MXPA02000128A

MXPA02000128A - Material mejorado de heridas para mejorar curacion de heridas.

Info

Publication number: MXPA02000128A
Application number: MXPA02000128A
Authority: MX
Inventors: David N Herndon
Original assignee: Res Dev Foundation
Priority date: 1999-06-22
Filing date: 2000-06-22
Publication date: 2002-06-21
Also published as: US6576618B1; EP1210046A1; CN1137723C; EP1210046A4; AU5758500A; US20020128222A1; CN1372450A; IL147127A0; JP2003502350A; WO2000078259A1; AU771904B2; ZA200110240B; CA2377371A1; BR0012528A; RU2245722C2

Abstract

La presente invencion describe la incorporacion de construcciones genicas de liposoma directamente en una herida para mejorar adicionalmente la reparacion de heridas, en materiales de cierre y/o cubierta de heridas para mejorar la funcionalidad del material. La presente invencion describe adicionalmente el uso de membranas fetales humanas (por ejemplo, amnios) mejoradas con la terapia genica de liposomas como un material de cubierta de heridas en la reparacion de heridas de espesor completo. Las membranas fetales mejoradas o la piel de cadaver mejorada tiene ventajas con respecto a los materiales actualmente usados que carecen de la construccion genica de liposomas y son un planteamiento eficiente y seguro para mejorar el resultado clinico en pacientes con lesiones de quemadura.

Description

MATERIAL MEJORADO DE HERIDAS PARA MEJORAR CURACIÓN DE HERIDAS Antecedentes de la Invención Campo de la Invención La presente invención está relacionada en general al campo de la medicina de traumas y heridas. De manera más específica, la presente invención se refiere a métodos para mejorar la curación de heridas y a materiales mejorados de cubierta de heridas.

Descripción de la Técnica Relacionada Las lesiones por quemadura representan una de las formas más severas de trauma. Entre mayor sea la lesión por quemadura, más severa serán las consecuencias y mayor la probabilidad de pobres resultados prolongados y muerte. Anualmente, hay más de 2 millones de pacientes de quemaduras y los costos por tratamiento exceden un billón de dólares por año. Las lesiones por fuego y quemadura son la tercera causa principal de lesiones y muerte en niños con una edad de 1 a 18 años. El número de mortalidades de las quemaduras ha disminuido durante la última década, principalmente debido a la resucitación temprana y por fluidos adecuados, el soporte nutricional agresivo y temprano, control mejorado de infecciones, cuidado de REF: 135234 heridas/curación de heridas, mejorados, y modulación hormonal . La curación de heridas es de principal importancia en la recuperación de pacientes quemados, y por lo tanto, su resultado clínico. Se ha mostrado que la escisión temprana de la herida y el injerto de tejido mejoraron la respuesta hipermetabólica y la supervivencia después de la lesión por quemadura. Se puede usar piel autóloga para injertar la herida escindida (sitio donador) , sin embargo, no hay un tratamiento efectivo en pacientes con quemaduras especialmente grandes. En estos casos, se han usado materiales de piel sintética o piel de cadáver. La cubierta de la herida se debe distinguir del cierre de la herida. Los materiales de cierre de herida son biológicamente aceptados por el lecho de la herida, los cuales llegan a ser incorporados de forma permanente en la herida cicatrizante. Por otra parte, los materiales de cubierta de heridas dependen de la incorporación en él coagulo de la herida y en el re-crecimiento de los tejidos de granulación por adhesión; este fenómeno es característico de muchos materiales de cubierta de heridas. Los materiales de cubierta de heridas, en general, no son biodegradables, y por lo tanto, sólo pueden ser sustitutos temporales de la epidermis. Los materiales de cubierta de heridas por lo tanto se deben reemplazar con la piel del paciente, ya sea por re-epitelialización o injertos de piel. En el caso de cubierta temporal, la herida no será colonizada con bacterias y no debe ser suficientemente superficial de modo que se espera que cure completamente en el espacio de tres semanas. Las células epiteliales de los apéndices epidérmicos crecen y reemplazan la epidermis destruida y gradualmente, se desprende el material de cubierta de herida. Por lo tanto, el objetivo principal de los materiales de cubierta de herida en las quemaduras superficiales de segundo grado es limitar la invasión microbiana del lecho de la herida (barrera microbiana) para prevenir de este modo la infección y para limitar el acceso de aire y para reducir al mínimo de este modo el dolor. También se han usado materiales de cubierta de heridas para lesiones profundas de segundo o tercer grado antes del cierre definitivo de la herida con piel autóloga en pacientes con lesiones masivas por quemaduras. Los materiales óptimos de cubierta de heridas aún tienen que ser determinados. Sin embargo, los requisitos para los materiales de cierre de herida son el imitar a la dermis y epidermis normales. Específicamente, los requisitos de un material superior de cierre de heridas son: a) proporcionar una barrera no tóxica antiséptica, no inflamatoria y no antigénica a las bacterias y otros microbios; b) proporcionar una proporción normal de conductividad de calor y agua; c) proporcionar una adherencia inmediata, uniforme e íntima al lecho de la herida; d) proporcionar soporte para ' la defensa normal del huésped local y los mecanismos de reparación de heridas; e) mantener la elasticidad y durabilidad a largo plazo; f) permitir el potencial de crecimiento; y g) proporcionar función cosmética y mecánica a largo plazo con propiedades de contractura de heridas que son comparables a autoinjertos de espesor dividido. INTEGRA1 , ALLODERM^ o BI0BRANEMR demuestran muy buena biocompatibilidad y características de curación. Sin embargo, estos materiales son muy costosos, lo que limita su uso extendido. La piel de cadáver es un planteamiento relativamente eficiente y barato para la cubierta de heridas. Sin embargo, el riesgo de transmisión de HIV, CMV, HSV y hepatitis es un problema significativo, y por lo tanto, limita la aplicación de la piel de cadáver. Las membranas fetales poseen numerosas características ventajosas que hacen a este material aplicable como material de cubierta de heridas, incluyendo: a) baja inmunogenicidad; b) no tóxico, antiséptico y no inflamatorio; c) no infección por HIV, HSV o CMV; d) cantidades ilimitadas (que, por lo tanto, permite que el tejido de membrana fetal sea una alternativa barata a los reemplazos de piel existentes) ; e) variabilidad de longitud, diámetro y espesor; y f) componentes mecánicos endógenos, tal como colágeno, laminina y fibronectina, para asegurar de este modo estabilidad mecánica, soporte y potencial de crecimiento similar a aquel de la piel humana normal . De forma bioquímica, la lesión térmica es una forma particularmente severa de trauma acompañada por una respuesta hipermetabólica caracterizada por un alto rendimiento cardiaco, consumo incrementado de oxígeno, respuesta inmunitaria comprometida y catabolismo de proteína y grasa [34] . La herida por quemadura soporta este estado hipermetabólico vulnerable al producir y liberar tromboxano y citocinas pro-inflamatorias [35-37] . De esta manera, la curación de heridas es importante para la supervivencia y recuperación en pacientes con quemaduras [22, 38-39]. Los agentes anabólicos, tal como la hormona de crecimiento y el factor-I de crecimiento tipo insulina, han demostrado atenuar la respuesta hipermetabólica y mejorar la curación de heridas [35. 39-41]. El factor-I de crecimiento tipo insulina, un pequeño polipéptido de aproximadamente 7-5 kD de tamaño, es un agente anabólico que se ha mostrado que mejora el metabolismo [35], la función de la mucosa del intestino [42] y pérdidas de proteínas [43] después de una lesión térmica. El IGF-I medía las acciones de la hormona de crecimiento en el estado hipermetabólico al atenuar la pérdida de masa corporal sin grasa, la respuesta inmunitaria comprometida, la respuesta de fase aguda, y al mejorar la curación de heridas [35, 38, 44-47]. El tratamiento con IGF-I mejora la curación de heridas al estimular la formación de colágeno y la mitogenicidad de los fibroblastos y queratinocitos [40, 41, 48]. Hay efectos laterales adversos, tal como hipoglicemia, cambios del estado mental, edemas, fatiga y jaqueca, lo que limita la utilidad terapéutica del IGF-I en el tratamiento de las quemaduras [49, 50]. Estos efectos laterales adversos son más probablemente debido a las dosis supra-fisiológicas del IGF-I libre, que se requieren para la eficacia biológica [49, 50]. Es importante [1, 2] la selección de un vehículo apropiado para la distribución génica. Los virus, en particular los adenovirus debido a sus capacidades de transfección específicas, se han usado como vehículos de distribución génica [1-3]. Sin embargo, los virus, exhiben toxicidad asociada a la infección viral, compromiso inmunológico, y posibles efectos mutagénicos o carcinogénicos que hacen a este planteamiento potencialmente peligroso [1] . El uso de liposomas como un sistema de distribución llega a ser de esta manera un modelo atractivo debido a su composición no viral, estabilidad y capacidad para interactuar con la membrana celular [4] . La adición de propiedades catiónicas a la estructura liposómica normal y la incorporación de colesterol, junto con el uso de promotores de citomegalovirus (CMV) en las construcciones de ADNc usadas para la transferencia génica, incrementa la eficiencia, y los niveles de expresión transgénica igual a aquellos logrados con construcciones adenovirales [4,5]. La técnica anterior está deficiente de métodos para mejorar la curación de heridas y en materiales mejorados de cubierta de heridas. La presente invención cumple la necesidad largamente esperada y el deseo en la técnica.

Sumario de la Invención La presente invención describe un método para la curación mejorada de heridas usando liposomas que tienen genes que codifican para agentes de mejoramiento de crecimiento. La presente invención describe adicionalmente un material mejorado de cubierta de heridas impregnado con liposomas que tienen genes que expresan factores de crecimiento para mejorar la curación de heridas. Es un objeto de la presente invención disminuir la respuesta hipermetabólica, y de esta manera, mejorar el resultado clínico e incrementar la capacidad de supervivencia después del trauma, particularmente de la lesión térmica. La presente invención describe la incorporación de construcciones génicas liposómicas directamente en una herida y/o en el material de cubierta para mejorar la reparación de heridas y mejorar la funcionalidad del material de cubierta de heridas. La presente invención describe adicionalmente el uso de una membrana amnios, humana, fetal, mejorada, en unión con construcciones génicas liposómicas que expresan factores de crecimiento, como un material pasajero de cubierta de heridas en la reparación de heridas de espesor completo. La membrana fetal tiene ventajas con respecto a los materiales actualmente usados, tal como IntegraR Biobrane' MR Alloderm^, y es un planteamiento eficiente y seguro para mejorar el resultado clínico. Un objeto de la presente invención es proporcionar métodos para mejorar la curación de heridas, métodos para mejorar el material de cubierta de heridas y un material mejorado de cubierta de heridas. En una modalidad de la presente invención, se proporciona un método para mejorar la curación de heridas, que comprende el paso de: inyectar en la herida un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento. En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para mejorar la curación de heridas, que comprende los pasos de: cubrir la herida con un material de cubierta de heridas, en donde el material de cubierta de heridas se impregna con un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento. En aun otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para mejorar la curación de heridas, que comprende los pasos de: cubrir la herida con un material de cierre de heridas, en donde el material de cierre de heridas se impregna con un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento. En aun otra modalidad de la presente invención, se proporciona un vendaje mejorado para heridas, que coipprende: un material de cubierta de heridas; y un liposoma que comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento. En otra modalidad de la presente invención, se proporciona una composición para mejorar la curación de heridas, que comprende: un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento; y un portador farmacéuticamente aceptable. Otros aspectos, características y ventajas adicionales de la presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción de las modalidades actualmente preferidas de la invención. Estas modalidades se dan para el propósito de descripción.

Breve Descripción de los Dibujos Los dibujos anexos se han incluido en la presente de modo que las características, ventajas y objetos de la invención, citados anteriormente, llegarán a ser claros, y se puedan entender en detalle. Estos dibujos forman parte de la especificación. Sin embargo, se va a señalar que los dibujos anexos ilustran modalidades preferidas de la invención y no se deben considerar como que limitan el alcance de la invención. La Figura 1 muestra un dibujo esquemático de los sitios de inyección. Los animales con un sitio de inyección recibieron la inyección sólo en el sitio de inyección I, en tanto que los animales con dos sitios recibieron las inyecciones en los sitios de inyección I y II. Las biopsias I, II y III de piel se tomaron para el análisis 33 días después de la quemadura. La Figura 2 muestra una representación esquemática de un ADNc de plásmido de IGF-I (pcDNA3 ) con el promotor impulsado por CMV. Un plásmido estructuralmente similar para ß-galactosidasa (gen de Lac Z) también se ll encapusuló en el mismo liposoma. La Figura 3 muestra él por ciento de cambio en los pesos corporales representados para el estudio de 7 días. * Diferencia significativa entre los grupos a p<0.05. Los datos se presentan como edia±SEM. La Figura 4 muestra secciones histológicas de la piel después de la reacción histoquímica para la actividad de ß-galactosidasa y contrateñidas con eosinas (4A) . Un producto de reacción azul-verde, finamente granular se presenta dentro de muchas células miofibroblásticas e histiocíticas en el tejido de granulación que esta bajo de la herida de quemadura. Aumento x 380 (4B) . El tejido dérmico inyectado con solución salina (control) que está bajo de la piel sin daño cerca de la herida de quemadura no mostró producto de reacción. Aumento x 380. La Figura 5 muestra la presencia del ARNm de IGF-I en la piel después de la transfección con lipoplejos que contienen el AD?c que codifica para el IGF-1. ?o se pudo detectar el AR?m de IGF-I en las biopsias de piel de ratas transfectadas con liposomas solas o en solución salina (sendas A y B) . Hubo una cantidad significativa de AR?m de IGF-I en las biopsias de piel de ratas transfectadas con AD?c de IGF-1 (sendas C) . Se muestra la muestra representativa . La Figura 6 muestra las concentraciones de transferrina en suero durante el periodo de estudio de 7 días. La transferrina en suero disminuyó después de la lesión por quemadura. Los liposomas atenuaron la caída a 2 y 5 días después de la quemadura. * Diferencia significativa entre grupos, p<0.05. Los datos se presentan como media±SEM. (Transíerrina en suero normal: >72 mg/dl) . La Figura 7 muestra ociacido-glicoproteína 1 a 7 días después de la lesión térmica. * Diferencia significativa entre solución salina y liposomas a p<0.05. Los datos se presentan .como media±SEM. (0C?-acidglicoproteína sérica normal: 55-70 pg/ml) . La Figura 8 muestra TNF-a en suero 1 a 7 días después de la lesión térmica. * Diferencia significativa entre solución salina y liposomas a p<0.05. Los datos se presentan como media±SEM. (TNF-a sérico, normal: 1-10 pg/ml) . La Figura 9 muestra IL-lß en suero 1 a 7 días después de la lesión térmica. * Diferencia significativa entre solución salina y administración de liposomas a p<0.05. Los datos se presentan como media±SEM. (IL-lß sérica, normal: 4-20 pg/ml) . La Figura 10 muestra que el área de la re-epitelialización de la herida se midió por planimetría. Las ratas que recibieron construcciones de ADNc de IGF-I encapsuladas tuvieron el por ciento más alto de re- epitelización a todo lo largo del período de estudio en comparación a los liposomas o grupos con solución salina. * ADNc-liposoma contra liposoma y solución salina (p<0.05). Los datos se presentan como media±SEM. La Figura 11 muestra el área de la re-epitelización de la herida que se midió por planimetría. Las ratas que reciben inyecciones múltiples de construcciones de ADNc de IGF-I encapsuladas tuvieron el por ciento más bajo de re-epitelización a todo lo largo del periodo de estudio en comparación a las inyecciones individuales. * Inyecciones múltiples de ADNc de IGF-I contra inyecciones individuales, p<0.05. Los datos se presentan como media±SEM. La Figura 12 muestra que la presencia de la proteína de ß-galactosidasa se detectó por el ensayo de gen indicador quimioluminiscente en las biopsias de piel I, II, y III. (12A) Las ratas que reciben inyección individual de la construcción de ADNc demostraron una disminución significativa en la expresión de ß-galactosidasa a lo largo del borde de la herida. * Diferencia significativa entre la biopsia de piel I contra III, p<0.05. (12B) Las Ratas que reciben inyecciones múltiples demostraron niveles elevados, consistentes, de expresión de ß-galactosidasa. No hubo diferencias entre las biopsias de piel I, II, III. Los datos se presentan como media±SEM.

La Figura 13 muestra la concentración de la proteína de IGF-I en las biopsias de piel I, II y III que se midió por RÍA. (13A) Las ratas que recibieron inyección individual demostraron la disminución de la concentración de IGF-I de la biopsia I a III. * Diferencia significativa entre biopsia de piel I contra III, p<0.05. (13B) Animales que recibieron inyecciones múltiples demostraron altos niveles consistentes de IGF-I. Datos presentados como media±SEM.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención representa las ventajas de usar vectores distribuidos por liposomas que expresan agentes de mejoramiento de crecimiento a heridas de trauma, particularmente lesiones térmicas, en ratas. La presente invención compara adicionalmente la funcionalidad de varios materiales de cubierta de heridas, tal como membrana fetal, piel humana y varios materiales sintéticos comercialmente disponibles en los mini-cerdos Yorkshire. De manera más específica, la presente invención describe la introducción de construcciones génicas de liposomas que codifican para factores de mejoramiento de crecimiento, . por ejemplo, factor-I de crecimiento tipo insulina (IGF-I) , o factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) directamente en el lecho de la herida o en el material dé cubierta de herida y compara la eficiencia con respecto a heridas no tratadas con liposomas . La eficiencia de la terapia génica con liposomas se valora al medir la velocidad de admisión y el tiempo de curación, examinando "histológicamente la contracción de la herida, la histología, marcadores inmunitarios del rechazo del material de cubierta y el grado de respuesta hipermetabólica a intervalos semanales durante un periodo de 4 meses. En base a los hallazgos informados en la presente, la terapia génica, en la cual se distribuyen uno o más genes que expresan factores de crecimiento, vía vehículos de liposoma inyectados directamente en la herida o inyectados en un material de cubierta de heridas que se aplica subsecuentemente a la herida reformará y mejorará el tratamiento actual de lesiones térmicas, ulceras de piel y procedimientos de injerto de piel. La presente invención se refiere a métodos para mejorar la curación de heridas y a materiales mejorados de cubierta de heridas . La presente invención también se refiere a un método para mejorar la curación de heridas, que comprende el paso de: inyectar en la herida un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento. La presente invención también se refiere a un método para mejorar la curación de heridas, que comprende • los pasos de : cubrir la herida con un material de cubierta de heridas, en donde el material de cubierta de heridas se impregna con un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento . En aun otro aspecto, la presente invención también se refiere a un método para mejorar la curación de heridas, que comprende los pasos de: cubrir la herida con un material de cierre de heridas, en donde el material de cierre de heridas se impregna con un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un ' agente de mejoramiento de crecimiento. En aun- otro aspecto, la presente invención también se dirige a un vendaje mejorado para heridas, que comprende: un material de cubierta de heridas; y un liposoma que comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento. Típicamente, el liposoma que comprende el agente de me oramiento de crecimiento se distribuye al material de cubierta de heridas por inyección, que se puede hacer antes o subsecuente a la aplicación del material e cubierta de heridas, a -la herida. En aun otro aspecto, la presente invención también se dirige a una composición para mejorar la curación de heridas, que comprende: un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente- de mejoramiento de crecimiento; y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición de esta modalidad se puede empacar tal que la composición se puede cargar fácilmente en una jeringa o alternativamente, se puede empacar directamente en una jeringa. En estas modalidades, las heridas representativas que se pueden tratar usando las composiciones y métodos de la presente invención incluyen trauma térmico, trauma químico, trauma excisional, trauma quirúrgico o abración. Los liposomas preferibles son los liposomas catiónicos que contienen colesterol. En general, los agentes de mejoramiento de crecimiento son hormona de crecimiento, factor I de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas o factor-ß de crecimiento de transformación. De manera preferente, cuando el agente de mejoramiento de crecimiento es el factor I de crecimiento tipo insulina (IGF-I) y la concentración del gen que codifica para el IGF-I en el liposoma es de aproximadamente 2.2 µg/ml de liposoma. Los materiales de cubierta de heridas representativos incluyen a nios fetal humano, corion fetal humano, • piel de cadáver humano, piel sintética y otros materiales conocidos por aquellos que tienen experiencia en la técnica. Los materiales de cierre de heridas, representativos incluyen amnios fetal humano, corion fetal humano, piel singenéica humana, piel halogenéica humana y otros materiales conocidos por aquellos expertos en la técnica. De acuerdo con la presente invención, se puede emplear biología molecular convencional, microbiología, y técnicas de ADN recombinante dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas explican completamente la literatura. Ver, por ejemplo Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A' Practical Approach, " Volumes 1 y II (D.N: Glover ed. 1985) : "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984): "Nucleic Acid Hibridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]: Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enz mes" [IRL Press. (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984) . Por lo tanto, si aparecen en la presente, los siguientes términos deben tener las definiciones expuestas a continuación. Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de los desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timidina, o citosina) en su forma de hebra individual o una hélice de doble hebra. El término se refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a alguna forma terciaria, particular. De esta manera, este término incluye ADN de doble hebra encontrado, inter alia, en moléculas de ADN (por ejemplo fragmentos de restricción), virus, plásmidos, y cromosomas. Al analizar la estructura de la presente de acuerdo a la convención normal dando sólo la secuencia en la dirección 5 ' a 3 ' a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (es decir, la hebra que tiene un homólogo de secuencia al ARNm) . Un "vector" es un replicón, tal como plásmido fago o cósmido, al cual se puede unir otro fragmento de ADN para ocasionar la replicación del segmento unido. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo; es decir, capaz de la replicación bajo su propio control. Un "origen de replicación" se refiere aquellas secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN. Una "secuencia de control de expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia de codificación "se enlaza de forma operable" y "bajo el control" de la secuencias de control transcripcionales y transduccionales en una célula cuando la ARN-polimerasa transcribe la secuencia de codificación en el ARNm, que luego se traduce en la proteína codificada por la secuencia de codificación. En general, los vectores de expresión que contienen secuencias promotoras que facilitan la transcripción y traducción eficiente del fragmento de AD? insertado, se usan en unión con el hospedador. El vector de expresión contiene típicamente un origen de replicación, promotor (es) terminador (es) , así como genes específicos que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en células transformadas. Los hospedadores transformados se pueden fermentar y cultivar de acuerdo a medios bien conocidos en la técnica para lograr el crecimiento óptimo de las células . Una "secuencia de codificación" de AD? es una secuencia de AD? de doble hebra que se transcribe y traduce en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los limites de la secuencia de codificación se determinan por un codon de inicio en el término 5' (amino) y un codon finalizador de traducción en el término 3' (carboxilo). Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a, secuencias .procarióticas, AD?c de AR?m eucariótico, secuencias de AD? genómico de AD? eucariótico (por ejemplo un mamífero), y aun secuencias de AD? sintéticas. Una secuencia de poliadenilación y la secuencia de terminación de transcripción usualmente se localizará 3 ' a la secuencia de codificación. Un ADNc se define como ADN-copia o ADN- complementario, y es un producto de una reacción de transcripción invertida de un transcripto de ARNm. Un "exon" es una secuencia expresada transcripta del locus del gen, en tanto que un "intrón" es una secuencia no expresada que es el locus del gen. Las secuencias de control transcripcionales y transduccionales son secuencias reguladoras de ADN, tal como promotores, intensificadores, señales de poliadenilación, terminadores, y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una célula hospedadora. Un "cis-elemento" es una secuencia de nucleótidos, también llamada una "secuencia de consenso" o "porción", que interactúa con otras proteínas que pueden regular ascendentemente o regular descendentemente la expresión de un locus específico de gen. Una "secuencia de señal" también se puede incluir con la secuencia de codificación. Esta secuencia codifica para un péptido de señal, N-terminal al péptido, que se comunica a la células hospedadoras y dirige el polipéptido a la ubicación celular apropiada. Las secuencias de señal se pueden encontrar asociadas con una variedad de proteínas nativas a las procariotas y eucariotas.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir la ARN-polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación en la dirección 3' (dirección 3') . Para propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora se une en su término 3 ' por el sitio de iniciación de transcripción y se extiende en la dirección 5' (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por arriba del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de transcripción, así como los dominios de unión a proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN-polimerasa) . Frecuentemente, pero no siempre, los promotores eucarióticos, contienen cuadros "TATA" y cuadros "CAT" . Los promotores procarióticos contienen secuencias del Shine-Delgarno además de las secuencias de consenso en -10 y -35. En general, "gen" se propone para incluir los elementos promotores y reguladores enlazados de forma operable a una secuencia de codificación. Estas secuencias promotoras y elementos reguladores pueden ser el promotor natural del gen y/o los elementos reguladores, o pueden ser heterólogos. Una región "heteróloga" es un segmento identificable en el ADN dentro de una molécula de ADN más grande que no se encuentra en asociación con la molécula más grande de la naturaleza. De esta manera, cuando la región heteróloga codifica para un gen de mamífero, el gen usualmente estará flanqueado (por ejemplo, secuencias promotoras y/o elementos reguladores) por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. En otro ejemplo, la secuencia de codificación es una construcción en donde la secuencia de codificación misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc en el cual la secuencia de codificación genómica contiene intrones, las secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo) . Las variaciones alélicas p elementos mutacionales que se presentan e forma natural no ocasionan una región heteróloga de ADN como se define en la presente. La "tecnología de ADN recombinante" se refiere a técnicas para unir dos moléculas de ADN heterólogas, usualmente como resultado de la aligación in vi tro de los ADN de diferentes organismos. Las moléculas de ADN recombinantes se producen comúnmente por experimentos en ingeniería genética. Los términos y sinónimos incluyen "empalme génico", "clonación molecular" e "ingeniería genética". El producto de estas manipulaciones da por resultado una "molécula recombinante" o "recombinante" . Se ha "transformado" o "transfectado" una célula con ADN exógeno o heterólogo cuando este ADN se ha introducido dentro de la célula. El ADN de transformación se puede integrar o no (enlazado covalentemente) en el genoma de la célula. En las procariotas, levadura y células de mamífero por ejemplo, el ADN de transformación se puede mantener en un elemento episomal tal como un vector o plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, una célula establemente transformada es una en la cual el ADN de transformación se ha llegado a integrar en un cromosoma de modo que se hereda por las células hijas a través de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariótica para establecer las líneas celulares o clones comprendidos de una población de células hija que contienen el ADN de transformación. Un "clon" es una población de células derivada de una célula individual o predecesor por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecimiento aceptable in vi tro por muchas generaciones. Un organismo, tal como una planta o animal, que se ha transformado con ADN exógeno se llama "transgénico". Como se usa en la presente, el término "amnios" se refiere a una membrana delgada extraembriónica que circunda el embrión y se deriva de los tejidos del ectodermo y mesodermo . Como se usa en la presente, el término "corion" se refiere a la membrana extraembriónica más exterior que eventualmente llega a ser parte de la placenta, donde además de las funciones respiratorias, suministra nutrientes y remueve los desperdicios. Como se usa en la presente, el término "liposomas" se refiere a una pequeña vesícula unida por una membrana de lípido de bicapa hecha artificialmente de fosfolípidos. El ADN, proteínas y otros materiales se pueden encerrar dentro del liposoma e introducir en células de animal por fusión con la membrana de plasma. Como se usa en la presente, el término "liposoma catiónica de colesterol" se refiere específicamente a un liposoma que contiene colesterol. Como se usa en la presente, el término "agente de mejoramiento del crecimiento" se refiere a compuestos que promueven el crecimiento. Como se usa en la presente, el término "velocidad de admisión o toma" se refiere a la "velocidad saludable", o "velocidad de aceptación" del tejido donador en el tejido hospedador. Se contempla de manera específica que las composiciones farmacéuticas se pueden preparar usando los liposomas descritos en la presente invención. En este caso, la composición farmacéutica comprende un gen que codifica para un factor de crecimiento, el liposoma de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Una persona que tiene habilidad en la técnica será capaz fácilmente de determinar, sin experimentación indebida, las dosis apropiadas y rutas de administración apropiadas del liposoma de la presente invención. Cuando se usa en un paciente en terapia, el vehículo de liposoma descrito en la presente invención se administra al paciente o un animal en cantidades terapéuticamente efectivas, es decir, cantidades que distribuyen efectivamente cantidades apropiadas del ADN que codifica para el agente de mejoramiento de crecimiento. Normalmente se administrará en forma inyectable a la herida o material de cubierta de heridas, pero se usarán como sea apropiado otras rutas de administración. La dosis y régimen de dosis dependerá de la naturaleza de la herida, (la severidad del daño de tejido) y su tamaño, la historia del paciente y otros factores. La cantidad de liposoma administrada se basará típicamente en el área de la herida con inyecciones liposómicas aproximadamente con 4 cm de separación. El programa se continuará para optimizar la efectividad en tanto que se equilibren contra los efectos negativos del tratamiento. Ver, Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed. (1990) Mark Publishing Co . , Easton. Penn.; y Goodman y Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics 8th Ed (1990) Pergamon Press; que se incorporan en la presente como referencia. Para la administración local, los liposomas se formularán más típicamente en una forma inyectable de dosis unitaria (solución, suspensión, emulsión) en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable. Este portador es preferentemente no tóxico y no terapéutico. Los ejemplos de este portador son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5 %. Los portadores no acuosos tal como aceites fijos y oleato de etilo también se pueden usar. El portador puede contener cantidades menores de aditivos tal como sustancias que mejoran la isotonicidad y estabilidad química, por ejemplo, amortiguadores y conservadores. Los liposomas se formularán típicamente en portadores a concentraciones tal como aproximadamente 1 µg a 10 µg.

Los siguientes ejemplos se dan para el propósito de ilustrar las varias modalidades de la invención y no ser proponen para limitar la presente invención de ninguna manera : Ejemplo 1 Animales-Ratas experimentales Se colocaron ratas Sprague-Dawley machos, adultos (350-375 g) en jaulas de fondo de alambre y se alojaron en un cuarto con temperatura controlada con un ciclo de luz- oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron a su ambiente durante 7 días antes del inicio del estudio ciego. Todas recibieron cantidades iguales de una dieta líquida de Sustacal (Mead Jonson Nutritionals, Evansville, Indiana, USA) y agua ad libi tum a todo lo largo del estudio. Cada rata recibió una quemadura por escaldadura de espesor completo de 60 % de área superficial corporal total (TBSA) . Las ratas térmicamente lesionadas entonces se dividieron al azar en: (a) 2 grupos para recibir inyecciones de liposomas catiónicas que contienen colesterol (20 µl de liposomas en 180 µl de solución salina, n=28) , o solución salina (control 200 µl , n=28); (b) 2 grupos para recibir semanalmente inyecciones subcutáneas de liposomas (10 µl de liposomas en 180 µl . de solución salina) que contienen 2.2 µg de una construcción de ADNc de IGF-I y 0.2 µg del la ß-galactosidasa del gen indicador, la construcción de ADNc de Lac Z impulsada por un promotor de CMV (n=12) en un sitio de inyección en el borde de la herida por quemadura (Figura 1) o inyecciones subcutáneas semanales de liposomas (10 µl de liposomas en 180 µl de solución salina) que contiene 2.2 µg de construcción de ADNc de IGF-I impulsada por citomegalovirus y 0.2 µg del gen indicador para ß- galactosidasa, ADNc de Lac Z (n=12) en dos sitios de inyección en el borde de la herida de quemadura (Figura 1) ; o (c) 3 grupos para recibir semanalmente inyecciones subcutáneas de solución salina (200 µl de solución salina normal; n=10) ; inyecciones subcutáneas semanales de liposomas (10 µl de liposomas en 180 µl de solución salina) que contienen 0.2 µg del gen indicador para la construcción de ADNc de Lac Z de ß-galactosidasa (n=10) , o inyecciones subcutáneas semanales de liposomas (10 µl de liposomas de 180 µl de solución salina) que contienen 2.2 µg de una construcción de ADNc de IGF-I y 0.2 µg de la construcción de ADNc de Lac Z de ß-galactosidasa de gen indicador (n=10) .

Ejemplo 2 Animales-Cobayos experimentales Los mecanismos de reparación de heridas en los mini-cerdos Yorkshire están más cercanos a los mismos mecanismos en humanos. De esta manera, los mini-cerdos Yórkshire son un modelo bien descrito y se han usado en varios estudios de trauma, experimentales. Cada uno de los 10 cerdos Yorkshire recibieron 4 heridas de espesor completo (modelo normal) bajo anestesia y analgesia. Cada sitio de herida que es de forma cuadrada rectangular, con una dimensión aproximada de 8x8 cm, separado aproximadamente 5 cm entre sitios y confinados al área del flanco superior y espalda. Las heridas se deben colocar y establecer de acuerdo a un esquema particular tal que el animal pueda estar confortable en su lado después de la liberación de la hamaca de restricción. Inmediatamente después de la inducción de la herida, la herida se cubre con un corion/amnios fetal, humano, INTEGRA (Life Science) ALLODERM*1 (Life-Cell) o BIOBRANEMR (Dow-Hickhan) . La cubierta se engrapa a la herida no quemada y se cubre con una gasa impregnada de ungüento antibiótico triple y un vendaje de presión voluminoso. Se usan conforme se requiera grapas y/o suturas. Después de la cirugía, los animales de estudio se suspenden en una restricción de hamaca en tanto que recuperan de la anestesia para proteger los sitios de injerto de la lesión o dislocación. Los animales permanecen en esta restricción de hamaca por no más de 24 horas.

Ej emplo 3 Liposomas Los liposomas usados fueron liposomas catiónicos que contienen colesterol, el reactivo DMRIE-C (bromuro de 1, 2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxi-etil-amonio) , preparado con agua filtrada con membrana de colesterol (Life Technologies, Rockville, MD) . La construcción de ADNc de IGF-I (Figura 2) consistió de un plásmido de ADNc de IGF-1 impulsado por citomegalovirus preparado en el UTMB Sealy Center for Molecular Science Recombinant DNA Core Facility (el ADNc de IGF-I fue una amable donación de G. Rotwein. NIH. Bethesda. MD) . Las dosis usadas fueron liposomas al 10 % (la concentración más alta usada en los experimentos de transferencia de ADN que no tiene consecuencias perjudiciales en la solubilidad de ADN y es compatible con los paradigmas de transferencia génica. A fin de determinar el transcurso de tiempo de los efectos liposómicos, los liposomas se inyectaron intravenosamente en la vena de la cola de las ratas en el grupo (a) 0.5 horas después de la lesión térmica y se examinaron los cambios durante un periodo de 7 días. El volumen de 200 µl es una cantidad que se puede administrar en la vena de la cola de una rata sin provocar efectos laterales peligrosos, tal como detección cardiaca. Inmediatamente después de la lesión térmica, cada rata del grupo (b) o (c) recibió 0.2 ml de las soluciones inyectadas en cualquier sitio, 1 cm del margen de la vida, o en dos sitios distantes entre sí. Figura 1) . Este protocolo se repitió una vez a la semana durante 4 semanas. Se prepararon lipoplejos frescos cada semana antes de las inyecciones .

Ej emplo 4 Protocolo Se midieron los pesos corporales al mismo tiempo cada día. El por ciento de cambio en el peso corporal total se incrementó en general durante los primeros dos días seguido por una disminución en el peso corporal 2 días después de la quemadura. En las ratas que mantuvieron liposomas mantuvieron su peso corporal mejor en comparación a los controles tratados con solución salina p<0.05 (Figura 3) . Las ratas se sacrificaron por decapitación 1, 2, 5 o 7 días después de la quemadura (para ratas en el grupo (a) ) , o alternativamente, 5 días después de la última inyección (33 días después de la quemadura) para ratas en los grupos (b) y (c) . Se recolectó sangre en separadores de plasma y suero, se giro a 1000 g durante 15 minutos, se decantó y se congeló a -73°C. El hígado y el músculo gastrocnemio se recolectaron, se pesaron, se seccionaron y las muestras de cada uno se secaron a 602C a un peso constante. Las relaciones de peso seco/húmedo se usaron para estimar el contenido de proteína. Tres muestras de la piel dorsal, definidas como biopsia I, II o III, se recolectaron, se congelaron a presión en nitrógeno líquido y se almacenaron a -732C para el análisis (Figura 1) . No hubo diferencias en las relaciones de peso seco/húmedo entre los animales tratados por liposoma y de control para el músculo gastrocnemio y el hígado. El colesterol sérico, ácidos grasos libres, proteínas de fase aguda séricas (haptoglobina y a2 macroglobina) , proteínas hepáticas constitutivas (proteína total, transferrina y albúmina) , y glucosa se midieron en un nefelómetro de Behring (Behring, Dearfield, IL.). Se determinó la de ai-ácido-glicoproteína en suero por ELISA Wako Chemicals Inc, Richmond, VA.) . Una curva normal para las concentraciones de ai-ácido-glicoproteína de rata fue lineal de 0 a 1500 pg/ml en una escala logarítmica. Los niveles de TNF-a en plasma se determinaron por ELISA (Endogen, Woburn, MA. ) . La carga normal usada para la cuantificación de la TNF-a de rata fue lineal de 0 a 833 pg/ml en una escala logarítmica. Se terminaron los niveles de IL-lß séricos por ELISA (Biosource Int; Camarillo. CA. ) y su curva normal usada para la cuantificación de IL-ß de .rata fue lineal de 0 a 1500 pg/ml en la escala logarítmica. La IL-6 sérica se . determinó por biopsia usando células B9 de fase logarítmica (línea de hibridoma de ratón) tratadas con concentraciones séricas crecientes. La proliferación celular en respuesta al suero adicional se midió por reducción de MTS cuantitativa, de manera espectrofotométrica .

E emplo 5 Transfección- Se determinó la transfección al medir la presencia de ß-galactosidasa. Se detectó la proteína de ß- galactosidasa por tinción histoquímica con Bluo-gal en las tres biopsias de piel. Los especímenes de piel se fijaron durante, la noche a 4SC en fijador que consiste de 4 % de paraformaldehído en solución de Hanks amortiguada con HEPES a pH 7.6. Después del lavado en amortiguador y solución salina amortiguada con fosfato (PBS) , los especímenes se incubaron durante la noche a 372C en una solución al 0.1 % de sustrato Bluo-gal (indolil-ß-D-galactósido halogenado) (LIFE Technologies, Gaitherburg, MD, USA) , se amortiguó a pH 7.6. Después del lavado extensivo, los tejidos se incrustaron en parafina, y las secciones histológicas se hicieron y se tiñeron con hematoxilina y eosina o con eosina sola. La presencia de la proteína de ß-galactosidasa también se detectó por el ensayo del gen indicador quimioluminiscente (GALACTO-LIGHT PLUSMR, Tropix Inc. Bedford, MA. USA) en piel. Se prepararon las muestras como sigue [55] : 100 mg de tejido se homogeneizaron en 200 µl de amortiguador de lisis (Tris 40 mM (pH 7.5), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) durante aproximadamente 30 segundos. Las muestras se centrifugaron (12,000 x g) durante 3 minutos. El sobrenadante se removió, el volumen se midió y se almacenó en hielo. El sedimento residual se enjuagó con 200 µl de amortiguador de lisis y se micro-centrifugó. El ensayo siguió las instrucciones de los fabricantes en placas de 96 cavidades. El producto de reacción azul-verde, granular, fino de la reacción de ß-galactosidasa estaba predominantemente presente en el tejido de granulación, compuesto de miofibroblastos, en forma de usillo, macrófagos y pequeños vasos sanguíneos en crecimiento debajo de la herida. Las células que tiñeron consistentemente para ß-galactosidasa fueron los miofibroblastos, células endoteliales y macrófagos en las áreas de inflamación e incluyeron células gigantes multinucleares, indicando transfección preferencial de células con mayores velocidades de proliferación (Figura 4A) . Aunque la mayoría de la tinción para ß-galactosidasa fue en el citoplasma, se observaron algunos productos de reacción fuera de los límites de la célula, posiblemente debido a las enzimas liberadas por las células muertas o la difusión simple de los productos de reacción. También se detectó una pequeña cantidad del producto de reacción en la matriz de los folículos del cabello cerca de los sitios de inyección. No se detectó ß-galactosidasa en los animales tratados con solución salina (Figura 4B) . Se incrementó la expresión de la proteína de la ß-galactosidasa alrededor del perímetro de la herida en ratas que reciben las construcciones de ADNc de Lac Z más ADNc de IGF-I, encapsuladas con liposoma en comparación a las ratas tratadas con solución salina (p<0.05; Tabla 1). La diferencia entre los grupos en las concentraciones de ß-galactosidasa en células sanguíneas, hígado, bazo o riñon. Este hallazgo es consistente con la conclusión que las células sistemáticas no se transfectaron después de las inyecciones subcutáneas de ADNc (Tabla 2) .

Tabla 1 Expresión de ß-galactosidasa en piel Datos presentados son media±SEM. * Diferencias significativas contra liposomas y ADNC de IGF-I (p<0.05) .

Tabla 2 Expresión de ß-galactosidasa en sangre, hígado, riñon y bazo Datos presentados como media±SEM.

Ejemplo 6 IGF-I En ratas que reciben la construcción de ADNc de IGF-I, hubo evidencia de ARNm de IGF-I en la piel próxima a los sitios de transfección pero no en los tejidos de control o tratados en falso (Figura 5) .

Las concentraciones de proteína de IGF-I se midieron por RÍA en tres biopsias de piel (Figura 1) . Las proteínas se extrajeron al pulverizar aproximadamente 40 mg de tejido bajo nitrógeno líquido, adicionando amortiguador de extracción (PBS, 0.25 ml de PMSF, 50 mg de leupeptina, 100 mg de aprotinina, y 50 mg de anti-dolor) en un volumen 1:7 (7 ml de amortiguador/gramo de tejido) y homogenizando la mezcla. Para permitir que se recuperaron las proteínas, las muestras se congelaron durante la noche a -802C. Después de la descongelación, se adicionaron 50 µl del homogenado a 150 µl de la solución de extracción y se centrifugaron a 13,500 rpm durante 5 minutos. 100 µl del sobrenadante se adicionaron en 400 µl de la solución de neutralización y el RÍA se realizó como se describe en las guías del equipo (Diagnostic System Laboratories, Webster, TX, USA) .

En todas las biopsias de piel tomadas, los animales tratados con las construcciones de ADNc de IGF-1 tuvieron mayores concentraciones de proteína de IGF-I alrededor del perímetro de la herida en comparación de las biopsias de los animales tratados con liposomas solos o solución salina (p<0.05; Tabla 3). No hubo diferencia en tres grupos en la concentración de proteína de IGF-I en suero, hígado, bazo o riñon (Tabla 4) .

Tabla 3 concentración de proteína de IGF-I en piel Datos presentados son media±SEM. * Diferencias significativas contra liposomas y solución salina p<0.05.

Tabla 4 Concentración de proteína de IGF-I en sangre, hígado, riñon y bazo Datos presentados como media±SEM.

Ejemplo 7 Proteínas hepáticas constitutivas, proteínas de fase aguda y citocinas. La concentración de la proteína total en suero disminuyó después de la lesión de quemadura. Las ratas que reciben liposomas mostraron un incremento en la proteína total en suero 5 días después la quemadura (liposomas: 5.6 ± 0.1 g/dl contra controles: 5.2 ± 0.1 g/dl) , p<0.05. La transferrina en suero disminuyó después de la lesión por quemadura por casi 30 % por debajo de lo normal. La ratas tratadas con liposomas mostraron un incremento en la transferrina en suero a 2 y 5 días después de la quemadura en comparación .a los controles (p<0.05; Figura 6). No vieron diferencias significativas en la albúmina en suero entre los grupos tratados y de control. Adicionalmente, no hubo diferencias significativas entre los animales tratados y de control en el colesterol de suero, ácido graso libre y glucosa se podrían demostrar a todo lo largo del periodo de estudio. Las proteínas de fase aguda tipo I, la haptoglobina en suero y la ai-ácido-glicoproteína se incrementó después de la lesión térmica. Los liposomas disminuyeron la ai-ácido-glicoproteína en suero 1 y 5 después de la quemadura (p<0.05, Figura 7) . No hubo diferencia significativa en la haptoglobina en suero entre los animales tratados con liposomas y los controles. La proteína de fase aguda tipo II se incrementó después de la quemadura . por casi 50 %. No hubo diferencias en la a- acroglobulina en suero entre los animales tratados con liposomas y los animales de control . Todas las citocinas medidas se incrementaron después de la lesión térmica. La IL-lß en suero disminuyó durante el primer día después de la quemadura y TNF-a en suero a 1 y 2 días después de la quemadura en ratas que reciben liposomas en comparación a los controles (p<0.05; Figura 8A, B) . Ningún cambio en la IL-6 en suero se observó en las ratas tratadas con liposomas en comparación a los controles .

Ejemplo 8 Eficiencia Biológica Todas las ratas sobrevivieron a la quemadura por escaldadura con una TBSA de 60 % y las inyecciones de los fármacos sin efectos laterales perjudiciales. Se determinó la curación de heridas como sigue; la escara de la herida se dejó intacta durante los primeros 28 días y luego se removió por tracción suave, con precaución tomada para no perturbar o destruir él borde de curación a lo largo de la periferia. Después de remover la escara, los animales se colocaron en una superficie normal y el área de la herida se trazó en hojas de acetato a lo largo de la entrecara re-hepitalizada y no quemada, bien demarcada y el borde conducente del neoepitelio. Las áreas de estos trazos se calcularon por planimetría computarizada (Sigma Sean and Sigma Plot software) . Además, se tomaron biopsias de piel del borde de la herida a los 33 días después de la quemadura y se realizó análisis microscópico ligero usando técnicas establecidas. Las mediciones histológicas para la re-epitelización de la piel lineal usaron la técnica de tinción de HE . A los 28 y 33 días después de la lesión térmica, las ratas que reciben las construcciones de ADNc de IGF-I mostraron un incremento significativo en la re-epitelización en comparación con aquellas que recibieron liposomas solos o solución salina (p<0.05; Figura 10) . Esta mejora en la curación de heridas es más probablemente debida a un estimulo mitogénico de IGF-I a los queratinocitos y fibroblastos, puesto que se encontró una actividad mitogénica incrementada en ratas tratadas con la construcción de ADNc de IGF-I en comparación a aquellas que reciben liposomas solas o solución salina. Las ratas que reciben la construcción de ADNc de IGF-I tuvieron niveles de proteína sérica, totales, más altos y los niveles de proteína hepática, totales en comparación con las ratas tratadas con liposomas o solución salina (p<0.05; Tabla 5).

Tabla 5 Concentración de proteína total en suero e hígado Datos presentados como media±SEM. *Diferencia significativa contra Liposomas y solución salina p<0.05.

Ejemplo 9 Procedimiento de tejido donador de membrana amnios fetal y preparación de amnios y corion Después del consentimiento informado, tomando el historial y detectando los factores de riesgo potenciales tal como cáncer, enfermedades infecciosas, abuso de drogas y comportamiento sexual, el presunto donador se prueba para hepatitis B y C, RPR', HIV1 , HIV2 (como se hace rutinariamente por el banco de piel SBI y como se define por AATB) . Esta prueba se hace en el momento de la distribución y en una cita programada con el paciente no hospitalizado 60-90 días después de la distribución. Inmediatamente después de la distribución, las placentas con membranas fetales adherentes se obtienen de los donadores adecuados (de acuerdo a las guías de la AATB) . Después del lavado preliminar con solución de Ringer en el cuarto de distribución la placenta se transfiere a un medio de cultivo de tejido (por ejemplo RPMI 1640) que contiene agentes antibacterianos y antifungales y se transporta a 42C al sitio de procesamiento. Los pasos de obtención se llevan a cabo usando técnica aséptica tal que no se presente contaminación bacteriana y fungal del producto. Se realiza la prueba microbiológica con cada paso de procesamiento para monitorear la contaminación. Se pueden realizar técnicas de PCR adicionales en las muestras de tejido para excluir también infección viral (por ejemplo HIV-1 o -2) . En el sitio de procesamiento (instalación del banco de tejido de SBI) , el lavado adicional y enjuague de la placenta con solución de Ringer vía recipientes umbilicales se lleva a cabo. Luego se separan mecánicamente entre sí las capas de amnios y corion y de la placenta, y el material celular de cubierta se remueve por digestión enzimática con tripsina (Boehringer Mannheim, Indianápolis . IN) (dilución 1:1 de agua destilada en tripsina durante 2 horas a 202C seguido por enjuague repetido con solución salina amortiguada con fosfato (de acuerdo a WO 93/10722) . Para consistencia, se almacena el amnios preparado usando técnicas de congelación de velocidad de control, normales. Para obtener diferentes propiedades de tejido y características, las estructuras de membrana fetal se reticulan . usando una solución de glutaraldehído al 1.5 % (Sígma, St. Louis, MO) durante 20 minutos a 202C, seguido por lavado en glicina al 1.5 % (Sigma, St. Louis, MO) 3 veces durante 15 minutos como se describe para la conservación de piel por el Euro Banco de Piel (61) . La preparación para el almacenamiento definitivo incluye la liofilización usando un sistema de liofilización en anaquel con un doble procedimiento de liofilización que da por resultado un contenido de humedad de menos o igual a 6 % de agua, o conservación por agitación de las membranas fetales en glicerol a 85 % a 202C durante dos periodos de 3 horas. Estos últimos permiten una humedad residual de 15 % de agua y asegura la inactivación de HIV y otros virus (62). Este último tratamiento da por resultado células viables no remanentes y una antigenicidad disminuida que da por resultado una respuesta inmunológica disminuida (63, 64). Se almacena el tejido conservado en glicerol a 42C. Ambos procedimientos se terminan por la transferencia del tejido en una bolsa de hoja, permitiendo la esterilización adicional por radiación gamma o gas de etileno. Antes de uso, el tejido se reconstituye por inmersión en solución salina/solución de Ringer. Los materiales de cubierta de heridas, adicionales, tal como un tejido sintético que comprende un colágeno tipo I y II y piel humana, se preparan para propósitos de comparación (Patente de los Estados Unidos No. 5,002,071: Walter et al. , 1998) .

Ejemplo 10 Liposomas catiónicos que contienen colesterol como un sistema de distribución para terapia génica para el trauma atenúan la respuesta de fase aguda en ratas térmicamente lesionadas .

Un contribuidor principal al hipermetabolismo asociado con una lesión térmica que es el incremento en las proteínas de fase aguda y las' citocinas [9, 10, 11]. Se mostró en la presente que la administración de liposomas catiónicas que contienen colesterol mejoró el peso corporal y la expresión de las proteínas hepáticas constitutivas, transferrina y proteína total después de la quemadura en comparación a la solución salina. Además, se mostró que los liposomas disminuyeron las proteínas de fase aguda tipo I en suero y las proteínas de fase agua tipo I sensibles a las citocinas pro-inflamatorias, TNF-a e IL-lß en suero. Es probable que la disminución en IL-lß y T?F-a conduzca subsecuente a una disminución en estas proteínas de fase aguda . Las razones de los efectos benéficos asociados con los liposomas son más probablemente debidas al efecto directo de las porciones de lípidos liposómicos en las membranas celulares dañadas o a un mejoramiento de la admisión de los nutrientes extracelulares y la encapsulación in si tu y la protección de los factores de crecimiento endógenos y citocinas elaborados localmente como parte de la respuestas hipermetabólica que se activan por las proteínas de fase agua y citocinas. Las citocinas pro-inflamatorias, en particular TNF-a, inhiben la síntesis de proteína e inducen pérdida de peso [16-18] . Después de una lesión térmica, así como en la sepsis, los niveles en suero de TNF-a se incrementa junto con la protólisis del músculo inducida por sepsis [19, 21]. Los niveles de T?F-a en suero disminuidos se asocian con una mejora en el equilibrio neto de proteínas y una reducción en la pérdida de peso corporal en pacientes pediátricos térmicamente lesionados [22, 23] . De esta manera, como se muestra en la presente, una disminución en el TNF-a de suero puede conservar el peso corporal e incrementar los niveles séricos de transíerrina. Varios estudios han intentado determinar los mecanismos por los cuales los liposomas catiónicos ejercen un efecto inhibitorio en la expresión de citocinas in vi tro, sin embargo, no están definidos actualmente, los mecanismos exactos [25-30] . Parece probable que el factor nuclear kappa B (?F-kB) juega un papel importante [27] En la ?F-kB es una señal de transcripción y es crucial en el desarrollo de la respuesta inmunitaria e inflamatoria, celular [27] . Debido a las interacciones electrostáticas entre las células y los liposomas catiónicos, los liposomas se unen al receptor para las proteínas de baja densidad oxidadas (OxLDL) [28, 29]. Sambrand y colaboradores han mostrado que esta unión competitiva y la activación subsecuente del receptor de OxLDL suprimen indirectamente la activación y/o unión de NF-kB a su sitio de ADN cognado [28] . Adicionalmente, Aramaki y colaboradores han mostrado que los liposomas catiónicos inhiben la fosforilación de tirosina. de p41, una proteína de la familia de los factores de transcripción de MAP-cinasas, que conduce consecutivamente a la regulación descendente de NF-kB [25-27] . La inhibición de p41 y NF-kB inhibe la inducción de la oxido nítrico-sintetasa inducible (iNOS) , que disminuye la subsecuente expresión de óxido nítrico (NO) [25, 26] . Estos cambios en la ruta de señal se han puesto en hipótesis como que son responsables de la inhibición selectiva de la expresión de TNF-a al nivel post-transcripcional [25, 26, 31] . Dado que NO e iNOS estimulan la expresión de IL-lß, parece probable que la inhibición de la actividad de NO o iNOS a través de liposomas catiónicós conduzca a la expresión disminuida de IL-lß [32, 33]. Por lo tanto, la administración de " liposomas catiónicos proporciona aparentemente beneficio en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, en parte debido a la inhibición de la liberación de citocinas pro-inflamatorias [31, 34]. La administración de liposomas catiónicos que contienen colesterol modula la respuesta hipermetabólica al afectar la expresión de citocinas, aunque los efectos de la inyección no van probablemente a persistir más allá de 5 días. No hubo diferencias en la citosina en suero y proteína a 7 días después de la quemadura entre los animales tratados con liposomas y los de control. Adicionalmente, la transferrina en suero disminuyó desde el día 5 al día 7 después de la quemadura en ratas que reciben liposomas, en tanto que los animales tratados con control mostraron un incremento en la transferrina en suero desde el día 5 al día 7 después de la quemadura. Además, la haptoglobina en suero se incrementó desde el día 5 al 7 en el grupo tratado con liposomas, en tanto que la haptoglobina en suero disminuyó durante el mismo periodo de tiempo en animales de control. Por lo tanto, los liposomas catiónicos con colesterol incrementaron las proteínas hepáticas constitutivas y disminuyeron las proteínas de fase aguda tipo I, con disminuciones asociadas en los niveles de IL-lß y TNF-a. De esta manera, los liposomas catiónicos con colesterol parecen ser adecuados como un sistema de distribución para la terapia génica en trauma, debido a que los liposomas modulan de forma favorable la respuesta hipermetabólica inducida por trauma y no inducen la citotoxicidad asociada típicamente con el uso de otros liposomas catiónicos in vivo . [4, 7].

Ejemplo 11 Impacto clínico de inyecciones múltiples de una construcción génica de IGF-I después de la lesión térmica. . Todas las ratas en cada grupo sobrevivieron a quemadura por escaldadura con una TBSA de 60 % e inyecciones de fármacos sin evidencia de ningún efecto lateral perjudicial. El peso corporal total se incrementó en casi 2 % por semana para las primeras 4 semanas después de la quemadura en animales transfectados con inyecciones individuales y múltiples de la construcción de ADNc de IGF-I-liposomas, sin diferencias entre los dos grupos. Las ratas que recibieron múltiples inyecciones de la construcción de ADNc de IGF-I tuvieron mayores niveles de proteína sérica (inyección individual de 5.2 ± 0.05 g/dl contra inyección múltiple de 0.5 ± 0.06 g/dl y la proteina hepática total (inyección individual 0.64 ± 0.0.002 mg/ml contra inyección múltiple 0.71 ± 0.03 mg/dl) en comparación a una inyección individual (p<0.05) . Después de que se removió la escara, el por ciento de área de la re-epitelización de la herida por quemadura fue significativamente mayor 33 días después de la quemadura en ratas que. reciben la doble inyección de ADNc de IGF-1 en comparación a la inyección individual (38±2 % contra 31±2 %, respectivamente; p<0.05) . Estos resultados se confirmaron por mediciones histológicas de re-epitelización lineal. Las ratas tratadas con dobles inyecciones de ADNc de IGF-I mostraron una re-epitelización significativamente mayor en comparación a las inyecciones individuales (p<0.05; Figura 11). La transfección, determinada por el ensayo de gen indicador quimioluminiscente para detectar ß-galactosidasa, se incrementó alrededor del perímetro de la herida en animales que reciben inyecciones múltiples de las construcciones de ADNc de Lac Z y ADNc de IGF-I, encapsuladas en liposomas en comparación a las inyecciones individuales (p<0.05; Figura 12A, B) . Las concentraciones en piel de la proteína de IGF-I disminuyeron del punto I de biopsia de piel al punto III de biopsia de piel en ratas que reciben la inyección individual de la construcción de ADNc de IGF-1 a lo largo del borde de la herida (Figura 13A) . Los animales que recibieron dobles inyecciones de la construcción de ADNc mostraron concentraciones de proteína de IGF-I elevadas, consistentes a lo largo del borde completo de la herida (Figuras 13B) . Adicionalmente, la transfección fue detectable tan cerca como un día después de la inyección subcutánea del gen de Lac Z. La velocidad de transfección se incrementó y tuvo un pico o máximo 5 días después de la inyección. En contraste a los experimentos in vitro en los cuales la transfección no fuese detectable 7 días después de la administración, la transfección de células de piel fue aun detectable 7 y 14 días después de la inyección in vivo . Después de la inyección subcutánea del ADNc de IGF-I y la construcción de Lac Z indicadora, las células dérmicas transfectadas, - miofibroblastos, células endoteliales y macrófagos se identificaron, incluyendo las células gigantes multinucleadas conocidas como que son proliferativas. Los niveles de ARNm para IGF-I se incrementaron en la piel de ratas transfectadas con la construcción de IGF-1. Que el ARNm se tradujo en la proteína es consistente con el incremento observado en las concentraciones en piel de la proteína de IGF-I. Este incremento momentáneo en la expresión local de la proteína de IGF-I provocaría una estimulación concurrente de las síntesis de proteína de IGFBP-3 y los niveles incrementados del complejo biológicamente activo IGF-I/IGFBP-3 localmente sin ningún incremento suprafisiológico concomitante en los 'niveles en circulación de la proteína de IGF-I libre, y por lo tanto, no hay efectos laterales perjudiciales [49, 50]. Las pequeñas cantidades de proteína de IGF-I expresadas después de las transfecciones liposómicas son efectivas de una manera paracrína sin los efectos adversos de dosis mayores requeridas por la administración sistemática. Una elevación de la concentración de la proteína de IGF-I en la piel mejoró la curación de heridas en términos de la re-epitelización y recuperación de células dérmicas junto con la mitosis de células dérmicas. Las ratas que reciben el AD?c de IGF-I también tuvieron peso corporal incrementado y concentraciones de proteína total en suero e hígado. Puesto que no se observó ni transfección ni expresión incrementada de IGF-I en sangre, hígado, bazo o riñon, los efectos benéficos (por ejemplo peso corporal conservado, concentración de proteína en suero e hígado incrementada) , son debido a la curación mejorada de vidas y la recuperación mejorada de células dérmicas después de la lesión y resultan de los efectos paracrinos asociados con niveles locales mayores de proteína de IGF-I como lo opuesto a los cambios en los niveles en circulación de proteína de IGF-I que resultan de la transfección sistemática. El IGF-I ejerció efectos mitogénicos en los queratinocitos y fibroblastos con la estimulación de síntesis de colágeno, así como mejoró la recuperación celular después de la lesión, conduciendo a una curación mejorada de heridas [40, 41, 48] . Las ventajas del cierre temprano de heridas, demostradas en los varios estudios clínicos [36, 37] , incluyen una respuesta de quemadura hipermetabólica disminuida y una disminución en los mediadores inflamatorios, tal como IL-I, IL-6, IL-8 y TNF-a [36, 37] . Además, la proteína de IGF-I disminuyó las citocinas pro-inflamatorias IL-lß y expresión de TNF-a después de la lesión térmica [57] . Por lo tanto, IGF-I puede ejercer su efecto benéfico sistemático a través del mejoramiento de la re-epitelización y/o la disminución de la respuesta pro- inflamatoria en la piel, que es una de las principales fuentes de síntesis de citocinas y liberación después de la quemadura [58, 59] . Se demostró en la presente que la transfección se restringe a la piel dentro de un pequeño perímetro de los sitios de inyección. La naturaleza de la expresión de IGF-I fue más probablemente debida a interacciones entre las cargas superficiales positivas en los liposomas catiónicos y las membranas celulares exteriores negativamente cargadas, que restringen la migración liposómica [54]. Sin embargo, la tra?sfección y la expresión de IGF-I se incrementaron significativamente cuando se usaron múltiples sitios de inyección en comparación a un sitio individual de inyección. Las múltiples inyecciones de ADNc de IGF-1 demostraron una elevación consistente con la expresión de la proteína de IGF-I junto con curación mejorada de heridas en tanto que una inyección individual demostró menos proteína de IGF-I a lo largo de la herida. Este hallazgo es clínicamente pertinente, debido a que los liposomas que encapsulan el gen se deben aplicar a distancias bien definidas desde los sitios de trauma para proporcionar transfección óptima y expresión de proteínas. -? Los experimentos en la presente demuestran que la administración subcutánea de las construcciones de ADNc de IGF-I encapsuladas con liposomas transfectan exitosamente células dérmicas. También se demuestra que el ADNc se transfirió en ARNm y tradujo en la proteína de IGF- I. Múltiples inyecciones de ADNc de IGF-I incrementaron el número de células transfectadas y la expresión de proteína, 10 que mejoró la curación de heridas en comparación a una inyección individual. El proceso de transfección, transcripción y traducción se restringió a la piel, puesto que la transfección sistemática o expresión de proteína de IGF-I sistemática, incrementada no se observó. Las 15 respuestas biológicas a la IGF-I de piel incrementada fueron una mejora en la curación de heridas con mejoras sistemáticas subsecuentes a la respuesta hipermetabólica.

Ejemplo 12 20 Transferencia génica de ADNc de IGF-I encapsulada en liposomas incrementa la proteína de IGF-I en células de piel para promover la curación de heridas El uso de la terapia génica momentánea después del trauma es un nuevo planteamiento para mejorar el resultado clínico y mortalidad. La importancia principal es la selección del vector apropiado para la distribución génica [1, 2] . La composición no viral, la no citotoxicidad, la infectividad incrementada y la actividad anti-inflamatoria hacen a los liposomas catiónicos que contienen colesterol un planteamiento promisorio para mejorar la respuesta hipermetabólica inducida por quemadura [4, 51-53] . Se ha mostrado en la presente que los liposomas catiónicos que contienen colesterol son un sistema de distribución efectivo in vivo después de la lesión térmica. Adicionalmente, los mecanismos por los cuales la transfección de ADN y la expresión génica inducida, subsiguiente alteran las respuestas de trauma térmico se reportan en la presente así como los efectos de la transferencia génica de IGF-I en un modelo de lesión térmica. Se mostró en la presente que la administración subcutánea de las construcciones de ADNc de IGF-1 encapsuladas con liposomas transfectaron exitosamente a las células dérmicas y que el ADNc se transcribió en ARNm y tradujo en la proteína de IGF-I. El proceso de transfección, transcripción y traducción se restringió a la piel. Las respuestas biológicas a IGF-I en piel incrementadas fueron la mejora en la curación de heridas con mejoras sistemáticas subsecuentes a la respuesta hipermetabólica. Estos hallazgos, se concluye que los liposomas catiónicos que contienen colesterol que capsulan un vector de plásmido de expresión para ADNc de IGF-1, cuando se dan las ratas con una lesión térmica de TBSA al 60 %, son efectivos en el incremento de las concentraciones de proteína de piel de IGF-1 y de este modo mejoran la curación de heridas.

Ejemplo 13 Comparación de membranas para el material de cubierta Para determinar la eficiencia biológica de los diferentes materiales de cubierta de heridas, se toman semanalmente mediciones de los resultados durante un periodo de tiempo de 4 meses e incluyen: a) tiempo de curación de heridas; b) re-epitelización por planimetría computarizada, mediciones histológicas/por microscopio electrónico; c) integridad por velocidad de toma o admisión e histología y marcadores inmunitarios de rechazo; y b) velocidades elásticas y concentración. En base a estos datos, la funcionalidad y la eficiencia de los diferentes materiales de cubierta se evalúan y se determinan los más adecuados . Adicionalmente, se mide la transferencia génica por: a) ensayos histoquímicos y quimioluminiscentes de la expresión del gen indicador (ß-galactosidasa) como una detección para la transfección; b) análisis de transferencia Northern para el ARNm de IGF-I en la piel como un marcado para la transcripción; y c) radioinmunoensayos para detectar la proteína de IGF-I en la piel . Adicionalmente, la respuesta de fase aguda se determina por: a) peso corporal, admisión nutricional, equilibrio de nitrógeno y concentración de proteína en músculo e hígado; b) producción de proteína hepática constitutiva (albúmina, transferrina, pre-albúmina y proteína de unión a retinol) determinado por nefelómetro; c) proteínas de fase aguda (haptoglobina, al-ácido-glicoproteína, a2-macroglobulina y fibrinógenos) determinado por inmunoensayos enlazados a enzimas (ELISA) y nefelómetro; y e) citocinas (interleucina-lß, interleucina- 4, interleucina-6, interleucina-8, interleucina-10, factor- a de necrosis de tumor e interferón-?) determinadas por ELISA.

Ejemplo 14 Cubierta de heridas de una lesión por quemadura Para simular más exactamente el tratamiento clínico, cada uno de los 15 cerdos Yorkshire recibieron una quemadura por flama de espesor completo (modelo normal) de 35 % de área superficial de cuerpo total (TBSA) bajo anestesia y analgesia. Los animales permanecieron restringidos en una hamaca durante 24 horas y recibieron cuidado intensivo, incluyendo resucitación adecuada y analgesia. Para imitar la instalación clínica, veinticuatro horas después de recibir la quemadura, los animales se sometieron a escisión de heridas e injerto. Este es aproximadamente el mismo cuadro de tiempo después de la lesión térmica que los pacientes humanos se escinden e injertan. Bajo anestesia general y analgesia, la herida por quemadura completa se escinde y se cubre inmediatamente ya sea con amnios humano o amnios humano impregnado con complejos génicos liposómicos. Solo un tipo del material de cubierta se usa por animal, como lo opuesto a diferentes tipos de materiales de cubierta de heridas en el dorso del mismo animal . La cubierta se engrapa a la herida no quemada y se cubre con gasa que contiene ungüento de antibiótico triple y un vendaje a presión voluminoso. Se usan conforme se requieran grapas y/o suturas. Después de la cirugía, los animales de estudio se suspenden en una restricción de hamaca en tanto que se recuperan de la anestesia como se describe anteriormente. Estos experimentos determinan el efecto de diferentes materiales de cubierta con y sin los vectores de expresión liposómicos en la respuesta de fase aguda hepática y con relación a estos efectos a la curación de heridas. Por lo tanto, inmediatamente después de la quemadura, cirugía y en los días post-operativos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16, se retira sangre venosa del animal y se examina para las proteínas hepáticas constitutivas, proteínas de fase aguda y citocinas. El amnios humano o INTEGRA11* representa un depósito para las construcciones génicas liposómicas. Debido a las interacciones electrostáticas entre la superficie de la célula/herida, los liposomas migran fuera del material de cubierta impregnado y transfectan la piel y las células heridas para incrementar de este modo la concentración de IGF-I local. El incremento en la concentración de IGF-I mejora subsecuentemente a la curación de heridas.

Ejemplo 15 Factores de crecimiento adicionales de acuerdo con IGF-I La combinación de membrana fetal o piel de cadáver humano impregnada con construcciones génicas liposómicas acelera y mejora la admisión del injerto, funcionalidad, curación de heridas y la respuesta hipermetabólica después de la lesión. Las construcciones génicas liposómicas pueden codificar para el factor-I de crecimiento tipo insulina (IGF-I) , factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) , hormona de crecimiento (GH) , factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor-ß de crecimiento de transformación (TGF-ß) o cualquier combinación de los factores mencionados con anterioridad.

Conclusión Los liposomas que contienen un ADNc que contiene IGF-I se han mostrado que conservan el peso corporal después de una herida de 60 % de TBSA, previenen el desaprovechamiento de la proteína muscular, mejoran la curación de heridas e incrementan la concentración de proteína de IGF-I en la piel. Adicionalmente, la transfección de células y la subsecuente expresión del gen de IGF-I es un evento local restringido al sitio de inyección. Puesto que no se detectaron diferencias significativas en las concentraciones de suero de IGF-I e IGFBP-3, los efectos benéficos de la distribución génica de liposomas son debido a la curación mejorada, localizada, de heridas, en lugar de los cambios sistémicos en el IGF-1 en circulación. La presente invención demuestra que los ADNc que codifican para agentes de mejoramiento de crecimiento modulan favorablemente la respuesta hipermetabólica después de la lesión térmica, y que las construcciones de liposomas se pueden usar de manera efectiva como un sistema de distribución para las transfecciones génicas. Los beneficios terapéuticos de la transfección génica liposómica se mejoró adicionalmente al incrementar el número de sitios de inyección alrededor de los bordes de la herida o por "vendaje de herida" que incrementó el número de células transfectadas y los niveles concomitantes de expresión génica. Por lo tanto, la membrana fetal, u otros materiales de cubiertas de heridas, impregnados con liposomas que contienen la construcción génica de IGF-I mejora la curación de heridas y representa el tratamiento óptimo de heridas por quemadura. Esta aplicación de terapia génica liposómica se usa para impregnar piel de cadáver humano amnios u otros tipos de materiales de cierre y cubierta de heridas y puede revolucionar la cirugía plástica, reconstitutiva, de trauma y quemadura y mejorar el resultado clínico de estos pacientes.

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Cualquier patente o publicación mencionada en esta especificación son indicativas de los niveles de aquellos expertos en la técnica a la cual corresponde la invención. Además, estas patentes y publicaciones se incorporan como referencia en la presente al mismo grado como si cada publicación individual se indicará de forma específica o individual para ser incorporada como referencia. Una experto en la técnica apreciará fácilmente que la invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y para obtener los fines y ventajas mencionadas, así como aquellos objetos, fines y ventajas inherentes en la presente. Los presentes ejemplos, junto con los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas y compuestos específicos descritos en la presente son actualmente representativos de las modalidades preferidas, son de ejemplo y no se proponen como limitaciones del alcance de la invención. Los cambios en la presente y otros usos se presentará para aquellos expertos en la técnica los cuales se abarcan dentro del espíritu de la invención como se define por el alcance de las reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para mejorar la curación de heridas en un individuo en necesidad de este tratamiento, caracterizado porque comprende el paso de: inyectar un liposoma en la herida, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento del crecimiento. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la herida se selecciona del grupo que consiste de trauma térmico, trauma químico, trauma excisional, trauma quirúrgico y abrasión. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el liposoma es un liposoma catiónico que contiene colesterol. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de mejoramiento de crecimiento se selecciona del grupo que consiste de hormona de crecimiento, factor I de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento . de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor-ß de crecimiento de transformación. 5.' El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el agente de mejoramiento de crecimiento es el factor-I de crecimiento tipo insulina (IGF-I) y la concentración del gen que codifica para IGF-I én el liposoma es de aproximadamente 2.2 µg/ml de liposoma. 6. Un método para mejorar la curación de heridas, caracterizado porque comprende los pasos de: cubrir la herida con un material de cubierta de heridas, en donde el material de cubierta de heridas se impregna con un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento . 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la impregnación del material de cubierta de heridas se realiza antes de cubrir la herida o subsecuente a la cubierta de la herida. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la herida se selecciona del grupo que consiste de trauma térmico, trauma químico, trauma excisional, trauma quirúrgico, y abrasión. . El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el material de cubierta de herida se selecciona del grupo que consiste de amnios fetal humano, corion fetal humano, piel de cadáver humano y piel sintética. 10. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el liposoma es un liposoma catiónico que contiene colesterol. 11. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el agente de mejoramiento de crecimiento se selecciona del grupo que consiste de hormona de crecimiento, factor-I de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor-ß de crecimiento de transformación. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el agente de mejoramiento de crecimiento es el factor-I de crecimiento tipo insulina (IGF-I) y la concentración del gen que codifica para IGF-I en el liposoma es de aproximadamente 2.2 µg/ml de liposoma. 13. Un método para mejorar la curación de heridas, caracterizado porque comprende los pasos de: cubrir la herida con un material de cierre de herida, en donde el material de cierre de herida se impregna con un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento . 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la impregnación del material de cubierta de herida se realiza antes de la cubierta de la herida o subsecuente a la cubierta de la herida. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la herida se selecciona del grupo que consiste de trauma térmico, trauma químico, trauma escisional, trauma quirúrgico y abrasión. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el material de cierre de herida se selecciona del grupo que consiste de amnios fetal humano, corion fetal humano, piel singeneica humana y piel halogeneica humana. 17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el liposoma es un liposoma catiónica que contiene colesterol. 18. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el agente de mejoramiento de crecimiento se selecciona del grupo que consiste de hormona de crecimiento, factor-I de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor-ß de crecimiento de transformación. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el agente de mejoramiento de crecimiento es factor-I de crecimiento tipo insulina (IGF-I) y la concentración del gen que codifica para IGF-I en el liposoma es de aproximadamente 2.2 µg/ml de liposoma. 20. Un vendaje mejorado para heridas, caracterizado porque comprende: un material de cubierta de herida; y un liposoma que comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento. 21. El vendaje mejorado para heridas de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el material de cubierta de herida se selecciona del grupo gue consiste de amnios fetal humano, corion fetal humano, piel de cadáver humano y piel sintética. 22. El vendaje mejorado para heridas de Y conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el liposoma es un liposoma catiónica que contiene colesterol. 23. El vendaje mejorado para heridas de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el agente de mejoramiento de crecimiento se selecciona del grupo que consiste de hormona de crecimiento, factor-I de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento de fibroblastos, factor .de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor-ß de crecimiento de transformación . 24. El vendaje mejorado para heridas de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el agente de mejoramiento de crecimiento es el factor-I de crecimiento tipo insulina (IGF-I) y la concentración del gen que codifica para IGF-I en el liposoma es aproximadamente 2.2 µg/ml de liposoma. 25. Una composición para mejorar la curación de heridas, caracterizada porque comprende: un liposoma, en donde el liposoma comprende al menos un gen que codifica para un agente de mejoramiento de crecimiento; y un portador farmacéuticamente aceptable. 26. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la herida se selecciona del grupo que consiste de trauma térmico, trauma químico, trauma escisional, trauma quirúrgico y abrasión. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el liposoma es un liposoma catiónico que contiene colesterol. 28. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el agente de mejoramiento de crecimiento se selecciona del grupo que consiste de hormona de crecimiento, factor-I de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor-ß de crecimiento de transformación. 29. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el agente de mejoramiento de crecimiento es el factor-I de crecimiento tipo insulina (IGF-I) y la concentración del gen que codifica para TGF-I en el liposoma es de aproximadamente 2.2 µg/ml de liposoma. 30. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la composición se envasa tal que la composición se puede cargar en una j eringa . 31. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la composición se envasa en una jeringa. MATERIAL MEJORADO E HERIDAS PARA MEJORAR CURACIÓN DE — HERIDAS RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe la incorporación de construcciones génicas de liposo a directamente en una herida para mejorar adicionalmente la reparación de heridas, en materiales de cierre y/o cubierta de heridas para mejorar la funcionalidad del material. La presente invención describe adicionalmente el uso de membranas fetales humanas (por ejemplo, amnios) mejoradas con la terapia génica de liposomas como un material de cubierta de heridas en la reparación de heridas de espesor completo. Las membranas fetales mejoradas o la piel de cadáver mejorada tiene ventajas con respecto a los materiales actualmente usados que carecen de la construcción génica de liposomas y son un planteamiento eficiente y seguro para mejorar el resultado clínico en pacientes con lesiones de quemadura .