MX2008008774A

MX2008008774A - Celulas madre mesenquimales que expresan los receptores tnf-alfa.

Info

Publication number: MX2008008774A
Application number: MX2008008774A
Authority: MX
Inventors: Alla Danilkovitch; Diane Carter; Alicia Tyrell; Simon Bubnic; Michelle Marcelino; Rodney Monroy
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2007-01-05
Publication date: 2008-09-26
Also published as: CA2635915A1; AU2007208504B2; EP2465922A2; ZA200805609B; CA2893204C; US11821004B2; US20140248244A1; HK1151553A1; EP1971679A2; US20180087032A1; BRPI0706529A2; WO2007087139A2; US8486695B2; EP1971679B1; US20110189768A1; CA2635915C; CN101370930A; US20120214178A1; EP2465922A3; US20090169522A1

Abstract

Se describen células madre mesenquimales las cuales expresan el receptor TNF-a Tipo I en una cantidad de al menos 13 pg/106 células. Tales células madre mesenquimales inhiben la proliferación de linfocitos y pueden emplearse en particular en el tratamiento de enfermedad del injerto contra hospedero.

Description

CELULAS MADRE MESENQUIMALES QUE EXPRESAN LOS RECEPTORES TNF- ALFA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a las células madre mesenquimales. Más particularmente, esta invención se refiere a células madre mesenquimales las cuales expresan los receptores del factor alfa de necrosis de tumor (T F-a) y en particular, el receptor del factor alfa de necrosis de tumor (TMF-a) tipo I (T FRI) , en una cantidad de al menos 13 pg/106 células. Tales células madre mensequimales inhiben la proliferación de linfocitos. Las células madre mesenquinales (MSC, por sus siglas en inglés) son células madre multipotentes que pueden fácilmente diferenciarse en linajes incluyendo osteoblastos , miocitos, condorcitos y adipositos (Pittenger, et al., Science, Vol . 284, pag. 143 (1999) ; Haynesworth, et al., Bone, Vol. 13, pag. 69 (1992) ; Prockop, Science, Vol. 276, pag. 71 (1997)) . Los estudios in vitro han demostrado la capacidad de las MSC para diferenciarse en los músculos (Wakitani, et al., Muscle Nerve, Vol. 18., pag. 1417 (1995)), precursores tipo neuronales (Woodbury, et al., J. Neurosci. Res. Vol. 69, pag. 908 (2002) ; Sánchez -Ramos , et al., Exp. Neurol . Vol. 171, pag. 109 (2001)) , cardiomiocitos (Toma, et al., Circulation, Vol. 105, pag 93 (2002) ; Fakuda, Artif. Organs, Vol. 25, pag. 187 (2001)) y posiblemente otros tipos de células. Además, las MSC Ref. : 193648 han mostrado que proporcionan capas alimentadoras efectivas para la expansión de las células madre hematopoyéticas (Eaves, et al., Ann. N. Y. Acaá. Sci., Vol . 938, pag. 63 <2001) ; Wagers, et al., Gene Therapy, Vol. 9, pag. 606 (2002)). Los estudios recientes con una variedad de modelos animales han mostrado que las MSC pueden ser útiles en la reparación -o regeneración del hueso, cartílago, menisco o tejido miocardial dañado (Dekok, et al., Clin. Oral Implants Res., Vol. 14, pag. 481 (2003)); u, et al., Transplantation, Vol. 75, pag. 679 (2003); Noel, et al., Curr. Opin. Investig. Drugs, Vol. 3, pag. 1000 (2002); Bailas, et al., J. Cell. Biochem. Suppl . , Vol. 38, pag. 20 (2002); ackenzie, et al., Blood Cells Mol. Dis., Vol. 27, págs. '601-604 (2001)). Varios investigadores han usado las MSC -con resultados animadores para el transplante en modelos de la enfermedad animales que incluyen osteogénesis imperfecta (Peraira, et al., Proc. Nat . Acad. Sci., Vol. 95, pag. 1142 (1998)), parkinsonismo {Schwartz,et al., Hum. «Gene ther., Vol. 10, pag. 2539 (1999)), lesión de la médula espinal ??????, et al., Neuroreport, Vol. 11, pag. 3001 (2000); Wu, et al., J. Neurosci. Res., Vol. 72, pag. 393 (2003)) y trastornos cardiacos (Tomita, et al., Circulation, Vol. 10?, pag. 247 (1999). Shake, et al., Ann. Thorac. Surg., Vol. 73, pag. 1919 (2002)). De forma importante, los resultados prometedores se han reportado en ensayos clínicos para osteogénesis imperfecta (Horowitz, et al., Blood, Vol. 97, pag. 1227 (2001); Horowitz, et al . Proc. Nat. Acad. Sci . Vol. 99, pag.8932 (2002)) e injertado aumentado de transplantes de médula ósea heterólogos (Frassoni, et al., Int. Society for Cell Therapy, SA006 (resumen) (2002); Koc, et al., J. Clinc. Oncol . Vol. 18, pag. 307-316 (2000)). Además, los estudios in vitro ie diferentes laboratorios muestran que las MSC pueden inhibir la proliferación de células T ya sea en cultivos de linfocitos mezclados o por otros estímulos tales como antígenos y mitógenos (Di Nicola, et al., Blood, Vol. 99, págs. 3638-3843 (2-002); Tse, et al., Transplantation, Vol. 75, pá-gs . 389-397 (2003); Aggarwal, et al., Blood, Vol. 105, págs. 1815-1822 (2005)). Datos in vitro recientes demuestran además que las MSC disminuyen la secreción -de citoquinas pro-inflamatorias, factor-a de necrosis de tumor (TNF-a) , e interferon-? (IFN-?) e incrementan simultáneamente la producción de interleucina-? de citoquinas anti-inflamatorias (IL-10) e interleucina-4 (IL-4) por células inmunes. (Aggarwal, 2005). Estos resultados indican que debido a las actividades inmunomoduladoras y anti-inflamatorias, las MSC pueden ser benéficas para el tratamiento de respuestas inmunológicas las cuales se presentan en enfermedades injerto contra hospedero «ÜVHD, por sus siglas en inglés) , transplante de órgano sólido, y enfermedades autoinmunes tales como esclerosis múltiple y artritis reumatoide. Un reporte de caso clínico demuestra el efecto terapéutico de las MSC para GVHD aguda soporta fuertemente esta hipótesis. (Le Blanc, et al., The Lancet, Vol. 363, págs. 1439-1441 (2004)). Los receptores TNF-a se expresan en la superficie de las células madre mesenquimales . Los datos acumulados indican que el TNF-a es un regulador importante de la función de células madre mesenquimales. La incubación de TNF-a con las células madre mesenquimales humanas en cultivos sobrerregula de la prostaglandina E2 (PGE2) y secreción del factor de crecimiento de ceratinocito (KGF) , lo que induce la actividad de la enzima indolamina 2,3 desoxigenasa (IDO) y la migración celular estimulada. El TNF-ct ha demostrado que está presente en heridas y sitios inflamatorios, especialmente en órganos objetivos por enfermedad de injerto contra hospedero. (Koide, et al., Transplantation, vol. 64, págs. 518-524 (1997); uriowa, et al., J. Clin. Invest., Vol. 107, págs. 1365-1373 (2001) ; Deans, et al., Exp. Hermatol . , Vol. 28, págs. 875-884 (2002) ; Ellison, et al., J. -Clin. Immunol . , Vol. 24, págs. 197-211 (2004)). Asi, tales datos indican que la expresión de los receptores TNF-a por células madre mesenquimales pueden ser crítica para las actividades inmunosupresoras , inmunomoduladoras , anti-inflamatorias , reparadora de tejido o de cicatrización de heridas, así como migración a sitios de inflamación. Hay dos tipos de receptores TNF-a, o TNFR; el Tipo I (TNFRI), también conocido como p55, y Tipo II (TNFRII ) , también conocido como p75. (Tartaglia, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. Vol. 88, págs. 9292-9296 (1991). Ambos tipos de receptores TNF-a se presentan en las MSC; sin embargo, el TNFRI es el tipo predominante. (Vancheri, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol . , Vol. 22, págs. 628-634 (2000); Debets, et al., Cytokine, Vol. 8, -págs. 80-88 (1996). La invención se describe ahora -con respecto a las figuras en donde: La Figura 1 es una gráfica de la correlación entre la expresión TNFRI y la capacidad de las MSC para inhibir la proliferación de PBMC in vitro; La Figura 2 es una gráfica que muestra la expresión TNFRI por las células madre mesenquimales humanas almacenadas a -80°C, -70°C, -60°C y -5O°C; La Figura 3 es una gráfica que muestra la expresión TNFRI y la capacidad para inhibir la proliferación de PBMC i vitro de células madre mesenquimales humanas almacenadas a -80°C y -50°C; y La Figura 4 es un gráfica que muestra la expresión TNFRI por células madre mesenquimales humanas almacenadas a -135°C o menos, y luego descongeladas y mantenidas a temperatura ambiente durante 6, 8, 24 ó 32 horas. De conformidad con un aspecto de la -presente invención, se -proporciona una composición que comprende células madre mesenquimales . Las células madre mesenquimales expresan el receptor TNF-a Tipo I (TNFRI) en una cantidad efectiva para inhibir la proliferación de linfocitos. En una modalidad, las células madre mesenquimales expresan TNFRI en una cantidad de al menos 13 pg/106 células. En otra modalidad, las células madre mesenquimales expresan el TNFRI en una cantidad de al menos 15 pg/106 células. En aún otra modalidad, las células madre mesenquimales expresan TNFRI en una cantidad de al menos 18 pg/1'06 células. Aunque el alcance de la presente invención no se limita para ningún razonamiento teórico, los solicitantes han encontrado que las células madre mesenquimales que expresan el receptor TNF-a Tipo I en una cantidad desde al menos 13 pg/106 células inhiben la proliferación de linfocitos. Tales células madre mesenquimales son particularmente útiles en inhibir las respuestas inmunes, y más particularmente tales células madre mesenquimales son útiles en el tratamiento de enfermedad injerto contra hospedero; rechazo al transplante de órgano sólido tal como por ejemplo, rechazo al transplante de corazón, rechazo al transplante de hígado, rechazo al transplante de páncreas, rechazo al transplante del intestino y rechazo al transplante de riñon; y enfermedades autoinmunes tales como, por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, enfermedad de Crohn, síndrome de Guilain-Barré, lupus eritematoso, miastenia gravis, neuritis óptica, psoriasis, enfermedad de Graves, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis de Ord, anemia aplástica, síndrome de Reiter, hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, síndrome opsoclonus mioclonus, arteritis temporal, encefalomielitis diseminada aguda, síndrome de Goodpasture, gronulomatosis de Wegener, enfermedad celíaca, penflgo, poliartritis, anemia hemolítica autoinmune caliente y escleroderma. En una modalidad, las células madre mesenquimales se obtienen de un mamífero. El mamífero puede ser un primate, incluyendo primates humanos y no humanos . Las células madre mesenquimales pueden ser una composición homogénea o pueden ser una población celular mezclada enriquecida en MSC. Las composiciones de células madre mesenquimales homogéneas pueden obtenerse al cultivar células periosteales o de médula adherente, y las células madre mesenquimales pueden ser identificadas por los marcadores de superficie celular específicos los cuales se identifican con anticuerpos monoclonales únicos. Un método para obtener una población celular enriquecida en las células madre mesenquimales se describen, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 5,486,359. Las fuentes alternativas para las células madre mesenquimales incluyen, pero no se limitan a, sangre, piel, sangre del cordón umbilical, músculo, grasa, hueso y pericondrio.

La cantidad del receptor TNF-a celular, tal como el receptor TNF-a Tipo I, que se expresa en un cultivo de las células madre mesenquimales pueden determinarse por los métodos conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, ensayos cuantitativos tales como ensayos ELISA cuantitativos, por ejemplo. Se entenderá, sin embargo, que el alcance de la presente invención no se limita a ningún método -particular para determinar la cantidad del receptor TNF-a. En una modalidad, la cantidad del receptor TNF-a expresado por un cultivo de las células madre mesenquimales -se determina por un ensayo ELISA. En tal ensayo, un lisado celular de un cultivo de las -células madre mesenquimales se agrega a un pozo de una placa ELISA. El pozo puede recubrirse con un anticuerpo, ya sea anticuerpos monclonales o policlonales , contra el receptor TNF-a. El pozo luego se lava, y luego se pone en contacto con un anticuerpo, ya sea anticuerpos monoclonales o policlonales, contra el receptor TNF-a. El anticuerpo se conjuga a una enzima apropiada, tal como peroxidasa de raíz de rábano, por ejemplo. El pozo luego puede incubarse y luego se lava después del periodo de incubación. Los pozos luego se ponen en contacto con un substrato apropiado, tal como uno o más cromógenos . Los cromógenos los cuales pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, peróxido de hidrógeno y tetrametilbenzidina .

Después de que los substratos se agregan, el pozo se incuba durante un periodo apropiado de tiempo. Una vez completada la incubación, una solución "de paro" se agrega al pozo con objeto de detener la reacción de la enzima con el substrato. La densidad óptica (OD) de la muestra luego se mide. La densidad óptica de la muestra se correlaciona a las densidades ópticas de las muestras que contienen cantidades conocidas del receptor TNF-cc con objeto de determinar la cantidad del receptor TNF-a que expresa por el cultivo de las células madre mesenquimales a tratarse. Así, la presente invención proporciona la selección de una población de células madre mesenquimales las cuales expresan el Tipo 1 del receptor TNF-a en una cantidad de al menos 13 pg/106 células. Tales células madre mesenquimales seleccionadas pueden mezclarse con un portador farmacéutico apropiado para el tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en la presente arriba. Por ejemplo, las células madre mesenquimales pueden administrarse como una suspensión incluyendo un medio líquido farmacéuticamente aceptable para inyección. Las células madre mesenquimales de la presente invención se administran a un animal en una cantidad efectiva para tratar una o más de las enfermedades o trastornos mencionados arriba en el animal. El animal puede ser un mamífero, y el mamífero puede ser un primate, incluyendo primates humanos y no humanos . Las células madre mesenquimales pueden administrarse sistémicamente, tales como, por ejemplo, por administración intravenosa, intraarterial o intraperitoneal . La dosis exacta de las células madre mesenquimales a ser administrada depende de una variedad de factores, incluyendo, pero no limitando, la edad, peso y sexo del paciente, las enfermedades o trastornos a tratar, y la extensión y severidad del mismo. La invención ahora se describirá con respecto a los siguientes ejemplos; sin embargo, el alcance de la -presente invención no se pretende que se limite por ello.

Ejemplo 1 Con objeto de investigar el papel del TNFRI en la actividad hMSC inmunosupresora, las hMSC se transfectan transitoriamente por oligonucleótidos tipo TNFRI antisentido con el propósito de reducir la expresión TNFRI (Shen et al., J. Biol. Chem., Vol . 272, págs . 3550-3553 (1997)). Con objeto de alcanzar diferentes grados de inhibición de la expresión TNFRI, tres diferentes concentracion-es de oligonucleótidos se usaron para los -experimentos de transfección . Las MSC -no transíectadas y MSC transfectadas con un oligonucleótido sentido se usaron como controles . La expresión TNFRI en las hMSC se analizó en los lisados celulares por ELISA, y el efecto de reducción en la expresión TNFRI en la capacidad hMSC para inhibir la proliferación hPBMC in vitro se investigó. Las MSC derivadas de la médula ósea humana en el Pasaje 5 de 7 diferentes donadores se usaron para el análisis. Las células se obtuvieron de aspiradores de la médula ósea y se aislaron usando hespan. Las células luego se cultivan entonces a través del Pasaje 5, y se congelan en una solución de criconservación estándar que contiene albúmina de suero humano (HSA) al 5% y dimetilsulfóxido al 10% en Plasmalito A (Baxter) . Las células se almacenaron a -80°C previo al análisis. En el día del experimento, las hMSC se descongelaron, contaron y colocaron en placas de cultivo de tejido de 6 pozos a 2.5 x 105 células/pozo . Después de la incubación durante la noche, las células se transfectaron con oligonucleótidos sentido o antisentido TNF I en concentraciones de 1.25, 2.5 y 5 µg/ml de acuerdo al protocolo del fabricante del reactivo de transfección (Invitrogen, el inserto de producto de reactivo de transfección Cellfectin) . 24 horas después de la transfección, las células se colectaron de las placas. Un grupo de células se lisó, y la expresión del TNFRI en las células lisadas se analizó por ELISA de acuerdo al protocolo sTNFRI ELISA (R&D Systems, inserto de producto) . La expresión TNFRI se expresó en pg del receptor por 1 x 106 células . Para el ensayo ELISA, 2.5xl05 MSC por pozo se lisaron directamente en los pozos usando 250 µ?/???? del reactivo de extracción/lisis de células de mamífero-célula lítica (Sigma, Catálogo No. C-297S) que contiene un cóctel inhibidor de proteína completa (Roche) . Los lisados celulares luego se centrifugaron durante 10 minutos a 12,000-14,000 rpm en un centrifugador Eppendorf para remover el material insoluole de la solución amort i-guadora de lisis. Los lisados celulares luego se colectaron en un tubo nuevo para uso en el ensayo ELISA. Un método alternativo de la lisis celular, esto es, lisis de los peletizados celulares en tubos, también se lleva a cabo para congelar las células y para células colectadas de las placas o matraces de cultivo celular. Ambos métodos, la lisis celular directa en las placas de cultivo y la lisis de peletizados celulares en tubos, dio resultados comparables . Un kit ELISA comercialmente disponible, Quantikine®, TNFRI humano (Catálogo No. DRT 100, R & D Systems) se usó para la detección de TNFRI en lisados celulares. Este ensayo se proporciona para la medición de TNFRI tanto solubles así como asociados con las células (Cjwang, et al., Biochemis try , Vol . 36, pg . 6033 { 1997)) . El ensayo emplea la técnica de inmunoensayo de la enzima intercalado cuantitativo. El ensayo emplea una microplaca que incluye pozos -que se han cubierto previam-ente con un anticuerpo monoclonal específico para TNFRI . El TNFRI presente en las muestras cal ibradoras , muestran de control de calidad, o muestras de los lisados celulares MSC se capturan por el anticuerpo TNFRI inmovilizado. Después -del lavado de cualquiera de las substancias no enlazadas, los anticuerpos policlonales enzimáticos específicos para el TNFRI se agregan a los pozos. Siguiendo una etapa de lavado para remover cualquier anticuerpo ligado a la enzima no enlazada, una solución de substrato se agregó a los pozos, y desarrolla el color en proporción a la cantidad del TNFRI enlazado. El desarrollo de color luego se detuvo, y la intensidad del color se mide usando un lector ELISA. Los detalles del ELISA se dan en la presente a continuación . 50 µ? del HDl-7 diluido de ensayo, una base de la proteína amortiguada con el conservador, se agregaron a los pozos de una placa ELISA. Los pozos se recubrieron con un anticuerpo monoclonal específico para TNFRI. 200 µ? de las muestras de calibrador (que contienen 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.25 pg/ml, 15.625 pg/ml ó 7.813 pg/ml del TNFRI humano soluble), muestras de control de calidad (que contienen 45 pg/ml, 100 pg/ml o 250 pg/ml del TNFRI humano), o los lisados celulares luego se agregaron a los pozos. Previo a la adición de la muestra de control de calidad y calibración a los pozos, tales muestran se trataron con el agente de extracción de lisis de células de mamífero-célula líticas (Si-gma) y cóctel de inhibidor de proteína completo (Roche) como se describe en la presente arriba. La placa luego se cubrió con una tira adhesiva, y se incubó durante 2 horas ± 10 minutos a temperatura ambiente. El líquido luego se decantó de cada pozo al invertir la placa sobre una pendiente, y luego la placa se lavó tres veces. La placa se lavó cada vez con 400 µ? de una solución amortiguadora de lavado agregada a cada pozo. El líquido residual se removió al invertir la placa y transferencia. 200 µ? de los anticuerpos policlonales TNFRI solubles conjugados a peroxidasa de raíz de rábano luego se agregaron a cada pozo . La placa luego se incubó durante 2 horas ± 10 minutos a temperatura ambiente. El líquido luego se decantó de cada pozo, y cada pozo se lavó tres veces con 400 µ? de solución amortiguadora de lavado como se describe en la presente arriba. 200 µ? de una solución de substrato de peróxido de hidrógeno estabilizado y cromogen de tetrametilbenzidina estabilizado luego se agregaron a cada pozo. La placa luego se incubó durante 20 minutos ± 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. 50 µ? de una solución de ácido sulfúrico 2N luego se agregaron a cada pozo. La densidad óptica (OD) de cada muestra se midió entonces dentro de 30 minutos con una prueba de 450 nm y un filtro de referencia 570 nm. Los valores de la densidad óptica se correlacionaron entonces a las cantidades de TNFRI en las muestras de lisado celular.

La cuanti ficación se realizó al comparar la señal de las muestra de los lisados de célula MSC a los estándares TNFRI evaluados al mismo tiempo. Cada corrida ELISA proporciona una curva de calibración e incluye muestras de control de calidad en duplicado colocadas en placa en las muestras de prueba frontal y posterior. Las muestras de -control de calidad se usaron para la evaluación de vali-dez de la corrida ELISA. Los datos de la expresión TNFRI se expresaron en picogramos del receptor por lxlO6 células. Los datos brutos (en pg/ml) r-eflejan TNFRI en picogramos por lxlO6 células (2.5xl05 células se lizaron en 250 µ? del reactivo de lisis, así correspondiendo a lxlO6 células /mi ) . Los valores ELISA para las muestra de calibración se dan en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1: Cálculos para los estándares de calibración de corrida ELISA *Nota: OD - densidad óptica; %DFT - % de Diferencia teórica; CV% - % Coeficiente de variación. Los valores ELISA para las muestras de control de calidad se dan en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2. Cálculos para las muestras de control de calidad de corrida ELISA *Nota: OD - densidad óptica; %DFT - Diferencia teórica; CV% -% Coeficiente de variación Con base en los valores ELISA para la calibración y muestras de control de calidad mostradas en las Tablas 1 y 2 en la presente arriba, la expresión TNFRI en pg por lxlO6 células para las muestras de células madre mesenquimales de los donadores se determinó. -Como se describe en la presente arriba, las células madre mesenquimales de cada dona-dor fueron no transfectadas o transfectadas 'con un TNFRI sentido u oligonucleótido antisentido en una concentración de 1.25, 2.5 ó 5 ug/ml . Los valores ELISA y la cantidad de TNFRI expresados por cada una de las muestras de células madre mesenquimal-es de cada uno de los donadores se -da en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3 . Cálculos para las muestra de prueba de corrida ELISA *Nota: OD -densidad ópti-ca; SD - Desviación estándar; CV% - % Coeficiente de variación A partir de los datos mostrados arriba en la Tabla 3, la expresión TNFRI determinó para (control) , así * con 1.25, 2.5, sentido. Los valores de expresión TNFRI medios se dan Tabla 4 a continuación.

Tabla . Expresión TNFRI para los hMSCs transfectadas con oligonucleótidos anti-sentido y control (sentido): resumen para los 7 donadores de hMSC probados *Nota: Estos valores representan números TNFRI medios (de la tabla 3, columna 8: "TNFRI en pg por lxlO6 células") redondeando a número enteros Un segundo grupo de células transfectadas se usó para la investigación del efecto de las hMSC en la proliferación hPBMC in vitro. Los PBMCs humanos de dos diferentes donadores se usaron por este ensayo. Los PBMCs se aislaron de la sangre leucoferesada usando centrifugación de gradiente Ficoll-Paque de conformidad al protocolo del fabricante (Amersham Biosciences , Ficoll-Paque más isnerto de producto) . Las células se almacenaron a -80°C en un medio que incluye 90% de FBS y 10% de DMSO previo al análisis. En el día del experimento las hPBMC se descongelaron, contaron y colocaron en placas de cultivo de tejido de 96 pozos a 1 x 105 células/pozo junto con hMSC (lxlü4 células/pozo) . Una combinación de anticuerpos anti-CD3 (1 g/ml) y anti-CD28 (1 ug/ml) se usó para estimular la proliferación -de linfocitos que representan un modelo in vitro para características -de activación de células inmunes de -GVHD y rechazo de los órganos alogénicos. (Trickett, et al., J. Immunol . Methods , Vol . 275, págs. 251-255 (2003); Koulova, et al., J. Exp. Med. , Vol. 173, No. 3, págs. 759-762 (1991); Foster, et al., Transplanta ion, Vol. 76, No. 6; Czitrom, Clin. Ortho. Relat. Res., Vol. 326, págs. 11-24 (1996)). Las placas luego se incubaron en una atmósfera humidificada que contiene CO2 al 5%. La proliferación de los PBMC solos y en la presencia de SC se midió en el día 5 -desde inicio del cultivo por la adición de [Metil-3H] -timidina en 1 uCi/pozo para la 18-20 horas finales de cultivo. Después del etiquetado, las células se transfirieron en un filtro de vidrio usando un cosechador de placa de 96 pozos, y la radioactividad incorporada en el ADN se midió por un contador beta de escintilación líquida. La absorción de [Metil-3H] -timidina en ADN en cuentas por minuto (cpm) representa la proliferación de hPBMC. Los resultados finales se expresaron como % de inhibición de la proliferación de PBMC en la presencia de las MSC calculado como: 100%- [Proliferación (PBMC+MSC, cpm) x 100/Proliferación (PBMC, cpm)] Los resultados para las células madre mesenquimales de cada uno de los donadores se da en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5 . Inhibición de la proliferación de hPBMC inducida por CD3 /CD28 por hMSCs transf ectadas con oligonucleótidos anti-sentido y control ( sentido) : resumen para los 7 donadores hMSC probados Nota: ND - sin datos Los datos de arriba c-on respecto a la inhibición de la proliferación PBMC inducida por CD3/CD28 se correlacionan a los datos de expresión TNFRI medios mostrados en la Tabla 4 en la presente arriba. Los datos correlacionados con respecto a la expresión TNFRI media e inhibición de la proliferación PBMC inducida por CD3/CD28 se dan en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6 . Expresión TNFRI y efecto en la proliferación de hPBMC in vitro por hMSC transfectadas con oligonucleótidos TNFRI Los resultados de estos experimentos muestran que las hMSC con expresión disminuida -del tipo I TNFR NFRI) pierde su capacidad para suprimir la proliferación hPBMC in vitro. Los datos soportan la premisa de que la expresión de TNFRI es una ligadura esencial para la supresión de la proliferación d-e PBMC por MSC. Asi, el TNFRI puede usarse como un marcador potencial para la actividad inmunomoduladora de MSC. Con base en los datos obtenidos, un umbral de potencia de 13.07 pg de TNFRI (medio ± SD) por 1 x 106 de células correlacionadas con menos de 50% de inhibición de la proliferación de hPBMC (Tabla 6, Figura 1). Así, las MSC no potentes son células que expresan menos de 13 pg TNFRI por 1 x 106 células .

Ejemplo 2 TNFRI es un marcador sensible a la temperatura de la funcionalidad de hMSC La manipulación ex vivo de las células de mamíferos se restringe por un número de factores incluyendo la temperatura. Por ejemplo, las temperatura bajas tales como -80±5°C, o inferior, aún tan baja como -135°C o menos (nitrógeno líquido) se requieren para el almacenamiento celular mi-entras que la expansión -de células ex vivo requiere una temperatura de 37±0.5°C. La exposición de células a temperaturas exteriores de los rangos óptimos pueden llevar a una disminución en la funcionalidad celular o muerte celular. Las células de mamífero son capaces de resistir fluctuaciones de temperatura menores de corta duración; sin embargo, cada tipo de células tiene su propio rango de tolerancia a la temperatura para mantenimiento del cultivo celular, transporte y almacenamiento . El nivel de expresión de TNFRI en las hMSC se correlaciona con la actividad inmunosupresora de hMSC. El nivel de la expresión TNFRI por las hMSC de menos de 13 pg/106 células se ha determinado como un umbral, debajo del cual las hMSC comienzan a perder su capacidad para suprimir una respuesta inmune (Ver Figura 1) . Así, la expresión TNFRI es un marcador de inmunosupresión hMSC, una actividad que se considera esencial para las MSC para ser eficaces para el tratamiento de reacciones inmunologicas que toman lugar en GVHD, rechazo al órgano, enfermedades autoinmunes, y otras enfermedades. En la presente, se investigó los efectos de las fluctuaciones de la temperatura durante el almacenamiento de las hMSCs congeladas así como el efecto del tiempo de exposición de las células a temperatura ambiente en la expresión de TNFRI en las hMSC.

Efecto de las fluctuaciones de la temperatura de almacenado en la expresión TNFRI y potencial inmunosupresor de hMSC. El objetivo de estos experimentos fue investigar la capacidad de las hMSCs para mantener sus características funcionales después de una exposición a temperaturas arriba de -80 °C, las cuales no son temperaturas óptimas para almacenamiento de células congeladas . Las MSC humanas se congelaron en el Pasaje '5 y se colocaron para almacenamiento •en un congelador a -80±5°C. Después de varias semanas, las bolsas de células congeladas se removieron del congelador -80±5°C y se colocaron en ya sea -70±S°C, -60±5°C, ó 5Ü±5°C durante 72±2 horas. Después -de 72±2 -horas, las bolsas se regresaron al almacenamiento a -80±5°C durante al menos 24 horas antes del descongelado y análisis. Un conjunto de bolsas se mueve de un congelador -8 ±5°C a otro, siguiendo el mismo programa como las otras bolsas, que sirve como un control. En el día del experimento las bolsas que contienen las -células se descongelaron, las células se -contaron, y los lisados celulares para el ELISA TNFRI se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. El ELISA TNFRI se realizó como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se resumen en la Figura 2 (las barras muestran los valores TNFRI ±SD para 3 bolsas hMSC) . Los datos muestran que la exposición de hMSC a las temperatura de -60±5°C ó -50±5°C disminuye .el nivel de expresión TNFRI: el nivel del TNFRI detectado por ELISA fue debajo del umbral de potencia hMSC determinado de 13 pg/106 células (representado por la línea sólida en la gráfica) . Paralelo con la medición TNFRI, dos bolsas con hMSC almacenadas a -8O±5°C (la temperatura de almacenamiento óptima sirve como un control) y a -50±5°C (correspondiente a un +30°C mayor que la temperatura de almacenamiento óptima -8O±5°C) se usaron para la investigación de la actividad inmunosupresora hMSC. La capacidad de las MSC para suprimir la proliferación inducida por anti-CD3/CD28 -de hPBMC in vitro se evaluó como se ¦describe -en el Ejemplo 1. Los resultados muestran que las hMSC almacenadas a -5O±5°C pierden su capacidad para suprimir la proliferación hPBMC, mientras que las células almacenadas a - 80±5°C inhiben la proliferación de hPBMC por 92% (Figura 3, las barras oscuras representan la inhibición ±SD% media de la proliferación de hPBMC. Los números dentro de las barras oscuras muestran valores numéricos) . La actividad inmunosupresora de MSC depende del nivel de la expresión TNFRI: las células que expresan más de 13 pg/106 células de TNFRI, que se determinó como un umbral de potencial inmunosupresor MSC, son biológicamente activas, y las células con el nivel TNFRI debajo de 13 pg/106 células no lo son (Figura 3, las barras claras representan el ±SD medio -del nivel de expresión TNFRI. Los números dentro de las barras claras muestran valores numéricos) . Asi, las temperaturas de almacenamiento no óptimas disminuyen la expresión TNFRI en las hMSC, y se correlaciona con la disminución en la funcionalidad de hMSC.

Efecto -del tiempo de exposición de la célula a temperatura ambiente en la expresión TNFRI en hMSC. Los resultados de este experimento sirven como evidencia adicional que la expresión TNFRI en las hMSC se disminuye bajo la exposición celular a temperaturas no óptimas. En este experimento el efecto de la suspensión celular almacenada a temperatura ambiente en la expresión TNFRI se estudió. Dos lotes de hMSC se usaron en el experimento. Las bolsas que contienen las hMSC se almacenaron a <-13'5°C previo al experimento. En el día del experimento las células se descongelaron y diluyeron con solución fisiológica de Plasmalito A (Baxter) en una manera que imita -el procesamiento celular actual para la administración hMSC intravenosa en los sitios clínicos. Las hMSC descongeladas y diluidas se mantuvieron a temperatura ambiente (22°C-24°C) y las muestras se tomaron y probaron para la cantidad de TNFRI a 0 (inmediatamente después de la línea base de descongelado), 6, 8, 10, 24 y 32 horas después del descongelado. Los resultados muestran que la exposición de las 'hMSC a temperatura ambiente disminuyen los niveles de expresión TNFRI en las hMSC (Figura 4, las barras representan ±SD medio del nivel de expresión TNFRI de 2 lotes hMSC. La línea sólida representa el nivel de expresión TNFRI ole 13 pg/106 células, el cual es el umbral -de potencia de hMSC) . La disminución importante en la expresión TNFRI se observó en 24 horas y 32 horas, y .esto se correlacionó con una disminución importante en la viabilidad celular (debajo de 20%, datos no mostrados) . Así, los experimentos descritos arriba muestran que la expresión TNFRI por hMSC es sensible a la temperatura, y el TNFRI puede usarse como un marcador de funcionalidad de hMSC que se exponen a temperatura no óptimas durante el almacenamiento, transporte o procesamiento de las células. La descripción de -todas las patentes, publicaciones, incluyendo solicitudes de patente publicadas, números de acceso al depósito, y números de acceso a la base de datos se incorporan por ello para refer-encia -en la misma extensión como si cada patente, publicación, número de acceso al depósito, y número de acceso a la base de datos fueran específicamente e individualmente incorporados para referencia. Se entenderá, sin embargo, que el alcance de la presente invención no se limita a las modalidades -específicas descritas arriba. La invención puede practicarse de otra manera a como se describe particularmente y todavía estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición que comprende células madre mesenquimales , caracterizada porque las células madre mesenquimales expresan el receptor TNF-a Tipo I en una cantidad de al menos 13 pg/106 células.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las células madre mesenquimales expresan el receptor TNF-a Tipo I en una cantidad de al menos 15 pg/106 células .
3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque las células madre mesenquimales expresan el receptor TNF-a Tipo I en una cantidad de al menos 1-8 pg/G?6 células .
4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las células madre mesenquimales son células madre mesenquimales humanas .
5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable .
6. Un método para obtener células madre mesenquimales que expresan el receptor TNF-a Tipo I en una cantidad de al menos 13 pg/106 células, caracterizado porque comprende: obtener al menos una población celular que incluye células madre mesenquimales de al menos un donador; determinar la cantidad del receptor TNF-a Tipo I expresado por las células madre mesenquimales en cada uno de al menos una población celular; y seleccionar las células madre mesenquimales las cuales expresan el receptor TNF-oc Tipo I en una cantidad de al menos 13 pg/106 células.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6 , caracterizado porque las células madre mesenquimales expresan el receptor TNF-a Tipo I en una cantidad de al menos 15 pg/106 células .
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las células madre mesenquimal-es expresan el receptor TNF-a Tipo I en una cantidad de al menos 18 pg/106 células .
9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las células madre mesenquimales son células madre mesenquimal-es humanas .