NL1027360C2 - Werkwijze voor de bereiding van vernette enzymaggregaten met verbeterde eigenschappen. - Google Patents

Description

Werkwijze voor de bereiding van vernette enzymaggre-gaten met verbeterde eigenschappen

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van vernette enzymaggregaten.

Werkwijzen voor de bereiding van vernette enzymaggregaten zijn bekend in de techniek. Een dergelijke werkwijze 5 is bijvoorbeeld beschreven in EP 108888.7 Al.

Dergelijke bekende werkwijzen bieden een beperkte mogelijkheid eigenschappen te variëren, en leiden dientengevolge dikwijls tot vernette enzymaggregaten met eigenschappen, in het bijzonder activiteit en colloïdaal gedrag, die 10 niet optimaal zijn voor de uiteindelijke toepassing van de vernette enzymaggregaten.

Derhalve is het een doel van de onderhavige uitvinding een werkwijze voor de bereiding van vernette enzymaggregaten te verschaffen die een ruimere keuze aan reagentia mo-15 gelijk maakt en derhalve de mogelijkheid schept om enzymaggregaten te verkrijgen met verbeterde eigenschappen, in het . bijzonder activiteit en colloïdaal gedrag.

Hiertoe is de werkwijze volgens de onderhavige gekenmerkt door de volgende stappen: 20 i. het genereren van aldehydegroepen op al dan niet in een geschikt oplosmiddel opgeloste enzymmoleculen; ii. het precipiteren van de enzymmoleculen met een geschikt precipitatiemiddel; iii. het vernetten van de van aldehydegroepen voor-25 ziene, geprecipiteerde enzymmoleculen onder gebruikmaking van een amineverbinding onder oplevering van vernette enzymaggregaten met verbeterde eigenschappen.

Verrassenderwijs is gebleken dat door de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding toe te passen enzymaggrega-30 ten kunnen worden verkregen met verbeterde eigenschappen, in het bijzonder verbeterde activiteit en colloïdaal gedrag.

Dit wordt mogelijk gemaakt doordat het vernettings-middel uit twee componenten bestaat, te weten een aldehyde-component op het enzym en een apart toe te voegen aminecompo-35 nent die derhalve samen in vele verschillende combinaties 1027360 2 ; ] kunnen worden toegepast.

Bij voorkeur wordt stap i. van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding uitgevoerd door toevoeging van een i aldehydeverbinding. Deze kan een mono-, di- of polyaldehyde | 5 zijn, waarbij een monoaldehyde nog minstens 1 reactieve groep j dient te bezitten die in staat is om te reageren met het enzym onder oplevering van 1 of meerdere aldehydegroepen op het enzym.

Dergelijke aldehyden blijken goedkope en doelmatige 10 middelen voor het genereren van aldehydegroepen op een enzym- j

molecuul te zijn. I

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding wordt in de werkwijze volgens de uitvinding stap i. uitgevoerd door toevoeging van een geschikt oxidatie- | 15 middel. ;

Bovendien wordt het oxidatiemiddel bij voorkeur gekozen uit de groep van perjodaten van aardalkalimetalen, waarbij natriumperjodaat (NaIC>4) de meeste voorkeur verdient.

Wanneer stap i. van de werkwijze volgens de uitvin-20 ding (het genereren van aldehydegroepen op de enzymmoleculenj wordt uitgevoerd door toevoeging van een geschikt oxidatiemiddel, zoals NaIC>4, heeft dit als voordeel dat op specifieke plaatsen op het enzym aldehydegroepen worden gegenereerd en in het algemeen de enzymatische activiteit behouden blijft.

25 Daarnaast kunnen de zouten die hierbij ontstaan eenvoudig worden weggewassen tijdens een eventuele wasstap.

Voorts verdient het de voorkeur wanneer in stap iii. een reductiemiddel wordt toegevoegd.

Door toevoeging van een reductiemiddel worden vrije 30 aldehydegroepen van het enzym verbonden met de toegevoegde aminen.

! ·

Toevoeging van een reductiemiddel in stap iii. van de werkwijze volgens de uitvinding heeft als voordeel dat in i enkele minuten een vernetting tot stand komt, waardoor de be·*-35 réidingstijd in vergelijking met andere methoden korter is.

Daarnaast worden aldehyden die niet met een amine hebben gereageerd geïnactiveerd, waardoor ze niet in een later stadium alsnog kunnen reageren. Dit laatste is belangrijk omdat wordt 1027360 3 voorkomen dat de deeltjesgrootte van de vernette enzymaggre-gaten groter wordt dan 10 tot 50 micrometer. Het te groot worden van de deeltjes is nadelig voor de activiteit.

Bij voorkeur wordt het reductiemiddel gekozen uit de 5 groep van NaCNBH3 of NaBHa.

Deze reductiemiddelen bleken bijzonder geschikt te zijn.

Bij voorkeur wordt in stap iii. van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding ammonia gebruikt als amine-10 verbinding.

Tot dusverre was het gebruikelijk om slechts di- en polyamineverbindingen te beschouwen als vernettingsmiddelen voor vernette enzymaggregaten. De uitvinders hebben thans echter gevonden dat toepassing van ammonia als vernettings-15 middel vernette enzymaggregaten met gunstige eigenschappen oplevert. Bij het gebruik van ammonia als amineverbinding worden in het algemeen vernette enzymaggregaten verkregen die niet gekleurd zijn. De deeltjes zijn uniform en vormen kleine deeltjes die in water onmiddellijk, zonder extra mechanische 20 behandelingen zeer goed kunnen worden geresuspendeerd. Dit zorgt voor goede activiteit.

Het verdient verder de voorkeur wanneer in stap iii. van de werkwijze een diamine wordt gebruikt als amineverbinding.

25 Tot dusverre was het gebruikelijk om de lengte van de diamine als vernettingsmiddel in verband te zien met de activiteit van de daarmee verkregen vernette enzymdeeltjes.

Verrassenderwijs is thans gevonden dat doordat in de werkwijze volgens de uitvinding aldehydegroepen worden gege-30 nereerd, zonder dat hierbij vernetting optreedt, de toegepaste di- of polyamine specifiek kan worden gekozen teneinde bepaalde fysische eigenschappen van de vernette enzymaggregaten te verkrijgen.

Zo maakt bijvoorbeeld introductie.van zure groepen 35 (bijvoorbeeld onder gebruikmaking van het aminozuur lysine) het vernette enzymaggregaat negatief geladen in basisch milieu, en de introductie van basische groepen (bijvoorbeeld onder gebruikmaking van polyethyleendiaminen zoals pentaethy- 1027360 4 leenhexamine) het vernette enzymaggregaat positief geladen in zuur milieu. Deze behandelingen zorgen voor ander colloïdaal gedrag. Door de voor het enzym meest gunstige modificatie toe te passen kan de activiteit behouden of verhoogd worden. Ook 5 kunnen apolaire groepen (bijvoorbeeld onder toepassing van xyleendiamine, polyxylyleendiamine, 1,3-propaandiamine, hex-aandiamine) of polaire groepen (bijv. 1,3-diamino-2-propanol) worden opgenomen afhankelijk van het oplosmiddel dat wordt gebruikt in de beoogde toepassing. De amine kan ook afkomstig 10 zijn uit het eiwit zelf, in de vorm van aminebevattende zij-groepen van aminozuren, zoals lysine.

Het verdient voorts de voorkeur wanneer in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding de amineverbinding in stap ii. afkomstig is van het precipitatiemiddel van stap i. 15 Dit heeft als voordeel dat het niet nodig is om voor het uitvoeren van stap iii. apart een amineverbinding toe te voegen, waardoor minder handelingen hoeven te worden uitgevoerd en door de hogere concentratie van de amine minder re-actieve amines nodig zijn, met alle tijd- en kostenbesparing 20 van dien.

Bij voorkeur is het precipitatiemiddel een ammonium-verbinding en is de amineverbinding ammonia, waarbij de werkwijze wordt uitgevoerd bij pH 8-9,5. Bij gebruik van di- of polyamines wordt bij voorkeur geen ammoniumzout gebruikt, 25 maar polyethyleenglycol of een ander aminevrij oplosmiddel.

Met nog meer voorkeur is de ammoniumverbinding ammo-niumsulfaat. Bij het gebruik van ammoniumsulfaat en glutaral-dehyde vindt geen spontane vernetting plaats indien de pH tussen de 8 en de 9,5 wordt gehouden. Bij een lagere pH vindt 30 wel spontane vernetting plaats voordat de reductie stap plaats kan vinden, waardoor vernette aggregaten worden verkregen met zeer sterk afwijkende eigenschappen zoals verkleuring en grote deeltjes.

Bij het gebruik van di- of polyamines kan de pH wor-35 den gevarieerd tussen 1 en 14, bij voorkeur tussen 4 en 10 en meest optimaal tussen 6 en 8.

Voorts is gevonden dat de enzymmoleculen in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gepre- 1.027360 5 cipiteerd met een geschikt precipitatiemiddel (stap i.) voorafgaand aan het genereren van aldehydegroepen op de enzymmo-leculen (stap ii.).

Dit aspect van de werkwijze kan bijvoorbeeld met 5 voordeel worden benut wanneer NaIC>4 wordt gebruikt om aldehydegroepen op het eiwit te introduceren. NaIC>4 is namelijk goed oplosbaar in waterige oplosmiddelen (waarin de enzymen zich bevinden vóór precipitatie), maar is slecht oplosbaar in gebruikelijke precipitatiemiddelen. Hierdoor is het na aggrega-10 tie verminderd actief en worden verdere stappen van het proces niet verstoord.

De deeltjesgrootte van de vernette enzymaggregaten die worden verkregen onder toepassing van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding kan in sommige gevallen te 15 klein zijn voor bijvoorbeeld filtratie met behulp van conventionele glasfilters.

Derhalve is het voordelig om de mogelijkheid te hebben om de deeltjesgrootte van de vernette enzymaggregaten te vergroten.

20 Hiertoe is de werkwijze volgens de onderhavige uit vinding in een voorkeursuitvoeringsvorm voorts gekenmerkt doordat in stap i een dragermateriaal wordt toegevoegd.

Het dragermateriaal is bij voorkeur silica.

Volgens de stand van de techniek worden enzymen en 25 vernette enzymaggregaten in het algemeen gewassen met een bufferoplossing. Het is algemeen aanvaard dat wassen met een buffer het best is voor de kwaliteit van de aggregaten.

In tegenstelling daarmee is thans gevonden dat het voordeel heeft wanneer, na stap iii. van de werkwijze volgens 30 de onderhavige uitvinding, de vernette enzymaggregaten worden gewassen met gedemineraliseerd water, gevolgd door een droogstap.

Zouten en andere opgeloste stoffen worden zo op doelmatige wijze weggewassen, hetgeen zorgt voor verhoogde 35 activiteit in organische media en in ionogene vloeistoffen (eng. 'ionic liquids').

Vervolgens verdient het de voorkeur om de droogstap uit te voeren door behandeling met een organisch oplosmiddel, 1027360 6 dat bij voorkeur wordt gekozen uit de groep van met water mengbare oplosmiddelen zoals aceton, alcoholen en iortogene vloeistoffen. Eventueel kan het met water mengbare oplosmiddel met een vluchtiger oplosmiddel worden weggewassen (zoals 5 diëthylether) om het droogproces te versnellen.

Gebleken is dat vernette enzymaggregaten die worden bereid onder toepassing van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding verbeterde activiteit hebben in organische media en ionogene vloeistoffen. Aceton, met water mengbare 10 ethers, alcoholen en ionogene vloeistoffen zijn hierbij voordelige en doelmatige oplosmiddelen gebleken.

Vervolgens kan het organische oplosmiddel door toevoeging van ether, gevolgd door uitdampen worden verwijderd.

Toevoeging van ether gevolgd door uitdampen levert 15 zeer efficiënte droging op. Eventueel kan een bekende hoeveelheid water aan het vernette aggregaat worden toegevoegd indien dit de activiteit blijkt te verhogen. Dit kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door aceton met een bekend percentage water toe te voegen, en daarna met ether de aceton te verwij-20 deren. Een kleine hoeveelheid water in het vernette aggregaat kan tot verhoogde activiteit leiden indien het medium waarin de vernette aggregaat uiteindelijk wordt gebruikt een water-vrij medium is.

In een volgend aspect heeft de onderhavige uitvin-25 ding betrekking op enzymaggregaten die verkrijgbaar zijn volgens de werkwijzen van de onderhavige uitvinding.

Deze aggregaten hebben verbeterde activiteit en col-loïdaal gedrag in vergelijking met aggregaten die zijn bereid volgens standaard werkwijzen.

30 Gunstige resultaten werden verkregen indien de en- zymmoleculen werden gekozen uit de groep van laccasemoleculen en lipasenmoleculen, echter de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is ook toepasbaar op andere enzymen zoals proteases, esterases, oxynitrilase, nitrilase, aminoacylase, 35 penicilline-acylase, oxidases, reductases. Vooral lipases en esterases worden veel onder "droge" omstandigheden gebruikt, waardoor droging erg belangrijk is. Teveel water kan een verstoring veroorzaken in de reactie die door het enzym wordt 1027360 7 gekatalyseerd.

Naast een verhoogde activiteit is verhoging van de stabiliteit ook een gunstige eigenschap van vernette enzym aggregaten. Een belangrijke technische beperking van het ge-5 bruik van het enzym laccase voor de oxidatie van zetmeel (zoals bekend uit bijvoorbeeld WO 0050621) is het feit dat het enzym laccase tijdens de reactie ook geoxideerd wordt door de hulpstof 2,2,6,6-tetrametyl-l-piperidinyloxy (TEMPO). Dit heeft tot gevolg dat het enzym na verloop van tijd wordt ge-10 inactiveerd. Dit betekent dat gedurende het oxidatieproces voortdurend nieuwe laccase dient te worden toegevoegd. Hierdoor kan dit proces, ondanks de duidelijke milieuvoordelen, om economische redenen nauwelijks concurreren met de huidige technologie.

15 Door nu van laccase een vernet aggregaat te maken is het enzym beter beschermd tegen oxidatie. De levensduur tijdens het oxideren van zetmeel wordt verlengd, waardoor het proces economisch rendabel wordt.

Omdat een vrij enzym niet door kan dringen in het 20 vernette enzymaggregaat, dit is alleen toegankelijk voor kleinere moleculen, zijn enzymen in vernette, geaggregeerde toestand beschermd tegen aanvraat van afbrekende enzymen zoals proteasen. Dit voordeel komt bijvoorbeeld tot uiting in het geval van laccase-enzymen. Ofschoon het opgeloste enzym-25 preparaat naast laccase ook nog proteaseactiviteit vertoont, is in het vernette enzymaggregaat geen proteaseactiviteit meer waarneembaar. De stabiliteit van de laccase-enzymmoleculen is in vernette enzymaggregaten sterk verbeterd ten opzichten van het vrije laccasepreparaat. Hierdoor is een 30 extra zuiveringsstap van de laccase-enzymmoleculen overbodig.

Voor de toepassing van de laccase in de oxidatie van zetmeel komt dit voordeel nog op een andere manier tot uiting. Naast laccase- en proteaseactiviteit vertoont het opgeloste enzympreparaat ook nog amylaseactiviteit. Amylase 35 breekt zetmeel af in kleinere fragmenten. Dit is onwenselijk omdat de eigenschappen van door laccase geoxideerde kleinere zetmeelfragmenten veel slechter zijn dan niet door amylase afgebroken en door laccase geoxideerd zetmeel. In vernette, 1027360 8 geaggregeerde vorm blijkt ook de amylaseactiviteit - net als de proteaseactiviteit - sterk afgenomen te zijn. Zetmeel is dus ook te groot om in de vernette enzym aggregaat door te dringen wat normaal leidt tot hydrolyse in kleinere fragmen-5 ten wat tot ongewenste produkteigenschappen leidt. Ook hier is een extra zuiveringsstap overbodig.

De uitvinding wordt hierna toegelicht aan de hand van de volgende, niet-beperkende voorbeelden.

10 VOORBEELDEN

Voorbeeld 1:Laccaseactiviteit

Laccase (Trametes versicolor, Wacker Chemie)-15 activiteit werd gemeten door een hoeveelheid laccase-enzym op te lossen in 40 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5. 100 mg 2,2-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) (ABTS) werd opgelost in 20 ml van dezelfde buffer en 200 Dl van deze oplossing werd gemengd met 800 Dl van de laccaseoplossing en geïn-20 cubeerd bij 25°C. De extinctieverandering bij 420 nm werd gebruikt om de laccase activiteit te bepalen. Een activiteits-eenheid (ü) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die een verandering veroorzaakt in extinctie van 0,027 dE*20 per mi- I

nuut in een reactievolume van 1 ml.

25

Voorbeeld 2 Bereiding van het nitrosoniumzout van 2,2,6,6-tetramethyl-l-piperidinyloxy (TEMPO) onder gebruikmaking van laccase 30 Een oplossing van TEMPO-nitrosoniumion w.erd als volgt bereid met laccase: 6,9 g TEMPO werd opgelost in 1 liter gedemineraliseerd water. 200 mg laccase van Trametes versicolor (Wacker) werd gesuspendeerd in 20 ml gedemineraliseerd water. Nadat de enzymoplossing 10 minuten werd geroerd, 35 werd het supernatant (centrifugeren 5 minuten bij 1500xg) ontzout met een P6 kolom. Het ontzoute materiaal werd aan de TEMPO-oplossing toegevoegd. Na ongeveer 150 minuten onder pH stat omstandigheden bij pH 5, kamertemperatuur, onder beluchting met een beluchtingseenheid, was 91% van de TEMPO omgezet 1027360 9 in nitrosonium, zoals bleek uit het verbruik van 100,8 ml HCL (0,4 N) en een verschuiving van geel naar een meer oranje kleur (de verhouding E480/E430 nam toe van ongeveer 0,3 naar 1,4).

5

Voorbeeld 3: Diamineselectie en -optimalisatie 25 mg laccase (Trametes versicolor, Wacker Chemie) werd opgelost in 1 ml 100 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5 bij 10 4°C. Na centrifugatie werd 0,9 g polyethyleenglycol (8000k) toegevoegd aan het supernatant bij kamertemperatuur. Na 30 minuten roeren werd koude (4°C) glutaraldehyde (25% oplossing) toegevoegd met een eindconcentratie die het tienvoudige (50-150 mM) van de diamine bedroeg. De ontstane oplossing 15 werd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Vervolgens werd een geselecteerde diamine (als 100 mM oplossing, pH 4,5) in één keer toegevoegd, met verschillende eindconcen-traties (5-15 mM). Het mengsel werd langzaam gedurende 3 uren bij kamertemperatuur geroerd.

20

Tabel 1. Diamineselectie en -optimalisatie_ mMdia- mM glutaraldehyde % VEA* activiteits U / mg uiterlijk van de VEA* mine opbrengst suspensie 1 5 PDA . 50 45 3,89 vlokkerig, bezinkt snel 2 1Q PDA 100 39 3|38 3 15 PDA 150 33 2,88 poederig, 4 5 HMDA 50 63 4,14 bezinkt snel 5 10 HMDA 100 47 4,03 6 15 HMDA 150 36 3,09 vlokkerig, 7 5 PEHA 50 48 4,20 bezinkt heel langzaam 8 10 PEHA 100 34 3,94 9 15 PEHA 150 30 2,55 10 5 PXDA 50 45 3,87 grote deeltjes 1027360 10 11 10 PXDA 100 31 2,67 12 15 PXDA 150 30 2,56 *VEA= vernet enzymaggregaat PDA = 1,3-propaan diamine; HMDA = 1,6-hexamethyleendiamine; PEHA = pentaethyleenhex amine; PXDA = polyxylyleendiamine

Tabel 2. Activiteit van vernette enzymaggregaten na wassen en resuspenderen met pentaethyleen- hexamine als diamine _____ mM % VEA* activiteits _PEHA_opbrengst_UI mg 1 2.5 32 2,79 2 5 31 4,25 3 7.5 32 3,76 4 10 38 3,95 5 12.5 37 3,16 6 15_37_2,50 *VEA= vernet enzymaggregaat

Voorbeeld 4: bereiding 1 van vernet: laccaseenzymaggregaat (glutaraldehyde en pentaethyleendiamine) 1 g laccase (Trametes versicolor, Wacker Chemie) 5 werd opgelost in 40 ml 100 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5 bij 4°C. Na centrifugatie werd 36 g polyethyleenglycol (8000k) toegevoegd aan het supernatant bij kamertemperatuur. Na 30 minuten roeren werd 2,873 ml koude (4°C) glutaraldehyde (25% oplossing) druppelsgewijs toegevoegd. De ontstane oplossing 10 werd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Vervolgens werd 7,4 ml pentaethyleendiamine (PEHA) (als 100 mM oplossing, pH 4,5) toegevoegd, in een keer. Het mengsel werd langzaam gedurende 3 uur bij kamertemperatuur geroerd. Daarna werd 200 ml water toegevoegd en werd het vernette enzymaggre-15 gaat afgecentrifugeerd. De pellet werd geresuspendeerd in 9 1027360 11 ml 100 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5 met 10% polyethyleen-glycol (8000k) en ingevroren.

Voorbeeld 5: Opwerking van vernette enzymaggregaten met 5 droogstap

Het vernette enzymaggregaat werd bereid als onder voorbeeld 4. Nadat de vernetting volledig was, werd de vernette enzymaggregaatsuspensie 3x gewassen (centrifugeren en 10 decanteren) met een zelfde volume gedemineraliseerd water om alle in water oplosbare componenten te verwijderen. Daarna werd de pellet geresupendeerd in aceton een ander met water mengbaar oplosmiddel zou ook geschikt zijn, gecentrifugeerd en geresuspendeerd in diëthylether (of een vergelijkbaar op-15 losmiddel zou ook geschikt zijn). Na centrifugatie was het vernette enzymaggregaat vrij van zouten of andere componenten. Het kon bewaard worden in de ether als suspensie of de ether kon worden uitgedampt om het vernette enzymaggregaat als droog poeder te isoleren.

20

Voorbeeld 6: bereiding II van vernet laccaseenzymaggregaat (perjodaatoxidatie en pentaethyleendiamine) 1 g laccase (Trametes versicolor, Wacker Chemie) 25 werd opgelost in 10 ml 100 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5 bij 4°C. Na centrifugatie werd 10 ml 100 mM natriummetaperjodaat toegevoegd aan het supernatant. Na 1 uur incubatie bij 4 °C werd 18 g polyethyleneglycol (8000k) bij kamertemperatuur aan het supernatant toegevoegd. Na 30 minuten roeren werd 3,7 ml 30 pentaethyleendiamine (PEHA) (als 100 mM oplossing, pH 4,5) toegevoegd, in een keer. De ontstane oplossing werd 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Daarna werd 4 ml koud (4°C) natri-umcyanoboorhydride (100 mM oplossing) toegevoegd.

Het mengsel werd langzaam gedurende 1 uur bij kamer-35 temperatuur geroerd. Daarna werd 200 ml water toegevoegd en werd het vernette enzymaggregaat afgecentrifugeerd. De pellet •werd geresuspfendeerd in 10 ml 100. mM natriumacetaatbuffer pH

4,5 met 10% polyethyleenglycol (8000k) en ingevroren.

i 1027360 12

Voorbeeld 7: bereiding van vernet laccase-enzymaggregaat III (periodaatoxidatie en ammonia) 1 g laccase (Trametes versicolor, Wacker Chemie) 5 werd opgelost in 10 ml 100 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5 bij 4°C. Na centrifugatie werd 10 ml 100 mM natriummetaperiodaat toegevoegd aan het supernatant. Na 1 uur bij 4°C werd 10 g ammoniumsulfaat toegevoegd aan het supernatant bij kamertemperatuur en de pH op 8,5 ingesteld. Daarna werd het mengsel 10 gedurende 2 uren bij kamertemperatuur geroerd op pH 8,5.

Daarna werd 4 ml koud (4°C) natliumcyanoboorhydride (100 mM oplossing) toegevoegd. Het mengsel werd langzaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Daarna werd 200 ml water toegevoegd en het vernette enzymaggregaat afgecentrifugeerd.

15 De pellet werd geresuspendeerd in 10 ml 100 mM natriumacetaat buffer pH 4,5 met 10% polyethyleenglycol (8000k) en ingevroren.

Voorbeeld 8. De stabiliteit van laccase in aanwezigheid van 20 het nitrosoniumzout van TEMPO.

Een oplossing van 0,5 mg/ml laccase in 0,2 M succi-naatbuffer pH 6 werd bereid en het nitrosonium zout van TEMPO werd toegevoegd onder oplevering van een eindconcentratie te 25 geven van 32 mM. De oplossing werd geïncubeerd en' de restac-tiviteit van het enzym werd bepaald. Uit de verhouding tussen de activiteit en tijd, kon de halfwaardetijd van laccase in aanwezigheid van het nitrosonium zout van TEMPO worden uitgerekend. Hetzelfde experiment werd uitgevoerd met het vernette 30 enzymaggregaat uit Voorbeeld 4 (bereiding I van vernet lac-caseenzymaggregaat) in dezelfde buffer en in aanwezigheid van 32 mM van het nitrosoniumzout van TEMPO.

35 Tabel 3. Halfwaardetijd van vernette laccaseenzymaggregaten_

Enzym Halfwaardetijd in aanwezigheid van het nitrosoniumzout _van TEMPO_

Vrije Laccase 15 minuten 1 027360___ _

Laccase-VEA* 116 minuten

Voorbeeld 4 __ *VEA= vernet enzymaggregaat 13

Voorbeeld 9: De stabiliteit van vernet laccaseenzymaggregaat bij 55 °C

5

Een oplossing van 0,5 mg/ml laccase (T. versicolor) in 40 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5 en een oplossing van 0,5 mg/ml vernet enzymaggragaat uit Voorbeeld 4 in dezelfde buffer werden geïncubeerd bij 55 °C en de activiteit werd regel-10 matig bepaald. Uit de activeitsdaling in de tijd kon de half-waardetijd onder deze omstandigheden bepaald worden. De half-waardetijd van laccase bleek circa 11 uur te zijn, en die van het vernette enzymaggragaat uit Voorbeeld 4 circa 40 uur.

15 Voorbeeld 10: Oxidatie van zetmeel Zètmeeloplossingen werden bereid door het geleren van Lintner aardappelzetmeel (Sigma S-2630) in water. Voor elk experiment werd een oplossing bereid van 16 gram gege-20 leerde zetmeel in 800 ml 0,1 M succinaatbuffer pH 5,6. Aan deze oplossing werd 3,2 g TEMPO toegevoegd. (TEMPO vormt een .

precipitaat met zetmeel onder bepaalde omstandigheden, welke oplost tijdens het proces). In elk experiment werd 30% van de totale hoeveelheid enzymeenheden toegevoegd bij de start van 25 de reactie. Tijdens de eerste 6 uren van de reactie werd de resterende 70% van de enzymeenheden toegevoegd 6 porties per uur. De reactietemperatuur bedroeg 37°C. De pH werd constant gehouden met een pH-stat. Omzetting van zetmeel werd gemeten door een online analyse van het hydroxydeverbruik. De omzet-30 tingsgraad is gedefinieerd als het percentage van C6-hydroxylgroepen omgezet tot carbonzuurgroepen.

Tabel 4, Stabiliteit vernet enzymaggragaat uit Voorbeeld 4._

Enzym Totaal aantal eenheden Omzettingsgraad _gebruikt_na 24 uur

Laccase 2000 61% _L° 27360 _ _ 14

Laccase 1700 51%

Vernet enzymaggragaat 1377 64% uit Voorbeeld 4___

De resultaten laten zien dat aanzienlijk minder eenheden nodig zijn wanneer het vernette enzymaggragaat uit Voorbeeld 4 wordt gebruikt in plaats van oplosbare laccase.

5 Voorbeeld 11: bereiding I van vernet lipase-enzymaggregaat (glutaraldehyde met reductie)

Aan 150 ml lipase (CaLB, Novozyme 525F) werd 0,45 gram kaliumwaterstoffosfaat toegevoegd en de pH werd op 7,3 10 gesteld met verdund fosforzuur. Daarna werd 135 g polyethy-leenglycol (8000k) toegevoegd en werd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd, waarna 10,85 ml glutaraldehyde (25% oplossing in water) werd toegevoegd. Na 3 uur roeren bij kamertemperatuur werd 28,5 ml koud (4°C) natriumcyanoboorhy-15 dride (100 mM oplossing) toegevoegd. Het mengsel werd langzaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Daarna werd 285 ml water toegevoegd en werd nog eens 30 minuten geroerd. Daarna werd het vernette enzymaggregaat afgecentrifugeerd. De pellet werd 3 keer met 400 ml gedemineraliseerd 20 water gewassen (centrifugeren, decanteren), 1 keer met 300 ml aceton, 1 keer met 150 ml aceton en 1 keer met 150 ml diëthy-lether. Hierna werd de pellet na uitdampen van de ether als droog poeder verkregen.

25 Tabel 5. Diamineselectie voor periodaatgeoxideerde Candida antarctica lipase B.

% Opbrengst

Pellet structuur Diamine (10 mM) VEA* dun EDA 53 dun P1.2DA 46 dun PDA 64 dun HMDA 85 dun XDA 91 vlokkerig_ PXDA_94_ 1 027360__ _ 15 zeer vlokkerig PEHA 91 dun Lysine 71 dun_Lysine ethylester 62_ *VEA= vernet enzymaggregaat EDA= 1,2 diaminoëthaan; P1,2DA= 1,2-propaandiamine PDA= 1,3-propaandiamine; HMDA = 1,6-hexamethyleendiamine; XDA = xyleendiamine; PXDA = polyxylyleendiamine; PEHA = pentaethyleenhexamine; 5

Tabel 6. Diamine-optimalisatie voor periodaatgeoxideerde Candida antarctica lipase B.

% Opbrengst

Diamine Concentratie mM VEA* HMDA 5 76 HMDA 10 82 HMDA 15 83 PXDA 5 82 PXDA 10 85 PXDA 15 79 PEHA 5 80 PEHA 10 62 PEHA_15_67_ *VEA= vernet enzymaggregaat 10 Voorbeeld 12: Lipase vernet: enzymaggregaat bereiding II (pe-riodaat oxidatie en polyxylyleendiamine)

Aan 150 ml lipase (CaLB, Novozyme 525F) werd 150 ml 100 mM natriummetaperiodaat toegevoegd en het ontstane meng-15 sel werd 1 uur op kamertemperatuur gehouden. Vervolgens werd 1,3 gram kaliumwaterstoffosfaat toegevoegd en werd de pH 7,8 gesteld met verdund fosforzuur. Daarna werd 270 g polyethy-leenglycol (8000k) toegevoegd en werd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd waarna 57 ml polyxylyleendiamine 20 (100 mM, pH 7,8) oplossing in een keer werd toegevoegd. Na 10 minuten werd 57 ml koud (4°C) natriumcyanoboorhydride (100 mM oplossing) toegevoegd.

Het mengsel werd langzaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Daarna werd 285 ml water toegevoegd en 1027360 16 werdnog 1 uur geroerd. Daarna werd het vernette enzymaggre-gaat afgecentrifugeerd. De pellet werd 3 keer met 400 ml ge-demineraliseerd water gewassen (centrifugeren, decanteren), 1 keer met 300 ml aceton, 1 keer met 150 ml aceton en 1 keer 5 met 150 ml diëthylether. Hierna werd het pellet na uitdampen van de ether als droog poeder verkregen.

Tabel 7. Activiteit van Candida antarctica lipase B formuleringen in organische media.

Hydrolyseactiviteit3 Omesteringsactiviteitb

Vrij lipase 22000

Novozym 435 7300 250 VEA-vooróee/d K niet geredu- 3000 11 ceerd VEA-voonbee/d K wel geredu- 38000 50 ceerd VEA-voorbeeld L 31000 1500

a) Tributyrin eenheden / gram: 5 vol% tributyrine in 40 mM Tris buffer; pH 7.5; 40eC

b) Fenyiethylamine 41 mM; n-butyl methoxyacetaat 34 mM; 12 mg / ml, Mol. seave 4A, 40°C

10 Voorbeeld 13: Het vernetten van enzymaggregaten met toevoeging van een drager

Om een goede binding van de aggregaat aan de drager te verkrijgen werd silica (Davisil 644, 100-200 mesh, 150A) 15 voorbehandeld met 3-aminopropyltriethoxysilane (zoals beschreven in WO 03/031610). Hierdoor ontstaan aminogroepen op de drager die, zoals beschreven, met de aldehydegroepen op het enzym kunnen reageren. Aan 1 g van déze voorbèhandelde silica werd 5 ml gedemineraliseerd water en 12 ml van met pe-20 riodaat behandeld en met polyethyleenglycol geaggregeerd enzym (CaLB, Novozyme 525F) uit voorbeeld 12 toegevoegd. Overigens is het ook mogelijk de silica voor de aggregatie toe te 1027360 17 voegen. Na 15 minuten roeren werd 1.7 ml PXDA (100 mM) toegevoegd en 2 uur geroerd. Daarna werd met 1,7 ml 100 mM NaCNBH3 gedurende 1 uur gereduceerd. Op een glasfilter werd het aldus verkregen vernette enzym aggregaat op silica gewassen met wa-5 ter, aceton en ether. De vaste stof (900 mg) had een activiteit van 2400 eenheden per gram in de tributyrinetest. Dit komt overeen met ongeveer 10% enzym per gram dragermateriaal.

1027360

Claims (21)

1. Werkwijze voor de bereiding van vernette enzymag-gregaten, welke werkwijze is gekenmerkt door de volgende stappen: 5 i. het genereren van aldehydegroepen op al dan niet in een geschikt oplosmiddel opgeloste enzymmoleculen; ii. het precipiteren van de enzymmoleculen met een geschikt precipitatiemiddel; iii. het vernetten van de van aldehydegroepen voor- 10 ziene, geprecipiteerde enzymmoleculen onder gebruikmaking van een amineverbinding onder oplevering van vernette enzymaggre-gaten met verbeterde eigenschappen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat stap i. wordt uitgevoerd door toevoeging van een aldehy- 15 deverbinding.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat stap i. wordt uitgevoerd door toevoeging van een geschikt oxidatiemiddel.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, 20 dat het oxidatiemiddel wordt gekozen uit de groep van perjo- daten van aardalkalimetalen.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat in stap iii. voorts een reductiemiddel wordt toegevoegd.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, 25 dat het reductiemiddel wordt gekozen uit de groep van NaCNBH3 . en NaBH4.

7. Werkwijze volgens één der conclusies 1-6, met het kenmerk, dat in stap iii ammonia wordt gebruikt als amineverbinding.

8. Werkwijze volgens één der conclusies 1-6, met het kenmerk, dat in stap iii een di- of polyamine wordt gebruikt als amineverbinding.

9. Werkwijze volgens één der conclusies 1-8, met het ! kenmerk, dat de amineverbinding in stap iii. afkomstig is van 35 het precipitatiemiddel.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het precipitatiemiddel een ammoniumverbinding is en de 1027360 amineverbinding ammonia, waarbij de werkwijze wordt uitgevoerd bij pH 8 - 9,5.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de ammoniumverbinding ammoniumsulfaat is.

12. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de enzymmoleculen worden geprecepiteerd met een geschikt precipitatiemiddel (stap i.) voorafgaand aan het genereren van aldehydegroepen op de enzymmoleculen (stap ii.) .

13. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat in stap i een dragermateriaal wordt toegevoegd.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het dragermateriaal silica is.

15. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat na stap iii de vernette enzymaggregaten worden gewassen met gedemineraliseerd water, gevolgd door een droogstap.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, 20 dat de droogstap wordt uitgevoerd door behandeling met een organisch oplosmiddel.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat het organische oplosmiddel wordt gekozen uit de groep van met water mengbare oplosmiddelen.

18. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat het organische oplosmiddel vervolgens wordt verwijderd door ether toe te voegen, gevolgd door uitdampen.

19. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de enzymmoleculen worden gekozen uit de 30 groep van laccase-, lipase-, protease-, esterase-, oxynitri-lase-, nitrilase-, aminoacylase-, penicilline acylase-, lya-se-, oxidase- of reductasemoleculen.

. 20. Vernette enzymaggregaten verkrijgbaar volgens één der voorgaande conclusies.

21. Toepassing van vernette enzymaggregaten ver krijgbaar volgens één der voorgaande conclusies voor de oxidatie van zetmeel. 1 0 ? 7 3 R 0