor het bepalen van de identiteit van de bacteriën beschreven. Hiertoe wordt op korte afstand van de kolonies een putje in de agar gemaakt dat met een specifiek antiserum wordt gevuld. De kolonies worden gelyseerd. Diffusie van antigeen uit de kolonie en antilichaam uit het met antiserum gevulde putje leidt tot een immuunprecipitaat dat vervolgens aangekleurd kan worden. Deze procedure beslaat ongeveer twee dagen.Also in the above-mentioned U.S. Patent 4,677,055, an immunological technique for determining the identity of the bacteria is described. To this end, a well is made in the agar at a short distance from the colonies and filled with a specific antiserum. The colonies are lysed. Diffusion of colony antigen and antibody from the antiserum-filled well leads to an immunoprecipitate which can then be stained. This procedure takes about two days.

Een alternatieve, nieuwe benadering voor de detectie van microorganismen wordt geboden door het gebruik van de moderne DNA technologie. Wat snelheid en gevoeligheid betreft lijkt amplificatie van DNA sequenties met de PCR (polymerase chain reaction) onder toepassing van primers die voor een bepaald microorganisme (een bepaald genus, species of stam) specifiek zijn een veelbelovende mogelijkheid. Een belangrijk nadeel van de PCR techniek is evenwel dat de amplificatie van de target DNA sequentie geremd wordt door grote hoeveelheden van contaminerend DNA.An alternative, new approach to the detection of microorganisms is offered by the use of modern DNA technology. In terms of speed and sensitivity, amplification of DNA sequences with the PCR (polymerase chain reaction) using primers specific for a particular microorganism (a particular genus, species or strain) seems a promising possibility. An important drawback of the PCR technique, however, is that the amplification of the target DNA sequence is inhibited by large amounts of contaminating DNA.

Door Jansen et al., PNAS USA 87, 1990, 2867-2871, is een systeem voor het aantonen van het hepatitis A virus (HAV) beschreven waarin een 1.5 ml eppendorf buisje wordt bekleed (gecoat) met een monoklonaal antilichaam dat tegen het hepatitis A virus is gericht. Een faeces monster dat mogelijk het HAV bevat, wordt in het buisje gebracht en na een incubatie van een nacht wordt de suspensie weggewassen. Na toevoeging van een geschikte buffer volgt reverse transcriptie om het HAV RNA (HAV is een RNA virus) om te zetten in DNA dat vervolgens in een andere buffer aan een PCR wordt onderworpen.A system for detecting hepatitis A virus (HAV) in which a 1.5 ml eppendorf tube is coated (coated) with a monoclonal antibody against hepatitis has been described by Jansen et al., PNAS USA 87, 1990, 2867-2871. A virus is targeted. A faecal sample, which may contain the HAV, is placed in the tube and the suspension is washed away after overnight incubation. After adding an appropriate buffer, reverse transcription follows to convert the HAV RNA (HAV is an RNA virus) into DNA which is then subjected to PCR in another buffer.

Deze procedure duurt ongeveer 24 uur. Zijn voordeel schuilt in de combinatie van specificiteit van de antilichaam stap, gevoeligheid van de PCR en eenvoudige confirmatie van de specificiteit van de PCR produkten. Er zijn echter ook belangrijke nadelen aan deze methode verbonden, bijv. het feit dat hij niet gebruikt kan worden voor het aantonen van pathogene microorganismen zoals Salmonella bacteriën. Bij virale infecties doet zich, in tegenstelling tot bij bacteriële infecties, zelden of nooit het probleem voor van de aanwezigheid van nauwverwante soorten microorganismen. Opwerkingsprocedures voor bacteriëel gecontamineerde monsters teneinde ze geschikt te maken voor een PCR zijn nagenoeg niet beschikbaar.This procedure takes about 24 hours. Its advantage lies in the combination of specificity of the antibody step, sensitivity of the PCR and simple confirmation of the specificity of the PCR products. However, there are also significant drawbacks to this method, eg the fact that it cannot be used to detect pathogenic microorganisms such as Salmonella bacteria. Viral infections, unlike bacterial infections, rarely, if ever, present the problem of the presence of closely related types of microorganisms. Work-up procedures for bacterially contaminated samples to make them suitable for a PCR are virtually unavailable.

Wel is er een aantal protocollen beschreven voor PCR op reincultures. De bacteriën worden gepelleteerd in een centrifuge, opgenomen in water en gedurende 10 min op 95°C verwarmd, waarna proteinase K wordt toegevoegd en gedurende 10 min bij 55°C wordt geïncubeerd. Het proteinase wordt in 15 min bij 95°C geïnactiveerd, waarna RNase wordt toegevoegd en de incubatie gedurende 15 min bij 37°C wordt voortgezet.However, a number of protocols have been described for PCR on pure cultures. The bacteria are pelleted in a centrifuge, taken up in water and heated at 95 ° C for 10 min, after which proteinase K is added and incubated at 55 ° C for 10 min. The proteinase is inactivated at 95 ° C for 15 min, then RNase is added and incubation is continued at 37 ° C for 15 min.

Pas dan wordt de PCR reactie uitgevoerd (Barry et al., Biotechnology 8, 1990, 233-236).Only then is the PCR reaction performed (Barry et al., Biotechnology 8, 1990, 233-236).

In sommige gevallen wordt zelfs uitgegaan van DNA dat na lysis en proteinase K behandeling eerst nog opgezuiverd wordt via fenol extracties en eventueel CsCl gradiënten (Bernet et al., J. Clin. Microbiol. 27, 1989, 2492-2496; Wilson et al., J. Clin. Microbiol. 28, 1990, 1942-1946; Plikaytis et al., J. Clin. Microbiol. 28, 1990, 1913-1917).In some cases, it is even assumed that DNA is first purified after lysis and proteinase K treatment via phenol extractions and possibly CsCl gradients (Bernet et al., J. Clin. Microbiol. 27, 1989, 2492-2496; Wilson et al. J. Clin Microbiol. 28, 1990, 1942-1946; Plikaytis et al., J. Clin. Microbiol. 28, 1990, 1913-1917).

Extractie van viraal DNA uit biopten, serum of bloed verloopt via protocollen die vergelijkbaar zijn met de bovenstaand beschreven methode, waarbij DNA zuivering plaats vindt via fenol extracties en CsCl gradiënten (zie Kaneko et al., PNAS USA 86, 1989, 312-316; Maitland et al., Brit. J. Cancer 59, 1989, 698-703).Extraction of viral DNA from biopsies, serum or blood proceeds via protocols similar to the method described above, with DNA purification via phenol extractions and CsCl gradients (see Kaneko et al., PNAS USA 86, 1989, 312-316; Maitland et al., Brit J Cancer 59, 1989, 698-703).

In water waarin faecale besmetting (Enterobacteriaceae) kan hebben plaatsgevonden, is de monsteropwerking relatief eenvoudig omdat er weinig partikels en andere bacteriën aanwezig zijn. Twee centrifugatie stappen of een filtratie stap zijn dan ook voldoende. Uit de verkregen cellen wordt vervolgens DNA vrijgemaakt met behulp van lysis buffer. Aan de verkregen cellen wordt 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8.13), 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatine, 0.05 mg/ml proteinase K, 20 mM dithiothreitol en 1.8 μΜ SDS toegevoegd. Na 15 sec vortexen wordt het mengsel gedurende 1 tot 1.5 uur bij 37°C geïncubeerd, vervolgens wordt de proteinase K geïnactiveerd door 5 min verwarmen tot 80°C. Hierna wordt de PCR uitgevoerd (zie Atlas en Bej, in "PCR protocols; a guide to methods and applications", Innis, Gelfand, Sninsky en White eds, Academie Press, San Diego, 399-406).In water where faecal contamination (Enterobacteriaceae) may have taken place, the sample work-up is relatively simple because there are few particles and other bacteria present. Two centrifugation steps or a filtration step are therefore sufficient. DNA is then released from the obtained cells using lysis buffer. 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8.13), 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin, 0.05 mg / ml proteinase K, 20 mM dithiothreitol and 1.8 μΜ SDS are added to the obtained cells. After 15 sec vortexing, the mixture is incubated at 37 ° C for 1 to 1.5 hours, then the proteinase K is inactivated by heating to 80 ° C for 5 min. The PCR is then performed (see Atlas and Bej, in "PCR protocols; a guide to methods and applications", Innis, Gelfand, Sninsky and White eds, Academy Press, San Diego, 399-406).

Voor de isolatie van bacteriën uit grondmonsters wordt gebruik gemaakt van een aantal blending en centrifugatie stappen, gevolgd door een lysis stap en DNA zuivering via onder andere een CsCl gradiënt (Steffan en Atlas, Appl. Environm. Microbiol. 54, 1988, 2185-2191).For the isolation of bacteria from soil samples, a number of blending and centrifugation steps are used, followed by a lysis step and DNA purification via, inter alia, a CsCl gradient (Steffan and Atlas, Appl. Environm. Microbiol. 54, 1988, 2185-2191 ).

De uitvinding verschaft nu een werkwijze en kit waarmee het, in tegenstelling tot alle eerder voorgestelde technieken, mogelijk is om op een snelle, specifieke en gevoelige wijze microorganismen zoals bacteriën, schimmels en gisten aan te tonen in verschillende soorten van monsters.The invention now provides a method and kit which, in contrast to all previously proposed techniques, makes it possible to detect microorganisms such as bacteria, fungi and yeasts in different types of samples in a fast, specific and sensitive manner.

De uitvinding heeft in een eerste aspect betrekking op een werkwijze voor het aantonen van microorganismen in een monster, waarbij de te detecteren microorganismen uit het monster worden geïsoleerd met behulp van antilichamen met een specifieke affiniteit voor deze microorganismen en een vaste drager voor deze antilichamen, en vervolgens het DNA van de aldus geïsoleerde microorganismen wordt onderworpen aan een PCR waarin voor de aan te tonen microorganismen specifieke primers worden gebruikt.The invention relates in a first aspect to a method for detecting microorganisms in a sample, wherein the microorganisms to be detected are isolated from the sample using antibodies with a specific affinity for these microorganisms and a solid support for these antibodies, and the DNA of the microorganisms thus isolated is then subjected to a PCR using specific primers for the microorganisms to be detected.

In een tweede aspect heeft de uitvinding betrekking op een kit voor het aantonen van microorganismen in een monster, omvattende antilichamen met een specifieke affiniteit voor de te detecteren microorganismen, welke antilichamen gebonden zijn aan een vaste drager voor deze antilichamen of voorzien zijn van een middel met behulp waarmee ze aan een eveneens tot de kit behorende vaste drager voor de antilichamen kunnen worden gebonden, alsmede een set van voor de aan te tonen microorganismen specifieke primers voor een PCR.In a second aspect, the invention relates to a kit for detecting microorganisms in a sample, comprising antibodies with a specific affinity for the microorganisms to be detected, which antibodies are bound to a solid support for these antibodies or provided with an agent having by means of which they can be bound to a solid support for the antibodies also belonging to the kit, as well as a set of primers specific for the microorganisms to be detected for a PCR.

De werkwijze volgens de uitvinding is met name geschikt voor het aantonen van microorganismen die bestaan uit bacteriën, schimmels of gisten van een bepaald genus, een bepaald species, of een bepaalde stam, waarbij de combinatie van het gebruik van antilichamen met een specifieke affiniteit voor de te detecteren microorganismen om juist deze microorganismen uit het monster te isoleren en het gebruik van een set van voor de aan te tonen microorganismen specifieke primers voor een PCR om juist het DNA van deze microorganismen te amplificeren verzekert dat de methode bijv. bij bacteriën onderscheid kan maken tussen verschillende genera, of tussen verschillende soorten, of zelfs tussen verschillende stammen.The method according to the invention is particularly suitable for the detection of microorganisms consisting of bacteria, fungi or yeasts of a certain genus, a certain species, or a certain strain, in which the combination of antibodies with a specific affinity for the microorganisms to be detected to isolate precisely these microorganisms from the sample and the use of a set of primers specific for the microorganisms to be detected for a PCR to amplify precisely the DNA of these microorganisms ensures that the method can distinguish e.g. bacteria between different genera, or between different species, or even between different tribes.

De uitvinding is niet beperkt tot werkwijzen voor het aantonen van pathogene bacteriën in klinische monsters (zoals urine, faeces, sputum, speeksel, serum, bloed, biopten, enz.) of voedingsmiddelen, maar omvat ook werkwijzen om bijv. de voor de bereiding van consumabele produkten zoals brood, bier, wijn, kaas, yoghurt, e.d. gebruikte gisten en/of schimmels te kunnen identificeren. Bij voorkeur wordt de uitvinding echter benut voor het aantonen van pathogene bacteriën, hetgeen met de bestaande technieken niet op een bevredigende wijze mogelijk is. Zo is de uitvinding bijzonder geschikt voor het aantonen van microorganismen die bestaan uit bacteriën van een van de genera Salmonella. Klebsiella of Listeria. Mede in verband met de voorkeur voor toepassing van de uitvinding ter bepaling van bacteriën zal in de verdere beschrijving van de uitvinding gemakshalve vaak gesproken worden over bacteriën, zonder dat daarmee beoogd wordt om de uitvinding in dit opzicht te beperken.The invention is not limited to methods for detecting pathogenic bacteria in clinical specimens (such as urine, faeces, sputum, saliva, serum, blood, biopsies, etc.) or foods, but also includes methods for e.g. to identify consumable products such as bread, beer, wine, cheese, yoghurt, etc. used yeasts and / or fungi. Preferably, however, the invention is used to detect pathogenic bacteria, which is not satisfactorily possible with existing techniques. Thus, the invention is particularly suitable for detecting microorganisms consisting of bacteria from one of the genera Salmonella. Klebsiella or Listeria. Partly in connection with the preference for the use of the invention for the determination of bacteria, the further description of the invention will, for the sake of convenience, often refer to bacteria, without the aim of limiting the invention in this respect.

Voor een optimaal betrouwbaar resultaat is nodig dat de voor de isolatie van de beoogde microorganismen te gebruiken antilichamen (bij voorkeur monoklonale antilichamen) in staat zijn om met nog levende bacteriën te reageren, d.w.z. een specifieke affiniteit hebben voor en kunnen binden aan de nog levende bacteriën. Het zijn immers met name de nog levende bacteriën die DNA bevatten en de uiteindelijke detectie vindt bij de werkwijze volgens de uitvinding plaats aan de hand van het bacteriële DNA.For an optimal reliable result it is necessary that the antibodies to be used for the isolation of the target microorganisms (preferably monoclonal antibodies) are able to react with living bacteria, ie have a specific affinity for and can bind to the living bacteria . After all, it is in particular the still-living bacteria that contain DNA and the ultimate detection takes place in the method according to the invention on the basis of the bacterial DNA.

Volgens de uitvinding heeft het derhalve de voorkeur dat voor de isolatie van de aan te tonen microorganismen uit het monster monoklonale antilichamen worden gebruikt die opgewekt zijn tegen het levende microorganisme, d.w.z. dat het als bron voor de antilichamen fungerende proefdier (meestal een muis) met de levende bacteriën (althans bacteriën die deze toestand dicht benaderen) is geïmmuniseerd. In het geval van voor de muis niet-pathogene humane virussen zoals het HAV is dit geen al te groot probleem, maar in het geval van bijv. Salmonella bacteriën die ook voor de muis pathogeen zijn, lijkt zo'n immunisatie niet mogelijk.According to the invention, it is therefore preferable that monoclonal antibodies raised against the living microorganism, ie the source of the antibodies (usually a mouse) containing the antibodies to be detected, are used for the isolation of the microorganisms to be detected from the sample. live bacteria (at least bacteria that closely approximate this condition) has been immunized. In the case of human non-pathogenic human viruses such as the HAV, this is not too great a problem, but in the case of, for example, Salmonella bacteria that are also pathogenic in the mouse, such immunization does not seem possible.

Alle tot nog toe beschreven monoklonale antilichamen tegen Salmonella reageren alleen met dode bacteriën, hetgeen betekent dat het monster waarin de bacteriën zitten eerst opgekookt moet worden. Dit geldt algemeen voor alle momenteel ter beschikking staande immunologische assays voor de detectie van Salmonella. Koken van deze bacteriën heeft echter tot gevolg dat zij lyseren en hun DNA inhoud verliezen. Een PCR is dan natuurlijk niet meer mogelijk.All previously described monoclonal antibodies against Salmonella only react with dead bacteria, which means that the sample containing the bacteria must first be boiled. This generally applies to all currently available immunological assays for the detection of Salmonella. Cooking these bacteria, however, causes them to lyse and lose their DNA content. A PCR is then of course no longer possible.

De bestaande immunisatie methodieken kunnen dus niet worden gebruikt indien men monoklonale antilichamen tegen nog levende pathogene bacteriën in handen wil krijgen. Daarvoor zijn twee duidelijke redenen aan te wijzen. Allereerst worden adjuvantia gebruikt om een immuunrespons te verkrijgen. Deze adjuvantia hebben echter als nadeel dat de natieve eiwitten van het organisme in het adjuvans denatureren waardoor vele epitopen vernietigd worden. Er worden op deze manier dan ook vooral monoklonale antilichamen verkregen die reageren met delen van de eiwitten die niet van struktuur veranderen na behandeling met of opname in een adjuvans (zie Luk et al., J.The existing immunization methods can therefore not be used if one wants to acquire monoclonal antibodies against living pathogenic bacteria. There are two clear reasons for this. First of all, adjuvants are used to obtain an immune response. However, these adjuvants have the drawback that the native proteins of the organism denature in the adjuvant, destroying many epitopes. In this way, mainly monoclonal antibodies are obtained that react with parts of the proteins that do not change structure after treatment with or incorporation into an adjuvant (see Luk et al., J.

Immunol. Meth. 129, 1990, 243-250; Mason Smith en Potter, J. Immunol. 114, 1975, 1847-1850; Feng et al., J. Gen. Microbiol. 136, 1990, 337-342).Immunol. Meth. 129, 1990, 243-250; Mason Smith and Potter, J. Immunol. 114, 1975, 1847-1850; Feng et al., J. Gen. Microbiol. 136, 1990, 337-342).

Op de tweede plaats is immunisatie met natieve organismen in principe onmogelijk in gevallen dat het organisme pathogeen is voor het te immuniseren dier. Om dit probleem te omzeilen gebruikt men in de praktijk voor de immunisatie veelal eiwitten van het organisme in geïsoleerde vorm. De eiwitten wekken echter een zeer zwakke immuunrespons op, om welke reden de zorgvuldig geïsoleerde eiwitten meestal tegelijk met een adjuvans worden ingespoten (zie Sadallah et al., J. Infect. Dis. 161, 1990, 59-64). Door een gehele denaturatie van het organisme of de geïsoleerde eiwitten worden de antigenen veel immunogener. Door de behandelingen met adjuvantia of andere denaturatie methoden gaan echter veel conformatie epitopen verloren. Het aldus geprikkelde immuunsysteem zal daarom geen immuunrespons opleveren tegen dergelijke conformatie epitopen. Op levende bacteriën komen echter vooral conformatie epitopen voor omdat deze de voedselvoorziening en beweging van het organisme verzorgen.Secondly, immunization with native organisms is in principle impossible in cases where the organism is pathogenic to the animal to be immunized. To circumvent this problem, proteins of the organism in isolated form are often used for the immunization in practice. However, the proteins elicit a very weak immune response, which is why the carefully isolated proteins are usually injected simultaneously with an adjuvant (see Sadallah et al., J. Infect. Dis. 161, 1990, 59-64). Antigen becomes much more immunogenic due to complete denaturation of the organism or the isolated proteins. However, due to treatments with adjuvants or other denaturation methods, many conformational epitopes are lost. The immune system thus challenged will therefore not produce an immune response against such conformational epitopes. However, conformational epitopes mainly occur on living bacteria because they provide the food supply and movement of the organism.

Volgens de uitvinding zijn voor dit probleem meerdere oplossingen gevonden. Om toch een immuunrespons te verkrijgen tegen de natieve epitopen wordt volgens de uitvinding geïmmuniseerd met levende bacteriën of bacteriën die deze status zo dicht mogelijk benaderen. Volgens één methode worden de bacteriën samen met een antibioticum in het proefdier ingespoten en wel zodanig dat het bereikte bacteriostatische effect een expositie van de in zijn groei geremde maar nog wel levende bacterie aan het immuunsysteem toelaat. Volgens een tweede methode om een immuunrespons tegen levende bacteriën te verkrijgen wordt de bacteriestam behandeld met een lage concentratie formaline. Hierdoor wordt waarschijnlijk de opname van de bacteriën door fagocyten (pathogene bacteriën worden vaak door fagocyten opgenomen om vervolgens onzichtbaar voor het immuunsysteem intracellulair verder te leven) dermate belemmerd dat expositie aan cellen van het immuunsysteem kan plaatsvinden.According to the invention, several solutions have been found for this problem. In order nevertheless to obtain an immune response against the native epitopes, immunization is carried out according to the invention with live bacteria or bacteria that approach this status as closely as possible. According to one method, the bacteria are injected into the test animal together with an antibiotic, such that the bacteriostatic effect achieved allows the immune system to exhibit the growth-inhibited but still living bacteria. According to a second method of obtaining an immune response against living bacteria, the bacterial strain is treated with a low concentration of formalin. This is likely to hinder the uptake of the bacteria by phagocytes (pathogenic bacteria are often taken up by phagocytes and subsequently live invisibly intracellularly invisible to the immune system) so much that exposure to cells of the immune system can take place.

Het heeft dus volgens de uitvinding de voorkeur dat voor de bereiding van de monoklonale antilichamen gebruik is gemaakt van een immunisatie met het levende microorganisme in combinatie of na behandeling met (een groei van de bacterie remmende hoeveelheid) antibioticum of (een opname van de bacterie door fagocyten remmende hoeveelheid) formaldehyde.Thus, it is preferred according to the invention that for the preparation of the monoclonal antibodies, an immunization with the living microorganism has been used in combination or after treatment with (a growth inhibiting amount of the bacterium) antibiotic or (an uptake of the bacterium by phagocyte inhibitory amount of formaldehyde.

Volgens de uitvinding moeten de voor de isolatie van de aan te tonen microorganismen gebruikte antilichamen aan een vaste drager gebonden zijn of worden (eventueel na de reactie met de in het monster aanwezige microorganismen indien de antilichamen en vaste drager op een geschikte wijze zodanig zijn gemodificeerd dat zo'n latere koppeling tot stand kan worden gebracht, bijv. via een biotine/avidine systeem, een hapteen/anti-hapteen systeem, enz.). Hoewel de aard van de vaste drager in principe niet aan bijzondere beperkingen onderhevig is en de vaste drager bijv. uit inerte deeltjes van metaal, kunststof of glas kan bestaan die door centrifugeren van de rest van het monster kunnen worden afgescheiden, heeft het volgens de uitvinding zeer de voorkeur dat magnetische deeltjes worden gebruikt die zeer gemakkelijk met behulp van een magnetische kracht uit het monster kunnen worden opgepikt. Vergeleken met het gebruik van de wand van een buisje als vaste drager voor de antilichamen is bij gebruik van deeltjes en vooral magnetische deeltjes dankzij het goede contact met het monster veel minder tijd nodig om een optimale binding van microorganisme en antilichaam te realiseren.According to the invention, the antibodies used for the isolation of the microorganisms to be detected must be or be bound to a solid support (optionally after reaction with the microorganisms present in the sample if the antibodies and solid support have been suitably modified such that such later coupling can be accomplished, e.g., via a biotin / avidin system, a hapten / anti-hapten system, etc.). Although the nature of the solid support is not in principle subject to special limitations and the solid support may consist, for example, of inert particles of metal, plastic or glass which can be separated from the rest of the sample by centrifugation, it has according to the invention it is very preferred that magnetic particles are used which can be very easily picked up from the sample by means of a magnetic force. Compared to the use of the tube wall as a solid support for the antibodies, due to the good contact with the sample, the use of particles and especially magnetic particles requires much less time to realize an optimal binding of microorganism and antibody.

Het heeft dus volgens de uitvinding sterk de voorkeur dat als vaste drager voor de antilichamen, met behulp waarvan de aan te tonen microorganismen uit het monster worden geïsoleerd, magnetische deeltjes worden gebruikt. Liefst worden de aan te tonen microorganismen uit het monster geïsoleerd door aan het monster magnetische deeltjes toe te voegen waaraan monoklonale antilichamen met specifieke affiniteit voor de aan te tonen microorganismen zijn gebonden en na incubatie de magnetische deeltjes met, indien aanwezig, daaraan gebonden de aan te tonen microorganismen af te scheiden. Het heeft verder de voorkeur dat hierbij magnetische deeltjes met daaraan gebonden monoklonale antilichamen met specifieke affiniteit voor de aan te tonen microorganismen worden gebruikt die verkregen zijn door de monoklonale antilichamen te incuberen met magnetische deeltjes welke bekleed zijn met antilichamen met specifieke affiniteit voor de monoklonale antilichamen. Indien de monoklonale antilichamen bijv. van de muis afkomstige immunoglobulinen zijn, kunnen de magnetische deeltjes bekleed zijn met bijv. immunoglobulinen van de geit met specificiteit voor immunoglobulinen van de muis.It is therefore highly preferred according to the invention that magnetic particles are used as a solid support for the antibodies, by means of which the microorganisms to be detected are isolated from the sample. Most preferably, the microorganisms to be detected are isolated from the sample by adding to the sample magnetic particles to which monoclonal antibodies with specific affinity for the microorganisms to be detected are bound and, after incubation, the magnetic particles with, if present, bound to the show microorganisms to secrete. It is further preferred to use magnetic particles with attached monoclonal antibodies with specific affinity for the microorganisms to be detected, which are obtained by incubating the monoclonal antibodies with magnetic particles coated with antibodies with specific affinity for the monoclonal antibodies. For example, if the monoclonal antibodies are mouse-derived immunoglobulins, the magnetic particles may be coated with, e.g., goat immunoglobulins with specificity for mouse immunoglobulins.

Bacteriën en andere microorganismen vertonen het verschijnsel van aspecifieke binding of hechting aan vaste oppervlakken. Dit vormt met name een groot probleem indien het te onderzoeken monster naast de aan te tonen microorganismen, zoals Salmonella, ook andere soorten bacteriën bevat. Dit probleem wordt nog verder vergroot indien er een klein aantal van de aan te tonen microorganismen naast een grote overmaat van andere microorganismen aanwezig is, bijv. één Salmonella bacterie op een miljoen Escherichia coli bacteriën. In dat geval zal de in het Amerikaanse octrooischrift 4,677,055 beschreven methode falen doordat de Salmonella1s volkomen overgroeid worden door de aan de deeltjes hechtende Escherichia coli bacteriën. De onderhavige uitvinding lost dit probleem volledig op door de PCR als detectie methode te gebruiken. Deze verzekert door een juiste keuze van de primers specificiteit en een hoge gevoeligheid. Om deze gewenste eigenschappen te bereiken is het echter wel raadzaam de PCR uit te voeren aan het uit de cellen vrijgemaakte en van de vaste drager gescheiden DNA dat verkregen wordt door de bacteriën te lyseren (bijv. door verwarming op 60-100°C) en na centrifugeren de supernatant voor de PCR te gebruiken. Het heeft dus volgens de uitvinding de voorkeur dat uit de aan de magnetische deeltjes gebonden microorganismen het DNA wordt geïsoleerd en in afwezigheid van de magnetische deeltjes aan een PCR wordt onderworpen. Voor het overige stelt de uitvinding weinig eisen aan de monsteropwerking voor de PCR; gebruik van lysis buffer, fenol extracties en CsCl gradiënten zijn niet nodig, ook niet wanneer de werkwijze gericht is op het aantonen van bijv. Enterobacteriaceae of Listeria.Bacteria and other microorganisms show the phenomenon of nonspecific binding or adherence to solid surfaces. This is a particular problem if the sample to be examined contains other types of bacteria in addition to the micro-organisms to be detected, such as Salmonella. This problem is further exacerbated if a small number of the microorganisms to be detected are present in addition to a large excess of other microorganisms, eg one Salmonella bacterium on a million Escherichia coli bacteria. In that case, the method described in U.S. Patent 4,677,055 will fail because the Salmonella are completely overgrown by the Escherichia coli bacteria adhering to the particles. The present invention completely solves this problem by using the PCR as a detection method. This ensures specificity and high sensitivity through the correct choice of primers. However, to achieve these desirable properties, it is recommended to perform the PCR on the DNA released from the cells and separated from the solid support, which is obtained by lysing the bacteria (e.g., by heating at 60-100 ° C) and use the supernatant for the PCR after centrifugation. It is thus preferred according to the invention that the DNA is isolated from the microorganisms bound to the magnetic particles and subjected to a PCR in the absence of the magnetic particles. Otherwise, the invention makes few demands on sample work-up for the PCR; no use of lysis buffer, phenol extractions and CsCl gradients is necessary, even if the method is aimed at detecting, for example, Enterobacteriaceae or Listeria.

De PCR condities zijn op zichzelf aan de deskundige bekend (zie bijv. het Amerikaanse octrooischrift 4,683,202), evenals de daarvoor bruikbare soorten van DNA polymerase, zoals het veel toegepaste Taq DNA polymerase. De keuze van de primers is echter specifiek voor de onderhavige werkwijze: door deze keuze kan worden verzekerd dat de werkwijze specifiek is voor een bepaald genus, een bepaald species of zelfs een bepaalde stam van een microorganisme. Het vinden van geschikte primers is echter niet altijd even gemakkelijk. Dit blijkt bijv. een probleem te zijn indien men specificiteit voor een bepaald genus van bacteriën wil verzekeren, bijv. voor het genus Salmonella, d.w.z. indien men wil dat met de werkwijze alle soorten en stammen behorende tot het genus Salmonella worden herkend terwijl tot andere genera behorende bacteriën niet worden herkend. Het is bekend dat rRNA sequenties een grote mate van overeenstemming vertonen binnen een bepaald genus en daarvan is voor hybridisatie experimenten reeds gebruik gemaakt (zie EP-A-0 357 306; EP-A-0 277 237; WO 88/03957). Door Chen et al., FEMS Microb. Lett. 57, 1989, 19-24 is het gebruik van rRNA primers beschreven, echter om bacteriën in het algemeen aan te tonen. Het gebruik van rRNA primers is een door de uitvinding omvatte mogelijkheid, maar is niet in alle gevallen geschikt. Met name bij Salmonella blijkt er nl. toch een nogal sterke sequentie variatie voor te komen in de rRNA sequenties. Een geschikt alternatief is gevonden in de sequentie van de "oorsprong van DNA replicatie" van het bacteriële chromosoom (oriC). Van een aantal Enterobacteriaceae is de sequentie van oriC bekend (Kornberg in "Supplement to DNA replication", Freeman and Co., San Francisco). Deze oriC sequentie bestaat uit gebieden die tussen de Enterobacteriaceae geconserveerd zijn en gedeelten die variabel zijn. Onbekend was echter dat deze variabele gedeelten binnen bijv. het genus Salmonella geconserveerd zijn en dus als basis kunnen dienen voor primers voor een genus-specifieke PCR.The PCR conditions are known per se to those skilled in the art (see, e.g., U.S. Patent No. 4,683,202), as are the useful types of DNA polymerase, such as the widely used Taq DNA polymerase. However, the choice of primers is specific to the present method: this choice can ensure that the method is specific to a particular genus, species, or even a particular strain of a microorganism. Finding suitable primers is not always easy, however. This appears to be a problem, for example, if one wants to ensure specificity for a particular genus of bacteria, e.g. for the genus Salmonella, ie if one wants the method to recognize all species and strains belonging to the genus Salmonella while to other genera. associated bacteria are not recognized. RRNA sequences are known to show a high degree of similarity within a particular genus and have already been used for hybridization experiments (see EP-A-0 357 306; EP-A-0 277 237; WO 88/03957). By Chen et al., FEMS Microb. Lett. 57, 1989, 19-24, the use of rRNA primers has been described, however, to detect bacteria in general. The use of rRNA primers is a possibility encompassed by the invention, but is not suitable in all cases. Especially with Salmonella, it appears that a rather strong sequence variation does occur in the rRNA sequences. A suitable alternative has been found in the "origin of DNA replication" sequence of the bacterial chromosome (oriC). The sequence of oriC is known from a number of Enterobacteriaceae (Kornberg in "Supplement to DNA replication", Freeman and Co., San Francisco). This oriC sequence consists of regions conserved between the Enterobacteriaceae and sections that are variable. However, it was unknown that these variable parts are conserved within, for example, the genus Salmonella and can therefore serve as a basis for primers for a genus-specific PCR.

De uitvinding omvat dus werkwijzen waarbij in de PCR primers worden gebruikt die gebaseerd zijn op gedeeltes van een rRNA sequentie. Deze benadering is in de praktijk bruikbaar gebleken voor bijv. bacteriën van het genus Listeria.Thus, the invention encompasses methods using primers based on portions of an rRNA sequence in the PCR. This approach has proven useful in practice for e.g. bacteria of the genus Listeria.

Tevens omvat de uitvinding werkwijzen waarbij in de PCR primers worden gebruikt die gebaseerd zijn op gedeeltes van een sequentie van de oorsprong van DNA replicatie.The invention also encompasses methods using primers in the PCR based on portions of a sequence of the origin of DNA replication.

Een concreet voorbeeld daarvan vormt een werkwijze waarbij bacteriën van het genus Salmonella worden aangetoond en in de PCR gebruik wordt gemaakt van de volgende oligonucleotide primers: primer 1: 5'-TTATTAGGATCGCGCCAGGC-3' primer 2: 5'-AAAGAATAACCGTTGTTCAC-3'A concrete example of this is a method in which bacteria of the genus Salmonella are detected and the following oligonucleotide primers are used in the PCR: primer 1: 5'-TTATTAGGATCGCGCCAGGC-3 'primer 2: 5'-AAAGAATAACCGTTGTTCAC-3'

In een concreet uitvoeringsvoorbeeld zal deze toepassing van de uitvinding nader worden toegelicht.This application of the invention will be further elucidated in a concrete exemplary embodiment.

Een tweede voorbeeld wordt gevormd door een werkwijze waarbij bacteriën van het genus Klebsiella worden aangetoond en in de PCR gebruik wordt gemaakt van de volgende oligonucleotide primers: primer 1: 5'-CTTGTCTTGTGGATAAGTCA-3' primer 2: 5'-TCTTCTGTGGATAACTATGC-3 *A second example is a method in which bacteria of the genus Klebsiella are detected and the following oligonucleotide primers are used in the PCR: primer 1: 5'-CTTGTCTTGTGGATAAGTCA-3 'primer 2: 5'-TCTTCTGTGGATACTATGC-3 *

Proefondervindelijk is vastgesteld dat met deze primercombinatie en met Klebsiella-specifieke monoklonale antilichamen de werkwijze volgens de uitvinding selectief is voor bacteriën van het genus Klebsiellaf hetgeen een positieve uitslag betekent voor Klebsiella oxvtoca en Klebsiella pneumoniae en een negatieve uitslag betekent voor Escherichia coli. Citrobacter freundii. Serratia marcescens. Proteus mirabilis. Enterobacter cloacae en Enterobacter aeroqenes.It has been established experimentally that with this primer combination and with Klebsiella-specific monoclonal antibodies, the method according to the invention is selective for bacteria of the genus Klebsiellaf, which means a positive result for Klebsiella oxvtoca and Klebsiella pneumoniae and a negative result for Escherichia coli. Citrobacter freundii. Serratia marcescens. Proteus mirabilis. Enterobacter cloacae and Enterobacter aeroqenes.

Niet elke primer combinatie is echter bruikbaar en werkzaam in de PCR. Zo is vastgesteld dat voor het aantonen van Klebsiella de op de oriC sequentie gebaseerde primer combinatie: primer 1: 5'-CTTGTCTTGTGGATAAGTCA-3' primer 2·: 5'-AAGTATAACCGTTGCCTGA-3' onwerkzaam is.However, not every primer combination is useful and effective in the PCR. For example, it has been determined that for the detection of Klebsiella the primer combination based on the oriC sequence: primer 1: 5'-CTTGTCTTGTGGATAAGTCA-3 'primer 2: 5'-AAGTATAACCGTTGCCTGA-3' is ineffective.

In het hierna volgende voorbeeld is gebruik gemaakt van monoklonale antilichamen die aan levende Salmonella bacteriën kunnen binden. Hybridoma's die deze monoklonale antilichamen produceren, zijn op 28 november 1990 gedeponeerd bij het ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures), UK, onder de volgende nummers: ΜΑΒ 55-23-B7: ECACC 90112807 ΜΑΒ 70-2-2A: ECACC 90112808 ΜΑΒ 71-40-A1: ECACC 90112809The following example uses monoclonal antibodies that can bind to live Salmonella bacteria. Hybridomas producing these monoclonal antibodies were deposited on November 28, 1990 with ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures), UK, under the following numbers: ΜΑΒ 55-23-B7: ECACC 90112807 ΜΑΒ 70-2-2A: ECACC 90112808 -71-40-A1: ECACC 90112809

Voorbeeld PCR amplificatieExample PCR amplification

De PCR techniek werd gebruikt voor het amplificeren van een 160 bp lang gedeelte van de sequentie van de oorsprong van DNA replicatie. Daartoe werden primers gebruikt met een aan de oorsprong van replicatie van Salmonella typhimurium ontleende sequentie. Deze oligonucleotide primers werden gesynthetiseerd op een Pharmacia LKB Gene Assembler Plus Synthesizer onder toepassing van de fosforamidiet technologie. Na deprotectie en afsplitsing van de vaste drager werden de oligonucleotiden door chromatografie op NAP10 kolommen gezuiverd. De primers hadden de volgende sequenties: primer 1: 5'-TTATTAGGATCGCGCCAGGC-3' primer 2: 5'-AAAGAATAACCGTTGTTCAC-3'The PCR technique was used to amplify a 160 bp long portion of the DNA replication origin sequence. To this end, primers were used with a sequence derived from the origin of replication of Salmonella typhimurium. These oligonucleotide primers were synthesized on a Pharmacia LKB Gene Assembler Plus Synthesizer using the phosphoramidite technology. After deprotection and cleavage of the solid support, the oligonucleotides were purified by chromatography on NAP10 columns. The primers had the following sequences: primer 1: 5'-TTATTAGGATCGCGCCAGGC-3 'primer 2: 5'-AAAGAATAACCGTTGTTCAC-3'

De specificiteit van de set primers werd in een PCR aan 27 Salmonella stammen en 19 andere Enterobacteriaceae (geen Salmonella) getest (zie tabel A). Het PCR reactiemengsel (eindvolume 100 μΐ) bestond uit 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl2/ 0.001% (w/v) gelatine, 100 μΜ van elke dNTP, 0.5 μΜ van elke primer, 1.25 U Ampli-Taq polymerase (Cetus, Emeryville, CA, USA). De amplificatie werd uitgevoerd in 35 cycli op een Perkin-Elmer Thermocycle (Perkin-Elmer Instruments, Norwalk, CT, USA). Een cyclus bestond uit een denaturatie stap van 1 min bij 94°C, een primer annealing stap van 1 min bij 50°C en een extensie stap van 1 sec bij 72°C. Na amplificatie werd 15 ml van het monster aan electroforese op een 1.5% agarose gel onderworpen. Het DNA werd met ethidiumbromide gekleurd. Fragmenten die door knippen van lambda DNA met PstI waren verkregen, werden als lengtemerkers gebruikt (het lambda DNA en het restrictie endonuclease PstI waren, evenals de dNTPs, van Boehringer Mannheim, Duitsland afkomstig).The specificity of the set of primers was tested in PCR on 27 Salmonella strains and 19 other Enterobacteriaceae (no Salmonella) (see Table A). The PCR reaction mixture (final volume 100 μΐ) consisted of 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl2 / 0.001% (w / v) gelatin, 100 μΜ of each dNTP, 0.5 μΜ of each primer, 1.25 U Ampli-Taq polymerase (Cetus, Emeryville, CA, USA). Amplification was performed in 35 cycles on a Perkin-Elmer Thermocycle (Perkin-Elmer Instruments, Norwalk, CT, USA). One cycle consisted of a 1 min denaturation step at 94 ° C, a 1 min primer annealing step at 50 ° C and an extension step of 1 sec at 72 ° C. After amplification, 15 ml of the sample was electrophoresed on a 1.5% agarose gel. The DNA was stained with ethidium bromide. Fragments obtained by cutting lambda DNA with PstI were used as length markers (the lambda DNA and the restriction endonuclease PstI, like the dNTPs, were from Boehringer Mannheim, Germany).

Na de amplificatie werd niet alleen bij de Salmonella tvphimurium stammen, maar bij alle geteste Salmonella bacteriën een DNA fragment met de verwachte grootte gevonden. Daarentegen trad geen amplificatie op bij de geteste andere Enterobacteriaceae zoals Shigella. Escherichia coli. Citrobacter en Pseudomonas. Hieruit werd afgeleid dat de gekozen set van primers Salmonella-specifiek is.After amplification, a DNA fragment of the expected size was found not only in the Salmonella tvphimurium strains, but in all Salmonella bacteria tested. In contrast, no amplification occurred in the tested other Enterobacteriaceae such as Shigella. Escherichia coli. Citrobacter and Pseudomonas. From this it was deduced that the chosen set of primers is Salmonella specific.

Gevoeligheid en specificiteit van de werkwijzeSensitivity and specificity of the method

Een verdunningsreeks van Salmonella tvphimurium. welke variëerde van 5xl07 tot 5xl02 cellen/ml, werd (telkens 100 μΐ) in een werkwijze volgens de uitvinding getest. Als magnetic beads werden Magnisort M deeltjes (magnetisch chroomdioxide) van DuPont (Wilmington, DE, USA) gebruikt. Deze werden gecoat met immunoglobulinen van de geit die specifiek waren voor IgG en IgM van de muis. De binding van monoklonale antilichamen (van de subklasse IgM), gericht tegen Salmonella bacteriën, aan de magnetic beads geschiedde door supernatant van de hybridoma cultuur gedurende 5 min bij 35°C in een fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 1% gelatine (gPBS) met de gecoate magnetic beads te incuberen. De magnetische deeltjes werden met behulp van een magneet geïsoleerd, waarna de supernatant werd weggegooid.A dilution series of Salmonella tvphimurium. which ranged from 5x107 to 5x10 2 cells / ml was tested (100 µl each) in a method according to the invention. Magnisort M particles (magnetic chromium dioxide) from DuPont (Wilmington, DE, USA) were used as magnetic beads. These were coated with goat immunoglobulins specific for mouse IgG and IgM. The binding of monoclonal antibodies (of the subclass IgM), directed against Salmonella bacteria, to the magnetic beads was done by supernatant of the hybridoma culture for 5 min at 35 ° C in a phosphate buffered saline with 1% gelatin (gPBS) with the incubate coated magnetic beads. The magnetic particles were isolated using a magnet, after which the supernatant was discarded.

De testmonsters werden in gPBS gesuspendeerd en aan de magnetische deeltjes toegevoegd. Na een incubatie van 15 min bij 35°C werden de magnetische deeltjes met behulp van een magneet geïsoleerd en drie keer met gPBS gewassen. Na de laatste wasstap werden de magnetische deeltjes in aqua bidest geresuspendeerd.The test samples were suspended in gPBS and added to the magnetic particles. After a 15 min incubation at 35 ° C, the magnetic particles were isolated by magnet and washed three times with gPBS. After the final washing step, the magnetic particles were resuspended in aqua bidest.

Bij een poging om de PCR direct aan de met de magnetische deeltjes geëxtraheerde bacteriën uit te voeren, bleek dat de amplificatie door de magnetische deeltjes werd geremd. Daarom werden de monsters gedurende 5 min bij 100°C geïncubeerd om de bacteriecellen te vernietigen en kortstondig gecentrifugeerd, waarna een fractie van de supernatant (met daarin bacteriëel DNA) aan de PCR werd onderworpen. De PCR (35 DNA amplificatie cycli) werd uitgevoerd op de hierboven beschreven wijze.Attempting to perform the PCR directly on the bacteria extracted with the magnetic particles found that amplification was inhibited by the magnetic particles. Therefore, the samples were incubated for 5 min at 100 ° C to destroy the bacterial cells and centrifuged briefly, after which a fraction of the supernatant (containing bacterial DNA) was subjected to the PCR. The PCR (35 DNA amplification cycles) was performed as described above.

Als resultaat (niet getoond) werd gevonden dat met behulp van de werkwijze volgens de uitvinding een hoeveelheid cellen van 103 kon worden gedetecteerd. Om de efficiency van de binding van de Salmonella bacteriën aan de met de monoklonale antilichamen gekoppelde magnetische deeltjes te bepalen, werd de supernatant die na de incubatie met de bacteriën was verkregen eveneens aan de PCR onderworpen. Er werd geen amplificatie van de target DNA sequentie gevonden, waaruit kan worden afgeleid dat de binding van de Salmonella bacteriën aan de monoklonale antilichamen op de magnetische deeltjes vrijwel compleet was.As a result (not shown), it was found that an amount of 103 cells could be detected using the method of the invention. To determine the efficiency of the binding of the Salmonella bacteria to the magnetic particles coupled to the monoclonal antibodies, the supernatant obtained after incubation with the bacteria was also subjected to the PCR. No amplification of the target DNA sequence was found, from which it can be deduced that the binding of the Salmonella bacteria to the monoclonal antibodies on the magnetic particles was almost complete.

Bij verdere experimenten bleek dat de werkwijze volgens de uitvinding ook in staat was om 103 Salmonella bacteriën aan te tonen in een monster waarin tevens 107 niet-Salmonella bacteriën (Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa.Further experiments showed that the method according to the invention was also able to detect 103 Salmonella bacteria in a sample also containing 107 non-Salmonella bacteria (Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa.

Klebsiella oxytoca en Citrobacter freundii) aanwezig waren. In controle experimenten met Escherichia colir Pseudomonas aeruginosa. Klebsiella oxvtoca. Citrobacter freundii en gPBS werd geen detecteerbare amplificatie waargenomen.Klebsiella oxytoca and Citrobacter freundii) were present. In control experiments with Escherichia colir Pseudomonas aeruginosa. Klebsiella oxvtoca. Citrobacter freundii and gPBS no detectable amplification was observed.

TABEL A PCR amplificatie van Salmonella stammen en andereTABLE A PCR amplification of Salmonella strains and others

Enterobacteriaceae stammen PCR Salmonella amplificatie serogroepEnterobacteriaceae strains PCR Salmonella amplification serogroup

S. durazzo + AS. durazzo + A

S. clinical isolate Μ + AS. clinical isolate Μ + A

S. paratyphi A-0 + AS. paratyphi A-0 + A

S. typhimurium L + BS. typhimurium L + B

S. typhimurium 1724 + BS. typhimurium 1724 + B

S. typhimurium 14H + BS. typhimurium 14H + B

S. bredeny + BS. bredeny + B

S. derby + BS. derby + B

S. heidelberg + BS. heidelberg + B

S. brandenburg + BS. brandenburg + B

S. clinical isolate 10.2 + BS. clinical isolate 10.2 + B

S. saintpaul + BS. saintpaul + B

S. paratyphi B + BS. paratyphi B + B

S. abortus equi + BS. abortion equi + B

S. infantis + Cl S. newport + C2S. infantis + Cl S. newport + C2

S. belem + CS. belem + C

S. clinical isolate 859 + ClS. clinical isolate 859 + Cl

S. paratyphi C + CS. paratyphi C + C

S. panama + DS. panama + D

S. typhosa + DS. typhosa + D

S. enteriditis + DS. enteriditis + D

S. shargani + ES. shargani + E

S. give + ES. give + E

S. pretoria + FS. pretoria + F

S. atlanta + GS. atlanta + G

S. worthington + GS. worthington + G

Escherichia coli Escherichia coli 07K1 Klebsiella pneumonia 1.100 Klebsiella pneumonia 1.88 Klebsiella oxytoca Citrobacter freundii Citrobacter diversus Serratia liquefaciens Serratia marcescens Enterobacter agglomerans Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Morganella morganii Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Shigella flexneri Shigella dysenteriae Yersinia enteroliticaEscherichia coli Escherichia coli 07K1 Klebsiella pneumonia 1.100 Klebsiella pneumonia 1.88 Klebsiella oxytoca Citrobacter freundii Citrobacter diversus Serratia liquefaciens Serratia marcescens Enterobacter agglomerans Enterobacter aerogenerica yugiereria Shuggiaigellaella agarellaisellagellaasella gellausglaella

Claims

A method for detecting ant organisms in a sample, wherein the microorganisms to be detected are isolated from the sample using antibodies with a specific affinity for these microorganisms and a solid support for these antibodies, and then the DNA of the microorganisms thus isolated is subjected to a PCR (polymerase chain reaction) using specific primers for the microorganisms to be detected.

The method according to claim 1, wherein the microorganisms to be detected consist of bacteria, fungi or yeasts of a certain genus, a certain species, or a certain strain.

The method according to claim 1, wherein the microorganisms to be detected consist of bacteria of one of the genera Salmonella. Klebsiella or Listeria.

The method of claim 1, wherein monoclonal antibodies raised against the living microorganism are used to isolate the microorganisms to be detected from the sample.

A method according to claim 4, wherein for the preparation of the monoclonal antibodies, use has been made of an immunization with the living microorganism in combination or after treatment with (a growth inhibiting amount of bacteria) antibiotic or (an uptake of the bacterium by phagocytes inhibitory amount) of formaldehyde.

The method according to claim 1, wherein magnetic particles are used as the solid support for the antibodies, by means of which the microorganisms to be detected are isolated from the sample.

The method according to claim 1, wherein the microorganisms to be detected are isolated from the sample by adding to the sample magnetic particles to which monoclonal antibodies with specific affinity for the microorganisms to be detected are bound and after incubation the magnetic particles with, if present, bound to separate the microorganisms to be detected.

The method of claim 7, wherein magnetic particles with attached monoclonal antibodies with specific affinity for the microorganisms to be detected are obtained obtained by incubating the monoclonal antibodies with magnetic particles coated with antibodies with specific affinity for the monoclonal antibodies. .

The method of claim 1, wherein the DNA is isolated from the microorganisms bound to the magnetic particles and subjected to a PCR in the absence of the magnetic particles.

The method of claim 1, wherein primers based on portions of an rRNA sequence are used in the PCR.

The method of claim 1, wherein primers are used in the PCR based on portions of a sequence of the origin of DNA replication.

The method of claim 1, wherein bacteria of the genus Salmonella are detected and the following oligonucleotide primers are used in the PCR: primer 1: 5'-TTATTAGGATCGCGCCAGGC-3 'primer 2: 5'-AAAGAATAACCGTTGTTCAC-3'

The method of claim 1, wherein bacteria of the genus Klebsiella are detected and the following oligonucleotide primers are used in the PCR: primer 1: 5'-CTTGTCTTGTGGATAAGTCA-3 'primer 2: 51-TCTTCTGTGGATAACTATGC-3'

Kit for detecting microorganisms in a sample, comprising antibodies with a specific affinity for the microorganisms to be detected, which antibodies are bound to a solid support for these antibodies or provided with an agent by means of which they are also attached to a kit associated solid support for the antibodies can be bound, as well as a set of primers specific for the microorganisms to be detected for a PCR (polymerase chain reaction).

Kit according to claim 14, comprising monoclonal antibodies with specific affinity for the microorganisms to be detected, raised against the living microorganism.

The kit of claim 15, comprising monoclonal antibodies, prepared by immunization with the living microorganism in combination or after treatment with (a bacterial inhibitory amount) antibiotic or (phagocyte inhibitory amount of the bacterium) formaldehyde .

The kit of claim 14, comprising magnetic particles as the solid support for the antibodies.

Kit according to claim 17, comprising magnetic particles with attached monoclonal antibodies with specific affinity for the microorganisms to be detected, obtained by incubating the monoclonal antibodies with magnetic particles coated with antibodies with specific affinity for the monoclonal antibodies.

The kit of claim 14, comprising a set of primers for the PCR based on portions of an rRNA sequence.

The kit according to claim 14, comprising a set of primers for the PCR based on portions of a sequence of the origin of DNA replication. ►

The kit according to claim 14 for detecting bacteria of the genus Salmonella, comprising the following oligonucleotide primers for the PCR: primer 1: 5'-TTATTAGGATCGCGCCAGGC-3 'primer 2: 5'-AAAGAATAACCGTTGTTCAC-3'

Kit according to claim 14 for detecting bacteria of the genus Klebsiella. comprising the following oligonucleotide primers for the PCR: primer 1: 5'-CTTGTCTTGTGGATAAGTCA-3 'primer 2: 51-TCTTCTGTGGATAACTATGC-3'